KR20190007999A - Method for producing of valuable compounds from cordyceps having enhanced productivity of valuable compounds - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 동충하초 유래 유용물질의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특징적인 동충하초 (cordyceps) 액침배양 조건을 통하여 유용물질의 생산성을 극대화시키고, 배당체 분해 단계를 통하여 유용물질이 갖는 효능을 현저히 향상시킨 동충하초 유래 유용물질의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a useful substance derived from Cordyceps, and more particularly, to a method for producing a useful substance derived from Cordyceps, by maximizing the productivity of a useful substance through characteristic cordyceps immersion culture conditions and significantly improving the efficacy of a useful substance The present invention relates to a method for producing a useful substance derived from Cordyceps sp.
동충하초는 숙주인 곤충의 몸에서 겨울을 지내고 있다가 여름에 풀처럼 나타나는 것에서 유래하는 맥각균목 동충하초과의 작은 버섯으로서, 대부분 곤충에 기생하여 숙주가 되는 곤충의 사체에 자실체를 내며, 하초동충이라고도 한다. 전 세계적으로 약 800 여종, 국내에는 약 80 여종의 동충하초가 존재하는 것으로 알려져 있다. 동충하초의 대표적인 균은 코디셉스(Cordyceps)이며, 예로부터 중국에서 불로장생의 비약으로 결핵, 황달 등의 치료와 자양강장제로서의 효과가 인정되어 한방약재로 널리 사용되어 왔다.Cordyceps is a small mushroom of the Cordyceps cryptosporium, which is derived from the fact that it is winter in the body of the host insect, and appears like grass in the summer. Most of it is parasitic on the insect and gives fruit body to the body of the insect becoming the host. There are about 800 species in the world and about 80 kinds of Chinese caterpillar fungus exist in Korea. Cordyceps, a typical bacterium of Cordyceps , has been widely used as herbal medicines because of its efficacy as a treatment for tuberculosis, jaundice, etc. and as a nourishing tonic with its prolonged use in China.
동충하초의 성분을 분석해 보면 면역증강, 항암, 노화방지 효과가 있는 다당체와 비타민, 미네랄 성분 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 인체에 필요한 11종의 아미노산이 함유되어 있으며, 세포 활성화에 필요한 항산화 지질인 리놀렌산 (linolenic acid)과 핵산인 3'-데옥시아데노신이 상당량 포함되어 있다. 이러한 동충하초는 피부 흡수성이 뛰어나고, 피부 세포의 증식효과로 인해 피부 탄력성이 증가하는 효과를 나타낸다.It is known that it contains polysaccharides, vitamins and minerals that have immune enhancement, anticancer and anti-aging properties. It contains 11 kinds of amino acids needed for human body. It is an antioxidant lipid Linolenic acid and the nucleic acid 3'-deoxyadenosine. The Cordyceps sinensis has excellent skin absorbability and shows an effect of increasing skin elasticity due to the proliferation effect of skin cells.
이러한 장점을 지니고 있는 동충하초는 발생 조건이 까다로워 자연에서 쉽게 얻을 수 없어 매우 고가에 거래되고 있으며, 산업적 활용에 있어서 가격이 장애 요소로 작용하여 이를 극복하기 위하여 인공재배에 대해 많은 연구가 진행되고 있으나, 여전히 자실체를 생성하기까지는 많은 시간 (50 ~ 80 시간)이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 동충하초 자실체는 코디세핀, 아데닌 등의 유용 물질을 미량 함유하고 있어, 기능성 유효 함량에 맞는 제품을 생산하기 위해서는 동충하초 자실체의 대량생산, 분리 정제, 농축 등의 공정이 필수적이므로, 이는 생산단가 상승과 높은 제품가격의 주요 원인이 되고 있으며, 이러한 이유로 재배 기간도 단축시키고 공정 단계도 축소할 수 있는 액침 배양을 통한 연구를 진행하고 있다.In order to overcome this problem, there have been many researches on artificial cultivation. However, in order to overcome this problem, It still takes a long time (50 to 80 hours) to produce the body. In addition, since the Cordyceps sinensis contains trace amounts of useful substances such as cordycepin, adenine and the like, it is necessary to mass-produce, isolate, purify, and concentrate the Cordyceps sinensis fruit body in order to produce a product that meets the effective functional content. And high product prices. For this reason, we are conducting research through immersion culture which can shorten cultivation period and reduce process steps.
동충하초에 의해 생산되는 천연물질은 피부 안정성이 탁월하고, 피부에 무자극성인 장점이 있어 화장품 제형에 장기적인 효과를 갖는다. 천연 핵산인 3'-데옥시아데노신이 상당량 포함되어 있어 안전성이 확보된 동충하초의 안전성에 대한 소비자의 신뢰가 있으며, 주름개선 효능도 보고되고 있기 때문에 동충하초에 대한 다양한 개발이 가속화 될 것으로 보인다.Natural substances produced by Cordyceps are excellent in skin stability and non-irritating to the skin, and have long-term effects on cosmetic formulations. As the natural nucleic acid, 3'-deoxyadenosine, is contained in a considerable amount, it is believed that the safety of the caterpillar fungus is secured by consumers, and the wrinkle-reducing effect is also reported.
또한, 미생물 또는 식물유래 대사 산물은 당과 결합하여 배당체로 존재하는 경우가 많은데, 분자구조 내의 수산기가 배당체로 치환되면 상기 효능이 없어지거나 감소하는 것으로 알려져 있으므로 배당체가 분해되어야 한다. 배당체는 특정 분자 혹은 단백질 중에서 글리코실기를 분해하는 탈당화 반응 방법으로 분해하며, 크게 화학적 방법과 효소를 이용한 방법이 있다.In addition, microorganisms or plant-derived metabolites are often present as glycosides in association with sugars. When the hydroxyl groups in the molecular structure are replaced by glycosides, the glycosides must be degraded because they are said to be lost or decreased. Glycosides are degraded by a dehydration reaction method which decomposes glycosyl groups among specific molecules or proteins, and there are methods using chemical methods and enzymes.
화학적 방법은 글리코실기에 특이적 반응성을 지닌 화합물을 사용하여 원하는 글리코실기를 제거하는 방법으로서, 하이드라진 탈수반응, 알칼리 베타-제거반응, 트리플로메탄술폰산을 이용한 방법 등이 있다. 하지만, 화학적 탈당화 반응의 단점으로는 변환율이 낮고 반응조건이 혹독하여 분자의 분해를 초래할 수 있다는 단점이 있다. 또한, 효소를 이용한 탈당화 반응은 화학적 방법에 비해 반응조건이 훨씬 온화하며, 비교적 변환율이 높다는 장점이 있으나, 이용되는 효소의 가격이 고가이며, 효소의 안정성이 낮은 단점이 있다.The chemical method is a method of removing a desired glycosyl group using a compound having a specific reactivity to a glycosyl group, including a hydrazine dehydration reaction, an alkali beta-elimination reaction, and a method using triflomethanesulfonic acid. However, the disadvantage of the chemical desolvation reaction is that the conversion rate is low and the reaction conditions are severe, which may lead to decomposition of the molecules. In addition, the desolvation reaction using an enzyme is advantageous in that the reaction conditions are much milder than those of the chemical method, and the conversion rate is relatively high, but the price of the enzyme used is high and the stability of the enzyme is low.
이에 본 발명자들은 상술한 바와 같은 천연물 소재의 생산 과정의 단점을 보완하고자 최적의 배양조건을 도출하고, 유효성분의 함량이 일정하고 고농도의 대사산물을 생산한 후 고정화된 효소를 이용한 생물전환 기술로 배당체를 분해하여 대사산물이 갖는 효능을 증대시킬 수 있는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법을 제공하고자 한다.Accordingly, the present inventors have found that, in order to compensate for the disadvantages of the production process of natural materials as described above, the present inventors have found that optimal culture conditions are derived, and a biosynthesis technology using an immobilized enzyme after producing a high- Which is capable of decomposing glycosides to increase the potency of the metabolites.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a beneficial substance derived from Cordyceps, comprising the steps of:
(a) 동충하초 종균을 배지에 접종하고 배양하여 종균 배양액을 수득하고 균질화하는 단계,(a) inoculating and culturing the seedlings of a Chinese cabbage seed culture to obtain a seed culture and homogenizing the seed culture,
(b) 상기 균질화된 종균 배양액을 유기 질소원 및 무기 질소원이 포함된 배지에 접종 및 배양하여 배양액을 수득하는 단계,(b) inoculating and culturing the homogenized seed culture into a medium containing an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source to obtain a culture solution,
(c) 상기 배양액을 담체에 고정화된 효소와 반응하여 배당체를 분해하는 단계.(c) decomposing the glycoside by reacting the culture with the enzyme immobilized on the carrier.
본 발명에 따른 동충하초 유래 유용물질의 생산방법에 있어서, 상기 유용물질은 코디세핀, 아데노신 및 아데닌 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.In the method for producing a useful substance derived from Cordyceps, the useful substance is any one selected from codisepine, adenosine and adenine.
또한, 본 발명은 상기 (b) 단계 이전에, 종균 배양액에 포함된 코디세핀, 아데노신 및 아데닌으로 이루어진 유용물질 중의 어느 하나의 생산에 적합한 유기 질소원 및 무기 질소원을 선택하여 배지에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.The present invention also provides a method for preparing a culture medium containing an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source suitable for the production of any one of the useful substances of cordycepin, adenosine and adenine contained in the seed culture, .
상기 유기 질소원은 효모 추출물 (Yeast Extract), 트립톤 (Tryptone), 카사미노산 (Casamino acid), 소이톤 (Soytone), 백토 펩톤 (Bacto Peptone), 프로테오스펩톤 (Proteose Peptone) 및 폴리펩톤 (Polypeptone) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 무기 질소원은 (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, NH4NO3, NaNO3 및 KNO3 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.The organic nitrogen source may be selected from the group consisting of Yeast Extract, Tryptone, Casamino acid, Soytone, Bacto Peptone, Proteose Peptone and Polypeptone ) one type of feature, and not less than selected from the inorganic nitrogen source (NH 4) 2 SO 4, (NH 4) 2 HPO 4,
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유용물질은 코디세핀일 수 있고, 상기 유기 질소원은 효모 추출물일 수 있으며, 상기 무기 질소원은 (NH4)2HPO4,NaNO3 또는 이들의 혼합물일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the useful substance may be codeseepin, and the organic nitrogen source may be a yeast extract, and the inorganic nitrogen source may be (NH 4 ) 2 HPO 4 , NaNO 3 Or a mixture thereof.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (b) 단계에서 균질화된 종균 배양액을 2 ~ 4%의 접종량으로 배지에 접종할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the seed culture medium homogenized in the step (b) may be inoculated into the medium at an inoculation amount of 2 to 4%.
또한, 본 발명은 상기 (c) 단계 이전에, 상기 배양액에 포함된 배당체 분해에 적합한 효소를 분석하여 선택하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 선택은 배양액과 α-amylase, gluco-amylase, fungamyl, ctec-2, celluclast 및 cellobiase 중에서 선택되는 각각의 효소를 반응시켜 페놀함량 및 라디컬 소거능을 분석하여 선택하는 것일 수 있다.Further, the present invention may further comprise a step of analyzing and selecting an enzyme suitable for the degradation of the glycoside contained in the culture broth prior to the step (c), wherein the selection is carried out by mixing the culture broth with α-amylase, gluco-amylase, fungamyl , ctec-2, celluclast, and cellobiase to analyze phenol content and radical scavenging ability.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 분석을 통하여 선택된 효소는 fungamyl일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the enzyme selected through the analysis may be fungamyl.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (b) 단계의 접종 후 배양은 15 ~ 37 ℃ 및 pH 5 ~ 7에서 50 ~ 200 rpm의 교반속도로 배양하는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the post-inoculation culture in step (b) may be carried out at a stirring rate of 50 to 200 rpm at 15 to 37 ° C and a pH of 5 to 7.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (c) 단계는 배양액을 담체에 고정화된 효소와 2.5 ~ 4.5 시간 동안 반응하여 배당체를 분해하는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the step (c) may be a step of decomposing the glycoside by reacting the culture with the enzyme immobilized on the carrier for 2.5 to 4.5 hours.
본 발명에 따르면 코디셉스 (cordyceps, 동충하초)를 특정 조건에서 균일화된 균사체 형태로 배양하여 단기간에 배양액을 수득할 수 있으며, 배당체 분해가 가능한 최적의 효소를 선정하고 이를 담체에 고정화하는 단계를 거쳐, 이후 발효 공정을 통하여 항산화, 항노화 및 콜라게나제 (Collagenase) 저해 활성이 현저히 향상된 유용물질을 높은 생산성으로 수득할 수 있어 천연 화장품 원재료로 유용하게 활용할 수 있다.According to the present invention, it is possible to obtain a culture solution in a short period of time by culturing cordyceps (Cordyceps) in the form of homogeneous mycelium under specific conditions. The optimum enzyme capable of degrading the glycosides is selected and immobilized on a carrier, Thereafter, a useful substance having remarkably improved antioxidation, anti-aging, and collagenase inhibiting activity can be obtained with high productivity through the fermentation process, so that it can be usefully used as a raw material for natural cosmetics.
도 1 은 본 발명에 따른 동충하초 유래 유용물질의 생산방법의 전체적인 단계를 개략적으로 보여주는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 동충하초 (코디셉스) 액침 배양에서 균질화된 종균 배지를 본 발명에 따른 배양에 접종했을 때, 접종량에 따라 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 동충하초 (코디셉스) 액침 배양에서 유기 질소원이 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 동충하초 (코디셉스) 액침 배양에서 무기 질소원이 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 동충하초 (코디셉스) 액침 배양에서 배양액과 각 효소의 반응(반응 시간)에 따른 콜라게나제(collagenase)의 활성 저해율을 보여주는 그래프이다. Fig. 1 is a flowchart schematically showing an overall step of a method for producing a beneficial substance derived from Cordyceps sinensis according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the effect of the seed culture medium according to the present invention on the production of cordycepin, which is one of the useful substances, in the culture according to the present invention when the homogenized seed culture medium is inoculated in the culture medium of the Cordyceps sinensis according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the effect of the organic nitrogen source on the production of cordycepin, one of the useful substances, in the immersion culture of Cordyceps sinensis according to the present invention.
4 is a graph showing the effect of an inorganic nitrogen source on the production of codisepine, which is one of the useful substances, in the immersion culture of Cordyceps sinensis according to the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the inhibition rate of collagenase activity according to the reaction (reaction time) between the culture medium and each enzyme in the immersion culture of Cordyceps sinensis according to the present invention.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 발명자들은 코디셉스 배양시 특정 조건이 코디세핀 (cordycepin), 아데노신 (adenosine), 아데닌 (adenine) 등의 유용물질 생산성에 영향을 미치고, 유용물질의 항산화, 항노화 등의 특정 효능에도 영향을 미치는 것을 확인하여 본 발명을 도출하였다.The inventors of the present invention have found that a specific condition during the cultivation of Codicepses affects productivity of useful substances such as cordycepin, adenosine and adenine and also affects specific effects such as antioxidation and anti-aging of useful substances And thus the present invention was derived.
또한, 배양시 펠릿형(pellet type)으로 성장함으로써 접종할 때 일정한 량이 접종되지 않는 단점을 보완하기 위하여, 균질기(homogenizer)을 종균 배양액을 균질화하여 배양에 접종한 결과 모든 배양액이 일정하게 균사체로 자라는 것을 확인하였다.In addition, in order to compensate for the disadvantage that a certain amount is not inoculated at the time of inoculation by growing into a pellet type at the time of culturing, homogenizing the homogenized culture medium and inoculating the culture medium with the homogenizer, .
또한, 탄소원의 성분보다 질소원의 성분에 따라서 코디세핀의 생산 함량이 크게 변화됨을 확인하고, 이에 최적화된 액침 배양 조건을 도출한 결과, 400 ppm 이상의 높은 코디세핀 함량을 얻을 수 있음을 확인하였다.Also, it was confirmed that the content of codisepine was significantly changed according to the nitrogen source component than that of the carbon source. As a result of optimized immersion culture conditions, it was confirmed that a high content of cordycepin of 400 ppm or more can be obtained.
나아가서, 본 발명은 효소 고정화를 통해 반응에 사용한 효소를 재사용할 수 있는 것을 특징으로 하고 있어 효소의 가격 문제를 해결할 수 있고, 효소를 고정화하지 않았을 경우 보다 안정성이 더욱 증대되어 보다 효율적인 공정인 것을 특징으로 한다.Further, the present invention is characterized in that the enzyme used in the reaction can be reused through enzyme immobilization, thereby solving the problem of the price of the enzyme, and more stable than that when the enzyme is not immobilized, which is a more efficient process .
액침 배양을 통하여 코디셉스의 유용물질을 생산하는 방법에 대해서는 계속 연구개발되어 왔으나, 효소를 담체에 고정화하여 배당체를 분해하는 단계를 통하여 유용물질 성분의 증가 및 특정 효능을 향상시킨 것에 대해서는 보고된 바가 없다.Methods for producing a useful substance of Codiceceus through immersion culture have been studied and developed. However, it has been reported that the enzymatic activity is increased by immobilizing the glycoside to increase the useful substance component and the specific effect none.
본 발명은 고정화된 효소를 이용하여 코디셉스 유래 유용물질의 생산성을 증대시키고, 유용물질이 갖는 항노화 효능의 활성을 높인 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법에 관한 것으로 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a method for producing a useful substance derived from Cordyceps sinensis, which comprises increasing the productivity of a useful substance derived from Codisps using an immobilized enzyme and increasing the activity of an anti-aging activity of a useful substance, .
(a) 동충하초 종균을 배지에 접종하고 배양하여 종균 배양액을 수득하고 균질화하는 단계,(a) inoculating and culturing the seedlings of a Chinese cabbage seed culture to obtain a seed culture and homogenizing the seed culture,
(b) 상기 균질화된 종균 배양액을 유기 질소원 및 무기 질소원이 포함된 배지에 접종 및 배양하여 배양액을 수득하는 단계,(b) inoculating and culturing the homogenized seed culture into a medium containing an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source to obtain a culture solution,
(c) 상기 배양액을 담체에 고정화된 효소와 반응하여 배당체를 분해하는 단계.(c) decomposing the glycoside by reacting the culture with the enzyme immobilized on the carrier.
상기 a)에 사용되는 동충하초 균사체는 코디셉스 시넨시스 (Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스 (Cordyceps militaris), 코디셉스 오피오글로쏘이데스 (Cordyceps ophioglossoides), 코디셉스 시카데 (Cordyceps cicadae), 코디셉스 소보리페라 (Cordyceps sobolifera), 코디셉스 베아우베리아 (Cordyceps beauveria) 및 코디셉스 바씨아나 (Cordyceps bassiana) 중에서 선택되는 1종 이상의 균사체일 수 있다.Wherein a) fungus mycelium coordination sepseu sinen sheath (Cordyceps sinensis) is used, the other coordination sepseu mm less (Cordyceps militaris , Cordyceps < RTI ID = 0.0 > ophioglossoides , Cordyceps cicadae , Cordyceps < RTI ID = 0.0 > sobolifera), Cody sepseu beret brother Beria (Cordyceps beauveria) and Cody sepseu bassi Ana (Cordyceps bassiana ) may be used.
본 발명은 종균 배양액을 수득한 이후에 균질화하는 단계를 거치는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by the step of homogenizing after obtaining the seed culture.
일반적으로 배지에서 포자를 접종하여 종균 배양시 펠릿형(pellet type)으로 성장하여 접종시에 일정한 량이 접종되지 않는 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 배지에서 종균배양 후, 균질기(homogenizer)를 이용하여 균질화하여 접종하고, 그 결과 균사체가 일정하게 자라는 것을 확인하였다.In general, in order to solve the problem that a seed is not inoculated at the time of inoculation by growing into a pellet type when the seed culture is inoculated with the spore in the medium, the present invention uses a homogenizer after the seed culture in the medium And homogenized and inoculated. As a result, it was confirmed that the mycelium was constantly growing.
또한, 종균 배양액의 접종량은 하기 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 균질화된 종균 배양액을 2 ~ 4%의 접종량으로 배지에 접종하는 것이 바람직하다.As to the inoculum amount of the seed culture, as shown in Fig. 2, it is preferable to inoculate the homogenized seed culture into the medium at an inoculation amount of 2-4%.
본 발명은 종균 배양액에 포함된 코디세핀, 아데노신, 아데닌 등의 특정 유용물질의 생산에 적합한 유기 질소원 및 무기 질소원을 선택하여 배지에 첨가하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source suitable for production of a specific useful substance such as codisepine, adenosine, adenine and the like contained in the seed culture are selected and added to the medium.
하기 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 유용물질이 코디세핀인 경우에 유기 질소원은 효모 추출물이고, 무기 질소원이 (NH4)2HPO4, NaNO3 또는 이들의 혼합물일 때 코디세핀의 생산성이 극대화된다.As shown in FIG. 3 and FIG. 4, when the useful substance is cordycepin, the organic nitrogen source is yeast extract, and the inorganic nitrogen source is (NH 4 ) 2 HPO 4 , NaNO 3 Or a mixture thereof, the productivity of codisepine is maximized.
본 발명은 배양액에 포함된 배당체 분해에 적합한 효소를 분석하여 선택한 후에 이를 담체에 고정화시켜 배당체 분해 반응을 거치도록 한다.In the present invention, an enzyme suitable for decomposing glycosides contained in a culture broth is analyzed and selected, and then immobilized on a carrier to undergo a glycoside decomposition reaction.
하기 도 5 및 실시예의 [표 1]에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따란 최종 생산되는 유용물질인 코디세핀이 갖는 콜라게나제 활성 저해능 향상에 fungamyl 효소가 가장 적합함을 알 수 있다.As can be seen from the following Table 5 and Table 1 of the Examples, it can be seen that fungamyl enzyme is most suitable for improving the collagenase activity inhibitory activity of cordysepine, which is a useful substance that is finally produced according to the present invention.
또한, 배당체 분해를 통하여 콜라게나제 활성 저해능을 더욱 향상시키기 위하여 담체에 고정화된 효소와 반응시키고, 그 반응 시간은 2.5 ~ 4.5 시간 동안 반응하는 것이 바람직하다.In order to further improve the inhibitory activity of collagenase activity through glycosidation, it is preferable to react with an enzyme immobilized on a carrier, and to conduct the reaction for 2.5 to 4.5 hours.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이러한 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. These examples and experimental examples are only intended to illustrate the present invention in detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples and experimental examples.
<< 실시예Example >>
(1) PDA (Potato Dextrose Agar) 평판 배지에 보관 중인 코디셉스 밀리타리스 (Cordyceps militaris) 균주를 PDA(Potato Dextrose Agar) 사면배지에 접종하고, 25 ℃에서 7 일간 배양하였다. 단일 종으로 확인 (오염 여부 확인) 후에, 0.2% Tween 80 용액 10 mL을 첨가하여 얻은 포자 용액을 90 mL YPD (1% yeast extract, 1% peptone, 2% glucose) 상기 배지에 10%로 접종한 후 25 ℃에서 약 3 ~ 4 일간 배양하였다.(1) Cordyceps militaris strains stored in a PDA (Potato Dextrose Agar) plate medium were inoculated into a PDA (Potato Dextrose Agar) slope medium and cultured at 25 ° C for 7 days. After 10 ml of 0.2
(2) 다음으로, 상기 종균 배양액을 균질기 (homogenizer)에서 10,000 rpm으로 균질화한 후에, 코디셉스 액침 배양에 있어서 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 함량 분석을 이용하여 코디세핀의 생산에 가장 적합한 종균 배양액의 접종량, 그리고 가장 적합한 유기 질소원과 무기질소원을 비교 분석하였다.(2) Next, the seed culture was homogenized at 10,000 rpm in a homogenizer, and then analyzed for the content of codisepin, which is one of the useful substances in the coadisse immersion culture, The amount of inoculum, and the most suitable organic nitrogen and inorganic nitrogen were compared.
(ⅰ) 먼저, 종균 배양액을 균질화한 후에 배양 배지 50 mL (0.1% KH2PO4, 0.2% MgSO4·7H2O)에 1 ~ 5%로 접종량을 달리하여 25 ℃에서 100 rpm으로 8 일간 배양하였다.(I) First, the seed culture was homogenized and then seeded in a culture medium of 50 mL (0.1% KH 2 PO 4 , 0.2% MgSO 4 .7H 2 O) at 1 to 5% at 25 ° C. and 100 rpm for 8 days Lt; / RTI >
배양한 후에 유용물질 중의 하나인 코디세핀 함량을 분석하였으며, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었으며, 코디세핀의 함량 분석 방법은 하기의 방법으로 실시하였다.After the cultivation, the content of codistin, which is one of useful substances, was analyzed. The results are shown in FIG. 2, and the content of codistin was analyzed by the following method.
하기 도 2는 본 발명에 따른 코디셉스 액침 배양에서 균질화된 종균 배양액을 접종량을 달리한 경우에 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 접종량을 3%로 한 경우에 코디세핀의 함량이 가장 높았다. 따라서, 코디세핀의 생산성을 높이기 위해서는 접종량을 3%로 하는 것이 바람직함을 알 수 있다.FIG. 2 is a graph showing the effect of homogenized seed culture medium on the production of codisepin, which is one of the useful substances when the inoculation amount is varied, in the immersion culture of the Codicece according to the present invention. Cefin content was the highest. Therefore, it is preferable to set the inoculation amount to 3% in order to increase the productivity of cordycepin.
<코디세핀 함량분석 방법>≪ Method for analyzing the content of codisin &
유용물질 중의 하나인 코디세핀 (cordycepin)의 함량분석은 UV Detector (SPD-20A, Shimadzu, Japan)가 탑재된 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하였고, 컬럼 (column)은 XBridge C18 5 ㎛ (250 4.6 ㎜, Waters)를 사용하였다. 컬럼의 이동상 (mobile phase)은 15% methanol in 20 mM phosphoric acid를 사용하였으며, 유속은 0.6 mL/min 이였다.The content of cordycepin, one of the useful substances, was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with a UV detector (SPD-20A, Shimadzu, Japan). Columns were
(ⅱ) 종균 배양액을 균질화한 후에 유기 질소원을 각각 ① 대조구, ② 효모 추출물 (Yeast Extract), ③ 트립톤 (Tryptone), ④ 카사미노산 (Casamino acid), ⑤ 소이톤 (Soytone), ⑥ 백토 펩톤 (Bacto Peptone), ⑦ 프로테오스펩톤 (Proteose Peptone), ⑧ 폴리펩톤 (Polypeptone)을 2%로 하여 배양 배지 50 mL (0.1% KH2PO4, 0.2% MgSO4·7H2O)에 1 ~ 5%로 접종하여 25 ℃에서 100 rpm으로 8 일간 배양하였다.(Ⅱ) After homogenizing the seed culture, the organic nitrogen source was used as a control, a yeast extract, a trytone, a casamino acid, a soybean, a white clay peptone, (0.1% KH 2 PO 4 , 0.2% MgSO 4 .7H 2 O) was added to the culture medium in an amount of 1 to 5 (Bacto Peptone), 7% Proteose Peptone and 8% Polypeptone %, And cultured at 25 DEG C at 100 rpm for 8 days.
배양한 후에 유용물질 중의 하나인 코디세핀 함량을 분석하였으며, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었으며, 코디세핀의 함량 분석 방법은 상기 방법으로 동일하게 실시하였다.After the cultivation, the content of codistin, which is one of the useful substances, was analyzed. The results are shown in FIG. 3, and the content of codistin was analyzed in the same manner as described above.
하기 도 3은 본 발명에 따른 코디셉스 액침 배양에서 유기 질소원이 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 8 일 배양 기준으로 효모 추출물 (Yeast Extract)인 경우에 코디세핀의 함량이 가장 높았다. 따라서, 코디세핀의 생산성을 높이기 위해서는 유기 질소원을 효모 추출물 (Yeast Extract)로 선택하는 것이 바람직함을 알 수 있다.FIG. 3 shows the effect of the organic nitrogen source on the production of cordycepin, which is one of the useful substances, in the immersion culture of Codicece according to the present invention. In case of yeast extract, The content was the highest. Therefore, it is preferable to select the organic nitrogen source as Yeast Extract in order to increase the productivity of cordycepin.
(ⅲ) 또한, 종균 배양액을 균질화한 후에 무기 질소원을 각각 ① 대조구, ② (NH4)2SO4, ③ (NH4)2HPO4, ④ NH4Cl, ⑤ NH4NO3, ⑥ NaNO3, ⑦ KNO3 를 2%로 하여 배양 배지 50 mL (0.1% KH2PO4, 0.2% MgSO4·7H2O)에 1 ~ 5%로 접종하여 25 ℃에서 100 rpm으로 8 일간 배양하였다.(NH 4 ) 2 SO 4 , (NH 4 ) 2 HPO 4 , ( 4 ) NH 4 Cl, (5) NH 4 NO 3 , (6) NaNO 3 , 7) 1% to 5% of KNO 3 was inoculated to 50% of culture medium (0.1% KH 2 PO 4 , 0.2% MgSO 4 .7H 2 O) at 2 % and cultured at 25 ° C for 10 days at 100 rpm.
배양한 후에 유용물질 중의 하나인 코디세핀 함량을 분석하였으며, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었으며, 코디세핀의 함량 분석 방법은 상기 방법으로 동일하게 실시하였다.After the cultivation, the content of codistin, which is one of useful substances, was analyzed. The results are shown in FIG. 4, and the content of codistin was analyzed by the same method.
하기 도 4는 본 발명에 따른 코디셉스 액침 배양에서 무기 질소원이 유용물질 중의 하나인 코디세핀의 생산에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 8 일 배양 기준으로 (NH4)2HPO4 또는 NaNO3인 경우에 코디세핀의 함량이 가장 높았다. 따라서, 코디세핀의 생산성을 높이기 위해서는 유기 질소원을 (NH4)2HPO4 또는 NaNO3로 선택하는 것이 바람직함을 알 수 있다.To 4 is a result showing the effect on the production of one of the coordination sepin of inorganic nitrogen sources are useful materials in coordination sepseu immersion culture according to the invention, up to 8 days incubation reference (NH 4) 2 HPO 4 Or NaNO 3 , the content of cordisepin was the highest. Therefore, in order to increase the productivity of codistepin, the organic nitrogen source should be replaced by (NH 4 ) 2 HPO 4 Or it can be seen that it is preferable to select as NaNO 3.
(3) 상기의 배양으로 균일화된 균사체 형태로 배양하여 수득한 배양여액 내의 배당체 (유용물질이 당과 결합)의 분해에 가장 적합한 효소를 비교 분석하였다.(3) The most suitable enzymes for the degradation of glycosides (useful substances bound to sugars) in the culture filtrate obtained by culturing in the form of homogeneous mycelium by the above culturing were compared and analyzed.
(ⅰ) 먼저, 배양여액 (10 mL)에 α-amylase, gluco-amylase, fungamyl, ctec-2, celluclast, cellobiase 각각의 효소를 50 unit씩 투여하여 라디칼소거능 및 총 페놀 함량 측정 실험을 하였다.(I) First, 50 units of α-amylase, gluco-amylase, fungamyl, ctec-2, celluclast, and cellobiase were administered to the culture filtrate (10 mL) to determine the radical scavenging ability and total phenol content.
자유 라디칼 소거능 측정은 DPPH 시약 및 샘플을 1:1로 하여 25 ℃에서, 5 ~ 30 분 동안 반응을 수행하였으며, 반응이 완료된 샘플은 517 ㎚ 흡광도에서 측정하여 각 효소들을 비교 분석하였다.Free radical scavenging activity was measured by DPPH reagent and sample at 1: 1 at 25 ℃ for 5 ~ 30 min. The samples were analyzed by absorbance at 517 ㎚.
총 페놀 함량을 측정은 폴린-시오칼투 (folin-ciocalteu) 시약을 각 샘플에 투여하여 30 ℃에서 2 ~ 10 분 동안 반응을 수행하였으며, 각 샘플에 20% Na2CO3를 투여하여 24 ℃에서 5 ~ 60 분 동안 반응을 진행하고, 반응이 끝난 샘플을 765 ㎚ 흡광도에서 측정하였다.The total phenol content was measured by adding a folin-ciocalteu reagent to each sample and reacting at 30 ° C for 2 to 10 minutes. Each sample was treated with 20% Na 2 CO 3 at 24 ° C The reaction was carried out for 5 to 60 minutes, and the reacted sample was measured at 765 nm absorbance.
상기 각각의 효소에 대해서 라디컬 소거능 및 페놀 함량을 측정하여 비교 분석한 후에, 가장 효능이 우수한 fungamyl 효소를 선택하였다After the radical scavenging activity and phenol content of each of the above enzymes were measured and compared, the most effective fungamyl enzyme was selected
(4) 효소 고정화 반응은 수산화기의 활성을 위해 산 처리 및 과산화수소로 활성탄의 표면을 전처리하였으며, 3-APTES (aminopropyl-thethoxysilane) 물질을 이용해 작용기인 아미노기를 붙이고, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 알데하이드기를 생성 후 최종적으로 효소와 고정화를 실시하였다.(4) The enzyme immobilization reaction was carried out by acid treatment and hydrogen peroxide pretreatment of the surface of the activated carbon for the activation of the hydroxyl group, and 3-APTES (aminopropyl-thethoxysilane) substance was used to attach the functional amino group and glutaraldehyde After the aldehyde group was formed, the enzyme was immobilized with the enzyme.
실리카 겔(Silica gel) 담체에 고정화된 효소의 activity를 측정한 결과 약 53 U/mL를 보였다. 실리카 겔(Silica gel)에 고정화된 효소의 효능을 보기 위해 배양액과 0.5 ~ 5 시간 동안 반응하여 콜라게나제(collagenase)의 활성 저해율을 분석하였다The activity of the enzyme immobilized on the silica gel carrier was measured to be about 53 U / mL. In order to examine the efficacy of the enzyme immobilized on silica gel (Silica gel), the inhibition rate of collagenase activity was assayed by reacting with the culture solution for 0.5 to 5 hours
하기 도 5는 코디셉스 배양여액에 각각의 효소와 그 처리 시간에 따른 콜라게나제 (collagenase) 활성 저해율 결과이고, 그 결과 fungamyl 효소가 저해율이 가장 높음을 확인할 수 있다.FIG. 5 shows the result of inhibition of collagenase activity by each enzyme and its treatment time in the culture solution of Codisheps, and as a result, the inhibition rate of fungamyl enzyme was the highest.
또한, 하기 [표 1]은 실리카 겔 담체에 고정화된 효소 (fungamyl)와 배양여액을 반응시켜 배당체 분해 단계를 거침에 따라 콜라게나제 활성 저해율을 나타낸 것으로서, 배당체 분해 단계 전의 배양액의 콜라게나제 활성 저해율 대비 효소와 반응으로 배당체 분해 단계를 수행한 이후에 콜라게나제 활성 저해율이 향상되었음을 확인할 수 있다.[Table 1] shows the inhibition rate of collagenase activity by reacting fungamyl immobilized on a silica gel carrier with a culture filtrate to obtain a collagenase activity inhibition step. The collagenase activity of the culture broth prior to the step of decomposing glycoside It was confirmed that the inhibition rate of collagenase activity was improved after the glycoside decomposition step was performed by reacting with the enzyme with respect to the inhibition rate.
또한, 담체에 고정화된 효소와의 배당체 분해 반응 시간은 3 ~ 4시간이 바람직함을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the decomposition reaction time of the glycoside with the enzyme immobilized on the carrier is preferably 3 to 4 hours.
(5) 담체에 고정화된 효소는 PBR (Packed bed reactor) 실험을 통하여 효소의 재사용이 가능함을 확인하였으며, 다만 3회 이상 재사용한 경우에는 콜라게나제 활성 저해율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.(5) The enzyme immobilized on the carrier was confirmed to be capable of reusing the enzyme through a PBR (Packed bed reactor) experiment. However, it was confirmed that the inhibition rate of collagenase activity was reduced when the enzyme was reused three times or more.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 최적화된 액침 배양에서 코디셉스 (cordyceps; 동충하초)를 균일화된 균사체 형태로 배양하여 수득한 배양액에 고정화된 효소로 배당체 분해를 하여 항노화 기능 등의 특정 효능을 갖는 유용 물질을 높은 수율로 생산할 수 있는 바, 화장품 원료 산업에 유용하게 활용할 수 있다.As described above, in the immersion culture optimized according to the present invention, cordyceps ( cordyceps ) are cultured in homogenized mycelial form, and the resulting culture solution is subjected to glycoside decomposition with the enzyme immobilized thereon, Can be produced with high yield, and thus can be usefully used in the cosmetic raw material industry.
Claims (8)
(b) 상기 균질화된 종균 배양액을 유기 질소원 및 무기 질소원이 포함된 배지에 접종 및 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 배양액을 담체에 고정화된 효소와 반응하여 배당체를 분해하는 단계;를 포함하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법으로서,
상기 유용물질은 코디세핀, 아데노신 및 아데닌 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.(a) inoculating and culturing the seedlings of a Chinese cabbage seed culture to obtain a seed culture and homogenizing the seed culture;
(b) inoculating and culturing the homogenized seed culture into a medium containing an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source to obtain a culture liquid; And
(c) reacting the culture solution with an enzyme immobilized on a carrier to decompose the glycoside,
Wherein said useful substance is any one selected from cordisepine, adenosine and adenine.
상기 (b) 단계 이전에, 종균 배양액에 포함된 코디세핀, 아데노신 및 아데닌으로 이루어진 유용물질 중의 어느 하나의 생산에 적합한 유기 질소원 및 무기 질소원을 선택하여 배지에 첨가하는 단계;를 더 포함하고,
상기 유기 질소원은 효모 추출물 (Yeast Extract), 트립톤 (Tryptone), 카사미노산 (Casamino acid), 소이톤 (Soytone), 백토 펩톤 (Bacto Peptone), 프로테오스펩톤 (Proteose Peptone) 및 폴리펩톤 (Polypeptone) 중에서 선택되는 1종 이상이고,
상기 무기 질소원은 (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, NH4NO3, NaNO3 및 KNO3 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.The method according to claim 1,
The method according to claim 1, further comprising the step of selecting and adding to the medium an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source suitable for the production of any one of the useful substances consisting of codisepin, adenosine and adenine contained in the seed culture broth prior to the step (b)
The organic nitrogen source may be selected from the group consisting of Yeast Extract, Tryptone, Casamino acid, Soytone, Bacto Peptone, Proteose Peptone and Polypeptone ), ≪ / RTI >
The inorganic nitrogen source (NH 4) 2 SO 4, (NH 4) 2 HPO 4, NH 4 Cl, NH 4 NO 3, NaNO 3 And a method of producing fungus-derived biologically active substances, characterized in that at least one member selected from the group consisting of KNO 3.
상기 유용물질은 코디세핀이고, 상기 유기 질소원은 효모 추출물이며, 상기 무기 질소원은 (NH4)2HPO4,NaNO3 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.3. The method of claim 2,
And the useful substance is coordinated sepin, and the organic nitrogen source is yeast extract, of the inorganic nitrogen source (NH 4) 2 HPO 4, NaNO 3 Or a mixture thereof. ≪ RTI ID = 0.0 > 5. < / RTI >
상기 (b) 단계에서 균질화된 종균 배양액을 2 ~ 4%의 접종량으로 배지에 접종하는 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.The method according to claim 1,
Wherein the seed culture medium homogenized in step (b) is inoculated into a culture medium with an inoculation amount of 2 to 4%.
상기 (c) 단계 이전에, 상기 배양액에 포함된 배당체 분해에 적합한 효소를 분석하여 선택하는 단계;를 더 포함하고,
상기 선택은 배양액과 α-amylase, gluco-amylase, fungamyl, ctec-2, celluclast 및 cellobiase 중에서 선택되는 각각의 효소를 반응시켜 페놀함량 및 라디컬 소거능을 분석하여 선택하는 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.The method according to claim 1,
Further comprising the step of analyzing and selecting an enzyme suitable for decomposing glycosides contained in the culture liquid before the step (c)
Wherein the selection is performed by analyzing the phenol content and the radical scavenging ability by reacting each of the enzymes selected from the culture medium with α-amylase, gluco-amylase, fungamyl, ctec-2, celluclast and cellobiase, .
상기 분석을 통하여 선택된 효소는 fungamyl인 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.6. The method of claim 5,
Wherein the enzyme selected through the above analysis is fungamyl.
상기 (b) 단계의 접종 후 배양은 15 ~ 37 ℃ 및 pH 5 ~ 7에서 50 ~ 200 rpm의 교반속도로 배양하는 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.The method according to claim 1,
Wherein the culturing after inoculation in step (b) is carried out at a stirring speed of from 15 to 37 ° C and a pH of from 5 to 7 at a speed of from 50 to 200 rpm.
상기 (c) 단계는 배양액을 담체에 고정화된 효소와 2.5 ~ 4.5 시간 동안 반응하여 배당체를 분해하는 것을 특징으로 하는 동충하초 유래 유용물질의 생산방법.The method according to claim 1,
Wherein the step (c) comprises reacting the culture with an enzyme immobilized on a carrier for 2.5 to 4.5 hours to decompose the glycoside.
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