KR20180119466A - Anti-cancer Composition Comprising Vitexin - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing vitexin as an active ingredient. In addition, the present invention relates to a food composition for preventing or ameliorating cancer containing vitexin as the active ingredient, and a feed composition. According to the present invention, vitexin inhibits autophagy against tumor growth in vivo, and induces apoptosis, thereby being used as a novel natural anticancer agent. Particularly, vitexin, according to the present invention, shows significant effects on carcinomas showing resistance to anticancer drug, thereby being applicable as an anticancer agent effective in patients with cancer resistant to anticancer agents.

Description

비텍신을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 {Anti-cancer Composition Comprising Vitexin}Anti-cancer Composition Comprising Vitexin < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising biotexin as an active ingredient.

또한, 본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다. Further, the present invention relates to a food composition and a feed composition for preventing or ameliorating cancer comprising biotexin as an active ingredient.

전세계적으로 대장암은 암으로 인한 사망의 3위를 차지하고 있는 암에 해당한다. 대장암 환자는 진단시의 암의 단계 또는 종양의 위치 및 환자 개인의 특성에 따라 화학 요법 또는 수술을 받게 된다. 많은 종전 연구 및 노력에도 불구하고, 일부 대장암 환자는 종양세포가 구조적 및 기계적으로 무관한 화합물에 대한 저항성을 가지며 이에 따라 기존 치료법에 반응하지 않는다. 이러한 형상은 다제 내성 (multi drug resistance, MDR)이라 하며, 이는 종양 재발의 원인이 된다. Colon cancer worldwide is the third cancer in cancer deaths. Patients with colorectal cancer will receive chemotherapy or surgery depending on the stage of the cancer at the time of diagnosis, the location of the tumor, and the individual characteristics of the patient. Despite many previous research and efforts, some colorectal cancer patients have resistance to structurally and mechanically irrelevant compounds in tumor cells and thus do not respond to conventional therapies. This shape is called multi drug resistance (MDR), which causes tumor recurrence.

현재 대부분의 연구는 독성이 낮고, MDR 표현형을 극복하여 암 환자의 치료율 및 생존 가능성을 향상시키는 천연 항암제 개발에 힘쓰고 있다. MDR의 메커니즘 중 하나는 운반체 단백질을 통하여 암세포로부터 항-신생물제를 능동적으로 방출하여, 약물의 세포내 농도를 줄이는 것이다. 암 세포로부터의 약물 방출은 ATP 결합 카세트 (ATP binding cassette, ABC) 수송체 패밀리 단백질에 의해 엄격하게 조절된다. 다양한 인간 암에서 ABC 단백질의 높은 수준의 발현이 관찰되며, 이에 따라 다양한 항암제에 대한 내성이 발달하게 된다. Currently, most of the studies are devoted to the development of natural anticancer drugs that have low toxicity and overcome the MDR phenotype to improve the cure rate and viability of cancer patients. One of the mechanisms of MDR is to actively release anti-neoplastic agents from cancer cells through the carrier protein, thereby reducing the intracellular concentration of the drug. Drug release from cancer cells is tightly regulated by the ATP binding cassette (ABC) transporter family proteins. High levels of expression of the ABC protein are observed in a variety of human cancers, thereby developing tolerance to a variety of anticancer agents.

MDR1 또는 ABC 서브패밀리 B 멤버 1 (ABC sub-family B member 1, ABCB1)로도 알려진 P- 당단백 (P-glycoprotein, P-gp)은 많은 외래 물질을 세포 밖으로 펌핑하는 것으로 잘 특징 지워진 플라즈마-막 단백질이다. 이 단백질은 여러 암에서 상향 조절되어 MDR 세포 내의 약물 축적을 감소시켜 항암제에 대한 내성 발달을 촉진한다. 따라서 P-gp의 발현 억제 또는 기능 억제는 약물 내성 암세포를 화학 요법 제제에 감작시키는 효과적인 접근법이나, in vivo 연구의 결과는 대부분 P-gp 활성 조절제가 효과가 없다는 것을 나타내었다. 따라서 천연물 및 그 합성 유도체로부터 유래된 P-gp 억제제는 인간 암세포에서 약제 내성의 영향을 회피하기 위한 잠재적인 후보 물질로 간주된다. 또한 다른 연구 결과들은 항-세포 사멸 (anti-apoptotic) 또는 전-세포사멸 (proapoptotic) 단백질의 변형된 발현이 화학요법에 대한 약물 저항성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 거대자가포식 (Macroautophagy) 또는 자가포식 (autophagy)는 손상된 세포 기관 또는 미사용 단백질을 제거하는 세포 분해 경로이며, 이는 대장암 진행을 촉진하고 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 데 관여한다. 암세포는 일반적으로 대사 스트레스 또는 아미노산 기아 상태에서 활성화되는 자가포식을 이용하여, 종양의 생존 및 성장을 돕는다. 종래 연구에 따르면 자가포식(autophagy)는 세포 사멸을 억제하여 화학 요법 치료에 대한 암세포 저항성을 촉진시키고, 이에 따라 자가포식의 억제는 치료 저항성 암세포의 화학 요법에 대한 재감작 (resensitization)을 강화시킨다. 따라서 여러 약제를 사용하여 자가표식을 표적하는 것은 암세포의 약물 내성을 억제하는 데 도움이 될 수 있다. P-glycoprotein (P-gp), also known as MDR1 or ABC subfamily B member 1 (ABCB1), is a plasma-membrane protein that is well characterized as pumping many foreign substances out of the cell to be. This protein is upregulated in many cancers to reduce drug accumulation in MDR cells, thereby promoting resistance to anticancer drugs. Thus, inhibition or inhibition of P-gp expression is an effective approach to sensitizing drug-resistant cancer cells to chemotherapeutic agents, but in vivo studies have shown that most P-gp activity modulators are ineffective. Thus, P-gp inhibitors derived from natural products and synthetic derivatives thereof are considered potential candidates for avoiding the effects of drug resistance in human cancer cells. Other studies also indicate that modified expression of anti-apoptotic or proapoptotic proteins can induce drug resistance to chemotherapy. Macroautophagy or autophagy is a cellular degradation pathway that removes damaged cellular or unused proteins, which is involved in promoting colon cancer progression and enhancing resistance to stress. Cancer cells use autopoiesis, which is generally activated by metabolic stress or amino acid starvation, to help the tumor survive and grow. Previous studies have shown that autophagy inhibits apoptosis, thereby promoting cancer cell resistance to chemotherapy treatment, and thus inhibiting autophagy enhances resensitization of chemotherapy of chemotherapeutic resistant cancer cells. Thus, targeting a self-marker using a variety of agents may help to inhibit the drug resistance of cancer cells.

비텍신 (Vitexin)은 항산화, 항염증 및 진통 작용을 나타내는 자연적으로 유도된 플라보노이드 화합물이다. 다만, 종래 연구에서는 비텍신 (vitexin)이 항암 화학 물질 내성 암세포에서 아폽토시스를 유도하는지에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다. Vitexin is a naturally derived flavonoid compound that exhibits antioxidant, anti-inflammatory and analgesic effects. However, it is not yet known whether vitexin induces apoptosis in cancer-resistant cancer cells in the prior art.

이에 본 발명자들은 비텍신의 약물 내성 암 세포에 대한 세포 독성 효과를 확인하였다. 또한, 본 발명자는 대장 암 HCT-116 세포주를 5- 플루오로 우라실, 시스플라틴, 도세탁셀 및 빈크리스틴에 노출시켜 MDR 인간 대장 암 세포주 HCT-116DR100을 개발했다. 그 결과, vitexin 치료가 HCT-116DR 세포에서 자가포식 (autophagy)를 억제함으로써 세포사멸을 유도한다는 것을 확인 하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. Therefore, the present inventors confirmed the cytotoxic effect of bitectin on drug-resistant cancer cells. The present inventors also developed the MDR human colon cancer cell line HCT-116DR100 by exposing the colon cancer HCT-116 cell line to 5-fluorouracil, cisplatin, docetaxel and vincristine. As a result, it was confirmed that vitexin treatment induces apoptosis by inhibiting autophagy in HCT-116DR cells, and the present invention has been accomplished.

이에 본 발명의 목적은, 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising biotexin as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a food composition and a feed composition for preventing or ameliorating cancer, which comprises bitexyn as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises bitexyn as an active ingredient.

상기 암은 약물 저항성 암일 수 있다.The cancer may be a drug resistant cancer.

또한, 상기 암은 정상 조직에 비하여 MDR-1의 발현이 상향조정된 암일 수 있다.In addition, the cancer may be an animal whose MDR-1 expression is up-regulated relative to normal tissue.

또한, 상기 비텍신은 상기 MDR-1의 발현을 감소시키는 것일 수 있으며, 상기 비텍신은 자가포식 (autophagy) 억제제일 수 있다. In addition, the biotecin may decrease the expression of MDR-1, and the biotecin may be an autophagy inhibitor.

상기 암은 그 종류를 제안하지 않으나, 바람직하게는 대장암일 수 있다.The cancer does not suggest its kind, but it can be preferably a colon cancer.

또한, 본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating cancer comprising biotexin as an active ingredient.

또한, 본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a feed composition for preventing or ameliorating cancer comprising biotexin as an active ingredient.

본 발명에 따르면, 비텍신은 생체 내에서 종양 성장에 대하여 자가포식(autophagy)을 억제하고, 세포 사멸 (apoptosis)을 유도하는 바, 신규한 천연물 항암제로 이용될 수 있다.According to the present invention, vithexin inhibits autophagy against tumor growth in vivo and induces apoptosis, and thus can be used as a novel natural anticancer agent.

특히, 본 발명에 따르면, 비텍신은 항암제 내성을 나타내는 암종에 유의적인 효과를 나타내는 바, 항암제 내성을 갖는 암환자에서도 효과적인 항암제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. In particular, according to the present invention, vytexin has a significant effect on carcinoma showing resistance to anticancer drugs, and thus it is expected that it can be used as an effective anticancer agent even in cancer patients having anticancer drug resistance.

도1은 비텍신 처리에 의한 HCT-116DR 세포의 성장 억제를 나타낸 도이다.
(A) 24 시간 동안 10 μM, 25 μM 및 50 μM 비텍신으로 처리 한 후 세포 형태 변화를 나타낸다.
(B) HCT-116 및 HCT-116DR 세포에서의 MDR1의 발현을 나타낸다.
(C, D) 세포에 표시된 농도의 비텍신으로 24 시간 동안 처리하고, 세포 생존력을 (C) MTT 및 (D) LDH 분석으로 확인한 결과이다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다.
다른 문자는 (a ~ d)은 서로 유의한 차이가 있음을 나타낸다 (p <0.05).
도2는 비텍신이 Rh-123 축적을 감소시키는 것을 나타낸 도이다.
(A, B) HCT-116DR 세포에서의 Rh-123 축적에 대한 vitexin 처리 효과를 나타낸 도이다. 세포를 비텍신의 존재 또는 부재 하에서 37 ℃에서 24 시간 동안 미리 인큐베이션한 다음, Rh-123과 함께 37 ℃에서 30 분 더 인큐베이션하였다. Rh-123의 축적은 형광 현미경으로 측정하였다.
(C) HCT-116DR 세포에서의 ATPase 활성에 대한 비텍신 처리의 효과를 나타낸 도이다.
(D) 표시된 농도로 세포에 비텍신을 처리하고, 전체 세포 용해물을 MDR1 항체로 면역 블롯팅한 결과를 나타낸 도이다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 다른 문자 (a - d)를 갖는 값은 서로 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 3은 비텍신 처리가 HSF-1의 핵 전좌를 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것을 나타낸 도이다.
HCT-116DR 세포를 24 시간 동안 비텍신으로 지시된 농도로 처리 하였다.
(A) 핵 추출물과 총 세포 용해물을 표시된 항체로 면역블롯팅한 결과이다.
(B) 24 시간 동안 비텍신으로 처리된 HCT-116DR 세포에 대한 Apostrand ELISA 검사 결과를 나타낸 도이다.
(C) HCT-116DR 세포를 vitexin으로 24 시간 처리한 후 세포사멸 (Apoptosis) 마커 단백질로 웨스턴 블롯하여 검출하였다.
(D) HCT-116DR 세포를 Hoechst 33342로 염색 한 후, 현미경으로 세포핵을 관찰하여 세포 사멸을 검출 하였다. 세포 사멸 세포의 수 (강한 청색 염색)는 대조군에서 관찰 된 것과 비교하여 용량 의존적으로 유의하게 증가하였다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 다른 문자 (a - d)를 갖는 값은 서로 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 4는 HCT-116DR 세포에서의 비텍신 처리가 자가포식 (autophagy)을 억제함을 확인한 도이다.
(A) 세포 자가포식를 측정하기 위해 Cyto-ID 녹색 자가포식 (autophagy) 시약을 이용하여 유동 세포 계측분석을 수행하였다. 자가포식 백분율의 Representative graph는 24 시간 동안 비텍신으로 처리한 후 유동 세포 계측법으로 측정 하였다.
(B) HCT-116DR 세포를 AO 염색하여 형광 현미경 (눈금 = 0.1 ㎜)을 사용하여 오토파고좀 (autophagosome)형성 (밝은 오렌지색 과립)을 측정하였다. 자가포식 세포의 비율은 400 세포를 관찰하여 계산하였다.
(C) 다양한 자가포식 마커의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 다른 문자 (a - d)를 갖는 값은 서로 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 5는 비텍신 처리가 자가포식 (autophagy)을 감소시켜 HCT-116DR 세포의 약물 내성을 반전시키는 것을 나타낸 도이다.
(A) 세포를 2.5 mM 3-MA 및/또는 50 μM 비텍신으로 24 시간 동안 처리하고, MTT 분석에 의해 3-MA-유도된 세포사멸 억제 효과를 검출하였다.
(B) 다양한 자가포식 및 세포사멸 마커의 단백질 수준은 24 시간 동안 2.5 mM 3-MA 및/또는 50 μM 비텍신으로 처리 한 후 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 다른 문자 (a - d)를 갖는 값은 서로 유의 한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 6은 비텍신의 처리가 HCT-116DR 종양 이종 이식 마우스 동물모델에서 종양 성장을 억제하는 것을 확인한 도이다.
1x10⁷HCT-116DR세포를 누드마우스 동물모델의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하고 마우스의 종양 발생을 모니터하였다. 종양의 크기가 5 x 5 mm³에 달했을 때, 마우스에 주당 3 일 동안 경구 투여에 의해 비히클 또는 25 mg / kg 또는 50 mg / kg 비텍신을 투여하였다.
(A) 처리 개시 후 종양 부피를 관찰한 결과이다.
(B) H & E 염색 후 종양 절편의 대표 이미지를 나타낸 도이다. (C) HSP 및 자가포식 관련 단백질 수준 그리고 (D) 세포사멸 (apoptosis) 마커 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 다른 문자 (a - d)를 갖는 값은 서로 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 7 (A)는 다양한 세포주를 표시된 농도의 vitexin으로 24 시간 동안 처리하고 세포 생존력을 MTT assay로 확인한 결과이다 [Cis = Cisplatin; Dox = 도세탁셀]. (B)는 다양한 세포주에 대한 비텍신의 IC50 값을 계산하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험 (n = 3)의 평균 ±SD를 나타낸다.
도 8은 Vitexin이 HCT-116DR 세포에서 DNA 손상을 유도함을 확인한 결과이다.
(A) 24 시간 동안 배양 한 후, HCT-116DR 세포를 코멧 어세이 (comet assay)하였다. 코멧 꼬리 (halo effect)의 존재는 단편화된 DNA의 존재를 나타낸다. 꼬리의 DNA의 백분율이 비텍신의 처리 후 증가함을 확인하였다. (B) 머리 직경 (C) 꼬리 길이의 정량을 comet assay 후에 계산하였다. DNA가 손상된 핵 (혜성 포함)은 머리 지름이 감소하고 꼬리 길이가 길어졌다. 데이터는 3 회의 독립적인 실험의 평균 ±SD를 나타내며, n = 3이다. 상이한 문자 (a-d)를 갖는 값은 서로 유의하게 상이하다 (p <0.05). 1, Lt; RTI ID = 0.0 &gt; HCT-116 < / RTI &gt;
(A) Cell morphology changes after treatment with 10 μM, 25 μM and 50 μM bactexin for 24 h.
(B) Expression of MDR1 in HCT-116 and HCT-116DR cells.
(C), (D), and (D) LDH analysis for cell viability.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3).
Other characters (a ~ d) indicate significant differences (p <0.05).
Figure 2 is a graph showing that Vitectycin reduces Rh-123 accumulation.
(A, B) HCT-116DR cells with vitexin treatment for Rh-123 accumulation. The cells were preincubated for 24 hours at 37 DEG C in the presence or absence of Vectex, and then incubated with Rh-123 at 37 DEG C for a further 30 minutes. The accumulation of Rh-123 was measured by fluorescence microscopy.
(C) shows the effect of bapticin treatment on ATPase activity in HCT-116DR cells.
(D), and immunoblotting whole cell lysate with MDR1 antibody.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3). Values with other characters (a - d) show significant differences (p <0.05).
FIG. 3 is a graph showing that the bactexin treatment inhibits nuclear translocation of HSF-1 and induces apoptosis.
HCT-116DR cells were treated for 24 hours with the indicated concentrations in bactex.
(A) nuclear extract and total cell lysate were immunoblotted with labeled antibody.
(B) Apostrand ELISA test results for HCT-116DR cells treated with baptics for 24 hours.
(C) HCT-116DR cells were treated with vitexin for 24 hours and then detected by Western blotting with apoptosis marker protein.
(D) HCT-116DR cells were stained with Hoechst 33342, and cell nuclei were observed under a microscope to detect apoptosis. The number of apoptotic cells (strong blue staining) was significantly increased in a dose-dependent manner compared to that observed in the control group.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3). Values with other characters (a - d) show significant differences (p <0.05).
FIG. 4 shows that bactexin treatment in HCT-116DR cells inhibits autophagy.
(A) Flow cytometry analysis was performed using a Cyto-ID green autophagy reagent to measure cell autoradiography. Representative graph of autogenous percentage was measured by flow cytometry after treatment with bactex for 24 hours.
(B) HCT-116DR cells were stained with AO and autophagosome formation (bright orange granules) was measured using a fluorescence microscope (scale = 0.1 mm). The proportion of autopoietic cells was calculated by observing 400 cells.
(C) Protein levels of various self-predominant markers were analyzed by western blotting.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3). Values with other characters (a - d) show significant differences (p <0.05).
Figure 5 is a graph showing that bapticin treatment reduces autophagy and reverses drug resistance of HCT-116DR cells.
(A) cells were treated for 24 hours with 2.5 mM 3-MA and / or 50 μM Bitingxin and 3-MA-induced inhibition of cell death was detected by MTT assay.
(B) Protein levels of various autophagic and apoptotic markers were analyzed by western blotting after treatment with 2.5 mM 3-MA and / or 50 μM bapticcin for 24 hours.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3). Values with other characters (a - d) show significant differences (p <0.05).
FIG. 6 shows that treatment with Vectex inhibits tumor growth in an HCT-116DR tumor xenografted mouse animal model.
1x10 &lt; ^{7 &gt;} HCT-116DR cells were subcutaneously inoculated into the right flank of the nude mouse animal model and the tumorigenesis of the mice was monitored. When the size of the tumor reached 5 x 5 mm ³ , the mice were given vehicle or 25 mg / kg or 50 mg / kg vytexin by oral administration for 3 days per week.
(A) is a result of observing the tumor volume after initiation of treatment.
(B) Representative images of tumor sections after H & E staining. (C) HSP and autophagic related protein levels and (D) apoptosis marker proteins were analyzed by western blotting.
Data represent the mean ± standard deviation of three independent experiments (n = 3). Values with other characters (a - d) show significant differences (p <0.05).
Figure 7 (A) shows the results of various cell lines treated with vitexin at the indicated concentrations for 24 hours and cell viability by MTT assay [Cis = Cisplatin; Dox = docetaxel]. (B) calculated IC50 values of vitexin for various cell lines. Data represent the mean ± SD of three independent experiments (n = 3).
Figure 8 shows that Vitexin induces DNA damage in HCT-116DR cells.
(A) After 24 hours of culture, HCT-116DR cells were comet assayed. The presence of the halo effect indicates the presence of fragmented DNA. The percentage of DNA in tail was increased after treatment with Vitectin. (B) Head diameter (C) The tail length was calculated after comet assay. DNA damaged nuclei (including comets) have reduced head diameter and longer tail length. Data represent the mean ± SD of three independent experiments, n = 3. Values with different characters (ad) are significantly different from each other (p &lt; 0.05).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises biotexin as an active ingredient.

본 발명에서 비텍신(vitexin, Apigenin-8-C-D glucopyranoside)은 Vitex negundo, Acer palmatum, etc을 포함한 다양한 식물에서 발견되는 천연 플라보노이드 물질이다. In the present invention, vitexin (Apigenin-8-C-D glucopyranoside) is a natural flavonoid substance found in various plants including Vitex negundo, Acer palmatum,

상기 비텍신은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.The vitexcle can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Acid addition salts include those derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid and the like, aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, Derived from organic acids such as acetic acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid and the like. Examples of such pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogenphosphate, dihydrogenphosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, But are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, but are not limited to, halides, halides, halides, halides, halides, halides, But are not limited to, lactose, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzene sulfonate, toluene sulfonate, chlorobenzene Sulfonates, methanesulfonates, propanesulfonates, naphthalene-1-sulfonates, and the like, as well as sulfonates such as benzyl sulfonate, sulfonate, xylene sulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, -Sulfonate, naphthalene-2-sulfonate, mandelate, and the like.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 비텍신 또는 비텍신 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다. The acid addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method. For example, the acid addition salt may be prepared by dissolving bactic acid or bactic acid derivative in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc., The precipitate may be filtered and dried, or the solvent and excess acid may be distilled off under reduced pressure, followed by drying and crystallization in an organic solvent.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. The alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess amount of an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is preferable for the metal salt to produce sodium, potassium or calcium salt. In addition, the corresponding salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable salt (such as silver nitrate).

나아가, 본 발명은 상기 비텍신 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.Further, the present invention encompasses not only the above-mentioned bexticin and pharmaceutically acceptable salts thereof but also solvates, optical isomers, hydrates and the like which can be prepared therefrom.

상기 비텍신(Vitexin)은 비텍신(Vitexin)을 포함하는 모든 동식물로부터 추출될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 단풍 나무잎, 녹두, 부처꽃, 메밀, 홍초 및 산사자 중 적어도 어느 하나 이상으로부터 추출될 수 있다. The vitexin may be extracted from all plants and animals including Vitexin and more preferably be extracted from at least one of maple leaves, mung bean, buchu flower, buckwheat, have.

또한, 상기 비텍신은 화학적, 또는 생물학적으로 합성될 수 있으며, 그 합성 방법을 제한하지 않는다. In addition, the biotecin can be synthesized chemically or biologically, and the synthesis method thereof is not limited.

본 발명에서 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 말한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종 (carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 암종은 상피세포(epithelial cells) 유래의 암일 수 있다. 육종은 각 조직이 골수 밖의 중간엽 세포(mesenchymal cell)에서 유래된 세포로부터 발생된 것일 수 있는 결합 조직(즉, 뼈, 연골, 지방 및 신경)으로부터 유래된 암일 수 있다. 조혈세포 유래의 암은 골수를 떠나 림프절 및 혈액에서 성숙하는 경향이 있는 조혈세포로부터 유래할 수 있다. 배세포 종양은 다능성 세포(pluripotent cell)로부터 유래된 암일 수 있다. 상기 다능성 세포는 정소 또는 난소에 종종 존재할 수 있다. 모세포종은 미성숙 전구 세포 또는 배아 조직으로부터 유래할 수 있다. 상기 암은 흑색종, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.In the present invention, the cancer may be solid cancer or non-solid cancer. Solid tumors are cancerous tumors that occur in organs such as the liver, lungs, breast, and skin. Non-solid cancer is cancer that develops in the blood, also called blood cancer. The cancer may be carcinoma, sarcoma, cancer derived from hematopoietic cells, germ cell tumor, or blastoma. Carcinoma may be cancer from epithelial cells. Sarcoma may be a cancer derived from connective tissue (i.e., bone, cartilage, fat, and nerves) where each tissue may be derived from cells derived from mesenchymal cells outside the bone marrow. Cancer from hematopoietic cells may originate from hematopoietic cells that leave the bone marrow and tend to mature in the lymph nodes and blood. Gastric cell tumors can be cancer derived from pluripotent cells. The pluripotent cells can often be present in testes or ovaries. Bromoblastoma may originate from immature progenitor cells or embryonic tissue. The cancer is selected from the group consisting of melanoma, cerebrospinal tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, Myelodysplastic syndromes (MDS), myelofibrosis, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, skin cancer, and the like.

특히 상기 암은 대장암일 수 있다. In particular, the cancer may be a colon cancer.

본 발명에서 사용되는 용어인 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제하거나 암의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.As used herein, the term " prevention " refers to any action that inhibits cancer by delaying administration of the pharmaceutical composition or delaying the onset of cancer. The term " treatment " refers to any action that improves or alters the symptoms of cancer by administration of the pharmaceutical composition.

상기 암은 약물 저항성 암일 수 있다. 본 발명의 용어인 “약물 저항성 암”이란 항암제 치료 또는 방사선 치료 등에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어 상기 치료법에 의하여 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 약물 저항성 암은 특정한 항암제 또는 방사선 치료에 대하여 처음부터 내성을 갖을 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴시간의 치료로 인하여 암세포 내의 유전자가 변이되어 동일한 치료제에 대하여 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다The cancer may be a drug resistant cancer. The term &quot; drug resistant cancer &quot; as used herein means an extremely low sensitivity to anticancer drug therapy or radiation therapy, and means a cancer in which the symptom of cancer is not improved, alleviated, alleviated or treated by the above-mentioned treatment. The drug resistant cancer may be resistant to a specific anticancer agent or radiation therapy at the beginning and may not exhibit resistance at first, but the gene in the cancer cell may be mutated due to a long time treatment, so that the drug is no longer susceptible to the same therapeutic agent May occur

상기 약물 저항성 암은 암조직 또는 암세포에서 일반 조직 또는 일반 세포에 비하여 MDR1 (Multidrug resistance 1)의 유전자 발현 및 활성이 상향조절된 것 일 수 있다.The drug resistant cancer may be an upregulated gene expression and activity of MDR1 (Multidrug resistance 1) in cancer tissues or cancer cells as compared to general tissues or general cells.

본 발명에 따른 비텍신은 상기 MDR1의 발현 및 활성을 감소키시고 (실시예 2), 자가포식(autophagy)을 억제하여 세포 사멸을 유도(실시예 3, 및 4)할 수 있다. 이에 따라서, 상기 비텍신은 MDR1의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있으며, 자가포식 억제제일 수 있다. Tetracin according to the present invention can reduce the expression and activity of MDR1 (Example 2), inhibit autophagy and induce apoptosis (Examples 3 and 4). Accordingly, the biotecin may decrease the expression or activity of MDR1, and may be an autopoiesis inhibitor.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 암이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may be used in a method for preventing or treating cancer, and specifically, the method for preventing or treating cancer may include administering to a subject in which cancer is expected to occur or to be developed.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.The term " administration " of the present invention means introducing the composition into a subject in an appropriate manner.

본 발명의 용어 "개체"란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term " individual " of the present invention means all animals such as mice, mice, livestock and the like, including humans that have developed or can develop cancer. Specific examples include, but are not limited to, mammals including humans.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 비텍신을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term " pharmaceutically effective amount " of the present invention means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the kind and severity of the subject, The activity of the compound, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. For example, the composition may be administered as an active ingredient at a dose of 0.01 to 500 mg / kg per day, specifically 10 to 100 mg / kg, and the administration may be administered once a day or divided into several times . In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.001 to 50% by weight of the biotecin of the present invention based on the total weight of the composition.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.

본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the above-described effective ingredient. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols or the like, oral preparations, suppositories or sterilized injection solutions according to a conventional method have. Specifically, when formulating, it can be prepared by using diluents or excipients such as fillers, weights, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like commonly used. Solid formulations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such a solid preparation may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Liquid preparations for oral administration, liquid paraffin, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include withexol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) depending on the intended method, and the dose may be determined depending on the condition and the weight of the patient, The mode of administration, the route of administration, and the time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.The present invention provides a food composition for prevention or amelioration of cancer, which comprises biotexin as an active ingredient.

본 발명의 용어, "개선"이란, 상기 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.The term " improvement " of the present invention means all the actions in which the administration of the composition improves or alters the cancer.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.The term " food " of the present invention is intended to encompass all kinds of foods, such as meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice creams, Vitamin complex, health functional food, and health food, all of which include foods in a conventional sense.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.The term "functional food" as used herein means the same term as "food for special health use" (FoSHU). In addition to nutrition, It means food. Here, the term "function (surname)" means that the structure and function of the human body have a beneficial effect for health use such as controlling nutrients or physiological action. The food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art and can be prepared by adding raw materials and ingredients which are conventionally added in the art. In addition, the formulations of the foods can also be produced without restrictions as long as they are formulations recognized as food. The composition for food of the present invention can be manufactured in various forms, and unlike general drugs, it has advantages of being free from side effects that may occur when a food is used as a raw material for a long period of time, and is excellent in portability, Can be ingested as an adjuvant to promote the effect of preventing or improving cancer.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다.The health food refers to a food having an active health promotion or promotion effect compared with a general food, and a health supplement food refers to a food for health assistance. In some cases, the terms health functional foods, health foods, and health supplements may be used interchangeably.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 암의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.Since the food composition of the present invention can be routinely ingested, it can be very usefully used because a high effect can be expected for preventing or improving cancer.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.The food composition may further comprise a physiologically acceptable carrier. The type of carrier is not particularly limited, and any carrier conventionally used in the art can be used.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. In addition, the food composition may contain additional components that are commonly used in food compositions and can improve odor, taste, visual appearance, and the like. For example, vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid and the like. In addition, it may include minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) It may also include amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine, and the like.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.In addition, the food composition may contain at least one kind selected from the group consisting of preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate), disinfectants (such as bleaching powder and highly bleached white powder, sodium hypochlorite), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA) (Sodium nitrite), bleach (sodium sulfite), seasoning (sodium MSG glutamate, etc.), sweeteners (dicin, cyclamate, saccharin, etc.), coloring agents , Sodium, etc.), perfume (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium hydrogen D-tartrate), emulsifiers, thickeners (foams), encapsulating agents, gum bases, foam inhibitors, solvents, And may include food additives. The additives may be selected and used in appropriate amounts depending on the type of food.

본 발명의 비텍신은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The non-texin of the present invention can be added as it is or can be used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to conventional methods. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to its intended use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, the food composition of the present invention may be added in an amount of not more than 50 parts by weight, specifically not more than 20 parts by weight, based on the food or beverage, when the food or drink is prepared. However, in case of long-term ingestion for health and hygiene purposes, the active ingredient may be contained in an amount not exceeding the above range and there is no problem in terms of safety.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.As an example of the food composition of the present invention, it can be used as a health beverage composition. In this case, various flavors or natural carbohydrates can be added as an additional ingredient like ordinary beverages. The above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose, sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Xylitol, sorbitol, erythritol, and the like. Sweeteners include natural sweeteners such as tau Martin and stevia extract; Synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used. The ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the health beverage composition of the present invention.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the health beverage composition may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acid, protective colloid thickener, pH adjuster, stabilizer, Alcohols or carbonating agents, and the like. It may also contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks, or vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present invention.

본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 비텍신을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The food composition of the present invention may be contained in various weight percentages as long as it can exhibit the preventive or ameliorative effect of cancer. Specifically, 0.001 to 100% by weight or 0.01 to 80% by weight, based on the total weight of the food composition, But are not limited thereto.

또한, 본 발명은 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a feed composition for preventing or ameliorating cancer comprising biotexin as an active ingredient.

상기 사료는 가축에 급여되는 일반적인 사료로, 용어 "가축"은 집에서 기르는 짐승, 즉 포유류, 가금류 등을 의미하는 것이다. 본 발명에서 상기 포유류는 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말 등을 예로 들 수 있으며, 가금류로는 닭, 오리, 칠면조 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The term " livestock " refers to domestic animals, such as mammals, poultry, and the like. In the present invention, the mammal may be, for example, a dog, a cat, a cow, a pig, a goat, a sheep or a horse. Examples of the poultry include a chicken, a duck and a turkey.

상기 사료 조성물은 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은 가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다.The feed composition may include general basic feeds fed according to the type of livestock. These basic feeds are known in the art and are commercially available depending on the type of livestock, so that any person skilled in the art will be able to manufacture or purchase them very easily.

구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있다.Specifically, the basic feed may include some or all of a starch-containing substance, a protein-containing substance, a fat-containing substance, a vitamin-containing substance, an inorganic substance-containing substance, an antioxidant substance, an antibiotic,

상기 전분 함유 물질은 그것이 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 모두 사육동물의 기초사료에 포함될 수 있는데, 이러한 전분 함유 물질은 일반적으로 옥수수, 콩, 밀, 수수, 보리, 귀리 등으로부터 얻어진다. 적합한 전분 함유 물질로서는 옥수수 분쇄물이나 분말, 귀리 분쇄물이나 분말, 콩 분쇄물이나 분말, 밀 분쇄물이나 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 적합한 전분 함유 물질은 귀리 분말, 옥수수 분쇄물, 밀 분쇄물, 콩 분말 등이다. 이러한 전분 함유 물질은 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있다면, 그 농도는 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로 전분 함유 물질은 약 30~80중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.The starch-containing material may be included in the feedstuff of the rabbit as long as it can sustain the growth of the animal. Such starch-containing material is generally obtained from corn, soybean, wheat, sorghum, barley, oats and the like. Examples of suitable starch-containing substances include corn flour or powder, oat flour or powder, bean flour or powder, wheat flour or powder. Suitable suitable starch containing materials are oat flour, corn flour, wheat flour, soy flour, and the like. The concentration of such a starch-containing substance is not particularly limited as long as it can effectively maintain the growth of the animal. Generally, the starch-containing material may be included in the basic feed in a range of about 30 to 80% by weight.

단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 유지시킬 수 있는 한, 가축의 기초사료에 포함될 수 있다. 경제적인 이유로 어분, 콩 분말 등과 같은 단백질 함유 물질이 사용되고 있는데, 다른 것들로서는 콩 단백질 농축물, 혈분, 혈장 단백질, 탈지유 건체물, 유(乳) 단백질 농축물, 옥수수 글루텐(Gluten) 분말, 밀 글루텐 분말, 이스트, 해바라기씨 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 단백질 함유 물질은 어분, 혈분, 혈장 단백질, 콩 분말 등이다. 단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있는 한, 사육동물의 기초사료에 포함되는 그것의 농도는 중요하지 않다. 일반적으로, 단백질 함유 물질은 약 10~50중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.Protein-containing materials can also be included in animal feed as long as they can sustain the growth of the animal. For economic reasons, protein-containing substances such as fish meal and soybean powder have been used. Others include soy protein concentrate, blood meal, plasma protein, skim milk dry product, milk protein concentrate, corn gluten powder, wheat gluten Powder, yeast, sunflower seed powder and the like. Preferred protein-containing substances are fish meal, blood meal, plasma protein, soybean powder and the like. As long as the protein-containing material can effectively maintain the growth of the animal, its concentration in the animal feed is not important. Generally, the protein-containing material can be included in the basic feed in a range of about 10 to 50% by weight.

상기 지방 함유 물질로는 라드(Lard), 우지, 콩기름, 레시틴, 코코넛유 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 지방 함유 물질 또한 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 그 농도는 제한되지 않으며, 일반적으로 약 2~20중량의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.The fat-containing material includes, but is not limited to, lard, tallow, soybean oil, lecithin, coconut oil and the like. The concentration of the fat-containing substance is not limited as long as it can maintain the growth of the animal, and it can be included in the basic feed in the range of about 2 to 20 wt%.

또한 기초사료에는 수용성, 지용성 비타민과 미량의 무기물이 포함될 수 있다. 상기 비타민으로는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 리보플라빈, 판토텐산(Pantothenic Acid), 나이아신, 비타민 B12, 엽산, 비오틴, 비타민 C 등이 사용될 수 있다. 미량의 무기물로서는 구리, 아연, 요오드, 셀렌, 망간, 철, 코발트 등이 사용될 수 있다. 여기서 "미량"이 의미하는 바는 가축의 기초사료에 사용된 이들 성분들의 양이 다른 성분들의 양보다 실질적으로 적은 것을 의미한다. 일반적으로, 비타민이나 무기질이 미량으로 기초사료에 포함될 경우에 조성물 총 중량에 약 0.0001~5중량%로 포함될 수 있다.The base feed can also contain water-soluble, fat-soluble vitamins and trace minerals. Examples of the vitamins include vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, riboflavin, pantothenic acid, niacin, vitamin B12, folic acid, biotin and vitamin C. Copper, zinc, iodine, selenium, manganese, iron, cobalt and the like can be used as a trace amount of an inorganic substance. Here, "trace" means that the amount of these ingredients used in the livestock base feed is substantially less than the amount of the other ingredients. Generally, when a small amount of vitamin or mineral is included in the basic feed, it may be contained in an amount of about 0.0001 to 5% by weight based on the total weight of the composition.

또한 기초사료에는 BHT(Butylated Hydroxytoluene), BHA(Butylated Hydroxyanisole), 비타민 E, 아스코르브산 등의 산화방지물질이 포함될 수 있으며, 이들 산화방지물질은 약 0.0001~1중량%의 극소량으로 포함될 수 있다.In addition, the base feed may include antioxidants such as BHT (Butylated Hydroxytoluene), BHA (Butylated Hydroxyanisole), vitamin E and ascorbic acid, and these antioxidants may be contained in a very small amount of about 0.0001 to 1% by weight.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

실험예Experimental Example

실험예Experimental Example 1: 화학물질 및 시약 1: Chemicals and reagents

달리 명시되지 않는 한, 비텍신, 아크리딘 오렌지 (acridine orange, AO), 5-플루오로우라실 (5-FU), 시스플라틴 (CIS), 도세탁셀 (DOC), 빈크리스틴 (VIN), 3-(4,5-디메틸 -2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT), Hoechst 33342, 3-메틸아데닌 (3-MA), 디메틸술폭시드 (DMSO) 및 기타 화학 물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. β-actin, MDR-1, HSF-1, lamin B, HSP70, HSP27, BID, BAX, cytochrome C, caspase-3, caspase-9, 및 Bcl-2 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구매하였다. HSP90 항체는 Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA)로부터 구매하였다. BECN-1 및 ATG5는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구매하였다. LC3는 Abcam (Cambridge, MA, USA)으로부터 구매하였다. 웨스턴 블롯을 위한 HRP (Horseradish peroxidase)-컨쥬게이트 제2 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매하였다. Unless otherwise indicated, the terms acinetine orange, AO, 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin (CIS), docetaxel (DOC), vincristine (VIN) 2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), Hoechst 33342, 3-methyladenine (3-MA), dimethylsulfoxide (DMSO) Materials were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). The antibodies to B-actin, MDR-1, HSF-1, lamin B, HSP70, HSP27, BID, BAX, cytochrome C, caspase-3, caspase-9 and Bcl-2 were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). HSP90 antibodies were purchased from Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA). BECN-1 and ATG5 were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). LC3 was purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA). HRP (Horseradish peroxidase) -conjugate second antibody for Western blot was purchased from Santa Cruz Biotechnology.

실험예Experimental Example 2: 세포 배양 및 MDR HCT-116 세포주의 수립 2: Cell culture and establishment of MDR HCT-116 cell line

인간 대장암종 세포주 HCT-116 (ATCC, Rockville, MD)를 10% FBS 및 25mM HEPES 버퍼 및 1% Pen-Strep cocktail (Gibco BRL)로 보충된 RPMI 1640 배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 내에 37℃ (95% air, 5% CO₂)에 유지되었다. (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) supplemented with 10% FBS and 25 mM HEPES buffer and 1% Pen-Strep cocktail (Gibco BRL), human colon carcinoma cell line HCT-116 Maintained at 37 ° C (95% air, 5% CO ₂ ).

저밀도의 HCT-116 세포를 25 cm² 플라스크에 시딩하고, 생존 세포가 명백한 콜로니로 자랄 때까지 0.2 nM 도세탁셀, 빈크리스틴 및 0.2 μM 시스플라틴 및 5- 플루오로우라실을 생존 세포가 명백한 콜로니로 자랄 때까지 처리 하였다.Low density HCT-116 cells were seeded in 25 cm ² flasks and incubated with 0.2 nM docetaxel, vincristine and 0.2 μM cisplatin and 5-fluorouracil until viable cells grew into clear colonies until the cells grew into clear colonies Respectively.

이 세포들은 3일 간격으로 3 번씩 3-6 주 동안 노출되었으며, 사이클 사이의 성장 회복을 가능하게 하였다. 3 회의 약물 처리가 완료된 후, 용량을 두 배로 늘려 최종 약물 농도가 도달될 때까지 처리를 반복 하였다. 모든 세포주는 완전한 배지에서 단층으로 유지되었다. 선택된 콜로니는 모든 약물의 존재하에 증폭되었다. 10 nM 도세탁셀, 빈크리스틴 및 10 μM 시스플라틴 및 5-FU에서 유지된 MDR 서브라인을 HCT-116DR로 명명 하였다.These cells were exposed for 3 to 6 weeks at 3-day intervals, allowing growth recovery between cycles. After three drug treatments were completed, the dose was doubled and treatment was repeated until the final drug concentration was reached. All cell lines were maintained monolayers in complete medium. Selected colonies were amplified in the presence of all drugs. The MDR sublines maintained in 10 nM docetaxel, vincristine and 10 μM cisplatin and 5-FU were designated HCT-116DR.

실험예Experimental Example 3:  3: MTTMTT 및  And LDHLDH 어세이Assay

비텍신의 24시간 처리 후, MTT working solution (5 mg/mL)을 첨가하고 4시간 후, 세포 독성을 microplate reader (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서의 광학 밀도를 측정함으로서 평가하였다. 플라즈마-막 무결성 (Plasma-membrane integrity)은 LDH assay kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 세포로부터 배양 배지로의 LDH (lactate dehydrogenase)의 누출을 기초로 하여 측정하였다. LDH 누출은 490 nm 및 690 nm의 광학밀도에서 측정하여 결정하였다. The optical density at 540 nm was measured using a microplate reader (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) after 4 hours of MTT working solution (5 mg / &Lt; / RTI &gt; Plasma-membrane integrity was measured based on the leakage of LDH (lactate dehydrogenase) from the cells into the culture medium using the LDH assay kit (Sigma-Aldrich). LDH leakage was determined by measuring at optical densities of 490 nm and 690 nm.

또한, 다양한 암종에 대하여 MTT assay를 하기 위하여, 인간 대장 암종 세포주 HCT-116, Km12C 및 HT29, 인간 폐 상피 암종 세포주 A549 및 도세탁셀 내성 A549 Dox (ATCC, Rockville, MD)를 10% 우태아혈청 (FBS), 25mM HEPES 버퍼 및 1 % Pen-Strep 칵테일 (Gibco BRL)이 보충된 RPMI 1640 배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 37 ℃ (95 % 공기, 5 % CO₂)에서 유지하였다.Human lung cancer cell lines HCT-116, Km12C and HT29, human lung epithelial carcinoma cell line A549 and docetaxel-resistant A549 Dox (ATCC, Rockville, Md.) Were inoculated into 10% fetal bovine serum ), 37 [deg.] C (95% air, 5% CO ₂ ) in RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) supplemented with 25 mM HEPES buffer and 1% Pen-Strep cocktail (Gibco BRL).

인간 간세포 암 세포주 HepG2, 시스플라틴 내성 HepG2 Cis 및 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa를 10 % 우태아 혈청 (FBS) 및 1 % Pen-Strep cocktail (Gibco BRL)을 첨가한 DMEM (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 배양하였다. 24 시간 동안 비텍신을 처리 (25-100 μM) 한 뒤, 세포 독성을 MTT 워킹 용액을 첨가한 4 시간 후 마이크로 플레이트 판독기 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)로 540 nm에서 광학 밀도를 측정하여 평가하였다 (5 mg / mL).Human hepatocellular carcinoma cell line HepG2, cisplatin resistant HepG2 Cis and human cervical cancer cell line HeLa were cultured in DMEM (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% Pen- Strep cocktail (Gibco BRL) (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) for 4 hours after MTT working solution was added to the cells, followed by treatment with biotecin (25-100 μM) for 24 hours The optical density at 540 nm was measured (5 mg / mL).

실험예Experimental Example 4:  4: AVOAVO (acidic vesicular organelle) 형성의 검출 및 정량화 (acidic vesicular organelle) formation and quantification

AVOs의 존재는 AO 염색에 의하여 평가하였다. 화합물-처리된 세포를 PBS로 세척한 뒤, 5% FBS를 포함하는 PBS에 희석된 1 μg/mL AO로, 30분동안 37℃에서 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 필터가 장착된 형광현미경을 통하여 488 nm에서 관찰하였다. AVO 정량화를 위해, AO-염색된 세포를 수확하고, PBS로 2 회 세척하고, 5 % FBS를 함유하는 PBS에 재현탁시킨 다음, 형광현미경으로 분석하였다The presence of AVOs was assessed by AO staining. Compound-treated cells were washed with PBS and stained with 1 μg / mL AO diluted in PBS containing 5% FBS for 30 min at 37 ° C. Cells were washed with PBS and observed at 488 nm through a fluorescence microscope equipped with a filter. For AVO quantification, AO-stained cells were harvested, washed twice with PBS, resuspended in PBS containing 5% FBS and analyzed by fluorescence microscopy

실험예Experimental Example 5:  5: 웨스턴Western 블롯Blot 분석 analysis

세포 용해물 (전체 세포, 세포질 및 핵)을 10 % 또는 15 % 폴리 아크릴아미드 겔에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 옮겼다. 뒤이어 블롯을 PBS 내의 5%의 무지방 우유에 1시간 동안 인큐베이션하였으며, 2시간동안 37℃에서 또는 밤새 4℃에서 특정단백질에 대한 항체로 탐침하였으며, 뒤이어 1시간동안 실온에서 HRP-컨쥬게이트 제2 항체로 다시 탐침하였다. 인큐베이션 사이의 세척은 세척 완충액으로 3회 수행하였으며, 최종 세척 후, 신호를 ECL detection system을 통하여 전개시켰다. Cell lysates (whole cells, cytoplasm and nuclei) were separated in 10% or 15% polyacrylamide gels and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Subsequently, the blots were incubated in 5% non-fat milk in PBS for 1 hour and probed with antibodies against specific proteins at 37 ° C for 2 hours or at 4 ° C overnight, followed by incubation for 1 hour at room temperature with HRP- And then probed with the antibody again. Washing between incubations was performed 3 times with wash buffer, and after final washing, signals were developed through an ECL detection system.

실험예Experimental Example 6: P- 6: P- gpgp 활성을 위한 Rh-123  Rh-123 for activity 어세이Assay

P-gp-관련 유출 활성은 세포가 형광 화합물 Rh-123을 검출하는 능력을 통하여 평가하였다. 세포를 6- 웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰로 접종 하였다. 비텍신 (10, 25, and 50 μM)으로 24시간동안 세포 처리 후, Rh123 (최종농도; 1 μM)를 포함하는 신선한 배지로 교체한 후, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척하고, Rh-123 형광 (Nikon Eclipse TS100 Epi-fluorescence microscope, Japan)의 추가 검출을 위해 PBS에 재현탁시켰다. 평균 형광 값은 대조군에서 관찰 된 것의 백분율로 환산되었다.P-gp-related efflux activity was assessed by the ability of cells to detect the fluorescent compound Rh-123. Cells were inoculated into 6-well plates at 1 x ¹⁰ cells / well. Cells were treated with bactex (10, 25, and 50 μM) for 24 hours, then replaced with fresh medium containing Rh123 (final concentration; 1 μM), and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After incubation, the cells were washed twice with cold PBS and resuspended in PBS for further detection of Rh-123 fluorescence (Nikon Eclipse TS100 Epi-fluorescence microscope, Japan). The mean fluorescence value was converted to a percentage of that observed in the control group.

실험예Experimental Example 7:  7: ATPaseATPase 어세이Assay

활성 약물 유출의 경우, P-gp ATPase 활성은 ATP가 ADP 및 유리 인산으로 분해되는 것을 촉매해야 한다. HCT-325 116 DR 세포를 배양하고 다양한 농도의 비텍신으로 24시간동안 처리하였다. 5 mM ATP를 첨가함으로서 반응을 개시하였으며, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 5% 소디움 도데실 설페이트 용액을 첨가함으로써 반응을 종결하였으며, 효소로 유리된 유리 인산 및, 결과 측색물 (colorimetric product)를 측정하여 효소 활성을 결정하였다 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).In the case of active drug efflux, P-gp ATPase activity should catalyze ATP degradation to ADP and free phosphate. HCT-325 116 DR cells were cultured and treated with varying concentrations of BATTECHIN for 24 hours. The reaction was initiated by the addition of 5 mM ATP and incubated at 37 [deg.] C for 20 minutes. The reaction was terminated by addition of 5% sodium dodecyl sulfate solution, enzyme activity was determined by measuring the free phosphoric acid liberated with the enzyme and the resulting colorimetric product (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

실험예Experimental Example 8:  8: 코멧Comet 어세이Assay (Comet assay) (Comet assay)

DNA 손상을 평가하기 위해 간유리 현미경 슬라이드를 1 % 정상 융점 아가로오스로 미리 코팅하였다. HCT-116DR 세포를 처리한 후 수확한 다음 37 ℃에서 PBS (pH 7.4) 중 1 % 저-융점 아가로오스 70 μL에 부유시켰다. 세포를 미리 코팅된 간유리 슬라이드 위로 즉시 핏펫팅하고, 아가로스를 10분 동안 얼음 상에서 정치시켰다. 2.5 M NaCl, 0.1 M Na2 EDTA, 10 mM Tris, 10 % DMSO 및 1 % Triton X-100 (pH 10)을 함유하는 커플린병 (Coplin jar)에 4 ℃에서 1 시간이상 슬라이드를 놓아 세포를 용해시켰다. 이어서, 슬라이드를 30분 동안 전기영동 용액 (0.3M NaOH 및 1mM Na2EDTA, pH> 13)에 침지시키고, 동일한 용액에서 1.3 V/cm에서 20분 동안 전기영동 한 후, 중화 완충액 (0.4 M Tris, pH 7.5)에 20 분간 세척하였다. 슬라이드를 70%의 에탄올에 15분간, 무수 에탄올에 추가로 15분간 침지하고, 건조를 위하여 벤치에 밤새 놔두어 코멧 (comet)을 고정하였다. 코멧을 제조사 (Sigma-Aldrich)가 권장하는 희석액에서 SYBR green으로 염색하였다. 각 슬라이드의 100개의 코멧을 꼬리의 형광 강도에 따라 Komet 3.0 (Kinetic Imaging Ltd, Liverpool, UK)을 사용하여 컴퓨터화 된 이미지 분석으로 정량화하고 결과를 그룹화 하였다Liver glass microscope slides were precoated with 1% normal melting point agarose to assess DNA damage. HCT-116DR cells were harvested and then harvested and suspended in 70 μL of 1% low-melting agarose in PBS (pH 7.4) at 37 ° C. Cells were immediately pipetted onto a pre-coated liver slide and agarose was allowed to settle on ice for 10 minutes. The cells were lysed by placing the slides in a Coplin jar containing 2.5 M NaCl, 0.1 M Na2 EDTA, 10 mM Tris, 10% DMSO and 1% Triton X-100 (pH 10) . The slides were then immersed in the electrophoresis solution (0.3M NaOH and 1mM Na2EDTA, pH > 13) for 30 minutes, electrophoresed at 1.3 V / cm for 20 minutes in the same solution, 7.5) for 20 minutes. The slides were immersed in 70% ethanol for 15 minutes, in anhydrous ethanol for 15 minutes, and then placed on a bench overnight to dry to fix the comet. Comet was stained with SYBR green in a dilution recommended by the manufacturer (Sigma-Aldrich). 100 comets of each slide were quantified by computerized image analysis using Komet 3.0 (Kinetic Imaging Ltd, Liverpool, UK) according to the fluorescence intensity of the tail and grouped the results

실험예Experimental Example 9:  9: HoechstHoechst 염색을 통한 핵 응축 (nuclear condensation) 검출 Detection of nuclear condensation through dyeing

처리 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 4 % 포름알데히드로 30 분간 고정시켰다. 고정된 세포를 Hoechst 33342 염료 (1 μg / mL)로 어두운 곳에서 15 분동안 염색하고 PBS로 세척하고, Nikon Eclipse TS100 Epi-fluorescence microscope (Nikon)을 사용하여 형광 현미경 사진을 수득하였다. After treatment, the cells were washed twice with PBS and fixed with 4% formaldehyde for 30 minutes. Immobilized cells were stained with Hoechst 33342 dye (1 μg / mL) in the dark for 15 minutes, washed with PBS, and photomicrographs were obtained using a Nikon Eclipse TS100 Epi-fluorescence microscope (Nikon).

실험예Experimental Example 10:  10: 유세포Flow cell 분석 analysis

세포 사멸 유도 및 AVO 발달은 각각 in situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Sciences, Basel, Switzerland) 및 Cyto-ID™ Autophagy Detection Kit (Enzo LifeSciences)를 이용하여 정량화 하였으며, 유세포분석기를 통하여 분석하였다. 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 염색 한 다음 수확 한 후, 청색 (488nm) 여기광으로 조사한 1x10⁴ 세포에서 녹색 (510-530 nm) 형광 방출을 형광 활성 세포 분류기를 사용하여 측정하였다. 총 50,000개의 이벤트를 수집하고, 데이터 분석은 Kaluza flow cytometry software (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. Cell death induction and AVO development were quantified using in situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Sciences, Basel, Switzerland) and Cyto-ID ™ Autophagy Detection Kit (Enzo LifeSciences) and analyzed using flow cytometry. Cells were stained at 37 ° C for 30 minutes and harvested and then green (510-530 nm) fluorescence emission was measured in 1x10 ⁴ cells irradiated with blue (488 nm) excitation light using a fluorescence activated cell sorter. A total of 50,000 events were collected and analyzed using Kaluza flow cytometry software (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

실험예Experimental Example 11: 단일 가닥 DNA의 측정 11: Measurement of single-stranded DNA

ApoStrand ELISA apoptosis detection kit (Enzo Life Sciences)를 사용하여 세포 내 단일 가닥 DNA의 양을 결정하였다. 자멸된 세포의 DNA는 포름 아미드 변성에 민감하며, 변성된 DNA는 단일 가닥 DNA에 대한 단일 클론 항체를 사용하여 검출하였다. 1 x 10⁵ 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하고, 비텍신(vitexin)을 처리하였다. 어세이는 제조사의 지시에 따라 수행하였고, 흡광도는 ELISA 판독기 (Bio-Tek Instruments)로 405 nm에서 측정하였다.ApoStrand ELISA Apoptosis detection kit (Enzo Life Sciences) was used to determine the amount of intracellular single stranded DNA. The DNA of the self-destructed cells was sensitive to formaldehyde denaturation, and the denatured DNA was detected using monoclonal antibodies against single-stranded DNA. Was 1 x 10 ⁵ cells cultured in a 96-well plate, and processing the non-teksin (vitexin). Assays were performed according to the manufacturer's instructions, and the absorbance was measured at 405 nm with an ELISA reader (Bio-Tek Instruments).

실험예Experimental Example 12:  12: 무흉선Athymine 누드 마우스 이종이식 연구 Nude mouse xenotransplantation study

Orient Bio, Inc. (Seoul, Korea)에서 BALB/c 무균 무흉선 암컷 마우스(4 주령, 체중 20-22g)를 구입하였다. 마우스는 살균된 온도가 조절된 방에서 12h:12h의 명:암 일정에서 표준 설치류 식단 및 물을 자유식이 하였다. 동물 관리 및 취급 지침은 대구대학교 실험동물운영위원회(경북, 한국)의 승인을 받았다. Orient Bio, Inc. (Seoul, Korea) were purchased from BALB / c asymptomatic athymic female mice (4 weeks old, body weight 20-22 g). The mice were freeze-dried with a standard rodent diet and water at 12 h: 12 h in the sterile temperature-controlled room. Animal management and handling guidelines were approved by the Experimental Animal Management Committee of Daegu University (Gyeongbuk, Korea).

생착을 위해, 1x10⁷ HCT-116DR 세포를 우측 옆구리 부위에 피하 접종하고 종양 발달을 모니터 하였다. 종양 크기가 5x5 mm³ 일 때 마우스를 무작위로 4 그룹 (n=5/그룹)으로 할당하고 주당 3일 동안 구강 투여로 비히클 또는 25 mg/kg 또는 50mg/kg의 비텍신을 투여하였다. 종양의 부피를 실험 기간 동안 모니터링하고 [(W)²xL]/2의 공식을 이용하여 산정했다. 여기서 W는 가장 짧은 종양의 폭을, L은 가장 긴 종양의 길이를 나타낸다. 종양을 절개하여 액체 질소에 저장하거나 추가 분석을 위해 포르말린에 고정시켰다.For engraftment, 1x10 &lt; ⁷ &gt; HCT-116DR cells were subcutaneously inoculated into the right flank and tumor development was monitored. Mice were randomly assigned to 4 groups (n = 5 / group) when the tumor size was 5x5 mm ³ and administered vehicle or 25 mg / kg or 50 mg / kg vytexin by oral administration for 3 days per week. The volume of the tumor was monitored during the experiment and estimated using the formula [(W) ² x L] / 2. Where W is the width of the shortest tumor and L is the length of the longest tumor. Tumors were dissected and stored in liquid nitrogen or fixed in formalin for further analysis.

실험예Experimental Example 13: 헤마톡실린 및 에오신 염색 13: hematoxylin and eosin staining

포르말린-고정된, 파라핀-포매된 종양 표본을 절편하고 (4 μM), 탈-파라핀화 및 수화후 슬라이드를 증류수로 세척하고 헤마톡실린으로 5 분 내지 10 분 동안 염색하였다.A formalin-fixed, paraffin-embedded tumor specimen was sectioned (4 μM), de-paraffinized and hydrated, and the slides were washed with distilled water and stained with hematoxylin for 5 minutes to 10 minutes.

과량의 염색을 1 % HCl-EtOH 용액으로 제거한 후 암모니아수 및 증류수로 세척하였다. 백그라운드 대조 염색을 에오신으로 수행한 후 에탄올 및 자일렌세척 뒤, 슬라이드를 광학 현미경 (400x)하에 분석 하였다.Excess dye was removed with 1% HCl-EtOH solution and washed with ammonia water and distilled water. Background control dyeing was performed with eosin followed by ethanol and xylene washing, and the slides were analyzed under an optical microscope (400x).

실험예Experimental Example 14: 데이터 분석 및 통계 절차 14: Data Analysis and Statistics Procedures

통계 분석은 Windows 용 SPSS software v22.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험의 평균±표준편차 (SD)로 표시하였다. 데이터는 일원분류 분산분석 (one-way analysis of variance)을 거쳤으며, Duncan의 다중 범위 테스트를 사용하여 샘플 간의 유의차를 계산하였다. 차이는 p <0.05에서 통계적으로 유의하다고 간주하였다. Statistical analysis was performed using SPSS software v22.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) for Windows. Results were expressed as mean ± standard deviation (SD) of three independent experiments. The data were subjected to one-way analysis of variance and Duncan's multiple range test was used to calculate the significant difference between the samples. Differences were considered statistically significant at p <0.05.

실시예Example

실시예1Example 1 : 약물-저항성 HCT-: Drug-resistant HCT- 116DR116DR 세포주의 생존력에 대한  For the viability of cell lines 비텍신의Vitech 영향 확인 Verify impact

화학-저항성 암세포에서 비텍신의 세포 독성 효과를 확인하기 위해, 24 시간 동안 농도를 증가시키면서 HCT-116DR 세포에 비텍신을 처리하였다. 비텍신 처리는 HCT-116DR 세포의 형태학적 변화 및, 용량-의존적으로 세포 배양 플레이트로부터 라운딩 (rounding) 및 분리를 야기하였다 (도 1A).In order to confirm the cytotoxic effect of Vectexin in chemo-resistant cancer cells, vitectin was treated with HCT-116DR cells with increasing concentrations for 24 hours. Bactexin treatment resulted in morphological changes of HCT-116DR cells, and rounding and separation from the cell culture plates in a dose-dependent manner (Figure 1A).

MDR1 수치는 화학-내성 암세포에서 상향 조절되는바, HCT-116 대장암 모세포 및 HCT-116DR 세포에서 MDR1의 발현을 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석은 HCT-116 세포에서 관찰 된 수준과 비교하여 HCT-116DR 세포에서 MDR1 발현이 향상되었음을 나타내었다 (도 1B).MDR1 levels were upregulated in chemo-resistant cancer cells, confirming the expression of MDR1 in HCT-116 colon cancer cells and HCT-116DR cells. Western blot analysis showed that MDR1 expression was enhanced in HCT-116DR cells compared to levels observed in HCT-116 cells (Fig. 1B).

세포 생존력에 대한 비텍신의 영향을 조사하기 위하여, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-Yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 수행하였다. 우리는 비텍신으로 HCT116DR 세포의 비텍신의 처리가 용량의존적으로 세포 생존 능력을 현저히 감소시킨다는 것을 관찰하였다 (도 1C). 또한, 비텍신으로 처리한 세포는 증가된 LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 나타내었으며 (도 1D), 이는 비텍신이 약물 내성 대장암 세포의 생존력을 저해함을 시사한다.3- (4,5-dimethylthiazol-2-Yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was performed to investigate the effect of vitexin on cell viability. We observed that the treatment of Vectexin of HCT116DR cells with Bactcx significantly reduced cell viability in a dose-dependent manner (Fig. 1C). In addition, cells treated with bactex showed increased LDH (lactate dehydrogenase) activity (Fig. 1D), suggesting that vitexin inhibits the viability of drug resistant colorectal cancer cells.

실시예Example 2:  2: 비텍신이Viteckin MDR1의Of MDR1 발현과 활성을 억제함을 확인 It is confirmed that it suppresses expression and activity

MDR-1 발현이 HCT-116DR 세포에서 상향 조절되기 때문에, 비텍신의 처리가 MDR1 발현 및/또는 활성에 영향을 미치는지 확인하였다. rhodamine-123 (Rh-123)의 세포 내 누적을 측정하여 24 시간 동안 다양한 농도의 비텍신으로 처리한 HCT-116 DR 세포의 MDR1 활성을 측정하였다.Since MDR-1 expression is up-regulated in HCT-116DR cells, it was determined whether treatment with biotexin affects MDR1 expression and / or activity. The intracellular accumulation of rhodamine-123 (Rh-123) was measured and the MDR1 activity of HCT-116 DR cells treated with various concentrations of bapticin for 24 hours was measured.

도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 비텍신이 처리된 HCT-116DR 세포는 대조군 세포에 비해 Rh-123 축적을 나타내었고, MDR1 관련 ATPase 활성은 용량 의존적으로 감소하였다 (도 2C).As shown in FIGS. 2A and 2B, the HCT-116DR cells treated with Vitexin showed Rh-123 accumulation as compared with the control cells and the MDR1-related ATPase activity was dose-dependently decreased (FIG. 2C).

뒤이어, 비텍신이 MDR-1 단백질 수준에 영향을 줄 수 있는지 평가하였다. HCT-116DR 세포를 24 시간 동안 농도를 증가시키면서 비텍신을 처리하고, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석하였다.Subsequently, we evaluated whether vitexin can affect MDR-1 protein levels. HCT-116DR cells were treated with vithexin with increasing concentrations for 24 hours and Western blot analysis of cell lysates.

결과는 비텍신 처리 후 MDR-1 수치가 유의하게 감소된 것을 나타내었다(도 2D). 이 데이터는 비텍신이 MDR1 발현을 억제하고, 이어서 그 활성을 약화 시켰음을 나타내는 것이다. The results showed a significant decrease in MDR-1 levels after treatment with non-texin (Figure 2D). This data indicates that vytexin inhibits MDR1 expression and subsequently weakens its activity.

실시예Example 3: HCT-116 DR 세포에서  3: In HCT-116 DR cells 비텍신이Viteckin 세포 사멸 유도에 미치는 영향의 확인 Identification of the effect on induction of apoptosis

몇몇 연구는 열충격전사인자 (heat shock transcription factor, HSF)-1이 세포질에서 핵으로 이동하여, 단백질 독성 스트레스 동안 열 충격 단백질 (HSP)의 발현을 조절함으로써, 암세포 생존 및 향상된 화학내성을 유도한다고 제안하였다. 이에 따라, 본 연구자는 비텍신이 HSF-1의 이동 (translocation) 및 HSPs 발현에 영향을 미치는지를 확인하였다. Several studies have suggested that heat shock transcription factor (HSF) -1 translocates from the cytoplasm to the nucleus and regulates the expression of heat shock proteins (HSPs) during protein toxic stress, leading to cancer cell survival and improved chemical resistance Respectively. Thus, the present inventor confirmed that Vitecex affects the translocation and HSPs expression of HSF-1.

HCT-116DR 세포를 24 시간 동안 증가하는 농도의 비텍신으로 처리하였고, 핵 추출물을 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, 처리되지 않는 HCT-116DR 세포의 핵 추출물에서 HSF-1가 충분하게 검출됨을 확인하였다. 대조적으로, HSF-1의 수준은 비텍신으로 처리된 HCT-116DR 세포에서 현저하게 감소되었다 (도 3A). 이 결과와 일치하여, HSP90 및 HSP70 단백질의 수준은 또한 비텍신 처리에 의해 감소되었다 (도 3A).HCT-116DR cells were treated with increasing concentrations of bapticin for 24 h and nuclear extracts were subjected to western blot analysis. As a result, it was confirmed that HSF-1 was sufficiently detected in the nuclear extract of untreated HCT-116DR cells. In contrast, the level of HSF-1 was significantly reduced in HCT-116DR cells treated with non-texin (Figure 3A). Consistent with these results, the levels of HSP90 and HSP70 proteins were also reduced by non-texcin treatment (Figure 3A).

그 다음에 비텍신-유도 세포 독성이 세포 사멸의 유도에 관여하는지를 조사하였다. HCT-116DR 세포에 24 시간 동안 비텍신을 처리하고 ApoStrand apoptosis 검출 키트를 사용하여 세포 사멸 유도를 평가 하였다.Next, we examined whether Baptic-induced cell toxicity was involved in induction of apoptosis. HCT-116DR cells were treated with vithexin for 24 hours and the induction of apoptosis was evaluated using the ApoStrand apoptosis detection kit.

결과는 비텍신 처리가 사멸된 세포의 전형적인 특징인 DNA 단일가닥 절단 (single-strand breaks, SSBs)을 향상시킨다는 것을 나타내었다 (도 3B).The results showed that bapticin treatment improved single-strand breaks (SSBs), a typical characteristic of killed cells (Fig. 3B).

또한, BID (BH3-interacting-domain death agonist) ), B-cell lymphoma (Bcl)-2-associated X protein (BAX) 및 cytochrome c과 같은, 전-세포사멸 단백질 (pro-apoptotic protein)의 발현 수준이 증가하고, caspase-3의 절단이 증가함을 확인하였다 (도 3c). Expression levels of pro-apoptotic proteins such as BID (BH3-interacting-domain death agonist), B-cell lymphoma (Bcl) -2-associated X protein (BAX) and cytochrome c And caspase-3 cleavage was increased (FIG. 3c).

HCT-116DR 세포에서의 비텍신에 의한 세포사멸의 유도는 비텍신-처리된 HCT-116DR 세포의 Hoechst 33342 염색으로도 확인하였으며, 이는 세포 사멸의 지표인 pycnonuclei formation이 증가함을 나타내었다 (도 3D).Induction of apoptotic cell death by HCT-116DR cells was also confirmed by Hoechst 33342 staining of non-texin-treated HCT-116DR cells, indicating an increase in pycnonuclei formation, an indicator of apoptosis (Fig. 3D ).

비텍신이 DNA 이중 가닥 절단 (DNA double-strand breaks, DSBs)을 유도하는지 여부를 결정하기 위해 우리는 코멧 어세이 (단일세포 겔 전기영동)를 수행하였다. 그 결과 비텍신을 처리한 HCT-116DR 세포에서 머리에 비하여 코멧 꼬리의 증가된 강도를 확인하였으며, 이는 대조군 세포에 비한 DSBs의 수를 나타낸다 (도 8). To determine whether Vitectin induces DNA double-strand breaks (DSBs), we performed a Comet Assay (single cell gel electrophoresis). As a result, an increased intensity of comet tail was observed in HCT-116DR cells treated with Vectex compared to the head, which indicates the number of DSBs as compared with control cells (FIG. 8).

비텍신의 세포 사멸 효과는 TUNEL 염색과 유세포 분석에 의해 확인되었으며, TUNEL 양성 세포 (세포 사멸)의 점진적 증가가 비텍신 처리 후 관찰되었다.The cytotoxic effect of Vitexin was confirmed by TUNEL staining and flow cytometry, and a gradual increase of TUNEL positive cells (apoptosis) was observed after treatment with bactex.

이러한 결과는 비텍신이 화학내성성 HCT-116DR 세포에서 세포 사멸을 유도함을 시사한다.These results suggest that Vitectin induces apoptosis in chemically resistant HCT-116DR cells.

실시예Example 4:  4: 비텍신(Vitexin)이Vitexin 자가포식(autophagy)을Autophagy 억제하여 세포 사멸을 유도함을 확인 To inhibit cell death.

일부 종전 연구에 따르면 자가포식(autophagy)는 화학 요법 제제로 처리된 종양 세포에서 세포 생존 또는 세포 사멸을 촉진한다. 본 발명자는 HCT-116DR 세포에서 비텍신이 자가포식(autophagy)에 영향을 미치는지 평가하였다.According to some previous studies, autophagy promotes cell survival or apoptosis in tumor cells treated with chemotherapeutic agents. The present inventors evaluated whether vitectin affects autophagy in HCT-116DR cells.

결과, 비텍신 처리는 자가포식 속도와 오토파고좀 (autophagosome) 형성을 감소시키며, 이는 Cyto-ID 및 AO (acridine orange) 염색이 각각 농도 의존적으로 관찰됨으로써 확인된다 (도 4A 및 B).As a result, baptchin treatment reduces the rate of autophagic feeding and autophagosome formation, which is confirmed by the concentration-dependent observation of Cyto-ID and AO (acridine orange) staining, respectively (Figs. 4A and B).

이어서 자가포식 기작에 관여하는 단백질의 발현에 대한 비텍신의 영향을 확인하였다. We next confirmed the effect of vitexin on the expression of proteins involved in autophagic mechanisms.

웨스턴 블롯 분석 결과, 비텍신 처리는 자가포식 마커 단백질인 ATG (autophagy protein) 5와 beclin-1 (BECN1)의 발현을 현저히 감소 시켰고, LC3-1(microtubule-associated protein light chain 3-I) 의 LC3-II로의 전환을 억제하였다 (도 4c).Western blot analysis showed that the treatment of bactexin significantly reduced the expression of ATG (autophagy protein) 5 and beclin-1 (BECN1), an autophagic marker protein, and LC3-1 (microtubule-associated protein light chain 3-I) -II (Fig. 4 (c)).

이러한 결과는 비텍신이 HCT-116DR 세포에서 자가포식(autophagy)를 억제함을 나타내며, 이는 비텍신-매개 세포사멸 (apoptosis) 유도와 관련이 있을 수 있음을 시사한다. These results suggest that Vitectin inhibits autophagy in HCT-116DR cells, suggesting that it may be related to induction of apoptosis in non-texin-mediated cells.

이 억제 효과가 비텍신-매개 세포사멸 (apoptosis)과 관련이 있는지 알아보기 위해 우리는 autophagy 억제제 인 3- 메틸아데닌 (3-methyladenine, 3-MA)을 이용하였다.To investigate whether this inhibitory effect is related to apoptosis, we used an autophagy inhibitor, 3-methyladenine (3-MA).

3-MA와 비텍신의 복합 처리는 3-MA 또는 비텍신 단독 처리한 HCT-116DR 세포에 비하여, HCT-116DR 세포의 생존력을 현저하게 감소시켰다 (도 5A).The combined treatment of 3-MA and Vitexin significantly reduced the viability of HCT-116DR cells compared to 3-MA or non-texin alone treated HCT-116DR cells (Figure 5A).

더욱이, 3-MA와 비텍신의 HCT-116DR 세포에 대한 복합 처리는, 3-MA와 비텍신의 단독 처리에 비하여, caspase-3 및 caspase-9의 절단을 증가시키고 ATG5 및 BECN1의 발현을 억제하며, LC3-I의 LC3-II로의 전환을 억제하였다 (도 5B). 이러한 결과는 자가포식의 억제가 비텍신에 의한 세포자멸 유도에 기여한다는 것을 보여준다.Furthermore, the combined treatment of HCT-116DR cells with 3-MA and Vytexin increases the cleavage of caspase-3 and caspase-9 and inhibits the expression of ATG5 and BECN1, To inhibit the conversion of LC3-I to LC3-II (Fig. 5B). These results show that inhibition of autopoiesis contributes to induction of apoptosis by baptics.

실시예Example 5: 이종 이식 종양 모델에서의  5: In xenograft tumor model 비텍신의Vitech 종양 성장 억제 효과의 확인 Identification of tumor growth inhibitory effect

비텍신은 in vitro에서 세포 생존력을 억제하는 바, 동물 모델 시스템에서의 비텍신의 항종양 효과를 평가하였다. HCT-116DR 세포를 Balb / c 누드 마우스에 피하주사하고, 25 mg/kg 또는 50 mg/kg의 용량으로 비텍신을 경구 투여 하였다.Vitectin inhibited cell viability in vitro and evaluated the antitumor effect of Vitectin in animal model systems. HCT-116DR cells were subcutaneously injected into Balb / c nude mice and orally administered with vitexin at a dose of 25 mg / kg or 50 mg / kg.

그 결과, 비히클 처리군과 비교하여, 비텍신 처리군에서 종양 크기가 현저히 감소됨을 것을 관찰했다 (도 6A). H&E (Hematoxylin & eosin) 염색 역시, 비히클 처리군에 비하여 비텍신 처리군에서 종양 조직에서 관찰된 세포사멸과 관련된 추가적인 병리학적 변화를 나타냈다 (도 6B).As a result, it was observed that the tumor size was significantly reduced in the non-texcin treated group compared to the vehicle treated group (Fig. 6A). H & E (Hematoxylin & eosin) staining also showed additional pathological changes associated with cell death observed in tumor tissues in the non-texin treated group compared to the vehicle treated group (Fig. 6B).

웨스턴 블롯 분석에 의하면 비텍신의 처리는 HSP90과 HSP70, anti apoptotic protein Bcl-2, 자가포식 마커 ATG5의 발현을 감소 시켰을 뿐만 아니라, pro-apoptotic protein BAX의 발현을 증가시켰고 caspase-9와 caspase-3의 절단을 증가시켰다 (도 6C 및 D).Western blot analysis showed that treatment with Vytexin not only reduced the expression of HSP90 and HSP70, anti-apoptotic protein Bcl-2, and autopoetic marker ATG5, but also increased the expression of pro-apoptotic protein BAX and increased expression of caspase-9 and caspase-3 (Fig. 6C and D).

이러한 데이터는 생체 내에서 종양 성장에 대한 비텍신의 억제 효과가 자가포식(autophagy) 억제 및 세포 사멸 (apoptosis)유도에 기인 한 것으로 나타낸다.These data indicate that the inhibitory effect of vytexin on tumor growth in vivo is due to autophagy inhibition and induction of apoptosis.

실시예Example 6: 다양한  6: Various 암세포주의Cancer cell 세포 생존율에 대한  For cell survival rate 비텍신Beatty 처리의 효과 Effect of treatment

다양한 암세포주에 대하여 표시된 농도의 vitexin으로 24 시간 동안 처리하고 세포 생존율을 MTT assay로 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.The cells were treated with various concentrations of vitexin for 24 hours and the cell viability was confirmed by MTT assay. The results are shown in FIG.

도 7 (A)는 다양한 세포주를 표시된 농도의 vitexin으로 24 시간 동안 처리하고 세포 생존력을 MTT assay로 확인한 결과이다 [Cis = Cisplatin; Dox = 도세탁셀]. (B)는 다양한 세포주에 대한 비텍신의 IC50 값을 계산하였다. 데이터는 세 번의 독립적 인 실험 (n = 3)의 평균 ±SD를 나타낸다.Figure 7 (A) shows the results of various cell lines treated with vitexin at the indicated concentrations for 24 hours and cell viability by MTT assay [Cis = Cisplatin; Dox = docetaxel]. (B) calculated IC50 values of vitexin for various cell lines. Data represent the mean ± SD of three independent experiments (n = 3).

도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대장암세포 뿐 아니라 간암 폐암 세포주에 대해서도 세포 생존율을 저하시키는 것을 확인하였으며, 항암제 내성 세포에도 효과를 나타내는 것을 확인하였다.  As can be seen from FIG. 7, it was confirmed that the cell survival rate was lowered not only in the colorectal cancer cells but also in the liver cancer lung cancer cell line, and it was also confirmed to have an effect on the cancer-resistant cells.

Claims (8)

비텍신을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises vithexin as an active ingredient. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 약물 저항성 암인 것인, 약학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the cancer is a drug resistant cancer. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 정상 조직에 비하여 MDR1의 발현이 상향조정된 것인, 약학적 조성물. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the cancer is up-regulated in expression of MDR1 relative to normal tissue. 청구항 3에 있어서, 상기 비텍신은 상기 MDR1의 발현을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.4. The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the biotecin reduces the expression of MDR1. 청구항 1에 있어서, 상기 비텍신은 자가포식 (autophagy) 억제제인 것인, 약학적 조성물.2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the biotecin is an autophagy inhibitor. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 대장암인 것인, 약학적 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the cancer is colon cancer. 비텍신을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.A food composition for prevention or improvement of cancer, which comprises Vitecin as an active ingredient. 비텍신을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물. A feed composition for preventing or ameliorating cancer comprising biotex as an active ingredient.

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