KR20190030691A

KR20190030691A - 위험 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 옥사진 유도체

Info

Publication number: KR20190030691A
Application number: KR1020197001453A
Authority: KR
Inventors: 크리스티나 로페즈-로페즈; 울프 노이만
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2019-03-22
Also published as: CN109475562A; EP3487504A1; IL264040A; MA45719A; AU2017298651A1; SG11201811022TA; BR112019000902A2; MX2019000834A; CA3028629A1; US20200345746A1; JP2019524743A; JOP20190003A1; US20180036315A1; TW201805004A; CL2019000122A1; WO2018015868A1; RU2019101210A; PH12018502703A1

Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 옥사진 유도체 BACE-1 억제제 및 이러한 옥사진 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 특히, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유한다.

Description

위험 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 옥사진 유도체

본 발명은 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 옥사진 유도체, 및 이러한 옥사진 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며; 특히, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유한다.

알츠하이머병(AD)은 진행성 기억상실, 치매 및 궁극적으로는 전반적인 인지기능 손상 및 사망을 야기하는 전 세계적으로 가장 보편적인 신경 장애 및 가장 흔한 연령 관련 약화 질환 중 하나이다. 현재, 이용 가능한 유일한 약리학적 요법은 증상 약물, 예컨대 콜린에스테라제 억제제 또는 AD의 2차 행동 증상을 제어하기 위해 사용되는 다른 약물이다. AD 병원성 과정 단계를 표적으로 한 연구 치료에는 아밀로이드-β(Aβ) 종의 생성, 축적 또는 독성 후유증을 저해하기 위해 의도된 치료법이 포함된다(문헌[Kramp VP, Herrling P, 2011]). (1) Aβ에 대한 능동적 또는 수동적 면역요법에 의한 아밀로이드 제거의 증대; (2) 베타-부위-APP 절단 효소-1(BACE-1, 아밀로이드 전구체 단백질[APP]의 가공에 관여하는 효소)의 억제를 통한 생성 저하에 의한 Aβ 저하를 표적으로 한 전략이 잠재적 치료 가능성이 있다.

질병의 치매 단계를 표적으로 한 최근의 임상 시험에서의 동물 데이터 및 제한된 이점을 기반으로 하여, Aβ-저하 치료가 전임상 단계에서 AD의 진행을 예방하거나 지연시키는 데 가장 효과적일 것이라는 확신이 증가하고 있다. 이러한 접근법은 참여자들이 섬유성 Aβ의 정체기, 타우(신경섬유) 병리의 광범위한 출현 및 비가역적인 시냅스 또는 신경 손실 전의 증상 및 질병이 발병하기 전 또는 매우 초기 단계에서 치료될 수 있도록 한다.

아포지질단백질 E(ApoE4) 유전자의 ε4 대립유전자는 알츠하이머병(AD)의 주요 위험 인자이다. APOE 유전자는 3개의 다형성 대립유전자 ε2, ε3 및 ε4에 존재하며 ε3이 가장 빈번하다. APOE 이소형은 Aβ 제거, 응집 및 침착에 상이한 영향을 준다: ε2는 예방적일 것으로 보이나 ε4 보인자는 병리가 증대되고, 연령 의존적 인지기능 쇠퇴가 가속화된다(검토를 위해 문헌[Liu CC et al., 2013] 참조).

인간 ApoE는 19번 염색체(유전자 APOE, Uniprot P02649, 18개의 아미노산의 프로-펩타이드를 포함하여 317개의 아미노산에 대한 유전자 코드)에 위치하고, 성숙한 형태는 299개의 아미노산으로 이루어지며, 가요성 링커에 의해 연결된 2개의 개별적인 N 말단 및 C 말단 도메인을 가진다. N 말단 도메인은 수용체 결합을 위한 결합 도메인(아미노산 136 내지 150)을 함유하며, 지질 결합 도메인(아미노산 240 내지 260)은 C 말단 부분에 위치한다. 인간에서 3개의 주요 이소형(apoE2, -3 및 -4)이 공지되어 있으며, (위치 112에 Cys가 존재하고, 위치 158에 Arg이 존재하는) ApoE3의 대립유전자 빈도는 인간에서 대략 50% 내지 90%이다. 인간에서 (위치 112 및 158에 Cys가 존재하는) ApoE2는 1% 내지 5%의 대립유전자 빈도를 나타내며, (위치 112 및 158에 Arg이 존재하는) ApoE4는 5% 내지 35%의 대립유전자 빈도를 나타낸다. ApoE3 및 4는 LDL 수용체와 고 친화도로 결합하며, ApoE2(Cys-158로 인함)는 단지 저 친화도를 갖는다.

ApoE4 동형접합체는 일반 인구의 약 2% 내지 3%를 차지하는 것으로 추정되고, 다른 APOE 유전자형을 가진 사람들보다 AD 증상의 발병 위험이 훨씬 더 높으며, 발병 당시의 평균 연령은 68세이다(문헌[Corder EH et al., 1993]). 85세까지 증상이 발생한 AD의 평생 위험은 남성 동형접합체의 경우 51%, 여성 동형접합체의 경우 60% 내지 68% 정도로 높을 수 있다. 85세 ApoE4 이형접합체의 상응하는 위험 백분율은 ApoE3/4 유전자형을 보유하는 남성 및 여성의 경우 각각 23% 및 30%이고, ApoE2/4 유전자형을 보유하는 남성 및 여성의 경우 각각 20% 및 27%이다(문헌[Genin E et al., 2011]). ApoE4 유전자의 존재가 Aβ 제거, 응집 및 침착에 영향을 줌으로써 AD의 위험을 증대시킨다고 제의되었다(문헌[Liu CC et al., 2013]). ApoE4 이형접합체에서 뇌 아밀로이드 병리의 존재가 동형접합체와 유사한 AD의 임상 증상이 발생할 위험을 유의하게 증가시킬 것으로 예상된다.

본 명세서에서 "화합물 1"로 지칭되는 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드는 이전에 WO 2012/095469 A1에 기재된 바 있는 경구적으로 활성인 BACE 억제제이고, BACE-1의 경우 BACE-2보다 대략 3배의 선택성을 가지며, 적절한 표적외 결합 또는 활성을 갖지 않는다.

지금까지 현장에서의 높은 후퇴율과 실망감을 감안할 때(문헌[Cummings JL et al., 2014]), 실험적으로 질병을 개선하는 임의의 AD 요법이 위험 환자에 효과적인 것으로 입증될 것인지 여부에 대해서는 불확실성이 높다. 그러나, (i) 바람직하지 않은 부작용, 예를 들어 모발 탈색이 부재하는 ApoE4 트렌스제닉 마우스 및 인간 ApoE4 보인자에서의 Aβ 수준의 저하; (ii) APP23 마우스 모델에서 아밀로이드-β 침착의 감소; 및 특히, (iii) 기저 AD 병리에 대한 효과를 나타내는 뇌척수액에서 Aβ42/Aβ40의 비율의 증가 시, 본 명세서에서 화합물 1에 의해 입증된 높은 수준의 효과는 화합물 1이 AD의 임상 증상의 발병 위험이 있는 환자, 특히 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는 환자에서 AD의 예방에 효과적일 것임을 강하게 시사한다.

인지기능 무손상 ApoE4 동형접합체 환자 또는 인지기능 무손상 아밀로이드 양성 ApoE4 이형접합체 환자에서 AD의 예방에서의 화합물 1의 효과를 입증하기 위해 설계된 II/III기 임상 시험이 본 명세서에 기재된다. BACE 억제제 요법이 아밀로이드 침착의 다수의 잠재적 원인과 무관하게 아밀로이드 플라크 축적을 감소시키고/감소시키거나 예방할 것으로 예상되므로, 현재의 정보를 기반으로 하여 이렇게 제의된 임상 시험으로부터의 결과 및 본 명세서에 기재된 결과는 ApoE4 동형접합체 및 이형접합체 여부를 떠나, 위험 환자(예를 들어, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린(presenilin)-1 및 -2에 대한 유전자에 돌연변이를 보유하는 환자(문헌[O'Brien RJ, Wong PC, 2011]) 또는 다운 증후군 환자(문헌[Head E et al., 2012]))에서, AD에 대해 일반화될 수 있으며, 이에 적용 가능할 수 있다.

본 발명의 제1 양태에서, 이에 따라 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이 제공된다.

본 발명의 제2 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 제3 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 방법이 제공되며, 이러한 방법은 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료 유효량을 이러한 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제4 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 방법이 제공되며, 이러한 방법은 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 이러한 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제5 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도가 제공된다.

본 발명의 제6 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명의 제7 양태에서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 약제의 제조를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도가 제공된다.

도 1: 8주 동안 화합물 1 또는 NB-360으로 만성적으로 처리된 C57BL/6 마우스의 털 색깔 점수(평균 ± SEM)
도 2: 마지막 투여 후 8 μmol/kg 및 50 μmol/kg의 화합물 1로의 처리시 C57BL/6 마우스에서의 뇌 Aβ40의 감소(평균 ± SD, n=4/그룹)
도 3: APOE4-TR 수컷 및 암컷 마우스에서 전뇌 Aβ40 수준에 대한 화합물 1의 급성 투여의 효과(3개월령 내지 5개월령, 평균 ± SEM)
도 4: APOE4-TR 수컷 및 암컷 마우스에서 CSF Aβ40 수준에 대한 화합물 1의 급성 투여의 효과(3개월령 내지 5개월령)(평균 ± SEM)
도 5: APOE4-TR 수컷 및 암컷 마우스에서 CSF Aβ42 수준에 대한 화합물 1의 급성 투여의 효과(3개월령 내지 5개월령)(평균 ± SEM)
도 6: APOE4-TR 수컷 및 암컷 마우스에서의 화합물 1 급성 노출(3개월령 내지 5개월령, 평균 ± SD)
도 7: 뇌 PK/PD 관계(개별 데이터)
도 8: 뇌 PK/PD 관계(평균 ± SD)
도 9: 인간 대상체에서 다회의 상승적 경구 투여량 연구에서 2주 노출 후 CSF Aβ40 수준에 대한 화합물 1의 효과
도 10: 인간 대상체에서 CSF Aβ40 수준에 대한 화합물 1의 효과 - 3개월차(마지막 투여로부터 24시간 후)의 기준선으로부터의 변화%
도 11: Triton TX-100 추출 APP23 뇌에서의 Aβ40에 대한 화합물 1의 효과
도 12: Triton TX-100 추출 APP23 뇌에서의 Aβ42에 대한 화합물 1의 효과
도 13: Triton TX-100 추출 APP23 뇌에서의 sAPPα에 대한 화합물 1의 효과
도 14: Triton TX-100 추출 APP23 뇌에서의 sAPPβ(Swe)에 대한 화합물 1의 효과
도 15: APP23 마우스의 뇌척수액에서의 Aβ40에 대한 화합물 1 처리의 효과
도 16: 마우스에서 포름산 가용성 Aβ40에 대한 화합물 1의 효과(값은 평균 ± SEM임)
도 17: 마우스에서 포름산 가용성 Aβ42에 대한 화합물 1의 효과(값은 평균 ± SEM임)
도 18: 마우스에서 포름산 가용성 총 Aβ(40 + 42)에 대한 화합물 1의 효과(값은 평균 ± SEM임)
도 19: 마우스에서 포름산 가용성 Aβ42/40 비율에 대한 화합물 1의 효과(값은 평균 ± SEM임)
도 20: 플라크 조직학에 대한 화합물 1의 효과 - 소형 플라크의 수(총 면적으로 정규화된 데이터)
도 21: 플라크 조직학에 대한 화합물 1의 효과 - 중형 플라크의 수(총 면적으로 정규화된 데이터)
도 22: 플라크 조직학에 대한 화합물 1의 효과 - 대형 플라크의 수(총 면적으로 정규화된 데이터)
도 23: 플라크 조직학에 대한 화합물 1의 효과 - 총 플라크 면적(총 면적으로 정규화된 데이터)
도 24: 총 면적에 대해 정규화된 총 GFAP 양성 면적. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 25: 총 면적에 대해 정규화된 플라크 결합 GFAP 양성 면적. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 26: 총 면적에 대해 정규화된 비-플라크 결합 GFAP 양성 면적. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 27: 총 면적에 대해 정규화된 근위 GFAP 양성 면적. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 28: 총 면적에 대해 정규화된 원위 GFAP 양성 면적. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 29: 총 IBA1 양성 면적에 대한 화합물 1 처리의 효과. 샘플 면적에 의해 정규화된 별개의 미세아교세포 집합이 제시된다. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 30: 플라크 결합 IBA1 양성 면적에 대한 화합물 1 처리의 효과. 샘플 면적에 의해 정규화된 별개의 미세아교세포 집합이 제시된다. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 31: 비-플라크 결합 IBA1+ 면적에 대한 화합물 1 처리의 효과. 샘플 면적에 의해 정규화된 별개의 미세아교세포 집합이 제시된다. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 32: 근위 IBA1+ 면적에 대한 화합물 1 처리의 효과. 샘플 면적에 의해 정규화된 별개의 미세아교세포 집합이 제시된다. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 33: 원위 IBA1+ 면적에 대한 화합물 1 처리의 효과. 샘플 면적에 의해 정규화된 별개의 미세아교세포 집합이 제시된다. 평균 ± SEM으로 제시된다. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.
도 34: 건강한 대상체에서, 강한 CYP3A4 억제제 이트라코나졸 또는 강한 CYP3A4 유도제 리팜피신과 조합하여 제공된 경우 및 단독으로 제공된 경우, 화합물 1의 PK를 평가하기 위한 2 파트의 공개 표지 2기의 일정 순서의 연구의 설계.
도 35: 기준선에서 0.09 미만의 CSF Aβ42/Aβ40 비율을 갖는 고령의 건강한 ApoE4 비-보인자 및 ApoE4 보인자 대상체에서 화합물 1로의 처리에 대한 반응으로 CSF Aβ42/Aβ40 비율의 기준선으로부터의 변화 배수. 던네트 다중 비교 시험에 의해 비교를 수행하였다.

본 발명의 다양한 구현예가 본 명세서에 기재된다.

본 발명의 제1 양태의 일련의 A 구현예

구현예 A1: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A2: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 구현예 A1에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A3: 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고 유전적 소인은:

(i) 아밀로이드 전구체 단백질, 프레세닐린-1 또는 프레세닐린-2에 대한 유전자 내의 돌연변이; 또는

(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재

인, 구현예 A2에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A4: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 구현예 A3에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A5: 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 구현예 A4에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A6: 환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 구현예 A4에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A7: 환자는 아밀로이드-양성인, 구현예 A1 내지 A6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A8: 아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 구현예 A7에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A9: 환자는 60세 내지 75세인, 구현예 A3 내지 A8 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A10: 화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A11: 화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A12: 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A13: 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A14: 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A15: 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A16: 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A17: 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 A1 내지 A9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A18: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A19: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하고, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A20: 화합물은 유리 형태인, 구현예 A1 내지 A19 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물.

구현예 A21: 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 구현예 A1 내지 A20 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A22: 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 구현예 A1 내지 A20 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A23: CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제인, 구현예 A21 또는 A22에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

구현예 A24: CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제인, 구현예 A23에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.

본 발명의 제2 양태의 일련의 B 구현예

구현예 B1: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물.

구현예 B2: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 구현예 B1에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B3: 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고, 유전적 소인은:

(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재

인, 구현예 B2에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B4: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 구현예 B3에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B5: 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 구현예 B4에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B6: 환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 구현예 B4에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B7: 환자는 아밀로이드-양성인, 구현예 B1 내지 B6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B8: 아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 구현예 B7에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B9: 환자는 60세 내지 75세인, 구현예 B3 내지 B8 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B10: 화합물은 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B11: 화합물은 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B12: 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B13: 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B14: 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B15: 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B16: 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B17: 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 구현예 B1 내지 B9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B18: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 약제학적 조성물.

구현예 B19: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하며, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 약제학적 조성물.

구현예 B20: 화합물은 유리 형태인, 구현예 B1 내지 B19 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B21: 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 구현예 B1 내지 B20 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B22: 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 구현예 B1 내지 B20 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B23: CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제인, 구현예 B21 또는 B22에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

구현예 B24: CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제인, 구현예 B23에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물.

본 발명의 제3 양태의 일련의 C 구현예

구현예 C1: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 방법으로서, 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료 유효량을 이러한 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

구현예 C2: 구현예 C1에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 방법.

구현예 C3: 구현예 C2에 있어서, 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고, 유전적 소인은:

(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재

인, 방법.

구현예 C4: 구현예 C3에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 방법.

구현예 C5: 구현예 C4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 방법.

구현예 C6: 구현예 C4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 방법.

구현예 C7: 구현예 C1 내지 C6 중 어느 하나에 있어서, 환자는 아밀로이드-양성인, 방법.

구현예 C8: 구현예 C7에 있어서, 아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 방법.

구현예 C9: 구현예 C3 내지 C8 중 어느 하나에 있어서, 환자는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75세 이상인, 방법.

구현예 C10: 구현예 C3 내지 C8 중 어느 하나에 있어서, 환자는 60세 내지 75세인, 방법.

구현예 C11: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C12: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C13: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C14. 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80% 내지 99, 97, 95, 93, 90, 87, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 또는 50%의 범위에서 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C15. 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 적어도 80, 85, 90, 93, 95, 97, 또는 99%의 환자 또는 80, 85, 또는 90 내지 99, 97, 95, 또는 93%의 환자에서, 40% 내지 70%, 45% 내지 65%, 또는 50% 내지 60%, 또는 적어도 50%의 범위의 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C16. 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은, 적어도 80, 85, 90, 93, 95, 97, 또는 99%의 환자 또는 80, 85, 또는 90 내지 99, 97, 95, 또는 93%의 환자에서, 65 내지 95%, 75 내지 90%, 또는 80 내지 90%, 또는 적어도 80%의 범위의 CSF, 혈액 또는 혈장 중 Aβ 1 내지 40의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C17: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 5 mg/일 내지 10 mg/일; 10 mg/일 내지 15 mg/일; 15 mg/일 내지 20 mg/일; 20 mg/일 내지 25 mg/일; 25 mg/일 내지 30 mg/일; 30 mg/일 내지 35 mg/일; 35 mg/일 내지 40 mg/일; 45 mg/일 내지 50 mg/일; 50 mg/일 내지 55 mg/일; 55 mg/일 내지 60 mg/일; 60 mg/일 내지 100 mg/일; 100 mg/일 내지 200 mg/일; 200 mg/일 내지 300 mg/일; 15 mg/일 내지 85 mg/일; 50 mg/일 내지 85 mg/일; 15 mg/일 내지 300 mg/일; 또는 50 mg/일 내지 300 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C18: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C19: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C20: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C21: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C22: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 0 ng/ml 내지 50 ng/ml; 50 ng/ml 내지 100 ng/ml; 100 ng/ml 내지 150 ng/ml; 150 ng/ml 내지 200 ng/ml; 200 ng/ml 내지 250 ng/ml; 250 ng/ml 내지 300 ng/ml; 300 ng/ml 내지 350 ng/ml; 350 ng/ml 내지 400 ng/ml; 400 ng/ml 내지 450 ng/ml; 450 ng/ml 내지 500 ng/ml; 500 ng/ml 내지 550 ng/ml; 550 ng/ml 내지 600 ng/ml; 600 ng/ml 내지 650 ng/ml; 또는 650 ng/ml 내지 700 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C23: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C24: 구현예 C1 내지 C10 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C25: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 방법으로서, 이러한 방법은 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료 유효량을 이러한 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 방법.

구현예 C26: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 방법으로서, 이러한 방법은 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료 유효량을 이러한 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하며, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 방법.

구현예 C27: 구현예 C1 내지 C26 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 유리 형태인, 방법.

구현예 C28: 구현예 C1 내지 C27 중 어느 하나에 있어서, 화합물 1은 약제학적 조성물 중에 포함되는, 방법.

구현예 C29: 구현예 C1 내지 C28 중 어느 하나에 있어서, 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 방법.

구현예 C30: 구현예 C1 내지 C28 중 어느 하나에 있어서, 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 방법.

구현예 C31: 구현예 C29 또는 C30에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제인, 방법.

구현예 C32: 구현예 C31에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제인, 방법.

본 발명의 제5 양태의 일련의 D 구현예

구현예 D1: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

구현예 D2: 구현예 D1에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 용도.

구현예 D3: 구현예 D2에 있어서, 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고, 유전적 소인은:

(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재

인, 용도.

구현예 D4: 구현예 D3에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 D5: 구현예 D4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 D6: 구현예 D4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 D7: 구현예 D1 내지 D6 중 어느 하나에 있어서, 환자는 아밀로이드-양성인, 용도.

구현예 D8: 구현예 D7에 있어서, 아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 용도.

구현예 D9: 구현예 D3 내지 D8 중 어느 하나에 있어서, 환자는 60세 내지 75세인, 용도.

구현예 D10: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D11: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D12: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D13: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D14: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D15: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D16: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D17: 구현예 D1 내지 D9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D18: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 D19: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하며, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 D20: 구현예 D1 내지 D19 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 유리 형태인, 용도.

구현예 D21: 구현예 D1 내지 D20 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 약제학적 조성물 중에 포함되는, 용도.

구현예 D22: 구현예 D1 내지 D21 중 어느 하나에 있어서, 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 용도.

구현예 D23: 구현예 D1 내지 D21 중 어느 하나에 있어서, 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 용도.

구현예 D24: 구현예 D22 또는 D23에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제인, 용도.

구현예 D25: 구현예 D24에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제인, 용도.

본 발명의 제7 양태의 일련의 E 구현예

구현예 E1: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 약제의 제조를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

구현예 E2: 구현예 E1에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 용도.

구현예 E3: 구현예 E2에 있어서, 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고, 유전적 소인은:

(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재

인, 용도.

구현예 E4: 구현예 E3에 있어서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 E5: 구현예 E4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 E6: 구현예 E4에 있어서, 환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 E7: 구현예 E1 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 환자는 아밀로이드-양성인, 용도.

구현예 E8: 구현예 E7에 있어서, 아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 용도.

구현예 E9: 구현예 E3 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, 환자는 60세 내지 75세인, 용도.

구현예 E10: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E11: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E12: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E13: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E14: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E15: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E16: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E17: 구현예 E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E18: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 약제의 제조를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 용도.

구현예 E19: 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방을 위한 약제의 제조를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도로서, 알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하며, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용되는, 용도.

구현예 E20: 구현예 E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 유리 형태인, 용도.

구현예 E21: 구현예 E1 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, 약제는 약제학적 조성물인, 용도.

구현예 E22: 구현예 E1 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 용도.

구현예 E23: 구현예 E1 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는, 용도.

구현예 E24: 구현예 E22 또는 E23에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제인, 용도.

구현예 E25: 구현예 E24에 있어서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제인, 용도.

추가의 발명에서, 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공되며, 이러한 방법은 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료 유효량을 필요로 하는 환자에 이를 투여하는 단계를 포함하며, 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는다. 일 구현예에서, 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는다. 일 구현예에서, 환자는 3개월 이하의 기간 동안 CYP3A4 억제제 또는 유도제로 동시에 처리된다. 일 구현예에서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제이다. 일 구현예에서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제이다. 일 구현예에서, 환자는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75세 이상이다. 일 구현예에서, 환자는 60세 내지 75세이다. 일 구현예에서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 화합물 노출의 2, 13, 26, 52, 78, 104, 130, 156, 182, 208, 234, 260, 286, 312, 338, 332, 390, 또는 416주 후 CSF, 혈액 또는 혈장에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 5 mg/일 내지 10 mg/일; 10 mg/일 내지 15 mg/일; 15 mg/일 내지 20 mg/일; 20 mg/일 내지 25 mg/일; 25 mg/일 내지 30 mg/일; 30 mg/일 내지 35 mg/일; 35 mg/일 내지 40 mg/일; 45 mg/일 내지 50 mg/일; 50 mg/일 내지 55 mg/일; 55 mg/일 내지 60 mg/일; 60 mg/일 내지 100 mg/일; 100 mg/일 내지 200 mg/일; 200 mg/일 내지 300 mg/일; 15 mg/일 내지 85 mg/일; 50 mg/일 내지 85 mg/일; 15 mg/일 내지 300 mg/일; 또는 50 mg/일 내지 300 mg/일의 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 10 mg/일 내지 30 mg/일의 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 15 mg/일의 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 50 mg/일의 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 0 ng/ml 내지 50 ng/ml; 50 ng/ml 내지 100 ng/ml; 100 ng/ml 내지 150 ng/ml; 150 ng/ml 내지 200 ng/ml; 200 ng/ml 내지 250 ng/ml; 250 ng/ml 내지 300 ng/ml; 300 ng/ml 내지 350 ng/ml; 350 ng/ml 내지 400 ng/ml; 400 ng/ml 내지 450 ng/ml; 450 ng/ml 내지 500 ng/ml; 500 ng/ml 내지 550 ng/ml; 550 ng/ml 내지 600 ng/ml; 600 ng/ml 내지 650 ng/ml; 또는 650 ng/ml 내지 700 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 일 구현예에서, 화합물은 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 정상 상태 Cmax 값을 야기하는 1일 투여량으로 사용된다. 추가의 구현예에서, 화합물은 유리 형태로 사용된다.

추가의 발명에서, 약제로서의 용도를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이 제공되며, 약제로 처리되는 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도체로 동시에 처리되지 않는다. 추가의 발명의 또 다른 양태에서, 알츠하이머병의 치료 또는 예방 용도를 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이 제공되며, 환자는 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는다. 이러한 추가의 발명의 일 구현예에서, 환자는 3개월 초과의 기간 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제로 동시에 처리되지 않는다. 이러한 추가의 발명의 일 구현예에서, 환자는 3개월 이하의 기간 동안 CYP3A4 억제제 또는 유도제로 동시에 처리된다. 추가의 구현예에서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제, 중간의 억제제 또는 약한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제, 중간의 유도제 또는 약한 유도제이다. 추가의 구현예에서, CYP3A4 억제제는 CYP3A4의 강한 억제제이고; CYP3A4 유도제는 CYP3A4의 강한 유도제이다. 추가의 구현예에서, 화합물은 15 mg/일 또는 50 mg/일의 투여량으로 사용된다. 추가의 구현예에서, 화합물은 유리 형태로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 약제학적 조성물 중에 포함된다.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "화합물 1" 또는 "Cmpd 1"은 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드를 지칭하며, 하기 구조식을 갖는다:

실시예 1에서, 대안적 화학명 형식을 사용하여 "화합물 1"은 또한 3-클로로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-카복실산 [6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-트리플루오로메틸-3,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일)-5-플루오로-피리딘-2-일]-아미드로서 지칭된다.

용어 "화합물 1", "Cmpd 1" 및 이에 상응하는 전체 화학명은 발명의 기재내용 전반에 걸쳐 상호 혼용 가능하게 사용된다. 화합물의 단지 하나의 형태만이 의도되는 것으로 문맥상 명확하게 명시되지 않는 한, 이 용어는 유리 형태 또는 약제학적으로 허용 가능한 염 형태의 화합물을 지칭하는 것으로 의도된다. 화합물 1은 WO 2012/095469 A1, 실시예 34에 기재되어 있다. WO 2012/095469 A1, 특히 실시예 34의 합성과 관련된 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알츠하이머병" 또는 "AD"는, 단지 전임상 알츠하이머병 또는 단지 임상 알츠하이머병만이 의도되는 것으로 문맥상 명시되지 않는 한, 전임상 및 임상 알츠하이머병 둘 모두를 포괄한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "임상 알츠하이머병" 또는 "임상 AD"는, 단지 AD로 인한 경증의 인지기능 손상(MCI) 또는 AD로 인한 치매만이 의도되는 것으로 문맥상 명시되지 않는 한, AD로 인한 MCI 또는 AD로 인한 치매 둘 모두를 포괄한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전임상 알츠하이머병" 또는 "전임상 AD"는 임상 증상의 부재 하의 AD의 생체내 분자 바이오마커의 존재를 지칭한다. 미국 국립 노화 연구소 및 알츠하이머 협회는 전임상 AD의 여러 단계를 제시하는 체계를 제공하며, 이는 하기의 표 1에 제시된다(문헌[Sperling et al., 2011]).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알츠하이머병의 예방"은 AD의 예방적 치료; 또는 AD의 발병 또는 진행의 지연을 지칭한다. 예를 들어, AD의 발병 또는 진행이 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안 지연된다. 일 구현예에서, "알츠하이머병의 예방"은 전임상 AD의 예방적 치료; 또는 전임상 AD의 발병 또는 진행의 지연을 지칭한다. 추가의 구현예에서, 전임상 AD의 발병 또는 진행이 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안 지연된다. 또 다른 구현예에서, "알츠하이머병의 예방"은 임상 AD의 예방적 치료; 또는 임상 AD의 발병 또는 진행의 지연을 지칭한다. 추가의 구현예에서, 임상 AD의 발병 또는 진행이 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안 지연된다.

전임상 AD의 발병 또는 진행의 지연은, 예를 들어 하기의 측정에 의해 초기 기준선 값과 관련된 생체내 분자 바이오마커를 측정함으로써 평가될 수 있다:

(a) 뇌 아밀로이드 침착의 감소. 예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상을 사용한 복합 피질 아밀로이드 표준 흡수 값 비율(SUVR)의 기준선으로부터의 변화의 측정에 의한다. SUVR 비율의 측정을 위한 적절한 PET 추적자는 ¹⁸F-플로르베타피르(((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-([¹⁸F]-플루오로에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-3-일)비닐)-N-메틸 벤젠아민))이다. 이 방법으로, 비치매 개체의 독립 샘플에서 시간 경과에 따른 아밀로이드 축적의 발생을 측정할 수 있다(문헌[Palmqvist S et al., 2015]). SUVR 측정은 소정의 참조 영역에서의 추적자 흡수를 참조하여 소정의 피질 뇌 관심 영역(ROI)에서 계산할 수 있다. 피질의 ROI는 초기 AD에서 통상적으로 영향을 받는 영역뿐만아니라 두정엽, 후두엽, 외 측두엽 및 중앙 측두엽의 신피질 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는 AD에서 아밀로이드 침착이 높은 것으로 인식되어 있는 영역을 포함한다(문헌[Vlassenko AG et al., 2012]). 일 구현예에서, 초기 기준선 값과 관련된 뇌 아밀로이드 침착은 치료 1년 당 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10.0% 미만의 비율로 감소된다;

(b) 더욱 구체적으로는, PET 및 적절한 타우 추적자, 예를 들어 ¹⁸F-THK5351(문헌[Harada R et al., 2016])를 사용한 뇌 타우 병변에서 기준선으로부터의 SUVR 변화의 측정 또는 뇌척수액(CSF)을 사용한 총 타우 및 인산화된 타우(문헌[Forlenza OV et al., 2015])의 측정에 의한 기저 타우 병리에 대한 효과. 일 구현예에서, CSF 타우 또는 인산화된 타우의 수준은 초기 기준선 값에 비해 치료 1년당 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50%만큼 감소된다;

(c) ¹⁸F-FDG(2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로글루코스) PET(각 스캔당 200 MBq)를 사용한 신경 글루코스 대사, 밀도 및/또는 활성에 대한 효과. AD 발병 뇌 영역의 ¹⁸F-FDG PET 신호는 AD에서 인지기능 손상, 후속 인지기능 쇠퇴 및 신경병리와 관련되고, AD의 임상 및 전임상 단계에서 시간 경과에 따라 진행되는 것으로 인식되어 있으며, 질병 및 치료 효능 바이오마커이다(문헌[Foster NL et al., 2007]). 데이터를 분석하여, 선택된 참조 영역에 대한 글루코스 대사의 변화를 결정한다. 일 구현예에서, 초기 기준선 값에 대한 ¹⁸F-FDG PET에 의해 결정된 바와 같은 AD 발병 뇌 영역에서의 신경 글루코스 대사의 저하는 치료 1년당 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 미만으로 제한된다;

(d) 용적 측정 자기공명 영상(vMRI)에 의해 뇌 용적의 기준선으로부터의 변화를 측정함으로써 평가되는 바와 같은 뇌 용적 손실에서의 더 느린 쇠퇴. vMRI를 사용하여 해마, 측뇌실 및 총 뇌 용적의 변화를 측정할 수 있다. 일 구현예에서, 해마 용적 손실은 치료 1년당 1, 2, 또는 3% 미만으로 제한된다; 또는

(e) 본 명세서의 실시예 10에 기재된 바와 같은, 예를 들어 피질 아밀로이드 침착의 지표인 0.09 미만의 기준선 CSF Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율을 갖는 대상체에서의 시간 경과에 따른 CSF Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율. 일 구현예에서, CSF Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율은 초기 기준선 값에 대하여 적어도 3, 6, 9, 12, 18, 24, 또는 36개월의 기간 동안 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 200%만큼 증가한다.

전임상 AD의 발병 또는 진행의 지연은 또한, 예를 들어 알츠하이머 예방 전략(API) 전임상 복합 인지기능(APCC) 시험 배열을 사용하여 질병의 전임상 단계에서의 변화를 추적하기 위해 민감한 인지기능 척도를 사용하여 초기 기준선 값에 대하여 평가할 수 있다. APCC는 후기 발병 AD(LOAD)의 임상 단계로 진행될 위험이 있는 개체에서 인지기능 쇠퇴를 검출하고 추적하기 위한 민감한 툴로서 개발되었다(문헌[Langbaum JB et al., 2014]).

임상 AD의 발병의 지연은 AD로 인한 인지기능 및 기능 손상의 지연을 측정함으로써, 예를 들어 AD로 인한 경증의 인지기능 손상(MCI) 및/또는 AD로 인한 치매의 임상 진단에 대한 지연 시간을 측정함으로써 평가할 수 있다. 미국 국립 노화 연구소 - 알츠하이머 협회 워킹 그룹에 의해 제안된 핵심 임상 진단 기준을, 예를 들어 MCI(문헌[Albert MS et al., 2011]) 또는 치매(문헌[McKhann GM et al., 2011])의 진단에 사용할 수 있다. 유럽 의약청(EMA)은 그의 "AD 및 다른 치매의 치료를 위한 의약품 임상 시험 초안 가이드라인"(EMA/인체용 의약품 위원회(CHMP)/539931/2014)에서 하기에 제시된 바와 같이 AD로 인한 MCI 및 AD 치매의 진단을 위한 미국 국립 노화 연구소 기준을 요약하였다.

AD로 인한 MCI로 진단하기 위해서는 다음에 명시된 개체내 쇠퇴의 증거가 요구된다:

a) 임상 시험자의 자체 기록 또는 정보 기록 및/또는 판단에 의해 지적된 바와 같은 이전에 획득된 수준으로부터의 인지기능 변화.

b) 연령 및 교육수준에 일치하는 정규 값에 대하여 적어도 하나의 영역에서의 인지기능 손상(그러나 반드시 일화 기억일 필요는 없음); 하나 초과의 인지기능 영역에서의 손상이 인정될 수 있다.

c) 기준상, 심지어 단지 보조적인 경우에도 일상생활의 장치 보조 하의 활동(IADL)의 '경미한 문제'가 또한 인정된다 할지라도(즉, 기준상, 독립성이 요구된다기보다는, 기능적 손실로 인한 경미한 의존성이 인정됨), 기능적 능력의 보존된 독립성.

d) 명목상 c(상기)의 기능인 치매의 부재.

e) 다른 잠재적 치매 장애의 부재 하의 AD의 표현형에 일치하는 임상 징후. 다음에 의해 증가된 진단 신뢰도가 제공될 수 있다.

1) 최선책: 양성 Aβ 바이오마커 및 양성 퇴행성 바이오마커

2) 차선책:

i. 퇴행성 바이오마커 부재 하의 양성 Aβ 바이오마커

ii. Aβ 바이오마커에 대한 시험의 부재 하의 양성 퇴행성 바이오마커

AD 치매로 진단하기 위해서는 다음이 요구된다:

a) 개체 내의 인지기능 및 기능의 쇠퇴에 의해 결정되는 바와 같은 치매의 존재.

b) 내재적 발병 및 진행성 인지기능 쇠퇴.

c) 2개 이상의 인지기능 영역의 손상; 기억상실 징후가 가장 통상적이나 기준상 비 기억상실 징후(예를 들어, 실행 기능 및 시공간 능력의 손상)를 기반으로 한 진단이 인정된다.

d) 다른 치매성 장애와 관련된 현저한 특징의 부재.

e) 상기의 AD로 인한 MCI 절에서 논의된 바이오마커 알고리즘에 의해 증가된 진단 신뢰도가 제공될 수 있다.

AD로 인한 MCI 및 AD 치매의 진단시의 인지기능 손상 및 쇠퇴는, 예를 들어 다음을 사용하여 질병의 임상 단계에서 변화를 추적하기 위한 정묘한 인지기능 척도를 사용하여 측정할 수 있다:

a) 임상 치매 평가(CDR) 척도 - 박스의 합(SOB). CDR은 인지기능 및 기능 수행성을 평가하고, AD의 임상 연구에 광범위하게 사용되는 전반적 척도이다(문헌[Morris JC, 1993]). 이 척도는 기억, 방향성, 판단 및 문제 해결, 지역사회 문제, 가정 및 취미 및 개인 관리의 6개의 영역을 평가한다. 각각의 영역에 점수를 할당하고, 이를 합산하여 박스의 합(SOB) 점수를 획득한다;

b) 신경 심리 상태 평가를 위한 반복 배열(RBANS). RBANS(문헌[Randolph C, 1998])는 진단 목적 및 시간에 따른 신경인지기능 상태의 변화를 추적하기 위한 목적 둘 모두를 위해 특별히 설계된 임상 툴이다. 이 배열의 주요 설계 목적 중 하나는 매우 경증의 치매를 검출하고 특성화하기 위한 것이다; 또는

c) 일상 인지기능 척도(ECog). ECog는 일상 기억, 일상 언어, 일상 시공간 능력, 일상 계획, 일상 구성 및 일상 분리 주의의 6개의 인지기능-관련 영역을 포괄하는 39개의 항목으로 구성된 인지기능-관련 일상 능력을 측정한다(문헌[Farias ST et al., 2008]).

AD로 인한 MCI 및 AD 치매의 진단용으로 적합한 Aβ 바이오마커는, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, CSF Aβ 1 내지 40, Aβ 1 내지 42 또는 뇌에서의 베타 아밀로이드 신경염 플라크의 PET 영상을 포함한다.

AD로 인한 MCI 및 AD 치매의 진단용으로 적합한 퇴행성 바이오마커는 전임상 AD의 발병 또는 진행의 지연을 평가하기 위해 사용되는 생체내 분자 바이오마커와 관련하여 상기에 기재되어 있으며, 예를 들어 기저 타우 병리에 대한 효과; 신경 글루코스 대사에 대한 효과; 또는 뇌 용적 손실의 더 느린 쇠퇴를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "환자"는 인간 대상체를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알츠하이머병의 임상 증상의 발생 위험이 있는 환자"는 다음을 지칭한다:

(a) 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인이 있는 인간 대상체, 예를 들어:

i. 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 프레세닐린-1 및 -2에 대한 유전자에 돌연변이를 보유하는 대상체(문헌[O'Brien RJ, Wong PC, 2011]), 또는

ii. ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는 대상체(문헌[Liu CC et al., 2013]);

(b) 다운 증후군을 가진 인간 대상체(문헌[Head E et al., 2012]); 또는

(c) 84세 이상의 인간 대상체.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아밀로이드-양성"은 뇌에 축적된 Aβ의 검출 가능한 수준을 갖는 환자를 지칭한다. 일 구현예에서, 환자가 CSF에서의 Aβ의 평가 또는 아밀로이드 PET 영상 또는 둘 모두를 기반으로 하여 뇌에 축적된 Aβ의 검출 가능한 수준을 갖는 경우, 환자는 "아밀로이드-양성"이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "PET에 의해 결정된 아밀로이드-양성"은 백그라운드와 비교하여 증가된 수준의 아밀로이드 PET 추적자 보유를 지칭한다. 아밀로이드-양성의 측정에 적합한 PET 추적자는 ¹⁸F-플로르베타피르(문헌[Palmqvist S et al., 2015]), ¹⁸F-플로베타벤(NeuraCeq) 및 ¹⁸F-플루테메타몰(Vizamyl)을 포함한다. 예를 들어, 뇌 ¹⁸F-플로르베타피르 PET 스캔(각각의 스캔당 260 MBq)에서 1.1 이상의 SUVR을 아밀로이드-양성 진단 임계치로 사용할 수 있다(문헌[Schreiber S et al., 2015]). 또한 1.2 또는 1.3의 SUVR을 임계치로서 사용할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CSF 측정에 의해 결정된 아밀로이드-양성"은 건강한 대조군 그룹에서 관찰된 것과 비교하여, 감소된 CSF Aβ 1 내지 42 값을 지칭한다. 예를 들어, 아밀로이드-양성은 CSF에서 192 ng/L 이하의 Aβ 1 내지 42 값에 의해 결정될 수 있다(문헌[Mattsson N et al., 2015]). 그러나, 아밀로이드-양성의 결정에 사용되는 CSF Aβ 1 내지 42 컷 오프 값은 사용되는 특정 기법에 따라 다를 것이다(문헌[Forlenza OV et al., 2015]). 아밀로이드 양성은 또한 CSF에서 0.09 미만의 Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율에 의해 결정할 수 있다(문헌[Janelidze S et al., 2016]). 일 구현예에서, Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 또는 Aβ42/ Aβ40 비율은 0.20, 0.15, 0.10, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06 또는 0.05 미만 또는 0.20 내지 0.01, 0.15 내지 0.01, 0.10 내지 0.01, 또는 0.05 내지 0.01이다. Aβ 1 내지 40 및 Aβ 1 내지 42 값은, 예를 들어 Luminex 플랫폼에서의 단일클론 단일 항체 샌드위치 효소-연관 면역흡착제(ELISA) 분석(문헌[Herskovitz AZ et al., 2013]) 또는 Meso Scale Discovery(MSD) 96 웰 MULTI-ARRAY 인간/설치류(6E10) Aβ40 및 42 샌드위치 면역분석(Meso Scale Discovery, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용한 표준 면역분석 기법을 사용하여 측정할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CYP3A4"는 시토크롬 P450 3A4를 지칭한다. CYP3A4는 매우 광범위한 약물의 대사에서 주요한 역할을 하는 효소이다(문헌[Luo G et al., 2004]).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CYP3A4의 유도제"는 CYP3A4 활성 수준의 증가를 야기하는 약물을 지칭한다. CYP3A4 유도제의 예는 카바마제핀(carbamazepine), 페니토인(phenytoin), ,리팜피신(rifampicin), 및 세인트존스워트(St John's wort)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A4 활성의 측정에 적합한 기법은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sevrioukova IF and Poulos TL, 2015] 참조). CYP3A4의 "강한", "중간의" 및 "약한" 유도제는 화합물 1의 혈장 곡선하면적(AUC)(0 내지 무한대의 곡선하면적(AUCinf)으로 계산됨)을 각각 80% 이상, 50% 이상 내지 80% 미만, 및 20% 이상 내지 50% 미만만큼 저하시키는 약물이다. 일 구현예에서, "CYP3A4의 유도제"는 "CYP3A4의 강한 유도제"이다. CYP3A의 강한 유도제의 예는 카바마제핀, 엔잘루타미드(enzalutamide), 미토테인(mitotane), 페니토인(phenytoin), 리팜핀(rifampin)(리팜피신(rifampicin)으로도 알려짐) 및 세인트존스워트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A의 중간의 유도제의 예는 보젠탄(bosentan), 에파비렌즈(efavirenz), 에트라비린(etravirine) 및 모다피닐(modafinil)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A의 약한 유도제의 예는 아모다피닐(armodafinil) 및 루핀아미드(rufinamide)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-3(최종 방문일: 2016년 10월 11일)을 참조한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CYP3A4의 억제제"는 CYP3A4 활성 수준의 저하를 야기하는 약물을 지칭한다. CYP3A4 활성의 측정에 적합한 기법은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sevrioukova IF and Poulos TL, 2015] 참조). CYP3A4 억제제의 예는 클라리트로마이신, 그레이프푸르트 쥬스 및 이트라코나졸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A4의 "강한", "중간의" 및 "약한" 억제제는 화합물 1의 혈장 AUC(0 내지 무한대의 곡선하면적(AUCinf)으로 계산됨)을 각각 5배 이상, 2배 이상 내지 5배 미만, 및 1.25배 이상 내지 2배 미만만큼 증가시키는 약물이다. 일 구현예에서, "CYP3A4의 억제제"는 "CYP3A4의 강한 억제제"이다. CYP3A의 강한 억제제의 예는 보세프레비르(boceprevir), 코비시스타트(cobicistat), 코니바프탄(conivaptan), 다노프레비르(danoprevir) 및 리토나비르(ritonavir), 엘비테그라비르(elvitegravir) 및 리토나비르, 그레이프푸르트 쥬스, 인디나비르(indinavir) 및 리토나비르, 이트라코나졸, 케토코나졸(ketoconazole), 로피나비르(lopinavir) 및 리토나비르, 파리타프레비르(paritaprevir) 및 리토나비르 및 (옴비타스비르(ombitasvir) 및/또는 다사부비르(dasabuvir)), 포사코나졸(posaconazole), 리토나비르, 사퀴나비르(saquinavir) 및 리토나비르, 텔라프레비르(telaprevir), 티프라나비르(tipranavir) 및 리토나비르, 트롤레안도마이신(troleandomycin), 보리코나졸(voriconazole), 클라리트로마이신(clarithromycin), 딜티아젬(diltiazem), 이델라리십(idelalisib), 네파조돈(nefazodone), 및 넬피나비르(nelfinavir)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A의 중간의 억제제의 예는 아프레피탄트(aprepitant), 시메티딘(cimetidine), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클로트리마졸(clotrimazole), 크리조티닙(crizotinib), 사이클로스포린(cyclosporine), 드로네다론(dronedarone), 에리트로마이신(erythromycin), 플루코나졸(fluconazole), 플루복사민(fluvoxamine), 이마티닙(imatinib), 토피소팜(tofisopam), 및 베라파밀(verapamil)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CYP3A의 약한 억제제의 예는 클로르족사존(chlorzoxazone), 실로스타졸(cilostazol), 포사프레피탄트(fosaprepitant), 이스트라데필린(istradefylline), 이바카프토르(ivacaftor), 로미타피드(lomitapide), 라니티딘(ranitidine), 라놀라진(ranolazine), 타크로리무스(tacrolimus), 및 티카그렐로르(ticagrelor)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-2(최종 방문일: 2016년 10월 11일)를 참조한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CYP3A4의 억제제 또는 유도제의 동시 처리"는 환자에 CYP3A4의 억제제 또는 유도제에 의한 치료 요법이 적용되고, 또한 화합물 1에 의한 치료 요법이 적용되는 상황을 지칭한다. 일 구현예에서, 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16주 초과 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제 및 화합물 1로 동시에 처리되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 또는 12개월 초과 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제 및 화합물 1로 동시에 처리되지 않는다. 특정 구현예에서, 환자는 3개월 초과 동안 CYP3A4의 억제제 또는 유도제 및 화합물 1로 동시에 처리되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 효과를 보유하고, 통상적으로 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 염을 지칭한다(문헌[Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 2^nd Revised Edition(2011) P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth]).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적 조성물"은 경구 투여에 적합한 고체 형태(통상적으로 젤라틴 캡슐)의 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.

용어 본 발명의 화합물의 "치료 유효량"은 초기 기준선 값에 대한 CSF 또는 혈장 Aβ 1 내지 40 수준의 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 환자에서 BACE-1의 억제를 유도하는 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다.

명확하게 하기 위해 본 명세서에 범위가 제공되는 경우, 상기 범위는 한계치를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어 30 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량 범위는 또한 30 mg/일 및 50 mg/일의 투여량을 포함한다.

약어 목록

실시예

하기 실시예는 화합물 1을 제조할 수 있는 방법을 예시하고(실시 예 1); 화합물 1이 비교 화합물 NB-360에서 관찰된 바람직하지 않은 모발 탈색 부작용 없이 야생형 마우스에서 Aβ 수준을 감소시키는 데 효과적인지를 입증하고(실시예 2); APOE4 트렌스제닉 마우스 모델에서 화합물 1의 PK/PD 효과를 보여주고(실시예 3); 인간 임상 연구에서 최초로 화합물 1의 PD 효과를 보여주고(실시예 4); 3개월 임상 연구에서의 화합물 1의 안전성 및 내성을 입증하고(실시예 5); 3개월 임상 연구에서의 화합물 1 PD 반응에 대한 ApoE4 유전자형의 효과를 보여주고(실시예 6); APP23 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크 수 및 면적을 감소시키는 화합물 1의 치료 효과를 입증하고(실시예 7); ApoE4 동형접합체 위험 환자에서 화합물 효능 연구를 수행할 수 있는 방법을 예시하고(실시예 8); CYP3A4의 강한 억제제 또는 유도제와 조합하여 제공되는 경우, 화합물 1의 AUC에 어떠한 영향이 미치는지를 보여주며(실시예 9); ApoE4 보인자 및 비 보인자 환자 둘 모두에서 화합물 1의 처리가 기저 AD 병리에 어떠한 영향을 미치는지를 입증한다(실시예 10).

실시예 1: 화합물 1의 제조

화합물 1의 제조는 WO 2012/095469 A1(실시예 34)에 기재되어 있다. 화합물 1은 또한 하기에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

NMR 방법

양성자 스펙트럼은 별도의 언급이 없는 한, Bruker 400 MHz 울트라쉴드 분광분석기(ultrashield spectrometer)에 기록된다. 화학적 이동은 메탄올(δ 3.31), 디메틸 술폭사이드(δ 2.50), 또는 클로로포름(δ 7.29)과 관련하여 ppm 단위로 보고된다. 소량의 건조 샘플(2 mg 내지 5 mg)을 적절한 중수소 용매(0.7 mL) 중에 용해시킨다. 자동으로 쉬밍(shimming)을 수행하고, 당업자에 널리 공지되어 있는 절차에 따라 스펙트럼을 얻는다.

크로마토그래피 일반 정보

HPLC 방법 H1( Rt _H1 ):

HPLC-컬럼 치수: 3.0 x 30 mm

HPLC-컬럼 유형: Zorbax SB-C18, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% TFA; B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA

HPLC-구배: 3.25분 동안 30% 내지 100% B, 유속 = 0.7 ml/분

LCMS 방법 H2( Rt _H2 ):

HPLC-컬럼 치수: 3.0 x 30 mm

HPLC-컬럼 유형: Zorbax SB-C18, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% TFA, B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA

HPLC-구배: 3.25분 동안 10% 내지 100% B, 유속 = 0.7 ml/분

UPLCMS 방법 H3( Rt _H3 ):

HPLC-컬럼 치수: 2.1 x 50 mm

HPLC-컬럼 유형: Acquity UPLC HSS T3, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% 포름산 + 3.75 mM 아세트산암모늄 B) ACN + 0.04 Vol.-% 포름산

HPLC-구배: 1.4분 동안 2% 내지 98% B, 98% B 0.75분, 유속 = 1.2 ml/분

HPLC-컬럼 온도: 50℃

LCMS 방법 H4( Rt _H4 ):

HPLC-컬럼 치수: 3.0 x 30 mm

HPLC-컬럼 유형: Zorbax SB-C18, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% TFA; B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA

HPLC-구배: 3.25분 동안 70% 내지 100% B, 유속 = 0.7 ml/분

LCMS 방법 H5( Rt _H5 ):

HPLC-컬럼 치수: 3.0 x 30 mm

HPLC-컬럼 유형: Zorbax SB-C18, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% TFA; B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA

HPLC-구배: 3.25분 동안 80% 내지 100% B, 유속 = 0.7 ml/분

LCMS 방법 H6( Rt _H6 ):

HPLC-컬럼 치수: 3.0 x 30 mm

HPLC-컬럼 유형: Zorbax SB-C18, 1.8 μm

HPLC-용리제: A) 물 + 0.05 Vol.-% TFA; B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA

HPLC-구배: 3.25분 동안 40% 내지 100% B, 유속 = 0.7 ml/분

a) 2- 브로모 -5- 플루오로 -4- 트리에틸실라닐 -피리딘

370 ml THF 중 디이소프로필아민(25.3 g, 250 mmol)의 용액을 드라이아이스 아세톤 배쓰에 의해 -75℃에서 냉각시켰다. 온도를 -50℃ 미만으로 유지하면서, BuLi(100 ml, 250 mmol, 2.5 M/헥산 중)를 적가하였다. 혼합물의 온도를 다시 -75℃에 도달시킨 후, 45 ml THF 중 2-브로모-5-플루오로피리딘(36.7 g, 208 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 -75℃에서 1시간 동안 교반하였다. 트리에틸클로로실란(39.2 g, 260 mmol)을 빠른 속도로 첨가하였다. 온도를 -50℃ 미만으로 유지시켰다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 -15℃까지 가온되도록 하고, 수성 NH₄Cl(10%)에 부었다. TBME를 첨가하여 층을 분리시켰다. 유기층을 염수로 세척하고, MgSO₄.H₂O로 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 갈색 액체를 제공하고, 이를 0.5 mm Hg에서 증류시켜 연황색 액체로서 표제 화합물을 생성하였다(b.p. 105℃ 내지 111℃). HPLC: Rt_H4 = 2.284 min; ESIMS: 290, 292 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.14(s, 1H), 7.40(d, 1H), 1.00-0.82(m, 15H).

b) 1-(6- 브로모 -3- 플루오로 -4- 트리에틸실라닐 -피리딘-2-일)- 에타논

500 ml THF 중 디이소프로필아민(25.4 g, 250 mmol)의 용액을 -75℃까지 냉각시켰다. 온도를 -50℃ 미만으로 유지시키면서, BuLi(헥산 중 100 ml, 250 mmol, 2.5 M)를 적가하였다. 반응 온도를 다시 -75℃에 도달시킨 후, 60 ml THF 중 2-브로모-5-플루오로-4-트리에틸실라닐-피리딘(56.04 g, 193 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 드라이아이스 배쓰에서 70분 동안 교반하였다. N,N-디메틸아세트아미드(21.87 g, 250 mmol)를 빠른 속도로 첨가하고, 반응 온도를 -57℃까지 상승시켰다. 반응 혼합물을 드라이아이스 배쓰에서 15분 동안 교반한 후, -40℃까지 가온되도록 하였다. 이를 2 M 수성 HCl(250 ml, 500 mmol), 250 ml 물 및 100 ml 염수의 혼합물에 부었다. 혼합물을 TBME로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO₄.H₂O 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 황색 오일을 제공하고, 이를 헥산/0% 내지 5% TBME로 용리시킴으로써 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 황색 액체로서 58.5 g의 표제 화합물을 생성하였다. TLC(Hex/TBME 99/1): R_f = 0.25; HPLC: Rt_H4 = 1.921 min; ESIMS: 332, 334 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 7.57(d, 1H), 2.68(s, 3H), 1.00-0.84(m, 15H).

c)(S)-2-(6- 브로모 -3- 플루오로 -4- 트리에틸실라닐 -피리딘-2-일)-2- 트리메틸실라닐옥시 -프로피오니트릴

우선, 100 ml 건식 DCM(0.001% 이하의 물) 중 물(54 mg, 3.00 mmol)을 용해시킴으로써 촉매 용액을 제조하였다. 이러한 습식 DCM(44 ml, 1.32 mmol 물 함량)을 20 ml 건식 DCM 중 티타늄(IV) 부톡사이드(500 mg, 1.47 mmol)의 잘 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 1시간 동안 환류시켰다. 그 후, 이 용액을 실온까지 냉각시키고, 2,4-디-tert-부틸-6-{[(E)-(S)-1-하이드록시메틸-2-메틸-프로필이미노]-메틸}-페놀 [CAS 155052-31-6](469 mg, 1.47 mmol)을 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이러한 촉매 용액(0.023 M, 46.6 ml, 1.07 mmol)을 223 ml 건식 DCM 중 1-(6-브로모-3-플루오로-4-트리에틸실라닐-피리딘-2-일)-에타논(35.53 g, 107 mmol) 및 트리메틸실릴 시아나이드(12.73 g, 128 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2일 동안 교반하고, 증발시켜 주황색 오일로서 47 g의 미정제 표제 화합물을 제공하였다. HPLC: Rt_H5 = 2.773 min; ESIMS: 431, 433 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 7.46(d, 1H), 2.04(s, 3H), 1.00(t, 9H), 1.03-0.87(m, 15H), 0.20(s, 9H).

d) (R)-1-아미노-2-(6- 브로모 -3- 플루오로 -4- 트리에틸실라닐 -피리딘-2-일)-프로판-2-올 하이드로클로라이드

보란 디메틸 술파이드 착물(16.55 g, 218 mmol)을 470 ml THF 중 미정제 (S)-2-(6-브로모-3-플루오로-4-트리에틸실라닐-피리딘-2-일)-2-트리메틸실라닐옥시-프로피오니트릴(47 g, 109 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 가열 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 MeOH를 주의하여 적가하여 켄칭하였다. 기체 방출이 멈춘 후, 수성 6 M HCl(23.6 ml, 142 mmol)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 증발시키고, 잔여물을 MeOH 중에 용해시키고, 증발시켜(2회) 추가 반응을 위해 충분히 순수한 44.5 g의 황색 기포를 생성하였다. HPLC: Rt_H1 = 2.617 min; ESIMS: 363, 365 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 7.93(s, br, 3H), 7.53(d, 1H), 6.11(s, br, 1H), 3.36-3.27(m, 1H), 3.18-3.09(m, 1H), 1.53(s, 3H), 0.99-0.81(m, 15H).

e) (R)-N-(2-(6- 브로모 -3- 플루오로 -4-( 트리에틸실릴 )피리딘-2-일)-2- 하이드록시프로필 )-4-니트로벤젠술폰아미드

335 ml THF 중 미정제 (R)-1-아미노-2-(6-브로모-3-플루오로-4-트리에틸실라닐-피리딘-2-일)-프로판-2-올 하이드로클로라이드(43.5 g, 109 mmol)의 용액에 500 ml 물 중 NaHCO₃(21.02 g, 250 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃ 내지 5℃까지 냉각시키고, 100 ml THF 중 4-니트로벤젠술포닐 클로라이드(26.5 g, 120 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 유액을 밤새 교반하면서, 온도를 실온에 도달하도록 하였다. 혼합물을 TBME로 추출하였다. 유기층을 MgSO₄.H₂O로 건조하고, 여과하고, 증발시켜 주황색 수지를 제공하고, 이를 헥산/10% 내지 20% EtOAc으로 용리시킴으로써 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하여 황색 수지로서 37.56 g의 표제 화합물을 생성하였다. TLC(Hex/EtOAc 3/1): R_f = 0.34; HPLC: Rt_H4 = 1.678 min; ESIMS: 548, 550 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): 8.40(d, 2H), 8.06(t, 1H), 7.97(d, 2H), 7.45(d, 1H), 5.42(s, 1H), 3.23(d, 2H), 1.44(s, 3H) 0.97-0.81(m, 15H); 키랄 HPLC(Chiralpak AD-H 1213, UV 210 nm): 90% ee.

f) 6- 브로모 -3- 플루오로 -2-[(S)-2- 메틸 -1-(4-니트로- 벤젠술포닐 )-아지리딘-2-일]-4-트리에틸실라닐-피리딘

510 ml THF 중 트리페닐포스핀(21.55 g, 82 mmol) 및 (R)-N-(2-(6-브로모-3-플루오로-4-(트리에틸실릴)피리딘-2-일)-2-하이드록시프로필)-4-니트로벤젠술폰아미드(37.56 g, 69 mmol)의 용액을 4℃까지 냉각시켰다. 온도를 10℃ 미만으로 유지시키면서, 톨루엔 중 디에틸 아조디카복실레이트의 용액(40 중량%, 38.8 g, 89 mmol)을 적가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 대략 1000 ml 톨루엔으로 희석하고, THF를 회전증발기에서 증발에 의해 제거하였다. 생성된 미정제 산물의 톨루엔 용액을 헥산/5% 내지 17% EtOAc으로 용리시킴으로써 실리카 겔 컬럼 상에서 예비 정제하였다. 가장 순수한 분획을 조합시키고, 증발시키고, TBME/헥산으로 결정화하여 백색 결정으로서 29.2 g의 표제 화합물을 생성하였다. HPLC: Rt_H4 = 2.546 min; ESIMS: 530, 532 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.40(d, 2H), 8.19(d, 2H), 7.39(d, 1H), 3.14(s, 1H), 3.02(s, 1H), 2.01(s, 3H) 1.03 - 0.83(m, 15H); α[D] -35.7°(c = 0.97, DCM).

g) 6- 브로모 -3- 플루오로 -2-[(S)-2- 메틸 -1-(4-니트로- 벤젠술포닐 )-아지리딘-2-일]-피리딘

플루오르화칼륨(1.1 g, 18.85 mmol)을 25 ml THF 중 6-브로모-3-플루오로-2-[(S)-2-메틸-1-(4-니트로-벤젠술포닐)-아지리딘-2-일]-4-트리에틸실라닐-피리딘(5 g, 9.43 mmol) 및 AcOH(1.13 g, 9.43 mmol)의 용액에 첨가하였다. DMF(35 ml)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO₃과 TBME의 혼합물에 부었다. 층을 분리하고, 염수 및 TBME로 세척하였다. 조합된 유기층을 MgSO₄.H₂O 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 황색 오일을 제공하고, 이를 TBME/헥산으로 결정화하여 백색 결정으로서 3.45 g의 표제 화합물을 생성하였다. HPLC: Rt_H6 = 2.612 min; ESIMS: 416, 418 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.41(d, 2H), 8.19(d, 2H), 7.48(dd, 1H), 7.35(t, 1H), 3.14(s, 1H), 3.03(s, 1H), 2.04(s, 3H); α[D] -35.7°(c = 0.89, DCM).

h) (R)-2-[(R)-2-(6- 브로모 -3- 플루오로 -피리딘-2-일)-2-(4-니트로-벤젠술포닐아미노)-프로폭시]-3,3,3-트리플루오로-2-메틸-프로피온산 에틸 에스테르

DMF(158 ml) 중 (R)-3,3,3-트리플루오로-2-하이드록시-2-메틸-프로피온산 에틸 에스테르(11.93 g, 64.1 mmol)의 용액을 회수하여 질소로 2회 플러싱(flushing)하였다. 수조에 의한 냉각을 사용하여 약 25℃의 반응 온도를 유지하면서, DMF(17 ml) 중 KOtBu(6.21 g, 55.5 mmol)의 용액을 적가하였다. 15분 후, 고체 6-브로모-3-플루오로-2-[(S)-2-메틸-1-(4-니트로-벤젠술포닐)-아지리딘-2-일]-피리딘(17.78 g, 42.7 mmol)을 첨가하고, 3시간 동안 계속 교반시켰다. 반응 혼합물을 1 M HCl(56 ml), 염수 및 TBME의 혼합물에 부었다. 층을 분리하고, 염수 및 TBME로 세척하였다. 조합된 유기층을 MgSO₄ ^.H₂O 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 반응 산물을 실리카 겔(헥산/25% 내지 33% TBME) 상에서의 크로마토그래피를 통해 정제하여 황색 수지로서 이성질체 부산물로 오염된 16.93 g의 표제 화합물을 생성하였다(¹H-NMR에 의한 비율 70:30).

HPLC: Rt_H6 = 2.380 min; ESIMS: 602, 604 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.32(d, 2H), 8.07(d, 2H), 7.46 - 7.41(m, 1H), 7.30 - 7.23(m, 1H), 6.92(s, 1H), 3.39 - 4.30(m, 2H), 3.95(d, 1H), 3.84(d, 1H), 1.68(s, 3H), 1.56(s, 3H), 1.40-1.34(m, 3H) + 이성질체 부산물.

i) (R)-2-[(R)-2-(6- 브로모 -3- 플루오로 -피리딘-2-일)-2-(4-니트로- 벤젠술포닐아미노 )-프로폭시]-3,3,3-트리플루오로-2-메틸-프로피온아미드

NH₃/MeOH(7 M, 482 ml) 중 (R)-2-[(R)-2-(6-브로모-3-플루오로-피리딘-2-일)-2-(4-니트로-벤젠술포닐아미노)-프로폭시]-3,3,3-트리플루오로-2-메틸-프로피온산 에틸 에스테르(16.93 g, 28.1 mmol)의 용액을 밀봉된 용기에서 50℃에서 26시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 잔여물을 DCM으로 결정화하여 무색 결정으로서 9.11 g의 표제 화합물을 생성하였다.

HPLC: Rt_H6 = 2.422 min; ESIMS: 573, 575 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.33(d, 2H), 8.06(d, 2H), 7.42(dd, 1H), 7.30 - 7.26(m, 1H), 7.17(s, br, 1H), 6.41(s, 1H), 5.57(s, br, 1H), 4.15(m, 2H), 1.68(s, 3H), 1.65(s, 3H).

j) N-[(R)-1-(6- 브로모 -3- 플루오로 -피리딘-2-일)-2-((R)-1- 시아노 -2,2,2- 트리플루오로 -1-메틸-에톡시)-1-메틸-에틸]-4-니트로-벤젠술폰아미드

85 ml DCM 중 (R)-2-[(R)-2-(6-브로모-3-플루오로-피리딘-2-일)-2-(4-니트로-벤젠술포닐아미노)-프로폭시]-3,3,3-트리플루오로-2-메틸-프로피온아미드(8.43 g, 14.70 mmol) 및 트리에틸아민(5.12 ml, 36.8 mmol)의 현탁액을 0℃ 내지 5℃까지 냉각시켰다. 30분 동안 트리플루오로아세트산 무수물(2.49 ml, 17.64 mmol)을 적가하였다. 추가의 트리에틸아민(1.54 ml, 11.07 mmol) 및 트리플루오로아세트산 무수물(0.75 ml, 5.29 mmol)을 첨가하여 반응을 완료하였다. 14 ml 수성 암모니아(25%) 및 14 ml 물의 첨가에 의해 반응 혼합물을 켄칭하였다. 유액을 15분 동안 교반하고, 추가의 물 및 DCM을 첨가하고, 층을 분리하였다. 유기층을 MgSO₄ H₂O로 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 실리카 겔(헥산/10% 내지 25% EtOAc) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 황색 수지로서 8.09 g의 표제 화합물을 제공하였다.

HPLC: Rt_H6 = 3.120 min; ESIMS: 555, 557 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 8.35(d, 2H), 8.11(d, 2H), 7.50(dd, 1H), 7.32(dd, 1H), 6.78(s, 1H), 4.39(d 1H), 4.22(d, 1H), 1.68(s, 6H).

k) ( 2R,5R )-5-(6- 브로모 -3- 플루오로 -피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2- 트리플루오로메틸 -5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일아민

92 ml 에탄올 중 N-[(R)-1-(6-브로모-3-플루오로-피리딘-2-일)-2-((R)-1-시아노-2,2,2-트리플루오로-1-메틸-에톡시)-1-메틸-에틸]-4-니트로-벤젠술폰아미드(9.18 g, 16.53 mmol) 및 N-아세틸시스테인(5.40 g, 33.10 mmol)의 용액을 회수하여 질소로 플러싱하였다. K₂CO₃(4.57 g, 33.1 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 원래의 용적의 약 1/4로 농축시키고, 물과 TBME 사이에 분할하였다. 유기층을 10% 수성 K₂CO₃ 용액으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 황색 오일을 제공하였다. 실리카(헥산/14% 내지 50%(EtOAc:MeOH 95:5)) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 회백색 고체로서 4.55 g의 표제 화합물을 제공하였다.

HPLC: Rt_H2 = 2.741 min; ESIMS: 370, 372 [(M+H)⁺, 1Br]; ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆): 7.71 - 7.62(m, 2H), 5.97(s, br, 2H), 4.02(d 1H), 3.70(d, 1H), 1.51(s, 3H), 1.47(s, 3H).

l) (2R, 5R)-5-(6-아미노-3- 플루오로 -피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일 아민

질소, Cu₂O(0.464 g, 3.24 mmol), 암모니아(101 ml, 25%, aq., 648 mmol, 30 당량)로 유리/스테인레스 강 고압멸균기를 퍼징하고, 에틸렌 글리콜(130 ml) 중 (2R,5R)-5-(6-브로모-3-플루오로-피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일아민(8 g, 21.6 mmol)을 첨가하였다. 고압멸균기를 밀폐시키고, 현탁액을 60℃까지 가열하고, 용액을 약 48시간 동안 교반하였다(최대 압력 0.7 bar, 내부 온도 59℃ 내지 60℃). 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석하였다. 유기상을 물 및 12% 수성 암모니아로 4회 및 마지막으로 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 산물(7 g, 일부 에틸렌 글리콜 함유, 정량적 수율)을 추가 정제 과정 없이 다음 단계에 사용하였다.

HPLC: Rt_H3 = 0.60 min; ESIMS: 307 [(M+H)⁺].

m) [(2R, 5R)-5-(6-아미노-3-플루오로-피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

디클로로메탄(185 ml) 중 (2R, 5R)-5-(6-아미노-3-플루오로-피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일 아민(6.62 g, 21.6 mmol), Boc₂O(4.72 g, 21.6 mmol) 및 휘니크 염기(Huenig's base)(5.66 ml, 32.4 mmol)의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하였다. 수성 층을 다시 디클로로메탄으로 추출하고, 조합된 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 밝은 녹색 고체(14 g)를 제공하였다. 미정제 산물을 실리카겔(사이클로헥산:에틸 아세테이트 95:5 내지 60:40) 상에서 크로마토그래피 분석하여 7.68 g의 표제 화합물을 제공하였다.

TLC(사이클로헥산:에틸 아세테이트 3:1): R_f = 0.21; HPLC: Rt_H3 = 1.14 min; ESIMS: 408 [(M+H)⁺]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl3): 11.47(br. s, 1H), 7.23(dd, J=10.42, 8.78 Hz, 1H), 6.45(dd, J=8.78, 2.64 Hz, 1H), 4.50(br. s, 2H), 4.32(d, J=2.38 Hz, 1H), 4.10(d, J=11.80 Hz, 1H), 1.69(s, 3H, CH3), 1.65(s, 3H, CH3), 1.55(s, 9H).

n) ((2R, 5R)-5-{6-[(3-클로로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-카보닐)-아미노]-3-플루오로-피리딘-2-일}-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일)-카르밤산 tert-부틸 에스테르

[(2R, 5R)-5-(6-아미노-3-플루오로-피리딘-2-일)-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일]-카르밤산 tert-부틸 에스테르(3.3 g, 8.12 mmol), 3-클로로-5-트리플루오로메틸피콜린산(2.2 g, 9.74 mmol), HOAt(1.99 g, 14.62 mmol) 및 EDC 하이드로클로라이드(2.33 g, 12.18 mmol)의 혼합물을 DMF(81 ml) 중에서 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 산물(12 g)을 실리카겔(사이클로헥산 대 사이클로헥산:에틸 아세테이트 1:1) 상에서 크로마토그래피 분석하여 5.2 g의 표제 화합물을 생성하였다.

TLC(실리카, 사이클로헥산:에틸 아세테이트 3:1): R_f=0.47; HPLC: Rt_H3 = 1.40 min; ESIMS: 615, 616 [(M+H)⁺, 1Cl]; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): 11.68(s, 1H), 10.41(s, 1H), 8.81(dd, J=1.82, 0.69 Hz, 1 H), 8.45(dd, J=8.91, 3.14 Hz, 1 H), 8.19(dd, J=1.88, 0.63 Hz, 1 H), 7.59(dd, J=9.79, 9.16 Hz, 1 H), 4.38(d, J=2.13 Hz, 1 H), 4.18(d, J=11.80 Hz, 1 H), 1.75(s, 3H), 1.62(s, 3H), 1.60(s, 9H).

o) 3- 클로로 -5-트리플루오로메틸-피리딘-2-카복실산 [6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-트리플루오로메틸-3,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일)-5-플루오로-피리딘-2-일]-아미드

디클로로메탄(81 ml) 중 ((2R, 5R)-5-{6-[3-클로로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-카보닐)-아미노]-3-플루오로-피리딘-2-일}-2,5-디메틸-2-트리플루오로메틸-5,6-디하이드로-2H-[1,4]옥사진-3-일)-카르밤산 tert-부틸 에스테르(4.99 g, 8.13 mmol) 및 TFA(6.26 ml, 81 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔여물을 적절한 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트 및 수성 암모니아로 희석하였다. 얼음을 첨가하고, 유기상을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 3.78 g의 표제 화합물을 생성하였다.

HPLC: Rt_H3 = 0.87 min; ESIMS: 514, 516 [(M+H)⁺, 1Cl]; ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d ₆): δ 11.11(s, 1H), 9.06(s, 1H), 8.69(s, 1H), 8.13(dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 7.80 - 7.68(m, 1H), 5.88(br. s, 2H), 4.12(d, J = 11.5 Hz, 1H), 3.72(d, J = 11.4 Hz, 1H), 1.51(s, 3H), 1.49(s, 3H).

실시예 2: 야생형 마우스에서의 화합물 1 및 비교 화합물 NB-360의 만성적 투여

특히 털의 변색에 대한 화합물 1의 만성 치료 효과를 조사하고, 야생형 마우스에서 효과적인 투여량을 결정하고, 효능 및 털 색깔 변화 사이의 창을 비교 BACE-1 억제제 화합물 NB-360(N-(3-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-4-플루오로페닐)-5-시아노-3-메틸피콜린아미드)와 비교하기 위해 시중에서 판매되는 야생형 마우스에서 본 명세서에 기재된 연구를 수행하였다(문헌[Neumann U et al., 2015; 및 Shimshek DR et al., 2016]).

동물

C57BL/6 마우스를 프랑스 소재의 Charles River 연구소에 주문하였다.

화합물 제형화 및 투여

화합물 1 및 NB-360을 현탁액으로서 제형화하였다. 비히클, 화합물 1 또는 NB-360을 8주 동안 골 단위당 10 ml/kg의 용적으로 1일 1회(오전) 제공하였다. 비히클: 물 중 0.5% 메틸셀룰로스 중 0.1% Tween80.

체중 및 털 색깔 점수화

체중을 1주일에 3회(월요일, 수요일, 금요일) 측정하였다. 임의의 모발 색깔 변화에 대한 주관적인 점수화를 1주일에 1회(수요일) 수행하였다. 점수(회색 털 몸통 %): 0: 변화 없음; 1: 소부분; 2: 30% 초과; 3: 50% 초과; 4: 75% 초과; 5: 100%. 털 색깔의 변화가 관찰된 경우, 동물을 사진으로 기록하였다. 최종 털 색깔 점수화는 연구에 참여하지 않은 자에 의해 블라인드 방식으로 수행하였다.

생체외 샘플 및 샘플 수집 방법

혈액 샘플을 사용하여 전혈 화합물 수준을 분석하고, 일부 생존 기간 동안 꼬리 정맥으로부터 EDTA 튜브(CB300, Sarstedt, 독일 소재)에 또는 부검 당일 몸통 혈액으로부터 EDTA Eppendorf 튜브(Milian SA, CatNo TOM-14, Fisher Scientific, 스위스 볼렌 소재) 또는 혈청 튜브(CB300Z, Sarstedt, 독일 눔브레히트 소재)에 채혈하였다.

아밀로이드-β(Aβ) 분석용 혈장을 EDTA 혈액의 원심분리(8000 rpm/6800xg, 15분, 4℃)에 의해 수집하여 단백질 Lo-Bind Eppendorf 튜브(003 0108.116, Eppendorf, 독일 함부르크 소재)에 수집하였다.

실온에서 20분 후, 원심분리(8000 xg, 15분, 4℃)에 의해 혈청을 분리하고, 단백질 Lo-Bind Eppendorf 튜브에 수집하여 신장 독성 바이오마커에 대해 조사하였다.

모든 혈액/혈장/혈청 샘플을 드라이아이스 상에 동결시키고, 분석 시까지 -80℃에 저장하였다.

머리를 절단한 직후 뇌를 제거하고, 식염수로 세정하고, 중간선 이하의 시상 면을 절개하였다. 좌측 절반의 소뇌를 사용하여 화합물 수준을 분석하고, 유리 튜브(Chromacol, 125 x 5-SV T051, 영국 웰린 가든 시티 소재)에 배치하고, 중량을 측정하고, 드라이아이스에 동결시키고, 좌측 절반의 전뇌(후각 벌브 제외)를 Aβ 분석에 사용하고, 드라이아이스 상의 금속 판에 동결시키고, 단백질 Lo-bind 튜브(003 0108.116, 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)에 배치하였다.

배와 등의 피부를 수집하여 화합물 수준을 분석하고, 중량을 측정하고, 드라이아이스 상에 동결시켰다.

화합물 수준의 분석

액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광분석(HPLC/MS/MS)에 의해 혈액, 뇌 및 피부에서 생물학적 샘플에서의 화합물 1 및 NB-360 수준을 정량화하였다. 뇌 샘플을 2배 용적의 KH₂PO₄ 완충액과 혼합하고, Covaris^® 장치를 사용하여 균질화하였다. 피부 샘플을 대략 6배 용적의 메탄올/물과 혼합하고, Precellys 튜브를 사용하여 균질화하였다. 30 μL의 혈액, 뇌 또는 피부 균질액을 구조적으로 관련된 내부 표준으로 스파이킹(spiking)하고, 후속하여 적어도 6배의 과량의 용적의 아세토니트릴과 혼합하여 단백질을 침전시켰다. 분석을 위해 상청액을 LC/MS/MS 시스템에 직접 주입하였다.

마우스 뇌에서의 Aβ40의 분석

뇌 균질화

동결된 마우스 전뇌의 중량을 측정하고, 초음파 처리(90% 듀티 사이클, 출력 제어 5, 40 펄스 내지 55 펄스, [초음파기 450, Branson])에 의해 9배 용적(w/v)의 빙냉 TBS-완전(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x 완전 [프로테아제 억제제 칵테일 정제: 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, 독일 펜츠베르크 소재]) 중에서 균질화하였다. 균질화 후, 분석을 위해 수개의 50 μl 분취량을 제조하고, -80℃에 저장하였다.

표준으로서 합성 Aβ1 내지 40 용액의 제조

인간 Aβ 펩타이드(1 내지 40) 트리플루오로아세테이트 염(H 1194.1000, Bachem, 스위스 부벤도르프 소재)을 Aβ1 내지 40의 보정 곡선으로 사용하였다. 이를 실온(RT)에서 대략 30분 동안 1 mg/ml의 농도로 무수 DMSO(41647, Fluka) 중에 용해되도록 한 후, 완전히 용해되었는지를 육안으로 조사하였다.

20 x 5 μl 분취량 및 100 μl 분취량의 잔여 용액을 LoBind 튜브(0030 108.094, Eppendorf, 독일 함부르크 소재)에 제조하고, Aβ 펩타이드를 산화로부터 보호하기 위해 질소 기체를 도포하고, -80℃에 저장하였다. 보정 곡선을 위해 5 μl 분취량을 단지 1회 사용한 후, 폐기하였다.

마우스 뇌에서의 Aβ40의 결정

Meso Scale Discovery(MSD) 96 웰 MULTI-ARRAY 인간/설치류(4G8) Aβ40 울트라센시티브 분석(Ultrasensitive Assay)(#K110FTE-3, Meso Scale Discovery, 미국 게이더스버그 소재)에 의해 마우스에서 내인성 Aβ40을 결정하였다. 보정 곡선 및 샘플 제조를 제외하고, 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였다. TritonX-100(TX-100) 가용성 Aβ40을 각각의 1:10 전뇌 균질액의 50 μl 분취량을 사용하여 1% TX-100에 의해 전뇌로부터 추출하고, TBS 완전(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x 완전 [프로테아제 억제제 칵테일 정제: 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, 독일 펜츠베르크 소재]) 중에서 50 μl 2% TX-100과 혼합하여 1% TX-100의 최종 농도 및 1:20 전뇌 희석에 도달시켰다. 샘플을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하고, 5분 마다 와류시켰다. 샘플을 초 원심분리(100000xg, 4℃, 15분)하고, 및 50 μl의 투명한 상청액을 새 튜브로 옮겼다. Aβ40 분석을 위해 상청액을 3% 차단제 A 용액(키트) 중에서 1:5로 추가로 희석하여 최종 전뇌 희석이 1:100이 되도록 플레이트에 적용하였다.

비-트렌스제닉 마우스 뇌 샘플을 제외하고, 합성 Aβ1 내지 40 펩타이드(1.56 pg/ml 내지 100 pg/ml)로 스파이킹된 1% 차단제 A 용액의 상응하는 희석으로 보정 곡선을 제조하였다: 이 경우, 합성 Aβ1 내지 40 펩타이드(1.56 pg/ml 내지 100 pg/ml)로 스파이킹된 상응하게 희석된 APP 넉아웃 마우스 전뇌에서 보정 곡선을 제조하였다. 모든 샘플 및 표준에 대해 25 μl를 웰당 적용하였다. 각각의 결정 시, 이중 반복 웰을 실시하였다. 이중 반복 웰로부터의 평균 값을 사용하여 계산하였다. MSD가 정량화 소프트웨어를 제공하지 않으므로, 샘플의 정량화 및 표준 곡선의 계산을 위해 샘플 및 표준의 상대 단위를 SOFTmax PRO 4.0 내에 도입시켰다.

결과

NB-360 또는 화합물 1로 만성적으로 처리된 C57BL /6 마우스에서의 체중 및 털 색깔에 대한 효과

야생형 나이브(naive) 마우스(C57BL/6)를 8주 동안 화합물 1 또는 NB360으로 만성적으로 처리하고, 3일 마다(월요일, 수요일, 금요일) 체중을 측정하였다. 비히클과 비교하여 전반적으로 치료 그룹의 유의한 체중 차이를 관찰할 수 없었으며, 그뿐만 아니라 연구 종료 시점인 56일 차에도 유의한 차이를 관찰할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 치료 그룹에서 유의한 체중 증가(0일 차 대 56일 차의 체중 비교)를 관찰할 수 있었다.

연구 과정 동안, NB-360으로 처리된 마우스에서 털 색깔 변화가 관찰되었다. C57BL/6의 흑색 털이 일부분에서 서서히 회색으로 변색되었다. 이들 회색 부분은 동물의 배 부분에서 관찰된 반면, 등 부분은 영향을 받지 않았다. 회색 부분의 출현은 3주 처리 후 분명해졌으며, 고 및 저 투여량 NB-360 그룹에서 상이한 정도로 존재하였다. 주관적인 점수화 시스템을 구현하여 털 탈색을 정량화하였다. NB-360 그룹의 모든 동물에서 털 탈색이 나타났다. 저 투여량 NB-360 그룹(20 μmol/kg)에서 단지 약한 정도이지만 유의한 털 점수 변화가 나타난 반면, 고 투여량 NB-360 그룹(100 μmol/kg)에서는 더욱 현저하고 상당한 털 색깔 변화가 나타났다, 도 1. 유의하게는, 5주의 NB-360 처리 후 털 탈색의 확산 및 증가가 정체기에 도달하였으며, 임의의 추가적 변화는 존재하지 않았다. 중요하게는, 화합물 1 치료 그룹에서 검출 가능하게 분명한 털 색깔 변화는 존재하지 않았다.

혈액 및 조직에서의 노출

첫 번째 투여 후 1일 차, 중반의 14일 차 및 최종 투여 후 연구 종료 시에 혈액에서의 화합물 1 노출을 결정하였다. 마지막 날에서의 노출은 실험 개시 시보다 지속적으로 더 낮았다. 화합물 1의 경우, 노출은 대략 35%만큼 감소하였다.

상이한 조직에서의 마지막 24시간 동안의 화합물 1의 노출을 AUC_0-24h로 표시하여 표 4에 요약하였다. 혈액의 경우, 1, 4, 7, 및 24시간째의 데이터로부터 AUC를 계산하였으며, 그뿐만 아니라 단지 4시간 및 24시간째에서의 데이터로부터 '미니' AUC를 계산하였다. 2개의 값을 비교하는 경우, 큰 차이는 나타나지 않았다. 조직 노출에서는 단지 4시간 및 24시간째의 데이터가 적용 가능하였다. '미니' AUC가 조직 노출을 충분히 잘 대변하는 것으로 결론지었다.

화합물 1 및 NB-360 둘 모두에서, 뇌 및 피부에서의 노출이 혈액에서보다 훨씬 더 높았다, 표 4. 특히, 피부 노출이 혈액 노출보다 몇 배 더 높았다. 추가로, 특히 NB-360의 경우, 등 부분의 피부보다 배 부분의 피부에서 노출이 더 높은 것으로 나타났다, 표 5. 모든 조직에서, 적절한 투여량 비례 노출이 존재하였다.

마우스 뇌에서의 아밀로이드-베타 저하

연구 마지막 날에, 마지막 투여를 제공한 후, n=4 마우스의 그룹을 4시간 및 24시간째에 희생시켰다. 전뇌를 분리하고, β-아밀로이드 펩타이드 1 내지 40에 대해 분석하였다. 비히클 및 치료 그룹에서의 Aβ40의 농도를 표 6에 요약하였으며 도 2에 도시하였다. 상응하는 비히클 처리 그룹에 대한 감소 퍼센트를 계산하였다. 처리에 의해 마지막 투여 후 4시간째에 유의한 Aβ40 감소를 야기하였다. 비히클에 대하여 화합물 1은 마지막 투여 후 24시간째에도 여전히 Aβ40의 25% 감소가 나타났으나 이는 유의하지 않았다. 고 투여량 그룹에서, 화합물 1은 마지막 투여 후 24시간째에 유의하게 더 낮은 수준의 Aβ40을 나타내었다. 50 μmole/kg 화합물 1 투여 그룹은 거의 평평한 프로파일을 나타내었으며, 24시간의 전체 과정 동안 Aβ40은 80% 내지 90% 감소하였다.

NB-360은 이중 BACE-1/BACE-2 억제제이고, 이는 BACE-1 및 BACE-2 효소 억제 시험관내 분석(문헌[Neumann U et al.,(2015)])에 의해 나타난 바와 같으며, 선택적으로, BACE-1의 경우 BACE-2에 대하여 1.0배가 제공된다. 동일한 분석에서, 화합물 1은 BACE-1의 경우 BACE-2에 대하여 3배의 선택성을 갖는 것으로 나타났다. 결론적으로, 만성 마우스 연구에서 화합물 1과 NB-360 사이의 효소 선택성 및 조직 분포의 중간의 변이가 모발 탈색 발생률에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 화합물 1은 생체내에서 활성임에도 불구하고, 마우스에서 모발 탈색의 징후를 나타내지 않았다.

실시예 3: APOE4 -TR 마우스에서의 화합물 1의 급성 PK/PD 투여량-반응 연구

인간 APOE4 상황에서 APP 대사에 대한 화합물 1의 효과를 연구하기 위해 인간 APOE4 대립유전자를 보유하는 트렌스제닉 마우스에서의 PK/PD 연구를 수행하였다(마우스 Apoe 유전자를 인간 APOE4로 교체함; APOE4-TR;(문헌[Knouff C et al., 1999])).

이 연구에서, 3개월령 내지 5개월령의 수컷 및 암컷 APOE4-TR 동물을 상이한 투여량(3, 10, 30 u mol/kg)의 화합물 1로 급성 처리하고, 처리 후 4시간 및 24째에 희생시켰다.

동물

수컷 및 암컷 트렌스제닉 동형접합 APOE4-TR(B6.129P2-Apoe ^{tm3(APOE*4)Mae} N8, Taconic, 모델 001549, 3개월령 내지 5개월령, n=48)을 Taconic로부터 입수하였다.

투여량 선택

3, 10 및 30 μmol/kg의 화합물 1을 투여하였다.

화합물 형태, 제형화 및 투여

화합물 1을 현탁액으로 제형화하였다. 비히클 또는 화합물을 10 ml/kg의 용적으로 경구 투여에 의해 1회 제공하였다. 비히클: 물 중 0.5% 메틸셀룰로스 중 0.1% Tween80.

체중

투여하기 전에 체중을 1회 측정하였다.

생체외 샘플 및 샘플 수확 방법

혈액 샘플을 사용하여 전혈 화합물 수준을 분석하고, 부검 당일 몸통 혈액으로부터 EDTA Eppendorf 튜브(Milian SA, CatNo TOM-14, Fisher Scientific, 스위스 볼렌 소재), 또는 혈청 튜브(CB300Z, Sarstedt, 독일 눔브레히트 소재)에 채혈하였다.

아밀로이드-β(Aβ) 분석용 혈장을 EDTA 혈액의 원심분리(8000 rpm/6800xg, 15분, 4℃)에 의해 수집하여 단백질 Lo-Bind Eppendorf 튜브(003 0108.116, 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)에 수집하였다.

머리를 절단한 직후 뇌를 제거하고, 식염수로 세정하고, 중간선 이하의 시상 면을 절개하였다. 좌측 소뇌를 사용하여 화합물 수준을 분석하고, 유리 튜브(Chromacol, 125 x 5-SV T051, 영국 웰린 가든 시티 소재)에 배치하고, 중량을 측정하고, 드라이아이스에 동결시키고, 좌측 절반의 전뇌(후각 벌브 제외)를 Aβ 분석에 사용하고, 드라이아이스 상의 금속 판에 동결시키고, 단백질 Lo-bind 튜브(003 0108.116, Eppendorf, 독일 함부르크 소재)에 배치하였다. 우측 뇌를 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, PBS로 세척한 후, 차후의 가능한 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매시켰다.

연구 종료일에 꼬리를 수집하고, -20℃에 저장하였다.

마우스 뇌에서의 Aβ40 및 CSF에서의 Aβ40 및 Aβ42의 분석

뇌 균질화

동결된 마우스 전뇌의 중량을 측정하고, 초음파 처리(90% 듀티 사이클, 출력 제어 5, 40 펄스 내지 55 펄스, [초음파기 450, Branson])에 의해 9배 용적(w/v)의 빙냉 TBS-완전(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x 완전 [프로테아제 억제제 칵테일 정제: 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, 독일 펜츠베르크 소재]) 중에서 균질화하였다. 균질화 후, 분석을 위해 여러 개의 50 μl 분취량을 제조하고, -80℃에 저장하였다.

표준으로서 합성 Aβ1 내지 40 용액의 제조

인간 Aβ 1 내지 40 트리플루오로아세테이트 염(H 1194.1000, 바헴, 스위스 부벤도르프 소재)을 Aβ1 내지 40의 보정 곡선으로 사용하였다. 이를 실온(RT)에서 대략 30분 동안 1 mg/ml의 농도로 무수 DMSO(41647, Fluka) 중에 용해되도록 한 후, 완전히 용해되었는지를 육안으로 조사하였다.

20 x 5 μl 분취량 및 100 μl 분취량의 잔여 용액을 LoBind 튜브(0030 108.094, 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)에 제조하고, Aβ 펩타이드를 산화로부터 보호하기 위해 질소 기체를 도포하고, -80℃에 저장하였다. 보정 곡선을 위해 5 μl 분취량을 단지 1회 사용한 후 폐기하였다.

마우스 뇌에서의 Aβ40의 결정

Meso Scale Discovery(MSD) 96 웰 MULTI-ARRAY 인간/설치류(4G8) Aβ40 울트라센시티브 분석(#K110FTE-3, Meso Scale Discovery, 미국 게이더스버그 소재)에 의해 마우스에서 내인성 Aβ40을 결정하였다. 보정 곡선 및 샘플 제조를 제외하고, 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였다. TritonX-100(TX-100) 가용성 Aβ40을 각각의 1:10 전뇌 균질액의 50 μl 분취량을 사용하여 1% TX-100에 의해 전뇌로부터 추출하고, TBS 완전(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x 완전 [프로테아제 억제제 칵테일 정제: 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, 독일 펜츠베르크 소재]) 중에서 50 μl 2% TX-100과 혼합하여 1% TX-100의 최종 농도 및 1:20 전뇌 희석에 도달시켰다. 샘플을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하고, 5분 마다 와류시켰다. 샘플을 초 원심분리(100000xg, 4℃, 15분)하고, 및 50 μl의 투명한 상청액을 새 튜브로 옮겼다. Aβ40 분석을 위해 상청액을 3% 차단제 A 용액(키트) 중에서 1:5로 추가로 희석하여 최종 전뇌 희석이 1:100이 되도록 플레이트에 적용하였다.

결과

APOE4-TR 마우스(마우스 Apoe 유전자를 인간 APOE4로 교체함)를 3종의 상이한 투여량(3, 10 및 30 μmol/kg)의 BACE 억제제 화합물 1로 급성 처리하였다. 마지막 투여 후 4시간 및 24시간째에 동물을 희생시키고, 전뇌를 분리하였다. 다양한 그룹의 Aβ40 및 Aβ42의 농도를 도 3, 도 4 및 도 5; 및 표 9, 표 10 및 표 11에 요약하였다. 비히클 처리 그룹에 대한 감소 퍼센트를 계산하였다. 모든 처리에 의해 마지막 투여 후 4시간 및 24시간째에 유의한 투여량 의존적 Aβ40 감소를 야기하였고, 효과는 4시간째의 경우 43% 내지 77%의 범위이었으며, 24시간째의 경우 20% 내지 66%이었다. 2종의 더 낮은 투여량 그룹(3 μmol/kg 및 10 μmol/kg)에서, 4시간 및 24째에 Aβ40 저하 효과가 유의하게 감소하였으나 마지막 투여 후 24시간째에 기준선 수준에 대체로 근접하였다. 고 투여량의 화합물 1(30 μmol/kg)은 거의 평평한 프로파일을 나타내었으며, 24시간의 전체 시간 과정 동안 Aβ40이 77% 내지 66% 감소하였다.

혈액 및 뇌에서의 급성 투여의 4시간 및 24시간째의 PK 데이터를 도 6 및 표 12에 제시하였다. 혈액 및 뇌에서 24시간 동안의 화합물 1의 노출을 AUC₀ _-24h로 표시하여 표 13에 요약하였다. 혈액 및 뇌에서의 화합물 1 노출은 투여량에 비례하였고, 24시간 후 화합물 수준의 예상된 소폭의 하락이 나타났으며, 이는 다시 투여량에 비례하였다. 뇌에서의 화합물 노출이 혈액에서보다 훨씬 더 높았다. 뇌 혈액 비율은 각각, 3, 10 및 30 μmol/kg 투여량 그룹에서 유사하였고, 4시간째에는 5, 3 및 4였으며, 24시간째에는 9, 4, 및 3이었다. 4시간/24시간의 노출 비율을 계산하였으며, 이는 상이한 투여량에서의 화합물 노출의 감소의 비교를 가능하게 한다(표 12). 화합물 1은 중간의 2배 내지 5배의 노출 감소를 나타내었으며, 상이한 투여량 사이 및 혈액과 뇌 사이에 큰 차이는 없었다.

모든 투여량 그룹의 각각의 동물에 대한 뇌 약동학적/약역학적 관계가 도 7에 도시되어 있다. 화합물 1의 경우 분명한 PK/PD 관계가 뚜렷하였고; 낮은 화합물 수준에서 Aβ 감소 효능은 최소였으나 높은 화합물 수준에서는 최대 효능의 효과가 검출되었다.

도 8은 상이한 투여량에서의 평균 값에 대한 PK/PD 관계를 보여준다. 마찬가지로, Aβ 감소에 대한 노출 의존적 효과가 분명하였고, 뚜렷한 최소 및 최대 효능 효과가 나타났다.

결론

이 실험 예에 제시된 연구는 화합물 1이 APOE4-TR 마우스의 생체내에서 경구로 적용 가능하고, 중심적으로 활성인 강한 BACE의 억제제임을 입증한다. 마우스 내인성 Apoe 유전자 좌위로부터 인간 APOE4를 발현하는 APOE4-TR 마우스를 사용하여 화합물 1의 PK/PD 관계를 연구하였다. ApoE4는 알츠하이머병의 고위험 인자인 것으로 나타났으며, APOE4-TR 마우스는 알츠하이머병의 뇌에서 ApoE4 효과와 유사하다.

APOE4-TR 마우스에서의 화합물 1의 PK 특성은 야생형 마우스에서 관찰된 것과 상이하지 않았다. 혈액 및 뇌에서 투여량 의존적 화합물 1 노출이 관찰되었으며, 뇌 수준이 훨씬 더 높았다. 추가로, 24시간 후 노출 저하는 야생형 마우스에서 관찰된 것과 유사하였다. 30 μmol/kg의 화합물 1은 APOE4-TR의 뇌에서 Aβ 감소에 대한 최대 효과(70% 초과)를 야기하였으며, 급성 투여의 경우 24시간 동안 유사한 정도로 지속되었다. PK/PD 관계는 야생형 마우스 및 랫트와 매우 유사하였다. APOE4-TR 마우스의 뇌에서 Aβ 감소에 대한 약간 더 낮은 최대 효능 효과가 최고 투여량(30 μmol/kg)에서 뚜렷하였다. 이는 APOE-4 TR 마우스에서 관찰된 아밀로이드-β의 더 낮은 제거율로 인한 것으로 보인다(문헌[Castellano JM et al., 2011]).

실시예 4: 최초 인체 연구

본 연구는 임상 완결되었으며, 고령의 건강한 성인 대상체에서 주로 화합물 1의 약동학 및 약역학뿐만 아니라, 안전성 및 내성을 평가하기 위한 무작위 이중 블라인드 방식의 위약 대조군 단일 및 다회 상승 경구 투여량 연구였다. 본 연구의 목적은 주요 PD 바이오마커로서 CSF에서의 Aβ를 사용하여 화합물 1의 단일 및 다회의 최대 내성 투여량을 결정하고, 약동학적/약역학적(PK/PD) 관계를 평가하는 것이었다.

60세 이상의 고령의 건강한 대상체에서, 2주 동안 750 mg 단일 투여량 및 300 mg QD의 최고 시험 투여량이 안전하고, 내성인 것으로 결정되었다. 약물 작용의 주요 바이오마커로서 CSF에서의 Aβ 농도를 사용한 약역학적 평가를 또한 고령의 건강한 대상체에 적용하였다. 단일 및 다회 투여 후, Aβ40 농도의 투여량 의존적 저하는 각각 대략 80% 및 90%까지 결정되었다(표 14 및 표 15, 도 9).

실시예 5: 3개월 투여 범위의 안전성 및 내성 연구

I기 임상 투여 범위의 안전성 및 내성 연구에서 화합물 1을 건강한 60세 이상의 고령 대상체에 투여하였다. 본 연구는 ClinicalTrials.gov에 NCT02576639 식별자 코드로 등재되어 있다.

이러한 무작위 이중 블라인드 방식의 위약 대조군 연구는 병렬 그룹으로 설계되었으며, 화합물 1은 5개의 치료 그룹에 1일 1회 경구 투여량으로 투여되었다(화합물 1: 2 mg, 10 mg, 35 mg 또는 85 mg QD 및 위약).

본 연구의 주 목적은, 인체 연구에서 최초로 2주 및 4주의 지속기간 동안 획득된 이전의 안전성 및 내성 데이터를 확장시킴으로써 AD 위험이 있는 대상체에서 추후의 장기간 효능 시험을 개시할 수 있도록 하는 것이었다. 추가로, 추후의 효능 연구를 위한 투여량 선택 결정을 뒷받침하기 위해 약동학적/약역학적 모델링 관련 데이터를 획득하였다.

본 연구에서, 화합물 1은 3개월 동안 2, 10, 35 및 85 mg의 1일 1회 투여량에서 안전하고 내성인 것으로 나타났다. CSF Aβ 수준에 대한 화합물 1 투여의 약역학적 효과가 표 16 및 도 10에 제시되어 있다. Aβ 저하의 정도는 시간 경과에 따라 안정하였으며, 대략 2주 내지 3주 후에 PD 정상 상태에 도달하였다.

3개월(91일) 동안 2, 10, 35 및 85 mg을 매일 투여한 후의 화합물 1의 약동학적 매개변수가 표 17에 제시되어 있다.

Cmax,ss 값은 91일 동안 규정된 투여량을 1일 1회(qd) 투여한 후의 화합물 1의 최대 혈장 정상 상태 농도를 나타낸다. "CV%"는 변이 계수 백분율을 나타낸다.

이들 결과를 기반으로 하여, 15 mg의 화합물 1의 1일 1회 투여는 70 ng/ml 내지 170 ng/ml의 혈장 Cmax,ss 값을 야기할 것으로 예상되며, 50 mg의 화합물 1의 1일 1회 투여는 200 ng/ml 내지 500 ng/ml의 혈장 Cmax,ss 값을 야기할 것으로 예상된다.

실시예 4 및 5에 제시된 데이터를 기반으로 하여, 계량약리학 모델링은 90%의 대상체에서 50 mg의 매일 투여에 의해 80% CSF Aβ40 저하에 도달되고, 15 mg의 투여량에서 60% CSF Aβ40 저하가 달성될 것으로 예측된다.

실시예 6: 화합물 1로의 처리에 대한 반응에 대한 ApoE4 유전자형의 효과

실시예 5 및 6에 기재된 완결된 최초 인체 3개월 투여 범위의 안전성 및 내성 임상 연구에서, 제1 투여 전(기준선) 및 각각 2주 및 3개월의 다회 투여 후, 요추 천자에 의해 CSF에서의 Aβ 농도를 구하였다. 또한, 합의된 대상체에서 ApoE4 유전자형을 획득하였다. 연구 처리를 받고, 약역학적 효과의 평가에 잠재적인 영향을 줄 수 있는 주요한 프로토콜 이탈행위가 없는 대상체에서 Aβ40 및 Aβ42 농도의 기준선으로부터의 변화 퍼센트를 계산하였다. 하기의 표 18 내지 표 21은 치료 그룹에 의한 기준선으로부터의 변화 퍼센트 및 ApoE 유전자형(E4 이형접합체 대 E4 비 보인자)의 통계 요약을 제공한다. CSF 데이터가 있는 단 한 명의 대상체만이 E4 동형접합체였다(3개월 투여 범위의 안전성 및 내성 연구). 이 대상체는 위약으로 처리되었고, Aβ40 및 Aβ42 농도 둘 모두에서 11% 저하가 나타났으며, 하기의 표에 포함되어 있지 않다. 데이터는 ApoE4 보인자와 비 보인자 사이에 화합물 1에 의한 처리에 대한 CSF Aβ40 및 Aβ42 반응에 차이가 없음을 보여준다.

실시예 7: BACE 억제제 화합물 1에 의한 플라크-보유 수컷 APP23 마우스의 만성 치료 처리

요약

2회의 투여량 시, 6개월 동안 플라크 보유 월령(12개월)의 APP23 트렌스제닉 마우스에 화합물 1을 만성적으로 투여하였다. 단지 비히클만이 제공된 그룹과 비교하여, 0.03 g/kg 사료의 화합물 1의 투여는 아밀로이드-β 40 및 42의 약간의 감소를 야기하고, 0.3 g/kg 사료의 투여는 비히클 그룹과 비교하여 아밀로이드-β 40 및 42의 큰 감소를 야기하였다. 마우스 뇌에서의 Aβ의 양은 기준선의 마우스(12개월령)와 유사하였다. 고 투여량 그룹에서는 혈장 및 CSF에서의 가용성 Aβ가 유일하게 유의하게 감소하였다. 면역조직화학에 의해 검출된 바와 같이, 플라크 부하량이 또한 저 투여량 그룹에서 약간(약 20%) 감소하였고, 고 투여량 그룹에서 크게(약 70%) 감소하였다. 소형 플라크, 중형 플라크 및 대형 플라크의 수는 처리에 동일하게 반응하였다. 활성화된 성상세포의 수를 GFAP 염색에 의해 결정하였다. 화합물 1에 의한 처리에 의해 총 GFAP 면역반응성은 투여량 의존적 방식으로 감소하였다. 대부분의 GFAP 양성 성상세포는 플라크와 결합되어 있지 않았으나 플라크 결합 성상세포는 플라크로부터 원위에 위치한 것과 비교하여 화합물 1 처리에 대해 더 강하게 반응하였다. IBA1에 의한 염색에 의해 활성화된 미세아교세포를 검출하였다. IBA1 양성 미세아교세포의 수는 화합물 1 처리에 의해 투여량 의존적으로 감소하였다. 플라크로부터 원위의 미세아교세포와 비교하여 아밀로이드 플라크의 근위의 미세아교세포가 처리에 의해 더 많이 감소하였다.

요약하자면, 화합물 1 처리는 비처리 비히클과 비교하여 마우스 뇌에서 뇌 아밀로이드-β 부하량의 투여량 의존적 감소, 및 2개의 신경염 마커인 활성화된 성상세포 및 미세아교세포의 수의 상호 연계 감소를 나타내었다.

방법

동물 및 투여량 선택

수컷 트렌스제닉, 이형접합 APP23(B6,D2-Tg(Thy1App)23Sdz(문헌[Sturchler-Pierrat C et al., 1997]), 12개월령 내지 14개월령, n=64)를 사료 펠렛 중의 0.3 g/kg 또는 0.03 g/kg 화합물 1로 처리하였다.

생체외 샘플 및 샘플 수확 방법

혈액 샘플을 사용하여, 전혈 화합물 수준을 분석하고, 부검 당일 몸통 혈액으로부터 EDTA Eppendorf 튜브(Milian SA, CatNo TOM-14, Fisher Scientific, 스위스 볼렌 소재), 또는 혈청 튜브(CB300Z, 자르슈테트, 독일 눔브레히트 소재)에 채혈하였다.

아밀로이드-β(Aβ) 분석용 혈장을 EDTA 혈액의 원심분리(8000 rpm/6800xg, 15분, 4℃)에 의해 수집하여, 단백질 Lo-Bind Eppendorf 튜브(003 0108.116, 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)에 수집하였다.

머리를 절단한 직후 뇌를 제거하고, 식염수로 세정하고, 중간선 이하의 시상 면을 절개하였다. 좌측 절반의 소뇌를 사용하여 화합물 수준을 분석하고, 유리 튜브(Chromacol, 125 x 5-SV T051, 영국 웰린 가든 시티 소재)에 배치하고, 중량을 측정하고, 드라이아이스에 동결시키고, 좌측 절반의 전뇌(후각 벌브 제외)를 Aβ 분석에 사용하고, 드라이아이스 상의 금속 판에 동결시키고, 단백질 Lo-bind 튜브(003 0108.116, Eppendorf, 독일 함부르크 소재)에 배치하였다.

연구 종료일에 꼬리를 수집하고 -20℃에 저장하였다.

화합물 수준의 분석

액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광분석(HPLC/MS/MS)에 의해 혈액 및 뇌에서 생물학적 샘플에서의 화합물 1 수준을 정량화하였다. 뇌 샘플을 2배 용적의 KH₂PO₄ 완충액과 혼합하고 Covaris^® 장치를 사용하여 균질화하였다. 30 μL의 혈액 또는 뇌 균질액을 구조적으로 관련된 내부 표준으로 스파이킹하고, 후속하여, 적어도 6배의 과량의 용적의 아세토니트릴과 혼합하여 단백질을 침전시켰다. 분석을 위해 상청액을 LC/MS/MS 시스템에 직접 주입하였다.

마우스 조직에서의 Aβ40 및 Aβ42의 분석

뇌 균질화

표준으로서 합성 Aβ 용액의 제조

APP23 마우스 뇌에서의 Triton X-100 가용성 Aβ의 결정

Meso Scale Discovery(MSD) 96 웰 MULTI-ARRAY 인간/설치류(6E10) Aβ40/42 분석(Meso Scale Discovery, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)에 의해 마우스에서 인간 Aβ40 및 42를 결정하였다. 보정 곡선 및 샘플 제조를 제외하고, 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였다. TritonX-100(TX-100) 가용성 Aβ40 및 42를 각각의 1:10 전뇌 균질액의 50 μl 분취량을 사용하여, 1% TX-100에 의해 전뇌로부터 추출하고, TBS 완전(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1x 완전 [프로테아제 억제제 칵테일 정제: 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, 독일 펜츠베르크 소재]) 중에서 50 μl 2% TX-100과 혼합하여, 1% TX-100의 최종 농도 및 1:20 전뇌 희석에 도달시켰다. 샘플을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하고, 5분 마다 와류시켰다. 샘플을 초 원심분리(100000 xg, 4℃, 15분)하고, 및 50 μl의 투명한 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 상청액을 3% 차단제 A 용액(키트) 중에서 1:5로 추가로 희석하여 최종 전뇌 희석이 1:100이 되도록 플레이트에 적용하였다.

비-트렌스제닉 마우스 뇌 샘플을 제외하고, 합성 Aβ1 내지 40 펩타이드(1.56 pg/ml 내지 100 pg/ml)로 스파이킹된 1% 차단제 A 용액의 상응하는 희석으로 보정 곡선을 제조하였다: 이 경우, 합성 Aβ1 내지 40 펩타이드(1.56 pg/ml 내지 100 pg/ml)로 스파이킹된 상응하게 희석된 APP 넉아웃 마우스 전뇌에서 보정 곡선을 제조하였다. 모든 샘플 및 표준에 대해 25 μl를 웰당 적용하였다. 각각의 결정 시, 이중 반복 웰을 실시하였다. 이중 반복 웰로부터의 평균 값을 사용하여 계산하였다. 샘플의 정량화 및 표준 곡선의 계산을 위해 샘플 및 표준의 상대 단위를 SOFTmax PRO 4.0 내에 도입시켰다.

APP23 마우스 뇌에서의 포름산 가용성 Aβ40의 결정

50 마이크로리터의 전뇌 균질액을 116.6 μl 100% 포름산과 혼합하여 최종 포름산 농도가 70%가 되도록 하였다. 샘플을 얼음 상에 저장하고 5분 마다 와류시켰다. 중화를 위해, 50 μl의 혼합물을 새 튜브 내에 피펫팅하고, 1x 완전 프로테아제 억제제를 함유하는 950 μl의 1 M Tris 염기를 첨가하였다. 튜브를 밤새 실온에 저장한 후, 4℃의 Eppendorf Microzentrifuge에서 14000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층으로부터 100 μl를 제거하고, 100 μl의 3% 차단제 A 용액(MesoScale 분석 키트의 일부)과 혼합하였다. 이 샘플을 분석 플레이트에 직접 제공하거나(희석 1:1332), 1% 차단제 A 용액 중에 추가로 희석하였다.

마우스 CSF에서의 Aβ40의 분석

마우스 CSF 샘플(3 μl)을 57 μL 1% 차단제 A(MSD)로 희석하고, 25 μl를 분석 플레이트에 제공하였다.

마우스 혈장에서의 Aβ40의 분석

혈장 샘플(30 μl)을 30 μl의 3% 차단제 A(MSD)와 혼합하고, 25 μl를 분석 플레이트에 제공하였다.

이중 형광 면역조직화학을 사용한 아밀로이드-베타 플라크 및 활성화된 성상세포의 조직학적 분석

아밀로이드 펩타이드의 C 말단 부분을 인식하는 토끼 항Aβ 일차 항체를 사용하여, 아밀로이드 플라크를 염색하였다(항체는 문헌[Schrader-Fischer G, Paganetti PA, 1996; Schrader-Fischer G et al., 1997]에 기재된 바와 같이 생성시킴). 활성화된 성상세포를 시판되는 토끼 항-GFAP(Dako Schweiz GmbH(스위스 바르 소재)로부터의 참조 Z0334)를 사용하여 검출하였다.

모든 염색은 전자동 장치 Ventana Discovery® Ultra(Roche Diagnostics Schweiz AG, 스위스 로트크로이츠 소재)를 사용하여 수행하였다. 모든 화학 물질은 Roche Diagnostic에 의해 제공되었다.

모든 연구 동물을 사용하고, 3 마이크로미터의 뇌 조직 절편을 새로 절단하여 SuperFrost+ 슬라이드 상에 수집하였다. 조직 절편을 탈파라핀화시키고, 무용매 조건(EZprep 용액) 하에서 재수화시킨 후, EDTA 기반 완충액(CC1 용액)에서 32분 동안 열 회수 순환에 의해 항원 회수(탈회)를 수행하였다. 후속하여, DISCOVERY 억제제(참조 07017944001(Roche))를 사용하여 4분 동안 슬라이드를 차단하였다. 항체 희석제에 1/20'000으로 희석된 일차 항체를 수동으로 조직 절편에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단기 후-고정(0.05%의 글루타르알데하이드)을 수행한 후, 항체(참조 05269717001) 사용 준비된 다량체 UltraMap-항 토끼 HRP를 16분 동안 적용하였다.

DISCOVERY FITC®를 사용하여 제조사의 권고에 따라 검출을 수행하였다. 그 후, 슬라이드를 92℃에서 20분 동안 열 변성시킨 후, 제2 일차 항체(1 / 2'000으로 희석된 항-GFAP)를 수동으로 적용하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. UltraMap-항-토끼 HRP 항체를 20분 동안 다시 사용하여 DISCOVERY 로다민 키트(참조 07259883001)와 조합된 GFAP를 검출하였다.

슬라이드를 세척하고, Prolong® Gold antifade 시약(참조 P36931, ThermoFisher, 스위스 소재)을 사용하여 마운팅하고, 40x 대물렌즈에서 Hamamatsu 슬라이드 스캐너 장치(NanoZoomer 2.0 HT, 스캐닝 소프트웨어 NDP-Scan Vers. 2.5, Hamamatsu Photonics France, Swiss Office, 스위스 졸로투른 소재)에 의해 추가로 스캐닝하였다. 스캐닝 설정은 다음과 같다: FITC 필터뿐만 아니라, DAPI 필터의 노출 시간을 57 ms로 설정하였다. TRITC 필터의 노출 시간(로다민의 검출)은 14.2 ms로 설정하였다.

이중 형광 면역조직화학을 사용한 아밀로이드-베타 플라크 및 활성화된 미세아교세포의 분석

아밀로이드 플라크를 동일한 항체를 사용하여 염색하고, 미세아교세포를 Wako Chemicals GmbH(독일 노이스 소재)로부터의 토끼 항-IBA1 항체(참조 019-19741)를 사용하여 검출하고, 항체 희석제 중에 1/200으로 희석하였다. 염색 프로토콜은 아밀로이드-베타 플라크 및 성상세포의 프로토콜과 정확하게 유사하였다. 슬라이드를 동일한 설정으로 스캐닝하였다.

이미지 분석

이미지 분석을 기반으로 한 정량적 플라크 평가에서, 등록 상표인 이미지 분석 플랫폼(ASTORIA, 자동 저장 이미지 분석)을 MS Visual Studio 2010 및 Matrox MIL V9 라이브러리(Matrox Inc, 캐나다 퀘벡 소재)로부터의 많은 기능을 기반으로 하여 개발하였다.

베타-아밀로이드 플라크 및 신경염 분석에서, 다음 순서의 단계를 수행하였다:

- 슬라이드를 40x 배율의 Hamamatsu Nanozoomer로 스캐닝하였다. 각각의 형광 표지(DAPI, FITC 및 TRITC)를 위해 개별 이미지를 생성하였다.

- 녹색 FITC 채널 이미지에 대한 Aβ 플라크 평가를 위해 뇌 절편에서의 피질을 규정하기 위한 ROI(관심 영역)의 윤곽선을 수동으로 표시한 후, 또한 다른 2개의 채널 이미지(xml 파일 생성 복사본)에 대해 생성된 윤곽선을 사용한다.

- 3개의 형광 채널 각각에 대한 *.tif 이미지 파일(10x 배율)의 생성 및 출력을 위해 자체 개발된 ImageScope(V12.1.0.5029, Aperio Inc., 미국 소재) 플러그 인을 실행한다.

이미지 배치 처리:

- 각각의 개별 형광 채널 이미지에 액세스함으로써 각각의 절편의 조합된 트루 컬러 이미지(true color image)(DAPI, FITC, TRITC)를 획득한다.

- 흑색의 비염색 백그라운드로부터의 유효한 샘플(윤곽선 표시된 ROI 내)의 분할.

- 녹색 채널 이미지(FITC-표지 Aβ 플라크)에서 객체의 분할을 위해 적응형 임계치화 기법을 적용한다.

- 녹색(FITC) 채널에서 신호를 발산하는 매우 작은 파편을 제거한 후, 정확한 후속 개별 객체 분석을 위한 접촉 객체의 분리.

- 형태학적 톱햇(tophat) 변환 및 임계치화를 통한 (성상세포 또는 미세아교세포를 나타내는 GFAP 또는 Iba1 염색에 특이적인) 적색 채널에서의 TRITC-표지 객체의 분할.

- 특징 기반 객체 분류

4개의 객체 범주

- 제외되어야 할 비특이적 파편(매우 희미한, 매우 작은 객체)

- 소형 플라크(40... 1000 픽셀)

- 중형 플라크(1000... 6500 픽셀)

- 대형 플라크(6500 픽셀 초과)

유효한 플라크의 수회의 형태계측 및 밀도계측 특징의 전산화

- 플라크의 수

- 비선형 방식의 적절한 항체의 염색 강도를 사용한 측정을 기반으로 한 단백질(항원) 농도의 양을 반영하도록 기재된 "특이적 광학 밀도"(문헌[Rahier et al., 1989; Ruifrok et al., 2001])

- TRITC+ 신호 대 플라크 면적의 비율을 기반으로 한 "플라크 결합 GFAP 또는 Iba1", 플라크 주변의 확장 고리 내의 TRITC+ 신호의 비율을 기반으로 한 "근위 GFAP 또는 Iba1"의 평가.

결과

투여 2개월 및 4개월 후 및 6개월의 연구 종료 시에 화합물 1의 혈액 농도를 결정한다. 표 24에 제시된 바와 같이, 연구 과정 동안 일정한 노출이 존재하였으며, 동물 사이의 허용 가능한 편차는 평균적으로 18%(8% 내지 36%)였다. 평균 화합물 1 혈액 농도는 0.03 g/kg 사료 투여 그룹의 경우 0.25 ± 0.13 μM(평균 ± SD)이었고, 0.3 g/kg 투여 그룹의 경우 2.10 ± 0.47 μM였으며, 이는 화합물 투여량의 10배 차이에 적절히 일치하는 것이었다. 본 연구에서 관찰된 노출은 화합물 1의 5 mg/kg 및 45 mg/kg의 1일 경구 투여량에 거의 상응하였다. 실험 종료 시에 결정된 뇌/혈액 비율은 0.03 g/kg 그룹의 경우 2.7이었고, 0.3 g/kg 그룹의 경우 3.3이었다.

APP 대사 산물의 생화학적 결정: 마우스 뇌로부터의 Triton TX-100-가용성 APP 대사 산물

뇌 균질액을 완충액 중 1% Triton X-100으로 추출하고, 생성된 상청액은 APP 대사 산물의 가용성 형태를 나타내는 것으로 간주되었다. Aβ40 및 42에 추가하여, 본 발명자들은 N-말단 APP 단편 sAPPα(α-세크레타제의 직접 절단 산물) 및 sAPPβ(Swe)(BACE1 절단의 직접 산물)를 결정하였다. 표 25에 제시된 바와 같이, 가용성 Aβ40 및 42는 비처리 그룹에서 연구 과정 동안 중간(2배 미만)으로 증가한다. 이 월령 동안 APP 발현 및 Aβ 생성에서의 변화가 유발되지 않은 것으로 인식되므로, 비히클 그룹(18개월령 내지 20개월령)에서의 증가 값은 Aβ 침착물의 "누출"로부터 유발되는 것으로 추정된다(수배 증가함, 하기 제시). 또한, 가용성 APP 대사 산물 sAPPα 및 β의 값은 비처리 그룹에서 유의하게 변화하지 않았다.

저 투여량(0.03 g 화합물 1/kg 사료)의 화합물 1로 처리된 마우스는 가용성 Aβ40 및 42의 약하나, 유의하지 않은 감소를 나타내었고, sAPPα에서 중간의 증가를 나타내었다(표 25 및 표 26, 도 11, 도 12 및 도 13). 가용성 APPβ(Swe)는 29%만큼 유의하게 감소하였다(표 25 및 표 26, 도 14). 화합물 1의 0.3 g/kg 투여량으로 처리된 마우스는 Aβ 및 sAPPβ(Swe) 둘 모두의 유의한 감소를 나타내었으며, 그뿐만 아니라 sAPPα에서 3배의 증가를 나타내었다(표 25 및 표 26, 도 11, 도 12 및 도 14).

종합하자면, 화합물 1 처리는 모든 가용성 BACE1 절단 산물의 투여량 의존적 감소를 야기하였으며, sAPPα에서 투여량 의존적 증가를 야기하였다.

CSF에서의 APP 대사 산물

부검시 모든 마우스로부터 CSF를 수집하였다. 기준선 그룹으로부터의 샘플을 대략 6개월 동안 저장하였으며, 연구 종료 시에 나머지 샘플과 함께 분석하였다. 표 27 및 도 15의 데이터는 CSF Aβ가 기준선 그룹(12개월령의 APP23 마우스)에서는 최고 수준이나 비히클 그룹(18개월령의 APP23 마우스)에서는 하락함을 보여준다. 이러한 비히클 그룹과 비교하여, 0.03 g/kg 사료 화합물 1 치료 그룹에서는 CSF Aβ40이 유의하지 않게 감소하며, 0.3 g/kg 사료 화합물 1 치료 그룹에서는 유의하게 감소한다. 높은 기준선 값의 원인은 현재 밝혀져 있지 않다. Aβ의 올리고머 형태의 해리가 더 높은 단량체 농도를 야기할 수 있는 경우, 이는 장기간 저장의 효과인 것으로 가정된다. 뇌 추출물로부터의 Triton TX-100 용해 Aβ보다 더 많은 CSF Aβ가, Aβ 생성의 변화에 직접적으로 반응하는 가용성 아밀로이드-β의 정상 상태 농도를 나타낸다. 높은 화합물 1 투여량(-43.7% 내지 -77%)에서의 현저하고 유의한 효과뿐만 아니라, 낮은 화합물 1 투여량(-4.6% 내지 -20%)에서의 소폭의 유의하지 않은 처리 효과는 뇌 조직으로부터 단리된 가용성 Aβ 종과 CSF에서의 Aβ40 사이에 매우 근사하다.

전뇌의 포름산 가용성 아밀로이드-베타 펩타이드

불용성 Aβ 종을 포름산으로 추출한 후, APP23 마우스 뇌에서의 아밀로이드-β의 침착된 형태에 대한 화합물 1의 처리 효과를 연구하였다. 표 28 및 표 29 및 도 16 내지 도 19에 제시된 바와 같이, 기준선과 비교하여 침착된 Aβ의 대폭 증가가 비히클 그룹에서 관찰되었다. Aβ42가 Aβ40보다 더 많이 증가하였으며(비히클 그룹에서 Aβ42/40 비율은 55%만큼 증가함), 이는 그의 더 높은 응집 경향과 일치하였다. Aβ40 및 Aβ42는 비히클과 비교하여 화합물 1의 저 투여량의 처리 후에 약 17%의 감소를 나타내었으나, 이는 통계적 유의도에 미치지 못했다. 추출물의 Aβ42/40 비율은 변하지 않았다. 침착된 Aβ40 및 Aβ42의 강하고 매우 유의한(비히클 대비 대략 80%) 감소가 높은 화합물 1 치료 그룹에서 관찰되었으며, Aβ42/40 비율은 0.07의 기준선 값으로 복원되었다. 요약하자면, APP23 마우스에서 화합물 1의 고 투여량의 처리는 아밀로이드 β의 증가를 거의 완전히 차단하였다.

아밀로이드 병리 및 신경염의 조직학적 평가: 플라크 수 및 플라크 면적

APP23 뇌 슬라이스 상의 아밀로이드 플라크를 아밀로이드 펩타이드의 C-말단 부분을 인식하는 항Aβ 항체로 염색하였다. 더욱 상세한 데이터 분석을 위해 APP23 마우스에서 다양한 형태의 아밀로이드-β 침착을 "소형", "중형" 및 "대형" 플라크로 분류하였다. 추가로, 총 면역-염색 면적을 결정하였다. 정량화 결과가 표 30 및 표 31 및 도 20 내지 도 23에 제시되어 있다. 대부분의 Aβ 침착물이 "소형" 플라크로 분류되었고, "중형" 플라크의 수는 10배 더 낮았으며, "대형" 플라크의 수는 100배 더 낮았다. 연구 기간 동안 비히클 그룹에서 모든 형태의 플라크의 수가 대략 4배 내지 6배 증가하였으며, 총 플라크 면적은 이와 동일하게 관찰되었다. 화합물 1의 처리는 저 투여량 치료 그룹에서 증가 폭을 약 25%만큼 감소시켰으며, 고 투여량 치료 그룹에서 약 60%만큼 감소시켰다. 비히클 그룹에서의 Aβ 증가 및 0.3 g/kg 사료 화합물 1 치료 그룹에서의 효과는 생화학적 결정과 비교하여, 조직학적 분석에서 더 낮다. 2차원 조직학적 분석은 모든 3차원에서 실제로 일어나는 플라크 용적 변화를 완전하게 재현하지 않을 수 있다.

활성화된 성상세포의 효과

GFAP(Glial Acidic Fibrillary Protein)는 활성화된 성상세포에서뿐만 아니라, 휴지기에서도 발견된다. GFAP 면역반응성은 종종 성상세포 수 및 활성화의 마커로서 사용된다. APP23 마우스에서, 마우스 월령이 대략 2배인 경우, 정규화된 GFAP 양성 면적이 증가하며, 이러한 증가는 화합물 1 처리에 의해 투여량 의존적 방식으로 감소하였다(표 32 및 표 33 및 도 24 내지 도 28). 아밀로이드 플라크와의 결합 여부와 관련하여, GFAP 면역반응성을 추가로 분류하였다(IBA1 면역반응성과 동일하게 수행함). 이러한 분석은, 대부분의 GFAP 면역반응성이 비-플라크 결합(원위)이고, 단지 10%만이 플라크 결합 또는 근위임을 보여준다. 비히클 그룹에서, 플라크 결합의 분획 및 근위 GFAP 면역반응성이 증가하였으며, 이는 아밀로이드 플라크와 근접하는 경우 성상세포 수/활성화가 우세하게 증가함을 시사한다. 원위의 비 플라크 결합 GFAP 양성 염색의 경우 노화에 따른 증가가 낮았다. 또한, 화합물 1 처리의 효과는 플라크 결합과 비-플라크 결합 GFAP 면역반응성 사이에 상이하였다: 플라크 결합/근위 GFAP 면역반응성에 대한 효과는 비-플라크 결합/원위 염색에서보다 더 강했다. 이들 데이터는 화합물 1이 주로 아밀로이드 플라크와 바로 근접한 경우, GFAP 염색에 대해 가장 가능하게는 플라크 자체에 효과를 가하는 방식으로 그 효과를 발휘함을 시사한다.

IBA1 양성 미세아교세포의 효과

IBA1(이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1)은 미세아교세포/대식세포 특이적 단백질이다. IBA1 면역반응성은 종종 미세아교세포 수 및 활성화의 마커로서 사용된다. APP23 마우스에서, 마우스 월령이 대략 5배인 경우, 정규화된 IBA1 양성 면적이 증가하며, 이러한 증가는 화합물 1 처리에 의해 투여량 의존적 방식으로 감소하였다(표 34 및 표 35). 아밀로이드 플라크와의 결합 여부와 관련하여, IBA1 면역반응성을 추가로 분류하였다. 이러한 분석은, 대략 75%의 IBA1 면역반응성이 비-플라크 결합(원위)이고, 단지 25%만이 플라크 결합 또는 근위임을 보여준다. 비히클 그룹에서, 플라크 결합의 분획 및 근위 IBA1 면역반응성이 증가하였다. 또한, 원위 및 비 플라크 결합 IBA1 양성 염색이 마우스의 월령에 따라 더 낮은 정도로 증가하였다. 또한, 화합물 1 처리의 효과는 플라크 결합과 비-플라크 결합 IBA1 면역반응성 사이에 상이하였다: 플라크 결합/근위 IBA1 면역반응성에 대한 효과는 강하고 유의하였다. 비-플라크 결합/원위 염색에서는 유의한 효과가 존재하지 않았다. 이는 플라크 면적에 대한 총 IBA1 염색 및 플라크 결합 IBA1 염색의 효과를 도시하는 도 29 내지 도 33에 추가로 예시되어 있다. 이들 데이터는 화합물 1이 주로 아밀로이드 플라크와 바로 근접한 경우, IBA1 염색에 대해 가장 가능하게는 플라크 자체에 효과를 가하는 방식으로 그 효과를 발휘함을 시사한다. 플라크로부터 원위인 경우, 플라크에 대한 효과는 미세아교세포 활성화/수에 강하게 영향을 미치지 않는다(대부분의 IBA1+ 면역반응성).

실시예 8: AD의 임상 증상의 발병 위험이 있는 참여자에서 화합물 1의 효능을 평가하기 위한 무작위 이중 블라인드 방식의 위약 대조군 연구의 요약

본 명세서에 기재된 임상 시험에서, 적정 시간대에 현저한 인지기능 악화 가능성이 더 큰 개체를 선택하기 위한 예후 강화 전략으로서 ApoE4 동형접합체의 확인이 사용되며, 이는 임상 시험의 설정 내에서 실질적으로 평가할 수 있다. 본 연구는 ClinicalTrials.gov에 NCT02565511 식별자 코드로 등재되어 있다. 대안적으로, 본 실시예는 15 mg 또는 50 mg 화합물 1을 1일 1회 경구 투여한 60세 내지 75세의 인지기능 무손상 ApoE4 보인자(예를 들어, PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는 뇌 아밀로이드("아밀로이드-양성")가 추가로 강화된 동형접합체; 또는 이형접합체)에 의해 수행할 수 있다. 본 연구는 ClinicalTrials.gov에 NCT03131453 식별자 코드로 등재되어 있다.

제의된 임상 시험에서 적어도 5년의 처리 기간 동안, 상당한 비율의 참여자가 AD로 인한 경증의 인지기능 손상(MCI) 또는 치매로 진단될 것으로 예상된다. 진단의 대부분은 MCI일 것으로 예상되며, 이는 치매 진단에 2년 내지 4년 선행될 것으로 예상된다.

실시예 9: 강한 CYP3A4 억제제 이트라코나졸 또는 강한 CYP3A4 유도제 리팜 피신과 조합하여 제공된 경우 및 단독으로 제공된 경우의 화합물 1의 약동학의 인체 연구

건강한 지원자에서의 약물-약물 상호작용(DDI) 연구에서, 화합물 1의 PK에 대한 강한 CYP3A4 억제제(이트라코나졸) 및 강한 CYP3A4 유도제(리팜피신)의 효과를 평가하였다. DDI 연구 설계가 도 34에 개괄되어 있다. 200 mg q.d.의 투여량의 이트라코나졸은 화합물 1과 함께 제공된 경우, 화합물 1이 단독으로 제공된 경우와 비교하여, 화합물 1의 평균 AUC를 2배 내지 3배 증가시켰으며, 화합물 1의 평균 Cmax를 25%만큼 증가시켰다(표 37). 600 mg q.d.의 투여량의 리팜피신은 화합물 1이 단독으로 제공된 경우와 비교하여 화합물 1과 함께 제공된 경우 화합물 1의 평균 AUC를 5배 내지 6배 저하시켰으며, 화합물 1의 평균 Cmax를 2.5배 저하시켰다(표 38). 결론적으로, 1기 연구에서 화합물 1 노출에 대한 강한 CYP3A4 유도제 및 강한 CYP3A4 억제제의 효과는, CYP3A4/5가 화합물 1의 제거에 매우 중요함을 보여주었다.

처리 및 대상체에 대해 일정한 효과를 갖는 ANOVA 모델을 각각의 로그-변환 PK 매개변수에 적용시켰다. 결과를 다시 변환하여, '조정된 geo-평균', 'Geo-평균 비율' 및 '90% CI'를 획득하였다.

실시예 10: 화합물 1의 처리에 대한 반응으로 고령의 건강한 ApoE4 이형접합체 및 ApoE4 비 보인자에서 기준선으로부터의 Aβ42 / Aβ40 비율의 변화의 평가

뇌에서의 증가된 Aβ 침착은 확립된 PET 추적자, 예를 들어¹¹C-Pittsburg 화합물 B, ¹⁸F-플로베타벤, 또는 ¹⁸F-플루테메타몰을 사용한 피질 Aβ의 PET 영상 및 또한 CSF Aβ 1 내지 42에서의 저하로서 결정할 수 있다. 다수의 연구가, 뇌에서 아밀로이드-β 병리의 검출을 위한 PET 영상 대 CSF Aβ 1 내지 42 분석 사이의 높은 일치성을 보여주었다(문헌[Weigand SD et al., 2011; Barthel H et al., 2011; Schipke CG et al., 2017]). 이러한 상관관계는, CSF Aβ 1 내지 42의 감소가 뇌에서 증가된 아밀로이드-β 침착의 결과임을 나타낸다. Aβ 1 내지 42와 달리, 피질 아밀로이드 침착물에 축적되기 어려운 Aβ 1 내지 40의 CSF 농도는 피질 아밀로이드-β 부하량이 높은 환자에서도 실질적으로 일정하게 유지된다. 이와 일치되는 것으로, Aβ 1 내지 42를 단독으로 사용하는 대신 CSF Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율을 사용하는 경우, 더욱 강력한 PET-CSF 상관관계가 획득되는 것으로 나타났다(문헌[Pannee J et al., 2016; Janelidze S et al., 2016]). 뇌에서 아밀로이드-β 병리의 검출을 위한 진단 툴로서 Aβ 1 내지 42/Aβ 1 내지 40 비율을 사용하는 것이 잘 확립되어 있으나, 항아밀로이드제의 처리에 대한 반응으로의 이러한 매개변수의 변화는 종래에 기재된 바가 없었다.

실시예 5에 기재된 고령의 건강한 대상체에서의 완결된 3개월 투여 범위의 안전성 및 내성 임상 연구에서, 제1 투여 전(기준선) 및 3개월의 다회 투여 후, 요추 천자에 의해 CSF에서의 Aβ40 및 Aβ42 농도를 획득하였다. 상당수의 대상체가 피질 아밀로이드 침착을 나타내는 것으로, 기준선 CSF Aβ42/Aβ40이 정상치 미만(0.09의 컷 오프 미만)인 것으로 나타났다. 비율이 0.09 미만인 대상체의 백분율은 비 보인자(15%)와 비교하여, ApoE4 보인자 그룹(33%)에서 더 높다. 이는 ApoE4 보인자에서 아밀로이드증이 발병할 위험이 증대된 것과 일치한다.

기준선 CSF Aβ42/Aβ40 비율이 0.09 미만인 대상체에서 3개월 동안의 화합물 1의 처리가 완료된 후의 CSF Aβ42/Aβ40 비율을 결정하였다, 도 35. 화합물 1의 처리는 동일한 대상체의 기준선 값과 비교하여, Aβ42/Aβ40 비율을 투여량 의존적 방식으로 증가시킨 것으로 나타났다. 증가된 Aβ42/Aβ40 비율은 ApoE4 대립유전자의 보인자 및 비 보인자 둘 모두의 경우, 처리에 대한 반응인 것으로 나타났다. 구체적으로는, 35 mg 및 85 mg의 1일 투여량은 Aβ42/Aβ40 비율의 1.36배(p<0.01 vs. 위약) 및 1.46배(p<0.01 vs. 위약) 증가를 야기하였다.

이러한 결과는 뇌로부터 CSF로의 Aβ42의 수송이 증가하였음을 나타내며, 이는 더 고 투여량의 화합물 1로 처리한 대상체에서의 감소된 피질 아밀로이드-β 부하량에 상응한다. 피질 아밀로이드-β 부하량의 감소는 화합물 1이 ApoE4 대립유전자의 보인자 및 비 보인자 둘 모두에서 AD의 아밀로이드 병리 특징을 변형시킬 수 있음으로써 이들 환자 그룹 중 어느 하나에서 AD의 예방에 효과적일 것으로 예상됨을 나타낸다.

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알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자에서 알츠하이머병의 예방에 사용하기 위한 화합물 N-(6-((3R,6R)-5-아미노-3,6-디메틸-6-(트리플루오로메틸)-3,6-디하이드로-2H-1,4-옥사진-3-일)-5-플루오로피리딘-2-일)-3-클로로-5-(트리플루오로메틸)피콜린아미드, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하거나 다운 증후군을 갖는, 제1항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
환자는 알츠하이머병의 임상 증상 발생에 대한 유전적 소인을 보유하고 유전적 소인은:
(i) 아밀로이드 전구체 단백질, 프레세닐린(presenilin)-1 또는 프레세닐린-2에 대한 유전자 내의 돌연변이; 또는
(ii) ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피의 존재
인, 제2항에 따라 사용하기 위한 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
알츠하이머병의 임상 증상 발생 위험이 있는 환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개 또는 2개의 카피를 보유하는, 제3항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
환자는 ApoE4 대립유전자 중 1개의 카피를 보유하는, 제4항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
환자는 ApoE4 대립유전자 중 2개의 카피를 보유하는, 제4항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
환자는 아밀로이드-양성인, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
아밀로이드-양성은 PET 또는 CSF 측정에 의해 결정되는, 제7항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
환자는 60세 내지 75세인, 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 70%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
화합물은, 화합물 노출의 2주 후 CSF에서 Aβ 1 내지 40의 적어도 50%의 저하를 야기하는 1일 투여량으로 사용되는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
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