KR102155449B1 - 식물에서 LysP11의 대량생산방법 및 이를 포함하는 돼지 단독증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물에서 LysP11의 생산방법 및 이를 포함하는 돼지 단독의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

식물에서 LysP11의 대량생산방법 및 이를 포함하는 돼지 단독증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Method or mass production of LysP11 in plants, and pharmaceutical composition for prevention and treatment of swine erysipelas comprising the same}

본 발명은 식물에서 LysP11의 생산방법 및 이를 포함하는 돼지 단독증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

식물을 이용하여 다양한 재조합 단백질을 저비용을 생산할 수 있는 방법들이 개발되었다. 식물은 재조합 단백질 생산단가가 동물세포를 이용하는 것보다 낮으며, 고가의 의료용 단백질뿐만 아니라 산업적으로 활용될 가능성이 있는 단백질의 대량 생산 시스템으로 활용될 수 있다. 이에 식물에서 다양한 재조합 단백질을 생산하는 방법에 대해서 많은 연구가 진행되고 있다. 식물은 대장균 등 미생물에 존재하는 내독소와 같은 독소가 거의 존재하지 않고, 인체에 감염할 수 있는 병원균이 없다는 점에서, 의료용 단백질을 생산하는데 있어서 많은 장점이 있다. 또한 프리온(prion)과 같은 유해한 단백질도 없는 것으로 알려져 있어서 동물세포나 미생물에 비해서 안전한 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 하지만, 이와 같은 장점에도 식물 세포에서 단백질을 생산함에서 동물세포를 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현 및 분리 정제의 어려움이 가장 큰 단점이 되고 있다. 이에 많은 연구가 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질 발현량을 증가시키고 효율적으로 단백질을 분리 정제하려는 시도가 있다.

식물에서 다양한 재조합 단백질의 발현 가능성이 확인되었다. 이 중의 하나가 항세균 단백질이다. 화학물질로 된 다양한 항생물질들이 개발되었으며 현재 광범위하게 활용되고 있다. 하지만 점차 항생제 내성 박테리아의 출현으로 새로운 종류의 항생제의 생산이 요구되고 있다. 이 중에 새로운 항생제의 하나로 주목을 받는 것이 엔돌리신(endolysin) 이다. 엔돌리신은 박테리아의 바이러스라 할 수 있는 박테리오파지들이 가지고 있는 유전자들로 이들로부터 만들어지는 단백질들은 박테리아의 세포벽 중에 펩티도글리칸을 특이적으로 분해할 수 있다. 따라서 박테리아를 용해할 수 있는 효소적인 성질을 가지고 있어, 새로운 항생제로 될 수 있다. 상기 엔돌리신은 박테리오파지들의 게놈에 암호화 되어 있는데 박테리아오 파지들은 박테리아에 특이적이며 각 박테리오파지의 엔돌리신은 호스트 박테리아에 특이성을 가지고 있다. 이러한 특이성은 주로 C-말단 세포벽에 결합하는 도메인에 의해서 나타나는 것으로 생각된다. 따라서 엔돌리신을 이용하여 각 종류의 박테리아에 대해서 특이적인 항생제를 만들 수 있을 것으로 예측된다. 최근에 다양한 종류의 박테리오파지의 게놈 서열이 밝혀졌다.

본 발명은 식물에서 엔돌리신을 분리 정제를 용이하기 위해 예의 노력한 결과, Propionibacterium의 박테리오파지 P11으로부터 유래된 엔돌리신 LysP11(Propionibacterium acnes bacteriophages P1.1 endolysin)을 재조합 벡터에 융합하면, LysP11의 생산이 용이하다는 것을 확인하였고, 상기 LysP11이 돼지 단독증의 원인균주인 Erysipelothrix rhusiopathiae의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 분해한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 식물에서 LysP11를 생산하기위한 재조합 벡터를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 식물에서 LysP11을 생산하는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 상기 전술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 LysP11를 포함하는 돼지 단독증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (i) M domain; (ii) CBM3 (Cellulose-binding module 3); (iii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier); 및 (iv) LysP11을 포함하는 식물에서 LysP11를 생산하기위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 LysP11의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 M domain의 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 CBM3의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SUMO의 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예 다르면, 상기 재조합 벡터에 BiP 또는 HDEL를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 BiP의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 HDEL의 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)일 수 있다.

본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 식물에서 LysP11을 생산하는 방법을 제공할 수 있다:

(a) 상기 전술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스 (amphous cellulose, AMC), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose,MCC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용 할 수 있다.

본 발명은 또한 LysP11를 포함하는 돼지 독단증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 식물에서 LysP11를 저비용 고효율로 생산할 수 있는 효과가 있다. 자세하게는 상기 재조합 벡터는 ER의 높은 축적을 유도하는 BiP, 단백질의 발현을 높이는 M domain, 셀룰로스 결합 도메인을 포함하는 CBM3, ER에 높은 축적률을 유도하는 HDEL을 순서대로 포함한 것이다. 또한 상기 재조합 벡터에 번역 증폭 서열인 5’CaMV 35S 프로모터 와 HSP terminator를 순서대로 연결하여 제조한 벡터이다. 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질전환한 후 배양하여, 주사기 침윤 방법으로 식물에서 LysP11를 저비용 고효율로 생산할 수 있고, 상기 생산된 LysP11는 셀룰로스 비드를 통해 분리한 뒤, His:bdSENP1를 이용하여 정제할 수 있는 효과가 있다. 상기 LysP11를 그람 양성균인 E. rhusiopathiae ATCC 19414에 처리한 결과, 이의 성장이 감소하는 효과가 있었다. 상기 LysP11를 돼지 독단균인 E. rhusiopathiaek에 처리한 결과 세포벽 또는 세포막에 손상을 주어 사멸시키는 효과가 있다.

도 1은 MCS-LysP11의 벡터의 구조와 이를 이용한 N. benthamiana에서의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 MCC 비드를 이용한 N. benthamiana의 총 단백질 추출물로부터 MCS-LysP11의 순수 분리 정제한 결과이다.
도 3은 LysP11의 항생활성 측정한 결과이다.
도 4는 LysP11의 pH, 온도, NaCl 농도에 따른 항균성의 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 LysP11의 처리 후 E. rhusiopathiae의 전자현미경 상에서의 변화를 확인한 결과이다.

상술한 바와 같이, 동물세포 또는 미생물을 이용하여 단백질을 생산하는 것은 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원과 같은 문제를 야기하며, 대량으로 생산할 때 기간 및 비용이 많이 소비 된다는 한계들을 갖는다. 이를 극복하기 위해 식물에서 단백질을 생산하는 방법이 개발되고 있으나, 이 또한 낮은 단백질 발현 및 분리정제의 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 식물에서 단백질 발현량을 증가시키고 효율적으로 단백질을 분리 정제 하기위한 방법을 개발하여 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명의 재조합 벡터는 LysP11를 포함하여, 상기 LysP11를 포함하는 재조합 벡터를 배양한 후, 상기 배양액을 주사기 침윤 방법을 통해 식물에 침윤 한 뒤, 이를 대량 생산한 후, 셀룰로스 비드를 통해 분리 한 뒤, 상기 탄산무수화효소에 대장균에서 생산한 His:bdSENP1를 이용하여 정제한 결과 높은 정제률 보였다. 또한 재조합 벡터로 제조된 LysP11이 E. rhusiopathiae ATCC 19414에 처리한 결과, 이의 성장이 감소시키고, 나아가 돼지 단독균에 처리한 결과 세포벽 또는 세포막의 손상을 주어 세포를 사멸 시키는 효과가 있었다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명은 (i) M domain; (ii) CBM3 (Cellulose-binding module 3); (iii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier); 및 (iv) LysP11을 포함하는 식물에서 LysP11를 생산하기위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어“란 Propionibacterium의 박테리오파지 P11를 말한다. 박테리아의 항생제의 하나로 주목을 받는 것이 엔돌리신(endolysin) 이다. 엔돌리신은 박테리아의 바이러스라 할 수 있는 박테리오파지들이 가지고 있는 유전자들로 이들로부터 만들어지는 단백질들은 박테리아의 세포벽 중에 펩티도글리칸을 특이적으로 분해하여 박테리아를 사멸시킨다. 엔돌리신을 이용하여 각 종류의 박테리아에 대해서 특이적인 항생제를 만들 수 있다. 이들 중에 프로피오니박테리아(Propionibacterium)의 박테리오파지 P11에 대한 서열도 개시되어 있으며, 엔돌리신 유전자로 LysP11이 있다.

상기 LysP11의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 염기서열 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 LysP11을 포함하는 재조합 단백질을 식물에서 생산하고자, 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 벡터는 ER 타겟팅을 위한 BiP leader sequence, 고발현을 유도 하는 M 도메인, N-말단 융합 도메인을 제거하기 위한 SUMO 도메인을 포함하였다. 그리고 C-말단 끝에 ER retention signal인 HDEL을 포함하였다. 프로모터는 double enhancer를 가진 modified 35S 프로모터를 사용하였으며, 터미네터(terminator)은 HSP terminator를 사용하였다 (도 1a). N. benthamiana plant 잎 조직에의 발현을 유도하기 위해서 MCS-LysP11 재조합 유전자를 가진 바이너리 벡터(binary vector)를 아그로박테리움 스트레인 EHA에 침윤하였다. 고발현을 유도하기 위해서 유전자 침묵 억제인자인 P38을 포함하는 바이너리 벡터를 아그로박테리움 스트레인 EHA 도입하여 밤새 배양한 배양물 및 MCS-LysP11 재조합 유전자를 가진 바이너리 벡터(binary vector)를 아그로박테리움 스트레인 EHA에 침윤하여 밤새 배양한 배양물을 동시에 침윤하였다. 침윤한 후 3-5일에 조직을 수확하여 단백질을 추출하였다. 상기 단백질 추출물을 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통하여 단백질의 발현을 확인하였다. MCS-LysP11이 65-70 kD 위치에서 확인되었다 (도 1b). 상기 MCS-LysP11을 MCC (microcrystalline cellulose; 마이크로크리스탈린셀룰로오스) 비드를 affinity matrix로 사용하여 순수 분리하였다. 40 g의 잎 조직으로부터 총 단백질을 추출하고, 상기 단백질 추출물을 MCC 비드에 섞고 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후 40 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.5)를 이용하여 5번 세척하여 헐겁게 결합된 non-specifically 단백질을 제거한 뒤, MCC 비드에 밀착되게 결합된 단백질을 끓여 용리한 뒤, 총 단 백질 추출물, washing-off solution을 함께 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통해서 단백질의 순도를 확인한 결과, MCS-LysP11을 순수 분리정제 할 수 있음을 확인하였다 (도 2a). Tag가 없는 LysP11을 확보하기 위해서, MCS-LysP11이 결합된 MCC 비드를 대장균에서 생산한 SUMO 도메인을 인식하여 자르는 His:bdSENP1을 같이 배양한 뒤, Ni+-NTA 친밀도 컬럼을 이용하여 배양액으로부터 제거하였다. 상기 LysP11의 순도는 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과 31 kD의 LysP11이 확인되었다 (도 2b). His:bdSENP1이 LysP11 부분에 오염되었는지를 확인하기 위해서 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통해서 확인하였다. His:bdSENP1이 LysP11 부분에는 확인이 되지 않았고 이를 통해서 LysP11이 순수하게 분리정제 되었음을 확인하였다. 이를 통해서 8 mg의 순수 LysP11을 1 kg의 생중량으로 부터 확보할 수 있었다. LysP11의 항생 활성을 확인하고자 1 μg/ml의 농도의 그람 양성균인 P. acnes ATCC 6919, Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ATCC 19615, and E. rhusiopathiae ATCC 19414들과 그람 음성균인 E. coli JM109에 처리하였다. 이를 통해서 LysP11이 E. rhusiopathiae에 대해서 특이적인 항생 활성을 보임을 확인하였다 (도 3c). LysP11의 pH 및 온도에 따른 항생활성을 비교한 결과 pH 8 ~ 9 사이에서 높은 활성을 보였으며, 35 ~ 37℃에서 높은 활성을 보였다. 또한 NaCl 농도가 높아짐에 따라서 활성이 높아졌으며, 400 mM에서 최대의 활성을 보였으며 그 이상에서는 활성이 낮아졌다 (도 4).

CBM3 (cellulose-binding module 3)은 C. thermocellum에서 확보한 셀룰로스 결합 도메인으로 셀룰로스에 대단히 높은 결합력을 보이고 있어서 단백질 순수 분리용 affinity tag로서 활용하기 위한 몇 가지의 특성을 가지고 있다. 상기 CBM3는 무정형 셀룰로스에 특이적이고 높은 결합도를 가지고 있으며, CBM3에 목적 단백질을 융합하였을 때 융합된 목적 단백질의 간섭을 덜 받으며, 또한 융합된 목적 단백질의 접힘(folding)을 도와준다. 미생물에서는 CBM3이 단백질의 생산수율을 높이는 것으로 보고되었다. 상기 CBM3가 결합하는 셀룰로스는 친화성 수지로서 친환경적이며, 가격이 대단히 저렴하다는 것 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. 셀룰로스는 화학적인 반응성이 거의 없어 다양한 조성의 버퍼 용액을 사용할 수 있으며, 단백질과도 반응을 하지 않을 것으로 알려졌다. 또한, 다양한 형태의 셀룰로스가 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 장점도 있다. 따라서 단백질 순수 분리에 최적의 친화적 수지가 될 수 있는 다양한 조건을 가지고 있다. 실제로 인체친화성으로 인하여 이미 다양한 의료용 및 인체적용 제품에 활용되고 있다.

상기 M doamin의 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있고, 염기서열 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 CBM3(cellulose-binding module 3)의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있고, 염기서열 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 7의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

Small ubiquitin-related modifier(SUMO)는 진핵세포의 ubiquitin-like molecules (Ubls) 그룹 중에서 유비퀴틴 다음으로 많이 연구된 단백질을 수식하는 적은 단백질이다. SUMO는 C-말단을 통해서 다양한 타겟 단백질에 존재하는 라이신의 ε-amino 잔기와 isopeptide를 형성함으로써 공유 결합으로 연결된다. 이 SUMO를 타겟 단백질에 융합하기 위해서는 SUMO 특이적인 단백질 분해효소가 SUMO 전구체로부터 C-말단 부위에 존재하는 extra 부위를 제거하여야 한다. 이때 SUMO 특이적인 단백질 분해효소는 SUMO 도메인의 C-말단부에 특이적으로 존재하는 글라이신(glycine)-글라이신(glycine) 모티프를 인식하여, GG 서열의 C-말단에 존재하는 extra 부위를 제거하게 된다. SUMO 프로테아제가 SUMO 전구체로부터 SUMO를 만들 때 SUMO 도메인을 인식하게 되고 두 개의 글라이신의 C-말단 부위를 자르게 되므로 SUMO 프로테아제는 대단히 높은 특이성을 보일 수 있다. 또한 두 개의 글리신 잔기(glycine residue) 다음에 오는 아미노산의 종류에 대해서 거의 특이성을 보이지 않으므로 다양한 단백질을 di-glycine 잔기 뒤에 달수가 있으며 이로부터 정확하게 di-glycine을 C-말단에 갖는 mature SUMO 도메인 제거함으로써 C-말단 부위에 있는 특정 단백질이 extra 아미노산을 갖지 않게 할 수 있는 특성을 가지고 있다. 따라서 SUMO에 타겟 단백질을 융합하여 SMO-타겟의 융합 단백질로 만들고 이로부터 SUMO 도메인을 제거하여 원하는 N-말단에 다른 extra 아미노산 잔기를 갖지 않는 타겟 단백질을 만들 수 있다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내재도입된 것이다.

용어 “재조합 발현 벡터”는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 식물세포에서 발현시키기 위한 적합한 벡터로는 pUC19 기반 플라스미드 또는 Ti플라스미드 벡터가 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다.Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 326 GFP 또는 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하며 당업자라면 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 LysP11를 암호화하는 유전자를 식물 세포내에서 발현시킬 수 있는 어떠한 벡터라도 선택하여 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 프로모터, 목적단백질의 발현량을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터이다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "작동 가능하게 연결"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 인자에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 인자일 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 추가로 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

상기 BiP의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함 할 수 있고, HDEL의 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 염기서열은 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며,비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다. “프로모터”란 용어는 구조유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. 구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 그로박테리움(Agrobacterium) 투마파시엔스일 수 있으며, 더 자세하게는 아그로박테리움 LBA4404, GV3101, AGL1, EHA101 또는 EHA105일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 제조합 벡터는 도 1a의 개열지도로 표시될 수 있다.

본명은 또한, (a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및 (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계를 포함하는 식물에서 LysP11를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 형질 전환된 식물세로부터 LysP11를 생산하는 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 세포에 형질전환 시킨 다음, LysP11가 발현되도록 적당한 시간 동안 배양한 후, 형질 전환된 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 LysP11를 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용 가능하다.

상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스 (amphous cellulose, AMC), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose, MCC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용할 수 있으며 가장 바람직하게는 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose, MCC)일 수 있다.

본 발명은 (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계에 본 발명의 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터 배양물 외 P38을 포함하는 재조합 벡터의 배양물을 동시에 침윤할 수 있다. p38은 gene silencing suppressor이다. 이외에도 gene silencing suppressor P19, HC-Pro, TVA 2b 등일 수 있다.

상기 식물에 침유하는 방법은 화학 전지법, 진공 또는 주사기 침윤 방법이 있고 가장 바람직하게는 주사기 침윤 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 Nicotiana benthamiana 일 수 있다.

(e) 단계 이후에 효소를 처리하는 단계;를 추가로 포함하여 LysP11를 정제하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 효소는 bdSENP1일 수 있고, 대장균에서 생산될 수 있다.

본 발명은 또한 LysP11를 포함하는 돼지 독단증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

LysP11이 E. rhusiopathiae에 대한 항성 활성을 확인하기 위해서 LysP11을 처리한 E. rhusiopathiae을 전자현미경으로 관찰한 결과, ysP11을 20 분 동안 처리한 E. rhusiopathiae은 세포벽의 변형이 왔으며, 세포질막이 얇아졌고, 세포의 형태가 크게 변형되었음을 확인할 수 있었으며, 60분 동안 LysP11을 처리하였을 때는 세포벽이나 세포막의 손상이 왔으며, 일부는 세포질 내용물이 없어졌으며, 세포들이 정상적인 형상을 가지지 않음을 확인하였다. 세포벽에 구멍이 생겼으며 이 구멍을 통해서 세포질 내용물이 빠져나가는 것이 관찰되었다. 이를 통해서 LysP11이 E. rhusiopathiae의 펩티도글리칸을 분해한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

돼지 독단증은 돼지에서 발열, 피부병변, 관절염 및 심내막염 등의 증상을 보이는 돼지의 주요 전염병으로서 원인세균은 Erysipelothrix rhusiopathiae 이다. 가검물이 오래 경과되어도 돼지단독균은 쉽게 배양 할 수 있으며 돼지단독균은 돼지고기 혹은 동물조직내에서 수개월 생존할 수 있다. 돈분이나 자연계에 노출되어도 12℃이하의 환경온도에서는 6개월간 생존할 수 있다. 이병은 근절하기 어려운 질병이고 제1종 법정전염병이다. 갑작스런 폐사, 발열, 식욕부진, 다이아몬드형 피부반점, 관절염, 심내막염 및 임신모돈의 유산이 특징이다. 정상돈의 편도에서 원인균이 일반적으로 발견되며 고온, 바이러스감염, 피로, 및 백신 등의 환경요인에 의해 발병한다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

MSC-Lysp11의 제작

LysP11의 재조합 단백질을 식물에서 대량 생산 하고자 바이너리 벡터(binary vector)인 MCS를 이용하였다. 상기 벡터는 ER 타겟팅을 위한 BiP leader sequence, 고발현을 유도 하는 M 도메인(human tyrosine phosphatase receptor type C (CD45)의 아미노산 Ala 231 부터 Asp 290까지), N-말단 융합 도메인을 제거하기 위한 SUMO 도메인을 포함하였다. 그리고 C-말단 끝에 ER retention signal인 HDEL을 포함하였다. 상기 유전자의 서열번호는 하기 표 1과 같다. LysP11은 Nicotiana benthamiana에서의 발현을 위해서 코돈에 최적화 되었다. 코돈에 최적화된 LysP11을 SUMO 도메인과 HDEL 사이에 위치하도록 하였다. 이렇게 제각된 LysP11 발현용 재조합 단백질 유전자를 MCS-LysP11라 명명하였다 (도 1a). 프로모터는 double enhancer를 가진 modified 35S 프로모터를 사용하였으며, 터미네터(terminator)은 HSP terminator를 사용하였다 (1300-MCS-LysP11).

재조합 벡터의 Agrobacterium strain EHA105에 도입 및 Nicotiana benthamiana 에서의 발현

N. benthamiana plant 잎 조직에의 발현을 유도하기 위해서 MCS-LysP11 재조합 유전자를 가진 바이너리 벡터(binary vector)를 아그로박테리움 스트레인 EHA에 도입하였다. 이를 밤새 배양하였으며, 상기 배양물을 OD600에서 1.0까지 배양하였다. 그리고 MCS-LysP11의 고발현을 유도하기 위해서 유전자 침묵 억제인자인 P38을 포함하는 바이너리 벡터를 아그로박테리움 스트레인 EHA 도입하여 밤새 배양한 후, 상기 배양물을 다시 OD600에서 1.0까지 배양하였다. 상기 두 MCS-LysP11 및 p38 배양물을 1:1로 섞어서 N. benthamiana 잎에 침윤하여 일과성 발현(transient expression)을 유도하였다. 침윤한 후 3-5일에 조직을 수확하여 단백질을 추출하였다. 상기 단백질 추출물을 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통하여 단백질의 발현을 확인하였다. MCS-LysP11이 65-70 kD 위치에서 확인되었다 (도 1b).

셀룰로스 비드를 이용한 재조합 단백질 LysP11의 순수 분리

LysP11의 활성을 규명하기 위해서 순수 분리정제 하였다. 먼저 MCS-LysP11을 MCC (microcrystalline cellulose; 마이크로크리스탈린셀룰로오스) 비드를 affinity matrix로 사용하여 순수 분리하였다. 40 g의 잎 조직으로부터 총 단백질을 추출하고, 상기 단백질 추출물을 MCC 비드에 섞고 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후 40 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.5)를 이용하여 5번 세척하여 헐겁게 결합된 non-specifically 단백질을 제거하였다. 이어서 MCC 비드에 밀착되게 결합된 단백질을 끓여 용리한 뒤, 총 단 백질 추출물, washing-off solution을 함께 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통해서 단백질의 순도를 확인하였다. 그 결과 MCC를 이용하여 MCS-LysP11을 순수 분리정제 할 수 있음을 확인하였다 (도 2a). Tag가 없는 LysP11을 확보하기 위해서 MCS-LysP11이 결합된 MCC 비드를 대장균에서 생산한 His:bdSENP1과 4℃에서 6-8 시간동안 배양하였다. His:bdSENP1은 SUMO 도메인을 인식하여 자르므로 LysP11을 MCS-LysP11으로부터 순수하게 분리할 수 있었다. 처리 후 His:bdSENP1은 Ni+-NTA 친미도 컬럼을 이용하여 배양액으로부터 제거하였다. 상기 LysP11의 순도는 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과 31 kD의 LysP11이 확인되었다 (도 2b). His:bdSENP1이 LysP11 부분에 오염되었는지를 확인하기 위해서 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 통해서 확인하였다. His:bdSENP1이 LysP11 부분에는 확인이 되지 않았고 이를 통해서 LysP11이 순수하게 분리정제 되었음을 확인하였다. 이를 통해서 8 mg의 순수 LysP11을 1 kg의 생중량으로 부터 확보할 수 있었다.

LysP11의 항생 활성의 확인

LysP11의 항생 활성을 확인하고자 1 μg/ml의 농도로 다양한 박테리아의 배양 메디아에 처리하고 박테리아의 성장을 OD600에서 확인하였다. 박테리아의 종류로는 그램 양성균인 P. acnes ATCC 6919, Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ATCC 19615, and E. rhusiopathiae ATCC 19414들과 그램 음성균인 E. coli JM109를 이용하였다. 이들 중에서 E. rhusiopathiae ATCC 19414만이 60 분 동안의 처리 시간에 OD 600의 52% 감소를 나타내었으며, 90분 처리하였을 때 OD 600의 68%까지 감소를 보였다 (도 3). 이어서 LysP11을 처리한 박테리아 활성을 확인하였다. 각 시간별로 박테리아를 확보하여 MS 플레이트에서 배양함으로써 집락형성능(colony forming unit)를 확인하는 방법으로 활성을 확인하였다. 90분 처리한 박테리아는 log 값에서 5 이상의 집락형성능이 감소함을 확인하였다. 이를 통해서 LysP11이 E. rhusiopathiae에 대해서 특이적인 항생 활성을 보임을 확인하였다 (도 3c). LysP11의 pH 및 온도에 따른 항생활성을 비교한 결과 pH 8 ~ 9 사이에서 높은 활성을 보였으며, 35 ~ 37℃에서 높은 활성을 보였다. 또한 NaCl 농도가 높아짐에 따라서 활성이 높아졌으며, 400 mM에서 최대의 활성을 보였으며 그 이상에서는 활성이 낮아졌다 (도 4).

LysP11이 E. rhusiopathiae에 대한 항성 활성 확인

LysP11이 E. rhusiopathiae에 대한 항성 활성을 확인하기 위해서 LysP11을 처리한 E. rhusiopathiae을 전자현미경으로 관찰하였다. LysP11을 20 분 동안 처리한 E. rhusiopathiae은 세포벽의 변형이 왔으며, 세포질막이 얇아졌고, 세포의 형태가 크게 변형되었음을 확인할 수 있었다. 60분 동안 LysP11을 처리하였을 때는 세포벽이나 세포막의 손상이 왔으며, 일부는 세포질 내용물이 없어졌으며, 세포들이 정상적인 형상을 가지지 않음을 확인하였다. 또한 세포벽에 구멍이 생겼으며 이 구멍을 통해서 세포질 내용물이 빠져나가는 것이 관찰되었다. 이를 통해서 LysP11이 E. rhusiopathiae의 펩티도글리칸을 분해한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method or mass production of LysP11 in plants, and pharmaceutical composition for prevention and treatment of swine erysipelas comprising the same <130> 1065300 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of LysP11 <400> 1 agatttattc cggcagcaca tcattcagca ggatcaaaca gcccagtgaa tagagttgtt 60 atccatgcaa catgtccgga cgttggattt ccttctgcat ccagaaaggg tcgggcagtg 120 tctacagcaa actatttcgc ttccccctct tctggtggta gtgcgcatta tgtctgtgat 180 atcagtgaaa cagtccagtg cttgagcgag tctacaattg ggtggcatgc gcctcccaat 240 ccacactcgc taggtataga gatttgcgct gatggaggtt cacacgcctc tttccgtgta 300 ccaggacatg cttacacgag ggaacaatgg ctcgatccta gagtttggcc tgctgtggag 360 aaggctgcca tactctgtag aagattgtgc gacaaataca atgttcctaa aaggaaactg 420 tctgctgccg acttgaaggc tggcaggcgg ggtgtatgtg gcc 463 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of 5 UTR <400> 2 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaa 27 <210> 3 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of BiP <400> 3 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 4 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of M domain <400> 4 ggatcccgat ggcaaacatc actgtggatt acttatataa caaggaaact aaattattta 60 cagcaaagct aaatgttaat gagaatgtgg aatgtggaaa caatacttgc acaaacaatg 120 aggtgcataa ccttacagaa tgtaaaaatg cgtctgtttc catatctcat aattcatgta 180 ctgctcctga tggtggagga ggttctggtg gtggatcaac tagt 224 <210> 5 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of SUMO <400> 5 atgcatatta atttgaaagt gaagggacag gacggaaacg aggttttctt ccgtatcaaa 60 agatcaacac aactcaagaa actcatgaat gcttactgcg atagacaaag cgtggacatg 120 acagctatag ctttcctatt tgatgggaga aggttgagag cggaacagac tccggatgag 180 cttgaaatgg aagatggaga tgagattgac gcaatgttac atcagactgg tgccggcggt 240 240 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of HDEL <400> 6 cacgatgagc tc 12 <210> 7 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of CBM3 <400> 7 gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60 ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120 accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180 gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240 ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300 gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360 tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420 tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggtccc 480 480

Claims (15)

1. (i) M 도메인;
   (ii) CBM3 (Cellulose-binding module 3);
   (iii) SUMO (a small ubiquitin-related modifier); 및
   (iv) LysP11(Propionibacterium acnes bacteriophages P1.1 endolysin);
   을 포함하고,
   상기 LysP11의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 식물에서 LysP11를 생산하기위한 재조합 벡터.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 M 도메인의 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
4. 제 1항에 있어서, 상기 CBM 3의 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 SUMO의 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
6. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터에 BiP 또는 HDEL를 추가로 더 포함하는, 재조합 벡터.
7. 제 6항에 있어서, 상기 BiP의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하고, 상기 HDEL의 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
8. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
9. 제 1항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
10. 제 9항에 있어서, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)인, 형질 전환체.
11. (a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;
    (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;
    (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및
    (e) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;
    를 포함하는 식물에서 LysP11를 생산하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 셀룰로스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스 (amphous cellulose, AMC), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose,MCC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용하는, 식물에서 LysP11를 생산하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 (e) 단계 이후에 효소를 처리하는 단계;를 추가로 포함하는, LysP11를 정제하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 효소는 bdSENP1인, LysP11를 정제하는 방법.
15. 삭제

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