KR20160050414A - 리보솜 단백질 S3 (rpS3)을 이용한 암의 진단 방법 - Google Patents

리보솜 단백질 S3 (rpS3)을 이용한 암의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리보솜 단백질 S3 (rpS3)을 이용한 암의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 암세포에서 발현되어 세포밖으로 분비되는 리보솜 단백질 S3 (rpS3)를 이용한 암의 진단 또는 진행단계의 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 것은, 혈액 등의 세포 분비물을 이용한 신속하고 간편한 방법으로써, 암의 진단 또는 진행단계를 예측하는데 매우 유용하다.

Description

리보솜 단백질 S3 (rpS3)을 이용한 암의 진단 방법 {Method for Diagnosing Cancer Using Ribosomal Protein S3 Antibody}
본 발명은 리보솜 단백질 S3 (rpS3)을 이용한 암의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 암세포에서 발현되어 세포밖으로 분비되는 리보솜 단백질 S3 (rpS3)를 이용한 암의 진단 또는 진행단계의 예측 방법에 관한 것이다.
단백질은 세포신호로부터 기관의 작용을 위한 조직의 재편성에 이르는 모든 생리과정에 관여한다. 그래서 세포 내에서 단백질 합성은 매우 중요한 과정인데, 이러한 기능을 리보솜이 담당한다. 리보솜은 아미노산을 연결하여 단백질 합성을 담당하는 세포 소기관으로 많은 리보솜단백질들과 리보솜 RNA (ribosomal RNA)의 결합으로 만들어지는 거대한 복합체로 이루어져 있다.
rpS3(Ribosomal protein S3)는 리보솜의 구성성분으로 40S 서브유닛의 외부 표면에 위치하며 개시인자(initiation factor) eIF2와 eIF3에 교차연결(cross-link)되어 있다. rpS3는 N-말단 부위에 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 가지고 있는데, 이것은 rpS3의 세포질에서의 기능과 핵에서의 회복(repair)능을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한, 많은 리보솜 단백질들은 복제, 전사, RNA 프로세싱, DNA 회복(repair), 악성 형질전환(malignant transformation) 등의 두 번째 기능을 가지고 있다.
rpS3 유전자는 인간 염색체 11번의 11q13.3 - q13.5에 위치한다. 특이할 점은 rpS3 유전자는 결장직장암(colorectal cancer) 환자에서 과발현 된다는 보고가 있다. 그러므로 rpS3의 유전자 산물은 XP-D에서는 없거나 변형되어 있고, 대장암에서는 과발현되며, 다른 암과도 관련이 되어 있을 가능성이 매우 높다. 이 뿐 아니라 11q13.3 - q13.5 부위의 연구에서는 자주 유전자의 구조적 이상(structural abnormality), 증폭(amplification)이 일어나고, 다발성 내분비 신생물 타입 (multiple endocrine neoplasia type ), 유방암(breast carcinoma), B 세포 신생종양과 같은 인체 암의 발생시에 과발현 된다고 알려져 있다(Pogue-Geile et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3842-3849, 1991).
지난 수년간 암에 대한 원인규명, 진단방법 및 치료방법에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 아직까지 암을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 개발되지 못하고 있다. 따라서, 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술 또는 약물 치료에 의해 암세포를 제거하거나 성장을 억제하는 것이 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.
암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직의 침범 또는 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 초기에는 아무런 자각증상이 없이 진행되는 암이 많기 때문에 다른 장기로 전이가 된 후에야 발견되는 경우가 많다. 따라서, 암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기진단의 필요성이 요구되는데, 일반적으로 초음파, X-선을 이용한 CT, MRI 등의 진단 이후, 최종적으로는 조직검사를 통해 확인하게 된다. 그러나, 조직검사와 같은 방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어, 보다 간편하고도 신속하게 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 필요하다.
여러 가지 암 환자의 체액 중에는 다수의 세포성 단백질이 증가하거나, 감소하는 것으로 나타난다. 암 환자에 있어서, 암세포 특이적인 발현양상을 나타내는 단백질의 유무 또는 발현양 분석을 암 특이적 항원을 검출하는 방법을 통해, 암에 대한 진단 또는 진행단계의 예측에 이용할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 혈액, 체액 등의 생물학적 시료에 존재하는 암 특이적인 마커를 이용하여 간편하고 신속하게 암을 조기 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 리보솜 단백질 S3 (rpS3)가 암세포에서 과발현 되어 세포외로 분비되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암의 진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보를 제공하기 위하여, 분리된 생물학적 시료로부터 암세포에서 발현되어 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 암세포에서 발현되어 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 rpS3 단백질의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 진행단계 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 것은, 혈액 등의 세포 분비물을 이용한 신속하고 간편한 방법으로써, 암의 진단 또는 진행단계를 예측하는데 매우 유용하다.
도 1은 (A) 인간 섬유육종 세포 및 (B) 쥐의 형질 세포종 배양 배지에서 rpS3 단백질의 세포외 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 기관지 상피세포 BEAS-2B 및 악성 인간 기관지 상피세포의 배양 배지에서 rpS3 단백질의 세포외 분비의 증가를 확인한 것이다.
도 3은 쥐의 형질 세포종 및 항암물질 내성이 생긴 악성 형질 세포종의 배양 배지에서 rpS3 단백질의 세포외 분비를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유방암 세포주 배양 배지에서 암의 전이에 따른 rpS3 단백질의 세포외 분비를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 암세포주에서 과발현되는 rpS3 단백질이 세포밖으로 분비될 뿐만 아니라, 악성 암세포일수록, 암의 전이가 진행될수록 rpS3 단백질의 분비가 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 암세포에서 발현되어 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 rpS3 단백질의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 rpS3 단백질의 양이 증가하는 경우, 암 또는 암의 진행단계로 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
rpS3 단백질은 암세포에서 과발현되어 세포밖으로 분비되는데, 악성 암세포일수록 분비되는 정도가 증가한다. 따라서, 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하여, rpS3 단백질 양의 분비 수준에 따라 암의 진행단계를 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 섬유육종, 형질세포종, 기관지암, 백혈병, 유방암, 난소암, 자궁암, 피부암, 방광암, 전립선암, 신장암, 갑상선암, 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 폐암, 뇌종양, 골육종, 악성혈관종 및 악성임파종으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 간편하게 분리될 수 있으므로 종래의 조직검사의 불편함을 개선할 수 있으며, 좀 더 신속하게 암의 진단 또는 진행단계를 예측할 수 있다. 예를 들어, 정기적인 혈액 검사로 rpS3 단백질을 측정하여 암의 발병 유무 및 더 나아가 암의 진행단계까지 예측이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 rpS3 단백질의 양은 rpS3 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 모두 포함하며 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 다클론 항체는 상기 rpS3 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 쥐, 랫트(rat), 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
상기 단백질 양을 측정하기 위한 분석방법으로는 면역블롯(웨스턴블롯), ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 암 세포주에서 rpS3 분비의 확인
인간 섬유육종 세포 HT1080, 쥐의 형질 세포종 MPC11 및 인간 기관지 상피 세포 BEAS-2B를 10% FBS(Thermo Scientific, USA)를 포함하는 DMEM 배지 (Thermo Scientific, Rockford, USA)에서 배양한 후, 16시간 동안 무혈청 DMEM 배지에서 다시 배양하였다. 그 다음, 배양액만 수집하여 배양액 내 죽은 세포를 제거하기 위하여 1,000rpm에서 3분간 원심분리를 수행하였고, 용기 바닥에 형성된 알갱이 (pellet)를 제거한 후 상층액을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device (Millipore, USA)를 이용하여 1/200배로 응축시켰다. 응축된 배양액은 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후, PVDF(Polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동시킨 다음 멤브레인을 블로킹(blocking) 용액으로 1시간 반응시켰다. 이 후, 웨스턴 블롯으로 3가지 리보솜 단백질 S3, L28 (Santa Cruz Biotechnology, USA), L11 (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 분석하였으며, 분석용 응축액에는 세포가 섞이지 않은 배양액으로 분비된 단백질만 존재하는 것을 fibrillarin (Santa Cruz Biotechnology, USA), C23 (Santa Cruz Biotechnology, USA), Raf1 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 항체로 확인하였다. 또한, (-) 대조군으로는 세포를 배양하지 않은 배지를 사용하였으며, (+) 대조군으로는 각각 암세포주의 세포분해물 (lysate) 를 사용하였다.
그 결과, 인간 섬유육종 세포 HT1080 및 쥐의 형질 세포종 MPC11의 배양액에서 리보솜 단백질 S3만이 나타났으며(도 1), 인간 기관지 상피 세포에서도 리보솜 단백질 S3가 분비되는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 악성 암 세포주에서 rpS3 분비의 증가 확인
2-1: 악성 인간 기관지 상피 세포
인간 기관지 상피 세포 BEAS-2B에 담배 연기 응축물을 처리하여 제작된 악성 세포 1799, 1198 및 1170-1을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양 한 후, 배양액을 응축하여 단백질양을 정량화하기 위해 Coomassie Brilliant Blue를 이용하여 SDS-PAGE를 염색하였다(도 2A). rpS3에 대한 웨스턴 블롯 역시 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 수행하였으며, 알려진 NM-23 (Santa Cruz Biotechnology) 항체로 악성 세포의 악성 정도를 비교하였다. 악성 세포는 1799, 1198, 1170-1 순으로 악성 정도를 나타냈다(도 2B).
웨스턴 블롯으로 악성 인간 기관지 상피 세포의 rpS3 분비를 측정한 결과, 악성 세포일수록 분비가 증가되는 NM-23 단백질과 마찬가지로 rpS3 단백질 역시 악성 세포에서 분비 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
2-2: 악성 쥐의 형질 세포종
쥐의 형질 세포종 MPC11를 독소루비신 (Calbiochem, United Kingdom) 항암물질에 저항성을 갖는 세포로 제작하기 위해, 독소루비신을 45일간 처리하면서 배양하여 독소루비신 항암물질에 저항성을 갖는 악성 쥐 형질 세포종 MPC11-Dox을 제작하였다. 실시예 1의 방법으로 악성 쥐 형질 세포종 MPC11-Dox을 배양 한 후, 배양액을 응축하여 rpS3 단백질의 분비를 측정하였다.
그 결과, 쥐 형질 세포종 MPC11의 배양액에 비해, 독소루비신에 저항성을 갖는 악성 쥐 형질 세포종 MPC11-Dox을 배양한 배양액에서 rpS3 단백질의 분비가 증가함을 확인하였다(도 3). 즉, 리보솜 단백질 S3는 악성 세포일수록 더욱 세포 밖으로 분비되는 정도가 증가함을 알 수 있었다.
실시예 3 : 암세포의 전이에 따른 rpS3 분비의 증가 확인
유방암 세포주 MCF7과 MDA-MB-231를 10% FBS(Thermo Scientific, USA)를 포함하는 DMEM 배지 (Thermo Scientific, Rockford, USA)에서 배양한 후, 16시간 동안 무혈청 DMEM 배지에서 다시 배양하는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 그 다음, 배양액만 수집하여 배양액 내 죽은 세포를 제거하기 위하여 1,000rpm에서 3분간 원심분리를 수행하였으며, 용기 바닥에 형성된 알갱이 (pellet)를 제거한 후 상층액을 Amicon Ultra-15를 이용한 응축 단계를 거치치 않고 배양액만 사용하여 리보솜 단백질 S3 분비를 확인하였다. 수득한 배양액은 단백질 정량을 실시하여 151μg/ml을 사용하고 대조군으로는 DMEM 배지를 사용하였으며, 리보솜 단백질 S3 항체 2.5μg/ml로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다.
그 결과, MCF7 보다 암 전이 능력이 높은 MDA-MB-231 세포주에서 훨씬 많은 양의 rpS3 단백질이 분비되는 것을 확인하였다(도 4). 이로써, 전이 능력이 높은 세포일수록 리보솜 단백질 S3의 세포외 분비 정도가 증가함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 다음 단계를 포함하는 암의 진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 암세포주에서 발현되어 세포밖으로 분비된 rpS3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 rpS3 단백질의 양을 대조군 시료와 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 rpS3 단백질의 양이 증가하는 경우, 암 또는 암의 진행단계로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 섬유육종, 형질세포종, 기관지암, 백혈병, 유방암, 난소암, 자궁암, 피부암, 방광암, 전립선암, 신장암, 갑상선암, 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 폐암, 뇌종양, 골육종, 악성혈관종 및 악성임파종으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 rpS3 단백질의 양은 rpS3 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 측정은 면역블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질칩으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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