KR20180132402A - 리보솜 단백질 S3에 대한 siRNA를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물 - Google Patents

리보솜 단백질 S3에 대한 siRNA를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 (1) 내지 (4) 중 적어도 하나를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다:
(1) rpS3 mRNA의 203번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/203;
(2) rpS3 mRNA의 635번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/635;
(3) rpS3 mRNA의 747번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/747;
(4) rpS3 mRNA의 766번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/766.

Description

리보솜 단백질 S3에 대한 siRNA를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물{Composition for Inhibition of Metastasis in Cancer Cells Including Ribosomal Protein S3 siRNAs}
본 발명은 암 세포 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 상세하게는, 세포 내에 존재하는 단백질의 발현을 특이적으로 억제하는 짧은 간섭 RNA(small interference RNA: siRNA)를 이용하여 암전이에 관련된 단백질을 제어함으로써 암전이를 방지하는 약학 조성물에 관한 것이다.
siRNA(small interference RNA)는 RNA 간섭((RNA interference: RNAi)을 유도하는 물질이며, 십여 개에서 수십 개 정도의 염기서열로 구성된 짧은 이중사슬의 RNA를 말한다.
RNAi는 다수의 진핵 세포 생물체에 보존되어 있는 전사 후 유전자 조절 방법으로, 소정의 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포에 도입함으로써 표적 유전자의 mRNA의 선택적 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있는 현상을 말한다. 상기 소정의 이중사슬 RNA는, 표적 유전자의 전령 RNA(mRNA)와 상동적인 서열을 가지는 센스 RNA(sense RNA)와 상기 센스 RNA와 상보적인 서열을 가지는 안티-센스 RNA(anti-sense RNA)로 구성된다(Fire A. et al., Nature, 391: 806-811, 1998).
RNAi는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 종래의 비효율적인 상동 재조합에 의한 유전자 파괴법을 대신하는 간단한 유전자 넉-다운(knock-down) 방법으로서 중요한 역할을 담당하며, siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 표적 유전자의 mRNA의 유전자 발현을 억제하게 된다. 특정 단백질이 관여된 질병의 치료제로도 응용될 수 있는 중요성이 있다.
리보솜 단백질 S3(ribosomal protein small subunit 3: rpS3) 는 리보솜을 구성하는 단백질로, 손상된 DNA를 복구하는 효소로도 알려져 있다 (Kim et al., 1995 J. Biol. Chem. 270(23) 13620-9). rpS3는 암 세포의 전이(metastasis), 세포사멸(apoptosis), 면역반응에 있어서의 전사 등에서 다양한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.
최근에는 인산화 (phosphorylation), 메틸화 (methylation), 모노유비퀴틴화 (monoubiquitination) 및 당화 (glycosylation) 등과 같은 변형들 (modifications)을 통해, rpS3의 다양한 역할들이 조절될 수 있다고 알려져 있다(Xiaofei et al., 2009 PLoS Pathog. 5(12) e100070; Kim et al., 2009 BBA-Mol. Cell Res. 1793(2), 395405; Yang et al., 2013 J. Biol. Chem. 288, 2965-2975; Lee et al., 2010 J. Biol. Chem. 285(38), 29457-68; Shin et al., 2009 Biochem Biophys Res Commun. 429(1-2), 57-62; Higgins et al., 2015 Mol. Cell. 59(1), 35-49 등).
본 발명은 암 세포 전이 억제용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 약학 조성물은, 하기 (1) 내지 (4) 중 적어도 하나를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물이다:
(1) rpS3 mRNA의 203번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/203,
(2) rpS3 mRNA의 635번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/635,
(3) rpS3 mRNA의 747번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/747,
(4) rpS3 mRNA의 766번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/766.
상기 암 세포 전이 억제용 약학 조성물은, si-rpS3/203를 포함할 수 있고, 이 때, 상기 si-rpS3/203은 서열번호 2의 염기서열로 표시된다. 상기 si-rpS3/203 은, rpS3 의 전령RNA(mRNA)의 수준에서 rpS3의 발현을 억제할 수 있다.
상기 암 세포 전이 억제용 약학 조성물은, si-rpS3/635를 포함할 수 있고, 이 ??, 상기 si-rpS3/635는 서열번호 3의 염기서열로 표시된다. 상기 si-rpS3/635 은, rpS3 의 전령RNA(mRNA)의 수준에서 rpS3의 발현을 억제할 수 있다.
상기 암 세포 전이 억제용 약학 조성물은, si-rpS3/747을 포함할 수 있고, 이 때, 상기 si-rpS3/747은 서열번호 4의 염기서열로 표시된다. 상기 si-rpS3/747 은, rpS3 의 전령RNA(mRNA)의 수준에서 rpS3의 발현을 억제할 수 있다.
상기 암 세포 전이 억제용 약학 조성물은, si-rpS3/766을 포함할 수 있고, 이 때, 상기 si-rpS3/766은 서열번호 5의 염기서열로 표시된다. 상기 si-rpS3/766 은, rpS3 의 전령RNA(mRNA)의 수준에서 rpS3의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명자들은 정상세포에서는 rpS3의 분비가 잘 일어나지 않는 반면에, 전이가 잘 일어나는 악성 종양세포에서는 많은 양의 rpS3가 분비되는 현상을 최근 연구를 통해 발견하였다.
rpS3는, rpS3를 구성하는 165번째 아미노산인 아스파라진 아미노산의 잔기에 N-연결당화(N-linked glycosylation)되며, 소포체-골지체(ER-Golgi) 분비 기작(secretion pathway)을 거쳐 세포 밖으로 분비된다. 분비된 rpS3 에 의해 암 세포의 전이가 일어나게 되고, rpS3 의 발현을 siRNA로 저해시키면 암 세포의 분비가 줄어들었다.
암 세포의 전이 및 악성화 정도에 있어, rpS3 의 분비는 중요한 역할을 담당한다. rpS3의 165번째 아미노산 아스파라진의 당화과정을 통한 단백질의 변형은, rpS3 의 분비를 조절하는데 중요한 역할을 담당한다.
암 세포의 전이 및 악성화에 중요한 역할을 담당하고 있는 rpS3 단백질을 mRNA 수준에서 조절할 수 있는 si-RNA를 제작하기 위하여, 발명자들은, 시퀀스(sequence) 분석을 통해, 인간 rpS3 유전자(ribosomal protein small subunit 3, Genbank accession number NM_001005.4)의 전사시작 코돈인 AUG을 기준으로 203, 635번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 si-RNA를 제작하였다. 또한, 발명자들은, 시퀀스(sequence) 분석을 통해, 인간 rpS3 유전자(ribosomal protein small subunit 3, Genbank accession number NM_001005.4)의 전사시작 코돈인 AUG을 기준으로 747, 766번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 si-RNA를 제작하였다.
제작된 si-RNA는 rpS3 mRNA의 오픈리딩프레임(open reading frame) 및 3' 비해석영역(3' untranslated region)의 서열을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 이를 이용하여, 발현된 rpS3 단백질을 특이적으로 인식하고 감소시킬 수 있다.
제작된 si-RNA는 표적 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다.
제작된 si-RNA를 이루는 뉴클레오티드 길이는 rpS3의 활성 및 발현을 방해할 수 있는, 10 내지 40 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 19 내지 21 뉴클레오티드 길이의 이중가닥 RNA일 수 있다. si-RNA의 길이는 뉴클레오티드가 이중가닥(페어링)을 이루는 길이를 말한다.
제작된 si-RNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단이 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 쪽이 돌출(overhang)한 구조와 5' 말단쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하다. 돌출되는 뉴클레오티드 수는 한정되지 않으나, 예를 들어 1 내지 8 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 4 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 dTdT, UU, 또는 이중가닥 형성부에서 계속해서 rpS3 mRNA와 일치하는 또는 상보적인 서열 등을 포함할 수 있다.
siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막고 생체 내 안정성을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다.
예를 들어, siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당(ribose ring)의 2'-위치의 수산기가 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기, 구체적으로는 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 치환되거나(이 때 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본(backbone)이 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 치환될 수 있다.
siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단, 바람직하게는 RNA의 종결 위치, 예컨대, 3' 말단 돌출부(예컨대 (dT)n, n=1-5, 바람직하게는 2-4의 정수)에만 도입할 수 있다.
다른 일례로, siRNA 센스(sense) 또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 혹은 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있으며, 바람직하게는 siRNA 센스(sense) 가닥의 5' 말단에 도입할 수 있다. 이를 통해 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.
제작된 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제작된 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA와 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
siRNA를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:5515-5520, 2002), 인 비트로(in vitro) 전사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al., Science, 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseIII 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology, 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명은 암 세포에서 분비된 rpS3를 mRNA 수준에서 억제시킬 수 있다.
본 발명은 암 세포의 전이 및 악성화를 억제시킬 수 있다.
도 1 은, 인간 섬유육종 세포주와 인간 피부 흑색종 세포주에서, 자체 제작된 si-rpS3 들에 의해 rpS3 만이 특이적으로 단백질 발현이 저해된 결과를 보여주는 이미지이다.
도 2a 내지 도 2c는, 자체 제작된 si-rpS3 들에 의해, 암 세포주의 악성화 모양의 변화 양상을 조사한 이미지이다.
이하, 실시예들 및 도면을 통해 본 발명들에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 하기의 실시예들은 본 발명들을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않음은 물론이다.
실시예1: rpS3의 분비와 관련된 165 번째 글리신 아미노산의 당화과정을 통한 단백질 변형
본 연구진에서 배양된 암 세포주의 배지로부터 rpS3 단백질에 대한 항체를 통해 면역침강 기법을 통해 분비된 rpS3 단백질만을 응축시켜 LC-MS/MS 기법을 수행하였다.
진행된 기법을 통하여 분비된 rpS3 단백질은 165번째 아스파라진에서 당화과정을 거치는 단백질 변형이 이루어지고 있음을 확인하였다.
실시예2: 암 세포주 내 발현되는 rpS3 단백질의 발현을 줄이기 위한 si-RNA 인 si-rpS3/203, 635, 747, 766 의 제작
암 세포주의 rpS3 단백질의 발현을 mRNA 수준에서 조절하기 위해서 sequence 분석을 통해 rpS3 mRNA 의 203번째와 635번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 각각의 21개 뉴클레오티드로 구성된 si-RNA(si-rpS3/203 과 si-rpS3/635)를 제작하였다.
특별히 이들은 rpS3 mRNA 의 단백질로의 번역에 포함되는 부분인 오픈리딩프레임(Open reading frame: ORF) 이며, 747번째와 766번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 si-rpS3/747과 si-rpS3/766 은 비해석부위(Untranslated region: UTR) 에 포함되는 부분이다.
각각의 시퀀스(sequence)는 표 1에 표기하였다.
si-RNA 시퀀스 Started matching site
si-rpS3/203 aac tga ctg ctg tag ttc aga ORF의 203번째 뉴클레오티드
si-rpS3/635 aac cca aag atg aga tac tgc ORF의 635번째 뉴클레오티드
si-rpS3/747 cag ctg tat tct gga gtc t UTR의 747번째 뉴클레오티드
si-rpS3/766 gga tgt tgc tct cta aag a UTR의 766번째 뉴클레오티드
실험 예1: rpS3 단백질의 si-RNA인 si-rpS3/203, 635, 747, 766을 이용한 단백질 발현 조절의 실시
실시예 2에서 얻은 si-RNA 인 si-rpS3/203, 635, 747과 766 이 rpS3 단백질의 발현을 조절할 수 있는지 확인하기 위해서 각각의 si-RNA 50pmol을 인간 섬유육종 세포주(HT1080)와 인간 피부 흑색종 세포주(WM115) 에 주입시킨 후 48시간동안 배양시켰다.
그 후 세포를 단백질분해효소 억제제(Protease inhibitors)가 포함된 Tris-NaCl-NP40 완충용액 (TNN buffer)에 넣고 냉동용해법(Freeze-thawing)을 통하여 세포를 용해시켰다.
여기서 얻은 세포용해물(cell lysate)을 정량한 후, 각각 20g씩의 세포총단백이 되도록 하여 12% SDS Acrylamide 겔에서 전기영동을 실시한 후, 이를 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다.
니트로셀룰로스 막에 활착된 세포총단백을 탈지분유(skim milk)로 만들어진 blocking solution으로 1시간 동안 blocking 반응을 시킨 후, 다클로날 rpS3 항체를 0.2g/mL의 농도로 희석한 용액을 상온에서 1시간 반응시켰다.
이들 샘플을 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase)가 결합된 염소 유래 항-토끼 IgG 혈청(Horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit and anti-mouse IgG serum)을 상온에서 1시간 처리 후, 화학발광기질(Chemiluminescence substrate)(Roche Diagnostics cat. #1 501 399)를 처리하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 1).
실험 결과, 본 발명에서 제작된 rpS3 단백질에 대한 si-RNA인 si-rpS3/203, 635, 747과 766은 인간 섬유육종 세포주(HT1080)와 인간 피부 흑색종 세포주(WM115)에서 rpS3만을 특이적으로 단백질 발현을 저해시킬 수 있음을 알 수 있다.
실험 예2: 본 발명 si-rpS3/203, 635, 747, 766을 이용하여 암 세포주의 악성화 모양의 변화 양상 조사
실시예 2에서 생산된 rpS3 단백질에 대한 si-RNA인 si-rpS3/203, 635, 747, 766을 이용하여 암 세포주의 악성화 모양의 변화 양상을 조사하기 위하여 실험 예1에서 확인한 바와 같이 mRNA수준을 조절하여 단백질 발현을 억제시킨 후 인간 섬유육종 세포주(HT1080)와 인간 피부 흑색종 세포주(WM115)의 세포 형태를 3D 입체 배양 기법을 통해 확인하였다.
24개의 배양홈이 있는 배양 용기에 300L의 매트리겔(Matrigel)로 전처리한 후, 37? 에서 15분간 배양하여 고체화한다. 그 후, 0.1 X 104 세포와 함께 2% 매트리겔이 포함된 배양 배지 600L를 첨가한 후, 7일간 배양하였고, 이 후, 배양용기에 담긴 세포는 현미경을 통하여 세포 모양 변화를 관찰하였다.
전이가능한 암 세포는 표면이 돌출되어 있으나, 전이가 불가능한 정상세포는 세포표면이 둥근 형태를 가지고 있다.
도 2a를 참조하면, 인간 섬유육종 세포주(HT1080)와 인간 피부 흑색종 세포주(WM115) 모두에서 rpS3 단백질의 발현을 mRNA 수준에서 조절한 si-rpS3/203, 635, 747, 766 에 의해 세포의 모양이 정상 세포 수준의 모양인 둥근 형태로 변화됨을 확인할 수 있었다.
도 2b를 참조하면, 리보솜 구성 단백질인 rpS6 와 RACK1 단백질의 경우 동일한 실험 조건에서 si-RNA 에 의한 rpS3와 같은 세포 형태 변화를 관찰할 수 없었다.
도 2c를 참조하면, rpS3 단백질의 분비와 관련한 당화과정에 중요한 부위인 165번 아미노산을 돌연변이화 한 rpS3 plasmid DNA 를 넣어 발현시킨 조건(rpS3-N165G)과 본래의 rpS3의 발현(rpS3-WT)을 비교하여 세포(HT1080)의 이동성(migration)을 확인해 본 결과 돌연변이 rpS3 단백질을 발 시킨 실험군에서 현저하게 세포이 이동성이 저하됨을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 하기 (1) 내지 (4) 중 적어도 하나를 포함하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물:
    (1) rpS3 mRNA의 203번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/203;
    (2) rpS3 mRNA의 635번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/635;
    (3) rpS3 mRNA의 747번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/747;
    (4) rpS3 mRNA의 766번째 염기서열에 결합하는 si-rpS3/766.
  2. 제1 항에 있어서,
    si-rpS3/203이 포함되며, 상기 si-rpS3/203은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물.
  3. 제1 항에 있어서,
    si-rpS3/635가 포함되며, 상기 si-rpS3/635는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물.
  4. 제1 항에 있어서,
    si-rpS3/747이 포함되며, 상기 si-rpS3/747은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물.
  5. 제1 항에 있어서,
    si-rpS3/766이 포함되며, 상기 si-rpS3/766은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 세포 전이 억제용 약학 조성물.
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