KR101716314B1 - 한국산 재래닭의 정강이색 식별방법 - Google Patents

한국산 재래닭의 정강이색 식별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국산 재래닭의 정강이 색깔에 관여하는 DNA 표지인자 개발에 관한 것으로서, 한국산 재래닭의 정강이 색깔에 대한 유전능력을 조기에 예측하고 식별할 수 있는 DNA 표지인자를 개발하여 한국산 재래닭의 경제 형질개선 또는 육종개량 프로그램에 이용하는 데 있다.
본 발명의 DNA 표지인자를 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 한국산 재래닭의 조기 선발도구로 활용하는 경우, 소비자가 한국산 재래닭에 요구하는 정강이색, 구체적으로 밝은 노란색에 가까운 노란색의 정강이색을 갖는 수입산 브로일러에 비하여 어두운색 즉, 명도가 낮은 정강이색을 가진 한국산 재래닭으로의 육종개량은 보다 효율적이고 경제적으로 추진할 수 있으며, 이를 통하여 재래닭 사육농가의 소득증대 및 경영개선에 이바지할 수 있다.

Description

한국산 재래닭의 정강이색 식별방법{A METHOD FOR DISCRIMINATING OF SHANK COLOR OF KOREAN NATIVE CHICKEN}
본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색 식별방법 및 상기 정강이색 식별을 위한 신규한 DNA 표지인자에 관한 것이다.
최근까지 동물유전자원의 보존에 관한 다양한 노력들이 계속되고 있다. 특히, 국제연합 식량농업기구(United Nations Food And Agriculture Organization, FAO)에서 운영하는 가축다양성 정보시스템(DAD-IS)을 중심으로, 전 세계의 동물유전자원이 문서화 되고 있다. 우리나라에서는 국립축산과학원을 중심으로 가축유전자원의 보존이 이루어지고 있으며, 닭과 관련해서는 1992년부터 전국에 산재되어 있는 재래닭을 수집하는 과정을 시작으로, 1994년 대한양계협회와 함께 고품질 재래닭 육용화 사업이 시작되어 15년간 경제형질을 기초로 재래닭의 선발이 이루어졌다. 그 결과, 5개의 한국 재래닭 라인이 구축되어 백색재래종, 흑색재래종, 회갈색재래종, 황갈색재래종 및 적갈색재래종의 이름으로 DAD-IS에 등재되었다.
상기 한국 재래닭 라인으로 선정된 재래닭은 '우리맛 닭'과 같은 실용계로 생산되어 소비되고 있으며, 우리맛닭이 다른 실용계 브로일러와 비교했을 때, 영양학적으로 우수하고 독특한 풍미와 질감으로 소비자들에게 인식되고 있다고 보고되었다.
상기 한국 재래닭은 주로 깃털색에 의해 다섯개의 라인으로 분류되어 있다. 이들 라인을 구축할 때, 노란색 정강이색을 가진 브로일러와의 차별성을 위해 회흑색 또는 암녹색과 같은 색깔이 어두운 정강이색을 가지는 개체를 선발하였다. 그러나, 여러 세대를 거듭한 선발에도 불구하고 모든 라인에서 다양한 정강이색을 가지는 개체들이 나타나고 있다.
한국의 소비자들은 재래닭의 정강이색이 어두운 것을 선호하기 때문에 정강이색은 중요한 경제형질의 하나로 여겨진다. 특히, 소비자들은 일반 브로일러와 달리 재래닭은 어두운 정강이색을 가졌을 것으로 기대한다. 따라서, 소비자들이 브로일러와 재래닭을 구분할 때, 정강이색이 중요한 지표가 되는 것으로 조사되어 있다.
닭에서 깃털색은 TYR(Tyrosinase), SLC45A2, SOX10, PMEL (Premelanosome protein), MC1R(Melanocortin 1 receptor) 및 MLPH (Melanophilin)와 같은 유전자들이 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
이 중, MC1R 유전자는 포유동물의 모색과 닭의 깃털색을 조절하는 중요한 유전자로 알려져 있다. 상기 MC1R 유전자는 eumelanin(black/brown)과 pheomelanin(red/yellow)을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
닭에서 정강이색과 같은 피부색은 사료내의 xanthophyll과 같은 carotenoid 함량과 관련되어 있으며, 이전의 연구에서 BCDO2 유전자를 노란 피부색의 원인유전자로 조사하기도 하였다. 상기 BCDO2 유전자는 beta-carotene dioxygenase 2 enzyme을 암호화하고 유색의 carotenoid를 무색의 apocarotenoid를 쪼개는 역할을 하여 노란색 또는 흰색 피부색을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 pigmentation은 red jungle fowl(적색야계)이 가축화된 닭의 유일한 기원이 아니라는 정보를 제공하였다.
한국산 재래닭을 이용한 이전에 연구를 살펴보면, 깃털색 변이와 관련하여 MC1R유전자에 대한 연구가 수행되었으나, 현재까지 닭에서 정강이색 변이와 관련된 원인유전자는 밝혀지지 않았다. 따라서, 소비자들이 원하는 정강이색을 가지는 개체를 선발하고, 이러한 개체의 정강이색 관련된 유전이 유지되기 위하여, 한국재래닭 정강이색과 관련된 유전자 요인을 확인하는 것이 요구된다.
그러나, 기존 동물의 유전자와 관련된 연구, 일 예로 마커도움선발법과 같은 유전체 정보를 이용한 방법은 주로 소 또는 돼지와 관련되어 연구되고 있으며, 닭 특히, 한국 재래닭 중에 대한 연구는 거의 진행되지 않고 있는 실정이다. 특히, 닭의 정강이색과 관련하여 MC1R의 특정 유전자형 또는 유전자 다형성과 닭의 정강이색 사이의 연관관계에 대한 연구는 거의 진행되어 있지 않은 실정이다.
KR 10-1258186 B
본 발명은 상기한 바와 같이, 소비자가 원하는 정강이색 즉, 노란색보다 진한 것으로 판단되는 정강이색을 가진 한국 재래닭을 선별하여, 소비자가 요구하는 한국산 재래닭을 생샌하여, 기존 한국 재래닭 생산 농가의 수익 개선을 위하여, 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 유전자 마커, 구체적으로 DNA 표지인자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 표지인자를 이용하여 한국산 재래닭의 정강이색을 확인하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 닭을 선별할 수 있는 유전자 마커, 구체적으로 DNA 표지인자를 제공한다.
또한, 본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 닭을 선별할 수 있는 유전자 마커, 구체적으로 DNA 표지인자를 검출 또는 증폭할 수 있는 제재를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 조성물을 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 판별 방법, 구체적으로 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 유전자 마커, 구체적으로 DNA 표지인자를 이용하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 한국 재래닭 또는 한국 토종닭이라고 불리우는 닭의 품종 개량과 관련된 연구를 진행하던 중, 한국 재래닭의 경제성 향상 및 사육농가의 수익향상을 위해, 소비자의 선호도와 관련하여 한국산 재래닭에 요구되는 정강이색에 대한 요구와 관련된 유전자 마커, 구체적으로 DNA 표지인자를 찾기 위한 연구를 진행하였다.
본 발명의 발명자들은 이에 대하여 심혈을 기울여 연구한 결과, 닭에 대한 가축유전자원의 보존 작업을 통하여 구축된 5종의 한국 재래닭의 유전제 분석을 통해 재래닭의 개체 별로 가지고 있는 DNA 염기서열의 변이가 탐색되었다. 특히, 한국 재래닭의 MC1R(Melanocortin 1 receptor) 유전자에 4개의 단일염기다형(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)이 존재하고, 이 중 유일한 단일염기다형, 구체적으로 상기 MC1R 유전자의 427 번째 염기서열(A>G) 부위의 단일염기다형이 한국산 재래닭의 정강이색과 밀접하게 관련이 있음을 확인하였으며, 이로부터 상기 유일하게 정강이색과 밀접하게 관련이 있는 것으로 확인된 한국 재래닭의 MC1R 유전자의 단일염기다형이 한국 재래닭의 정강이색을 확인하기 위한 DNA 표지인자로서 사용될 수 있음을 본 연구를 통하여 처음 확인하였으며, 이로부터 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)이란 같은 종의 생물이라도 모습이나 고유한 특징이 다양하게 나타나는 것 또는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미한다.
상기 다형성 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것 즉, 단일염기의 변이로 인한 형질의 차이를 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 다양한 동물의 품종을 판단하기 위해 상기 단일 유전자 변이에 의한 단일염기다형성이 널리 이용되고 있으며, 우리나라 고유 유전자원에 대한 연구와 유전자원의 보전을 위해 단일염기다형성을 이용한 SNP DNA 분석법을 이용한 다양한 연구가 수행되고 있으나, 이는 소 즉, 한우와 관련된 것에 집중되어 있고, 최근 돼지에 대한 연구도 증가하고 있는 추세이나, 한국산 재래닭 또는 토종닭과 관련된 연구는 제한적으로 진행되고 있다.
상기 다형성을 확인하기 위한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)란 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 상기 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, 단일염기 다형성은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 프라이머란 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있는 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소 등의 효소와 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트에 의하여 중합반응 즉, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)이 진행될 수 있는 서열을 의미한다. 상기 중합효소 연쇄 반응에서 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형될 수 있다.
본 발명에 있어서, 개체란 개체의 정강이색을 확인하고자 하는 대상인 닭, 구체적으로 한국산 재래닭을 의미하며, 상기 한국산 재래닭으로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 한국산 재래닭의 정강이색, 구체적으로 정강이 색이 어두운 색인지 여부를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, DNA 칩이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명은 닭, 구체적으로 한국산 재래닭 또는 한국산 토종닭의 정강이색 확인용 유전자 마커 또는 DNA 표지인자에 관한 것이다.
상기 한국산 토종닭의 정강이색 확인용 유전자 마커 즉, DNA 표지인자는 바람직하게는 한국산 토종닭의 정강이색을 확인할 수 있는지 여부 즉, 정강이색이 다른 유전자형에 비하여 어두운지 여부, 더 구체적으로 한국산 토종닭 즉, 한국산 재래닭의 평균 정강이색의 명도(L값) 또는 다른 유전자형을 갖는 한국산 토종닭의 정강이색의 명도(L값)에 비하여 명도가 더 낮은 정강이색을 갖는지 여부를 확인 또는 판단할 수 있는 단일염기다형(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 제공한다.
상기 마커는 바람직하게는 MC1R 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 단일염기다형(SNP) 위치인 427번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국산 토종닭 즉, 한국산 재래닭의 정강이색, 구체적으로 한국산 토종닭의 정강이색의 명도의 높고 낮음을 확인할 수 있는 DNA 표지인자일 수 있다.
이러한 측면에서, 상기 DNA 표지인자는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 염기가 A또는 G이고, 상기 427번째 염기를 포함하는 5개 내지 500개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드이며, 닭의 한국산 재래닭의 정강이색 즉, 한국산 토종닭의 정강이색, 구체적으로 한국산 토종닭의 정강이색의 명도의 높고 낮음을 확인할 수 있는 DNA 표지인자일 수 있다.
상기 DNA 표지인자는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용, 구체적으로 노란색 및 붉은색 여부에 대해 확인할 수 있는 정강이색 확인용 단일염기다형(SNP) 마커일 수 있다.
또한, 상기 정강이색이 어두운 즉, 정강이색의 명도가 다른 유전자형에 비하여 낮은 한국산 재래닭 확인용 단일염기다형(SNP) 마커의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 염기가 A또는 G이고, 상기 427번째 염기를 포함하는 5개 내지 500개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
바람직하게는, 상기 정강이색이 어두운 즉, 정강이색의 명도가 다른 유전자형에 비하여 낮은 한국산 재래닭 확인용 단일염기다형(SNP) 마커의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 염기가 A또는 G이며, 상기 427번째 염기를 포함하는 20개 내지 500개 또는 220개 내지 300개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 상기 정강이색이 어두운 즉, 정강이색의 명도가 다른 유전자형에 비하여 낮은 한국산 재래닭 확인용 단일염기다형(SNP) 마커는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인지 여부를 확인하기 위한 DNA 표지인자일 수 있다. 상기 DNA 표지인자는 상기 유전자형을 확인하여, 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 DNA 표지인자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 15수의 수컷과 73수의 암컷으로 구성된 총 88수의 다섯 계통의 한국산 재래닭 부모세대 집단과 이들을 교배하여 부화된 596수의 집단을 대상으로 MC1R 유전자의 단일염기다형 및 정강이색을 분석한 결과, MC1R 유전자의 427번째 염기가 정강이색의 어두운지 여부 즉, 정강이색의밀도와 밀접하게 관련이 있으며, 상기 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인지 여부에 따라 정강이색의 어두운지 여부가 달라짐을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 MC1R 유전자의 염기서열의 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인지 여부를 검출하거나 상기 유전자형을 확인할 수 있는 프라이머를 이용하면, 한국산 토종닭의 정강이색이 더 어두운지 여부를 정확하게 판별할 수 있을 것으로 기대된다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 표지인자를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 조성물을 제공한다.
상기 선별용 조성물은 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 조성물, 구체적으로 한국산 재래닭의 정강이색이 어두운지 여부 즉, 정강이색의 명도가 다른 유전자형에 비하여 낮은지 여부를 확인할 수 있는 조성물일 수 있다.
상기 DNA 표지인자는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 염기가 A또는 G 이고, 상기 427번째 염기를 포함하는 5개 내지 500개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드이고, 한국산 재래닭의 정강이색, 바람직하게는 정강이색이 어두운지 여부, 더욱 바람직하게는 정강이색의 명도가 다른 유전자형에 비하여 낮은지 여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 DNA 표지인자일 수 있다.
상기 DNA 표지인자를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 유전자의 다형성 부위의 검출 또는 증폭을 통해 확인하여, 한국 재래닭의 정강이 색, 구체적으로 정강이 색의 어두운 정도를 판단할 수 있는 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 단일염기다형성 마커 즉, SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼를 이용하여, 적절한 조건 및 적당한 온도 변화하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 또한, 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
따라서, 상기 프라이머는 한국 재래닭의 평균 또는 다른 유전자형을 갖는 한국 재래닭, 일 예로 동형 접합체 유전자형을 갖는 한국 재래닭의 정강이색을 기준으로 정강이색이 어두운지 여부, 바람직하게는 정강이색의 명도(L value)가 낮은지 여부를 선별할 수 있는 것이다. 상기 프라이머는 상기 유전자 마커, 구체적으로 한국산 재래닭의 MC1R 유전자, 바람직하게는 서열번호 1의 MC1R 유전자의 단일염기다형을 확인할 수 있는 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 프라이머의 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 한국산 재래닭의 정강이색을 확인, 구체적으로 한국 재래닭의 평균 또는 다른 유전자형을 갖는 한국 재래닭, 일 예로 동형 접합체 유전자형을 갖는 한국 재래닭의 정강이색 보다 정강이색이 더 어두운지 여부, 바람직하게는 정강이색의 명도(L value)가 더 낮은지 여부를 선별할 수 있는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 조성물을 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 한국산 재래닭의 정강이색 판별용 키트는 상기 DNA 표지인자 또는 유전자 마커의 존재 여부를 확인하거나, 상기 DNA 표지인자의 증폭 정도 또는 DNA 표지인자의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써, 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는지 여부를 판단할 수 있다.
이러한 측면에서, 상기 한국산 재래닭의 정강이색 판별용 키트는 DNA 분석용 키트 또는 PCT 키트일 수 있다. 상기 DNA 분석용 키트는 일 예로 DNA 칩일 수 있고, 상기 PCT 키트는 일 예로 RT-PCR 키트일 수 있다.
상기 DNA 분석용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩 키트일 수 있다. 상기 DNA 칩이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이 중 하나를 의미한다. 일 예로, 상기 DNA 칩 키트는 편평한 고체 지지판, 구체적으로 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 칩을 포함할 수 있으며, 상기 DNA 칩 키트는 상기 DNA 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응을 통하여 짧은 시간 내에 DNA와 관련된 대량 병렬 분석이 가능한 장점이 있다.
상기 RT-PCR 키트는 상기 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 DNA 표지인자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트로, 통상적인 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 상기 DNA 표지인자의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 추가로, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 한국산 재래닭의 정강이색 판별, 구체적으로 한국 재래닭의 평균 또는 다른 유전자형을 갖는 한국 재래닭, 일 예로 동형 접합체 유전자형을 갖는 한국 재래닭의 정강이색에 비하여 정강이색이 어두운지 여부, 바람직하게는 정강이색의 명도(L value)가 낮은지 여부를 선별하는 방법에 관한 것이다.
상기 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법은 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 DNA 표지인자의 427번째 염기를 포함하는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위를 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 분석하는 단계; 및 상기 분석된 염기서열의 결과로부터 427번째 염기를 확인하는 단계를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법일 수 있다.
또한, 상기 한국산 재래닭의 정강이색을 판별 방법은 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 DNA 표지인자의 427번째 염기를 포함하는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 분석하는 단계; 및 상기 분석된 염기서열의 결과로부터 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 427번째 염기를 확인하는 단계를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법일 수 있다.
상기 분석된 염기서열의 결과로부터 염기를 확인하는 단계는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인 것을 확인하는 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 분석된 염기서열의 결과로부터 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인 것을 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 선별 방법은 유전자형을 조사할 수 있는 마커 또는 프라이머 세트를 이용한 마커도움선발법(marker-assisted selection, MAS), 구체적으로, 한국 재래닭의 MC1R 유전자의 SNP 부위와 관련된 마커 또는 프라이머 세트를 이용한 마커도움선발법일 수 있다.
상기 개체로부터 분리된 DNA 시료는 상기 닭, 바람직하게는 검색대상이 되는 한국산 재래닭으로부터 채취한 게놈 DNA(genome DNA)일 수 있고, 더 구체적으로는 상기 게놈 DNA로부터 분리한 닭의 MC1R 유전자 또는 상기 MC1R 유전자에 해당하는 부위일 수 있다.
상기 DNA 시료는 닭, 구체적으로 한국산 재래닭으로부터 채취한 DNA 시료일 수 있고, 보다 구체적으로, 한국산 재래닭의 혈액, 정액, 육즙 또는 계육의 조직으로부터 얻은 게놈 DNA(genomic DNA)일 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형(SNP)을 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열일 수 있으며, 바람직하게는 427번째 염기에 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 분석하는 단계는 유전자형을 조사할 수 있는 마커 또는 프라이머 세트를 이용한 방법으로 마커도움선발법으로 수행할 수 있다.
상기 마커도움선발법은 상기 닭의 DNA 시료를 주형(template)으로 하여, 상기 특정부위를 포함하는 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하고, 상기 PCR반응산물을 시퀀싱하여 염기서열을 확인하거나, 상기 PCR 반응산물을 제한효소로 처리한 후, 아가로스 겔(agarose gel)과 폴리아크릴아마드 겔 (polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동한 후에, 상기 전기영동의 결과인 DNA 밴드(DNA band)를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭, 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 증폭된 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열 또는 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 분석하는 단계는 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 포함하는 DNA 표지인자에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 상기 증폭된 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열 또는 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 결정하는 것은 바람직하게는 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.
일 예로, 상기 TaqMan 방법은 분석대상인 DNA 단편, 일 예로 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 상기 분석결과로부터 분석대상인 DNA 단편의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 상기 SNP 또는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP 또는 MC1R 유전자의 특정부위가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다.
본 발명의 DNA 표지인자는 한국산 재래닭 중 소비자들이 원하는 정강이색인 기존 브로일러보다 진하고 어두운 색깔을 가진 한국산 재래닭을 확인할 수 있는 특이적 SNP 마커로서, 상기 DNA 표지인자를 이용하는 경우 단순히 모색 즉, 털 색깔만으로는 구분하기 어려운 정강이 색의 어두운지 여부를 신속하고 간편하게 확인할 수 있으므로, 사육대상인 한국산 재래닭의 정강이색에 대한 유전능력을 조기에 예측하고 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 표지인자를 한국산 재래닭의 경제 형질개선 또는 육종개량 프로그램에 이용하여, 한국산 재래닭의 육종개량을 보다 효율적이고 경제적으로 추진할 수 있으며, 이를 통하여 재래닭 사육농가의 소득증대 및 FTA 등 통상조약에 의해 국제적 경쟁력이 요구되는 사육농가의 경쟁력 향상과 능률 향상에 도움이 되어, 한국산 재래닭을 사육하는 농가의 수익성 향상 및 매출 증대에 이바지할 수 있을 것으로 평가된다.
도 l은 본 발명의 일 실시예에 따른, 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에 관한 것으로, 상기 굵은 글씨체(Bold type)로 표시된 부위는 MC1R 유전자의 유전자형 분석을 수행하여 확인된 주요 SNP 변이를 검출한 결과를 의미한다.
도 2 및 도 3은 시료로 사용된 DNA 시료를 제공한 한국산 재래닭의 깃털 색깔에 의한 구분(도 2)을 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다.　 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. DNA 시료 채취
대한민국 국립축산과학원(NIAS)에서 동일한 조건 및 동일한 사료로 사육한 5계통의 한국산 재래닭(Korean native chicken) 597 마리, 구체적으로 15수의 수컷과 73수의 암컷으로 구성된 총 88수의 다섯 계통의 한국 재래닭 부모세대 집단과 이들을 교배한 자녀세대 집단 597수의 샘플을 사용하였으며, 이 계통은 국립축산과학원에서 표준육종절차에 의해서 유지되어온 집단이다.
이들 596수의 F1 개체들은 각각 110수의 회갈색계통(G)과 90수의 흑색계통(L), 135수의 적갈색계통(R), 126수의 백색계통(W), 135수의 황갈색계통(Y)으로 나뉘어져 있으며 각 개체의 정강이색을 측정하였다. 모든 개체는 환경변이를 최소화하기 위하여, 같은 환경과 같은 사양조건에서 사육되었다.
각각의 정강이색은 최소 3반복으로 각기 다른 위치를 측정하였으며 색측정에는 spectrophotometer(색차계)를이용하여 lightness와 redness, yellowness를측정하였다.
상기 한국산 재래닭 개체의 DNA 시료는 다음과 같은 방법으로 수득하였다.
우선, 상기 22주령에 한국산 재래닭의 닭 날개에 위치한 익정맥으로부터 EDTA가 포함된 vacutainer 튜브를 이용하여 혈액 샘플을 확보하였으며, 상기 혈액 샘플로부터 manual extraction 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.
구체적으로, manual extraction은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 상기 혈액 샘플 5㎖당 버퍼A(0.32M Sucrose, 1 mM TrisHCl, 5 mM MgCl2, 1% Triton X-100, dH2O)를4배 부피(volume)으로 희석한 후, spin down 하여 상징액을 조심스럽게 제거하는 과정을 3회 반복하여, 상징액을 제거하였다. 상기 상징액이 제거된 혈액 샘플에 Buffer B(400 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM TriHCl, dH20) 2.25 ㎖와 Buffer C(5% SDS 2 ㎎/㎖, Proteinase K 2.6 ml) 250㎕를 첨가한 후, 혼합(inverting)해주고, 50 shaking incubator에서 24시간 동안 침지시켰다. 상기 침지 후, 포화상태의6M NaCl 675㎕를 첨가하고, 15초 동안 강하게 흔들어준 후 원심분리기에서3000 rpm으로 15분간 원심분리 후 상징액을 새 튜브(tube)로 옮겨주었다. 상기 상징액을 옮긴 튜브에 2배 부피(volume)의 99% 에탄올(EtOH) 수용액을 첨가하여, DNA를 침전시키고, 99% 에탄올 수용액을 제거하였다. 상기 99% 에탄올 수용액을 제거한 침전물을 70% 에탄올 수용액으로 세척한 후에, pipette-tip-hook 방법으로 DNA를 수득하고, 새 튜브(microtube)에 옮겨 담았다.
수득된 DNA 펠렛에 TE 버퍼(TE buffer) 500 ㎕를 넣어, DNA를 녹여 최종 DNA 시료를 수득하였다
실시예 2. MC1R 유전자의 SNP 확인
상기 한국산 재래닭의 SNP genotype은 BioMark HD system(Fluidigm® 192.24 SNPtypeTM, USA)을 이용하여 자손세대 집단의 유전자형을 측정하였다.
주요한 증폭부위(STA : SNP location)는 MC1R gene의 확인된 네 개의 SNP를 선택하여 array를 제작하였으며, 25 ng/㎕의 DNA를 이용하여 14번의 증폭과정을 수행하였다. 증폭에 사용한 STA는 IFC controller를 이용하여 희석하며 mixture는 BioMark 192.24 array를 이용하여 증폭사이클을 수행하였다. 마지막으로 자손세대 집단의 MC1R gene의 변이는 SNP genotyping analysis를 수행하여 확인하였다.
측정된 결과는 미니탭 14.0(Minitab, USA)을 이용하여 정규분포테스트를 실시하여 유의성 분석에 사용할 수 있는지를 확인하였다. 변이분석모델은 일반선형분석모델(general linear model, GLM)을 사용하여 개체간 또는 계통간의 유의성 테스트를 실시하였다. 상기 MC1R 유전자의 SNP에 의한 증체량에 대한 효과는 한국산 재래닭 5개 계통의 591 마리 모두에 적용되어 계산하였다. 상기 일반선형분석은 다음과 같은 모델을 이용하여 분석되었다.
[계산식]
Figure 112014104839712-pat00001
상기 계산식 1에서, Yijklmno은 개체의 표현형, μ 집단의 평균, Gi는 유전자형에 의한 고정 효과, Sj는 성별에 의한 고정 효과, Bk는 집단에 의한 고정 효과, Ll는 계통에 의한 고정 효과, Fm (l)는 첫 번째 계통에 속한 부계의 임의효과, Mn ( lm )는 첫 번째 계통과 부계와의 교배한 집단에 속한 모계의 임의효과, □ijklmno는 부모세대 집단과의 연관성 분석의 잔차로 사용되었다. 이러한 유전자형의 구분은 Tukey's test를 이용하였다.
상기 분석결과, 실시예 1에서 확인된 6개의 염기다형 중에서 정강이색과 관련이 있는 염기다형은 4개로 확인되었으며, 정강이색 중 유의적으로 관련이 있는 염기다형은 노란색과 관련해서는 3개로 확인되었으며, 특히 어두운 정강이색 즉, 정강이색의 명도와 유의적으로 관련이 있는 염기다형은 유일하게 1개로 확인되었고(표 1), 구체적으로 염기다형은 c.427 G>A SNP인 것으로 확인되었다.
Figure 112014104839712-pat00002
상기 표 1에서, P-value는 유의값을 나타내며, L값은 명도를, a값은 적색도를, b값은 황색도를 의미한다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 염기다형 중 c.212 C>T SNP, c.274 A>G SNP 및 c.427 A>G SNP는 정강이색과 관련이 있는 것으로 확인되었으나, c.212 C>T SNP 및 c.274 A>G SNP는 황색도와 관련이 있을 뿐이며, c.427 A>G만 유일하게 한국산 재래닭의 정강이색의 명도 즉, 어두운지 여부와 관련이 있는 것으로 확인되었으며, 상기 MCR1 유전자의 427번째 유전자형(Genotype)의 경우, AG의 이형접합체 유전자형인 경우 동형정합체에 비하여 유의적으로 정강이 색이 가장 어두운 색깔을 갖는 것으로 확인되었다.
한국산 재래닭의 경우, 다른 실용계 브로일러와 비교했을 때, 영양학적으로 우수하고 독특한 풍미와 질감으로 소비자들에게 우수한 것으로 인식되고 있으나, 한국 재래닭의 특징인 깃털색의 경우, 닭의 유통과정과 관련하여 한국 재래닭을 구분 짓는 특징이 되기 쉽지 않으며, 이로 인해 소비자들은 주로 수입산 브로일러와 비교하여 어두운 정강이 색깔을 가진 닭을 한국 재래닭으로 인식하고 있다.
이러한 측면에서, 본 발명에서 최초로 확인된 정강이 색의 명도와 관련된 SNP, 즉, c.427 A>G는 한국산 재래닭과 관련하여 어두운 정강이 색 등의 경제 형질 개선과 관련하여 유용하게 사용될 수 있을 것으로 평가되었다.
<110> Foundation of University-Industry Research Collaboration <120> A METHOD FOR DISCRIMINATING OF SHANK COLOR OF KOREAN NATIVE CHICKEN <130> DP20140423 <150> 2013-0130321 <151> 2013-10-30 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 945 <212> DNA <213> MC1R gene <400> 1 atgtcgatgc tggcccccct gcgcctgctg cgcgagccct ggaacgccag tgagggcaac 60 cagagcaayg ccacggccgg ggccggaggt gcctggtgcc aggggctgga catccccaat 120 gagctcttcc tgacgctggg gctggtgagc ctggtggaga acctgctggt ggtggccgcc 180 atcctcaaga acaggaatct gcactcgccc aygtactact tcatctgctg cctggccgtc 240 tccgacatgc tggtgagcgt cagcaacctg gccragacgc tcttcatgct gctgatggag 300 cacggcgtgc tggtgatccg cgccagcatc gtccgccaca tggacaatgt catcgacatg 360 ctcatctgca gctccrtcgt gtcctccctc tccttcctgg gggtcatcgc cgtggaccgc 420 tacatcrcca tcttctatgc gctgcgctac cacagcatca tgacgctgca gcgcgccgtg 480 gtcaccatgg ccagcgtctg gctggccagc accgtctcca gcaccgtctt aatcacctac 540 taccgcaaca acgccatcct gctctgcctc attggcttct tcctcttcat gctggtcctc 600 atgctggtgc tctacattca catgttcgcg ctggcaygcc accacgtgcg cagcatctcc 660 agccagcaga agcagcccac catctaccgc accagcagcc tgaagggagc cgtcacgctc 720 accatcctgc tgggagtctt cttcatctgc tgggggccct tcttcttcca cctcatcctc 780 atcgtcacct gccccaccaa ccccttctgc acctgcttct tcagctattt caacctcttc 840 ctcatcctca tcatctgcaa ttcagtggtc gatcccctga tctatgcctt ccggagccag 900 gagctccggc ggacgctgcg ggaggtggtg ctgtgctcct ggtag 945

Claims (9)

  1. 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 염기서열에서 427번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 427번째 염기를 포함하는 5개 내지 500개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드이고, 한국산 재래닭의 정강이색을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 한국산 재래닭의 정강이색 확인용 DNA 표지인자의 427번째 염기를 포함하는 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자에 대응되는 부위의 염기서열을 분석하는 단계; 및
    상기 분석된 염기서열의 결과로부터 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인지 여부를 확인하는 단계
    를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법은 상기 개체의 정강이색의 명도가 한국산 재래닭의 평균 정강이색의 명도보다 낮은지 여부를 확인하는 판별 방법인 것을 특징으로 하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법.
  3. 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 427번째 염기가 포함된 MC1R 유전자에 대응되는 부위의 염기서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 MC1R 유전자의 특정부위의 염기서열을 분석하는 단계; 및
    상기 분석된 염기서열의 결과로부터 상기 서열번호 1로 표시되는 MC1R 유전자의 427번째 유전자형(Genotype)이 AG의 이형접합체 유전자형인지 여부를 확인하는 단계
    를 포함하는 한국산 재래닭의 정강이색 판별 방법.
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