KR20180114032A

KR20180114032A - 저분자 화합물에 의한 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법

Info

Publication number: KR20180114032A
Application number: KR1020187022775A
Authority: KR
Inventors: 다카히로 오치야; 다케시 가츠다
Original assignee: 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터; 사이니티 가부시키가이샤
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-10-17
Also published as: WO2017119512A1; AU2017205801A1; US20190010464A1; ES2908707T3; CN108779439B; PL3401392T3; JPWO2017119512A1; EP3401392A4; US10961507B2; EP3401392A1; CN108779439A; EP3401392B1; SG10202006104YA; JP7063624B2; SG11201805846TA; DK3401392T3; CA3010808A1; RU2018128598A

Abstract

본 발명은, 포유 동물의 간세포에, TGF β 수용체 저해약, 그리고 임의로, 또한 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을, 인비트로로 접촉시키는 것을 포함하는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법을 제공한다.

Description

저분자 화합물에 의한 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법

본 발명은, 저분자 화합물에 의한 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법, 당해 저분자 화합물을 함유하여 이루어지는 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제 등에 관한 것이다.

간세포 생물학의 진보는, 간 재생 의료에 있어서의 그 응용에 대한 큰 관심을 부르고 있지만, 아직 그 실현에는 이르지 못하였다. 가장 기대되는 세포 소스의 하나인 인공 다능성 간세포 (iPS 세포) 는 집중적으로 연구되어 왔지만, 기능적인 간세포로의 효율적인 분화가 곤란한 점이나, 종양 형성 리스크가 여전히 존재하기 때문에, 그 응용은 아직도 한정적이다. 최근 개발된 방법조차, 성숙 간세포에 필적하는 효율로, 상해를 입은 간장을 재생하는 능력을 갖는 간세포를 만들어낼 수 없다 (비특허문헌 1). 한편, 최근의 연구에 의해, 상이한 계보의 세포를 간세포 유사의 세포로 직접 전환 (다이렉틀리 프로그래밍) 할 수 있는 것이 개시되었다 (비특허문헌 2 및 3). 그러한 유망한 지견에도 불구하고, 다이렉틀리 프로그래밍은, iPS 세포의 경우와 마찬가지로 유전자 개변을 수반하기 때문에, 예기치 못한 리스크가 여전히 존재하여, 재생 의료에 응용하지 못하고 있다.

최근, 몇개의 그룹이, 간장이 만성적으로 상해를 입으면, 성체 간세포는 증식성 또한 양능성의 간 줄기/전구세포로 리프로그램할 수 있다고 하는 놀랄만한 발견을 보고하였다 (비특허문헌 4 및 5). 이러한 혁신적인 발견들은, 간 줄기세포 이론뿐만 아니라, 간 재생 연구에도 커다란 통찰을 주는 것이다. 즉, 이와 같은 리프로그래밍을 인비트로로 재현할 수 있으면, 그렇게 해서 얻어지는 간 줄기/전구세포는, 간 재생 의료에 있어서의 새로운 세포 소스가 될 것으로 기대된다.

그러나, 유전자 개변을 수반하지 않고, 성숙 간세포를 간 줄기/전구세포로 리프로그램하는 방법은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자들이나 다른 그룹은 이전, 어떤 종류의 저분자 저해약의 조합이, 간세포의 다능성의 유도 및 유지에 기여하는 것을 보고하였다 (비특허문헌 6 및 7). 그러나, 이들 저분자 저해약의, 성숙 간세포로부터 간 줄기/전구세포로의 리프로그래밍에 대한 기여에 관한 보고는 전무하다.

Zhu, S. et al., Nature 508, 93-97 (2014) Huang, P. et al., Nature 475, 386-389 (2011) Sekiya, S., and Suzuki, A. Nature 475, 390-393 (2011) Tarlow, B. D. et al., Cell Stem Cell 15, 605-618 (2014) Yanger, K. et al., Genes Dev. 27, 719-724 (2013) Hou, P. et al., Science 341, 651-654 (2013) Kawamata, M. and Ochiya, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 14223-14228 (2010)

본 발명의 목적은, 유전자 개변을 수반하지 않고, 성숙 간세포를 간 줄기/전구세포로 효율적으로 리프로그램하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, TGF β 수용체 저해약의 존재하에서 포유 동물의 성숙 간세포를 배양하면, 그 세포를, 증식성이면서 또한 간세포와 담관 상피세포의 어느 쪽으로도 분화할 수 있는 양능성의 세포로 리프로그램할 수 있음을 알아내었다. 또한, TGF β 수용체 저해약에, 글리코겐 합성 효소 키나아제 3 (GSK3) 저해약 또는 Rho 키나아제 (ROCK) 저해약을 조합하여 사용함으로써, 리프로그래밍 효율을 개선하는 것에 성공하였다. 리프로그래밍 효율 개선 효과는, TGF β 수용체 저해약에 GSK3 저해약을 조합한 경우에 보다 현저하였다. TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 3 제를 병용한 경우, TGF β 수용체 저해약과 GSK3 저해약을 조합한 경우와 리프로그래밍 효율에 큰 차이는 보이지 않았지만, 3 제를 병용하는 쪽이 세포의 증식능이 우수한 것이 분명해졌다. 이와 같이 하여 얻어진 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포는, 만성 간 상해를 가진 면역 부전 마우스에 이식하면, 성숙 간세포와 동등한 간 재생능을 나타냈다.

본 발명자들은 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 다음과 같다.

(1) 포유 동물의 간세포에, 인비트로로 TGF β 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.

(2) 추가로, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을, 인비트로로 상기 간세포에 접촉시키는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 방법.

(3) 추가로, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을, 인비트로로 상기 간세포에 접촉시키는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 방법.

(4) 상기 간세포와 상기 TGF β 수용체 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재하에서 그 간세포를 배양함으로써 실시되는, (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(5) 상기 간세포와 상기 GSK3 저해약 및/또는 상기 ROCK 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재하에서 그 간세포를 배양함으로써 실시되는, (2) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(6) 포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스인, (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7) TGF β 수용체 저해약을 함유하여 이루어지는, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.

(8) GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는, (7) 에 기재된 제.

(9) GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는, (7) 에 기재된 제.

(10) 간세포가 인간, 래트 또는 마우스 유래인, (7) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 제.

(11) 이하의 특징을 갖는 포유 동물의 간세포 유래의 간 줄기/전구세포.

(a) 자기 재생능을 갖는다

(b) 간세포 및 담관 상피세포의 양방으로 분화할 수 있다

(c) 표면 항원 마커로서 EpCAM 을 발현하지만, Dlk1 을 발현하지 않는다.

(12) (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포의 유지·증폭제로서 사용되는, (7) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 제.

(13) (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포의 유지·증폭 방법으로서,

(i) 제 1 - 제 4 계대까지는 콜라겐 또는 매트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서,

(ii) 제 5 계대 이후에는 매트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서,

TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서, 그 간 줄기/전구세포를 계대 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.

(14) (1) ∼ (6) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포로부터의 담관 상피세포의 유도 방법으로서,

(i) 저밀도의 피더세포 상, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서 그 간 줄기/전구세포를 배양하는 공정, 및

(ii) 공정 (i) 에서 얻어진 세포를, 매트리겔을 함유하는 배지 중에서 추가로 배양하는 공정

을 포함하는, 방법.

(15) 피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법으로서,

(i) (1) ∼ (6) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포로부터 분화 유도된 간세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및

(ii) 그 간세포에 있어서의 피검 화합물의 대사를 측정하는 공정

을 포함하는, 방법.

(16) 포유 동물에 대한 피검 화합물의 간 독성을 평가하는 방법으로서,

(ii) 그 간세포의 장해의 유무 또는 그 정도를 측정하는 공정

을 포함하는, 방법.

(17) (1) ∼ (6) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포를 함유하여 이루어지는, 간 장해 개선제.

(18) 포유 동물에 있어서의 간 장해의 개선 방법으로서, 간 장해를 갖는 포유 동물에, (1) ∼ (6) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.

(19) 간 장해 개선제로서 사용하기 위한 (1) ∼ (6) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 (11) 에 기재된 간 줄기/전구세포.

본 발명에 의하면, 유전자 개변을 수반하지 않고, 간세포로부터, 자기 복제능과 간세포 및 담관 상피세포로의 분화능 (양능성) 을 갖는 간 줄기/전구세포를, 안전하고 신속하게 유도할 수 있다.

도 1 은, 초대 래트 성숙 간세포로부터 간 줄기/전구세포로의 리프로그래밍에 미치는 TGF β 수용체 저해약 (A), GSK3 저해약 (C), ROCK 저해약 (Y) 및 MEK 저해약 (P) 의 여러 가지 조합의 효과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, YAC 의 존재하 및 비존재하에서 배양한 초대 래트 성숙 간세포의 증식성을 나타내는 도면이다.
도 3 은 YAC 의 존재하 및 비존재하에서 배양한 초대 래트 성숙 간세포에 있어서의 N/C 비, 간 줄기/전구세포 마커의 발현을 나타내는 도면이다.
도 4 는 래트 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포가 기능적인 간세포로의 재분화능을 갖는 것을 나타내는 도면이다.
도 5 는 래트 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포가 기능적인 간세포로의 재분화능을 갖는 것을 나타내는 유전자 클러스터링 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 래트 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포가 기능적인 담관 상피세포로의 재분화능을 갖는 것을 나타내는 도면이다.
도 7 은 래트 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포가 증식능 및 간세포로의 재분화능을 상실하지 않고 장기 계대 가능한 것을 나타내는 도면이다.
도 8 은 래트 성숙 간세포 유래의 간 줄기/전구세포를 이식한 마우스 간 장해 모델에 있어서의 간 재생 효과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 YAC 자극에 의한, 동결 래트 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 유도를 나타내는 도면이다.
도 10 은 YAC 자극에 의한, 인간 동결 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 유도를 나타내는 도면이다.
도 11 은 인간 동결 간세포 유래의 간 줄기/전구세포를 계대 배양한 결과를 나타내는 도면이다.

1. 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 유도

본 발명은, 포유 동물의 간세포에, TGF β 수용체 저해약을 적어도 포함하는 1 이상의 저분자 시그널 전달 경로 저해약을, 인비트로로 접촉시키는 것을 포함하는, 그 성숙 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법 (「본 발명의 리프로그래밍법」이라고도 한다) 을 제공하는 것이다.

본 발명의 리프로그래밍법의 출발 재료로서 사용되는 「간세포」는, 간세포 마커 유전자 (예를 들어, 알부민 (ALB), 트랜스타이레틴 (TTR), 글루코오스-6-포스파타아제 (G6PC), 티로신아미노트랜스페라아제 (TAT), 트립토판-2,3-디옥시게나아제 (TDO2), cytochrome P450 (CYP), miR-122 등) 의 적어도 1 종 (바람직하게는 ALB, TTR, G6PC, TAT, TDO2 및 CYP 로부터 선택되는 2 종 이상, 보다 바람직하게는 3 종 이상, 더욱 바람직하게는 4 종 이상, 특히 바람직하게는 5 종 이상, 가장 바람직하게는 6 종 전부) 를 발현하고 있는 세포를 말한다. 그 간세포는 기능적인 것이 바람직하다. 「기능적」인 간세포란, (i) 모세 담관 구조를 갖고, 약물 대사물을 당해 소관에 축적하거나, (ii) 세포막에 ABC 트랜스포터 (예, MDR1, MRP 등) 를 발현하거나, (iii) ALB 의 분비 발현, (iv) 글리코겐 축적, (v) 약물 대사 효소 (예, CYP1A1, CYP1A2 등) 활성에서 선택되는 1 이상, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 3 이상, 더욱 바람직하게는 4 이상, 가장 바람직하게는 모든 기능을 유지한 간세포를 말한다.

본 발명의 리프로그래밍법에 사용하는 간세포는, 상기 간세포 마커 유전자의 발현에 의해 특징지을 수 있는 것이면, 어떠한 소스로부터 제공되어도 되고, 예를 들어, 포유 동물 (예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 말, 돼지, 소, 원숭이 등, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스) 의 배성 줄기세포 (ES 세포) 혹은 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포로부터, 자체 공지된 분화 유도 방법 (예를 들어, 상기 비특허문헌 1) 에 의해 얻어진 간세포나, 혹은 섬유아세포로부터 다이렉틀리 프로그래밍에 의해 유도된 간세포 (상기 비특허문헌 2 및 3) 등도 포함될 수 있다. 그러나, 유전자 개변을 수반하지 않는 간 줄기/전구세포를 안전하고 신속하게 제공한다는 본 발명의 주된 과제를 고려하면, 간세포로서, 포유 동물로부터 적출한 간장으로부터 단리 정제된 간세포를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 래트의 경우, 10 - 20 주령의 성체 래트로부터 적출한 간장을 사용하는 것이 바람직하지만, 2 개월령 이하의 유약 (幼若) 래트 유래의 간장을 사용해도 된다. 인간의 경우, 외과 수술에 의해 절제한 성인의 간장 조직편을 사용하는 것이 바람직하지만, 사망 태아로부터 절제한 간장을 사용해도 된다. 혹은, 이들 적출한 간장으로부터 단리 정제된 간세포를 동결시킨 세포 (동결 간세포) 를 사용할 수도 있다.

포유 동물의 간장 혹은 그 조직편으로부터 간세포를 정제하는 방법으로는, 관류법 (「배양 세포 실험 핸드북」 (요우도샤, 2004년) 등) 을 들 수 있다. 즉, 문맥 (門脈) 을 통해서 EGTA 액으로 예비 관류한 후, 콜라게나아제나 디스파제 등의 효소 용액 (행크스액 등) 으로 관류하여 간장을 소화하고, 여과, 저속 원심 등에 의해 세포편이나 비실질 세포를 제거하여 간세포를 정제한다.

상기와 같이 하여 조제된 간세포에, TGF β 수용체 저해약을 포함하는 1 이상의 저분자 시그널 전달 경로 저해약을, 인비트로로 접촉시킨다.

본 발명에 사용되는 TGF β 수용체 저해약으로는, 트랜스포밍 증식 인자 (TGF) β 수용체의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘, 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카르바모일-1H-피라졸 (A-83-01), 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)프테리딘-4-일)피리딘-4-일아민 (SD-208), 3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)]-1H-피라졸, 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프틸리딘 (이상, 머크사), SB431542 (Sigma Aldrich 사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 A-83-01 을 들 수 있다. TGF β 수용체 저해약에는, TGF β 수용체 안타고니스트도 포함된다.

이들 TGF β 수용체 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.

TGF β 수용체 저해약 이외의 저분자 시그널 전달 경로 저해약으로는, 바람직하게는 GSK3 저해약과 ROCK 저해약을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 GSK3 저해약으로는, 글리코겐 합성 효소 키나아제 (GSK) 3 의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, SB216763 (Selleck 사), CHIR98014, CHIR99021 (이상, Axon medchem 사), SB415286 (Tocris Bioscience 사), Kenpaullone (코스모·바이오사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 CHIR99021 을 들 수 있다.

이들 GSK3 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.

본 발명에 사용되는 ROCK 저해약으로는, Rho 결합 키나아제의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. ROCK 저해약으로는, 예를 들어, GSK269962A (Axon medchem 사), 파수딜하이드로클로라이드 (Fasudil hydrochloride) (Tocris Bioscience 사), Y-27632, H-1152 (이상, 와코 순약 공업사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Y-27632 를 들 수 있다.

이들 ROCK 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, GSK3 저해약과 ROCK 저해약은, 각각 단독으로 간세포에 접촉시켜도, 거의 간 줄기/전구세포를 유도할 수 없지만, TGF β 수용체 저해약과 함께 GSK3 저해약을 간세포에 접촉시키면, TGF β 수용체 저해약만을 접촉시킨 경우와 비교하여, 간 줄기/전구세포의 유도 효율 (「리프로그래밍 효율」이라고도 한다) 이 현저하게 상승한다. 또, TGF β 수용체 저해약과 함께 ROCK 저해약을 간세포에 접촉시킨 경우도, TGF β 수용체 저해약만을 접촉시킨 경우와 비교하여, 리프로그래밍 효율은 상승한다. 따라서, 본 발명의 리프로그래밍법에 있어서는, TGF β 수용체 저해약에 더하여, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을 추가로 간세포에 접촉시키는 것이 바람직하다. 특히, TGF β 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 를 사용하고, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 를 조합하는 것 (AC), TGF β 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 를 사용하고, ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 를 조합하는 것 (YA), TGF β 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 를 사용하고, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 및 ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 를 조합하는 것 (YAC) 이 바람직하다.

TGF β 수용체 저해약에 GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 조합하여 사용한 경우, TGF β 수용체 저해약과 GSK3 저해약을 조합하여 사용한 경우와 비교하여, 리프로그래밍 효과에는 큰 차이는 인정되지 않지만, 전자가, 후자에 비해 얻어지는 간 줄기/전구세포의 증식능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 있어서는, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 간세포에 접촉시킨다.

본 발명의 리프로그래밍법에 있어서는, GSK3 저해약, ROCK 저해약 이외의 저분자 시그널 전달 경로 저해약을 TGF β 수용체 저해약과 조합할 수도 있다. 그러한 저해약으로는, 예를 들어 MEK 저해약 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. MEK 저해약으로는, MEK (MAP kinase-ERK kinase) 의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, AZD6244, CI-1040 (PD184352), PD0325901, RDEA119 (BAY869766), SL327, U0126 (이상, Selleck 사), PD98059, U0124, U0125 (이상, 코스모·바이오사) 등을 들 수 있다.

본 발명의 리프로그래밍법에 있어서, 간세포와 TGF β 수용체 저해약을 포함하는 저분자 시그널 전달 경로 저해약의 접촉은, 이들 저해약의 존재하에서 간세포를 배양함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는, 배지 중에 유효한 농도로 이들 저해약을 첨가하여 배양을 실시한다. 여기서 배지로는, 넓게 동물세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 이용할 수 있다. 시판되고 있는 기초 배지를 이용해도 되며, 그것들로는, 예를 들어, 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코 개변 최소 필수 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, Ham's F12 배지, William's E 배지 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있지만, 이들에 특별히 한정되지 않는다. 배지로의 첨가제로는, 예를 들어, 각종 아미노산 (예를 들어, L-글루타민, L-프롤린 등), 각종 무기염 (아셀렌산염, NaHCO₃ 등), 각종 비타민 (니코틴아미드, 아스코르브산 유도체 등), 각종 항생 물질 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등), 항진균제 (예를 들어, 암포테리신 등), 완충제 (HEPES 등) 등을 들 수 있다.

또, 배지에는, 5 - 20 ％ 의 혈청 (FBS 등) 을 첨가할 수도 있지만, 무혈청 배지여도 된다. 무혈청 배지의 경우, 혈청 대체물 (BSA, HAS, KSR 등) 을 첨가해도 된다. 또한, 통상, 증식 인자, 사이토카인, 호르몬 등의 인자가 첨가된다. 이들 인자로는, 예를 들어 상피 증식 인자 (EGF), 인슐린, 트랜스페린, 간세포 증식 인자 (HGF), 온코스타틴 M (OsM), 히드로코르티손 21-헤미호박산 또는 그 염, 덱사메타손 (Dex) 등을 들 수 있지만, 그것들로 한정되지 않는다.

TGF β 수용체 저해약의 배지에 대한 첨가 농도는, 예를 들어, 0.01 - 10 μM, 바람직하게는 0.1 - 1 μM 의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다.

GSK3 저해약의 배지에 대한 첨가 농도는, 예를 들어, 0.01 - 100 μM, 바람직하게는 1 - 10 μM 의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다.

ROCK 저해약의 배지에 대한 첨가 농도는, 예를 들어, 0.0001 - 500 μM, 바람직하게는 1 - 50 μM 의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다.

이들 저해약이 수불용성 혹은 수난용성의 화합물인 경우, 소량의 저독성 유기 용매 (예를 들어, DMSO 등) 에 용해시킨 후, 상기한 최종 농도가 되도록 배지에 첨가하면 된다.

당해 배양에 사용되는 배양 용기는, 접착 배양에 적절한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샤알레, 튜브, 트레이, 배양 백 등을 들 수 있다. 배양 용기는, 내표면이, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적에서 세포 지지용 기질에 의해 코팅된 것을 사용할 수 있다. 그러한 세포 지지용 기질로는, 예를 들어, 콜라겐, 젤라틴, 매트리겔, 폴리-L-리신, 라미닌, 피브로넥틴 등을 들 수 있다. 바람직하게는 콜라겐 또는 매트리겔을 들 수 있다.

간세포는, 10²- 10⁶ 세포/㎠, 바람직하게는 10³- 10⁵ 세포/㎠ 의 세포 밀도로 배양 용기 상에 파종할 수 있다. 배양은, CO₂ 인큐베이터 중, 1 - 10 ％, 바람직하게는 2 - 5 ％, 보다 바람직하게는 약 5 ％ 의 CO₂ 농도의 분위기하에서, 30 - 40 ℃, 바람직하게는 35 - 37.5 ℃, 보다 바람직하게는 약 37 ℃ 에서 실시할 수 있다. 배양 기간으로는, 예를 들어 1 - 4 주간, 바람직하게는 1 - 3 주간, 보다 바람직하게는 약 2 주간을 들 수 있다. 1 - 3 일마다 신선한 배지로 교환한다.

상기와 같이 하여, 간세포를 TGF β 수용체 저해약, 그리고 임의로 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약에 접촉시킴으로써, 간세포를 간 줄기/전구세포로 리프로그램할 수 있다. 성숙 간세포는 인비트로에서는 증식하지 않는다고 일반적으로 생각되고 있지만, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 예를 들어, TGF β 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 를 이용하고, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 및 ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 를 조합하여 (YAC), 래트 초대 성숙 간세포를 배양한 경우, 2 주간의 배양에 의해 약 15 배로 증식하는 것이 분명해졌다. 또, 저밀도 (1×10² 세포/㎠) 로 파종한 래트 초대 성숙 간세포를 YAC 존재하에서 배양하여, 저속도 촬영으로 단일 세포마다의 증식을 조사한 결과, YAC 와의 접촉 개시 후 2 일째부터 6 일째까지의 5 일간의 배양 동안에, 5 세포 이상으로 증식한 단일 세포의 비율은 약 25 ％ 로, YAC 비존재하에서 배양한 경우의 약 1.4 ％ 에 비해 현저하게 증가하였다.

본 명세서에 있어서 「간 줄기/전구세포」 (「LSC」라고도 한다) 란, (a) 자기 재생능을 갖고, 또한 (b) 간세포 및 담관 상피세포의 양방으로 분화할 수 있는 양능성을 갖는 세포를 의미한다. 여기서 「담관 상피세포」 (「BEC」라고도 한다) 란, BEC 마커인 사이토케라틴 19 (CK19) 및 GRHL2 를 발현하는 세포를 말한다. 태아 간장의 간 아세포나, 간 장해시에 출현하는 오벌 세포도 간 줄기/전구세포 (LSC) 에 포함된다.

바람직한 일 실시 양태에 있어서, 본 발명의 리프로그래밍 방법에 의해 얻어지는 LSC 는, 상기 (a) 및 (b) 의 성질에 더하여, 종래 공지된 LSC 와 마찬가지로, (c) 표면 항원 마커로서 상피세포 접착 분자 (EpCAM) 를 발현하지만, 다른 기지의 LSC 에서 발현되어 있는 델타호모로그 1 (Dlk1)을 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 LSC 는 신규 LSC 라고 말할 수 있다. 또, 일 실시 양태에 있어서, 본 발명의 LSC 는, 이미 알려진 LSC 마커인 류신 리치리피트 함유 G 단백질 공액 수용체 5 (LGR5) 나 FoxL1 도 발현하지 않는다.

본 발명의 LSC 는, 추가로 이하의 특징 중 1 이상을 갖는다.

(d) 적어도 10 계대, 바람직하게는 20 계대 이상, 외관상의 증식 속도가 저하되지 않는다

(e) 적어도 10 계대, 바람직하게는 20 계대 이상, 간세포 및 BEC 로의 분화능을 유지한다

(f) 간세포와 비교하여 핵/세포질 (N/C) 비가 높다

(g) α-페토프로테인 (AFP), SRY-박스 (Sox) 9, EpCAM, Thy-1/CD90, 간세포 핵내 인자 1 호메오박스 B (HNF1β), 포크헤드박스 J1 (FoxJ1), HNF6/one cut-1 (OC1), CD44, 인테그린 α-6 (A6) 및 CK19 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 LSC 마커 유전자의 발현이, 간세포와 비교해 상승하고 있다

(h) AFP, CD44, EpCAM, CK19, Sox9, A6 및 CD90 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 단백질의 발현이, 간세포와 비교해 상승하고 있다

바람직한 실시양태에 있어서는, 본 발명의 LSC 는, 상기 (d) ∼ (h) 의 특징을 모두 갖는 것이다.

이상과 같이, 간세포를 TGF β 수용체 저해약, 바람직하게는 추가로 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약에 접촉시킴으로써, 그 간세포로부터 LSC 를 유도할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, TGF β 수용체 저해약을 함유하여 이루어지는, 간세포로부터의 LSC 유도제를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 LSC 유도제는, TGF β 수용체 저해약에 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는 병용제이고, 보다 바람직하게는, TGF β 수용체 저해약에 GSK3 저해약과 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는 병용제이다.

TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약은 그대로 LSC 유도제로서 사용할 수 있지만, 적당한 용매에 용해하여 액제로 할 수도 있다. 혹은, 이들 저해약은, 상기한 간세포로부터 LSC 를 유도용 배지와 조합하여 키트화할 수도 있다.

2. LSC 의 유지·증폭

상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 LSC 는,

각각 TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서 계대 배양함으로써, 효율적으로 유지·증폭시킬 수 있다.

배양 용기로는, 간세포로부터의 LSC 의 유도에 사용한 것과 동일한 배양 용기를 사용할 수 있다. 제 1 - 제 4 계대용의 배양 용기는, 콜라겐 또는 매트리겔로 코팅한다.

상기와 같이 하여 얻어진 초대 LSC를, 70 - 100 ％ 컨플루언트에 도달한 단계에서, 상기 콜라겐 또는 매트리겔 코팅한 배양 용기 상에, 10³- 10⁵ 세포/㎠ 의 밀도로 파종한다. 배지로는, LSC 의 유도 배양에 관해서 상기한 배지를 동일하게 사용할 수 있다. TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약의 첨가 농도도, LSC 의 유도 배양에 관해서 상기한 농도 범위로부터 적절히 선택할 수 있다. 배양 온도, CO₂ 농도도 LSC 유도 배양의 조건에 준한다. 70 - 100 ％ 컨플루언트에 도달한 단계에서, 세포를 트립신 처리하여 해리시키고, 계대를 실시한다.

제 5 계대 이후에는 매트리겔 코팅한 배양 용기를 사용한다. 5 - 8 계대 정도에서 안정적인 LSC 를 얻을 수 있다. 10 계대 이상 계대한 후에, 통상적인 방법에 의해 클론화를 실시할 수 있다.

상기와 같이, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약은, LSC 의 유도 배양뿐만 아니라, 유지·증폭 배양에 있어서도 배지에 첨가된다. 따라서, 본 발명은 또한, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약을 함유하여 이루어지는 LSC 의 유지·증폭제를 제공한다.

3. LSC 로부터 간세포로의 재분화

LSC 로부터 간세포로의 재분화 유도는, 자체 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 온코스타틴 M (OsM), 덱사메타손 (Dex), 간세포 증식 인자 (HGF) 등을 첨가한 배양액으로 배양하는 방법 (Journal of Cellular Physiology, Vol.227 (5), p.2051-2058 (2012) ; Hepatology, Vol.45 (5), p.1229-1239 (2007)), 매트리겔 중층법을 조합한 방법 (Hepatology 35, 1351-1359 (2002)) 등을 들 수 있다. 간세포로의 분화 유도용 배지에는, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약을 첨가해도 되고 하지 않아도 되지만, 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 LSC 를 분화 유도함으로써 얻어진 간세포는, 성숙 간세포에 전형적인 모세 담관 유사 구조를 갖고, 당해 소관 중에 약물 대사물을 축적할 수 있다. 또, 세포막에 있어서, MRP2 단백질 등의 ABC 트랜스포터를 발현한다. 그리고, 알부민의 분비 발현, 글리코겐의 축적, 시토크롬 p450 (chytochrome p450, CYP) 약물 대사 효소 활성 등의 일련의 간 기능을 발휘할 수 있다. 즉, 본 발명의 LSC 는, 기능적인 간세포로 재분화할 수 있다.

4. LSC 로부터 BEC 로의 분화 유도

LSC 로부터 BEC 로의 분화 유도는, 자체 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 겔을 사용하여, EGF, 인슐린 유사 증식 인자 2 (IGF2) 를 포함하는 배지 중에서 배양하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명자들은, 담관 유사 구조를 형성하도록 본 발명의 LSC 를 양호한 재현성으로 분화시키는 방법을 새롭게 알아냈다. 따라서, 본 발명은 또한, LSC 로부터 BEC 를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 BEC 유도법은,

(i) 저밀도의 피더세포 상, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서, 본 발명의 LSC 를 배양하는 공정, 그리고

(ii) 공정 (i) 에서 얻어진 세포를, 매트리겔을 함유하는 배지 중에서 다시 배양하는 공정을 포함한다.

공정 (i) 에 있어서 사용되는 피더세포는 특별히 한정되지 않고, 유지 배양을 보조할 목적으로 통상적으로 사용되는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 태아 유래 섬유아세포 (MEF), STO 세포 (ATCC, CRL-1503) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 MEF 이다.

여기서 「저밀도」란, 유지 배양을 보조할 목적으로 통상적으로 사용되는 세포 밀도보다 저밀도인 것을 의미하고, 예를 들어 1×10³ - 5×10⁴ 세포/㎠, 바람직하게는 5×10³ - 3×10⁴ 세포/㎠ 의 범위의 세포 밀도를 들 수 있다. 피더세포를 파종하는 배양 용기는, 콜라겐이나 젤라틴 등의 세포 지지용 기질로 코팅한 것이 사용된다. 초대 혹은 계대 배양된 본 발명의 LSC 를, 트립신 처리하여 해리시키고, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 함유하는 배지에 재현탁하여, 상기 피더세포 상에 10⁴- 10⁵ 세포/㎠ 의 세포 밀도로 파종한다. 배지에는, 필요에 따라서 혈청을 첨가해도 된다. 다음날, 배지를 mTeSR^TM1 (Stemcell Technologies) 과 같은 다능성 간세포의 유지 배지로 치환하고, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서, 3 - 10 일간, 바람직하게는 4 - 8 일간 배양한다. 1 - 3 일마다 신선한 배지로 교환한다. 그 후, 배지를 매트리겔을 함유하는 배지로 치환하고, 다시 3 - 10 일간, 바람직하게는 4 - 8 일간 배양한다. 1 - 3 일마다 신선한 배지로 교환한다. 매트리겔의 배지에 대한 첨가 농도는, 1 - 5 ％, 바람직하게는 1 - 3 ％ 의 범위에서 적절히 선택할 수 있다. 합계 1 - 3 주간 정도의 배양에 의해, 담관 유사 구조가 형성되고, 세포는 BEC 마커인 CK19 및 GRHL2 를 고레벨로 발현한다. 그리고, AQP1 이나 AQP9 등의 아쿠아포린이나 CFTR 및 AE2 등의 이온 채널의 유전자 및 단백질 발현이 상승한다. 또, 관 구조의 내강에 밀착 결합 마커인 ZO-1 의 강발현이 인정된다. 그리고, 그 세포는 물 수송능이나, 내강 내에 약물 대사물을 수송·축적하는 능력을 갖는 점에서, 본 발명의 LSC 는, 기능적인 BEC 로 분화될 수 있다.

5. 본 발명의 LSC 의 용도

상기 3. 에 기재된 바와 같이 하여 본 발명의 LSC 로부터 재분화된 간세포는, 예를 들어, 피검 화합물의 대사나 간 독성의 평가 등에 이용할 수 있다.

피검 화합물의 대사나 간 독성의 평가에는, 종래, 동물 모델 등이 이용되고 있었지만, 한번에 평가할 수 있는 피검 화합물의 수에 제한이 있고, 또 동물 모델 등에서 얻어진 평가를 그대로 인간에게 적용할 수 없다는 문제가 있었다. 그 때문에, 인간 간암 세포주나 초대 정상 인간 배양 간세포를 사용하는 평가 방법이 채용되고 있다. 그러나, 인간 간암 세포주는 암 세포이기 때문에, 인간 간암 세포주에서 얻어진 평가를 인간 정상 간세포에 적용할 수 없다고 하는 가능성이 남는다. 또, 초대 정상 인간 배양 간세포는 안정 공급이나 비용의 면에서의 문제가 있다. 또, 초대 정상 인간 배양 간세포를 불사화한 세포주는, 불사화하지 않은 경우와 비교하여, CYP3A4 의 활성이 저하되어 있음이 나타나 있다 (International Journal of Molecular Medicine 14 : 663-668, 2004, Akiyama I. et al.). 본 발명의 방법에 의해 제조된 간세포를 이용함으로써, 이와 같은 문제를 해결할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 피검 화합물의 대사를 평가하는 방법을 제공한다. 그 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 간세포에 피검 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 간세포에 접촉시킨 피검 화합물의 대사를 측정한다.

본 발명에서 사용하는 피검 화합물로는, 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 생체 이물질, 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드 등의 단일 화합물, 그리고, 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 세포 추출물, 세포 배양 상청, 발효 미생물 산생물, 해양 생물 추출물, 식물 추출물 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

생체 이물질로는, 예를 들어 약제나 식품의 후보 화합물, 기존의 약제나 식품을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니고, 생체에 있어서 이물질인 한, 본 발명의 생체 이물질에 포함된다. 보다 구체적으로는, 리팜핀 (Rifampin), 덱사메타손 (Dexamethasone), 페노바르비탈 (Phenobarbital), 시글리타존 (Ciglirazone), 페니토인 (Phenytoin), 에파비렌즈 (Efavirenz), 심바스타틴 (Simvastatin), β-나프토플라본 (β-Naphthoflavone), 오메프라졸 (Omeprazole), 클로트리마졸 (Clotrimazole), 3-메틸콜란트렌 (3-Methylcholanthrene) 등을 예시할 수 있다.

간세포와 피검 화합물의 접촉은, 통상, 배지나 배양액에 피검 화합물을 첨가함으로써 실시하지만, 이 방법으로 한정되지 않는다. 피검 화합물이 단백질 등인 경우에는, 그 단백질을 발현하는 DNA 벡터를 그 세포에 도입함으로써, 접촉을 실시할 수도 있다.

피검 화합물의 대사는, 당업자에게 주지된 방법으로 측정하는 것이 가능하다. 예를 들어 피검 화합물의 대사 산물이 검출된 경우에, 피검 화합물이 대사되었다고 판정된다. 또, 피검 화합물의 접촉에 의해, CYP (시토크롬 p450), MDR, MRP 등의 효소 유전자의 발현이 유도된 경우나, 이들 효소의 활성이 상승한 경우에, 피검 화합물이 대사되었다고 판정된다.

또 본 발명은, 피검 화합물의 간 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 그 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 간세포에 피검 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 피검 화합물을 접촉시킨 간세포의 장해의 정도를 측정한다. 장해의 정도는, 예를 들어 간세포의 생존률이나 GOT 나 GPT 등의 간 장해 마커를 지표로 측정할 수 있다.

예를 들어, 간세포의 배양액에 피검 화합물을 첨가함으로써, 간세포의 생존률이 저하되는 경우, 그 피검 화합물은 간 독성을 갖는다고 판정되고, 생존률에 유의한 변화가 없는 경우, 그 피검 화합물은 간 독성을 갖지 않는다고 판정된다. 또, 예를 들어, 간세포의 배양액에 피검 화합물을 첨가 후, 배양액 중의 GOT 나 GPT 가 상승하는 경우, 그 피검 화합물은 간 독성을 갖는다고 판정되고, GOT 나 GPT 에 유의한 변화가 없는 경우, 그 피검 화합물은 간 독성을 갖지 않는다고 판정된다.

또한, 이미 간 독성의 유무가 판명되어 있는 화합물을 대조로서 사용함으로써, 보다 정확하게, 피검 화합물이 간 독성을 갖는지 여부를 평가할 수 있다.

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 LSC 를 만성적인 간 장해를 갖는 면역 부전 마우스에 이식함으로써, 초대 성숙 간세포를 이식한 경우와 동등한 간 재생능을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 LSC 를 함유하여 이루어지는, 간 장해 개선제를 제공한다.

본 발명의 LSC 는, 필요에 따라서 표면 항원 마커인 EpCAM 에 대한 항체를 사용하여 플로 사이토메트리에 의해 정제하여 사용할 수 있다. LSC 는 적당한 등장 완충액 (예를 들어, PBS) 에 현탁하여 제제화할 수 있다. 필요에 따라서, 의약상 허용되는 첨가물을 추가로 함유시킬 수 있다. 그 LSC 현탁액은, 간 질환의 종류, 간 장해의 중독도 (重篤度) 등에 따라서도 상이한데, 예를 들어 성인의 경우, 10⁸- 10¹¹ 세포를 문맥내 투여, 비장내 투여 등에 의해 이식할 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 하등 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 순서

성숙 간세포의 단리

10 - 20 주령의 암컷 Wistar 래트 (닛폰 쿠레아, 시즈오카) 로부터, Seglen 의 수법을 사용하여 성체 래트 간세포를 단리하였다. 요약하면, 문맥을 통해서 Ca²⁺ 비함유 행크스/EGTA 용액으로 예비 관류 후, 간장을 0.05 ％ 콜라게나아제 함유 행크스액 약 400 ㎖ 에 의해, 25 - 30 ㎖/분으로 관류하였다. 적출한 간장을 가위로 기계적으로 소화시키고, 다시 0.025 ％ 콜라게나아제 용액 중, 37 ℃ 에서 15 분 소화시켰다. 이어서, 소화시킨 간장을 멸균한 코튼 메시로 2 회 여과하고, 57 g 으로 1 분간 원심 분리하여 세포 현탁액을 회수하였다. 세포 현탁액을 60 ㎛ 스테인리스 이중 메시 셀 스트레이너 (이케모토 이화 공업, 토쿄) 로 여과함으로써, 비소화 세포괴를 제거하고, 57 g 으로 1 분간 원심 분리하여 통과액을 회수하였다. 퍼콜 (GE 헬스 케어) 을 사용해서, 57 g 으로 10 분간 원심 분리하여 죽은 세포를 제거한 후, 57 g 으로 2 분간의 원심 분리에 의해 세포를 E-MEM 으로 2 회 세정하였다. 이렇게 해서 정제된 간세포를 여러 가지 실험에 사용하였다.

성숙 간세포의 초대 배양

성숙 간세포 배양용의 기본 배지로서, 소형 간세포 배양 배지 (SHM), 즉, 5 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO), 30 ㎎/ℓ L-프롤린 (Sigma), 0.05 ％ BSA (Sigma), 10 ng/㎖ 상피세포 증식 인자 (Sigma), 인슐린-트랜스페린-세린 (ITS)-X (Lifetechnologies), 10^-7 M 덱사메타손 (Dex), 10 mM 니코틴아미드 (Sigma), 1 mM 아스코르브산2-인산에스테르 (와코 순약, 토쿄) 및 항생 물질/항진균약 용액 (100 U/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 mg/㎖ 암포테리신 B) (Lifetechnologies) 를 첨가한, 2.4 g/ℓ NaHCO₃ 및 L-글루타민 함유 DMEM/F12 (Lifetechnologies, Carlsbad, CA) 를 사용하였다. 정제한 신선한 래트 성숙 간세포를, 이하의 4 개의 저분자 저해약 : 10 μM Y-27632 (WAKO), 1 μM PD0325901 (Axon Medchem, Groningen, Netherland), 0.5 μM A-83-01 (TOCRIS, Bristol, UK) 및 3 μM CHIR99021 (Axon Medchem) 의 임의의 조합을 첨가한, 혹은 첨가하지 않은 SHM 중에 현탁하고, I 형 콜라겐으로 코팅한 플레이트 (AGC 테크노글래스, 시즈오카) 상에 1×10⁴ 세포/㎠ 로 파종하였다. 파종 1 일 후에 배지를 교환하고, 그 후에는 1 일 간격으로 배지 교환하였다.

MH-LSC 의 계대 배양

초대 배양의 14 일째에, YAC 존재하에서 배양한 세포를 트립신 처리하여 회수하고, YAC 를 첨가한 SHM 중에 3×10⁴ 세포/㎠ 로 파종하였다. 최초의 4 계대에 대해서는, 매트리겔 또는 콜라겐으로 코팅한 플레이트 상에서 세포를 배양하였다. 5 계대 이후에는, 기본적으로 매트리겔 코팅한 플레이트 상에서 세포를 배양하였다. CELLBANKER (등록상표) 1 (타카라주조, 오쓰) 을 사용하여 동결 스톡을 조제하였다. 적어도 10 계대 후, Stem Cell Cutting Tool (베리타스, 토쿄) 을 사용하여 MH-LSC 의 클로닝을 실시하였다.

저세포 밀도에서의 저속도 촬영

초대 간세포를 콜라겐으로 코팅한 35 ㎜ 플레이트 (IWAKI) 상에, YAC 의 존재하 또는 비존재하에서 1×10² 세포/㎠ 로 파종하였다. 1 일째에 배지를 교환하였다. 2 번째의 배지 교환 후, BZ9000 올인원 형광 현미경 (키엔스, 오사카) 을 사용하여 저속도 촬영을 실시하였다. 위상차 이미지는 2 일째부터 6 일째까지 30 분 간격으로 300 회 촬영하고, 동영상은 해석마다 작성하였다. 다음으로, 개개의 세포를 촬영 기간을 통해 추적하여, 목적하는 세포에서 유래하는 최종 세포수를 계측하였다. 또, 개개의 세포에서 유래하는 아포토시스 세포의 총계도 계수하여, 아포토시스 빈도를, 총아포토시스 세포/최초의 총세포수 (저속도 촬영의 개시시에 계수) 로서 정량하였다.

정량적 RT-PCR

간세포 및 LSC 세포로부터, miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 전체 RNA 를 단리하였다. 역전사 반응은, High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Lifetechnologies) 를 사용하여, 제조자의 가이드 라인에 따라서 실시하였다. 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여, Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 표적 유전자의 발현 레벨은 내재성 컨트롤인 β-액틴으로 표준화하였다.

면역 세포 화학, 면역 조직 화학 및 PAS 염색

세포를 냉 (冷) 메탄올 (-30 ℃) 에 의해 얼음 위에서 5 분간 고정시켰다. 블로킹액 (Blocking One) (나카라이테스크, 쿄토) 으로, 4 ℃, 30 분 인큐베이트한 후, 세포를 일차 항체와 실온에서 1 시간 또는 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 다음으로, Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594-결합 이차 항체 (Lifetechnologies) 를 사용하여, 일차 항체를 검출하였다. 핵을 Hoechst 33342 (Dojindo) 로 공염색하였다.

조직 샘플은 포르말린 고정시켜, 파라핀 포매 (包埋) 하였다. 탈랍 및 재수화 (再水和) 후, 표본을 1/200 희석한 ImmunoSaver (닛신 EM, 토쿄) 중, 98 ℃ 에서 45 분 자비함으로써, 열 유도성 에피토프 회복을 실시하였다. 다음으로, 표본을 0.1 ％ 트리톤-X 100 으로 처리하여 막 투과화하였다. 블로킹 시약 (나카라이테스크) 으로 4 ℃, 30 분 처리한 후, 표본을 실온에서 1 시간 일차 항체와 인큐베이트하였다. 이들 절편을, ImmPRESS IgG-peroxidase kit (Vector Labs) 및 metal-enhanced DAB substrate kit (Life Technologies) 를 제조자의 지시에 따라 사용함으로써 염색하였다. 헤마톡실린으로 대비 염색한 후, 표본을 탈수하여 마운트하였다.

과요오드산-시프 (PAS) 염색은 PAS kit (Sigma-Aldrich) 를 사용하여 실시하고, 타액 디아스타아제 전처리의 유무로 글리코겐을 검출하였다.

MH-LSC 의 간세포 유도

14 일째의 초대 MH-LSC 또는 Rep-LS 세포주의 세포를 트립신 처리하여 회수하였다. 세포를 5 ％ FBS 를 첨가한 SHM+YAC 중에 현탁하고, 콜라겐으로 코팅한 플레이트에 3.75×10⁴ - 5×10⁴ 세포/㎠ 로 파종하였다. 1 일째에 SHM+YAC 로 배지 교환한 후, 2 일간 배양하였다. 다음으로, 간세포 분화를 위해, 배지를 20 ng/㎖ 온코스타틴 M (OsM) (Wako) 및 10^-6 M Dex 를 첨가한 SHM+YAC 로 치환하고, 2 일마다 배지 교환하면서 세포를 6 일간 배양하였다. 유도 개시 6 일째에, 세포에, 매트리겔 (Corning) 과 상기 간세포 유도 배지의 1 : 7 혼합물을 중층하여, 다시 2 일간 배양하였다. 간세포 유도의 마지막에 매트리겔을 흡인 제거하고, 세포를 여러 가지 기능 어세이에 사용하였다. 네거티브 컨트롤로서, 세포를 대응하는 배양 기간을 통해서 SHM+YAC 중에서 유지하였다.

MH-LSC 의 담관 유도

MH-LSC 의 접종에 앞서, 세포 주기를 정지시킨 마우스 태아 섬유아세포 (MEF) 를 콜라겐으로 코팅한 12-웰 플레이트 상에 5×10⁴ 세포/웰로 파종하였다. 다음날, 14 일째의 초대 MH-LSC 를 트립신 처리하여 회수하고, 5 ％ FBS 를 첨가한 SHM+YAC 중에 재현탁하여, 미리 접종해 둔 MEF 상에 5×10⁵ 세포/웰로 파종하였다. 다음날, YAC 를 함유하는 mTeSR^TM1 (Stemcell Technologies) (mTeSR1+YAC) 로 배지 교환함으로써 담관 유도를 개시하고, 2 일마다 배지 교환하면서 6 일간 배양을 계속하였다. 유도 개시 6 일째에, 배지를 2 ％ 매트리겔을 첨가한 mTeSR1+YAC 로 치환하고, 2 일마다 배지 교환하면서 다시 6 일간 배양을 계속하였다. 합계 12 일간의 배양 후에 담관 유도를 완료하고, 얻어진 세포를 어세이에 사용하였다. 네거티브 컨트롤로서 세포를 대응하는 배양 기간을 통해서 SHM+YAC 중, MEF 상에서 배양하였다.

알부민 분비 어세이

Rat Albumin ELISA Quantitation Set (Bethyl, Montgomery, TX) 를 사용하여, ELISA 에 의해 알부민 (ALB) 농도를 측정하였다. ALB 분비능의 시간 경과적 변화를 모니터링하기 위해서, 간세포 유도의 최초의 6 일간, 2 일마다 배양 상청을 샘플링하였다. 간세포 유도 완료 후의 ALB 분비능을 측정하기 위해서, 8 일째에 중층한 매트리겔을 흡인 제거하였다. 이들 세포의 절반을 DNA 함량 측정을 위해서 회수하고, 나머지 절반에는 신선한 배지를 첨가하여 다시 2 일간 배양하였다. 10 일째에 배양 상청을 회수하고, 8 일째부터 10 일째 사이에 분비된 ALB 를 측정하여, 8 일째의 DNA 함량으로 표준화하였다. DNA 함량은 DNA Quantity Kit (코스모바이오, 토쿄) 를 사용하여 측정하였다.

CYP1A 활성 측정

CYP1A 활성을 유도하기 위해서, 8 일째의 간세포 유도한 세포를, 5 μM 3-메틸콜란트렌 (3-MC) (Sigma) 으로 4 일간 처리하였다 (2 일째에 배지 교환을 실시하였다). 컨트롤 세포는 용매인 DMSO 만으로 처리하였다. 4 일 후에, P450-Glo CYP1A1 Assay (Luciferin-CEE) 를 사용하여, CYP1A 활성을 측정하였다. 제조자의 첨부 문서에 따르면, 이 키트는 CYP1A1 활성보다 CYP1A2 활성을 보다 효율적으로 검출할 수 있다. CYP1A 활성에 계속해서, 세포의 DNA 함량을 측정하여, CYP 활성을 표준화하였다. 3-MC 에 대한 응답성을 조사하기 위해, 활성의 배율 변화를, 각 실험에 대해 3 웰/조건을 사용하여, [3-MC 존재하에서의 평균 발광량/3-MC 존재하에서의 평균 발광량] 으로서 산출하여, 5 회의 독립된 실험의 평균치를 구하였다. 2 회의 실험에 있어서는, 전체 RNA 를 단리하여, CYP1A1 및 CTP1A2 의 유전자 발현 레벨도 평가하였다.

플루오레세인 디아세테이트 어세이

간세포 유도의 경우에는, 세포를 2.5 ㎍/㎖ 플루오레세인 디아세테이트 (FD) (Sigma) 를 함유하는 배지에서, CO₂ 인큐베이터 중 15 분간 인큐베이트하였다. 배지를 행크스 평형 염 용액 (HBSS) (Lifetechnologies) 으로 치환한 후, 대사된 플루오레세인을 형광 현미경 하에서 검출하였다. 담관 유도의 경우에는, 15 분간의 인큐베이션 후, 배지를 신선한 배지로 교환하고, 다시 30 분간 배양을 계속하여, 대사된 플루오레세인의 내강으로의 수송을 유도하였다. 이어서, 배지를 HBSS 로 치환하고, 플루오레세인의 분포를 형광 현미경 하에서 관찰하였다.

분비 어세이

담관 유도된 세포를, 2×10^-7 M 래트 세크레틴 (Wako) 의 존재하에서 30 분간 배양하여, 담관 유사 구조의 내강의 확장을 관찰하였다.

세포핵의 계수

메탄올 고정시킨 세포를 PBS(-) 로 1/1000 으로 희석한 hoechst33342 로 염색하고, Cellomics^TMArrayScan (R) VTI System (Lifetechnologies) 을 제조자의 안내에 따라서 이용하여, 핵을 계수하였다.

동결 간세포로부터의 LSC 유도

동결 래트 성숙 간세포 (Biopredic) 를 제조자의 안내에 따라서 융해하였다. 동결 래트 간세포 배양용의 기본 배지로서, 소형 간세포 배양 배지 (SHM), 즉, 5 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO), 30 ㎎/ℓ L-프롤린 (Sigma), 0.05 ％ BSA (Sigma), 10 ng/㎖ 상피세포 증식 인자 (Sigma), 인슐린-트랜스페린-세린 (ITS)-X (Lifetechnologies), 10^-7 M 덱사메타손 (Dex), 10 mM 니코틴아미드 (Sigma), 1 mM 아스코르브산2-인산에스테르 (와코 순약, 토쿄) 및 항생 물질/항진균약 용액 (100 U/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 mg/㎖ 암포테리신 B) (Lifetechnologies) 를 첨가한, 2.4 g/ℓ NaHCO₃ 및 L-글루타민 함유 DMEM/F12 (Lifetechnologies, Carlsbad, CA) 를 사용하였다. 융해시킨 동결 래트 성숙 간세포를, 이하의 4 개의 저분자 저해약 : 10 μM Y-27632 (WAKO), 1 μM PD0325901 (Axon Medchem, Groningen, Netherland), 0.5 μM A-83-01 (TOCRIS, Bristol, UK) 및 3 μM CHIR99021 (Axon Medchem) 을 SHM 중에 현탁하고, I 형 콜라겐으로 코팅한 플레이트 (AGC 테크노글래스, 시즈오카) 상에 1×10⁴ 세포/㎠ 로 파종하였다. 파종 1 일 후에 배지를 교환하고, 그 후에는 1 일 간격으로 배지 교환하였다.

인간 동결 간세포로부터의 LSC 유도

인간 동결 간세포 (Xenotech) 를 제조자의 안내에 따라서 융해하였다. 인간 동결 간세포 배양용의 기본 배지로서, SHM 을 사용하였다. PD0325901 을 제외한 3 개의 저분자 저해약을 사용한 점 이외에는, 상기한 동결 래트 성숙 간세포로부터의 LSC 유도와 동일한 방법에 의해 유도를 실시하였다. 사용한 인간 동결 간세포를 표 1 에 나타낸다.

인간 동결 간세포로부터 유도된 MH-LSC 의 계대 배양

상기한 MH-LSC 의 계대 배양과 동일한 방법으로, 인간 동결 간세포로부터 유도한 MH-LS 의 계대 배양을 실시하였다.

실시예 1 저분자 저해약은 초대 성숙 간세포의 증식을 유도한다

본 발명자들이나 다른 그룹은 이전에, 저분자 저해약이 줄기세포의 다능성의 유도 및 유지에 기여하는 것을 보고하였다 (Hou et al., 2013 ; Kawamata and Ochiya, 2010). 그리고, 본 발명자들은, 유방암 세포의 인비트로에서의 유지가 저분자의 존재에 강하게 의존하는 것을 밝혀내었다. 이들 지견에 기초하여, 본 발명자들은, 이들 저분자의 어느 특정한 조합, 즉, Rho 키나아제 저해약 Y-27632, 미토겐 활성화 프로테인 키나아제 (MEK) 저해약 PD0325901, 1 형 트랜스포밍 증식 인자 (TGF)-β 수용체 저해약 A-83-01, 및 글리코겐 합성 효소 키나아제-3 (GSK3) 저해약 CHIR99021 이, 성체 간세포를 간 줄기세포 유사의 분화 상태로 리프로그램하는지 여부를 조사하였다. 먼저, 10 - 20 주령의 래트로부터 초대 성숙 간세포를 단리하고, 상기 4 인자의 가능한 모든 조합의 존재하에서 배양하였다. 성숙 간세포는 인비트로에서 증식하지 않는다는 일반적인 생각에 반해, 4 인자의 몇 가지 조합의 존재하에서, 성숙 간세포의 명확한 증식이 관찰되었다 (도 1a 및 b). 이들 중, Y-27632, A-83-01 및 CHIR99021 의 3 인자의 조합 (이하, YAC 라고 한다) 이 성숙 간세포의 가장 높은 증식능을 만들어 냈다. 그 때문에, 이하의 실험에서는 성숙 간세포에 미치는 YAC 의 효과에 초점을 맞췄다. 본 발명자들은, YAC 가, 2 주간의 배양 동안에 세포핵수를 약 15 배로 증가시키는 것을 확인하였다 (도 2A). 마이크로어레이 해석에 의해, 배양 7 일째 (D7) 및 14 일째 (D14) 에 있어서의 일련의 세포 주기 마커의 유전자 발현 레벨이, YAC 존재하에서 상방 제어되고 있음을 알 수 있었다 (도 2B). 정량적 RT-PCR 해석의 결과, YAC 자극하에서의 2 주간의 성숙 간세포의 배양 기간 중, PCNA 와 FoxM1 은 일관되게 고레벨로 발현되고 있음이 확인되었다 (도 2C). 띄엄띄엄 접종된 간세포의 원프레임 포토그래핑 해석에 의해, 증식 중인 세포는 전형적인 성숙 간세포의 형태를 갖는 세포에서 유래하는 것이 확인되었다 (도 2D). 또한, 증식 중인 세포의 몇개는 당초 2 핵 세포로 (도 2D), 성숙 간세포가 YAC 유도성의 증식 세포의 기원인 것이 강하게 시사되었다. 대조적으로, YAC 비자극하에서는, 증식 세포는 거의 출현하지 않고, 보다 많은 세포가 아포토시스사하였다 (도 2D). 정량 해석의 결과, YAC 존재하와 비존재하의 사이에서, 세포수 프로파일에 명확한 시프트가 인정되었다 (도 2E). 특히, 5 일간의 배양 (2 일째부터 6 일째) 동안에 5 를 초과하는 세포를 산생하는 단일 세포의 비율이, YAC 비존재하에서는 1.39 ％ 였던 것에 비해, YAC 존재하에서는 25.1 ％ 로 현저하게 증대되었다 (도 2F). 대조적으로, 1 세포 이하가 된 단일 세포의 비율은, YAC 비존재하에서는 77.3 ％ 였던 것에 비해, YAC 존재하에서는 불과 4.30 ％ 였다 (도 2G). 또, 초대 간세포의 아포토시스의 빈도는, YAC 비존재하보다 YAC 존재하 쪽이 억제되었다 (도 2H).

실시예 2 YAC 유도성 증식 세포는 간 전구세포와 유사하다

YAC 유도성 증식 세포는, 0 일째의 초대 간세포나 YAC 비자극하의 세포와 비교하여 높은 핵/세포질 (N/C) 비를 나타냈다 (도 3a). 이와 같은 형태는, 태아 간 아세포나 성체 난형 세포를 포함하는 LSC 에 특징적이다. 그래서, 본 발명자들은, YAC 유도성 증식 세포가 LSC 마커의 발현에 있어서 LSC 에 유사한지 여부를 조사하였다. 정량적 RT-PCR 해석의 결과, α-페토프로테인 (AFP), SRY-박스 (Sox) 9, 상피세포 접착 분자 (EpCAM), Thy-1/CD90, 간세포 핵내 인자 1 호메오박스 B (HNF1β), 포크헤드박스 J1 (FoxJ1), HNF6/one cut-1 (OC1), CD44, 인테그린 α-6 (A6) 및 CK19 를 포함하는 다수의 LSC 마커의 발현 레벨이 YAC 자극하에서의 2 주간의 배양 동안에 상승하고 있음이 분명해졌다. (도 3b). AFP, CD44, EpCAM, CK19, Sox9, A6 및 CD90 의 단백질 발현 레벨은, YAC 자극에 의해 상승하는 것이 확인되었다 (도 3c). 이들 결과는, YAC 자극이 성숙 간세포에, 증식능뿐만 아니라 LSC 특이적 마커의 발현도, 적어도 부분적으로 부여하는 것을 강하게 시사하고 있다. 그 때문에, 본 발명자들은, YAC 유도성 증식 세포를, 성숙 간세포 유래 간 줄기세포 유사 세포 (MH-LSC) 라고 명명하였다. 다음으로, 본 발명자들은 MH-LSC 가 간세포와 담관 상피세포 (BECs) 의 양방으로 분화할 수 있는지 여부를 조사하였다.

실시예 3 MH-LSC 는 기능적인 간세포로 분화할 수 있다

본 발명자들은 먼저, 이전에 보고된 간 성숙 프로토콜 (Kamiya et al., 2002) 을 사용하여, MH-LSC 가 간세포로의 분화능을 갖는지 여부를 조사하였다 (도 4A). 온코스타틴 M (OsM) 과 덱사메타손 (Dex) 에 의한 간 분화 자극을 받은 MH-LSC (Hep-i(+) 세포라고 한다) 에 매트리겔을 중층하면, 모세담관 유사 구조를 갖는 전형적인 성숙 간세포 유사의 형태가 되었다 (도 4B). 실제로, 플루오레세인 디아세테이트 (FD) 투여 후, 대사된 플루오레세인은 Hep-i(+) 세포에 의해 형성된 이들 소관에 축적되었다 (도 4C). 이 현상은, 간 유도 전의 MH-LSC 에 있어서도, 간 유도를 실시하지 않고 같은 기간 배양한 MH-LSC (Hep-i(-) 세포) 에 있어서도 관찰되지 않았다 (도 4C). 또, Hep-i(+) 세포는 세포막에 있어서 MRP2 단백질을 발현했지만, MH-LSC 도 Hep-i(-) 세포도 그 단백질을 발현하지 않았다 (도 4D). 그리고, Hep-i(+) 세포는, Hep-i(-) 세포나 미분화의 MH-LSC 보다 고레벨로, 일련의 간 기능, 즉, 단백질 레벨에서의 알부민 (ALB) 발현 (도 4E) 및 그 분비 (도 4F, G), 글리코겐의 축적 (도 4H) 및 CYP1A 활성 (도 4I) 을 발휘하였다. 중요한 것은, CYP1A 활성 (도 4I, J) 뿐만 아니라, CYP1A1 및 CYP1A2 의 유전자 발현 (도 4K, L) 도, 3-메틸콜란트렌 (3-MC) 자극에 응답하여 보다 효율적으로 유도되었다. 이러한 지견은, mRNA 마이크로어레이를 사용한 유전자 클러스터링 해석에 의해 지지된다 (도 5A). 실제로, 대사 프로세스나 방어 응답과 같은 간 기능에 관련되는 유전자 세트는 Hep-i(+) 세포에서도 상방 제어되었다 (도 5B). 마이크로어레이의 데이터는 정량적 RT-PCR 에 의해 확인되었다 (도 5C). 중요한 것은, 세포 주기 관련 유전자의 대부분은, 간 유도 후에 하방 제어되었다. 이와 같은 유전자 발현 패턴은 미분화 MH-LSC 의 그것과는 두드러지게 대조적이었다. 따라서, MHC-LSC 는 YAC 자극에 의해 발암성 형질 전환을 일으키지 않는 것이 강하게 시사된다.

실시예 4 MH-LSC 는 기능적인 담관 상피세포로 분화할 수 있다

본 발명자들은, MH-LSC 가, 간세포로의 분화능에 더하여, 담관 상피세포 (BEC) 로도 분화할 수 있음을 알아냈다. 예비 실험에 있어서, 본 발명자들은, MH-LSC 의 장기간 배양을 가능하게 하는 배양 조건을 검토하여, 흥미롭게도 MH-LSC 에 담관 유사 구조를 형성하는 능력을 부여하는 조건을 알아냈다. 본 발명자들은, 이 조건을 조금 개변하여, 담관 유사 구조를 형성하도록 MH-LSC 를 양호한 재현성으로 분화시키는 것에 성공하였다. 이 개변한 배양 조건은, MH-LSC 를 띄엄띄엄 접종한 마우스 태아 섬유아세포 (MEF) 상에서, mTeSR1 배지 중 6 일간 공배양하는 공정과, 그 공정에서 얻어진 세포를, 2 ％ 매트리겔을 첨가한 mTeSR1 배지 중에서 다시 6 일간 배양하는 공정의 2 공정으로 이루어진다 (도 6A). 이 조건하에서 배양한 MH-LSC (BEC-i(+) 세포라고 한다) 는 관상 구조를 형성한 데 대해, 기본의 MH-LSC 유지 배지 중 MEF 상에서 배양한 MH-LSC (BEC-i(-) 세포) 는, 통상적인 단층 형태를 나타냈다 (도 6B). BEC-i(+) 세포는, BEC-i(-) 세포나 미분화 MH-LSC 보다도, BEC 마커인 CK19 및 GRHL2 를 고레벨로 발현하였다 (도 6C). 주목해야 할 점으로, 2 개의 아쿠아포린 AQP1 및 AQP9 와, 2 개의 이온 채널 CFTR 및 AE2 가, BEC-i(+) 세포에서 현저하게 상방 제어되어 (도 6C), 담관으로서 기능적으로 분화되어 있음이 강하게 시사되었다. 한편, BEC-i(-) 세포는, ALB 및 AFP 발현 레벨의 증가로 나타내는 바와 같이, 자연과 간세포 유사 세포로 분화되었다 (도 6C). 대조적으로, BEC-i(+) 세포는 이들 간세포 마커 유전자의 발현 상승을 나타내지 않아 (도 6C), BEC 로 계열 결정된 것을 시사하고 있다. 면역 세포 화학 분석의 결과, BEC-i(+) 세포는 관 구조에 정단 (頂端) 측에서 AQP1 을 발현하는 것이 확인되었다 (도 6D). AE2 및 CFTR 도 또한, 단층 상피를 형성한 BEC-i(+) 세포에서 발현되어 있었다 (도 6D). 또한, 관 구조의 내강에는 밀착 결합 마커 ZO-1 이 발현되어 있었다 (도 6D). 이들 결과는, 관 구조가 기능적인 것을 강하게 시사하고 있다. 실제로, BEC-i(+) 세포를 세크레틴으로 자극하면, 내강의 확장이 야기되어 (도 6E), 그 세포가 물 수송능을 갖는 것이 실증되었다. 또한 FD 의 존재하에서, 관 구조는 대사된 플루오레세인을 내강에 수송·축적하였다 (도 6F). 이상을 정리하면, MH-LSC 는 증식 가능하며, 또한 간세포와 BEC 의 어느 쪽으로도 분화될 수 있음이 나타나, 표현형으로서 진정한 LSC 에 가까운 것을 강하게 시사하고 있다.

실시예 5 효율적인 간 분화능을 소실하지 않는 MH-LSC 의 장기간 배양

MH-LSC 의 간 재생 의료에 대한 응용 가능성을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 MH-LSC 를 몇 계대에 걸쳐서 안정적으로 증폭시킬 수 있는 조건을 검토하였다. 그 결과, 배양 플레이트를 매트리겔로 코팅함으로써, MH-LSC 의 연속 계대가 가능해지는 것을 알아냈다 (도 7A). 최초의 실험에서는, MH-LSC 가 외관상 증식능을 저하시키지 않고 적어도 26 계대할 수 있음을 확인하였다 (도 7B). 또한, 안정적으로 배양된 MH-LSC 를 클론화하여 증폭시킬 수 있었다 (도 7C). 다음으로, 약 10 계대 후에, 5 회의 독립된 실험의 각각에 있어서, 2 - 4 클론을 수립할 수 있었다. 그것들의 간 특성을 현미경 관찰과 정량적 RT-PCR 에 의해 평가하였다. 각 실험에 있어서, 상피 형태를 나타내는 클론을 얻을 수 있었다 (도 7C). 이들 세포는, 상기 서술한 간 유도 (도 4A) 에 응답하여 성숙 간세포 유사의 형태를 나타냈다 (도 7D). ALB, AFP 및 G6PC 등의 간세포 마커의 유전자 발현 레벨은, 수립한 클론 사이에서 변동은 있었지만 (도 7E), 모든 클론에서, 간 유도에 응답하여 이들 유전자의 발현 레벨은 증대되었다 (도 7F). 이상과 같이, 이 배양 조건에 있어서, 간 분화능을 유지한 채로 MH-LSC 를 안정적으로 증폭시켜, 양호한 재현성으로 MH-LSC 의 클론을 수립할 수 있었다.

실시예 6 만성적으로 상해를 입은 간장에 있어서의 MH-LSC 의 재생능

만성적인 간 상해를 갖는 면역 부전 마우스에 MH-LSC 를 이식하여, 그 재생능을 조사하였다. SCID 마우스와 교배한 우로키나아제형 플라스미노겐 액티베이터 (uPA) 트랜스제닉 마우스 (uPA/SCID 마우스) 를 사용하였다. 이식 어세이를 위해서, 3 개의 독립된 클론을 선택하고, 렌티바이러스를 사용하여 copGFP 유전자를 도입하고, 퓨로마이신으로 도입 세포를 선발한 후, 이 표지화된 MH-LSC 클론을 uPA/SCID 마우스에, 1.5×10⁶ 세포/마우스로 비장내 이식하였다 (도 8A). 포지티브 컨트롤로서, 래트 성숙 간세포를 2×10⁵ 세포/마우스로 이식하였다. 혈청 중 래트 ALB 레벨을 이식 후 2 주마다 모니터링한 결과, 래트 성숙 간세포를 이식한 경우에는, 이식 후 8 주까지 착실하게 증가하였다 (도 8B). MH-LSC 를 이식한 마우스로부터 절제한 간장의 전체 이미지는, 종양 형성이 인정되지 않고 많은 갈색의 영역을 포함하고 있던 것에 반해, 비이식 마우스의 간장은 백색으로, 중증의 만성적 간 상해를 나타냈다 (도 8C 상 패널). 형광 염색의 전체 이미지로부터, 갈색의 영역은 GFP 양성 세포에 의해 구성되어 있는 것이 확인되어 (도 8C 하 패널), MH-LSC 가 유비쿼터스하게 상해 간을 치환한 것을 나타내고 있다. 나아가, 래트 Cyp2c6 에 대한 면역 조직 화학 분석의 결과, MH-LSC 이식 마우스의 간장 전체의 84 ％ 가 MH-LSC 유래 세포로 치환되어 있음을 알 수 있었다 (도 8D). 면역 조직 화학 분석 및 PAS 염색에 의해, MH-LSC 유래 세포는 균등하게 각종 성숙 간세포 마커 (Cyp2c6, Cyp1a2, Cyp3a1, Cyp7a1, Mrp2, Hnf4α) 를 발현하고 있고, 또, 글리코겐을 축적하고 있음이 나타났다 (도 8E). 또한, MH-LSC 유래 세포는 고빈도로 2 핵성인 것도 나타났다. 이들 결과는, MH-LSC 가 상해입은 간장을 효율적으로 재생시킬 수 있는 것, 종양 형성없이 기능적인 간세포로 분화될 수 있는 것을 나타내고 있다.

실시예 7 MH-LSC 의 그밖의 이미 알려진 LSC 마커의 발현

본 발명자들은, 델타호모로그 1 (DLK1), 류신-리치리피트 함유 G 단백질 공액 수용체 5 (LGR5) (Huch, M. et al., Nature, 494 : 247-250 (2013) ; (Huch, M. et al., Cell, 160 : 299-312 (2015)), 그리고 FoxL1 (Sackett, S.D. et al., Hepatology, 49 : 920-929 (2009)) 등의 다른 보고되어 있는 간 전구세포 마커에 대해 정량적 RT-PCR 을 실시했지만, YAC 존재하 및 비존재하의 어느 조건하에서도 그것들의 발현은 검출되지 않았다. 이들 결과는, YAC 유도성 증식 세포는, 이전에 보고되어 있는 간 전구세포의 유전자 발현 프로파일을 일부 모방하지만, 완전하게는 일치하지 않는 경우가 있음을 시사하고 있다.

실시예 8 동결 성숙 간세포로부터의 MH-LSC 의 유도

본 발명자들은, YAC 자극에 의해 동결 래트 간세포로부터 LSC 가 유도되는지 조사하였다. 동결 래트 간세포는 YAC 자극에 의해, 성숙 간세포와 비교하여 핵/세포질 (N/C) 비가 높은 세포의 증식이 확인되었다 (도 9). 대조적으로, YAC 비자극하에서는, 증식 세포는 거의 출현하지 않고, 보다 많은 세포가 아포토시스사하였다 (도 9).

실시예 9 인간 동결 간세포로부터의 MH-LSC 의 유도

본 발명자들은, YAC 자극에 의해 인간 동결 간세포로부터 LSC 가 유도되는지 조사하였다. 인간 동결 간세포는, YAC 자극에 의해 증식하였다. 또, YAC 자극에 의해, 래트 간세포에서 보여진 세포와 동일한 형태의 콜로니가 출현하였다 (도 10).

실시예 10 인간 동결 간세포로부터 유도한 MH-LS 의 계대 배양

본 발명자들은, 인간 동결 간세포로부터 유도한 MH-LS 의 계대 배양을 실시하여, 연속 계대가 가능한지를 조사하였다. 그 결과, 인간 동결 간세포로부터 유도한 MH-LS 는, 3 회의 계대 후에도 증식능을 유지하고 있었다 (도 11).

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 유전자 개변을 수반하지 않고, 간세포로부터, 자기 재생능와 간세포 및 담관 상피세포로의 분화능 (양능성) 을 갖는 간 줄기/전구세포를, 안전하고 신속하게 유도할 수 있기 때문에, 약물 평가 시스템이나 간 재생 의료에 대한 응용이 가능해지는 점에서 크게 유용하다.

본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2016-003088 (출원일 : 2016년 1월 8 일) 을 기초로 하고 있고, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

Claims

포유 동물의 간세포에, 인비트로로 TGF β 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
제 1 항에 있어서,
추가로, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을, 인비트로로 상기 간세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
제 1 항에 있어서,
추가로, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을, 인비트로로 상기 간세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간세포와 상기 TGF β 수용체 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재하에서 그 간세포를 배양함으로써 실시되는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간세포와 상기 GSK3 저해약 및/또는 상기 ROCK 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재하에서 그 간세포를 배양함으로써 실시되는, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스인, 그 간세포로부터의 간 줄기/전구세포의 제작 방법.
TGF β 수용체 저해약을 함유하여 이루어지는, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.
제 7 항에 있어서,
GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.
제 7 항에 있어서,
GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 조합하여 이루어지는, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
간세포가 인간, 래트 또는 마우스 유래인, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.
이하의 특징을 갖는 포유 동물의 간세포 유래의 간 줄기/전구세포.
(a) 자기 재생능을 갖는다
(b) 간세포 및 담관 상피세포의 양방으로 분화할 수 있다
(c) 표면 항원 마커로서 EpCAM 을 발현하지만, Dlk1 을 발현하지 않는다.
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포의 유지·증폭제로서 사용되는, 간세포로부터의 간 줄기/전구세포 유도제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포의 유지·증폭 방법으로서,
(i) 제 1 - 제 4 계대까지는 콜라겐 또는 매트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서,
(ii) 제 5 계대 이후에는 매트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서,
TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서, 그 간 줄기/전구세포를 계대 배양하는 것을 특징으로 하는, 간 줄기/전구세포의 유지·증폭 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포로부터의 담관 상피세포의 유도 방법으로서,
(i) 저밀도의 피더세포 상, TGF β 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재하에서 그 간 줄기/전구세포를 배양하는 공정, 및
(ii) 공정 (i) 에서 얻어진 세포를, 매트리겔을 함유하는 배지 중에서 추가로 배양하는 공정
을 포함하는, 간 줄기/전구세포로부터의 담관 상피세포의 유도 방법.
피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법으로서,
(i) 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포로부터 분화 유도된 간세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
(ii) 그 간세포에 있어서의 피검 화합물의 대사를 측정하는 공정
을 포함하는, 피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법.
포유 동물에 대한 피검 화합물의 간 독성을 평가하는 방법으로서,
(i) 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포로부터 분화 유도된 간세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
(ii) 그 간세포의 장해의 유무 또는 그 정도를 측정하는 공정
을 포함하는, 포유 동물에 대한 피검 화합물의 간 독성을 평가하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포를 함유하여 이루어지는, 간 장해 개선제.
포유 동물에 있어서의 간 장해의 개선 방법으로서, 간 장해를 갖는 포유 동물에, 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물에 있어서의 간 장해의 개선 방법.
간 장해 개선제로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 간 줄기/전구세포 또는 제 11 항에 기재된 간 줄기/전구세포.