KR20180090979A - Composition for preventing, improving or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising enzyme degrading 2-monoacylglycerol - Google Patents
Composition for preventing, improving or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising enzyme degrading 2-monoacylglycerol Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing, improving or treating hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver comprising 2-monoacylglycerol degrading enzyme.
최근 경제적 발전과 식습관 등의 변화에 따라 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 고인슐린혈증, 제2형 당뇨병, 간지방증 또는 비알코올성 지방간 등 다양한 질환을 포함하는 대사증후군 관련 질환의 발병이 급증하고 있는 상황이다. 이와 같은 질환들은 각각 발생하기도 하지만 일반적으로는 서로 밀접한 관련을 맺고 있으면서 여러 증상들을 동반하여 발생되는 경우가 대부분이다.The incidence of metabolic syndrome-related diseases including various diseases such as obesity, hyperlipidemia, high blood pressure, arteriosclerosis, hyperinsulinemia,
비만은 현대인의 건강을 가장 강력하게 위협하는 질병군이다. 고도의 비만은 인슐린의 감수성을 떨어뜨려 체내의 여러 대사 변화를 유발하게 되며, 결국 혈관계, 신경계 등 많은 합병증을 유발하여 사망하게 된다. 따라서 비만을 줄일 수 있는 생활습관이나 이에 대한 치료 약물을 개발하는 것이 의료계에서 매우 중요하게 생각되고 있다.Obesity is a group of diseases that most strongly threaten the health of modern people. A high degree of obesity decreases the sensitivity of insulin, causing various metabolic changes in the body, and eventually causes many complications such as the vascular system and the nervous system, leading to death. Therefore, it is considered very important in the medical field to develop lifestyle habits that can reduce obesity or drugs to treat them.
비만은 에너지의 섭취와 에너지의 사용의 불균형에서 초래된다. 첫째로 에너지의 섭취는 뇌의 시상하부 그 중추가 있으며, 체내에서 렙틴이나 그렐린 등의 호르몬에 의해 조절된다. 한번 섭취되어 소화관에서 흡수된 영양소는 결코 배설되지 않으며, 에너지로 사용되거나 몸에 저장된다. 따라서 비만 치료에서는 에너지의 섭취를 억제하는 메커니즘으로 비만 억제제를 개발하려는 노력이 있어 왔으며, 푸링이나 리덕틸 같은 식욕억제제가 사용되고 있다.Obesity results from an imbalance between energy intake and energy use. First, energy intake is at the center of the hypothalamus of the brain, and is regulated by hormones such as leptin and ghrelin in the body. Nutrients once ingested and absorbed from the digestive tract are never excreted and are used as energy or stored in the body. Therefore, in obesity treatment, efforts have been made to develop obesity inhibitors as a mechanism to inhibit energy intake, and appetite suppressants such as Puring and Reductil have been used.
에너지 섭취를 감소하는 또 다른 방법은 소화관에서 지방의 흡수를 억제하는 방법이다. 이 방법을 이용한 약물은 제니칼이 있는데, 이는 이자의 지방분해효소인 리파아제를 억제하는 약물이다. 제니칼을 투여할 경우 중성지방은 분해되지 못하여 소화관에서 흡수되지 않고 대변으로 배출된다.Another way to reduce energy intake is by inhibiting the absorption of fat from the digestive tract. The drug using this method is Xenical, which is a drug that inhibits lipase, a lipolytic enzyme of interest. When Xenical is administered, triglycerides cannot be decomposed, so they are not absorbed in the digestive tract and are excreted in the stool.
두 번째 방법은 에너지의 사용을 증대시키는 방법이다. 흔히 비만에 대한 사람들의 대처 방법이 "적게 먹고 운동을 많이 하는 것"이므로 운동을 많이 하여 에너지 소모를 증가시키는 것이 확실한 비만 치료라고 볼 수 있다. 최근에는 약물에 의해 에너지의 소모를 촉진시키기 위한 여러 노력이 이루어지고 있으며, 주로 갈색지방에 존재하는 짝풀림 단백질의 발현을 증가시켜 에너지 소모를 촉진하는 방향으로 연구가 이루어지고 있다.The second way is to increase the use of energy. Often, people's coping with obesity is "eating less and exercising a lot", so exercising a lot to increase energy consumption can be seen as a sure treatment for obesity. Recently, various efforts have been made to promote energy consumption by drugs, and studies are being conducted in the direction of promoting energy consumption by increasing the expression of the decomposition protein present mainly in brown fat.
하지만, 식욕을 억제하는 방법의 경우는 중추 신경에 작용하는 약물이 대부분으로 필연적인 신경계 부작용이 동반되는 경우가 많고, 식욕의 감소는 또한 우울함을 동반할 수 있는 문제점이 있으며, 소화관에서 지방 분해를 억제하는 제니칼의 경우 지방변과 그에 따른 악취 등으로 환자들이 복용하길 꺼려하며, 배변의사의 조절 문제로 사회 생활의 불편함도 초래한다. 짝풀림 단백질을 응용한 에너지 소모 촉진의 방법은 아직도 개발 단계이며, 장기별 특수성에 따라 약물의 특이성이 확보되기 전에는 사람에 이용되기 어려운 형편이다.However, in the case of a method of suppressing appetite, drugs that act on the central nerve are mostly accompanied by inevitable side effects of the nervous system, and a decrease in appetite also has a problem that may accompany depression, and fat breakdown in the digestive tract. In the case of suppressing Xenical, patients are reluctant to take it due to fatty stool and the resulting odor, and it also causes discomfort in social life due to the control problem of a defecation doctor. The method of promoting energy consumption by applying decoupled proteins is still in the development stage, and it is difficult to use in humans until the specificity of the drug is secured according to the specificity of each organ.
또한, 시판되고 있는 항비만제로는 티아졸리디네디온(thiazolidinediones, TZDs), 제니칼(한국로슈)과 시부트라민(sibutramine) 등이 있으나, 이러한 약물들의 부작용으로는 심혈관작용, 중추작용, 간장장애 및 신장장애 등이 있는 것으로 보고되었다. 그러므로 향후 장기 섭취 등에 따른 부작용이 없고 비만 예방과 치료를 겸한 고부가가치의 다기능성 제품의 개발이 시급한 실정이다.In addition, commercially available anti-obesity agents include thiazolidinediones (TZDs), Xenical (Roche Korea), and sibutramine, but side effects of these drugs include cardiovascular action, central action, liver disorders, and kidney disorders. It has been reported to have a back. Therefore, it is urgent to develop a high value-added multifunctional product that does not have side effects due to long-term intake, and has both obesity prevention and treatment.
한편, 모노아실글리세롤 리파아제(monoacylglycerol lipase, MGL)는 모노아실글리세롤을 분해하여 유리 지방산 및 글리세롤을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 종래의 기술에서는 장내에서 모노아실글리세롤 리파아제의 발현 증가에 의해 과식에 기인한 비만 표현형을 야기하는 것으로 보고된바 있으며(Chon, et al., FASEB, 22:807, 2008), 모노아실글리세롤 리파아제를 억제함으로써, 통증, 염증 및 중추신경계(central nervous system; CNS) 장애의 치료에 유용하다고 보고되었다 (Schlossburg et al., Nat. Neurosci., 13(9):1113, 2010). 이들 연구 보고는 모두 모노아실 글리세롤 리파아제가 체내 세포에서 작용할 때의 현상으로, 소화관 내에서 작용할 때에 대한 보고는 없으며, 사람의 소화관에서는 모노아실 글리세롤 리파아제 활성이 없다.On the other hand, monoacylglycerol lipase (MGL) is known to decompose monoacylglycerol to form free fatty acids and glycerol, and in the prior art, obesity caused by overeating due to increased expression of monoacylglycerol lipase in the intestine. It has been reported to cause a phenotype (Chon, et al., FASEB , 22:807, 2008), and by inhibiting monoacylglycerol lipase, it is used in the treatment of pain, inflammation and central nervous system (CNS) disorders. It has been reported to be useful (Schlossburg et al., Nat. Neurosci. , 13(9):1113, 2010). All of these studies are a phenomenon when monoacyl glycerol lipase acts on cells in the body, and there is no report on when it acts in the digestive tract, and there is no monoacyl glycerol lipase activity in the human digestive tract.
이에 본 발명에서는, 모노아실글리세롤 리파아제를 소화관에서 작용하게 할 경우 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시킬 수 있으며, 소화관에서 2-모노아실글리세롤을 모노아실글리세롤 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정의 에너지 소모를 촉진할 수 있으므로, 2-모노아실글리세롤 분해 효소가 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있을 것이라는 아이디어에 착안하여 이를 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, in the present invention, when the monoacylglycerol lipase acts in the digestive tract, it is possible to delay fat absorption by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, thereby reducing the absorption of triglycerides in the blood. When acylglycerol is decomposed into monoacylglycerol lipase, even if absorption is carried out, the recombination of triglycerides in digestive epithelial cells can be delayed or energy consumption in this process can be accelerated. The present invention was completed by proving the idea that it could be used as a prevention or treatment for fatty liver, hyperlipidemia,
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.The present invention has been devised to solve the above problems, and a composition for the prevention, improvement or treatment of hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver steatosis or non-alcoholic fatty liver comprising 2-monoacylglycerol decomposing enzyme; And it provides a health functional food composition for preventing or improving hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.The present invention also includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia or
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소는 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the 2-monoacylglycerol degrading enzyme may be a lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 효소는 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 리파아제일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the enzyme that specifically degrades the 2-monoacylglycerol may be a lipase derived from any one selected from the group consisting of human, mouse, yeast, fungi and bacteria.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the lipase may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현되는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the lipase may be expressed by a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 리파아제는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주에 의해 생산되는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the lipase may be produced by a strain transformed with the recombinant vector.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하여, 2-모노아실글리세롤의 소화상피세포로의 흡수량을 저감하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the 2-monoacylglycerol degrading enzyme completely decomposes 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, thereby reducing the absorption amount of 2-monoacylglycerol into digestive epithelial cells. Can be.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하고, 상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며, 이때, 상기 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모되는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the 2-monoacylglycerol degrading enzyme completely decomposes 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, and the decomposed fatty acids and glycerol are absorbed into digestive epithelial cells, so that triglycerides Energy consumption increases due to the process of being resynthesized as, in this case, the increase in energy consumption means that 3 to 4 ATPs are consumed more than the process in which monoacylglycerol and fatty acids are resynthesized into triglycerides in digestive epithelial cells. I can.
본 발명의 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 포함하는 조성물은 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있으며, 소화관에서 2-모노아실글리세롤을 특이적 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정에서 에너지 소모를 촉진할 수 있으므로, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 등을 예방, 개선 또는 치료하는 의약품 및 건강기능식품에 활용할 수 있다.The composition comprising an enzyme that decomposes 2-monoacylglycerol of the present invention has the effect of delaying fat absorption by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract and reducing blood absorption of triglycerides. When monoacylglycerol is decomposed into a specific lipase, it can delay triglyceride recombination in digestive epithelial cells even if absorption is performed or promote energy consumption in this process.Thus, hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
도 1은 중성지방의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 소화관에서 중성지방의 소화 및 흡수과정을 나타낸 모식도이며, 이자의 리파아제에 의해 분해된 지방산 2개와 모노아실글리세롤은 소화상피세포로 흡수되며, 소화상피세포에서 다시 중성지방으로 재결합하여 카일로미크론의 형태로 임파계로 유리된다.
도 3은 중성지방을 소화한 후 소화상피세포에서 흡수된 지방의 중성지방 재합성 경로를 나타낸 모식도이며, 모노아실글리세롤 리파아제(monoacylglycerol lipase, MGL)가 존재하는 경우 중성지방은 지방산 3개와 글리세롤로 완전히 분해되기 때문에 소화상피세포에서 중성지방을 재형성하는데 더 많은 에너지를 소모하게 된다.
도 4는 사람과 마우스의 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 유전자은행 번호 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 대량 생산을 위해 제조된 박테리아 발현 벡터 시스템을 나타낸 것이다.
도 6은 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 데이터로, 1은 투석 전, 2는 투석 후의 단백질을 의미한다.
도 7은 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 순수분리 정제 과정을 모식화한 그림이다.
도 8은 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여하여 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 9는 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여한 후에 마우스의 모습과 간(liver), 내장지방(epididymal fat, Epi-WAT)을 보여주는 그림이다.
도 10은 6주령 마우스에 돼지 췌장의 리파아제(대조군)와 Candida rugosa 리파아제(실험군)를 각각 7주간 투여한 후 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 나타낸 데이터이다.
도 12는 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 시간 별로 측정한 그림이며, Tyroxapol 투여 유무에 따라 표시하였다.
도 13은 모노아실글리세롤 리파아제 투여 후 1시간과 2시간 후에 마우스를 희생하여 소장 내에 작용하고 있는 효소의 활성을 측정한 결과이다.
도 14는 사람 소장 상피세포주인 Caco-2 세포를 이용하여 소장 상피세포 지방 재결합 능력이 모노아실글리세롤 리파아제의 투여에 의해 감소함을 보여주는 결과이다.
도 15는 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하는 동안 식이량 변화 및 변의 지방 함량을 측정한 것이다.
도 16은 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여한 후에 포도당 부하검사를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing the structure of triglycerides.
Figure 2 is a schematic diagram showing the process of digestion and absorption of triglycerides in the digestive tract, two fatty acids and monoacylglycerol decomposed by lipase of interest are absorbed into digestive epithelial cells, and recombined to triglycerides in digestive epithelial cells again It is liberated into the lymphatic system in the form of microns.
Figure 3 is a schematic diagram showing the triglyceride resynthesis pathway of fat absorbed from digestive epithelial cells after digestion of triglycerides. When monoacylglycerol lipase (MGL) is present, triglyceride is completely composed of three fatty acids and glycerol. Because it is broken down, the digestive epithelial cells consume more energy to reform triglycerides.
Figure 4 shows the gene bank number and amino acid sequence of monoacylglycerol lipase (MGL) of human and mouse.
5 shows a bacterial expression vector system prepared for mass production of monoacylglycerol lipase (MGL).
6 is data showing the results of SDS-PAGE after separation and purification of monoacylglycerol lipase (MGL), where 1 indicates a protein before dialysis and 2 indicates a protein after dialysis.
7 is a diagram schematically illustrating a pure separation and purification process of monoacylglycerol lipase (MGL).
8 is a result of measuring the change in body weight by administering monoacyl glycerol lipase to ob/ob mice in which obesity is induced for about 3 weeks.
FIG. 9 is a diagram showing the appearance of a mouse, liver, and visceral fat (epididymal fat, Epi-WAT) after administration of monoacylglycerol lipase to ob/ob mice in which obesity is induced for about 3 weeks.
FIG. 10 is a graph showing changes in body weight after administration of porcine pancreatic lipase (control) and Candida rugosa lipase (experimental group) to 6-week-old mice for 7 weeks, respectively.
FIG. 11 is data showing changes in blood triglyceride concentration by monoacylglycerol lipase (MGL) in mice administered with olive oil.
FIG. 12 is a diagram showing changes in blood triglyceride concentration by monoacylglycerol lipase in mice to which olive oil was administered over time, and displayed according to the presence or absence of Tyroxapol administration.
13 is a result of measuring the activity of an enzyme acting in the small intestine by sacrificing a
14 is a result showing that the ability of small intestine epithelial cell fat recombination to be reduced by administration of monoacylglycerol lipase using Caco-2 cells, which is a human small intestine epithelial cell line.
FIG. 15 shows changes in dietary amount and stool fat content during administration of monoacyl glycerol lipase to ob/ob mice in which obesity is induced.
FIG. 16 is a graph showing the results of a glucose tolerance test after administration of monoacylglycerol lipase to ob/ob mice induced with obesity for about 3 weeks.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
상술한 바와 같이, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료제로 사용되는 약물은 심장질환, 호흡기 질환, 혈압상승 및 불면증과 같은 부작용을 유발하며 그 효능의 지속성이 낮은 문제점이 있다. 따라서 향후 부작용이 없고, 대사증후군의 예방과 치료, 그리고 산화스트레스를 줄여 다양한 질환 예방 효과를 겸한 고부가 가치의 다기능성 제품의 개발이 시급한 실정이다.As described above, drugs used as treatments for hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
이에, 본 발명은 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에서 제공되는 조성물은 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있으므로, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 의약품 및 건강기능식품에 활용할 수 있다.Accordingly, the present invention has sought a solution to the above-described problem by providing a composition for preventing, improving or treating liver steatosis or non-alcoholic fatty liver comprising an enzyme that degrades 2-monoacylglycerol. The composition provided in the present invention has the effect of delaying fat absorption by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract and reducing blood absorption of triglycerides, so that hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
비만은 혈압 및 혈당을 상승시키고, 혈중 중성지방을 증가시키며 HDL 콜레스테롤을 감소시켜 결과적으로 대사증후군의 위험을 높이고, 궁극적으로는 심혈관 질환의 위험도를 증가시킬 수 있다. 상기 대사증후군(metabolic syndrome)은 복부 비만, 당뇨병, 이상지혈증(중성지방 상승, 고밀도 콜레스테롤 저하), 고혈압 등이 한 사람에게 동시다발적으로 생기는 것을 말한다. 즉, 본 발명의 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 조성물은 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료제로 사용이 가능하므로, 지질 관련 대상증후군 질환의 치료제로도 사용이 가능하다.Obesity raises blood pressure and blood sugar, increases blood triglycerides, and reduces HDL cholesterol, resulting in increased risk of metabolic syndrome, and ultimately, cardiovascular disease risk. The metabolic syndrome refers to the simultaneous occurrence of abdominal obesity, diabetes, dyslipidemia (increased triglycerides, lower high-density cholesterol), and high blood pressure in one person. That is, the composition comprising the 2-monoacylglycerol degrading enzyme of the present invention can be used as a preventive or therapeutic agent for hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
모노아실글리세롤 리파아제는 혈중 중성지방을 감소시킬 수 있으며, 상기 모노아실글리세롤 리파아제가 장 내에 존재하는 경우, 2-모노아실글리세롤이 지방산과 글리세롤로 완전히 분해되어, 모노아실글리세롤 및 지방산이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정을 지연시킬 수 있다.Monoacylglycerol lipase can reduce blood triglycerides, and when the monoacylglycerol lipase is present in the intestine, 2-monoacylglycerol is completely decomposed into fatty acids and glycerol, and monoacylglycerol and fatty acids are converted into digestive epithelial cells. It can delay the process of being absorbed and resynthesized into triglycerides.
또한, 상기 2-모노아실글리세롤을 분해 효소에 의해, 2-모노아실글리세롤이 지방산과 글리세롤로 완전히 분해되고, 상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며, 이때, 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모될 수 있다.In addition, the 2-monoacylglycerol is completely decomposed into fatty acids and glycerol by decomposing enzymes, and the decomposed fatty acids and glycerol are absorbed into digestive epithelial cells and resynthesized into triglycerides. Energy consumption increases, and the increase in energy consumption may consume 3 to 4 ATPs more than the process in which monoacylglycerol and fatty acids are resynthesized into triglycerides in digestive epithelial cells.
본 발명은 소화관에서의 영양소 흡수와 대사 경로의 특성에 착안한 역설적인 발상에서 출발한 것으로서, 소화관에서의 중성지방 소화를 더욱 촉진하여 지방 흡수를 줄이고 에너지 소모를 촉진하는 메커니즘에 기반을 두고 있다.The present invention is based on a paradoxical idea that focuses on the characteristics of nutrient absorption and metabolic pathways in the digestive tract, and is based on a mechanism that further promotes triglyceride digestion in the digestive tract, thereby reducing fat absorption and promoting energy consumption.
도 1에 나타난 바와 같이, 중성지방은 글리세롤에 세 개의 지방산이 결합된 형태를 가지고 있으며, 사람의 소화관에서 중성지방을 분해하는 효소는 이자에서 분비되는 리파아제가 대표적이다. 하지만, 상기 리파아제는 불완전한 리파아제로서, 1번과 3번의 지방산을 분해하지만 2번에 결합된 지방산을 유리하지 못하므로, 결국 이 효소에 의한 산물은 2개의 지방산과 1개의 모노아실글리세롤로 존재하게 된다.As shown in FIG. 1, triglyceride has a form in which three fatty acids are bound to glycerol, and an enzyme that decomposes triglycerides in the human digestive tract is a lipase secreted from pancreas. However, the lipase is an incomplete lipase, and decomposes the
도 2는 소화관에서 중성지방의 소화 및 흡수과정을 나타낸 모식도로, 이자의 리파아제에 의해 분해된 지방산 2개와 모노아실글리세롤은 소화상피세포로 흡수되며, 소화상피세포에서 다시 중성지방으로 재결합하여 카일로미크론의 형태로 임파계로 유리된다.Figure 2 is a schematic diagram showing the process of digestion and absorption of triglycerides in the digestive tract, two fatty acids and monoacylglycerol decomposed by lipase of interest are absorbed into digestive epithelial cells, and recombined to triglycerides in digestive epithelial cells again It is liberated into the lymphatic system in the form of microns.
상기 두 개의 지방산과 모노아실글리세롤이 중성지방으로 결합하는 과정에는 소화상피세포에 존재하는 MGAT2라는 효소가 작용하며, 도 3 상단에 나타낸 바와 같이, 상기 효소는 모노아실글리세롤에서 지방산 하나를 붙여 다이아실글리세롤을 형성하며, 형성된 다이아실글리세롤은 곧 중성지방이 된다. 이렇게 중성지방을 재형성한 후 카일로미크론 형태의 지단백을 형성해야지만 임파계 혹은 혈관계로 분비되어 용해된 채로 순환할 수 있다.In the process of binding the two fatty acids and monoacylglycerol to triglycerides, an enzyme called MGAT2 present in digestive epithelial cells acts, and as shown in the upper part of FIG. 3, the enzyme attaches one fatty acid from monoacylglycerol to diacyl. It forms glycerol, and the formed diacylglycerol soon becomes triglyceride. After reforming triglycerides in this way, lipoproteins in the form of kylomicrons must be formed, but they are secreted into the lymphatic system or the vascular system so that they can circulate in a dissolved state.
도 3 하단에 나타낸 바와 같이, 상기 대사경로에서, 모노아실글리세롤 리파아제를 사용하여 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 분해한다고 가정하면 결국 중성지방의 재형성 경로가 달라지게 된다. 글리세롤은 에너지를 소모하여 인산화가 되어야 하고, 이에 지방산 2개가 붙어 포스파티딘산이 된 다음 인산이 떨어지고 다이아실글리세롤을 형성하는 과정에 의해서 중성지방을 재형성할 수 있다. 상기 과정은 2-모노아실글리세롤이 직접 중성지방을 형성하는 과정에 비하여 3~4개의 ATP가 더 소모되므로, 에너지 소모를 촉진하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있게 된다.As shown in the bottom of FIG. 3, in the metabolic pathway, assuming that 2-monoacylglycerol is decomposed into fatty acids and glycerol using monoacylglycerol lipase, the remodeling pathway of triglycerides is eventually changed. Glycerol needs to be phosphorylated by consuming energy, and two fatty acids are attached thereto to become phosphatidic acid, and then phosphoric acid falls and triglycerides can be reformed by the process of forming diacylglycerol. The above process consumes 3-4 ATPs more than the process in which 2-monoacylglycerol directly forms triglycerides, so it is possible to prevent or treat obesity by promoting energy consumption.
즉, 본 발명에서는, 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 경구 복용하여 소화관 내에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해시키고, 지방의 흡수 및 재형성 지연/에너지 소모를 촉진하여 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 치료에 사용하고자 하였다.That is, in the present invention, by oral administration of an enzyme that decomposes 2-monoacylglycerol, triglycerides are completely decomposed into fatty acids and glycerol in the digestive tract, and the absorption and reformation of fat is delayed / energy consumption is promoted to promote hepatic steatosis, non-alcoholic It was intended to be used in the treatment of fatty liver, hyperlipidemia,
따라서, 본 발명은 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간 예방의 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating liver steatosis or non-alcoholic fatty liver comprising 2-monoacyl glycerol decomposing enzyme; Or it provides a health functional food composition for preventing or improving hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 포함하는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.The present invention also includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia or
나아가, 본 발명은 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.Further, the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising an enzyme that degrades 2-monoacylglycerol; Or it provides a health functional food composition for preventing or improving obesity.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해할 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제일 수 있다.In the composition of the present invention, the 2-monoacylglycerol degrading enzyme may be used without limitation as long as it can completely decompose 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, preferably 2-monoacylglycerol specifically It may be a lipase that degrades.
상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 효소의 기원은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 일 수 있다.The origin of the enzyme that specifically degrades 2-monoacylglycerol is not particularly limited, but may be derived from any one selected from the group consisting of human, mouse, yeast, fungi, and bacteria.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제를 제조하기 위해 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL) 유전자 서열을 재조합 벡터에 도입하고 상기 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 대량 발현할 수 있는 E. coli 시스템을 이용하여 단백질을 발현하여 부분 정제하였으며, His-tag을 이용하여 목적 단백질의 정제를 용이하게 하였다. 그러나, 사람 또는 마우스 이외에도, 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제를 암호화하는 유전자 서열이라면 제한없이 사용할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, in order to prepare a lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol, a human or mouse-derived monoacylglycerol lipase (MGL) gene sequence is introduced into a recombinant vector, and the monoacylglycerol lipase protein The protein was partially purified by expressing the protein using the E. coli system capable of expressing a large amount, and purification of the target protein was facilitated using His-tag. However, in addition to humans or mice, any gene sequence encoding a lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol may be used without limitation.
도 4는 사람과 마우스의 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 유전자은행 번호 및 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 필요에 따라서는 도 4에 제시된 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제의 일부 아미노산 서열을 변형시켜 효소활성을 증가시킬 수 있으며, 모노아실글리세롤 리파아제의 일부 염기서열을 변형시켜 재조합 미생물에서 모노아실글리세롤의 생산을 증가시킬 수 있다.Figure 4 shows the gene bank number and amino acid sequence of monoacylglycerol lipase (MGL) of human and mouse, if necessary, enzyme activity by modifying some amino acid sequences of human or mouse-derived monoacylglycerol lipase shown in Figure 4 May increase, and the production of monoacylglycerol in recombinant microorganisms may be increased by modifying some nucleotide sequences of monoacylglycerol lipase.
도 5는 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 대량 생산을 위해 제조된 박테리아 발현 벡터 시스템을 나타낸 것이며, 이를 이용하여 단백질을 대량 생산 후 조사한 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리가 성공적으로 수행되었다. 모노아실글리세롤 리파아제의 순수분리를 위한 컬럼 정제 공정을 통해 이 단백질에 특화된 단백질의 대량 생산 과정을 도출하였으며, 이를 도 7에 나타내었다.5 shows a bacterial expression vector system prepared for mass production of monoacylglycerol lipase (MGL), and as a result of investigation after mass production of a protein using this, as shown in FIG. 6, isolation of monoacylglycerol lipase (MGL) Was successfully carried out. Through a column purification process for pure separation of monoacylglycerol lipase, a mass production process of a protein specialized for this protein was derived, which is shown in FIG. 7.
도 8 및 9는 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여하여 체중 변화를 측정한 결과이며, 체중 감소와 간의 크기로 보여지는 지방간의 감소, 내장 지방의 감소를 보여준다. 이 결과로 모노아실글리세롤 리파아제의 장기 투여가 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 완화 및 체중 감소에 효과가 있음을 확인하였으며, 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료제와 비만 치료제로 이용할 수 있음을 보여준다.Figures 8 and 9 are results of measuring the weight change by administering monoacylglycerol lipase to ob/ob mice in which obesity is induced for about 3 weeks, and show the reduction of fatty liver and visceral fat as seen by weight loss and liver size. . As a result, it was confirmed that long-term administration of monoacylglycerol lipase is effective in relieving hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver and weight loss, and shows that it can be used as a treatment for hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver and as a treatment for obesity.
도 10은 6주령 마우스에 Candida rugosa 유래의 위치 비특이적 리파아제를 총 6주간 투여하여 체중 변화를 측정한 결과이다. 본 발명에서 용어 "위치 비특이적 리파아제 (non-specific lipase)"란 모든 트리글리세라이드의 모든 세 가지의 지방 아실기와 반응하는 리파아제를 의미한다.10 is a result of measuring the change in body weight by administering a position nonspecific lipase derived from Candida rugosa to a 6-week-old mouse for a total of 6 weeks. In the present invention, the term "non-specific lipase" refers to a lipase that reacts with all three fatty acyl groups of all triglycerides.
2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제는 2-모노아실글리세롤에만 특이적으로 작용하므로, 위치 비특이적 리파아제 보다 기질 특이성 및 분해 활성이 더 우수하여 더욱 효과적으로 비만을 치료할 수 있다. 따라서, 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제는 다른 추가의 성분과의 조합하지 않고 단독으로 사용하여도 비만 치료효과가 탁월하다.Since the lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol acts specifically only on 2-monoacylglycerol, it has better substrate specificity and decomposition activity than that of non-regio-specific lipase, so that obesity can be treated more effectively. Therefore, the lipase that specifically decomposes 2-monoacylglycerol is excellent in treating obesity even when used alone without combining with other additional ingredients.
도 8과 10의 결과를 직접적으로 비교하면, 도 8은 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 모노아실글리세롤 리파아제를 20 unit/day로 투여하고 체중 감량 효과를 본 것이며, 도 10은 위치 비특이적 리파아제의 한 종류인 Candida rugosa 유래 리파아제를 2,000 unit/day로 투여한 후 체중 감량 효과를 본 것으로, 상기 두 실시예에서 효과는 비슷하게 약 3 g 정도의 체중 감량 효과를 보였다. 이는 (1) 모노아실글리세롤을 기질로 한 반응에서 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제의 단백질당 활성이 비특이적 리파아제보다 월등하게 높음(50~100배)을 말해주고, (2) 비특이적 리파아제의 2-모노아실글리세롤에 대한 친화력이 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제만큼 우수하지 않다는 점을 말해주며, (3) 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제는 생리적인 소화액에 의한 중성지방 분해에 영향을 주지 않아 흡수되지 않아도 될 중성지방을 오히려 분해하는 현상이 일어나지 않음을 시사한다. 이러한 사실은 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 분해하는 리파아제가 비특이적 리파아제보다 매우 우수한 치료효과를 보일 수 있음을 의미한다.When comparing the results of FIGS. 8 and 10 directly, FIG. 8 shows a weight loss effect by administering a monoacyl glycerol lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol at 20 unit/day, and FIG. After administration of Candida rugosa- derived lipase, one type of lipase, at 2,000 unit/day, the weight loss effect was seen. In the above two examples, the effect was similar to that of about 3 g. This means that (1) the activity per protein of lipase, which specifically decomposes 2-monoacylglycerol, is significantly higher (50 to 100 times) than that of non-specific lipase in a reaction using monoacylglycerol as a substrate, and (2) non-specific This indicates that the affinity of lipase for 2-monoacylglycerol is not as good as that of lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol.(3) Lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol is physiological. It does not affect the decomposition of triglycerides by digestive juices, suggesting that triglycerides that do not need to be absorbed are rather decomposed. This fact means that a lipase that specifically degrades 2-monoacylglycerol can exhibit a very superior therapeutic effect than a non-specific lipase.
도 11은 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 나타낸 데이터이며, 도 12는 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 시간 별로 측정한 그림이다. 이 결과로 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 혈중 중성지방의 감소에 효과가 있음을 확인하였으며, 고지혈증 치료제로 이용할 수 있음을 보여준다.FIG. 11 is data showing changes in blood triglyceride concentration by monoacylglycerol lipase (MGL) in mice administered with olive oil, and FIG. 12 is a change in blood triglyceride concentration by monoacylglycerol lipase in mice administered with olive oil. This is a picture measured by time. As a result, it was confirmed that the administration of monoacylglycerol lipase is effective in reducing blood triglycerides, and shows that it can be used as a treatment for hyperlipidemia.
도 13과 14는 모노아실글리세롤 리파아제가 투여 후 소장 내에 작용한다는 것과 사람 소장 상피세포주인 Caco-2 세포에서 지방 재결합 지연 효과를 보여주는 결과이다.13 and 14 are results showing that monoacylglycerol lipase acts in the small intestine after administration and the effect of delaying fat recombination in Caco-2 cells, a human small intestine epithelial cell line.
도 15는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하는 동안 식이량 변화 및 변의 지방 함량을 측정한 것으로, 모노아실글리세롤 리파아제의 투여는 식이량에 변화를 가져오지 않으며, 지방변과 같은 부작용도 나타내지 않음을 확인하였다. 지방변은 종래 비만 치료제 중 하나인 제니칼의 심각한 부작용으로, 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제는 이러한 부작용을 전혀 나타내지 않으면서 체중 감소효과가 우수하여 비만 치료제로서 탁월한 효능을 나타냄을 확인하였다.FIG. 15 shows changes in dietary amount and stool fat content during administration of monoacylglycerol lipase, and it was confirmed that administration of monoacylglycerol lipase did not change the dietary amount and did not show side effects such as fatty stool. Fatty stool is a serious side effect of Xenical, one of the conventional obesity treatments, and it was confirmed that the monoacylglycerol lipase of the present invention exhibits excellent effect as a treatment for obesity because it exhibits no such side effects at all and has excellent weight loss effect.
도 16은 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여한 후에 포도당 부하검사를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것으로, 모노아실글리세롤 리파아제의 투여로 인해 비만이 완화되고 이에 따라 체내 대사가 개선되어 포도당 처리 능력이 향상됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 제2형 당뇨병과 같은 대사증후군 치료에 연결될 수 있음을 보여준다.FIG. 16 is a graph showing the results of a glucose tolerance test after administration of monoacylglycerol lipase to ob/ob mice induced with obesity for about 3 weeks, and obesity is alleviated due to the administration of monoacylglycerol lipase. It was confirmed that the metabolism was improved and the glucose processing ability was improved. These results show that the administration of the monoacylglycerol lipase of the present invention can be linked to the treatment of metabolic syndrome such as
본 발명에 따른 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있다. 제제화할 경우에는 2-모노아실글리세롤 분해 효소의 활성을 저해하지 않는 범위에서 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 모노아실글리세롤 리파아제에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 바람직하게는, 2-모노아실글리세롤 분해 효소의 활성이 위산과 위액에 의해 파괴되는 것을 방지하기 위해 코팅제제를 사용할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
본 발명에 따른 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 1 내지 500 unit/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 1 unit은 pH 7.4, 37℃ 조건에서 1시간 동안 모노아실글리세롤 1 μmole이 완전히 분해되는 양을 의미한다. 또한 모노아실글리세롤 리파아제를 포함하는 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The pharmaceutical composition comprising the 2-monoacylglycerol degrading enzyme according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but is generally administered in an amount of 1 to 500 unit/kg once to several times a day. It can be done, and 1 unit means the amount by which 1 μmole of monoacylglycerol is completely decomposed for 1 hour under conditions of pH 7.4 and 37°C. In addition, the dosage of the composition containing monoacylglycerol lipase may be increased or decreased depending on the route of administration, the degree of disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
또한, 본 발명의 2-모노아실글리세롤을 분해 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 상기 건강식품은 상기 모노아실글리세롤 리파아제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 비알코올성 지방간 예방용 음료는 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 예방용 건강보조제는 모노아실글리세롤 리파아제에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.In addition, types of health functional foods comprising a health functional food composition for preventing or improving liver steatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia,
상기 건강식품에 함유된 상기 2-모노아실글리세롤을 분해 효소의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다. The effective dose of the 2-monoacylglycerol degrading enzyme contained in the health food can be used according to the effective dose of the pharmaceutical composition, and the mixed amount of the active ingredient is suitably used according to the purpose of use, such as prophylactic or therapeutic treatment. Can be determined. In the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or for the purpose of health control, it may be less than the above range.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to preferred embodiments so that those of ordinary skill in the art can easily implement the present invention. However, the present invention may be implemented in various different forms and is not limited to the embodiments described herein.
모노아실글리세롤 리파아제 단백질의 제조 및 정제Preparation and purification of monoacylglycerol lipase protein
1-1 : 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제조1-1: Recombinant vector and recombinant microorganism production
본 발명에서는 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 제조하기 위해 단백질을 대량 발현할 수 있는 E. coli 시스템 및 His-tag을 이용하였으며, 사람 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA(Genebank Number: NM_001003794) 및 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA(Genebank Number: NM_011844)의 전사해독틀(open reading frame; ORF) 부분을 pT7-HMT(His-Myc-TEVprotease) 벡터(Geisbrecht BV et al., Protein Expression Purif 46:23-32, 2006)에 클로닝하였다.In the present invention, to prepare a monoacylglycerol lipase protein, an E. coli system and His-tag capable of mass-expressing proteins were used, and human monoacylglycerol lipase mRNA (Genebank Number: NM_001003794) and mouse-derived monoacylglycerol The open reading frame (ORF) portion of the lipase mRNA (Genebank Number: NM_011844) was converted into a pT7-HMT (His-Myc-TEVprotease) vector (Geisbrecht BV et al., Protein Expression Purif 46:23-32, 2006). It was cloned into.
상기 pT7-HMT 벡터는 6개의 His-tag과 목적단백질을 융합하여 박테리아에서 발현시키는 벡터이며, 발현되는 단백질을 쉽게 정제할 수 있는 특징이 있고, TEV protease를 이용해서 필요시에 tag을 분리해낼 수 있는 장점이 있다.The pT7-HMT vector is a vector expressed in bacteria by fusion of six His-tags and a protein of interest, and has the characteristic of being able to easily purify the expressed protein, and the tag can be separated when necessary using TEV protease. There is an advantage.
먼저, 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA의 ORF 부분(ATG 시작 코돈 제외)을 증폭할 수 있는 프라이머를 하기 표 1과 같이 제작하였으며, 증폭된 유전자를 벡터에 삽입할 수 있도록 제한효소 사이트가 포함되도록 제작하였다.First, a primer capable of amplifying the ORF portion (excluding the ATG start codon) of human or mouse-derived monoacylglycerol lipase mRNA was prepared as shown in Table 1 below, and a restriction enzyme site was included so that the amplified gene could be inserted into the vector. It was made to be.
효소limit
enzyme
번호order
number
MGLPerson
MGL
(밑줄 친 부분은 제한효소가 작용하는 부분을 표시한 것임)(The underlined part indicates the part where the restriction enzyme works)
사람 또는 마우스 유래 총 RNA를 지방조직으로부터 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR증폭 산물의 서열을 확인한 결과, 사람의 모노아실글리세롤 리파아제 유전자는 서열번호 5로, 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것을 확인하였다 (표 2).Human or mouse-derived total RNA was extracted from adipose tissue, and PCR (polymerase chain reaction) was performed using each of the primer pairs in Table 1 as a template. As a result of confirming the sequence of the PCR amplified product, it was confirmed that the human monoacylglycerol lipase gene is represented by SEQ ID NO: 5, and the mouse-derived monoacylglycerol lipase gene is represented by SEQ ID NO: 6 (Table 2).
상기 증폭시킨 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 유전자를 NdeI(Cat. No. R0111S; New England BioLabs, 미국) 혹은 SalI(Cat. No. R0138S; New England BioLabs, 미국) 및 XhoI(Cat. No. R0146S; New England BioLabs, 미국) 로 분해한 다음, 동일한 제한 부위를 전달한 pT7-HMT 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이 경우 6개의 His-tag은 단백질의 정제에, Myc-tag은 향후 웨스턴 분석법에 의한 단백질 검출에 이용될 수 있도록 하였다. 또한 필요시 TEV protease를 적용하여 His-Myc-tag을 제거할 수 있도록 디자인하였다.The amplified human or mouse-derived monoacylglycerol lipase gene was NdeI (Cat. No. R0111S; New England BioLabs, USA) or SalI (Cat. No. R0138S; New England BioLabs, USA) and XhoI (Cat. No. R0146S). ; New England BioLabs, USA), and then introduced into the pT7-HMT vector to which the same restriction site was delivered to prepare a recombinant vector. In this case, six His-tags can be used for protein purification, and Myc-tags can be used for protein detection by Western analysis in the future. In addition, it was designed to remove His-Myc-tag by applying TEV protease when necessary.
1-2 : 모노아실글리세롤 리파아제 단백질 생산 및 정제1-2: Monoacylglycerol lipase protein production and purification
그 다음, 상기 재조합 벡터를 대장균인 BL21(DE3)pCodon plus 균주(Cat. No. #230245; Agilent, 미국)에 형질전환하였다. 이 균주를 카나마이신(kanamycin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)과 2%의 에탄올이 함유된 LB 배지 500 ㎖에 접종하여 600 nm의 흡광도가 0.5~0.6이 될 때까지 키운 다음, 단백질 발현을 위해 IPTG를 1 mM로 첨가하여 섭씨 16도에서 16시간 동안 더 배양하였다.Then, the recombinant vector was transformed into E. coli BL21(DE3)pCodon plus strain (Cat. No. #230245; Agilent, USA). This strain was inoculated into 500 ml of LB medium containing kanamycin, chloramphenicol and 2% ethanol, and grown until the absorbance at 600 nm was 0.5-0.6, and then IPTG was added to 1 mM for protein expression. And incubated for 16 hours at 16 degrees Celsius.
배양액에서 균을 원심분리로 수확하여 Lysis buffer(50mM Tris-Cl, pH8.0, 500mM NaCl, 5mM imidazole, pH8.0)에 부유하고, Triton X-100을 1%로 첨가한 다음 lysozyme을 포함한 냉동-해동 방법으로 균을 깨뜨려 단백질 균등액을 만들었다. 초음파 분쇄법으로 핵산을 분해하고 원심분리 후 Ni-NTA agarose bead (Cat. No. 30210, Qiagen, 미국)을 이용하여 His-Myc-MGL 융합 단백질을 컬럼에 결합하였다. 박테리아 용해에 따른 내독소(endotoxin)를 제거하기 위하여 컬럼을 Triton X-114가 0.1%로 포함된 washing buffer를 이용하여 50 컬럼부피로 씻어내고, 그 후 Triton X-114가 없는 washing buffer를 이용하여 10 컬럼부피로 씻어내었다.The bacteria were harvested from the culture by centrifugation, suspended in a Lysis buffer (50mM Tris-Cl, pH8.0, 500mM NaCl, 5mM imidazole, pH8.0), added Triton X-100 in 1%, and frozen with lysozyme. -By defrosting the bacteria, a protein equalization solution was made. The nucleic acid was digested by ultrasonic grinding, and after centrifugation, the His-Myc-MGL fusion protein was bound to the column using Ni-NTA agarose beads (Cat. No. 30210, Qiagen, USA). To remove endotoxin caused by bacterial dissolution, wash the column with 50 column volumes using a washing buffer containing 0.1% Triton X-114, and then use a washing buffer without Triton X-114. Washed off with 10 column volumes.
컬럼에 부착된 단백질의 용출은 여러 테스트 결과 imidazole이 아닌 EDTA를 이용하여 용출하였다. 용출용액(150 mM EDTA, pH 8.0, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0)을 사용하여 수확한 단백질은 이후 200배의 50 mM Tris-Cl, pH 8.0으로 투석을 실시하여 "crude MGL"이라 하여 실험에 이용하였다.The elution of the protein attached to the column was performed using EDTA instead of imidazole as a result of several tests. Protein harvested using the elution solution (150 mM EDTA, pH 8.0, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0) was then dialyzed with 200
도 6은 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 데이터로, 본 발명에서 정제한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 크기는 약 33kDa인 것을 확인하였으며, 실제 마우스 모노아실글리세롤과 동일한 크기를 가지는 것을 확인하였다.6 is data showing the results of SDS-PAGE after separation and purification of mouse-derived monoacylglycerol lipase (MGL). It was confirmed that the size of the mouse-derived monoacyl glycerol lipase (MGL) purified in the present invention was about 33 kDa. And, it was confirmed to have the same size as the actual mouse monoacyl glycerol.
동물에 투여할 모노아실글리세롤 리파아제는 상기 crude MGL을 도 7과 같은 공정을 통해 HiTrap Phenyl HP, HiTrap SP, HiTrapQ 컬럼을 순차적으로 적용하여 더욱 순수하게 정제하였다.Monoacylglycerol lipase to be administered to animals was purified more purely by sequentially applying HiTrap Phenyl HP, HiTrap SP, and HiTrapQ columns to the crude MGL through the process shown in FIG. 7.
모노아실글리세롤 리파아제 단백질의 활성 측정Measurement of activity of monoacylglycerol lipase protein
본 발명에서는 실시예 1에서 정제한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제의 활성을 측정하기 위해 분리한 단백질과 그 기질인 oleoyl-rac-glycerol (Cat. No. M7765, Sigma, 미국)을 반응시키고, 그에 의해 유리되는 glycerol을 Glycerol assay kit(Cat. No. MAK117, Sigma, 미국)를 사용하여 키트에 첨부된 매뉴얼을 참고로 측정하였다. 1 unit은 pH 7.4, 37 ℃ 조건에서 1시간 동안 모노아실글리세롤 1 μmole이 완전히 분해되는 양으로 정의하였다. 이 활성 측정법은 glycerol standard를 참고로 하여 그 양을 계산하였다.In the present invention, in order to measure the activity of the mouse-derived monoacylglycerol lipase purified in Example 1, the protein isolated and its substrate, oleoyl-rac-glycerol (Cat. No. M7765, Sigma, USA) were reacted, thereby reacting. Free glycerol was measured using a Glycerol assay kit (Cat. No. MAK117, Sigma, USA) with reference to the manual attached to the kit. 1 unit was defined as the amount by which 1 μmole of monoacylglycerol was completely decomposed for 1 hour under conditions of pH 7.4 and 37°C. This activity measurement method was calculated by referring to the glycerol standard.
또한 단백질의 농도는 Pierce™ BCA assay kit(Cat. No. 23225, ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용하여 측정하였으며, 이를 통하여 mg 당 활성도를 계산하였다.In addition, the concentration of protein was measured using a Pierce™ BCA assay kit (Cat. No. 23225, ThermoFisher Scientific, USA), through which the activity per mg was calculated.
단백질에 남아있을 수 있는 내독소(endotoxin)는 Pierce™ LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Cat. No. 88282, ThermoFisher Scientific, 미국)을 이용하여 측정하였다.The endotoxin that may remain in the protein was measured using the Pierce™ LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Cat. No. 88282, ThermoFisher Scientific, USA).
위와 같이 측정한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제는 다음과 같은 결과를 보였다.The mouse-derived monoacylglycerol lipase measured as above showed the following results.
농도
3~5 mg/ml, total 300~500 mg / 40 liter culture
활성도 30~100 units/mg proteinActivity 30-100 units/mg protein
내독소 <10 EU/ml (*EU, endotoxin unit)Endotoxin <10 EU/ml (*EU, endotoxin unit)
모노아실글리세롤 리파아제의 비만 감소 효과Effect of monoacylglycerol lipase on obesity reduction
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 모노아실글리세롤 리파아제를 약 3주간 투여한 비만 ob/ob 마우스에서 체중 감소 혹은 체중 증가 지연 효과를 나타내는지를 확인하였다. 렙틴 유전자의 돌연변이로 식욕억제가 둔화되어 비만 형질을 나타내는 ob/ob 마우스(중앙실험동물, 한국)를 대상으로 11주령 마우스에 매일 200 ul (약 20~50 units)의 모노아실글리세롤 리파아제를 경구 가배지(oral gavage)로 약 3주간 매일 투여하였다. 사료의 섭취와 모노아실글리세롤 리파아제의 작용 시점을 동일화하기 위하여 금식을 시킨 다음 가배지를 한 이후 사료를 주는 방법을 선택하였다. In this example, it was confirmed whether the monoacylglycerol lipase prepared in Example 1 was administered for about 3 weeks in obese ob/ob mice to reduce weight or delay weight gain. In ob/ob mice (central laboratory animals, Korea) exhibiting obesity due to slowed appetite suppression due to a mutation in the leptin gene, 200 ul (approximately 20-50 units) of monoacylglycerol lipase was administered orally to 11-week-old mice every day. It was administered daily for about 3 weeks by oral gavage. In order to equalize the intake of feed and the action point of monoacylglycerol lipase, the method of feeding the feed after fasting and temporary medium was selected.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제 투여 후 체중이 의미있게 감소하여 3주 후 대조군에 비해 약 4~5 g의 체중 차이가 남을 확인하였다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이 육안으로도 체중 감소와 간지방증 또는 지방간의 완화, 내장 지방의 감소를 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 8, after administration of monoacylglycerol lipase, the body weight was significantly decreased, and after 3 weeks, it was confirmed that a difference in weight of about 4 to 5 g remained compared to the control group. In addition, as shown in FIG. 9, weight loss, liver steatosis or remission of fatty liver, and reduction of visceral fat were confirmed with the naked eye.
2-모노아실글리세롤의 분해와 비만 감소 효과Decomposition of 2-monoacylglycerol and reduction of obesity
본 실시예에서는 2-모노아실글리세롤 분해 효소에 의한 비만 감소 효과를 확인하였다. 구체적으로, 1,3-특이적 리파아제로 돼지 췌장의 리파아제(L3126, Sigma, 미국)를 대조군으로 하고 비특이적 리파아제로 Candida rugosa 리파아제(L1756, Sigma, 미국)를 선택하여 ob/ob 마우스(중앙실험동물, 한국)에 7주간 가베지로 투여하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.In this example, the effect of reducing obesity by 2-monoacylglycerol degrading enzyme was confirmed. Specifically, 1,3-specific lipase of porcine pancreatic lipase (L3126, Sigma, USA) was used as a control, and Candida rugosa lipase (L1756, Sigma, USA) was selected as a non-specific lipase, and ob/ob mice (central laboratory animals , Korea) was administered by garbage for 7 weeks and the results are shown in FIG. 10.
모노아실글리세롤 리파아제 투여에 의한 혈중 중성지방 감소 효과Effect of monoacylglycerol lipase on reducing triglycerides in blood
본 발명에서는 실시예 1에서 제조한 모노아실글리세롤 리파아제에 의해 실제 혈중 중성지방이 감소하는지 확인하기 위해 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 경구 투여하였으며, 실시예 2의 활성 측정결과를 바탕으로 마우스에 단위(unit)만큼 투여하였다.In the present invention, monoacylglycerol lipase was orally administered to mice to confirm whether the actual blood triglycerides were reduced by the monoacylglycerol lipase prepared in Example 1, and based on the activity measurement result of Example 2, the unit ( unit).
먼저, C57BL6/J 마우스를 4시간 이상 금식한 후에 올리브 오일 250 ㎕를 튜브를 이용한 가베지(gavage) 방법으로 투여하였으며, 동시에 대조군은 식염수 250 ㎕를, 실험군은 250 ㎕의 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 투여하였다. First, after fasting C57BL6/J mice for more than 4 hours, 250 µl of olive oil was administered by a tube-based gavage method, and at the same time, 250 µl of saline solution for the control group and 250 µl of monoacylglycerol lipase protein in the experimental group were administered. I did.
2시간 후에 마우스를 희생하여 혈액을 채취한 다음 혈중 중성지방의 양을 분석하였으며, Triglyceride Colorimetric Assay Kit(Cat No 10010303, Cayman, 미국)를 사용하여 키트에 포함된 매뉴얼에 따라 흡광도 500nm에서 측정하였다. 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스 군에서 혈중 중성지방이 크게 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제는 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.After 2 hours, the mice were sacrificed, blood was collected, and the amount of triglyceride in the blood was analyzed, and the absorbance was measured at 500 nm according to the manual included in the kit using the Triglyceride Colorimetric Assay Kit (Cat No 10010303, Cayman, USA). As a result, as shown in FIG. 11, it was confirmed that triglycerides in blood were significantly reduced in the group of mice administered with monoacylglycerol lipase. Through this, it was confirmed that the monoacylglycerol lipase of the present invention has the effect of reducing blood absorption of triglycerides by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract.
또한, 상기와 같은 실험을 시간 별로 측정한 결과 도 12에 나타난 바와 같이 생리식염수 투여군보다 모노아실글리세롤 리파아제 투여 군에서 지방의 흡수가 매우 낮았으며(도 12A), Tyloxopol을 투여하여 지방조직에 혈중 지방이 유리되는 것을 방지한 실험에서 더욱 확실히 나타났다(도 12B).In addition, as a result of measuring the above experiment by time, as shown in FIG. 12, the absorption of fat was very low in the monoacylglycerol lipase-administered group than in the physiological saline-administered group (FIG. 12A). It appeared more clearly in the experiment that prevented this from being released (FIG. 12B).
소장에서의 모노아실글리세롤 리파아제 활성도 측정Measurement of monoacylglycerol lipase activity in small intestine
본 실시예에서는 상기 실시예 5에서 입증된 지방 흡수 감소 효과가 실제로 모노아실글리세롤 리파아제가 작용한 결과임을 증명하기 위하여 경구 투여한 모노아실글리세롤 리파아제의 활성도를 소장에서 측정하였다.In this Example, the activity of monoacylglycerol lipase administered orally was measured in the small intestine in order to prove that the effect of reducing fat absorption demonstrated in Example 5 was actually the result of the action of monoacylglycerol lipase.
생리식염수 혹은 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 후에 1시간 또는 2시간 이후 마우스를 희생하여 소장 중 공장(jejunum) 부위를 근위부(proximal)와 원위부(distal)로 나누어 해부하고, 이를 PBS에 담가 소장 내의 물질이 PBS에 용출되도록 하였다. 여기에 존재하는 모노아실글리세롤 리파아제의 활성을 실시예 2에서의 방법을 이용하여 측정하였다.After 1 or 2 hours after administration of physiological saline or monoacylglycerol lipase, the mouse is sacrificed and the jejunum area of the small intestine is divided into proximal and distal parts, and the substance in the small intestine is immersed in PBS. This was allowed to elute in PBS. The activity of the monoacylglycerol lipase present here was measured using the method in Example 2.
그 결과, 도 13에서 나타낸 바와 같이 모노아실글리세롤(MGL)을 투여한 군은 경구 투여 후 1시간 후 근위부에서 2시간 후 원위부로 이용하는 것을 볼 수 있으며, 여기에 남아 있는 단백질의 총 활성은 경구 투여한 단백질의 1/5~1/10에 해당하였다. 이는 투여한 모노아실글리세롤 리파아제가 위산과 위액에 의해 파괴되지만 적어도 1/10에 해당하는 효소 활성이 소장에서 작용하고 있음을 의미한다. 따라서 마우스 실험에는 체내 필요량보다 과량을 투여할 필요가 있음을 말해준다. 향후 코팅제제 등의 방법으로 모노아실글리세롤 리파아제를 위산과 위액으로부터 보호할 수 있다.As a result, as shown in FIG. 13, it can be seen that the group administered monoacylglycerol (MGL) is used from the proximal to the distal after 1 hour after oral administration, and the total activity of the remaining proteins is oral administration. It corresponds to 1/5 to 1/10 of one protein. This means that the administered monoacylglycerol lipase is destroyed by gastric acid and gastric juice, but at least 1/10 of the enzyme activity is working in the small intestine. Therefore, it is said that in the mouse experiment, it is necessary to administer an excess amount than the body needs. In the future, monoacylglycerol lipase can be protected from gastric acid and gastric juice by a method such as a coating agent.
모노아실글리세롤 리파아제에 의한 소장세포의 중성지방 재결합 지연 효과Effect of Monoacylglycerol Lipase Delaying Recombination of Triglycerides in Small Intestine Cells
본 실시예에서는 상기 실시예 5와 실시예 6에서 확인된 중성지방 흡수 지연 효과가 실제로 소장세포의 중성지방 재결합 및 혈중 유리 과정을 지연함으로써 나타남을 증명하기 위하여 사람의 소장세포주인 Caco-2 세포(Cat No. HTB37, ATCC, 미국)를 이용하여 실험하였다. 이 배양 시스템은 도 11에 나타낸 바와 같이 소장관 쪽을 apical side로 놓아 소화 지방과 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 투여하고, 혈액 쪽을 basolateral side로 놓아 이 사이에 놓인 소장상피세포가 소화관에서 지방을 흡수하여 혈액으로 유리할 수 있는지를 검사하는 시스템이다. Caco-2 세포를 21일 동안 분화시키고 양측 배지가 세포를 통하지 않고서는 섞일 수 없도록 분화 후 세포간 연결이 잘 되어있는지를 저항 측정법으로 확인한 다음, 소장관 쪽에 oleic acid와 monooleoylglycerol을 투여하고, 생리식염수 혹은 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하였다. 17시간 동안 배양기에 둔 다음 혈액 쪽 배지를 회수하여 이 배지에 포함되어 있는 지단백 표면 단백질인 ApoB 단백질을 ELISA 방법으로 측정하였다.In this example, in order to prove that the effect of delaying the absorption of triglycerides confirmed in Examples 5 and 6 is actually manifested by delaying the triglyceride recombination and blood release process of small intestine cells, Caco-2 cells, a human small intestine cell line ( Cat No. HTB37, ATCC, USA). In this culture system, as shown in FIG. 11, digestive fat and monoacylglycerol lipase protein are administered by placing the small intestine side as the apical side, and the small intestine epithelial cells placed therebetween by placing the blood side as the basolateral side absorb fat from the digestive tract. It is a system that checks whether it can be advantageous with blood. Caco-2 cells were differentiated for 21 days, and after differentiation, so that both media could not be mixed without passing through the cells, the cell-to-cell connection was confirmed by resistance measurement, and then oleic acid and monooleoylglycerol were administered to the small intestine, and physiological saline solution. Alternatively, monoacylglycerol lipase was administered. After being placed in the incubator for 17 hours, the blood side medium was recovered and the ApoB protein, a lipoprotein surface protein, contained in the medium was measured by ELISA.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제 투여군에서 ApoB의 검출량이 매우 낮아졌음을 확인하였고, 이는 이 효소에 의해 모노아실글리세롤의 흡수를 저해하면 소장 상피세포의 혈중 지방 유리를 지연 또는 감소시킬 수 있다는 직접적인 증명이다.As a result, as shown in Fig. 14, it was confirmed that the amount of ApoB detected in the monoacylglycerol lipase-administered group was very low, and this indicates that inhibition of the absorption of monoacylglycerol by this enzyme delayed or reduced blood fat release of small intestinal epithelial cells. It is a direct proof that you can do it.
실시예 5, 6 및 7의 결과를 실시예 3의 결과와 종합하면, 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 소장 상피세포의 중성지방 재결합을 지연 혹은 감소시키고, 이에 따라 혈중에 유리되어 지방조직에 축적되는 지방량이 감소한 결과 체중 감소로 이어짐을 나타내고 있으며, 이는 이 효소에 의해 모노아실글리세롤 흡수를 저해함으로써 모노아실글리세롤 리파아제를 비만 치료제로 이용할 수 있다는 것을 의미한다.When the results of Examples 5, 6, and 7 are combined with the results of Example 3, administration of monoacylglycerol lipase in mice delays or decreases triglyceride recombination of small intestine epithelial cells, thereby being released in blood and thereby affecting adipose tissue. As a result of reducing the amount of accumulated fat, it indicates that it leads to weight loss, which means that monoacylglycerol lipase can be used as a treatment for obesity by inhibiting the absorption of monoacylglycerol by this enzyme.
2-모노아실글리세롤 리파아제의 투여에 따른 식이량 및 지방변 확인Confirmation of dietary amount and fat stool according to administration of 2-monoacylglycerol lipase
소장 내에서 모노아실글리세롤을 분해하여 지방 흡수가 지연되면 식이량도 변화할 수 있고 대변으로 지방이 과다 배출되어 지방변이 유발될 가능성을 생각할 수 있는데, 이를 조사하기 위해 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하는 중에 식이량을 측정하고, 또한 랜덤하게 변을 채취하여 지방 함량을 조사하였다. 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제의 투여는 식이량의 변화를 가져오지 않았으며, 지방변과 같은 부작용이 나타나지 않았다. 이는 지방 흡수를 저해하는 작용이 소장에서의 에너지 소모를 촉진함과 동반됨을 의미하며, 제니칼(성분명 orlistat)과 같은 약물이 지방 흡수를 억제하는 것과는 메커니즘이 다르고 지방변 부작용도 없음을 보여주고 있다.If fat absorption is delayed by decomposing monoacylglycerol in the small intestine, it is possible to change the amount of diet and cause fat stool due to excessive excretion of fat in the stool. To investigate this, during administration of monoacylglycerol lipase. The amount of diet was measured, and the stool was randomly collected to investigate the fat content. As a result, as shown in FIG. 15, administration of monoacylglycerol lipase did not result in a change in the amount of diet, and side effects such as fatty stool did not appear. This means that the action of inhibiting fat absorption is accompanied by the promotion of energy consumption in the small intestine, and the mechanism is different from that of drugs such as Xenical (ingredient name orlistat) to inhibit fat absorption, and there are no side effects of fat stool.
포도당 부하검사Glucose tolerance test
본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 모노글리세롤 리파아제를 투여한 마우스를 대상으로 포도당 부하검사를 실시하였다.In this example, a glucose tolerance test was performed on the mice administered with monoglycerol lipase in Example 3.
모노글리세롤 리파아제가 투여된 마우스에 포도당 1.5 mg/g body weight을 복강주사로 투여하였으며, 부하전, 부하후 15분, 30분, 60분 및 120분에 채혈하여 혈당치를 측정하였다.To mice to which monoglycerol lipase was administered, glucose 1.5 mg/g body weight was administered by intraperitoneal injection, and blood was collected at 15, 30, 60 and 120 minutes before and after loading, and blood glucose levels were measured.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 포도당 부하검사가 크게 향상된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 모노아실글리세롤 리파아제가 당뇨병과 같은 대사증후군 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.As a result, it was confirmed that the glucose tolerance test was greatly improved as shown in FIG. 16. These results suggest that monoacylglycerol lipase can be used to treat metabolic syndrome such as diabetes.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for preventing, improving or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising enzyme degrading 2-monoacylglycerol <130> 1061057 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MGL forward primer <400> 1 gccatatgcc agaggaaagt tccccagg 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MGL reverse primer <400> 2 cgctcgagtc agggtgggga cgcagttc 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse MGL forward primer <400> 3 gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccagg 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse MGL reverse primer <400> 4 cgctcgagtc agggtggaca cccagctc 28 <210> 5 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human monoacylglycerol lipase(MGL) <400> 5 gccatatgcc agaggaaagt tcccccaggc ggaccccgca gagcattccc taccaggacc 60 tccctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttctg caggtactgg aaacccacag 120 gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagccgg agagcacagt ggccgctatg 180 aagagctggc tcggatgctg atggggctgg acctgctggt gttcgcccac gaccatgttg 240 gccacggaca gagcgaaggg gagaggatgg tagtgtctga cttccacgtt ttcgtcaggg 300 atgtgttgca gcatgtggat tccatgcaga aagactaccc tgggcttcct gtcttccttc 360 tgggccactc catgggaggc gccatcgcca tcctcacggc cgcagagagg ccgggccact 420 tcgccggcat ggtactcatt tcgcctctgg ttcttgccaa tcctgaatct gcaacaactt 480 tcaaggtcct tgctgcgaaa gtgctcaacc ttgtgctgcc aaacttgtcc ctcgggccca 540 tcgactccag cgtgctctct cggaataaga cagaggtcga catttataac tcagaccccc 600 tgatctgccg ggcagggctg aaggtgtgct tcggcatcca actgctgaat gccgtctcac 660 gggtggagcg cgccctcccc aagctgactg tgcccttcct gctgctccag ggctctgccg 720 atcgcctatg tgacagcaaa ggggcctacc tgctcatgga gttagccaag agccaggaca 780 agactctcaa gatttatgaa ggtgcctacc atgttctcca caaggagctt cctgaagtca 840 ccaactccgt cttccatgaa ataaacatgt gggtctctca aaggacagcc acggcaggaa 900 ctgcgtcccc accctgactc gagcg 925 <210> 6 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse monoacylglycerol lipase(MGL) <400> 6 gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccaggc gaactccaca gaatgttccc taccaggacc 60 tgcctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttttg tagatactgg aagcccagtg 120 gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagctgg ggaacactgt ggccgttatg 180 atgagctggc tcatatgttg aaggggctgg acatgctggt atttgcccat gaccatgttg 240 gccatgggca gagtgaggga gagaggatgg tggtgtcgga cttccaagtt tttgtcagag 300 atgtgctgca acacgtggac accatccaga aggactaccc cgacgtcccc atcttcctcc 360 tgggccactc catgggcggt gccatctcca tcctagtggc tgcagagagg ccaacctact 420 tttctggcat ggtcctgatt tcacctctgg tccttgccaa tccggaatct gcatcgactt 480 tgaaggtcct tgctgccaaa ctgctcaatt ttgtcctgcc aaatatgacc ttggggcgca 540 ttgactccag cgtgctgtct cggaacaagt cggaggttga cctgtacaac tctgacccac 600 tcgtctgccg agcagggctg aaggtgtgct ttggcataca gctgctgaat gccgtcgcaa 660 gagtggagcg agcaatgccc aggctgacac tgccattcct gctgctgcag ggttctgctg 720 accggctttg cgacagcaaa ggtgcctacc tgctcatgga atcatcccgg agtcaggaca 780 aaacactcaa gatgtatgaa ggtgcctatc acgtcctcca cagggagctt ccggaagtga 840 ccaactccgt cctccatgaa gtaaactcgt gggtgtctca caggatagca gcagcaggag 900 ctgggtgtcc accctgactc gagcg 925 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for preventing, improving or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising enzyme degrading 2-monoacylglycerol <130> 1061057 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MGL forward primer <400> 1 gccatatgcc agaggaaagt tccccagg 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MGL reverse primer <400> 2 cgctcgagtc agggtgggga cgcagttc 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse MGL forward primer <400> 3 gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccagg 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse MGL reverse primer <400> 4 cgctcgagtc agggtggaca cccagctc 28 <210> 5 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human monoacylglycerol lipase (MGL) <400> 5 gccatatgcc agaggaaagt tcccccaggc ggaccccgca gagcattccc taccaggacc 60 tccctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttctg caggtactgg aaacccacag 120 gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagccgg agagcacagt ggccgctatg 180 aagagctggc tcggatgctg atggggctgg acctgctggt gttcgcccac gaccatgttg 240 gccacggaca gagcgaaggg gagaggatgg tagtgtctga cttccacgtt ttcgtcaggg 300 atgtgttgca gcatgtggat tccatgcaga aagactaccc tgggcttcct gtcttccttc 360 tgggccactc catgggaggc gccatcgcca tcctcacggc cgcagagagg ccgggccact 420 tcgccggcat ggtactcatt tcgcctctgg ttcttgccaa tcctgaatct gcaacaactt 480 tcaaggtcct tgctgcgaaa gtgctcaacc ttgtgctgcc aaacttgtcc ctcgggccca 540 tcgactccag cgtgctctct cggaataaga cagaggtcga catttataac tcagaccccc 600 tgatctgccg ggcagggctg aaggtgtgct tcggcatcca actgctgaat gccgtctcac 660 gggtggagcg cgccctcccc aagctgactg tgcccttcct gctgctccag ggctctgccg 720 atcgcctatg tgacagcaaa ggggcctacc tgctcatgga gttagccaag agccaggaca 780 agactctcaa gatttatgaa ggtgcctacc atgttctcca caaggagctt cctgaagtca 840 ccaactccgt cttccatgaa ataaacatgt gggtctctca aaggacagcc acggcaggaa 900 ctgcgtcccc accctgactc gagcg 925 <210> 6 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse monoacylglycerol lipase (MGL) <400> 6 gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccaggc gaactccaca gaatgttccc taccaggacc 60 tgcctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttttg tagatactgg aagcccagtg 120 gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagctgg ggaacactgt ggccgttatg 180 atgagctggc tcatatgttg aaggggctgg acatgctggt atttgcccat gaccatgttg 240 gccatgggca gagtgaggga gagaggatgg tggtgtcgga cttccaagtt tttgtcagag 300 atgtgctgca acacgtggac accatccaga aggactaccc cgacgtcccc atcttcctcc 360 tgggccactc catgggcggt gccatctcca tcctagtggc tgcagagagg ccaacctact 420 tttctggcat ggtcctgatt tcacctctgg tccttgccaa tccggaatct gcatcgactt 480 tgaaggtcct tgctgccaaa ctgctcaatt ttgtcctgcc aaatatgacc ttggggcgca 540 ttgactccag cgtgctgtct cggaacaagt cggaggttga cctgtacaac tctgacccac 600 tcgtctgccg agcagggctg aaggtgtgct ttggcataca gctgctgaat gccgtcgcaa 660 gagtggagcg agcaatgccc aggctgacac tgccattcct gctgctgcag ggttctgctg 720 accggctttg cgacagcaaa ggtgcctacc tgctcatgga atcatcccgg agtcaggaca 780 aaacactcaa gatgtatgaa ggtgcctatc acgtcctcca cagggagctt ccggaagtga 840 ccaactccgt cctccatgaa gtaaactcgt gggtgtctca caggatagca gcagcaggag 900 ctgggtgtcc accctgactc gagcg 925
Claims (21)
A pharmaceutical composition for preventing or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising lipase which specifically degrades 2-monoacylglycerol as an active ingredient.
2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the lipase specifically degrading the 2-monoacylglycerol is derived from any one selected from the group consisting of human and mouse.
3. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the lipase is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
4. The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the lipase is expressed by a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
5. The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the lipase is produced by a strain transformed with the recombinant vector.
The lipase specifically degrading the 2-monoacylglycerol according to claim 1, wherein the lipase which completely decomposes the 2-monoacylglycerol into a fatty acid and glycerol to reduce the amount of 2-monoacylglycerol absorbed into digestive epithelial cells ≪ / RTI >
A health functional food composition for preventing or ameliorating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising lipase which specifically degrades 2-monoacylglycerol as an active ingredient.
A pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia or type 2 diabetes comprising lipase which specifically degrades 2-monoacylglycerol as an active ingredient.
9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the lipase specifically degrading the 2-monoacylglycerol is derived from any one selected from the group consisting of human and mouse.
10. The pharmaceutical composition according to claim 9, wherein the lipase is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
11. The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the lipase is expressed by a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the lipase is produced by a strain transformed with the recombinant vector.
9. The method according to claim 8, wherein the lipase which specifically degrades the 2-monoacylglycerol completely decomposes the 2-monoacylglycerol into a fatty acid and glycerol to reduce the amount of 2-monoacylglycerol absorbed into digestive epithelial cells ≪ / RTI >
A health functional food composition for preventing or ameliorating hyperlipidemia or type 2 diabetes comprising lipase which specifically degrades 2-monoacylglycerol as an active ingredient.
A pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising lipase which specifically degrades 2-monoacylglycerol as an active ingredient.
16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the lipase specifically degrading the 2-monoacylglycerol is derived from any one selected from the group consisting of human and mouse.
17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the lipase is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein the lipase is expressed by a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
19. The pharmaceutical composition according to claim 18, wherein the lipase is produced by a strain transformed with the recombinant vector.
상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며,
이때, 상기 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
16. The method according to claim 15, wherein the lipase specifically degrading the 2-monoacylglycerol is a compound obtained by completely decomposing 2-monoacylglycerol into a fatty acid and glycerol,
Since the degraded fatty acid and glycerol are absorbed into digestive epithelial cells and regenerated into triglycerides, energy consumption is increased,
Wherein the increase in energy consumption is such that 3 to 4 ATPs are consumed more in the digestive epithelial cell than monoacylglycerol and fatty acid are re-synthesized into triglyceride.
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