KR20190038033A

KR20190038033A - 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체

Info

Publication number: KR20190038033A
Application number: KR1020170127991A
Authority: KR
Inventors: 변정훈
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2019-04-08
Also published as: KR102201471B1

Abstract

본 출원의 나노 복합체의 제조 장치 및 제조 방법, 이를 이용하여 제조한 나노 복합체는 생리 활성 물질 및 지지체의 결합을 위하여 열수 반응, 분리 정제 또는 후처리가 필요하지 않는 기체 단일-패스 구성을 이용하여 금속 응집체의 재조립을 통해 다기능 나노 복합체를 연속으로 제조할 수 있다.

Description

나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체{Manufacturing device of nanocomposites, method of preparing nanocomposites and nanocomposite prepared therefrom}

본 출원은 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체에 관한 것이다.

플라즈몬 금(Au) 기반의 나노 구조는 화학적으로 불활성이고, 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 상기 플라즈몬 금(Au) 기반의 나노 구조는 높은 생체 적합성을 가지며, 광학 특성을 조절할 수 있기 때문에 치료 및 진단 용도로 자주 사용한다. 특히, 근적외선(NIR) 영역에서의 나노 구조의 강한 광 흡수는 란다우 댐핑(Landau damping)을 통해 비방사성 에너지의 소실을 발생시키고 광열 온열 요법을 위한 충분한 열을 생성한다. 이에 따라, 나노 구조는 약물과 표적제 같이 다양한 치료 모드 및 상이한 생체 활성 분자를 사용하여 이러한 치료법으로 광범위하게 사용하였다.

가시광선에서 근적외선에 이르는 표면 플라즈몬 공명 파장을 조작함으로써 Au 나노 구조의 모양을 변화시키는 것을 확인하였다. Au 크기 증가로 인한 국지화된 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR) 흡수의 매우 제한된 적색 쉬프팅(red-shifting)과 비교할 때, Au 나노 구조의 모양 변화는 광열 요법 및 광학 진단에서 더 강한 광학적 거동을 유도한다. Au 나노 로드는 적색 쉬프팅 또는 확장을 달성하기 위해 자주 사용하며, 흡수 스펙트럼은 Au의 종횡비를 제어하여 조절할 수 있다.

그러나, 최근에 Au 나노 로드는 날카로운 모서리, 팁 및 잔류물 예를 들어, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드과 같은 물리화학적 특징으로 인해 세포 생존력을 제한한다고 보고되고 있으며, 이방성 특성으로 인해 높은 종횡비에 따른 혈관 내 잔류 시간이 낮은 문제점이 있다.

대한민국 등록특허 10-1707468 대한민국 등록특허 10-1705033

본 출원은 생리 활성 물질 및 지지체의 결합을 위하여 열수 반응, 분리 정제 또는 후처리가 필요하지 않는 기체 단일-패스 구성을 이용하여 금속 응집체의 재조립을 통해 다기능 나노 복합체를 연속으로 제조할 수 있는 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체를 제공한다.

본 출원은 나노 복합체의 제조 장치에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 제조 장치에 의하면, 전자 공여 그룹(electron donating group)을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하여 액적을 형성하는 분무부; 상기 분무부로부터 형성된 액적에 광을 조사하여 상기 금속 나노입자와 유기물을 재배열시켜 나노 구조체를 형성하는 광 조사부; 및 상기 광 조사부로부터 형성된 나노 구조체로부터 용매를 제거하여 나노 복합체를 생성하는 용매 제거부를 포함한다.

본 출원은 나노 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 제조 방법에 의하면, 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하여 액적을 형성하는 단계; 상기 단계에서 형성된 액적에 광을 조사하여 상기 금속 나노입자와 유기물을 재배열시켜 나노 구조체를 형성하는 단계; 및 상기 단계에서 형성된 나노 구조체로부터 용매를 제거하여 나노 복합체를 생성하는 단계를 포함한다.

본 출원은 나노 복합체에 관한 것이다. 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체에 의하면, 다수의 금속 나노 입자 및 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하고, 상기 유기물은 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 출원은 나노 복합체에 관한 것이다. 본 출원의 또 다른 일 구현예에 따른 나노 복합체에 의하면, 다수의 금(Au) 나노 입자, 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 또는 음전하로 하전된 계면활성제, 및 약물을 포함하고, 상기 계면활성제 및 약물이 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있는 것을 특징으로 한다.

도 1은 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치를 모식화한 도면이다.
도 2는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치 중 용매 제거부를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치의 전기장 인가부가 형성되어 있는 액적 이송부의 단면을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치 중 수집부를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 확산 건조기를 통한 용매 추출 전에 185 nm UV 조사 하에서 Au AG(Au 막대의 스파크 용발), TD 액적(에탄올에 용해된 TD) 및 하이브리드 액적(Au AG를 포함하는 TD 액적)의 크기 분포도이다.
도 7은 확산 건조기를 통과 한 후 (a) Au AGs 및 (b) 실시예 1(TAuD)의 저배율 및 고배율 TEM 이미지이다.
도 8은 (a) PBS에 분산된 실시예 1(TAuD) 나노 복합체의 동적광산란(DLS)법을 이용한 입자 크기 분포, 제타 전위 및 (b) TD를 포함하는 UV-vis 스펙트럼 그래프이다.
도 9는 다른 T 용액을 포함하는 재조립된 Au AG의 TEM 이미지이다.
도 10은 (a) 실시예 1(TAuD), Au 및 비교예 1(TAu)의 XPS Au 스펙트럼, (b) 실시예 1(TAuD), 비교예 1(TAu) 및 비교예 2(AuD의 FT-IR)스펙트럼, (c) 실시예 1(TAuD), 비교예 3(TD) 및 Au AG의 라만 스펙트럼 그래프이다.
도 11은 실시예 1(TAuD)로부터 (a) pH 트리거링 (5.5 및 7.4) (24 시간) 및 (b) 근적외선(NIR) 트리거 (6 시간 및 808nm) (2시간 후 5 분간 조사) 약물(DOX, D)의 시험관 내 방출 프로파일에 관한 그래프이다.
도 12는 808 nm 근적외선(NIR) 조사에 따른 (a) 농도 의존(2.5 W cm^-2) 및 (b) 6분 동안 비교예 1(TAu) 및 RPMI(대조군)의 강도-의존성 (150 μg/mL) 온도 상승 프로파일이다.
도 13은 632 nm 근적외선(NIR) 조사에 따른 (a) 농도 의존(2.5 W cm^-2) 및 (b) 6분 동안 비교예 1(TAu) 및 RPMI(대조군)의 강도-의존성 (150 μg/mL) 온도 상승 프로파일이다.
도 14는 (a) MDA-MB-231 및 (b) MCF-7 세포에서의 단일 D를 포함하는 근적외선(NIR) 조사의 부재 및 존재 하에서의 비교예 1(TAu) 및 실시예 1(TAuD)에 대한 생체 외 항암 효과 그래프, (c) MDA-MB-231 및 MCF 세포에서의 쿠마린-6에 로딩된 비교예 1(TAu)의 CLSM 이미지, (d) MDA-MB-231 및 (e) MCF-7 세포에 의한 실시예 1(TAuD)의 세포 흡수를 보여주는 FACS 분석 결과, (f) 808 nm 근적외선(NIR) 조사의 유무에 따른 비교예 1(TAu)로 처리된 세포에서의 p53의 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 15는 (i) 대조군, (ii) 단일 D군, (iii) 비교예 1(TAu)+ 근적외선(NIR)군 및 (iv) 실시예 1(TAuD)+세포군으로 처리한 후 MCF-7(상부) 및 MDA-MB-231(하부) 세포의 세포 사멸을 결정하기 위한 FACS 결과이다.
도 16은 생존/사망 분석에서의 역 형광 현미경 이미지이다.
도 17는 세포주기 분석을 측정한 광학 현미경 이미지이다.
도 18은 생체 내 항 종양 평가에 관한 것으로서, 단일 D를 포함하여 근적외선(NIR) 조사의 유무에 따른 비교예 1(TAu) 및 실시예 1(TAuD)에 대한 이종 이식 쥐를 지닌 MDA-MB-231의 (a) 종양 성장 및 (b) 중량-변화 프로파일 그래프 및 (c) 주입 후 24 시간 동안 안락사된 쥐에서 채취한 주요 장기[간(i), 폐(ii), 심장(iii), 비장(iv) 및 신장(v)]와 종양(vi)에 대한 Cy5.5 단독(중간) 및 Cy5.5와 결합한 비교예 1(TAu)(우측)의 생체 외 형광 이미지이다.
도 19는 생리 식염수 및 실시예 1(TAuD)로 전처리한 쥐의 종양에 근적외선(NIR) 조사하던 중 생체 내 광열 촬영한 이미지이다.
도 20은 T 대신에 지질 분자 LAu를 사용하여 상이한 유형의 나노 복합체를 제조하는 다른 조합물로서, (a) 액적유동(FD) 반응으로부터 LAu의 저배율 및 고배율 TEM 이미지, (b) LAu의 광열 활성을 확인하기 위한 LAuD로부터 근적외선(NIR)(632 및 808 nm, 5분)-트리거 D의 방출 프로파일 및 (c) 순 DNA 및 시판되는 리포펙타민과 비교하여 LAu 즉, LAuG와 결합된 pDNA(EGFP 포함)의 유전자 전달 성능 그래프이다.

본 출원에서 용어 「나노」는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 「나노 입자」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 입경을 갖는 입자를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 평균입경을 갖는 입자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원의 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체를 설명하며, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 출원의 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체의 범위가 첨부된 도면에 의해 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치를 모식화한 도면이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 상기 나노 복합체의 제조 장치는 분무부(13), 광 조사부(14) 및 용매 제거부(15)를 포함한다.

상기 분무부(13)는, 분무 장치 및 이송 기체 주입구를 포함할 수 있고, 예를 들어, 충돌 분무기(collison atomizer)일 수 있다. 상기 분무부(13)는 전자 공여 그룹(electron donating group)을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하여 액적을 형성할 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 분무 장치는 분무 노즐을 포함할 수 있다. 상기 분무 노즐은 상부 분무 노즐 및 하부 분무 노즐로 구성될 수 있다. 상기 노즐의 입경은 특별히 제한되지 않으나, 0.05 내지 2.0 mm일 수 있다. 상기 분무부에서는 상기 분무 노즐을 통해 분무부(13) 내로 상기 전자 공여 그룹(electron donating group)을 가지는 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 액적(droplet) 형태로 분무할 수 있다.

상기 분무부(13)는 전자 공여 그룹(electron donating group)을 가지는 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 혼합하여 용액을 제조하는 교반기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 교반기는 고속 교반이 가능한 장치면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 200 내지 4000 rpm 이며, 초음파를 인가하여 교반이 가능한 장치라면 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 이송 기체 주입부는, 상기 액적 이송부(17)에 이송 기체를 주입할 수 있다. 상기 이송 기체는 불활성 기체일 수 있고, 상기 불활성 기체는 질소(N₂), 헬륨(He), 네온(Ne) 및 아르곤(Ar) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 액적 이송부에 주입되는 기체의 압력은 1.5 기압 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기체의 압력이 1.5 기압을 초과하는 경우 재조립형 나노 소포체를 생성하기 곤란할 수 있고, 와류(Swirl)를 형성시켜 소포체 형성을 개선할 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 나노 복합체의 제조 장치는 방전부(11)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방전부(11)는, 방전에 의하여 금속 전극으로부터 금속 입자를 형성할 수 있다. 상기 방전부(11)는, 방전에 의해 금속 나노 입자를 발생시키기 위한 부분으로서, 소정 간격 이격되어 배치된 한 쌍의 도전성 로드 및 상기 도전성 로드에 각각 전압을 인가하는 전원부를 포함한다.

상기 방전은 스파크 방전 또는 아크 방전을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 예시에서, 상기 방전으로는 스파크 방전을 이용할 수 있다. 상기 「스파크 방전」은 상압에서 kV-mA 모드로 수행되는 고주파 방전 방식을 의미하고, 「아크 방전」은 진공에서 V-A 모드로 수행되는 고전류 방전 방식을 의미한다.

상기 한 쌍의 도전성 로드는 서로 이격 배치되어 간극(Gap)을 형성하고 있다. 예를 들면, 상기 방전부에서는 스파크 방전이 일어나며, 상기 스파크 방전에 의해 상기 도전성 로드 사이에서 국부적으로 발생되는 높은 온도에 의하여, 금속 나노입자가 발생된다. 본 출원에서 사용되는 용어 「간극」 또는 「간격」은 움직이거나 고정된 두 부품 사이의 틈을 의미하며, 예를 들어, 상기 간격은 각각 이격 배치 되어 있는 한 쌍의 도전성 로드 사이의 틈을 의미한다. 또한, 본 출원에서 용어 「나노」는 나노미터(nm) 단위의 크기로서, 예를 들면, 1 nm 내지 1000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원에서 용어 「나노입자」는 나노미터(nm) 단위의 크기, 예를 들면, 1nm 내지 1000 nm의 평균 입경을 갖는 입자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 도전성 로드를 구성하는 재료로는, 일함수 6.0 eV 이하의 금속이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 일함수 5.7 eV 이하, 5.0 eV 이하, 4.6 eV 이하 또는 4.2 eV 이하의 금속을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 예시에서, 상기 일 함수 6.0 eV 이하의 금속은 금, 바륨, 은, 카드뮴, 알루미늄, 베릴륨, 세륨, 세슘, 코발트, 크롬, 철, 갈륨, 가돌리늄, 하프늄, 수은, 인듐, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 납, 니오븀, 네오디뮴, 루비듐, 레늄, 로듐, 루테늄, 스칸듐, 주석, 스트론튬, 탄탈륨, 테르븀, 텔루륨, 토륨, 티타늄, 우라늄, 바나듐, 이트륨, 탈륨, 이테르븀, 아연, 팔라듐, 이리듐, 백금 및 지르코늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 금을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 도전성 로드 사이의 간격, 예를 들어, 상기 도전성 로드 간 최단거리인 전극 갭(electrode gap)은, 그 거리가 작을수록 점화요구 전압이 낮아지며, 그 거리가 커질수록 고전압이 요구된다. 또한, 전극 갭이 좁으면 스파크를 발생시키는데 필요한 전압은 감소하지만, 짧은 스파크는 혼합기에 점화 최소 에너지를 전달하여 실화를 일으킬 수 있으므로, 실험에 의해 적정 거리를 설정하는 것이 필요하다. 하나의 예시에서, 상기 전극 사이의 갭은, 0.1 내지 10 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 전원부는 상기 각각의 도전성 로드에 전압을 인가하기 위한 부분으로서, 하나의 예시에서 상기 전원부로부터 상기 도전성 로드에 인가되는 전압은 2 내지 5 kV이고, 전류량은 0.5 내지 5 mA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 전원부에서는 상기 한 쌍의 도전성 로드에 인가되는 전압을 일정하게 조절할 수 있다. 이에 따라, 금속 나노입자를 정량적으로 공급함으로써, 우수한 공급 안정성으로 금속 나노입자를 제조할 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 전원부는, 상기 도전성 로드에 고전압을 인가하기 위한 전기 회로를 포함할 수 있다. 상기 전기 회로는 고전압 공급원, 외부 커패시터 및 저항으로 구성된 정전압원(Constant High Voltage Source) 구조를 가지며, 다수의 저항, 다수의 커패시터 및 회로전류의 고속 스위칭이 가능한 회로를 이용하여 금속 나노입자의 크기를 조절할 수 있다.

비록 도시되지는 않았지만, 상기 본 출원의 나노 복합체의 제조장치는 캐리어 기체 공급 시스템(carrier air supply system) 등의 기체 공급 장치와, 질량유량계(mass flow controller, MFC) 등의 유량계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 기체 공급 장치 및 유량계에 의해 비활성 기체, 산소 또는 질소가 상기 도전성 로드 사이의 간격으로 정량적으로 공급될 수 있다.

상기 도전성 로드에 고전압을 인가하면 스파크 방전에 의해 상기 일함수 6.0 eV 이하의 금속이 기화 또는 입자화되어 상기 도전성 로드 사이의 간격을 통해 흐르는 비활성 기체, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기체 흐름을 따라 상기 분무부로 유출될 수 있다. 예를 들어, 상기 방전부의 도전성 로드로 전압이 인가되면, 방전부의 한 쌍의 도전성 로드 사이의 간격에서 상기 금속이 기화되며, 비활성 기체 또는 질소 등의 캐리어 기체를 따라 이동한 기화된 금속은, 상기 간격을 벗어남에 따라, 응축되고, 이에 따라, 금속 나노입자가 형성된다.

상기 방전부(11)로부터 생성되는 금속 나노입자의 입경은, 상기 비활성 기체 또는 질소의 유량 또는 유속에 따라, 수 나노미터 단위에서 수백 나노미터 단위로 광범위하게 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 공급되는 비활성 기체 또는 질소의 유량 또는 유속이 증가되는 경우, 상기 금속 나노입자의 농도가 감소됨에 따라 입자간의 응집현상 또한 감소하게 되며, 이러한 과정을 통해 금속 나노입자의 크기가 감소될 수 있다. 또한, 상기 금속 나노입자의 입경, 형상 및 밀도는, 인가전압, 주파수, 전류, 저항, 커패시턴스 값 등의 스파크 생성 조건; 상기 비활성 기체의 종류 및 유량; 또는 스파크 전극의 형상 등에 의해 변경될 수 있다.

상기 비활성 기체로는 아르곤(Ar) 또는 헬륨(He) 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 예시에서, 상기 나노 복합체의 제조 장치는 용액 생성부(12)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 용액 생성부(12)는 연속적으로 운영할 수 있다. 비록 도면에 도시되지는 않았지만, 상기 용액 생성부(12)는 폄프 및 교반기와 연결될 수 있다.

상기 펌프는 용매 또는 하나 이상의 전구체를 용액 생성부(12)에 정량적으로 공급할 수 있다. 상기 펌프는 상기 용매 또는 하나 이상의 전구체를 연속적 또는 간헐적으로 공급할 수 있는 장치면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 정량펌프 또는 실린지 펌프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 교반기는 상기 용매 또는 하나 이상의 전구체를 균일하게 혼합하여 용액을 제조할 수 있다. 상기 교반기는 교반이 가능한 장치면 특별히 제한되지 않으며, 교반 속도는 용매와 전구체 등의 종류, 점도 또는 함량에 따라 변경될 수 있고, 보다 균일한 교반을 위하여 초음파를 인가할 수도 있다.

상기 광 조사부(14)는, 상기 금속 나노 입자에 광을 조사하는 부분으로서, 상기 금속 나노 입자의 일함수보다 큰 광자 에너지를 가지는 광을 조사할 수 있다. 상기 광은 200 nm 이하 파장 범위의 자외선일 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 광 조사부(14)는 상기 금속 나노 입자에 광을 조사하는 광원을 포함할 수 있다. 상기 광원의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 금속의 일함수(work function)를 초과하는 광자 에너지를 보유하는 빛, 예를 들면, 200 nm 이하의 단파장을 가지는 빛을 조사할 수 있는 장치라면 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 고압 수은등, 초고압 수은등, 할로젠 램프, 블랙 라이트 램프, 마이크로파 여기 수은등, 각종 레이저 또는 X-선(X-ray) 등 공지된 광원이 이용될 수 있거나, 또는, 상온에서 비활성 기체의 흐름 중에 연 X-선(soft X-ray)의 조사를 통해 유사한 반응을 유도할 수도 있다. 200 nm 이하의 단파장을 가지는 빛을 조사할 수 있는 광원을 사용함으로써, 전이금속 나노 입자의 표면의 전자를 이탈시키고, 금속 표면의 전하를 양전하로 유도할 수 있다.

도 2는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치 중 용매 제거부를 나타낸 도면이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 상기 용매 제거부(15)는, 상기 액적 이송부로부터 이송된 액적의 용매를 제거하기 위한 부분으로서, 상기 용매 제거부(15)를 통과하여 상기 나노 복합체를 포함하는 액적으로부터 용매를 제거할 수 있다.

상기 용매 제거부(15)는 내부관(153) 및 관통 유로(152)를 포함할 수 있고, 내부에 흡착제(151)가 마련된 확산 건조기(diffusion dryer) 또는 디누더(denuder)일 수 있다.

상기 액적이 상기 관통 유로(152)를 통과하면서 상기 나노 복합체의 용매가 추출될 수 있다. 상기 관통 유로(152)는 상기 흡착제(151)를 포함하는 복수 개의 내부관들(153) 사이에 형성될 수 있다. 상기 내부관(153)은 스테인레스 메쉬와 같이 하나 이상의 중공(hollow)을 가지고 내구성 및 내열성을 가지는 것이라면 제한되지 않는다. 상기 내부관(153) 내부에 마련된 상기 흡착제(151)는 흡수-흡착 방식의 추출층(extraction bed)이 충진되어 있을 수 있고, 예를 들어, 활성탄소, 실리카겔, 제올라이트 또는 활성 알루미나 등과 같이 상업적으로 이용 가능한 흡착제 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

비록 도면에 도시되지는 않았지만, 상기 용매 제거 수단으로, 추출 수단을 포함할 수 있고, 상기 추출 수단은 유입부 및 유출부를 포함하는 추출 로(Furnace)일 수 있으며, 추출 용매가 상기 유입부를 통해 추출 수단으로 유입될 수 있고, 상기 유출부로는 추출 용매에 의해 용매가 추출된 혼합물, 즉 용매가 추출된 나노 복합체가 배출될 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 나노 복합체의 제조 장치는 액적 이송부(17)를 추가로 포함할 수 있다. 도 3은 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치의 전기장 인가부(18)가 형성되어 있는 액적 이송부(17)의 단면을 나타낸 도면이다.

도 3에 도시된 바와 같이, 상기 용매 제거부(15)는 액적 이송부(17)를 추가로 포함할 수 있고, 상기 액적 이송부(17)는 전기장 인가부(18)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전기장 인가부(18)는, 상기 용매 제거부(15)로부터 형성된 나노 복합체에 전기장을 인가하는 부분으로서, 상기 전기장 인가부(18)는 후술할 액적 이송부(17)의 중앙에서 가장자리 방향으로 전기장을 발생시키도록 탐침 또는 바늘과 같은 형태로 형성될 수 있고, 상기 전기장 인가부(18)가 형성되는 형태는 상기 액적 이송부(17)의 중앙에서 가장자리 방향으로 전기장을 발생시킬 수 있는 형태라면 제한되는 것은 아니다. 상기 전기장 인가부(18)에서 발생시키는 전기장의 세기는 -50 kV 내지 +50 kV일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형성된 액적과 동일한 극성의 전기장을 상기 액적에 인가함으로써 액적의 응집을 방지할 수 있다.

상기 액적 이송부(17)는, 상기 용매 제거부(18)로부터 형성된 나노 복합체를 이송시키는 부분으로서, 형성된 나노 복합체를 후술할 수집부(16)로 이송시킬 수 있다.

도 4는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치 중 수집부를 나타낸 도면이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 수집부(16)는 상기 용매 제거부(15)로부터 형성된 나노복합체를 수집하는 부분으로서, 상기 수집부(16)는 금속부 및 전압인가기를 포함할 수 있다.

상기 수집부(16)의 금속부(161)는 나노 복합체와 정전기적으로 결합할 수 있고, 상기 금속부(161)는 판 또는 봉과 같은 형태일 수 있다.

상기 전압인가기(162)는 상기 금속부(161)에 연결되어 있을 수 있다. 상기 금속부(161)와 나노 복합체가 결합할 수 있도록 상기 금속부(161)에 전압을 인가할 수 있고, 상기 전압은 - 10 내지 + 10 kV일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 나노 복합체가 양전하를 띄는 경우, 음의 전압을 인가하고, 상기 나노 복합체가 음전하를 띄는 경우, 양의 전압을 인가함으로써 나노 복합체를 수집할 수 있다.

본 출원은 또한, 나노 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법은 전술한 나노 복합체의 제조 장치를 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 따라, 상기 나노 복합체의 제조 장치에서 설명한 내용과 중복되는 내용은 생략하기로 한다. 예시적인 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법에 의하면, 액적 형성 단계, 나노 구조체 형성 단계 및 나노 복합체 생성 단계를 포함한다.

상기 액적 형성 단계는, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 분무부(13)에서 수행될 수 있으며, 하나의 예시에서, 상기 액적 형성 단계는 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하는 것을 포함한다.

상기 전자 공여 그룹은 치환되거나 비치환될 수 있는 C1 내지 C24 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 아민기, 이민기, 카르복실기, 인산기, 술폰산기 또는 이들의 조합을 의미하고, 화학 종에 대해 "치환된"은 바람직한 생성물 또는 방법을 방해하지 않는 기에 의해 치환된 것을 의미하며, 예를 들어 치환기는 알킬, 알콕시 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 전자 공여 그룹은 -NR₂, -NH₂, -OH, -OR, -NHC(=O)R, -OC(=O)R, -R, -CH=CH₂ 및 -CH=CR₂로 이루어진 그룹 선택되는 어느 하나를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제일 수 있고, 구체적으로 비이온성 계면활성제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 양이온성 계면활성제는 도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, 4급 암모늄 화합물, 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 키토산, 라우릴디메틸벤질암모늄 클로라이드, 아실 카르니틴 히드로클로라이드, 알킬피리디늄 할라이드, 세틸 피리디늄 클로라이드, 양이온성 지질, 폴리메틸메타크릴레이트 트리메틸암모늄 브로마이드, 술포늄 화합물, 폴리비닐피롤리돈-2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 디메틸 술페이트, 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드, 포스포늄 화합물, 4급 암모늄 화합물, 벤질-디(2-클로로에틸)에틸암모늄 브로마이드, 코코넛 트리메틸 암모늄 클로라이드, 코코넛 트리메틸 암모늄 브로마이드, 코코넛 메틸 디히드록시에틸 암모늄 클로라이드, 코코넛 메틸 디히드록시에틸 암모늄 브로마이드, 데실 트리에틸 암모늄 클로라이드, 데실 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드, 데실 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드 브로마이드, (C12-15)디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드, (C12-15)디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드 브로마이드, 코코넛 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드, 코코넛 디메틸 히드록시에틸 암모늄 브로마이드, 미리스틸 트리메틸 암모늄 메틸술페이트, 라우릴 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 라우릴 디메틸 벤질 암모늄 브로마이드, 라우릴 디메틸 (에테녹시)4 암모늄 클로라이드, 라우릴 디메틸 (에테녹시)4 암모늄 브로마이드, N-알킬 (C12-18)디메틸벤질 암모늄 클로라이드, N-알킬 (C14-18)디메틸-벤질 암모늄 클로라이드, N-테트라데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드 일수화물, 디메틸 디데실 암모늄 클로라이드, 트리메틸암모늄 할라이드 알킬-트리메틸암모늄 염, 디알킬-디메틸암모늄 염, 라우릴 트리메틸 암모늄 클로라이드, 에톡실화 알킬아미도알킬디알킬암모늄 염, 에톡실화 트리알킬 암모늄 염, 디알킬벤젠 디알킬암모늄 클로라이드, N-디데실디메틸 암모늄 클로라이드, N-테트라데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드 일수화물, N-알킬(C12-14) 디메틸 1-나프틸메틸 암모늄 클로라이드, 도데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 디알킬 벤젠알킬 암모늄클로라이드, 라우릴 트리메틸 암모늄 클로라이드, 알킬벤질 메틸 암모늄 클로라이드, 알킬 벤질 디메틸 암모늄브로마이드, C12 트리메틸 암모늄 브로마이드, C15 트리메틸 암모늄 브로마이드, C17 트리메틸 암모늄 브로마이드, 도데실벤질 트리에틸 암모늄 클로라이드, 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드, 디메틸 암모늄 클로라이드, 알킬디메틸암모늄 할로게니드, 트리세틸 메틸 암모늄 클로라이드, 데실트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실트리에틸암모늄 브로마이드, 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드, 메틸 트리옥틸암모늄 클로라이드, 폴리쿼트(POLYQUAT) 10, 테트라부틸암모늄 브로마이드, 벤질 트리메틸암모늄 브로마이드, 콜린 에스테르, 벤즈알코늄 클로라이드, 스테아르알코늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 브로마이드, 세틸 피리디늄 클로라이드, 4급화 폴리옥시에틸알킬아민의 할라이드 염, 미라폴(MIRAPOL), 알카쿼트(Alkaquat), 알킬 피리디늄 염, 아민, 아민 염, 이미드 아졸리늄 염, 양성자화 4급 아크릴아미드, 메틸화 4급 중합체, 양이온성 구아 검, 벤즈알코늄 클로라이드, 트리에탄올아민 및 폴옥사민으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 음이온성 계면활성제는 칼륨 라우레이트, 트리에탄올아민 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 도데실술페이트, 알킬 폴리옥시에틸렌 술페이트, 나트륨 알기네이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산 또는 그의 염, 글리세릴 에스테르, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 담즙산 또는 그의 염, 콜산, 데옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 글리코데옥시콜산, 알킬 술포네이트, 아릴 술포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 포스포네이트, 스테아르산 또는 그의 염, 칼슘 스테아레이트, 포스페이트, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 디옥틸술포숙시네이트, 나트륨 술포숙신산의 디알킬에스테르, 인지질 및 칼슘 카르복시메틸셀룰로즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비이온성 계면활성제는 트리톤계, SPAN 60, 폴리옥시에틸렌 지방(fatty) 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 피마 자유 유도체, 소르비탄 에스테르, 글리세릴 에스테르, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 에스테르, 세틸 알코올, 세토스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 아릴알킬폴리에테르 알코올, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴록사머, 폴락사민, 메틸셀룰로즈, 히드록시셀룰로즈, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시 프로필셀룰로즈, 히드록시프로필메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 비결정성 셀룰로즈, 다당류, 전분, 전분 유도체, 히드록시에틸 전분, 폴리비닐 알코올, 트리에탄올아민 스테아레이트, 아민 옥시드, 덱스트란, 글리세롤, 아카시아 검, 콜레스테롤, 트래거캔스, 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 트리톤계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약물은 항암제일 수 있고, 상기 항암제의 종류로는 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 이마티닙(imatinib), 시스플라틴(cisplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 저분자 약물 (small molecule drugs), 니트로겐 머스터드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약물은 분산액에 분산되어 있을 수 있고, 상기 분산액은 인체에 유해하지 않는 것이라면 가능하며, 생리식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 디클로로메탄, 디메틸설폭사이드 또는 에탄올 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약물은 용매 1 mL 당 0.1 mg 내지 3 mg으로 공급될 수 있으며, 예를 들어, 0.3 mg 내지 2.5 mg, 0.6 mg 내지 2 mg 또는 0.9 mg 내지 1.5 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 질병을 가지고 있는 환자의 상태에 따라 전술한 범위 내에서 알맞게 공급될 수 있다.

상기 금속 나노 입자는 일 함수가 2.0 eV 이상인 금속을 포함할 수 있고, 예를 들어, 3.0 eV 이상, 4.0 eV이상, 4.6 eV 이상 또는 5.0 eV 이상의 일함수를 가질 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 나노 입자의 일 함수를 전술한 범위로 제어함으로써, 상기 금속 나노 입자의 일 함수 이상의 광자 에너지를 보유하는 빛, 예를 들면, 자외선 등의 200 nm 이하의 단파장을 가지는 빛의 조사에 의해 상기 금속 표면의 전자를 이탈시키고, 금속 표면의 전하를 양전하로 유도할 수 있다. 또한, 200 nm 이하의 단파장을 가지는 자외선 조사 시에, 상기 계면활성제와 약물이 결합한 그룹의 음이온이 상기 양전하로 유도된 금속 나노 입자와 전기화학적으로 결합하며, 이에 따라, 정전기적으로 이온화된 금속 나노 입자에 유기기가 부착된 구조의 본 출원의 나노 입자를 자외선의 조사 등의 간단한 공정을 통해 형성할 수 있다. 본 출원에서 용어 「전기화학적 결합」은 공유결합, 이온결합 또는 물리적 흡착에 의한 결합을 의미한다.

상기 금속 나노 입자는 예를 들어, 금, 은, 철, 백금, 구리, 아연, 주석, 루테늄, 로듐, 가돌리늄, 디스프로슘, 망간, 티타늄, 팔라듐 및 크롬으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 금일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 나노 구조체 형성 단계는, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 광 조사부(14)에서 수행될 수 있으며, 하나의 예시에서, 상기 나노 구조체 형성 단계는, 상기 액적 형성 단계에서 형성된 액적에 광을 조사함으로써 상기 금속 나노 입자와 유기물을 재배열시켜 나노 구조체를 형성할 수 있다.

상기 나노 복합체 생성 단계는, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 용매 제거부(15)에서 수행될 수 있으며, 하나의 예시에서, 상기 나노 복합체 생성 단계는, 상기 나노 구조체 형성 단계에서 형성된 나노 구조체로부터 용매를 제거하여 나노 복합체를 생성할 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법은, 나노 복합체 수집 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 나노 복합체 수집 단계는, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 수집부(16)에서 수행될 수 있으며, 하나의 예시에서, 상기 나노 복합체 수집 단계는, 나노 복합체를 생성하는 단계 후에, 생성된 나노 복합체와 반대 극성의 전기장을 가하여 나노 복합체를 수집할 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법은, 상기 수집된 나노 복합체를 분산액에 분산시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 수집된 나노 복합체를 분산시키는 단계는, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 분산 장치에서 수행될 수 있으며, 상기 분산액은 인체에 유해하지 않는 것이라면 가능하며, 생리식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 디클로로메탄, 디메틸설폭사이드 또는 에탄올 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원은 또한, 나노 복합체에 관한 것이다. 본 출원의 나노 복합체는 전술한 나노 복합체의 제조 장치 및 나노 복합체의 제조 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 따라, 상기 나노 복합체의 제조 장치 및 나노 복합체의 제조 방법에서 설명한 내용과 중복되는 내용은 생략하기로 한다.

예시적인 본 출원의 나노 복합체에 의하면, 다수의 금속 나노 입자 및 전자 공여 그룹을 가지는 유기물을 포함할 수 있다.

상기 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물은 계면활성제, 지질, 약물 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 상기 유기물은 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 구현예인 나노 복합체는 전술한 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 나노 복합체에서 설명한 내용과 중복되는 내용은 생략하기로 한다.

본 출원의 또 다른 구현예인 나노 복합체에 따르면, 다수의 금(Au) 나노 입자, 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 계면활성제, 및 약물을 포함할 수 있고, 상기 전자 공여 그룹을 가지는 계면활성제 및 약물이 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 상기 나노 복합체에서 용어 「나노」는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 「나노 입자」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 입경을 갖는 입자를 의미할 수 있고, 예를 들어, 20 내지 200 nm의 평균입경을 갖는 입자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 나노 복합체는 디-스페이스(d-space) 값을 가질 수 있고, 본 출원에서 용어 「디-스페이스」는 상가 나노 복합체의 결정면 사이의 간격을 의미할 수 있다. 상기 디-스페이스는 고해상도 투과전자현미경(HR-TEM)으로 측정할 수 있고, 상기 디-스페이스 값은 0.20 내지 0.50 nm, 0.25 내지 0.40 nm 또는 0.27 내지 0.29 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 광 조사부에서 상기 분무부로부터 형성된 액적에 광을 조사함에 따라 상기 나노 구조체를 형성하는 경우, 상기 나노 복합체의 디-스페이스 값이 상기 금속 나노 입자의 디-스페이스 값보다 증가하는 방향으로 재배열이 일어날 수 있다.

상기 나노 복합체는 자외선-가시광선 분광기(UV-vis spectroscopy)로 측정하였을 경우, 광대역 흡수 피크를 가질 수 있고, 전술한 나노 복합체의 제조 장치의 광 조사부에서 광을 조사함에 따라 상기 금속 나노 입자와 상기 계면활성제가 반응하여 상기 계면활성제 단독보다 높은 광대역 흡수 피크를 나타낼 수 있다. 상기 광대역 흡수 피크의 범위는 350 내지 1,000 nm의 파장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

전술한 나노 복합체의 약물의 농도(함량)는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 1 내지 50 w/w%일 수 있다. 상기 약물의 농도가 1 w/w% 미만이면 약물 공급이 충분하지 않을 수 있고, 50 w/w% 초과하면 부작용을 유발시킬 수 있는 고농도 공급이 될 수 있다.

이하 실시예 및 비교예를 통하여 상기 기술한 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

금으로 이루어진 한쌍의 전극 로드를 이용하여 금 나노 소재를 제조하였다. 상기 금 나노 소재를 제조하기 위한 구체적인 조건은 하기와 같다. 금(Au-172561)으로 이루어진 한쌍의 전극 로드가 구비된 방전부에 공기를 주입시켰다. 질량유량계(MFC; Tylan, USA)를 통하여 상기 공기의 유량을 0.9L/min로 제어하였다. 상기 전극 로드의 길이는 100 mm, 직경은 8 mm이었고, 전극의 간격은 1 mm이었다. 상기 전극에 전압 3.4kV(저항 0.5 MΩ, 전기 용량 4.7 nF, 전류 2.8 mA 및 주파수 580 Hz)를 인가하여 금 덩어리(Au agglomerates, Au AG)를 제조하였다.

트리톤 X-100(Triton X-100, T) 및 독소루비신(DOX, D)를 함유하는 용액을 콜리슨 분무기에 주입하고 질소 가스(99.999% purity; 3 L/min)를 이용하여 상기 용액을 연속적으로 운반한다. 분무기로부터 하이브리드 방울을 7.8 초 동안 185 nm 파장으로 광 조사(E = 6.2 eV, I = 0.14 J m-2 s-1; 3SC-9-A0, UVP, UK)시켜 Au AG 내의 1차 금 입자(일함수, 5.1 eV)로부터 전자를 방출시켰다. 양극으로 충전된 Au의 표면은 TD에서 음으로 대전된 그룹과 정전기적으로 공액 결합하여 TAuD 나노 복합체를 형성할 수 있는 Au AG의 재조립을 유도한다.

하이브리드 물방울은 실리카 겔 및 펠렛형 활성탄을 5 : 5의 질량비율로 혼합한 드누더(denuder)를 통과함으로써 용매를 추출하였다. 나노 복합체는 전기장 형성 구성(핀(+4 kV)-링(접지))에서 기체 양이온으로 충전된 후, 정전기적 인력을 통해 전기장(-2.7 kV/cm) 하에서 연마된 알루미늄 막대를 이용하여 수집하였다.

상기 알루미늄 수집 막대를 40 kHz로 5분 동안 초음파 처리하여 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 담그고 로드에서 나노 복합체를 방출하여 바이오 분석에 사용된 나노 복합체 분산액을 형성하였다.

비교예 1

실시예 1에서 독소루비신을 결합하지 않은 것을 제외하고 동일하게 제조하였다.

비교예 2

실시예 1에서 트리톤 X-100을 결합하지 않은 것을 제외하고 동일하게 제조하였다.

비교예 3

실시예 1에서 Au AG를 결합하지 않은 것을 제외하고 동일하게 제조하였다.

실험예 1 - 나노 복합체의 입자 특성 분석

도 5는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조 장치, 나노 복합체의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조한 나노 복합체를 모식적으로 나타낸 도면이다. 액적유동(flowing drop; FD) 반응을 통하여 하이브리드 물방울을 형성한 것은 denuder에서 용매 추출 전에 스캐닝 이동도 입자 사이저(SMPS, 3936, TSI, USA)를 사용하여 Au AGs, TD 물방울 및 나노 복합체(하이브리드 물방울)의 크기 분포를 측정하였다. 제조한 TAuD 나노 복합체, Au AG 및 TD의 크기 분포는 Au AG와 TD 사이의 정량적 상호 작용을 확인하기 위해 SMPS (3936, TSI, USA)를 사용하여 결정되었다. SMPS 측정을 위한 샘플링 및 외장의 유속은 각각 0.1 및 1.0 L/min이었고, 스캔 시간은 135 초였다. PBS에 분산된 TAuD 나노 복합체의 크기 분포를 측정하기 위해 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS; Nano-ZS, Malvern Instruments, UK)을 이용하였다.

Au AG는 압축 질소 가스가 흐르는 상태에서 1차 Au 입자의 브라운 운동(열 충돌 거동)에 의해 형성되었다. TD 방울은 또 다른 압축된 질소 가스를 주입함으로써 콜리슨 분무 장치에 의해 에탄올 TD 용액을 생성하였다. 하이브리드 물방울은 Au AG 함유 기체 흐름을 동작 유체로서 콜리슨 분무 장치 내로 직접 주입하여 제조되었으며, 여기서 AG는 하이브리드 물방울로 분무되도록 TD 용액에 혼입된다. 하이브리드 액적을 185 nm UV 조사 하에 관형 반응기로 향하게 하였다.

도 6은 확산 건조기를 통한 용매 추출 전에 185 nm UV 조사 하에서 Au AG(Au 막대의 스파크 용발), TD 액적(에탄올에 용해된 TD) 및 하이브리드 액적(Au AG를 포함하는 TD 액적)의 크기 분포도이다. 분포의 요약은 하기 표 1에 도시하였다.

MPS를 사용하여 측정한 AG, TD 및 하이브리드 액적의 크기 분포를 도 6에 도시하였다. 결과는 기하 평균 직경(GMD), 기하 표준 편차(GSD) 및 총 수 농도(TNC)로 표시하였다. AG와 TD의 경우에는 유의한 차이가 있었지만 하이브리드 물방울의 크기 또한 각각의 AG와 TD의 경우와 비슷한 단일 형태(AG와 TD의 분포 사이에 위치)를 나타냈다. 이 결과는 분무 과정에서 거의 모든 입자가 입자 방울 내에 포함되었다는 것을 의미한다. 따라서, 이 생성물은 후속의 FD 반응에 사용하기에 적합하였다. 흥미롭게도, 하이브리드 방울의 GSD는 TD 방울의 GSD보다 현저히 낮았으며 이는 분열화하는 동안 AG의 조각을 포함하여 광 조사 하에 TD 성분 (개재 및 후속 접합) AG와의 재조립에 의해 야기될 수 있다. 이 결과는 Au AG의 광 물리 화학적 재결합이 관능화된 Au 나노구조를 제조하기 위한 적절한 경로임을 시사한다.

	Au Ag	TD 액적	하이브리드 액적
GMD	45.2	153.2	80.1
GSD	1.49	1.92	1.57
TNC	4.4x10⁶	8.2x10⁶	6.7x10⁶

도 7은 확산 건조기를 통과 한 후 (a) Au AGs 및 (b) 실시예 1(TAuD)의 저배율 및 고배율 TEM 이미지이다. 두 샘플의 오른쪽 이미지는 면간 거리와 그럴듯한 미세 표면 구조(노란색, 금, 파랑, T 및 적색, D)를 포함한다. Au AG는 어두운 점(1 차 Au 입자, ~ 6 nm), TAuD 나노 복합체는 대조 요소, 어두운 점(재조립된 1 차 Au 입자, ~ 4 nm) 및 더 밝은 층(표지된 TD)으로 구성된다. TAuD의 경우 도트의 위치는 나노 복합체의 형태로 더 밝은 레이어 내에 한정된다.

재조립은 또한 투과 전자 현미경 (TEM, CM-100, FEI / Philips, USA) 측정으로 검증되었다. 제조된 나노 복합체는 TEM 그리드 포집 (Ineris, France)를 통해 탄소 코팅된 구리 그리드(Tedpella, USA)에서 직접 전처리없이 가스 단일 패스 구성으로 포집되었다. 그리드는 46-180 kV 범위의 증가하는 전압에서 TEM 분석용 홀더 (CM-100, FEI / Philips, USA)로 옮겼다.

도 7a에 도시된 바와 같이, 스파크 박리에 기인하는 입자는 기체 유동에서의 현탁 중에 브라운 운동에 의해 야기된 1차 Au 입자(측면 치수에서 약 6 nm)의 AGs이다. 400 AG의 이미지 분석에 따르면 단 하나의 격리된 AG의 평균 크기는 약 48.8 nm이며 SMPS 측정에서 얻은 크기와 일치한다. 1 차 입자는 구형이고 매끄러운 표면을 가지며 입자 사이에 명확한 공극이 있어 AG가 Au 입자만을 포함한다는 것을 의미한다. 고배율 TEM은 Miller (111) 면심 입방면에 해당하는 인접한 격자에 대해 0.233 nm의 d 간격을 보였다. 따라서 이 결과는 AG가 순수한 1 차 Au 입자로부터 파생되었다는 사실을 더 뒷받침한다. 도 7b에 도시된 바와 같이, TD를 이용한 AG 광 이온화 (Denuder에서 용매 추출 후)에서 입자 형태는 현저하게 변화하여 더 밝은 대비 층으로 단단히 둘러싸인 어두운 점으로 나타났다. 어둡고 가벼운 구성 요소는 각각 Au 입자와 TD에 해당하며, 서로 다른 물질(즉, 소포 구조) 내의 밀집 구조는 광 조사 동안 양전하를 띠는 Au 표면과 TD의 음으로 대전된 작용기 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 생길 수 있다. 400 나노 복합체의 이미지 분석에 따르면 고립된 TAuD 나노 복합체의 평균 측면 치수는 88.2 nm이며 이는 SMPS 측정과 일치한다.

도 8은 (a) PBS에 분산된 실시예 1(TAuD) 나노 복합체의 동적광산란(DLS)법을 이용한 입자 크기 분포, 제타 전위 및 (b) TD를 포함하는 UV-vis 스펙트럼 그래프이다.

나노 복합체의 수력학적 크기 분포를 측정하기 위해 수집된 나노 복합체를 0.01M, pH 7.4인 인산염 완충 식염수(PBS)에 분산시킨 후 동적 광산란(DLS, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK)법을 이용하였다. 평균 크기는 SMPS 측정에서 얻은 것보다 큰 138 nm (도 8a) 인 것으로 판명되었다. 이 두 가지 방법의 크기 차이는 DLS 측정에 사용된 NV 농도가 상당히 높기 때문에 발생했을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 평균 유체 역학 크기는 ≤200 nm이었으며, 이는 전반적인 양의 포텐셜 (+7.8 mV) 때문일 것이다. 따라서, 제조된 NV는 창상 및 비특이적 흡착성 엔도 시토시스를 통한 후속 내재화를 통해 종양 조직으로의 향상된 투과성 및 수동 축적에 적합하다. 고배율 이미지의 분석은 다양한 크기의 입자 (약 4 nm)와 d- 간격 (0.288 nm)을 나타내었으며, 그 결과는 AG를 TAuD NVs로 재조합하는 광 조사 동안 TD의 다른 원소에 의한 Au 입자 표면상의 Au 원자의 치환과 일치한다. PBS (도 8b, inset)에 분산된 가공 NV (도 8b)의 UV-vis (T60, PG Instruments, UK) 스펙트럼은 Au NP의 LSPR 효과에 기인할 수 있는 550 nm 부근에서 작은 피크를 보였다(흡수 파장, 520-530 nm). TD는 약 470nm에서만 흡수 피크를 나타내지만, NV는 광 조사 하에서 Au AG가 TD와 반응 한 후에 높은 광대역 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 이 결과는 하이브리드 액적의 1차 Au 입자의 재배열에 의해 야기되어 인접한 Au 입자의 입자 간 플라즈몬 결합이 촉진될 수 있다. 이 결과는 또한 theranostic 응용 프로그램에서 광대역 NIR 유발 사진 변환 활동의 타당성을 지적했다.

도 9는 다른 T 용액을 포함하는 재조립된 비교예 1(Tau)의 TEM 이미지이다. T 용액의 농도는 5.35 (0.5 vT/v·에탄올%), 10.70 (1.0 v/v%), 26.75 (2.5 v/v%) 및 53.50 (5.0 v/v%) mg·T/mL·에탄올이다. T 농도를 증가시키면 보다 세밀한 구성을 가정한 나노 복합체가 생성된다.

도 9에 도시된 바와 같이, TAu를 제조하기 위해 크기와 세포 독성의 원하지 않는 증가를 피하고 정의되지 않은 AGs에 느슨한 나노 소포체 구조의 형성을 방지하기 위해 2.5 v/v%(에탄올 중)의 T 농도를 선택했다.

도 10은 (a) 실시예 1(TAuD), Au 및 비교예 1(TAu)의 XPS Au 스펙트럼, (b) 실시예 1(TAuD), 비교예 1(TAu) 및 비교예 2(AuD의 FT-IR )스펙트럼, (c) 실시예 1(TAuD), 비교예 3(TD) 및 Au AG의 라만 스펙트럼 그래프이다. 삽입 그림은 유리 디스크에서 광학 현미경 시편을 측정용으로 보여주었다.

나노 복합체의 표면 화학은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; polytetrafluoroethylene) 기판(11807-47-N, Sartorius, Germany)에 나노 복합체를 증착 후 흡광도 모드 (1450 내지 2300 cm^- ¹)에서 퓨리에 변환 적외선(FT-IR, iS-10, Thermo Electron, USA)분석을 사용하여 평가하였다. Au AG와 TAuD 사이의 표면 구조의 차이는 XPS(Axis-HIS, Kratos Analytical, Japan)를 사용하여 확인하였다. 라만 분광법 (T64000, HORIBA Jobin Yvon, Japan)을 사용하여 금 표면에 대한 TD의 통합을 평가하였다. PBS 및 TD 단독으로 분산된 나노 복합체의 광 흡수 스펙트럼을 자외선-가시광선 분광법(UV-vis spectroscopy, T60, PG Instruments, UK)를 사용하여 측정하였다.

제조된 나노 복합체의 표면 화학을 분석하여 Au와 TD 사이의 광 조사에 의해 유도된 접합을 확인하였다. 도 10(a)에 도시된 바와 같이, Au 4f X선 광전자 분광법(XPS, K-Alpha, Thermo Scientific, USA)을 이용하여 측정한 Au AG 및 TAuD의 결과이다. AG는 89.2와 85.5 eV에서 각각 Au 4f₅ _/2와 Au 4f₇ _/2(spin-orbit splitting에서 3.7 eV로 분리)로 두 개의 뚜렷한 피크를 가지고 있다. 이러한 피크는 Au⁰의 피크와 일치한다. TAuD 샘플에 대한 유사한 데이터는 Au와 TD 사이의 전하 이동으로 인한 Au 4f₅ _/2 및 Au 4f₇ _/2에 대해 각각 2.6 및 2.3eV의 음의 시프트를 갖는 86.6 및 83.2eV(3.4eV에 의해 분리되고 Au³ ⁺에 상응함)였고, 이는 광 조사가 Au와 TD 사이의 정전기적 결합(electrostatic conjugation)을 초래하는 것을 의미한다.

도 10(b)에 나타난 바와 같이, 푸리에 변환 적외선 (FTIR, iS-10, Thermo Electron, USA) 분석에서, Au와 TD 사이의 접합은 TAu와 AuD를 TAuD와 비교하여 더 검증되었다. TAu 스펙트럼은 TAu에서 T의 방향족 C-C 신축 및 C-H- 변형 모드의 커플링에 해당하는 1512 cm^-1에서 특성 밴드를 나타냈다. 또한, 이 대역은 TAuD 스펙트럼에 존재하지만 AuD 스펙트럼에는 존재하지 않는다. AuD와 TAuD에서 약 1610cm^-1의 광대역은 DOX에서 N-H 그룹의 굽힘에 부여될 수 있어 TD가 광 유도 정전기적 결합에 의해 Au 표면에 성공적으로 결합되었음을 의미한다.

도 10(c)에 도시된 바와 같이, TAuD의 라만 스펙트럼은 1648 cm^-1에서 Au AG 및 TD 스펙트럼에 존재하지 않는 날카로운 피크를 보였다. 이 결과는 TAuD에서 Au 광 이온화에 의해 D의 라만 시그널(링 B의 C = O 그룹의 수소 결합에 해당)이 증가하는 것을 의미한다. 이러한 표면 화학 분석은 주변 조건 즉, 단순함, 친환경 및 연속 제조 플랫폼에서의 가스 유동에서 Au 입자를 재구성, 재조합 및 기능화하기 위한 광 이온화에 기초한 실현 가능한 과학적 가능성을 제공할 수 있다.

도 11은 실시예 1(TAuD)로부터 (a) pH 트리거링 (5.5 및 7.4) (24 시간) 및 (b) 근적외선(NIR) 트리거 (6 시간 및 808nm) (2시간 후 5 분간 조사) 약물(DOX, D)의 시험관 내 방출 프로파일에 관한 그래프이다.

TAuD 나노 복합체의 시험관 내 D의 방출은 ABS(pH 5.5, 0.14 M NaCl) 및 PBS(pH 7.4, 0.14 M NaCl)에서 평가하였다. TAuD 분산 샘플(1 ㎖, 1 mg/mL) (0.3 mg의 D에 상당) (MWCO, 4000-6000 Da) (Spectra/Por®, USA)을 투석백에 넣고 20 mL의 ABS(또는 PBS)가 들어있는 50 mL 튜브에 연속적으로 침지시키고, 37 ℃에서 분당 100 스트로크로 작동하는 수조 쉐이커(HST-205 SW, Hanbaek ST Co., Korea)에 넣었다. 방출 매질 (0.5 mL)의 분취액을 소정 시간 간격으로 샘플링한 다음, 동일한 부피의 새로운 매질로 보충하였다. 배지 중의 D 농도는 UV-vis spectrophotometry (U-2800, PerkinElmer, USA)를 사용하여 측정하였다. 레이저 조사 하에서 D 방출을 조사하기 위해 1 mL의 TAuD를 교반기(400 RPM)가 달린 바이알에 넣고 PBS로 3 mL로 희석한 다음 레이저로 5 분간 조사했다. 일정 시간 간격으로 분취량 (0.5 mL)을 취하여 D 농도를 측정하기 위해 분석하였다.

도 11(a)에 도시된 바와 같이, 화학-광열 요법으로 암 조직에 가공된 나노 복합체의 다기능 응용을 선택했기 때문에, 나노 복합체의 약물 방출 특성은 다양한 완충 용액(PBS, pH 7.4; 아세테이트-완충된 염수 (ABS), pH 5.5)로 세척하고 상이한 근적외선 파장(808 및 632nm)에 노출시켰다. 나노 복합체로부터 D의 방출은 pH 7.4인 PBS에서 50 % 및 pH 5.5인 ABS에서 70 % 누출되었음을 바탕으로 24 시간 이상에서 나노 복합체로부터의 D의 방출 (TAuD에서 31.6±5.5 w/w%의 D 로딩 분획)이 pH 의존성인 것으로 확인하였다. pH 5.5에서 D(pKa ~ 8.3)의 보다 높은 수용해도는 보다 빠른 방출에 기여한 것으로 판단된다. 이 결과는 나노 복합체가 암 세포에 내재되어있는 엔도-리소좀(endo-lysosomal) 구획(pH 4.5-5.0)의 산성 환경과 매우 관련이 높다.

도 11(b)에 나타난 바와 같이, 근적외선 광에 의한 열 발생은 NIR (4W/cm²)에 5 분간 나노 복합체 노출 시 D의 방출이 급격히 증가한 것을 나타내며, 누적 D 방출은 16 %에서 약 60 %로 증가하는 것을 확인하였다.

도 12는 808 nm 근적외선(NIR) 조사에 따른 (a) 농도 의존(2.5 W/cm²) 및 (b) 6분 동안 비교예 1(TAu) 및 RPMI(대조군)의 강도-의존성 (150 μg/mL) 온도 상승 프로파일이다. 각 조건에 대한 온도 윤곽을 포함하며, 조사에 반응하여 레이저 빔 스폿 근처의 온도가 상당히 증가하였다.

도 13은 632 nm 근적외선(NIR) 조사에 따른 (a) 농도 의존(2.5 W/cm²) 및 (b) 6분 동안 비교예 1(TAu) 및 RPMI(대조군)의 강도-의존성 (150 μg/mL) 온도 상승 프로파일이다. 각 조건에 대한 온도 윤곽을 포함하며, 조사에 반응하여 레이저 빔 스폿 근처의 온도가 상당히 증가하였다.

도 12 및 도 13에 도시된 바와 같이, 근적외선 조사시의 광열 온도 상승을 조사하였다. 파장 사이의 유의한 차이가 없는 808 및 632 nm 파장에서 근적외선을 조사하였을 때, 열 발생은 농도 및 조사 강도에 의존적인 것으로 나타났다.

도 11 내지 도 13에서 나타난 결과는 본 출원에서 제작한 나노 복합체가 포토 트리거식 제어 방출 어플리케이션에 사용할 수 있음을 의미한다.

도 14는 (a) MDA-MB-231 및 (b) MCF-7 세포에서의 단일 D를 포함하는 근적외선(NIR) 조사의 부재 및 존재 하에서의 비교예 1(TAu) 및 실시예 1(TAuD)에 대한 생체 외 항암 효과 그래프, (c) MDA-MB-231 및 MCF 세포에서의 쿠마린-6에 로딩된 비교예 1(TAu)의 CLSM 이미지, (d) MDA-MB-231 및 (e) MCF-7 세포에 의한 실시예 1(TAuD)의 세포 흡수를 보여주는 FACS 분석 결과, (f) NIR (808 nm) 조사의 유무에 따른 비교예 1(TAu)로 처리된 세포에서의 p53의 웨스턴 블랏 분석 결과이다.

도 14(a) 및 (b)에 도시된 바와 같이, 시험관 내 항암 효과는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) assay를 사용하여 24 시간 배양한 후 MDA-MB-231(도 14(a)) 및 MCF-7(도 14(b)) 세포에서 세포 독성을 측정하여 평가하였다.

48 시간 인큐베이션 후 NIR 조사 유무에 따른 MTT 분석을 이용하여 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포(즉, 인간 유방 선암종)에서 단일 D, TAu 및 TAuD 샘플에 대한 세포 독성 측정을 측정하였다. 즉, 웰당 1 × 10⁴ 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Becton Dickinson Labware, USA)에 코팅(도말)하고, 세포 부착을 위해 12 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 세포를 세척하고, 100 μL MTT 용액(1.25 mg/mL)을 각 웰에 첨가하였다. 4 시간 동안 어두운 곳에서 배양하는 동안 살아있는 세포는 MTT 대사 산물인 보라색의 포르마잔 결정체를 생성하였다. 상기 결정을 100 ㎕ 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시키고, 마이크로 플레이트 판독기(Multiskan EX, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존력은 A_sample/A_control×100 %로 계산하였으며, 여기서 A는 570nm에서의 흡광도이다.

TAu로 처리된 세포의 생존율은 두 세포 유형 모두에서 75 % 이상이었으며, D 결합 전의 TAu는 생체 적합성을 나타냈다. T는 막 용해제 (membrane-lytic agent)로 알려져 있으나, 아교성 농도(<0.01 w/w%)로 존재한다. 광 조사 및 후속 용매 추출 하에서 Au로의 TD 혼입은 나노미터 공간 내에서 열적으로 안정한 비정질 T에 의하여 제한되었다. TAuD 투여 시 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 IC50 값은 각각 0.24 및 0.27 μg/mL이었다. 이 값은 단일 D의 값보다 유의하게 낮았으며, 이는 TAuD가 세포 흡수 및 D(MDA-MB-231: 0.48 ㎍/mL, MCF-7: 0.77 ㎍/mL)의 유지를 증가시키고, D의 대체된 전달자-매개 유출을 증가시키는 것을 의미한다. TAuD로 처리된 세포에 근적외선을 조사하는 경우, 두 세포 유형(MDA-MB-231: 0.13 ㎍/mL, MCF-7: 0.15 ㎍/mL) 모두에서 IC50 값이 더 감소했다. 이 결과는 고열로 유도된 파열 약물 방출, 화학 증감 및 방사선 조사 시의 열 손상으로 인한 것으로 유추할 수 있다.

도 14(c) 내지 도 14(e)에서 보여지는 바와 같이, TAu의 세포 흡착은 공 초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM, Leica Microsystems, Germany)(도 14(c)) 및 형광 활성 세포 선별(FACS, BD Biosciences, USA)을 사용하여 연구하였다(도 14(d) 및 도 14(e)).

CLSM(TCS SP2, Leica Microsystems, Germany)을 사용하여 세포에 의해 준비된 나노 복합체의 내부화를 관찰하였다. 2 mL 배지에서 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 5 x 10⁴ 세포/mL의 밀도로 12-웰 플레이트에서 커버 슬립 상에 시딩하였다. 세포를 24 시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 다음 5 μg/mL 쿠마린-6에 로딩된 TAu 나노 복합체와 100 ng LysoTracker Red를 각 웰에 첨가하였다. 10분 배양 및 후속 배지 제거 후, 커버 슬립을 PBS로 부드럽게 세척하고, 어두운 곳에서 4 % 파라포름알데히드 용액으로 고정한 후, 유리 슬라이드 상에 올려 놓고 글리세린으로 밀봉하였다. 세포 내 섭취를 확인하기 위해, 2 mL 배지에서 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포(1 × 10⁵)를 12-웰 플레이트에 시딩하였다. 12 시간 배양 후, 특정 시간 동안 TAuD와 함께 쿠마린-6에 로딩된 TAu 나노 복합체를 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리하여 수거하고 FACS 유동 세포 계측기(BD FACS Verse, BD Biosciences, USA)를 사용하여 유세포 분석을 위한 결합 완충액을 함유하는 1 mL PBS에 재현탁시켰다. 처리되지 않은 세포의 자동 형광은 내부 대조군으로 사용하였다.

쿠마린-6를 결합한 TAu의 녹색 형광 신호는 엔도시토시스를 통한 리소좀 흡수를 나타내는 빨간색 리소좀 염료와 함께 동위 원자화된다. D의 적색 형광은 비교적 약한 형광성 때문에 사용되지 않았으나, T의 존재 하에서 Au 1차 입자들 사이의 상호 작용 및/또는 응집 때문에 소지(quenching)에 의해 형광성이 일어날 수 있다. 세포 내 축적의 D는 FACS에 의해 확인되었으며, 섭취가 시간 의존적임을 나타낸다.

도 14(f)에 도시된 바와 같이, NIR 조사에 의해 유발된 괴사를 통한 세포 사멸을 조사하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 사용하였고, 세포 사멸 표지자 p53의 발현을 측정하였다.

웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)를 시행하여 세포 사멸 표지자 p53의 발현을 조사하였다. MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포(4 × 10⁵ 세포)를 12 시간 동안 배양하고 TAu로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 수확하고, 용해된 세포로부터 단백질을 추출하고 소 혈청 알부민 단백질 검정 키트를 사용하여 정량하였다. 단백질을 10 % 폴리아크릴아미드 상에서 분리하고 PVDF 멤브레인(Millipore, USA)에 전기 영동으로 전달하였다. 1 % Tween 20(TBST; tris buffered saline with Tween)이 함유된 트리스 완충 식염수에서 막을 5 % 탈지유로 막은 후, 막을 12 시간 동안 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)와 p53(Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)에 대한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 배양하였다. 막을 TBST로 세척하고, 2차 항체와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 단백질은 발광 이미지 분석기(LAS-4000 mini, Fujifilm, Japan)에서 향상된 화학 발광제를 사용하여 검출하였다.

이 결과는 광열 효과에 의한 세포 사멸이 기존의 화학 요법 또는 방사선 치료에서보다 즉각적이기 때문에 NIR에 노출된 TAu 처리 세포에서 심각한 괴사가 발생하지 않음을 나타낸다. 따라서, 본 출원에서 제조한 나노 복합체는 NIR 조사(강도 및 지속 시간) 및 광 유도자(예: 나노 복합체)의 투여량 및 조성을 조절함으로써 조절되는 응고 괴사보다 세포 사멸의 주된 구성에서 효율적인 항암 화학-광열 요법을 제공할 수 있고, 염증 반응을 최소화할 수 있다.

도 15는 (i) 대조군, (ii) 단일 D군, (iii) 비교예 1(TAu)+ 근적외선(NIR)군 및 (iv) 실시예 1(TAuD)+세포군으로 처리한 후 MCF-7(상부) 및 MDA-MB-231(하부) 세포의 세포 사멸을 결정하기 위한 FACS 결과이다.

세포 사멸 전, 세포 사멸, 괴사 및 살아있는 세포를 포함하는 분수를 비교하려면 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포 (2×10⁵)를 포함하는 2 mL 미디어는 12-웰 플레이트에 배치하고 12 시간 배향하였다. TAuD 나노 복합체 및 단일 D는 근적외선 조사의 존재 또는 부재 하에 첨가되었다. 48 시간 후, 세포를 긁어서 수확하고, PBS로 세척하고, 결합 완충액과 혼합 하였다. PE-아넥신-V와 7-아미노 액티노마이신 D를 각각 2 μL씩 첨가하고 부드럽게 섞은 후 어두운 곳에서 10 분간 방치하였다. 처리된 세포를 최종적으로 1mL의 최종 부피로 결합 완충액으로 희석하고, FACS 유동 세포 계측기 (BD FACS Verse, BD Bioscience, USA)를 사용하여 세포 사멸을 분석하였다.

도 15에 도시된 바와 같이, 상이한 세포 사멸 단게에서 TAuD로 처리한 세포(NIR 조사의 유무)의 분획을 측정함으로써 확인하였다. TAuD와 함께 배양한 후, 초기 및 후기 세포 사멸 단계에서 세포의 비율은 단일 D로 처리한 세포의 비율보다 현저히 더 큰 것을 확인하였다. 이러한 비율은 두 세포 유형에서 근적외선 조사에 따라 더 증가하는 것을 확인하였다.

도 16은 생존/사망 분석에서의 역 형광 현미경 이미지이다. 표시된 이미지는 NIR 조사(4 W/cm²) 후 5 분 동안 살아있는 세포(녹색, calcein-AM으로 염색됨) 및 죽은 세포(EthD-1로 염색됨)를 나타낸다. 점선은 조사 영역을 구분한다.

MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포(3 x 10⁵ in 2 mL)를 12-well dish에 깔고 세포 부착을 위해 밤새 배양했다. 0.1mg TAu의 첨가 후, 세포를 3 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 레이저 초점(spot size, 2mm) 아래 14 cm에 놓고 4 W/cm², 3분 동안 조사하였다. PBS를 제거한 후, 세포를 새로운 배지로 보충하고 3시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포는 PBS에서 2 μm의 calcein-AM(생존 세포, 녹색 형광)과 EthD-1(죽은 세포, 붉은 형광)으로 염색하고 역 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

NIR 조사(빔 직경 약 2mm, 4W/cm²)에 노출된 TAu를 처리한 MDA-MB-231 세포에서 생존/사망 분석을 수행하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 광선 노출 영역은 TAu로 처리한 세포에서 세포 사멸을 보였으나, NIR 노출이 없는 대조군(NIR 단독) 또는 TAu를 처리한 세포에서는 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 광열 세포 사멸이 부위 특수성이 있음을 의미한다.

도 17는 세포주기 분석을 측정한 광학 현미경 이미지이다. MDA-MB-231 세포에서의 세포 시계 표지는 (a) 대조군, (b) 단일 D, (c) 실시예 1(TAuD)와 함께 24시간 인큐베이션한 후에 수행하였다.

단일 D 및 TAuD 나노 복합체로 처리한 후의 MDA-MB-231 세포의 주요 세포주기 단계를 세포 시계 분석법(Biocolor Ltd., UK)을 사용하여 분석하였다. 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트 (2×10⁵ 세포/웰) 상에 접종하고 밤새 배양하여 세포 부착을 허용하였다. 그런 다음 세포를 0.1 μg/mL 단일 D 또는 TAuD(동등 농도)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하고, 새로운 배지로 보충하고, 150 μL 세포 시계 염료 시약을 첨가하였다. 1시간 후 세포를 세척하고 광학 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Japan)을 사용하여 영상을 얻었다. G2/M, S 및 G0/G1 단계의 세포는 진한 파란색, 녹색 및 황색으로 각각 색 변화를 나타냈다. 각 단계의 컬러 픽셀은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 사진으로 정량화하였다.

단일 D 및 TAuD 처리 후 MDA-MB-231 세포의 세포주기 분석은 산화 환원 염료를 사용하여 수행하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, 대부분의 대조군 세포는 S 및 G0/G1 단계에 있었고, 단일 D 처리는 세포의 53 %에서 G2/M 성장 정지를 유도하였다. TAuD 처리된 세포 중 67 %는 G2/M 체크 포인트에 도달하였다. 이러한 관찰은 엔도-리소좀에서 TAuD 내재화 증가 및 세포막 전달체를 통한 D 유출의 감소와 함께 핵으로의 D 방출로 이어질 수 있다.

도 18은 생체 내 항 종양 평가에 관한 것으로서, 단일 D를 포함하여 근적외선(NIR) 조사의 유무에 따른 비교예 1(TAu) 및 실시예 1(TAuD)에 대한 이종 이식 쥐를 지닌 MDA-MB-231의 (a) 종양 성장 및 (b) 중량-변화 프로파일 그래프 및 (c) 주입 후 24 시간 동안 안락사된 쥐에서 채취한 주요 장기[간(i), 폐(ii), 심장(iii), 비장(iv) 및 신장(v)]와 종양(vi)에 대한 Cy5.5 단독(중간) 및 Cy5.5와 결합한 비교예 1(TAu)(우측)의 생체 외 형광 이미지이다.

MDA-MB-231 이종 이식 종양은 코닝 Matrigel 매트릭스와 혼합된 1×10⁷ MDA-MB-231 세포의 피하 주사에 의해 6 주된 암컷 BALB/c 누드 마우스에서 생성하였다. 종양이 대략 100 mm³의 부피에 도달했을 때, 쥐를 4 내지 6 마리씩 5 개의 그룹으로 나누었다. 이 그룹들 중 4개 그룹은 자유 D (식염수), TAu (근적외선 조사), 또는 TAuD (근적외선 조사 여부와 상관없이)의 정맥 내 투여를 받았다. 샘플은 체중 kg 당 5 mg 약물에 상응하는 용량으로 투여하였다. 마우스를 주사 후 24 시간에 피부를 통해 NIR에 3 W/cm²의 세기로 3분 동안 노출시켰다. 종양의 크기는 디지털 캘리퍼스로 측정하였고 종양의 부피는 체적=1/2×(최장 치수)×(최단 치수)로 계산하였다. 모든 동물 취급 절차는 영남대학교의 기관 동물 윤리위원회의 승인을 받은 절차에 따라 수행되었다.

도 18(a)에 도시된 바와 같이, NIR 조사에 의한 TAu 및 TAuD의 항 종양 효능을 MDA-MB-231 보유 암컷 BALB/c 누드 마우스를 사용하여 생체 내에서 조사하였다. 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 단일 D 또는 TAu 또는 TAuD로 처리하여 NIR을 조사한 쥐는 실험 기간이 끝날 때 종양 체적이 현저하게 감소하였다. TAu로 치료하고 NIR을 조사한 쥐는 또한 고열 유도로 인한 중요한 종양 퇴행을 나타냈다.

도 18(b)에 도시된 바와 같이, 체중 변화 프로파일은 TAuD 치료가 치료의 마지막까지 생쥐의 체중에 유의한 변화를 유발하지 않았으나, D 단일 치료는 치료 7 일부터 체중 감소를 유도하였다. 이는 TAuD 치료가 D와 관련하여 유의한 전신성 세포 독성을 유도하지 않는다는 것을 의미한다.

도 18(c)에 도시된 바와 같이, 주입 후 24 시간 후의 TAu 생체 분포를 생체 외 형광 영상(FOBI, NeoScience Co., Ltd, Korea)을 사용하여 평가하였다.

MDA-MB-231 이종 이식 BALB/c 마우스에서의 TAu의 생체 내 분포는 형광 생체 내 이미징 시스템(FOBITM, Neoscience, Korea)을 사용하여 조사하였다. 이종 이식 쥐에 Cy5.5를 결합한 TAu를 정맥 내에 주사 하였다. 24시간 후, CO₂ 질식으로 생쥐를 희생시켰다. 종양 및 주요 장기를 절제하고 적색 채널에서 FOBITM을 사용하여 스캔하였다. 형광 세기는 NEOimage 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

TAu는 종양, 간, 폐 및 신장에 축적되는 것으로 확인하였으나, 심장 및 비장의 축적은 미미하였다. 종양에서의 Cy5.5를 결합한 TAu의 평균 형광 강도는 간에서의 두 배였으며, 이는 TAu 크기 분포에 의해 증가된 투과 및 보유로 인해 종양 조직에서의 TAu의 우선적 및 수동적 축적을 의미한다.

도 19는 생리 식염수 및 실시예 1(TAuD)로 전처리한 쥐의 종양에 근적외선(NIR) 조사하던 중 생체 내 광열 촬영한 이미지이다.

TAuD 투여 시, 디지털 열 화상 카메라 (Therm-App TH, Israel)를 사용하여 생체 내 광열 이미징을 수행하였다. 간단히 말하면, 생쥐는 식염수 또는 TAuD로 치료받았다. 24 시간 후, 종양을 NIR 조사 (4.0 W/cm²)에 최대 5분 동안 노출시켰다. 그런 다음 디지털 이미징을 수행하여 치료의 광열 효과를 결정하였다.

도 19에 도시된 바와 같이, MDA-MB-231을 갖는 이종 이식 쥐에서 TAuD 치료의 광열 효과를 조사하기 위해 생체 내 이미징을 수행하였다. 꼬리 정맥을 통한 주사 후 24시간에, 종양을 NIR 조사 (4.0 W/cm₂)에 최대 5분 동안 노출시켰다. 생리 식염수로 처리한 쥐에서는 유의한 열 상승이 발생하지 않았다. TAuD로 치료한 쥐는 초점 영역에서 34.8 ℃에서 43.4 ℃로 상당한 열 상승을 보였다. NIR에 노출되지 않은 신체 부위에서 명백한 온도 변화는 관찰되지 않았다. 근적외선 빛은 생물체에서 수 밀리미터의 깊이까지만 침투할 수 있으나, TAuD에 의한 종양의 효과적인 타겟팅으로 인하여 명백한 항암 효과를 나타낸다.

도 20은 T 대신에 지질 분자 LAu를 사용하여 상이한 유형의 나노 복합체를 제조하는 다른 조합물로서, (a) 물방울 낙하(FD) 반응으로부터 LAu의 저배율 및 고배율 TEM 이미지, (b) LAu의 광열 활성을 확인하기 위한 LAuD로부터 근적외선(NIR)(632 및 808 nm, 5 분)-트리거 D의 방출 프로파일 및 (c) 제거된 DNA 및 시판되는 리포펙타민과 비교하여 LAu 즉, LAuG와 결합된 pDNA(EGFP 포함)의 유전자 전달 성능 그래프이다. 삽입은 LAuG와 24 시간 및 48 시간 배양 한 HeLa 세포의 형광 이미지를 보여준다.

HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 4 시간 동안 2 mg pDNA (NV to pDNA, 10 : 1, w/w)를 함유한 복합 용액으로 처리하였다. 루시퍼 라제 활성은 루미노미터 (TD-20/20, Promega, US)로 측정하였다. 최종 루시퍼라제 활성은 단백질의 RLU/mg로서 나타내었다. 역 형광 현미경(DMI 4000 B, Leica Microsystems, Germany)을 사용하여 세포에서 녹색 형광 단백질 발현을 관찰하였다.

FD 반응을 통해 지질 (L-1118, Echelon Biosciences, USA) 분자 결합 Au(LAuD)와 유전자 복합체 LAu(LAuG)를 포함한 다른 나노 복합체를 제조하였다. 도 20(a)에서 보여지는 바와 같이, LAu의 모양을 보여 주며 어두운 부분(Au)이 더 밝은 대비 재료(L) 내에 갇혀 있음을 보여주며, FD 반응을 복잡한 시스템을 수정하지 않고 다양한 유형의 나노 복합체를 제조하도록 확장할 수 있음을 나타낸다.

도 20(b)에 도시된 바와 같이, NIR 트리거 D의 방출은 LAuD에 대해 테스트하였으며, 결과는 TAuD의 결과와 유사하다. HeLa 세포로의 LAu의 유전자 전달 성능은 FD 반응의 또 다른 치료에 대한 응용으로서, 루시퍼 라아제 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA(pDNA)를 사용하여 추가로 평가하였으며, 이를 도 20(c)에 도시하였다. 24시간 및 48시간 배양한 후, 세포[LA당 (relative luminescence unit; RLU)] 내로 24시간 및 48시간 동안 트랜스펙션한 LAu-pDNA 복합체 즉, LAuG의 양은 리포펙타민의 양과 비교할 만하고 제거된 DNA의 양보다 훨씬 컸다. EGFP를 포함하는 pDNA의 유전자 전달 수행은 제거된 DNA및 시판되는 리포펙타민과 비교하여 LAu 즉, LAuG와 복합체를 형성하였다. 도 20(c)의 상단 이미지는 유전자 전달 성능을 추가로 확인하는 24시간 및 48시간 배양 후 해당 형광 이미지(EGFP 발현에서 파생됨)를 보여준다. LAu를 이용한 NIR 트리거 D 방출 및 유전자 전달의 결과는 FD 반응의 잠재력을 증명하였다. 따라서, 다양한 구성 요소를 갖는 나노 복합체는 광범위한 나노 의학 응용 분야에 대해 효율적으로 제조될 수 있다.

11: 방전부
12: 용액 생성부
13: 분무부
14: 광 조사부
15: 용매 제거부
151: 흡착제
152: 관통 유로
153: 내부관
16: 수집부
161: 금속부
162: 전압인가기
17: 액적 이송부
18: 전기장 인가부

Claims

전자 공여 그룹(electron donating group)을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하여 액적을 형성하는 분무부;
상기 분무부로부터 형성된 액적에 광을 조사하여 상기 금속 나노입자와 유기물을 재배열시켜 나노 구조체를 형성하는 광 조사부; 및
상기 광 조사부로부터 형성된 나노 구조체로부터 용매를 제거하여 나노 복합체를 생성하는 용매 제거부를 포함하는 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 분무부는 충돌 분무기(collison atomizer)인 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 분무부는 이송 기체 주입구를 포함하는 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 방전에 의하여 금속 전극으로부터 금속 입자를 형성하는 방전부를 추가로 포함하는 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 광 조사부는 금속 나노 입자의 일함수보다 큰 광자 에너지를 가지는 광을 조사하는 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 용매 제거부는 내부에 흡착제가 마련된 확산 건조기(diffusion dryer)인 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 용매 제거부로부터 형성된 나노 복합체에 전기장을 인가하는 전기장 인가부를 추가로 포함하는 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 전기장 인가부는 액적 이송부의 중앙부에서 가장자리 측으로 전기장을 발생시키도록 마련된 나노 복합체의 제조 장치.
제 1 항에 있어서, 용매 제거부로부터 형성된 나노 복합체를 수집하는 수집부를 추가로 포함하는 나노 복합체의 제조 장치.
전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하는 용액 및 금속 나노 입자 응집체를 분무하여 액적을 형성하는 단계;
상기 단계에서 형성된 액적에 광을 조사하여 상기 금속 나노입자와 유기물을 재배열시켜 나노 구조체를 형성하는 단계; 및
상기 단계에서 형성된 나노 구조체로부터 용매를 제거하여 나노 복합체를 생성하는 단계를 포함하는 나노 복합체 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 전자 공여 그룹은 -O^-, -OH, 에테르, 에스테르, 아마이드, 또는 아민인 나노 복합체의 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 전자 공여 그룹을 가지는 유기물은 계면활성제, 지질, 약물 또는 이들의 혼합물인 나노 복합체의 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 금속 나노 입자는 금(Au) 나노 입자인 나노 복합체의 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 나노 복합체를 생성하는 단계 후에, 생성된 나노 복합체와 반대 극성의 전기장을 가하여 나노 복합체를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 나노 복합체의 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 수집된 나노 복합체를 분산액에 분산시키는 단계를 추가로 포함하는 나노 복합체의 제조 방법.
다수의 금속 나노 입자 및 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 음전하로 하전된 유기물을 포함하고,
상기 유기물은 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있는 나노 복합체.
제 16 항에 있어서, 금속 나노입자는 금(Au) 나노 입자인 나노 복합체.
제 16 항에 있어서, 전자 공여 그룹을 가지는 유기물은 계면활성제, 지질, 약물 또는 이들의 혼합물인 나노 복합체.
다수의 금(Au) 나노 입자, 전자 공여 그룹을 가지거나 또는 또는 음전하로 하전된 계면활성제, 및 약물을 포함하고,
상기 계면활성제 및 약물이 금속 나노 입자 사이에 정전기적으로 배열되어 있는 나노 복합체.
제 19 항에 있어서, 나노 복합체의 평균 입경은 20 내지 200 nm인 나노 복합체.
제 19 항에 있어서, 고해상도 투과전자현미경으로 측정한(HRTEM) 나노 복합체의 디-스페이스(d-space) 값은 0.20 내지 0.50 nm인 나노 복합체.
제 19 항에 있어서, 자외선/가시광선분광기(UV-vis spectroscopy)로 측정시 나노복합체는 350 내지 800 nm의 파장에서 광대역 흡수 피크를 가지는 나노 복합체.
제 19 항에 있어서, 약물의 농도(함량)은 1 내지 50 w/w%인 나노 복합체.