JPH08163996A - 動物細胞毒性試験方法 - Google Patents
動物細胞毒性試験方法Info
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- JPH08163996A JPH08163996A JP6308915A JP30891594A JPH08163996A JP H08163996 A JPH08163996 A JP H08163996A JP 6308915 A JP6308915 A JP 6308915A JP 30891594 A JP30891594 A JP 30891594A JP H08163996 A JPH08163996 A JP H08163996A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 培養される動物細胞の機能を高めて、生体内
と類似の環境に保つことにより、多数の実験動物を使う
ことなく、経済的に、効率良く、化学物質や医薬品の安
全性、毒性の評価をすることのできる試験方法を提供す
る。 【構成】 テロペプチドを除去し、もしくは還元剤で処
理したタイプＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲン
ゲル上で、動物細胞を一定期間培養した後、被検物質を
添加して一定時間後に動物細胞の機能を測定（急性毒性
試験）し、あるいは、低濃度の被検物質を定期的に繰り
返し添加しながら培養を続け、動物細胞の機能の経時変
化を測定（慢性毒性試験）する。
と類似の環境に保つことにより、多数の実験動物を使う
ことなく、経済的に、効率良く、化学物質や医薬品の安
全性、毒性の評価をすることのできる試験方法を提供す
る。 【構成】 テロペプチドを除去し、もしくは還元剤で処
理したタイプＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲン
ゲル上で、動物細胞を一定期間培養した後、被検物質を
添加して一定時間後に動物細胞の機能を測定（急性毒性
試験）し、あるいは、低濃度の被検物質を定期的に繰り
返し添加しながら培養を続け、動物細胞の機能の経時変
化を測定（慢性毒性試験）する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、培養される動物細胞の
機能を高めて、生体内と類似の環境に保つことにより、
従来動物で行われている新規の化学物質や医薬品の毒性
試験や安全性試験を、経済的に、効率良く、かつ再現性
良く行う動物細胞毒性試験方法に関するものである。
機能を高めて、生体内と類似の環境に保つことにより、
従来動物で行われている新規の化学物質や医薬品の毒性
試験や安全性試験を、経済的に、効率良く、かつ再現性
良く行う動物細胞毒性試験方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、新規の化学物質や医薬品の安全性
・毒性試験は動物の個体を使って行われてきているが、
検査結果の定量化が困難、因果関係の判定が困難等の欠
点に加えて、一種類の物質に多数の動物個体を必要とす
ることから、動物愛護の観点からも動物実験に替わる方
法が求められている。動物実験代替法は、使用する実験
動物の数を削減し、動物の飼育に伴う経済的な負担を軽
減すると共に、合理的で簡便な安全性・毒性評価法を開
発することを目的としている。
・毒性試験は動物の個体を使って行われてきているが、
検査結果の定量化が困難、因果関係の判定が困難等の欠
点に加えて、一種類の物質に多数の動物個体を必要とす
ることから、動物愛護の観点からも動物実験に替わる方
法が求められている。動物実験代替法は、使用する実験
動物の数を削減し、動物の飼育に伴う経済的な負担を軽
減すると共に、合理的で簡便な安全性・毒性評価法を開
発することを目的としている。
【０００３】動物実験代替法の一つとして、動物細胞を
体外に取り出して培養する方法が考えられているが、単
層培養方法では生体内の機能が直ぐに失われ、また細胞
自体もすぐに死んでしまい、毒性の判定が困難であり、
動物実験の代替法としては不十分である。
体外に取り出して培養する方法が考えられているが、単
層培養方法では生体内の機能が直ぐに失われ、また細胞
自体もすぐに死んでしまい、毒性の判定が困難であり、
動物実験の代替法としては不十分である。
【０００４】また、主として初代培養肝細胞について、
生体内と類似の環境を保つための三次元培養法として、
スフェロイド培養法（日本動物実験代替法学会第５回大
会要旨集ｐ３０〜３３（ '９１））や、マトリゲル培養
法（日本動物実験代替法学会第５回大会要旨集ｐ３８〜
４１（ '９１））を利用した代替法も行われてきてい
る。しかしながら、スフェロイド培養法の場合、２〜３
週間以上の長期培養によるスフェロイド中心部の細胞壊
死や、内部の細胞への物質の浸透性に問題がある。ま
た、マトリゲル培養法の場合、マトリゲルの構成物が完
全には解明されておらず、添加した被検物質単独の効果
なのか明確でない部分がある。
生体内と類似の環境を保つための三次元培養法として、
スフェロイド培養法（日本動物実験代替法学会第５回大
会要旨集ｐ３０〜３３（ '９１））や、マトリゲル培養
法（日本動物実験代替法学会第５回大会要旨集ｐ３８〜
４１（ '９１））を利用した代替法も行われてきてい
る。しかしながら、スフェロイド培養法の場合、２〜３
週間以上の長期培養によるスフェロイド中心部の細胞壊
死や、内部の細胞への物質の浸透性に問題がある。ま
た、マトリゲル培養法の場合、マトリゲルの構成物が完
全には解明されておらず、添加した被検物質単独の効果
なのか明確でない部分がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、以上のような従来技術の問題点を解決するために、
以前に提案した動物細胞培養方法、即ち、基質材料とし
てテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを使用
すると共に、培地中に特定の物質を添加する方法（特開
平３−４７８０号公報）や、還元剤で処理したタイプＩ
コラーゲンを使用する方法（特願平５−７８５８５号）
を用いて、培養動物細胞を生体内と類似の環境に保った
後、培地中に被検物質を添加して動物細胞の機能を評価
することにより、安全性・毒性試験評価に利用できるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
は、以上のような従来技術の問題点を解決するために、
以前に提案した動物細胞培養方法、即ち、基質材料とし
てテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを使用
すると共に、培地中に特定の物質を添加する方法（特開
平３−４７８０号公報）や、還元剤で処理したタイプＩ
コラーゲンを使用する方法（特願平５−７８５８５号）
を用いて、培養動物細胞を生体内と類似の環境に保った
後、培地中に被検物質を添加して動物細胞の機能を評価
することにより、安全性・毒性試験評価に利用できるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の目的は、テロペプチドを取
り除いたタイプＩコラーゲン、もしくは還元剤で処理さ
れたタイプＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲンゲ
ルを培養用基質材料として使用する動物細胞毒性試験方
法を提供することである。
り除いたタイプＩコラーゲン、もしくは還元剤で処理さ
れたタイプＩコラーゲンをゲル化してなるコラーゲンゲ
ルを培養用基質材料として使用する動物細胞毒性試験方
法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意検討した結果、本発明を完成する
に至ったものである。即ち、本発明は、タイプＩコラー
ゲン、特にテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲ
ン、もしくは還元剤で処理されたタイプＩコラーゲンを
ゲル化してなるコラーゲンゲルを培養用基質材料として
使用することを特徴とする動物細胞毒性試験方法であ
り、さらには、初代培養肝細胞を対象とする動物細胞毒
性試験方法である。
を達成するために鋭意検討した結果、本発明を完成する
に至ったものである。即ち、本発明は、タイプＩコラー
ゲン、特にテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲ
ン、もしくは還元剤で処理されたタイプＩコラーゲンを
ゲル化してなるコラーゲンゲルを培養用基質材料として
使用することを特徴とする動物細胞毒性試験方法であ
り、さらには、初代培養肝細胞を対象とする動物細胞毒
性試験方法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用される動物細胞培養用基質材料の主成分として使用
されるタイプＩコラーゲンとしては、その由来として仔
牛真皮、ブタ皮膚やラット尾腱等があるが、特に、由来
動物種や由来組織に限定されるものではなく、適宜のタ
イプＩコラーゲンを使用することができる。
使用される動物細胞培養用基質材料の主成分として使用
されるタイプＩコラーゲンとしては、その由来として仔
牛真皮、ブタ皮膚やラット尾腱等があるが、特に、由来
動物種や由来組織に限定されるものではなく、適宜のタ
イプＩコラーゲンを使用することができる。
【０００９】テロペプチドを取り除く方法としては、生
体由来の酵素であるペプシンを使用する方法がある。ま
た、還元剤処理に使用できる還元剤としては、水素化ホ
ウ素ナトリウム等の水溶液で利用できるものであって、
エステルやアミド（ペプチド結合）の還元は起こさず、
アルデヒド基の還元を起こすものは全て使用可能であ
り、このような作用を有するものであればその種類を問
わず、適宜のものを使用することが出来る。
体由来の酵素であるペプシンを使用する方法がある。ま
た、還元剤処理に使用できる還元剤としては、水素化ホ
ウ素ナトリウム等の水溶液で利用できるものであって、
エステルやアミド（ペプチド結合）の還元は起こさず、
アルデヒド基の還元を起こすものは全て使用可能であ
り、このような作用を有するものであればその種類を問
わず、適宜のものを使用することが出来る。
【００１０】本発明に使用される動物細胞培養用基質材
料は、テロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲン、
または還元剤で処理されたコラーゲンを主成分として含
有するものであり、当該コラーゲンを単独使用するも
の、もしくは適宜の他の基質材料を共存せしめたものの
いずれであっても使用することが可能であり、その主要
成分であるコラーゲンをゲル化させて、コラーゲンゲル
の状態で細胞培養基質として使用することを特徴とする
ものである。
料は、テロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲン、
または還元剤で処理されたコラーゲンを主成分として含
有するものであり、当該コラーゲンを単独使用するも
の、もしくは適宜の他の基質材料を共存せしめたものの
いずれであっても使用することが可能であり、その主要
成分であるコラーゲンをゲル化させて、コラーゲンゲル
の状態で細胞培養基質として使用することを特徴とする
ものである。
【００１１】ゲル形成の方法は、テロペプチドを取り除
いたタイプＩコラーゲン、または還元剤で処理されたタ
イプＩコラーゲンを主成分とする、所望濃度のコラーゲ
ン溶液を調整し、当該溶液をリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ
（Ｎ−〔２ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２
エタンスルホン酸〕）水酸化ナトリウム水溶液等を用い
て中性にし、２０℃以上、望ましくは３７℃で静置する
と、数時間でゲル化する。得られたゲルをリン酸緩衝液
や培養液で十分洗浄したものを細胞培養基質材料に用い
るが、これを長期に保存する場合は、ゲル化する前の溶
液状態で、約４℃で保管することにより長期保存するこ
とが出来る。
いたタイプＩコラーゲン、または還元剤で処理されたタ
イプＩコラーゲンを主成分とする、所望濃度のコラーゲ
ン溶液を調整し、当該溶液をリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ
（Ｎ−〔２ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２
エタンスルホン酸〕）水酸化ナトリウム水溶液等を用い
て中性にし、２０℃以上、望ましくは３７℃で静置する
と、数時間でゲル化する。得られたゲルをリン酸緩衝液
や培養液で十分洗浄したものを細胞培養基質材料に用い
るが、これを長期に保存する場合は、ゲル化する前の溶
液状態で、約４℃で保管することにより長期保存するこ
とが出来る。
【００１２】本発明に使用される動物細胞培養用基質材
料を使用して、動物細胞を培養する方法は、細胞をコラ
ーゲンゲルの上に播くだけでよく、播種後、数時間〜１
日で細胞はコラーゲンゲルの上面に接着する。動物細胞
については、肝細胞、乳腺細胞、腎臓細胞、その他適宜
の動物細胞に適用可能であり、その種類は特に限定され
るものではない。
料を使用して、動物細胞を培養する方法は、細胞をコラ
ーゲンゲルの上に播くだけでよく、播種後、数時間〜１
日で細胞はコラーゲンゲルの上面に接着する。動物細胞
については、肝細胞、乳腺細胞、腎臓細胞、その他適宜
の動物細胞に適用可能であり、その種類は特に限定され
るものではない。
【００１３】これらの動物細胞をコラーゲンゲル上で定
期的に培地交換を繰り返して、３〜１４日間、好ましく
は７〜１４日間培養して生体内と類似の環境に保った
後、培地中に被検物質を添加して動物細胞の機能を測定
することにより、各種の毒性試験評価を行うことが可能
となる。培地交換の間隔としては１〜４日毎、短い方が
好ましいが、作業量の点から通常は２〜３日毎に行う。
また、培養を行う期間は特に限定する必要はなく、３日
程度でも使用可能であるが、動物細胞機能は１〜２週間
の間が比較的安定しており好ましい。２週間を過ぎると
細胞の機能の安定性がやや低下して来る。
期的に培地交換を繰り返して、３〜１４日間、好ましく
は７〜１４日間培養して生体内と類似の環境に保った
後、培地中に被検物質を添加して動物細胞の機能を測定
することにより、各種の毒性試験評価を行うことが可能
となる。培地交換の間隔としては１〜４日毎、短い方が
好ましいが、作業量の点から通常は２〜３日毎に行う。
また、培養を行う期間は特に限定する必要はなく、３日
程度でも使用可能であるが、動物細胞機能は１〜２週間
の間が比較的安定しており好ましい。２週間を過ぎると
細胞の機能の安定性がやや低下して来る。
【００１４】被検物質の急性毒性の評価は、培地中に被
検物質を１回だけ添加し、一定時間経過後に動物細胞の
機能を測定することにより可能となる。細胞機能の特性
（種類）によっては、被検物質の添加から１時間程度で
変化が現れるものもあるが、通常は１〜４日経過後に測
定するのがよい。また、被検物質の慢性毒性の評価は、
被検物質を比較的低濃度で添加した培地を用いて、定期
的に培地交換を繰り返しながら培養を続け、１〜２ケ月
以上の長期間に亘って動物細胞の機能の経時変化を測定
することにより可能となる。測定を続ける期間は特に限
定されるものではないが、動物細胞の機能が必要なレベ
ルに保たれる期間が限度となる。
検物質を１回だけ添加し、一定時間経過後に動物細胞の
機能を測定することにより可能となる。細胞機能の特性
（種類）によっては、被検物質の添加から１時間程度で
変化が現れるものもあるが、通常は１〜４日経過後に測
定するのがよい。また、被検物質の慢性毒性の評価は、
被検物質を比較的低濃度で添加した培地を用いて、定期
的に培地交換を繰り返しながら培養を続け、１〜２ケ月
以上の長期間に亘って動物細胞の機能の経時変化を測定
することにより可能となる。測定を続ける期間は特に限
定されるものではないが、動物細胞の機能が必要なレベ
ルに保たれる期間が限度となる。
【００１５】その他にも、例えば、癌原性の評価は、慢
性毒性評価の場合と同様に低濃度の被検物質を培地中に
添加し続けた後、発癌マーカー酵素等の細胞内発現の有
無を見ることにより可能となる。さらに、肝細胞の代謝
機能を応用して、被検物質の肝細胞による代謝後の、各
種動物細胞に対する毒性評価を行うことも可能である。
性毒性評価の場合と同様に低濃度の被検物質を培地中に
添加し続けた後、発癌マーカー酵素等の細胞内発現の有
無を見ることにより可能となる。さらに、肝細胞の代謝
機能を応用して、被検物質の肝細胞による代謝後の、各
種動物細胞に対する毒性評価を行うことも可能である。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明について更に具体
的に説明する。 コラーゲンゲル培養床の調整 仔牛真皮よりＰＨ３の塩酸で溶出した、テロペプチドを
有するタイプＩコラーゲン（無処理コラーゲン）０．３
％溶液（ＰＨ３）と、ペプシン３％溶液（ＰＨ３）と
を、９：１の割合で混合し、４℃で約１日間攪拌を行っ
た。この反応溶液に１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水
と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣＯ3、４．７７％
Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶液）を８：１：１の
割合で混合し、３７℃に加温して約１日放置し、コラー
ゲンをゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルの
みを分離し、１ｍＭ（ミリモル）塩酸に溶解させてペプ
シン処理コラーゲン溶液を得た。
的に説明する。 コラーゲンゲル培養床の調整 仔牛真皮よりＰＨ３の塩酸で溶出した、テロペプチドを
有するタイプＩコラーゲン（無処理コラーゲン）０．３
％溶液（ＰＨ３）と、ペプシン３％溶液（ＰＨ３）と
を、９：１の割合で混合し、４℃で約１日間攪拌を行っ
た。この反応溶液に１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水
と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣＯ3、４．７７％
Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶液）を８：１：１の
割合で混合し、３７℃に加温して約１日放置し、コラー
ゲンをゲル化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルの
みを分離し、１ｍＭ（ミリモル）塩酸に溶解させてペプ
シン処理コラーゲン溶液を得た。
【００１７】同じく、仔牛真皮よりＰＨ３の塩酸で溶出
したテロペプチドを有するタイプＩコラーゲン０．３％
溶液（ＰＨ３）と、１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水
と１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液とを１０：１２：
１の割合で混合し、４℃で約１日間攪拌を行った。その
後、３７℃に加温して約１日放置し、コラーゲンをゲル
化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルのみを分離
し、１ｍＭ塩酸に溶解させ還元処理コラーゲン溶液を得
た。
したテロペプチドを有するタイプＩコラーゲン０．３％
溶液（ＰＨ３）と、１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水
と１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液とを１０：１２：
１の割合で混合し、４℃で約１日間攪拌を行った。その
後、３７℃に加温して約１日放置し、コラーゲンをゲル
化させた後、遠心分離にてコラーゲンゲルのみを分離
し、１ｍＭ塩酸に溶解させ還元処理コラーゲン溶液を得
た。
【００１８】得られたペプシン処理コラーゲン、還元処
理コラーゲン、および元の無処理コラーゲン０．３％溶
液（ＰＨ３）に、それぞれ１０倍濃度のリン酸緩衝生理
食塩水と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣＯ3 、４．
７７％Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶液）とを８：
１：１の割合で混合し、プラスチック培養皿の底面に１
ないし２ｍｍの厚さに敷いた後、３７℃インキュベータ
中でゲル化させた。得られた各コラーゲンゲルを、Ｌ−
１５培地で洗浄し培養に用いた。
理コラーゲン、および元の無処理コラーゲン０．３％溶
液（ＰＨ３）に、それぞれ１０倍濃度のリン酸緩衝生理
食塩水と再構成用緩衝液（２．２％ＮａＨＣＯ3 、４．
７７％Ｈｅｐｅｓ、０．０５％ＮａＯＨ溶液）とを８：
１：１の割合で混合し、プラスチック培養皿の底面に１
ないし２ｍｍの厚さに敷いた後、３７℃インキュベータ
中でゲル化させた。得られた各コラーゲンゲルを、Ｌ−
１５培地で洗浄し培養に用いた。
【００１９】動物細胞の培養 肝細胞をラットよりコラゲナーゼ灌流法にて分離し、上
記コラーゲンゲル上に５×１０5／ｃｍ2の濃度で播種
し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータ内で培養し
た。培養液はＬ−１５培地に、牛胎児血清１０％、イン
シュリン１０-7Ｍ、デキサメサゾン１０-7Ｍ、ＥＧＦ
（Ｅpidemal Ｇrowth Ｆactor)１０ｎｇ／ｍｌ、プロリ
ン３０μｇ／ｍｌ、およびジメチルスルフォキシド２％
を加えたものを用い、ゲル層の上面に１ないし２ｍｍ以
上の高さまで培養液を加え、２〜３日毎に培地交換をし
ながら培養を続けた。
記コラーゲンゲル上に５×１０5／ｃｍ2の濃度で播種
し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータ内で培養し
た。培養液はＬ−１５培地に、牛胎児血清１０％、イン
シュリン１０-7Ｍ、デキサメサゾン１０-7Ｍ、ＥＧＦ
（Ｅpidemal Ｇrowth Ｆactor)１０ｎｇ／ｍｌ、プロリ
ン３０μｇ／ｍｌ、およびジメチルスルフォキシド２％
を加えたものを用い、ゲル層の上面に１ないし２ｍｍ以
上の高さまで培養液を加え、２〜３日毎に培地交換をし
ながら培養を続けた。
【００２０】動物細胞毒性試験 ［実施例１］ 急性毒性試験 培養１５日目に肝毒性物質である四塩化炭素（０〜９０
ｍＭ）、およびジメチルニトロソアミン（０〜０．５ｍ
Ｍ）をそれぞれ培地中に添加し、約２４時間後に、肝細
胞機能として培地中に分泌されたアルブミン濃度を、ま
た、肝細胞膜の障害度の指標として細胞内から培地中へ
漏出するＬＤＨ酵素活性の割合をそれぞれ測定した。
ｍＭ）、およびジメチルニトロソアミン（０〜０．５ｍ
Ｍ）をそれぞれ培地中に添加し、約２４時間後に、肝細
胞機能として培地中に分泌されたアルブミン濃度を、ま
た、肝細胞膜の障害度の指標として細胞内から培地中へ
漏出するＬＤＨ酵素活性の割合をそれぞれ測定した。
【００２１】アルブミン分泌量については、図１に示す
とおり、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲル
上では、肝毒性物質である四塩化炭素、ジメチルニトロ
ソアミンの添加量に応じて低下しているのに対して、無
処理コラーゲンゲル上では、無添加の状態で既に機能が
低下しており、肝毒性物質の添加の影響を評価すること
が出来なかった。
とおり、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲル
上では、肝毒性物質である四塩化炭素、ジメチルニトロ
ソアミンの添加量に応じて低下しているのに対して、無
処理コラーゲンゲル上では、無添加の状態で既に機能が
低下しており、肝毒性物質の添加の影響を評価すること
が出来なかった。
【００２２】ＬＤＨ遊離率については、図２に示すとお
り、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲル上で
は、四塩化炭素、ジメチルニトロソアミンの添加量に応
じて増大しているのに対して、無処理コラーゲンゲル上
では、無添加の状態で既に細胞膜がかなり障害されてお
り、肝毒性物質の添加の影響を評価することが出来なか
った。
り、ペプシン処理、および還元処理コラーゲンゲル上で
は、四塩化炭素、ジメチルニトロソアミンの添加量に応
じて増大しているのに対して、無処理コラーゲンゲル上
では、無添加の状態で既に細胞膜がかなり障害されてお
り、肝毒性物質の添加の影響を評価することが出来なか
った。
【００２３】［実施例２］ 慢性毒性試験 培養７日目より培地交換毎（２〜３日毎）に、肝毒性物
質としてジメチルニトロソアミンを比較的低濃度（０．
０５ｍＭ）で培地中に添加し続けて、約２ケ月間培養
し、肝細胞機能としてアルブミン分泌量を測定した。比
較例として、ジメチルニトロソアミンを添加せずに培養
を続ける実験も行った。
質としてジメチルニトロソアミンを比較的低濃度（０．
０５ｍＭ）で培地中に添加し続けて、約２ケ月間培養
し、肝細胞機能としてアルブミン分泌量を測定した。比
較例として、ジメチルニトロソアミンを添加せずに培養
を続ける実験も行った。
【００２４】結果は、図３に示すとおり、ペプシン処
理、および還元処理コラーゲンゲル上での培養において
は、培養２週間目以降、ジメチルニトロソアミンを添加
した実験でアルブミン分泌量の低下が認められたのに対
して、無処理コラーゲンゲル上では、ジメチルニトロソ
アミン添加の有無にかかわらず２週間目以降機能が低下
し、添加の影響を長期間に亘って評価することが出来な
かった。
理、および還元処理コラーゲンゲル上での培養において
は、培養２週間目以降、ジメチルニトロソアミンを添加
した実験でアルブミン分泌量の低下が認められたのに対
して、無処理コラーゲンゲル上では、ジメチルニトロソ
アミン添加の有無にかかわらず２週間目以降機能が低下
し、添加の影響を長期間に亘って評価することが出来な
かった。
【００２５】以上のごとく、ペプシン処理、および還元
処理コラーゲンゲル上で培養した動物細胞に、毒性物質
を約２４時間接触させることにより急性毒性の評価がで
き、また、低濃度の毒性物質を長期に亘って継続して添
加することによる影響、即ち慢性毒性を評価することが
でき、動物実験に代替して急性毒性および慢性毒性の評
価試験に応用できる可能性が確認された。
処理コラーゲンゲル上で培養した動物細胞に、毒性物質
を約２４時間接触させることにより急性毒性の評価がで
き、また、低濃度の毒性物質を長期に亘って継続して添
加することによる影響、即ち慢性毒性を評価することが
でき、動物実験に代替して急性毒性および慢性毒性の評
価試験に応用できる可能性が確認された。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、多数の実験動物
を犠牲にすることなく、化学物質や医薬品の安全性、毒
性試験を行うことができ、多数の実験動物の飼育のため
の経済的な負担を軽減すると共に、合理的で簡便な安全
性、毒性の評価方法を提供することができる。
を犠牲にすることなく、化学物質や医薬品の安全性、毒
性試験を行うことができ、多数の実験動物の飼育のため
の経済的な負担を軽減すると共に、合理的で簡便な安全
性、毒性の評価方法を提供することができる。
【図１】実施例１の急性毒性試験における、アルブミン
分泌量に対する四塩化炭素およびジメチルニトロソアミ
ン添加量の影響を示す図である。
分泌量に対する四塩化炭素およびジメチルニトロソアミ
ン添加量の影響を示す図である。
【図２】実施例１の急性毒性試験における、ＬＤＨ酵素
遊離率に対する四塩化炭素およびジメチルニトロソアミ
ン添加量の影響を示す図である。
遊離率に対する四塩化炭素およびジメチルニトロソアミ
ン添加量の影響を示す図である。
【図３】実施例２の慢性毒性試験における、アルブミン
分泌量の経時変化を示す図で、（ａ）は培養７日目より
ジメチルニトロソアミン０．０５ｍＭを添加し続けた場
合、（ｂ）はジメチルニトロソアミンを添加しない比較
例の図である。
分泌量の経時変化を示す図で、（ａ）は培養７日目より
ジメチルニトロソアミン０．０５ｍＭを添加し続けた場
合、（ｂ）はジメチルニトロソアミンを添加しない比較
例の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小郷 克幸 横浜市栄区田谷町１番地 住友電気工業株 式会社横浜製作所内 (72)発明者 新原 直樹 横浜市栄区田谷町１番地 住友電気工業株 式会社横浜製作所内 (72)発明者 中嶋 裕人 横浜市栄区田谷町１番地 住友電気工業株 式会社横浜製作所内
Claims (4)
- 【請求項１】 タイプＩコラーゲンをゲル化してなるコ
ラーゲンゲル（培養用基質）上に動物細胞を播種し、定
期的に培地交換を繰り返して一定期間培養した後、培地
中に被検物質を添加し、一定時間経過後に動物細胞の機
能を測定することを特徴とする動物細胞毒性試験方法。 - 【請求項２】 タイプＩコラーゲンをゲル化してなるコ
ラーゲンゲル（培養用基質）上に動物細胞を播種し、定
期的に培地交換を繰り返して一定期間培養した後、さら
に、低濃度の被検物質を添加した培地を用いて、定期的
に培地交換を繰り返しながら培養を続け、動物細胞の機
能の経時変化を測定することを特徴とする動物細胞毒性
試験方法。 - 【請求項３】 タイプＩコラーゲンが、テロペプチドを
取り除いたタイプＩコラーゲン、もしくは還元剤で処理
されたタイプＩコラーゲンであることを特徴とする、請
求項１もしくは請求項２記載の動物細胞毒性試験方法。 - 【請求項４】 初代培養肝細胞を毒性試験の対象とする
ことを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか
に記載の動物細胞毒性試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6308915A JPH08163996A (ja) | 1994-12-13 | 1994-12-13 | 動物細胞毒性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6308915A JPH08163996A (ja) | 1994-12-13 | 1994-12-13 | 動物細胞毒性試験方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08163996A true JPH08163996A (ja) | 1996-06-25 |
Family
ID=17986810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6308915A Pending JPH08163996A (ja) | 1994-12-13 | 1994-12-13 | 動物細胞毒性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08163996A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002506522A (ja) * | 1997-06-09 | 2002-02-26 | グアヴァ テクノロジーズ インコーポレイテッド | 流体サンプル中のミクロ粒子を検出するための方法及び装置 |
| WO2002061120A1 (fr) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede pour evaluer l'aptitude d'un medicament a produire une enzyme dans des cellules hepatiques |
| WO2007025153A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Hepahope, Inc. | Novel enhanced processes for drug testing and screening using human tissue |
| WO2007025154A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Hepahope, Inc. | Chemosensitivity tester |
| US7195912B2 (en) * | 1997-09-09 | 2007-03-27 | Japan Science And Technology Corporation | Hydrogel thin film containing extracellular matrix components |
| US7829325B2 (en) | 2003-12-16 | 2010-11-09 | Hepahope, Inc. | Drug testing with bio-artificial organ slices including for example those derived from liver |
| JPWO2017119512A1 (ja) * | 2016-01-08 | 2018-11-15 | Cynity株式会社 | 低分子化合物による成熟肝細胞からの肝幹／前駆細胞の作製方法 |
-
1994
- 1994-12-13 JP JP6308915A patent/JPH08163996A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002506522A (ja) * | 1997-06-09 | 2002-02-26 | グアヴァ テクノロジーズ インコーポレイテッド | 流体サンプル中のミクロ粒子を検出するための方法及び装置 |
| JP4754661B2 (ja) * | 1997-06-09 | 2011-08-24 | ミリポア・コーポレイション | 流体サンプル中のミクロ粒子を検出するための方法及び装置 |
| US7195912B2 (en) * | 1997-09-09 | 2007-03-27 | Japan Science And Technology Corporation | Hydrogel thin film containing extracellular matrix components |
| WO2002061120A1 (fr) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede pour evaluer l'aptitude d'un medicament a produire une enzyme dans des cellules hepatiques |
| US7829325B2 (en) | 2003-12-16 | 2010-11-09 | Hepahope, Inc. | Drug testing with bio-artificial organ slices including for example those derived from liver |
| WO2007025153A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Hepahope, Inc. | Novel enhanced processes for drug testing and screening using human tissue |
| WO2007025154A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Hepahope, Inc. | Chemosensitivity tester |
| JPWO2017119512A1 (ja) * | 2016-01-08 | 2018-11-15 | Cynity株式会社 | 低分子化合物による成熟肝細胞からの肝幹／前駆細胞の作製方法 |
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