KR20190030263A - 식물에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 세포에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 목적 단백질의 분리 정제하는 방법에 관한 발명이다. 본 발명에 따른 식물세포를 이용한 목적 단백질 발현 시스템은 종래 식물세포 배양의 문제점을 해소하며, 바이오의약 단백질을 포함하는 목적 단백질을 대량생산함으로써, 식물유래 단백질 제품 등의 바이오 의약품의 상업화를 가능하게 하여 매우 효과적이다.

Description

식물에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 {Recombinant vector for separating and purifying target protein in plant}

본 발명은 식물 세포에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 목적 단백질의 분리 정제하는 방법에 관한 발명이다.

분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 경우, 생산 단가를 파격적으로 줄일 수 있고, 종래의 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 분리 정제하는 방법에서 발생할 수 있는 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 장기 보관 및 관리할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 해당 유용 물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템에 비해 절대적으로 유리하기 때문에 최단 기간에 높아진 수요에 따른 공급이 가능하다는 것도 장점이다.

하지만, 이와 같은 장점에도 식물 세포에서 단백질을 생산함에서 동물세포를 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현 및 분리 정제의 어려움이 가장 큰 단점이 되고 있다. 이에 많은 연구가 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질 발현량을 증가시키고 효율적으로 단백질을 분리 정제하려는 시도가 있었다.

한 편, Cellulose-binding module 3 (CBM3)은 C. thermocellum에서 확보한 cellulose binding domain으로 cellulose에 대단히 높은 결합력을 보이고 있어서 단백질 순수 분리용 affinity tag로서 활용하기 위한 몇 가지의 특성을 가지고 있다. 상기 CBM3는 무정형 cellulose에 특이적이고 높은 affinity를 가지고 있으며, CBM3에 목적 단백질을 fusion하였을 때 fusion된 target 단백질의 간섭을 덜 받으며, 또한 fusion된 목적 단백질의 folding을 도와준다고 알려져 있다 (Wen Wan et al. 2011). 미생물에서는 CBM3이 단백질의 생산수율을 높이는 것으로 보고되었다. 상기 CBM3가 결합하는 셀룰로즈는 친화성 수지로서 친환경적이며, 가격이 대단히 저렴하다는 것 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. cellulose는 화학적인 반응성이 거의 없어 다양한 조성의 버퍼 용액을 사용할 수 있으며, 단백질과도 반응을 하지 않을 것으로 알려졌다. 또한, 다양한 형태의 셀룰로즈가 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 장점도 있다. 따라서 단백질 순수 분리에 최적의 친화적 수지가 될 수 있는 다양한 조건을 가지고 있다. 실제로 인체친화성으로 인하여 이미 다양한 의료용 및 인체적용 제품에 활용되고 있다. Small ubiquitin-related modifier(SUMO)는 진핵세포의 ubiquitin-like molecules (Ubls) 들 그룹 중에서 ubiquitin 다음으로 많이 연구된 단백질을 수식하는 적은 단백질이다.. SUMO는 C-말단을 통해서 다양한 타겟 단백질에 존재하는 라이신의 ε-amino 잔기와 isopeptide를 형성함으로써 공유 결합으로 연결된다. 이 SUMO를 target 단백질에 융합하기 위해서는 SUMO 특이적인 단백질 분해효소가 SUMO 전구체로부터 C-말단 부위에 존재하는 extra 부위를 제거하여야 한다. 이때SUMO 특이적인 단백질 분해효소는 SUMO domain의 C-말단부에 특이적으로 존재하는 글라이신(glycine)-글라이신(glycine) motif를 인식하여, GG 서열의 C-말단에 존재하는 extra 부위를 제거하게 된다. SUMO protease가 SUMO 전구체로부터 SUMO를 만들때 SUMO domain을 인식하게 되고 두 개의 글라이신의 C-terminal 부위를 자르게 되므로 SUMO protease는 대단히 높은 특이성을 보일 수 있다.또한 두 개의 glycine residue 다음에 오는 아미노산의 종류에 대해서 거의 특이성을 보이지 않으므로 다양한 단백질을 di-glycine 잔기 뒤에 달수가 있으며 이로부터 정확하게 di-glycine을 C-말단에 갖는 mature SUMO domain을 제거함으로써 C-terminal 부위에 있는 특정 단백질이 extra 아미노산을 갖지 않게 할 수 있는 특성을 가지고 있다. 따라서 SUMO에 target 단백질을 fusion하여 SMO-target의 융합 단백질로 만들고 이로부터 SUMO domain을 제거하여 원하는 N-말단에 다른 extra 아미노산 잔기를 갖지 않는 target 단백질을 만들 수 있다.

본 발명자들은 식물 세포에서 목적 단백질을 분리 정제를 용이하기 위해 예의 노력한 결과, CBM3 및 SUMO을 목적 단백질에 융합하였을 때 단백질의 분리 정제가 용이하다는 것을 확인하였고, 이를 이용하여 형질전화 식물체에서 목적 단백질 분리 정제를 할 수 있다는 점을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 식물에서 SUMO domain; 및 CBM3 또는 sCBD를 목적 단백질에 융합하여 재조합 단백질의 고발현을 유도하고, CBM3의 경우 Mp domain을 이용하여 추가로 단백질의 발현을 높인 후, 식물세포의 총 단백질 추출물로부터 저비용으로 재조합 단백질을 순수 분리 정제하며, 상기 재조합 단백질 정제 시 사용된 친화성 태그인 CBM3 또는 sCBD의 완벽한 제거하기 위해 재조합 단백질을 AMC에 CBM3를 이용하여 고정 시킨 상태에서 bdSENP1을 이용하여 목적 단백질만을 추가 순서 없이 순수 분리 정제하여 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은, (a) CBM3(Cellulose-binding module 3) 또는 sCBD(Cellulose-binding module 1); 및 (b) SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제를 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

(a) 상기에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환 식물체를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계;

(d) 상기 발현된 목적 단백질을 셀룰로즈 비드에 결합하는 단계; 및

(e) 상기 세룰로즈 비드에 결합된 목적 단백질에 bdSEBNP1을 처리하여 목적 단백질만 분리 정제하는 단계.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) CBM3(Cellulose-binding module 3) 또는 sCBD(cellulose binding module 1); 및 (b) SUMO(Small ubiquitin-related modifier)를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제를 위한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 상기 CBM3(Cellulose-binding module 3)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이고, sCBD(Cellulose-binding module 1)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이며, SUMO(Small ubiquitin-related modifier)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터에 Mp(mannosylated peptide region)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 Mp(mannosylated peptide region)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터에 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터의 개열지도는 도 2로 표시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 하기의 단계를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

(a) 상기에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환 식물체를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계;

(d) 상기 발현된 목적 단백질을 셀룰로즈 비드에 결합하는 단계; 및

(e) 상기 세룰로즈 비드에 결합된 목적 단백질에 bdSEBNP1을 처리하여 목적 단백질만 분리 정제하는 단계.

본 발명의 상기 셀룰로즈 비드는 카르복실 메틸 셀룰로즈(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로즈(methyl cellulose, MC), 무정형 세룰로즈(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로즈(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로즈(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로즈 비드를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 bdSEBNP1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 상기 bdSEBNP1은 대장균에서 발현된다.

본 발명은 의료용 단백질과 같은 재조합 단백질을 식물에서 고 발현 시킨 후 저비용의 셀룰로즈(cellulose)를 친화성 수지(affinity resin)로 사용하여 순수하게 분리 정제 한 후, 분리 정제용 친화성 태그(affinity tag)를 완벽하게 제거하여 목적 단백질 부분만을 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 SUMO domain를 포함하므로 써, 식물에서 재조합 단백질의 고발현을 유도하는 할 수 있고, SUMO에 target 단백질을 fusion하여 SUMO-target의 융합 단백질로 만들고 이로부터 SUMO domain을 제거하여 원하는 N-말단에 다른 추가 아미노산 잔기를 갖지 않는 target 단백질을 만들 수 있으며, SUMO를 인식하는 protease인 SUMO protease site 인 di-glycine motif를 가지므로 proteolytic cleavage를 통하여 목적 단백질만을 순수 분리 하는 효과가 있다. 또한, 재조합 단백질의 순수분리용 친화성 태그(affinity tag)인 Clostridium thermocellum의 CBM3(cellulose-binding module 3) 또는 Trichoderma reesei의 sCBD(cellulose binding module 1)을 포함함으로써, 식물에서 총 단백질 추출물로부터 저비용으로 재조합 단백질을 순수 분리 정제 할 수 있고, 분리 정제 한 후 이를 셀룰로스 수지에 고정화 할 수 있다는 장점도 있다. 나아가, 재조합 단백질의 유전자의 N-과 C-말단에 각각 BiP의 signal sequence와 ER retention signal인 HDEL를 포함하므로써, ER(소포체)에 고농도로 축적을 유도하는 효과를 가진다. 또한, MP domain을 cellulose binding domain의 앞부분 및 BiP의 뒷부분에 포함하므로 써 발현 레벨을 증진시킨 것을 포함한다. 따라서 본 발명을 식물체로부터 고효율, 고발현의 목적 단백질을 수득할 수 있어 식물체를 활용한 산업용 또는 의료용 단백질의 대량생산에 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 CBM3-bdSUMO를 이용한 목적 단백질의 순수 분리 방법의 모식도이다.
도 2은 본 발명의 목적 단백질을 정제 및 분리용 재조합 발현 벡터의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 목적 단백질을 정제 및 분리용 재조합 발현 벡터의 개열지도 이다.
도 4은 본 발명에 식물 또는 대장균에서 발현 되는 재조합 발현 벡터의 모식도이다.
도 5은 본 발명은 bdSUMO 특이적인 단백질 가수분해 효소 (bdSENP1)에 의한 애기장대 protopalst 발현 시스템을 이용한 생체내 SUMO fusion 단백질의 분해 활성을 확인한 웨스턴 블럿 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균으로부터 Ni2+-NTA agarose column을 이용한 순수 분리한 bdSENP1의 웨스턴 블럿 사진이다.
도 7은 본 발명의 Mp-CBM3-SUMO fusion hIL6의 식물에서의 발현을 확인한 웨스턴 블럿 사진이다.
도 8은 본 발명의 AMC를 이용한 Mp-CBM3-SUMO-IL6 분리 및 AMC에 고정화를 확인한 사진이다.
도 9는 본 발명의 AbdSENP1를 이용하여 AMC에 고정된 Mp-CBM3-bdSUMO fusion hIL6의 in vitro 가수분해 활성을 확인한 사진이다.
도 10은 본 발명의 AMC에 고정된 Mp-CBM3-bdSUMO-IL6 fusion protein으로부터 과 bdSENP를 이용하여 정제용 태그의 제거와 column chromatography를 이용하여 순수분리한 hIL6를 확인한 SDS-page 및 웨스턴 블럿 사진이다.
도 11은 본 발명의 식물에서 생산한 hIL-6에 의한 human LNCaP에서의 STAT3 활성 검증한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 이에 본 발명자들은 식물에서 SUMO domain을 이용하여 재조합 단백질의 고발현을 유도함과 동시에 SUMO domain은 SUMO를 인식하는 protease인 SUMO protease site 인 di-glycine motif를 가지므로 proteolytic cleavage를 통하여 목적 단백질만을 순수 분리할 수 있고 CBM3(Cellulose-binding module 3) 또는 sCBD(cellulose binding module 1)를 이용하여 재조합 단백질을 발현하는 식물세포의 총 단백질 추출물로부터 저비용으로 재조합 단백질을 순수 분리 정제할 수 있으며, 분리 정체 후 상기 재조합 단백질을 AMC(무정형 셀룰로오즈)에 CBM3를 이용하여 고정 시킨 상태에서 bdSENP1을 이용하여 목적 단백질만을 추가 순서 없이 순수 분리 정제하여 대량 생산 할 수 있다는 사실을 확인하였다. (도 1 참조)

따라서 본 발명은 (a) CBM3(Cellulose-binding module 3) 또는 sCBD(cellulose binding module 1); 및 (b) SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제를 위한 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 “재조합 발현 벡터”는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 식물세포에서 발현시키기 위한 적합한 벡터로는 pUC19 기반 플라스미드 또는 Ti 플라스미드 벡터가 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투마파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 잇는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 326 GFP 또는 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하며 당업자라면 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 식물 세포내에서 발현시킬 수 있는 어떠한 벡터라도 선택하여 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 프로모터, 목적단백질의 발현량을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터이다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.“프로모터”란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. “구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

용어 "작동 가능하게 연결"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 인자에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 인자일 수 있다.

상기 CBM3(Cellulose-binding module 3)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이고, sCBD(Cellulose-binding module 1)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이며, SUMO(Small ubiquitin-related modifier)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 구체적으로, 상기 유전자는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 SUMO(Small ubiquitin-related modifier)는 Brachypodium distachyon 유래 일 수 있고, CBM3(Cellulose-binding module 3)는 Clostridium thermocellum 유래 일 수 있고, sCBD(cellulose binding module 1)은 Trichoderma reesei 유래일 수 있다.

상기에서 목적 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 특정 단백질로 한정되지는 않는다. 구체적으로 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein) 및 리포터단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 재조합 벡터에 단백질 발현의 수준을 높일 목적으로 Mp를 추가로 포함할 수 있다. 상기 Mp는 만노우즈 펩티드 부위(mannosylated peptide region)로, PTPRC (protein tyrosine phosphatase, receptor type, C)의 알라닌 231부터 아스파르트산 290까지의 60개 아미노산 프레그먼트이다. 목적 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 특정 단백질로 한정되지는 않는다. 구체적으로 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein) 및 리포터단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 Mp는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 구체적으로, 상기 유전자는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있고, 상기 BiP(chaperone binding protein) 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있으며, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드는 서열번호 6의 서열을 코디하는 유전자일 수 있다.

상기 재조합 벡터에 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

상기 재조합 벡터의 개열지도는 도 2로 표시될 수 있으며, 바람직하게는 도 3으로 표시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환 식물체를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계; (d) 상기 발현된 목적 단백질을 셀룰로즈 비드에 결합하는 단계; 및(e) 상기 세룰로즈 비드에 결합된 목적 단백질에 bdSEBNP1을 처리하여 목적 단백질만 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제하는 방법을 제공한다.

상기 형질전환된 식물세포로부터 목적 단백질을 생산하는 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환 시킨 다음, 목적 단백질이 발현되도록 적당한 시간동안 배양한 후, 형질전환된 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 애기장대로 형질전환체를 제작하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물에서 분리된 원형질체 모두 본 발명의 방법에서 사용 가능하다.

상기 셀룰로즈 비드는 카르복실 메틸 셀룰로즈(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로즈(methyl cellulose, MC), 무정형 세룰로즈(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로즈(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로즈(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로즈 비드를 이용할 수 있으며 가장 바람직하게는 무정형 세룰로즈(amphous cellulose, AMC)일 수 있다.

상기 bdSEBNP1은 대장균에서 발현될 수 있으며, 상기 bdSEBNP1는 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 bdSEBNP1은 Ni2+-NTA agarose column을 이용하여 분리 정제될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

유전자 정보 및 확보 방법

cellulose-binding module 1 (sCBD; 서열 번호 1)은 Trichoderma reesei로부터 확보하였으며, cellulose-binding module family 3 (CBM3; 서열 번호 2) 은 Clostridium thermocellum로부터 확보 되었으며, small ubiquitin-related modifier (bdSUMO; 서열 번호 3)는 Brachypodium distachyon (bd)로부터 확보되었으며, sCBD, CBM3 및 bdSUMO 유전자들의 염기 서열을 애기장대의 codon 활용도에 최적화되게 design 되었으며 바이오니아에서 제조하였다.

서열번호	서열	염기서열(또는 아미노산 서열)
1	sCBD	TQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
2	CBM3	VSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEP
3	bdSUMO	HINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMTAIAFLFDGRRLRAEQ TPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG (bdSENPI amino acids 248)
4	bdSENP1	PFVPLTDEDEDNVRHALGGRKRSETLSVHEASNIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTKRKLGYNLIDCDKIFVPIHKDVHWCLAVINIKEKKFQYLDSLGYMDMKALRILAKYLVDEVKDKSGKQIDVHAWKQEGVQNLPLQENGWDCGMFMLKYIDFYSRDMELVFGQKHMSYF RRRTAKEILDLKAG
5	HDEL	HDEL
6	BiP	MARSFGANSTVVLAIIFFGCLFALSSAIEEATKL
7	MP	ANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPD

sCBD 또는 CBM3; 및 bdSUMO 와 목적 단백질을 포함하는 식물 발현용 vector 제조

sCBD, CBM3 및 bdSUMO (Bioneer corp. Daejeon, South Korea)는 대장균(Top 10)에 도입하여 증폭하였다. 이후 대장균으로부터 분리된 플라즈미드 DNA를 제한효소로 잘라서 필요한 부위를 확보하였다. GFP는 녹색 형광 단백질로 생체 내 위치 확인용 마커 단백질로 널리 이용되는데 본 연구에서는 목적 단백질 대용으로 활용되었다. 또한 실질적인 목적 단백질의 한 예로 인간의 interleukin-6 (IL-6) (서열 번호 5)가 활용되었다.

sCBD, bdSUMO 및 GFP을 갖는 fusion construct 구축; 이들 domain들은 PCR을 통해서 확보 하였으며, 이어서 각 domain의 PCR product들을 overlap PCR 방법으로 연결하였다. 그리고 overlap PCR 산물들은 제한 효소인 BamHI과 XhoI를 이용하여 절단한 후 동일한 제한 효소로 절단된 326-ER이라 불리는 식물 발현 vector에 도입하였다. 이 326- MELsCH vector는 BiP (chaperone binding protein)의 소포체 targeting에 필요한 leader sequence, cauliflower mosaic virus의 35S promoter, translational enhancer sequence인 xx를 5'-UTR 및 HSP terminator를 가지고 있다. HDEL(His-Asp-Glu-Leu)은 ER retention signal로 덧붙여졌는데 이 서열은 PCR 과정 중에 도입 되도록 reverse primer에 포함되었다. PCR product들은 DNA sequencing을 통해서 확인하였다. 이 식물 발현용 vector는 326-MELsCH-bdSUMO-GFP (서열 번호 10)라 명명되었다(도 4).

식물에서 인간IL-6를 생산하기 위해서는 위에서 GFP에 사용한 동일한 방법으로 CBM3-bdSUMO-IL-6-HDEL construct (서열 번호 12)를 제조하였다. 이 융합 재조합 단백질의 발현양을 증가 시키기 위해서 MP domain을 BiP와 CBM3 사이에 도입하였다. Mp domain은 6 개의 N-glycosylation site를 가지고 있는 인간 protein tyrosine phosphatase, receptor type C (PTPRC)의 amino acid position 231에서 290까지를 갖는 domain이며 식물에서 단백질의 발현을 크게 높이는 것으로 알려졌다. Fusion construct는 마찬가지로 overlap PCR 방법을 통해서 처음 Mp와 CBM3을 연결하고, bdSUMO와 hIL-6 역시 overlap PCR 방법으로 연결하였다. 이 두 fragment를 326-ER vector에 도입하여 BiP-Mp-CBM3-SUMO-IL-6-HDEL을 갖는 fusion construct를 제조하였다. 이 후 326 vector에서 binary vector인 pCAMBIA1300에 도입하였다. pCAMBIA1300은 326 vector와 같은 promoter, 5'-UTR과 HSP terminator를 가지고 있다. 이 발현vector construct는 1300-ME-MCBM3-bdSUMO-IL-6이라 명명 되었다(도 2). 1300-ME-MCBM3-bdSUMO-IL-6를 A. tumefaciens GV3101 strain에 electroporation 방법으로 도입한 후 Nicotiana benthamiana의 잎에 transient expression을 통해서 발현을 확인하였다..

식물 및 대장균 발현용 bdSENP1 발현 vector구축

bdSENP1은 Brachypodium distachyon (bd)로부터 확보하였다. bdSENP1 유전자는 바이오니아 (한국)에서 화학 합성법으로 제조하였다. bdSENP1 를 대장균(Top 10)에 도입하여 증식한 후 제한 효소로 잘라서 식물 및 대장균 발현 vector를 구축하였다. 식물 발현 vector를 구축 하기 위해서 bdSENP1 플라스미드를 BamHI과 XhoI으로 자른 후 326- MELsCH vector의 BiP와 C-terminal ER retention signal HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 사이에 도입하였다. 이 식물 vector는 326-MELsCH-bdSENP1라 명명되었다 (도 4).

E. coli 발현용 bdSENP1 vector를 구축하기 위해서 pRSET expression vector를 사용하였다. N-terminal 6X histidine tag 하위에 bdSENP1을 먼저 BamH1과 EcoR1을 갖는 primer를 이용하여 PCR amplify한 후 이 PCR product를 BamH1과 EcoR1을 자른후 동일한 제한 효소로 자른 pRSET에 도입하였다. 확보된 clone들은 염기 서열을 automated DNA sequencing을 통해서 확인 하였다. 이 대장균용 발현 vector는 pRSET-bdSENP1라 명명 하였다(도 4).

재조합단백질 sCBD-bdSUMO과 CBM3-bdSUMO을 갖는 융합단백질의 식물에서의 발현

식물에서의 이들 sCBD-bdSUMO과 CBM3-bdSUMO을 갖는 융합 단백질의 발현은 polyethyleneglycol(PEG)-mediated transformation을 통해서 애기장대의 잎세포로부터 확보한 protoplasts에서 확인하거나 silencing suppressor (TCV-CP)와 동시에 Nicotiana benthamiana에 agrobacterium infiltration-mediated transient 발현을 통해서 확인하였다. sCBD-bdSUMO-GFP과 bdSENP1을 도입한 Arabidopsis mesophyll protoplasts에서 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해서 먼저 protoplast를 원심 분리 (500rpm, 10 mins)를 통해서 침강시킨 후 이 protoplast pellet을 130 l extraction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% [v/v], Triton X-100 and protease inhibitor)에 섞은 후 ice 위해서 sonication (10 sec, 30W)을 통해서 protoplast를 부수었다. 그렇게 얻어진 세포 추출물은 원심분리 (3000g, 10 min)를 통해서 침전물을 제거 하고 상등액만 확보 하였으며, 단백질 정량 등에 활용하였다. Mp-CBM3-bdSUMO-IL-6를 Nicotiana benthamiana 잎 조직에서 단백질 추출물을 확보하기 위해서 잎 조직을 먼저 잎조직 부피의 2배에 해당하는 단백질 추출 buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% [v/v], Triton X-100 and protease inhibitor)을 이용하여 homogenization을 하였다. 잎 추출물은 원심분리 (12000g, 10 min)를 하여 상등액을 확보하였으며 이는 단백질 정량 등 다음 분석에 활용하였다.

식물 세포의 소포체 내에서의 bdSENP1에 의한 bdSUMO 융합 단백질의 proteolytic cleavage

먼저 애기장대의 잎에서 확보한 protoplast에서 SUMO 융합 단백질과 bdSENP1의 발현을 확인 하고자 하였다. 또한 SUMO 융합 단백질을 bdSENP1이 잘 자르는지를 확인 하고자 하였다. 이를 위해서 SUMO 융합발현 vector 326-MELsCH-bdSUMO-GFP와 bdSENP1 발현 vector인 326-MELsCH-bdSENP1 (도 1)를 PEG 기법을 통해서 protoplast에 도입 하였다. 이들 vector들은 단독 또는 두 개의 조합으로 protoplast에 도입하였다. 또한 326-GFP는 대조군으로 사용 하였다. 형질전환된 protoplast로부터 단백질 추출물을 확보하여 이들을 적절한 항체를 이용하여 western blot analysis를 수행하여 단백질의 발현을 확인하였다. 또한 CBB staining을 통해서 전체 단백질의 양을 확인하였다(표 3). Anti-His 항체를 이용하여 Western blot analysis 수행 하였을 때 bdSENP1가 28 kDa 크기로 나타났다. GFP 항체를 사용하여 western blot 분석을 하였을 때 sCBD-SUMO-GFP만을 발현 시킨 경우에 융합 단백질은 42kDa 크기로 확인되었다. 반면에 bdSENP1를 sCBD-SUMO-GFP 융합 단백질과 같이 발현하였을 때 GFP항체는 29 kDa의 크기의 단백질을 인식 하는 것으로 나타났다(도 5B). 반면에 GFP 항체로 western blot 분석 후 이 GFP 항체를 제거한 후 이 동일한 western blot을 sCBD 항체로 western blot 분석을 수행 하였을 때는 CBD-bdSUMO에 해당하는 13kDa 밴드가 확인되었다 (도 5C). 이러한 결과를 통해서 bdSENP1가 세포내의 소포체에서 SUMO를 포함하는 재조합 단백질을 효과적으로 자르고 있음을 보인다고 결론지을 수 있다.

bdSENP1의 대장균 발현 및 Ni2+-NTA agarose column을 이용한 정제

bdSENP1을 대장균에서 생산하기 위해서 pRSET-bdSENP1를 BL21 (DE3) pLysS에 도입 하였다. 형질 전환된 대장균은 암피실린 저항성을 이용하여 확보 하였다. 단백질의 발현과 순수 정제를 위해서 하기의 방법을 따랐다. Colony 하나를 골라서 ampicillin (50 μg/ml)을 포함하는 5 ml SOB 배양액에서 배양 하였다. 37°C에서 shaking (225 rpm)을 하였다. 다음날, 이를 ampicillin (50 μg/ml)을 포함하는 200 ml 의 SOB 접종 후 OD600에서 0.4-0.6이 될 때까지 37°C에서 키웠다. IPTG를 최종 농도가 1 mM가 되도록 한 후 37°C에서 3 시간을 더 키웠다. 대장균을 원심분리 (12,000 rpm, 10 min)을 통해서 침강 시키고 상등액을 제거 하였다. 대장균은 20 ml cold lysis buffer (40mM Tris, 300mM NaCl, 2mM DTT, 20mM Na2 PO4 , 1% Triton-X-100, 10 mM imidazole, PMSF, pH-7.5)에서 sonication을 통해서 용해하였다. 이 때 2s 동안 ice에서 sonication한 후 3s의 pulse를 10분 동안 처리하였다. Sonication 후 대장균 추출액은 원심분리 (15,000g, 30 min, 4°C)에서 침강물을 제거한 후 상등액을 취하고 이를 이용하여 다음의 분리 정재 등을 진행하였다. 재조합 bdSENP1은 Ni2+-NTA agarose column (Qiagen, Valenica, CA)을 이용하여 아래에 기술된 방법을 이용하여 순수 분리하였다. 1ml의 Ni2+-NTA agarose resin을 빈 column에 채우고 storage solution을 제거 하였다. 10ml 결합 buffer (40mM Tris, 300mM NaCl, 20mM Na2 PO4 , 10 mM imidazole, pH-7.5)를 이용하여 column을 세척 한 후 bdSENP1을 포함하는 대장균의 상등액을 column에 도입 하였다. 용액의 흐름은 약 0.5 mL/min으로 조절하였다. Ni2+-NTA agarose column을 10 ml의 washing buffer (40mM Tris, 300mM NaCl, 20mM Na2PO4 , 30 mM imidazole, pH-7.5)를 이용하여 4 번 washing을 수행하였다. bdSENP1을 1 ml의 250 mM Imidazole를 가지고 pH 7.4 인 1xPBS buffer를 이용하여 column으로부터 유리 하였다. 단백질의 농도는 Bradford assay를 통해서 확인 하였다. bdSENP1의 정확한 정량과 순도는 SDS-PAGE 통해서 분리한 후 Commassie-staining을 통해서 확인 하였으며(도 6A), anti-his antibody(Qiagen, Valenica, CA)를 이용한 Western blot analysis 통해서 bdSENP1의 밴드를 확인하였다(도 6B). SDS-PAGE 분석에 따라서 단백질 순도가 95%이상 이라 추정되며, bdSENP1의 대장균에서의 수율은 6 mg/L로나타났다.

Nicotiana benthamiana에서의 Mp - CBM3 -SUMO-IL-6의 발현과 이 재조합 단백질의 CBM3를 이용한 AMC의 결합 확인

본 발명에서는 전체 식물 단백질 추출로부터 재조합 단백질을 순수 분리하기 위해서 CBM3를 친화성 태그로 사용하고자 하였다. CBM3는 AMC에 tight하게 결합하는 것으로 알려져 있다. 이를 위하여 CBM3를 SUMO domain의 N-말단에 위치하도록 재조합 단백질을 design하였다. 이렇게 제작된 construct를 Nicotiana benthamiana의 잎조직에 agrobacterium infiltration을 통해서 발현을 유도하였다. 이어서 Nicotiana benthamiana의 잎을 homogenization 후 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 후 상등액을 확보 하였다. 이를 SDS-PAGE를 통해서 분리한 후 Commassie blue stain을 통해서 분리된 상태를 확인 하였다(도 7A). 또한 이 상등액을 SDS-PAGE 후 western blot 분석을 통해서 Mp-CBM3-SUMO-IL-6의 발현을 확인하였다(도 7). 생쥐에서 만들어진 IL-6에 대한 항체로 Western blot analysis을 수행 하였을 때 55-75 kDa (도 7B) 사이에 단백질들이 확인되었다. Cellulose resin을 이용한 affinity purification을 수행하기 위해서 전체 단백질 추출액을 amorphous cellulose (AMC) microcrystalline powder (Sigma-Aldric)에 binding을 유도하였다. 여기에서 cellulose affinity purification 방법은 아래 기술한 바와 같다. Cellulose를 4배의 부피에 해당하는 증류수에 담가서 hydration 시켰다. 이 상태에서 수용액에 부유된 상태로 존재하는 미세 조각들은 제거하였다. 이 과정을 5회 반복 하였다. 최종적으로 cellulose bead는 물과 1:1비율 (V/V)로 되게 만든 후 sodium azide (0.1%)를 넣어서 4 °C에 보관 하였다. CBM3을 포함하는 재조합 단백질을 cellulose에 결합을 유도하기 위해서 Nicotiana bentamiana 잎 추출물 1ml을 500l cellulose bead와 2ml 원심 분리용 튜브에 섞어서 4°C에서 orbital shaker를 이용하여 섞어 주었다(60 rpm). Yeast에서 단백질을 생산한 경우 CBM3이 AMC에 약 300mg/g정도 결합 한다고 알려져 있다. 약 한 시간 동안 CBM3 융합 단백질이 cellulose에 결합하도록 한 후 간단한 원심분리를 통해서 cellulose bead는 침강 시키고 상등액은 제거 하였다. cellulose beads를 bead 부피의 4배에 해당하는 40mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)로 washing하여 약하게 비특이적으로 cellulose에 결합한 단백질들을 제거하였다. 셀룰로즈 bead에 결합한 단백질들을 2x SDS-PAGE sample buffer에 넣고 denaturation을 통해서 유리하였다. 다양한 조건하에서 식물에서 발현한 CBM3 fusion protein들을 셀룰로즈 bead로부터 유리 하고자 시도 하였지만 CBM3를 포함하는 재조합 단백질이 유리되지 않았다. 따라서 CBM3가 cellulose에 비가역적으로 대단히 강한 결합을 한다고 할 수 있다. 또한 cellulose bead에 결합을 한 CBM3 융합 단백질을 denaturation을 통해서 cellulose bead로부터 유리한 후 SDS-PAGE로 전개한 후 Commassie-staining을 통해서 확인 하였을 때 95% 이상의 순도를 갖는 것 으로 나타났다 (도 8). 이를 통해서 CBM3 융합 단백질을 이용하여 순수하게 단백질을 분리하는 affinity column으로 사용할 수 있을것이다.

식물에서 생산한 재조합 단백질 Mp - CBM3 -SUMO-IL- 6를 CBM3를 이용하여 cellulose bead에 결합한 상태에서 bdSENP1를 이용하여 IL-6의 특이적 분리 정제

재조합 단백질의 생산 후 단백질 분리 정제용으로 사용한 affinity tag는 불필요한 활성을 생산하고자 하는 목적 단백질에 도입할 수 있으며, 특히 의료용 단백질에서는 목적 단백질의 서열 외에는 추가적인 아미노산 잔기의 추가를 대단히 엄격히 제한한다. 따라서 분리 정제용의 tag를 제거 하는 것이 대단히 중요하다. 본 발명에서는 SUMO를 이용하여 affinity tag를 완벽하게 제거하는 방법을 제공한다. 특히 cellulose bead에 재조합 단백질을 결합 시킨 상태에서 목적 단백질 만cellulose bead로부터 SUMO-specific protease인 bdSENP1을 이용하여 분리 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법을 이용하여 4°C에서 1-2시간의 처리를 통해서 효율적으로 단백질을 분리 정제 할 수 있다. 먼저 cellulose bead에 단백질이 결합한 상태에서 bdSENP1이 SUMO를 인식하여 cleavage 반응을 수행할 수 있는 것을 확인 하였다(outlined in Figure 1). 간단하게, Mp-CBM3-SUMO-IL-6 재조합 단백질을 실시예 7 에서와 같이 AMC에 결합 하도록 한 후 AMC bead를 bdSENP1 reaction buffer (25mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1% NP-40, 250mM NaCl, 1mM DTT)로 한 번 세척한 후 bdSENP1 reaction buffer (500 ml)에 suspension 하였다. 여기에 bdSENP1 protease (5g)을 첨가하고 4°C에서 부드럽게 흔들면서(60 rpm) 1-2시간 동안 반응을 시켰다. 반응 후 IL-6는 cellulose bead로부터 유리되어 incubation buffer에 존재하게 될 것이다 (도 9). 반면에 CBM3은 SUMO domain과 같이 여전히 AMC에 비가역적으로 결합한 상태로 존재 하게 된다. 따라서 IL-6와 beSENP1은 상등액에 존재하게 되며, 이어서 bdSENP1은 his tag를 N-말단에 가지고 있으므로, Ni2+-NTA column을 통해서 bdSENP1을 제거하여 순수하게 IL-6를 분리 정제 하였다. 본 발명을 활용하여 좀 더 큰 scale의 IL-6를 식물에서 생산하고 순수 분리 정제를 수행하여 본 발명의 내용을 확인 하였다. 인간 IL-6가 포함된 BiP-CBM3-SUMO-IL-6-HDEL construct를 Nicotiana benthamiana에 transient expression 기법을 이용하여 발현 하였다. 이렇게 재조합 단백질을 발현하는 Nicotiana benthamiana 잎 25g에 25ml 단백질 추출용 buffer를 이용하여 총 단백질 추출물을 제조하였다. 이를 5ml AMC를 첨가하고 4°C orbital shaker에서 부드럽게 shaking (60 rpm)을 1 시간 동안 하면서 CBM3 domain을 갖는 BiP-Mp-CBM3-SUMO-IL-6-HDEL 재조합 단백질이 AMC에 결합을 하도록 유도 하였다. 이어서 4배의 beads 부피에 해당하는 40mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)를 이용하여 4번 세척하였다. AMC에 결합해 있는 BiP-Mp-CBM3-SUMO-IL-6-HDEL 재조합 단백질을 AMC에 결합한 상태로 SUMO protease를 이용하여 IL-6를 release 유도하였다. 이를 위해서 BiP-Mp-CBM3-SUMO-IL-6-HDEL이 결합해 있는 AMC를 bdSENP1 reaction buffer로 washing 한 후 10ml의 bdSENP1 reaction buffer에 suspension하고 여기에 순수 분리 정제된 bdSENPI protease (50g)를 더하고 1-2시간 동안 4°C에서 부드럽게 shaking(60rpm) 하면서 incubation 하였다. 이러한 방법을 통해서 C-terminal에 융합되어 있는 IL-6는 상등액에 존재하게 되며 Mp-CBM3-SUMO는 여전히 AMC에 결합한 상태로 있게 된다. 따라서 AMC와 Mp-CBM3-SUMO는 간단한 원심분리를 통해서 제거하였다(도 10). 이때 반응한 후 bdSENP1 역시 상등액에 있게 되므로 이를 his tag에 특이적으로 결합 하도록 bdSENP1이 design하였으므로, Ni2+-NTA agarose column을 이용하여 제거하였다. 최종적으로 소량 contamination 되어있는 extra protein들은 Superdex 200 column을 이용하여 size-exclusion chromatography를 이용하여 최종적으로 순수한 IL-6를 확보하였다. SDS-PAGE analysis와 Western blot analysis를 통해서 확인한 결과 Nicotiana benthamiana로부터 >95%의 순도로 IL-6가 분리 정제되었다. Bradford protein assay와 SDS-PAGE analysis를 통해서 확인한 결과 80 μg 분리 정제된 IL-6를 잎 조직 1g으로부터 얻을 수 있다는 것을 확인 하였다. 이어서 식물생산 IL-6의 활성을 확인하고자 하였다.

식물 생산IL-6 를 이용하여 human LNCaP 세포에의 STAT3 인산화를 통한 활성검증

식물에서 생산한 hIL-6의 활성을 검증하기 위해서, LNCaP cells (androgen-sensitive human prostate adenocarcinoma cells)을 이용하여 hIL-6에 의한 STAT3의 signaling pathway의 활성 증진 현상을 이용 하였다. hIL-6는 먼저 IL-6 receptor (gp80)에 결합한 후 이어서 gp130과 binding한다. 이 후 gp130이 dimer를 형성하게 되고 이 dimer 형의 gp130이 Janus kinases (Jaks)의 활성화를 유도해서 gp130의 tyrosine residues를 인산화 하게 된다. 이런 과정을 통해서 SHP2/Erk/Map pathway와 전사 인자들인 STAT1v and STAT3를 활성화 한다. LNCaP cells을 식물에서 생산한 hIL-6 150 ng/mL로 처리한 후 30 min에 STAT3의 인산화(P-STAT3) 정도를 확 인하였다. 그런 후 time-course study를 수행하여 1 시간까지의 인산화 정도를 측정 하였다 (도 11 A 및 도 11 B). 식물 생산 단백질의 활성을 대장균에서 생산한 상업적으로 구매한 hIL-6와 비교 하였으며, 같은 농도의 대장균에서 만들어진 단백질과 유사한 활성을 보임을 확인 하였다. 이를 통해서 식물 생산 hIL-6가 동일한 활성을 보이는 단백질임을 확인하였다.

실험은 아래의 방법으로 진행 하였다. LNCaP (전립선암세포주)는 10% FBS를 포함하는 배지인RPMI 1640 (Welgene, LM-011-01)에서 배양 하였다. LNCaP 세포 0.8x10⁶개를 60 mm 배양기에 seeding함으로써 배양을 시작하였다. 하루 후 , 10% FBS가 없는 RPMI 1640 배양액으로 교환한 후 8 시간 동안 serum 없는 상태로 키웠다. 식물 또는 대장균 유래의 IL-6 를 처리한 후 시간 별로 인산화를 측정하였다. 세포를 IL-6로 처리한 후 2 분, 15 분, 30 분 그리고 60 분에 수확한 PBS (Phosphate-buffered saline)로 washing 하였다. 수확한 세포는 1Xprotease inhibitor를 호함한 RIPA로 분쇄한 후 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는BCA assay kit (Thermo Pierce, 23225)로 측정 하였다. 단백질샘플은 5X Lamaeli buffer에 섞은 후 8% PAGE gel을 이용하여 전기영동 하였으며, STAT3에 대한 항체 또는 anti-p-STAT3 항체(Santacruz sc-482, anti-p-STAT3, Santacruz sc-8052)를 이용하여 확인 하였으며, loading 양을 정량하기 위해서 anti-beta actin 항체 (anti-beta actin, Santacruz sc-47778)를 이용하여 분석하였다. Western blot의 image 생성을 위해서 Clarity ECL substrate (Bio-Rad, 170-5061)를 이용 하였으며, image 들은 Image Quant LAS500(GE lifescience)을 이용하여 capture 하였다. 식물에서 생산한 hIL-6의 활성을 검증하기 위해서, LNCaP cells (androgen-sensitive human prostate adenocarcinoma cells)을 이용하여 hIL-6에 의한 STAT3의 signaling pathway의 활성 증진 현상을 이용 하였다. hIL-6는 먼저 IL-6 receptor (gp80)에 결합한 후 이어서 gp130과 결합한다. 이 후 gp130이 dimer를 형성하게 되고 이 dimer형의 gp130이 Janus kinases (Jaks)의 활성화를 유도해서 gp130의 tyrosine residues를 인산화하게 된다. 이런 과정을 통해서 SHP2/Erk/Map pathway와 전사 인자들인 STAT1 and STAT3를 활성화 한다. LNCaP cells을 식물에서 생산한 hIL-6 150 ng/mL로 처리한 후 30 분에 STAT3의 인산화(P-STAT3) 정도를 확인 하였다. 그런 후 time-course study를 수행하여 1 시간까지의 인산화 정도를 측정하였다 (도 11 A 및 도 11B). 식물 생산 단백질의 활성을 대장균에서 생산한 상업적으로 구매한 hIL-6와 비교 하였으며 , 같은 농도의 대장균에서 만들어진 단백질과 유사한 활성을 보임을 확인하였다. 이를 통해서 식물 생산 hIL-6가 동일한 활성을 보이는 단백질임을 확인하였다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Recombinant vector for separating and purifying target protein in plant <130> 1062619 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellulose-binding module 1 from Trichoderma reesei <400> 1 Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro 1 5 10 15 Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr 20 25 30 Ser Gln Cys Leu 35 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellulose-binding module 1 from Clostridium thermocellum <400> 2 Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp 1 5 10 15 Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile 50 55 60 Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr 65 70 75 80 Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala 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Claims (11)

1. (a) CBM3(Cellulose-binding module 3) 또는 sCBD(Cellulose-binding module 1); 및
   (b) SUMO(Small ubiquitin-related modifier)
   를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제를 위한 재조합 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 CBM3(Cellulose-binding module 3)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이고, sCBD(Cellulose-binding module 1)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자이며, SUMO(Small ubiquitin-related modifier)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인, 재조합 벡터.
3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터에 Mp(mannosylated peptide region)를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
4. 제 3항에 있어서, 상기 Mp(mannosylated peptide region)는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인, 재조합 벡터.
5. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
6. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
7. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터의 개열지도는 도 2로 표시되는, 재조합 벡터.
8. (a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;
   (b) 상기 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
   (c) 상기 형질전환 식물체를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계;
   (d) 상기 발현된 목적 단백질을 셀룰로즈 비드에 결합하는 단계; 및
   (e) 상기 세룰로즈 비드에 결합된 목적 단백질에 bdSEBNP1을 처리하여 목적 단백질만 분리 정제하는 단계;
   를 포함하는 목적 단백질의 분리 정제하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 셀룰로즈 비드는 카르복실 메틸 셀룰로즈(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로즈(methyl cellulose, MC), 무정형 세룰로즈(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로즈(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로즈(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로즈 비드를 이용하는, 목적 단백질의 분리 정제하는 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 bdSEBNP1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인, 목적 단백질의 분리 정제하는 방법.
11. 제 8항에 있어서, 상기 bdSEBNP1은 대장균에서 발현되는, 목적 단백질의 분리 정제하는 방법.

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