KR20180088837A - 재조합 효모를 사용한 오르토-아미노벤조산 및/또는 아닐린의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모 세포를 사용한 발효성 기질로부터의 o-아미노벤조산의 제조에 관한 것이다.

Description

재조합 효모를 사용한 오르토-아미노벤조산 및/또는 아닐린의 제조 방법

본 발명은 효모 세포를 사용한 발효성 기질로부터의 o-아미노벤조산의 제조에 관한 것이다.

현재, 시판되는 o-아미노벤조에이트 또는 상응하는 산의 재생 가능한 또는 생물학적으로 유래된 공급원이 없다. o-아미노벤조에이트는 시키메이트 산 경로의 자연 중간체이고 방향족 아미노산 L-트립토판의 생합성을 위한 전구체이다. o-아미노벤조에이트의 아닐린으로의 화학적 전환은 WO 2015/124687에 기재되어 있다.

현재의 아닐린 제조 방법은 석유-유래 원료로부터의 화학적 합성에 의존한다. 이러한 석유-유래 원료는 재생 가능한 자원 "바이오매스"와 같은, 재생 가능한 원료와는 반대로 재생 가능하지 않다. 아닐린의 화학 합성은 다단계 공정이다. 아닐린의 제조에 관련된 몇몇의 반응 단계는 높은 제조 비용을 초래한다. 더욱이, 아닐린의 통상적인, 즉 화학적, 합성은 위험한 중간체, 용매, 및 폐기물과 연관되어 환경에 상당한 영향을 줄 수 있다. 방향족-고리에서의 비-특이적 부반응은 생성물 수율의 감소를 초래하므로, 제조 비용을 추가로 증가시킨다. 석유-유래 원료는 글로벌 석유 가격에 기인하는 비용 변동에 의해 영향을 받는다.

WO 2015/124687는 생물학적으로-유래된 o-아미노벤조에이트 및 아닐린 제조의 개념을 개시한다. 두 전환 단계가 적용된다: (1) o-아미노벤조에이트의 발효적 생산 및 (2) o-아미노벤조산의 아닐린으로의 후속 촉매 전환. 전반적인 공정 개념은 하기 가공 단계를 포함한다:

a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 박테리아 숙주 세포를 사용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료의 발효에 의해, 안트라닐레이트 음이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제조하는 단계, (이어서 세포 제거),

b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 세포 무함유 수성 발효 브로쓰 내 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,

c) 침전에 의해 또는 유기 용매 내 용해에 의해 상기 안트라닐산을 회수하는 단계, 및

d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계.

상기 공정에 사용되는 재조합 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 과에 속한다. 두 박테리아 모두 유산소 조건 하에서, pH 7에서, 및 전형적으로 지수기 동안 o-아미노벤조에이트를 생산한다. WO 2015/124687에 기재된 박테리아의 이들 특징은 몇몇의 문제로 이어진다:

(i) pH 7에서의 o-아미노벤조에이트의 발효적 제조로 인하여 (단계 a), 염기, 예를 들어 NaOH가 안정한 중성 pH를 보장하기 위해 첨가될 필요가 있다. 후속 단계 b) 동안, 산, 예를 들어 HCl이 o-아미노벤조에이트를 o-아미노벤조산으로 전환시키기 위해 첨가될 필요가 있다. 그러므로, 부산물로서, 예를 들어 NaCl이 형성된다. NaOH, HCl의 사용 및 생성된 NaCl 염 용액의 폐수 처리는 선행 기술에 기재된 생명공학적 공정에 의해 제조되는 o-아미노벤조산의 증가된 제조 비용을 초래한다.

(ii) 더욱이, o-아미노벤조에이트는 미생물 세포에 독성을 가진다. 만약 미생물 세포가 o-아미노벤조에이트에 대한 증가된 내성을 보이는 경우, 상기 내성에 대해 기본이 되는 많은 메커니즘이 에너지 소비를 필요로 한다. 그러므로, 발효성 기질의 특정 부분은 유지 대사를 위해 소비되어 o-아미노벤조에이트의 감소된 수율을 초래한다. 이러한 이유로, 공정의 합당한 시공간 수율을 위해 요구되는 o-아미노벤조에이트의 높은 역가는 동시에 생성물 수율을 감소시킨다.

(iii) 발효가 유산소 조건에서 수행되기 때문에, 발효 용기는 통기되고 교반되어야 하며, 둘 다 발효 유닛에 대한 투자 및 작동 비용의 증가를 초래한다.

(iv) 더욱이, o-아미노벤조에이트는 전형적으로 지수기 동안 생성되고 미생물 성장과 결부된다. 이 사실은 o-아미노벤조에이트 제조의 전반적인 수율을 더욱 감소시킨다.

아닐린 제조를 위한 전구체로서 재생 가능한 공급원으로부터의 o-아미노벤조에이트의 생명공학적 제조가 잠재적인 이점을 제공하지만, 박테리아가 발효에 사용되는 경우 상기-기재된 모든 인자는 이 공정의 잠재적인 이점을 경감시킨다.

그러므로, 재생 가능한 공급원으로부터 o-아미노벤조에이트 및 아닐린을 제조하기 위한 대안적인 방법이 필요하다.

이 문제는 청구범위 및 설명에서 정의된 실시양태에 의해 해결된다.

첫 번째 실시양태에서, 본 발명은 o-아미노벤조산의 제조 방법에 관한 것으로

a) 적어도 하나의 발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포를 사용하여 발효 용기에서 적어도 하나의 발효성 기질을 발효시키는 단계; 및

b) 생성된 o-아미노벤조산을 발효 브로쓰로부터 분리하는 단계

를 포함한다.

발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포

발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포는 적어도 발효성 기질의 한 부분을 o-아미노벤조산으로 전환시키고 생성된 o-아미노벤조산의 적어도 한 부분을 발효 브로쓰로 방출하는 효모 세포이다. o-아미노벤조산은 방향족 아미노산 트립토판의 생산으로 이어지는 생화학적 경로 내 중간체이므로, 야생형 효모 세포는 대개 o-아미노벤조산을 방출하지 않는다. 그러므로, 적어도 하나의 발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포는, 바람직하게는, 생성된 o-아미노벤조산 모두가 추가의 생화학적 반응에 이용되는 것이 아니라 세포 내 축적되어 최종적으로 발효 브로쓰로 방출되는 방식으로 생화학적 경로가 변형된 효모 세포이다.

원칙적으로, 이러한 세포를 얻는 데 두 가지 접근법이 있다. (i) 트립토판의 합성으로 이어지는 다운스트림 반응에 의해 o-아미노벤조산의 생산율이 소비율을 초과할 수 있도록 o-아미노벤조산으로 유도되는 경로를 통한 탄소 플럭스가 증가될 수 있다. (ii) 야생형 균주에서의 o-아미노벤조산의 생산율 조차도 이 화합물의 축적을 야기할 수 있도록 o-아미노벤조산을 후속 대사물질 또는 생성물, 예를 들어 트립토판으로 전환시키는 경로의 용량이 감소될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 o-아미노벤조산을 소비하는 적어도 하나의 생화학적 경로는 완전히 차단된다. 효모 세포가 야생형 세포에 비해 o-아미노벤조산의 증가된 생산율 및 동시에 o-아미노벤조산의 감소된 소비를 가질 수 있도록 두 접근법이 조합되는 경우 특히 유리한 결과가 얻어진다.

상기-기재된 성질을 가진 효모 세포를 얻는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 적합한 세포는 o-아미노벤조산을 배지로 방출시키는 돌연변이체를 스크리닝함으로써 간단히 선택될 수 있다. 이러한 실험에서 돌연변이체의 빈도는 이온화 방사선 또는 화학적 돌연변이유발원과 같은 일반적인 수단에 의해 증가될 수 있다. 그러나, 이 공정은 우연에 달려있기 때문에, 유전 공학에 의해 관련 경로의 핵심효소를 표적화하는 것이 더 바람직하다. 유전 공학의 일반적인 방법을 사용하여 유전자의 발현 및 효소 활성이 자유롭게 증가하거나, 감소하거나 또는 심지어 없어질 수 있다.

본 발명의 방법에 사용될 바람직한 효모 종은 아시비아 고시피이(Ashbya gossypii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리타카(Yarrowia lipolytica), 자이고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii) 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 가장 바람직하게는, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에이다.

바람직하게는, 발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포는 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성의 변형을 포함하고, 이는 상기 효소 활성을 감소시킨다. 이 변형에 의해, o-아미노벤조에이트로부터 N-(5-포스포-D-리보실)-안트라닐레이트로의 플럭스는 감소되거나 또는 완전히 없어진다. 그러므로, 상기 변형은 o-아미노벤조에이트의 축적으로 이어진다.

용어 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성은 o-아미노벤조에이트의 N-(5-포스포-D-리보실)-안트라닐레이트로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 지칭한다. 효모에서, 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성은 Trp4 (YDR354W)에 의해 매개된다.

안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성의 상기-기재된 감소는 세 가지 주요 방식으로 달성될 수 있다: (i) 유전자의 전사가 감소되거나 없어지도록 효모 내 trp4 유전자의 발현의 조절이 변형될 수 있다. (ii) 변형된 유전자에 의해 인코딩된 효소가 더 낮은 고유 활성을 갖도록 trp4 유전자의 핵산 서열이 변형될 수 있다. (iii) trp4 유전자는 효모 이외의 유기체로부터 유래되고 Trp4보다 더 낮은 고유 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 가진 효소를 인코딩하는 유전자로 대체될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 효모 세포는 잔류 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 가지지 않는다. 바람직하게는, 이는 효모 세포 내 trp4 유전자의 발현을 없애거나 또는 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성이 없는 단백질이 생성되는 방식으로 trp4 유전자의 핵산 서열을 변형함으로써 달성된다. 이러한 변형으로부터 생성된 균주는 또한 “녹-아웃(knock-out) 균주”로서 당업계에 공지되어 있다. 명백하게, 이러한 균주는 L-트립토판에 대한 영양요구성이다.

o-아미노벤조산

본원에서 지칭되는 용어 “o-아미노벤조산“은 2-아미노벤조산에 관한 것이다. 이 화합물은 또한 안트라닐산으로 알려져 있다. 당업자는 산이 중성 물질로서 그의 양성자화된 형태로 존재할 수 있거나 음이온으로서 탈양성자화될 수 있음을 알고 있다. 수용액에서 산의 일부는 양성자화되고 일부는 음이온으로 존재한다. 양성자화된 산과 음이온 사이의 비율은 용액의 pH와 해당 산의 해리 상수 K_a에 의해 결정된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 “o-아미노벤조산”은 항상 양성자화된 산 뿐만 아니라 상응하는 음이온 둘 다를 지칭한다.

발효 브로쓰

발효의 시작시, 발효 브로쓰는 재조합 효모 세포 및 적어도 하나의 발효성 기질을 포함한다. 바람직하게는, 발효 브로쓰는 추가적으로 재조합 효모 세포의 성장 및/또는 유지에 필수적인 완충 시스템, 무기 영양소, 아미노산, 비타민 및 다른 유기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 발효 브로쓰는 수성이다. 충분한 시간의 발효 후 발효 브로쓰는 또한 원하는 발효 생성물인, o-아미노벤조산을 포함한다.

발효성 기질

본원에 의해 이해되는 발효성 기질은 산소의 존재 또는 부존재 하에 o-아미노벤조산을 생산하기 위해 재조합 효모 세포에 의해 이용될 수 있는 임의의 유기 화합물 또는 유기 화합물의 혼합물이다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태가 무산소 조건 하에서의 o-아미노벤조산의 제조에 관한 것이기 때문에, 발효성 기질은 바람직하게는 무산소 조건 하에서 o-아미노벤조산으로 전환될 수 있는 유기 화합물 또는 유기 화합물의 혼합물이다. 바람직한 발효성 기질은 추가적으로 재조합 효모 세포의 성장을 위한 에너지 및 탄소 공급원으로 사용한다. 바람직한 발효성 기질은 가공된 사탕무, 사탕 수수, 전분-함유 식물 및 리그노셀룰로스이다. 또한 바람직한 발효성 기질은 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO, 및 발효성 당이다.

바람직한 발효성 당은 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트리-사카라이드이다. 바람직한 C-5 모노사카라이드는 크실로스 및 아라비노스이다. 바람직한 C-6 모노사카라이드는 글루코스, 프룩토스 및 만노스이다. 바람직한 디사카라이드는 사카로스이고 바람직한 트리사카라이드는 케스토스이다. 바람직한 전분-함유 식물은 옥수수, 밀 및 호밀이다. 리그노셀룰로스는 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스(bagasse)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발효 브로쓰, 다른 구성 요소

발효성 기질 이외에도, 발효 브로쓰는 또한 재조합 효모 세포의 성장 및/또는 유지 대사를 위해 요구되는 무기 영양소, 아미노산, 비타민 및 다른 유기 화합물을 포함한다. 당업자는 원하는 바이오매스 농도를 달성하기 위하여 배지에 공급되어야 하는 무기 영양소의 유형과 양을 알고 있다. 효모의 상이한 균주는 비타민, 아미노산 및 다른 유기 화합물에 대한 그들의 필요성에 관해서 다를 수 있다. 만약 이 정보가 균주의 공급자에 의해 주어지지 않으면, 당업자에게 일상적인 간단한 성장 실험에 의해 얻어질 수 있다.

o-아미노벤조산의 축적 및 방출을 가능하게 하는 효모 세포의 유전자 변형은 재조합 효모 세포의 성장 및/또는 유지에 필수적인 유기 화합물을 제공하는 생화학적 경로를 통해 탄소 플럭스를 방해하거나 감소시킬 수 있다. 이러한 유전자 변형을 가진 재조합 효모 세포는, 그러므로, 특별한 영양요구성을 갖는다. 배지의 조성은 이러한 영양요구성을 고려해야 한다. 만약 효모 세포가 본 발명의 바람직한 실시양태에서와 같이 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 갖지 않으면, 이는 L-트립토판에 대해 영양요구성이고 이 아미노산은 발효 브로쓰에 첨가되어야 한다.

바람직하게는, 발효 브로쓰는 추가적으로 적어도 하나의 완충 시스템을 포함한다. 완충 시스템은 약산 및 그의 짝염기 또는 그 반대를 포함한다. 완충액의 효과로서, 발효 브로쓰에 강산 또는 강염기를 첨가하면 완충액이 없는 경우보다 그의 pH 값이 상당히 낮게 변한다. 각각의 원하는 pH 범위에 대해 적어도 하나의 적합한 완충 시스템이 있다. 이러한 완충액은 당업자에게 공지되어 있다. 하나의 바람직한 완충액은 시트레이트 완충액이다.

그러나, 본 발명의 방법의 산업적 적용에서 완충액 물질이 추가 비용을 야기하므로 발효 브로쓰에 산 또는 염기를 첨가함에 의해 pH를 조정하는 것이 바람직할 것이다.

발효 용기

용어 “발효 용기”는 발효성 기질의 o-아미노벤조산으로의 발효를 수행하기 위해 사용될 수 있는 임의의 용기에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 발효 용기는 온도, pH, 기질 농도, 생성물 농도, 용존 산소 및 발효 브로쓰의 세포 밀도와 같은 관련 공정 파라미터를 측정하기 위한 수단을 포함한다. 바람직하게는, 발효 용기는 추가적으로 적어도 하나의 상기 공정 파라미터를 조정하기 위한 수단을 포함한다.

일반적으로, 당업자는 주어진 발효 공정에 적합한 발효 용기를 설계하는 방법을 알고 있다. 특히, 발효 용기의 설계는 원하는 모드의 발효 공정 (배치, 공급형-배치 또는 연속 발효)에 맞게 조정되어야 한다. 발효 용기는 교반 탱크 반응기, 막형 반응기, 플러그 흐름 반응기, 또는 루프 반응기 (문헌 [Bioprozesstechnik, Horst Chmiel, ISBN-10: 3827424763, Spektrum Akademischer Verlag])를 포함한다. 호기성 및 혐기성 발효를 위한 바람직한 반응기 용기는 교반 탱크 반응기 또는 루프 반응기 (특히 에어리프트)이다.

본 발명은 o-아미노벤조산을 제조하는 방법의 단계 a) 및 제조된 o-아미노벤조산을 분리하는 방법의 단계 b)의 통합된 공정에 관한 것이다. 본원은 방법의 단계 b)를 수행하는 몇몇의 방식을 개시한다. 이들 중 일부는 특수한 발효 용기를 필요로 한다. 이러한 특히 바람직한 용기는 분리 단계 b)와 관련하여 아래에 추가로 기재된다.

배치/공급형-배치/연속 배양

발효를 수행하는 세 가지 주요 모드가 있다: 배치, 공급형-배치 및 연속 발효.

배치 발효에서 재조합 효모 세포, 적어도 하나의 발효성 기질 및 상기 기재된 바와 같은 추가로 요구되는 성분을 포함하는 발효 브로쓰가 제조된다. 그 후 발효 브로쓰는 재조합 효모 세포가 o-아미노벤조산을 생산하기에 적합한 조건 하에 발효 용기에서 인큐베이션된다. 배치 발효는 또한 바이오매스의 성장을 수반할 수 있다. 그러나, 본 발명의 재조합 효모 세포에서의 생성물 형성이 성장과 결부되지 않기 때문에 원칙적으로 성장을 허용하지 않는 조건 하에 재조합 효모 세포를 인큐베이션하는 것이 가능하다. 발효 동안 추가의 발효성 기질이 첨가되지 않는다. 그러나, 원하는 pH 값을 유지하거나 달성하기 위해 발효 브로쓰에 무기 산 또는 염기를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 일단 발효성 기질의 농도가 정해진 수준 아래로 떨어지면, o-아미노벤조산의 특정 양이 생성되거나 o-아미노벤조산의 생산율이 정의된 수준 아래로 떨어지고, 발효는 중단되고 o-아미노벤조산이 발효 브로쓰로부터 분리된다.

공급형-배치 발효에서 재조합 효모 세포, 적어도 하나의 발효성 기질 및 상기 기재된 바와 같은 추가로 요구되는 성분을 포함하는 발효 브로쓰가 제조된다. 그 후 발효 브로쓰는 재조합 효모 세포가 o-아미노벤조산을 생산하기에 적합한 조건 하에 발효 용기에서 인큐베이션된다. 공급형-배치 발효는 또한 바이오매스의 성장을 수반할 수 있다. 발효의 시작 후 추가의 발효성 기질이 적어도 한번 발효 브로쓰에 첨가된다. 그러므로, 전형적인 공급형-배치 발효는 발효성 기질의 농도가 특정 역치 아래로 떨어질 때까지 바이오매스 성장 및/또는 생성물 형성 기간을 특징으로 한다. 일단 이 것이 일어나면, 추가의 발효성 기질이 첨가되고 발효가 재개된다. 이 공정은 여러 번 반복될 수 있다. 본 발명의 방법에서 이는 바람직하게는 적어도 한 번, 적어도 두 번, 적어도 세 번 또는 적어도 네 번 반복된다. 원하는 횟수의 반복 후에, o-아미노벤조산은 발효 브로쓰로부터 분리된다. 발효성 기질 이외의 화합물, 특히 무기 산 또는 염기가 필요에 따라 종종 첨가될 수 있다.

연속 발효에서 발효성 기질은 발효 브로쓰에 연속적으로 첨가될 수 있다. 전형적으로, 효모 세포 및 경우에 따라 o-아미노벤조산을 포함하는 발효 브로쓰는 발효 용기로부터 연속적으로 제거되고 새 발효 브로쓰로 대체된다. 전형적인 연속 발효에서, 바이오매스, 발효성 생성물 및 o-아미노벤조산의 농도는 정상 상태에 있다. 이러한 시스템 내 효모 세포는 세포가 연속적으로 제거되고 새 발효 브로쓰 및 발효성 기질의 첨가가 세포 증식을 허용하는 조건을 유지하기 때문에 정지된 증식기에 결코 도달하지 않는다. 만약 세포가 생성물 스트림으로부터 제거되고 연속적으로 작동되는 발효 용기에 재-공급된다면, 세포 증식을 위한 기질 소비가 감소될 수 있다.

총 발효 용량은 몇몇의 발효조로 나누어질 수 있고, 브레이크 탱크가 단계를 포함하는 다운스트림 섹션으로의 발효 물질의 연속 공급을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다.

무산소 조건

본원에서 지칭되는 “무산소 조건“은 발효 용기 내 존재하는 산소 분압에서 배지 내 산소 소비가 없이 존재하는 것보다 발효 브로쓰의 더 낮은 산소 포화도를 특징으로 하는 조건이다. 효모 세포의 산소 소비가 공기로부터 발효 브로쓰로의 산소 운반 속도를 초과하는 경우 무산소 조건이 발효 브로쓰에서 우세하다. 산소 공급과 소비 사이의 이 불균형은 발효 브로쓰 내 산소 농도를 감소시킨다. 효모가 혐기성으로 살 수 있고 심지어 성장할 수 있으므로, 발효 브로쓰 내 무산소 조건이 용인된다. 그러므로, 발효 용기는 반드시 통기 장치를 장착할 필요가 없기 때문에 더 간단하고 저렴한 장치가 될 수 있다.

무산소 조건 하에서 충분한 성장을 보장하기 위해 성장에 필수적이고 산소의 존재에 의존하는 효소 반응, 예를 들어 에르고스티롤 생합성에 관련된 모노 옥시게나제를 지원하기 위해 적어도 매우 적은 양의 산소가 공급되어야 한다.

바람직하게는, 용어 “무산소 조건”은 산소 소비 없이 주어진 온도에서 대기의 산소 분압 하에 발효 브로쓰 내 존재하는 5 내지 90 %, 더 바람직하게는 5 내지 80 %, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 60 % 및 가장 바람직하게는 5 내지 40 %의 산소 포화도를 지칭한다.

정지된 증식기 동안의 제조

본 발명의 기초가 되는 연구에서 효모에 의한 o-아미노벤조산의 제조가 성장과 결부되지 않음이 놀랍게도 발견되었다. 그러므로, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서 방법의 단계 a)에서 생성된 o-아미노벤조산의 상당한 양이 정지된 증식기 동안 생성된다. 효모의 이 특징은 바람직하게는 세포의 정지된 증식기 동안 지속되도록 조정될 수 있는, 배치 또는 공급형-배치 발효에서 이용된다. 또한, 정지된 증식기 동안 o-아미노벤조산을 생산하는 효모의 능력은 추가의 발효를 위해 발효로부터 분리된 효모 세포를 재활용하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로, 효모 세포 내 바이오매스 성장과 생성물 형성의 디커플링은 바이오매스의 축적을 위해 더 적은 기질이 소비되고, 따라서, 더 큰 부분이 o-아미노벤조산의 제조에 집중되므로 기질의 더 경제적인 이용으로 이어진다.

본원에서 지칭된 용어 “정지된 증식기“는 배양 동안 변동이 없는 바이오매스, 즉 발효 조건에 의해 유발될 수 있거나 영양소(들) 및/또는 공간의 용량 한계에 기초하는, 바이오매스의 증가 또는 감소가 없는 것을 특징으로 하는 시기이다. 증식기가 이에 선행한다. 바람직하게는, 정지된 증식기 동안 바이오매스는 5 시간당 30 % 이하, 더 바람직하게는 20 % 이하 및 가장 바람직하게는 10 % 이하로 세포 증식 또는 세포 사멸에 의해 변하지 않는다.

공정의 pH

효모는 7.0 미만의 pH-값에서 성장할 수 있다. 따라서, 방법의 단계 a)는 바람직하게는 산성 pH, 즉 7.0 미만의 pH에서 수행된다. 아미노벤조산의 등전점에 가깝고 여전히 효모 세포의 성장 또는 적어도 정지된 증식기 동안의 o-아미노벤조산의 생성을 허용하는 가능한 가장 낮은 pH에서 방법의 단계 a)를 수행하는 것이 바람직하다. 양성자화된 중성 형태로 존재하는 o-아미노벤조산의 비율이 pH가 감소함에 따라 증가하므로, o-아미노벤조산의 용해도는 pH와 함께 감소하고 o-아미노벤조산의 등전점에서 최소의 용해도이다. 발효 브로쓰 내 용해된 o-아미노벤조산의 더 낮은 농도는 효모 세포에 대해 더 낮은 독성을 의미한다. 더욱이, 물에서의 더 낮은 용해도를 가진 양성자화된 중성 o-아미노벤조산의 더 큰 비율은 방법의 단계 b)에서 발효 브로쓰로부터 그의 분리를 용이하게 한다.

방법의 단계 a) 동안 pH 값은 바람직하게는 2.0 내지 6.0, 더욱 더 바람직하게는 2.5 내지 5.5, 더욱 더 바람직하게는 3.0 내지 5.5 및 가장 바람직하게는 3.5 내지 4.0의 범위이다.

본 발명의 방법의 하나의 바람직한 실시양태에서, o-아미노벤조산의 결정은 결정화를 용이하게 하기 위해 결정 시드로서 발효 브로쓰에 첨가된다. 바람직하게는, 결정은 배치 발효의 후반, 마지막 3분기 또는 마지막 4분기에 첨가된다. 또한 바람직하게는, 결정은 공급형-배치 발효의 후반, 마지막 3분기 또는 마지막 4분기에 첨가된다. o-아미노벤조산의 결정은 상업적 공급자로부터 얻어질 수 있거나 본 발명의 방법의 초기 제조 공정의 생성물일 수 있다.

발효 브로쓰로부터의 o-아미노벤조산의 분리

액체 상으로부터 고체 입자의 분리를 위한 임의의 방법이 방법의 단계 b)에서 사용될 수 있다. 바람직한 방법은 여과, 침전, 히드로사이클론 및 원심분리이다. 양성자화된 o-아미노벤조산은 물에서보다 도데칸올, 운데실아민, 디시클로헥실아민, 2,6-디에틸아닐린, 부탄산 옥틸에스테르, 아세트산 도데실에스테르, 디메틸프탈레이트, 벤질헥실에테르, 디에틸렌글리콜 디-n-부틸에테르와 같은 유기 용매에서 더 잘 용해되기 때문에, 하나 이상의 전술된 용매를 이용한 o-아미노벤조산의 추출은 방법의 단계 b)의 또 다른 바람직한 실시양태이다.

물에서의 o-아미노벤조산의 용해도가 pH와 함께 감소하기 때문에, pH 7.0 미만에서 분리를 수행하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 방법의 단계 b)에서 pH는 6.0 미만, 더 바람직하게는 5.0 미만이고 가장 바람직하게는 3.4와 4.0 사이이다. 만약 pH 값이 방법의 단계 b) 이전에 또는 중에 감소되는 경우, HCl 또는 H₃PO₄와 같은 강한 무기산의 사용이 바람직하다. 도 7에 도시된 바와 같이, 물에서의 오르토-아미노벤조산 (oAB)의 용해도는 pH 3.0와 pH 4.0 사이의 범위에서 특히 낮다. 따라서 이 범위 또한 바람직하다.

발효 브로쓰는 분리 단계 b)의 이전의 또는 도중의 임의의 시점에서 산성화될 수 있다. 그러나, 효모 세포의 고유한 내산성으로 인해 pH 3.0과 5.0 사이, 더 바람직하게는 pH 3.0과 4.0 사이, 가장 바람직하게는 pH 3.4와 4.0 사이에서 방법의 단계 a) 및 b)를 포함하는 완전한 발효 공정을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, pH는 알칼리성 완충액의 아화학량론적 첨가에 의해 상기 정의된 범위 내에서 안정화된다. 더 바람직한 실시양태에서 pH는 완충 시스템의 사용 없이 상기 정의된 범위 내에서 안정화된다.

방법의 단계 a)의 발효가 pH 3.0과 4.0 사이에서 수행되는 경우, 이 pH-범위 내 물에서의 o-아미노벤조산의 용해도가 충분히 낮기 때문에 방법의 단계 b)가 추가의 산성화 없이 동일한 pH에서 수행되는 것이 바람직하다.

발효 브로쓰에서, 두 유형의 입자가 존재한다: o-아미노벤조산의 결정과 효모 세포.

하나의 바람직한 실시양태에서, 결정화된 o-아미노벤조산은 발효 브로쓰로부터 효모 세포를 분리함이 없이 발효 브로쓰로부터 분리된다. 가장 바람직하게는, 이는 효모 세포와 결정화된 o-아미노벤조산의 상이한 밀도를 이용한 방법에 의해 달성된다. 발효 용기 내 교반기의 회전 속도는 효모 세포보다 더 높은 밀도를 가진 결정화된 oAB가 발효 용기의 바닥에 침전되는 동안 효모 세포만 현탁을 유지할 수 있도록 조정될 수 있다. 그 후 침전된 고체 oAB는 제거되고 예를 들어 여과 및 건조에 의해, 추가로 가공될 수 있다. 그러므로, 효모 세포 및 발효 브로쓰로부터의 oAB의 분리는 발효 용기로부터의 발효 브로쓰의 제거 없이 수행될 수 있다.

효모의 밀도는 세포 주기에 따라 1.08-1.1 g/㎤의 범위에 있다. 벌크 oAB의 밀도는 1.41 g/cm³이다. 입자 크기는 또한 영향력 있는 파라미터이다. 효모 세포는 10 마이크로미터 미만의 특징적인 길이에 상응하는 크기 분포를 갖는다. 효모 세포의 전형적인 크기 분포는 문헌 [P. Jorgensen et al. Science 297: 395, 2002]에서 찾을 수 있다.

크기와 밀도의 차이는 다음의 방정식을 통해 스토크스(Stokes) 법칙의 간략화된 사례로 나타낼 수 있는 침전/부유 속도에서의 차이를 야기한다:

교반 시스템의 경우 입자를 현탁하기 위한 최소 회전 속도는 또한 쯔비에터링(Zwietering) 방정식으로 나타내어지는 입자의 크기 및 밀도에 의존한다; 이에 따라 상이한 밀도와 크기를 가진 두 입자를 현탁하기 위한 회전 속도 사이의 비율은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

방법의 단계 b)에서 발효 브로쓰로부터 oAB를 분리하기 위한 바람직한 공정은 이러한 현상에 기초한다. 이 실시양태의 개략적 묘사가 도 3에 도시되어 있다. 발효조 내 신생 oAB 결정이 주어진 크기 초과, 바람직하게는 100 마이크로미터 초과, 가장 바람직하게는 500 마이크로미터 초과의 크기로 성장하기에 충분한 시간이 주어진다. 크기는 발효조의 여과 F 다운스트림에서 사용되는 필터의 컷오프 반지름을 정의함으로써 선택된다. 이러한 크기에 이르면 (i) 세포로부터의 그들의 분리 및 (ii) 추가의 가공을 위한 oAB의 탈수가 용이해진다.

여액은 더 많은 체류 시간을 허용하고 수력분급 효과를 도입하기 위해, 발효 용기로 재활용될 수 있다. 교반기의 회전 속도는 선택된 컷오프 크기를 가진 결정의 현탁을 유지하기 위한 최소 속도 아래이면서 효모 세포의 현탁을 유지하기 위한 최소 속도 초과가 되도록 조정된다. 크기와 밀도의 다양한 조합에 대한 최소 현탁 속도의 비율은 표 1에 주어지고, 이는 이 기준을 만족시키는 회전 속도의 넓은 범위가 존재한다는 것을 나타낸다.

표 1

이 회수 공정은 발효와 동시에 또는 발효에 뒤이은 수확 단계에서 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 수확 단계는 oAB 결정의 회수를 최대화하기 위해 더 낮은 pH 값, 바람직하게는 5.0 미만, 더 바람직하게는 pH 3.0과 4.0 사이, 가장 바람직하게는 pH 3.4와 4.0 사이에서 수행된다. 발효 및 수확은 연속, 반-배치 또는 배치 작업 모드에서 운용될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기-기재된 분리의 방법은 연속 발효 모드와 함께 사용된다.

발효가 배치 또는 공급형-배치 공정으로 수행되는 경우, 상기 기재된 바와 같이 발효 공정 동안 형성된 고체 oAB를 단리하고 본원에서 추가로 후술되는 바와 같이 흡착 및 탈착에 의해 발효의 마지막에 발효 브로쓰 내 남아있는 가용성 oAB를 단리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, o-아미노벤조산 및 효모 세포 둘 다 단일 단계 또는 두 개의 개별 단계로 발효 브로쓰로부터 분리된다. 만약 효모 세포 및 o-아미노벤조산이 하나의 단계로 발효 브로쓰로부터 분리된다면, 효모 세포로부터 o-아미노벤조산을 분리하는 추가의 단계를 방법에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 실시양태에서, 분리는 발효 용기의 외부에서 수행되고, 즉 효모 세포 및 oAB를 함유하는 발효 브로쓰는 발효 용기로부터 제거되고 발효 브로쓰의 액체 구성 요소 및 효모 세포로부터 oAB의 분리가 일어난다.

이 목적을 위해 유동, 중력 또는 원심 장에서의 입자 이동의 차이를 기반으로 하는, 임의의 단위 작업이 수행될 수 있다. 예를 들어, 침전통, 원심분리, 히드로사이클론 등 여과는 또한 예를 들어 문헌 [Perry's Chemical Engineers' Handbook, Eighth Edition]에서와 같이, 설계될 수 있다.

도 4는 공정을 개략적으로 도시한다. 효모 세포와 oAB를 포함하는 발효 브로쓰가 발효 공정 B로부터 제거되고 상기 기재된 적어도 하나의 수단을 이용하는 분리 D가 행해진다. 발효 브로쓰 내 용해되고 상기-기재된 수단 및 방법에 의해 분리될 수 없는 oAB를 추가로 회수하기 위하여, 발효 브로쓰에 흡착 및 탈착 E의 추가의 단계가 적용될 수 있다. 대안으로, 분리 D로부터 생성된 발효 브로쓰는 발효 용기 내로 다시 공급될 수 있다.

pH 3.0과 pH 4.0 사이의 pH에서 oAB의 최소 용해도에서도, 약 5 g/l oAB가 발효 브로쓰 내 용해된 채로 남아있다. 고체 oAB는 더 높은 oAB 농도가 존재하는 경우에만 형성된다. 그러므로, 고체/액체 분리의 방법은 5.0 g/l 미만의 농도에서 oAB를 회수하는 데 사용할 수 없으므로, 폐기되는 발효 브로쓰 내 oAB의 잠재적인 손실로 이어진다. 용해된 oAB를 회수하기 위해, 적합한 고체 상에 흡착 후 탈착하는 것은 본 발명의 다양한 실시양태에서 단독으로 또는 다른 방법과 함께 사용될 수 있는 분리 방법이다.

액체/고체 또는 고체/고체/액체 분리에 의해 발효 브로쓰로부터의 효모 세포의 분리를 야기하는 방법의 단계 b)의 임의의 실시양태에서, 분리된 효모 세포의 적어도 한 부분을 원래의 발효 브로쓰로 되돌리거나 또는 그들을 새 발효 브로쓰에 첨가하는 것이 바람직하다. 효모 세포가 바이오매스 성장에 결부되지 않고 o-아미노벤조산을 생산할 수 있기 때문에, 기존의 효모 세포는 새 바이오매스의 제조를 위해 기질을 소비할 필요 없이 추가의 발효에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 b)의 추가의 바람직한 실시양태에서, 방법의 단계 b)에서의 효모 세포 및 발효 브로쓰로부터의 oAB 분리는 적합한 용매로 추출함으로써 수행된다. 이 공정은 또한 oAB의 액체 추출이라고도 지칭된다.

적합한 용매는 물에 불용성이고, 물과 밀도 차이가 크며 25 ℃ 미만의 녹는점을 가진 것이다. 바람직하게는, 적합한 용매는 추가적으로 아닐린보다 높은 끓는점을 갖는다. 바람직한 용매는 도데칸올, 운데실아민, 디시클로헥실아민, 2,6-디에틸아민, 부탄산 옥틸에스테르, 아세트산 도데실에스테르, 벤질 헥실 에테르, 디에틸렌 글리콜, 디-n-부틸 에테르이다. 특히 도데칸올이 바람직하다.

추출 공정의 하나의 바람직한 실시양태에서, 추출은 용매를 발효 용기에 첨가함으로써 수행된다. 일정한 양의 용매가 항상 존재할 수 있도록 용매는 연속적으로 발효 용기에 첨가되고 그로부터 제거될 수 있다. 용해된 oAB를 담지하는 용매가 연속적으로 새 용매에 의해 대체되므로, 발효 용기 내 존재하는 용매는 결코 oAB로 포화되지 않고, 그러므로 수성 상에서 oAB 수준을 낮게 유지한다. 이는 효모 세포에 대한 oAB의 독성의 문제를 완화한다. 그러나, 효모 세포는 사용된 용매를 견딜 수 있어야 한다. 이 실시양태는 특히 연속 발효 공정에 적합하다.

이 공정은 도 5에 개략적으로 도시된다. oAB를 담지하는 용매는 스트림 19를 통해 발효 B로부터 제거되고 탈카르복실화 G에 적용된다. 경우에 따라, 공급형-배치 또는 연속 공정에서, 용매가 없는 발효 브로쓰가 스트림 7을 통해 발효로부터 제거되고 순수한 발효 브로쓰를 얻기 위해 액체/고체 분리가 적용된다. 상기 순수한 발효 브로쓰에는 수성 상 내 용해된 채로 남아있는 oAB를 회수하기 위해 바람직하게는 흡착 및 탈착 E가 적용된다.

추출 공정의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 용매는 발효 용기로부터 제거된 발효 브로쓰에 첨가된다. 효모 세포는 용매가 첨가되기 전에 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있다. 그러나, 효모 세포를 포함하는 발효 브로쓰를 이용하여 oAB의 액체 추출을 수행하는 것이 동일하게 바람직하다.

이 공정의 바람직한 실시양태는 도 6에 개략적으로 도시된다. 효모 세포 및 oAB를 함유하는 발효 브로쓰는 발효 B로부터 제거된다. 바이오매스 (스트림 17)는 액체 상으로부터 분리되고 액체 상은 액체 추출 L에 적용된다. 액체 추출로부터 생성된 수성 상, 즉 세포가 없고 용해된 oAB의 잔류량을 가진 발효 브로쓰는 잔류 oAB를 회수하기 위해 바람직하게는 흡착 및 탈착 E에 적용된다. 바이오매스 D의 분리는 생략되어 완전한 발효 브로쓰가 액체 추출에 적용될 수 있음을 염두에 두어야 한다.

발효성 기질로부터의 o-아미노벤조산의 제조를 위해 호기성 박테리아 대신 효모를 사용하는 것은 몇몇의 장점을 가진다:

(i) 효모는 무산소 조건 하에서 생존하고 심지어 증식한다. 그러므로, 발효 공정 동안 감소된 산소 농도는 생성물 수율을 감소시키지 않으므로 발효 브로쓰의 통기 수단이 생략되거나 감소될 수 있다. 이는 발효 용기의 비용과 복잡성을 감소시킨다.

(ii) 효모는 산 조건 하에서 생존하고 심지어 증식한다. 이는 물에서의 o-아미노벤조산의 용해도를 감소시켜 세포는 중성 pH에서보다 더 낮은 농도의 용해된 o-아미노벤조산에 노출된다. 이는 생성물 독성의 문제를 완화한다. 또한, 발효 브로쓰의 pH를 안정하게 유지하기 위해 첨가되어야 하는 염기의 양이 더 적으므로, 공정에서 생성되는 염의 양을 감소시킨다.

(iii) 방법이 효모에서만 가능한 산성 pH에서 수행되는 경우, 분리 단계 b)가 용이해진다. o-아미노벤조산의 용해도가 pH에 따라 감소되기 때문에, 방법의 단계 b) 전에 더 적은 산이 첨가되거나 또는 전혀 첨가되지 않아야 하므로, 방법에 의해 생성되는 염의 양을 추가로 감소시킨다. 더욱이, 만약 충분한 생성물 농도에 도달하면, 결정화된 o-아미노벤조산이 발효 단계 a) 동안 형성되고 발효 단계 a)가 계속되는 동안 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있다. 이는 본원에서 추가로 후술되는 몇몇의 유리한 공정 개념에서 효모-기재 발효의 통합을 허용한다.

(iv) 효모에 의한 o-아미노벤조산의 형성이 바이오매스 성장과 결부되지 않고, 따라서, 정지된 증식기 동안 허용가능한 속도로 계속된다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 정지된 증식기 동안 효모 세포의 사용을 수반하는 공정 개념은 지수 증식기에서만 세포를 사용하는 공정 개념에 비해 발효성 기질의 더 낮은 비율이 바이오매스 성장으로 전환되는 장점을 가진다. 이는 선행 기술로부터 공지된 박테리아-기재 방법에 비해 본 발명의 방법의 두드러진 장점이다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 따라 제조된 o-아미노벤조산의 아닐린으로의 추가 가공에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 o-아미노벤조산 또는 아닐린의 제조 방법에 관한 것이고, 여기서 o-아미노벤조산은 본원에서 상기 기재된 바와 같이 제조되고 o-아미노벤조산의 아닐린으로의 전환은 아래에 정의되는 추가의 방법의 단계에 의해 수행된다.

바람직하게는, o-아미노벤조산은 순수 화학적 방법에 의해, 즉 촉매로서 미생물 또는 효소의 사용 없이 아닐린으로 전환된다. 바람직한 화학적 방법은 o-아미노벤조산의 열 탈카르복실화이다.

열 탈카르복실화는 바람직하게는 촉매의 존재 하에 수행된다. 촉매는 제올라이트 촉매이고, 여기서 상기 제올라이트 촉매는 가장 바람직하게는 제올라이트 H-Y (예를 들어 제올리스트 인터내셔날(Zeolyst International), 카탈로그 번호 CBV600로부터 입수됨)이다. 산 촉매 제올라이트 H-Y (SiO₂/Al₂O₃는 5와 7 사이일 수 있고, 바람직하게는 5.5임)는 특히 높은 산성 특성을 가지고 예를 들어 역시 강한 산성 특성을 지니지만, 더 작은 세공 크기 (0.5 nm)를 가져 o-아미노벤조산 분자가 효과적으로 그 안으로 침투할 수 없어 결과적으로 산성 촉매의 활성 부위에 쉽게 접근할 수 없게 되어, 그의 유효성을 감소시키는 ZSM5-27 (예를 들어 클라리안트 수에드케미(Clariant SuedChemie), 카탈로그 번호 MFI-27, SiO2/Al2O3 = 27로부터 입수됨) 보다 더 넓은 세공 크기 (0.7-0.8 nm)를 갖는다.

바람직하게는, 열 탈카르복실화는 유기 용매에서 수행된다. 예를 들어 잔류 수분이 있는 또는 없는, 결정의 형태의 O-아미노벤조산은 바람직하게는 탈카르복실화 반응기에 산을 공급함에 의해 열적으로 탈카르복실화된다. 열 탈카르복실화는 150 ℃와 250 ℃ 사이, 바람직하게는 160 ℃ 와 220 ℃ 사이, 더 바람직하게는 180 ℃와 200 ℃ 사이의 온도에서 수행될 수 있다. 열 탈카르복실화는 o-아미노벤조산을 아닐린에 반응시키기에 충분한 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 열 탈카르복실화는 0.5 시간 내지 3 시간 동안 수행된다.

열 탈카르복실화는 열 탈카르복실화의 속도를 높이기 위해 산 촉매의 존재 하에서 수행될 수 있다.

열 탈카르복실화는 물, 아닐린과 같은 용매에서, 또는 1-도데칸올에서, 바람직하게는 1-도데칸올에서, 또는 1-도데칸올과 아닐린의 혼합물에서 수행될 수 있다.

또한, 열 탈카르복실화는 반응기에서 수행될 수 있고, 여기서 반응기 내 압력은 얼마나 많은 액체 상이 반응 중에 증발되고 탈카르복실화의 생성물인 이산화탄소 (CO₂)와 함께 반응기를 떠나는지에 대한 함수로 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, 열 탈카르복실화 후 바람직하게는 증류에 의해, 아닐린을 정제하는 추가의 단계가 이어진다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 해당 효소 활성을 감소시키는 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성의 변형을 포함하는 재조합 효모 세포에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 효모 종은 아시비아 고시피이, 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 야로위아 리폴리타카, 자이고사카로마이세스 바일리이 및 사카로마이세스 세레비지아에이다. 가장 바람직하게는, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에이다.

용어 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성은 o-아미노벤조에이트의 N-(5-포스포-D-리보실)-안트라닐레이트로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성은 Trp4 (YDR354W)에 의해 매개된다.

안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성의 상기-기재된 감소는 세 가지 주요 방식에 의해 달성될 수 있다: (i) 유전자의 전사가 감소되거나 없어지도록 효모 내 trp4 유전자의 발현의 조절이 변형될 수 있다. (ii) 변형된 유전자에 의해 인코딩된 효소가 더 낮은 고유 활성을 갖도록 trp4 유전자의 핵산 서열이 변형될 수 있다. (iii) trp4 유전자는 효모 이외의 유기체로부터 유래되고 Trp4보다 더 낮은 고유 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 가진 유전자로 대체될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 효모 세포는 잔류 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 가지지 않는다. 바람직하게는, 이는 효모 세포 내 trp4 유전자의 발현을 없애거나 또는 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성이 없는 단백질이 생성되는 방식으로 trp4 유전자의 핵산 서열을 변형함으로써 달성된다. 이러한 변형으로부터 생성된 균주는 또한 “녹-아웃(knock-out) 균주”로서 당업계에 공지되어 있다. 명백하게, 이러한 균주는 L-트립토판에 대한 영양요구성이다.

재조합 효모 세포는 o-아미노벤조산의 합성을 위한 전구체의 유효성을 증가시키는 추가의 유전자 변형을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 발효성 기질로부터 o-아미노벤조산을 제조하기 위한 재조합 효모 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 효모 세포는 상기 기재된 방법으로 사용된다.

도면의 간단한 설명

도 1: 실시예 1에 기재된 바와 같은 효모를 이용한 호기성 공급형-배치 발효의 결과.

도 2: 실시예 1에 기재된 바와 같은 효모를 이용한 혐기성 배치 발효의 결과.

도 3: 발효 용기 내 고체 oAB 분리의 개략적 묘사. A: 멸균; B: 발효; C: 공기 압축; D: 바이오매스 분리; E1 및 E2: 흡착 및 탈착; F: 여과; G: 탈카르복실화; H: 증류; I: 여과; J: 결정화.

1: 탄소 공급원 (예를 들어 당); 2: 질소 공급원 (예를 들어 NH₃); 3: 완충 용액 (예를 들어 NaOH); 4: 공기; 5A 및 5B: 선택적으로 또는 조합되어 사용될 수 있는, HCl에 대한 공급 지점; 6: 배기 공기; 7: 바이오매스 현탁액; 8: oAB 결정 현탁액; 9: 용출액, 예를 들어, 묽은 NaOH; 10: HCl; 11: 폐수; 12: 폐수; 13: CO₂; 14: 잔류물; 15: 잔류물; 16: 아닐린 생성물; 17: 바이오매스

도 4: 발효 용기의 외부에서의 발효 브로쓰로부터의 고체 oAB의 분리의 개략적 묘사. A: 멸균; B: 발효; C: 공기 압축; D: 고체/고체/액체 분리; E1 및 E2: 흡착 및 탈착; F: 여과; G: 탈카르복실화; H: 증류; I: 여과; J: 결정화.

1: 탄소 공급원 (예를 들어 당); 2: 질소 공급원 (예를 들어 NH₃); 3: 완충 용액 (예를 들어 NaOH); 4: 공기; 5A 및 5B 및 5C: 선택적으로 또는 조합되어 사용될 수 있는, HCl에 대한 공급 지점; 6: 배기 공기; 7: 발효 브로쓰 (바이오매스, 물, oAB); 8: oAB 결정 현탁액; 9: 용출액, 예를 들어, 묽은 NaOH; 10: HCl; 11: 폐수; 12: 폐수; 13: CO₂; 14: 잔류물; 15: 잔류물; 16: 아닐린 생성물; 17: 바이오매스

도 5: 발효 용기 내부에서 수행되는 oAB의 액체 추출의 개략적 묘사. A: 멸균; B: 발효; C: 공기 압축; D: 바이오매스 분리; E1 및 E2: 흡착 및 탈착; G: 탈카르복실화; H: 증류; I: 여과; J: 결정화.

1: 탄소 공급원 (예를 들어 당); 2: 질소 공급원 (예를 들어 NH₃); 3: 완충 용액 (예를 들어 NaOH); 4: 공기; 5A 및 5B: 선택적으로 또는 조합되어 사용될 수 있는, HCl에 대한 공급 지점 6: 배기 공기; 7: 바이오매스 현탁액; 9: 용출액, 예를 들어, 묽은 NaOH; 10: HCl; 11: 폐수; 12: 폐수; 13: CO₂; 16: 아닐린 생성물; 17: 바이오매스; 18: 용매; 19: 반응에 공급하는 용매 내 oAB 용액; 20: 용매 퍼징; 21: 용매 구성.

도 6: 발효 용기의 외부에서 수행되는 oAB의 액체추출의 개략적 묘사. A: 멸균; B: 발효; C: 공기 압축; D: 바이오매스 분리; E1 및 E2: 흡착 및 탈착; G: 탈카르복실화; H: 증류; I: 여과; J: 결정화; L: 액체 추출.

1: 탄소 공급원 (예를 들어 당); 2: 질소 공급원 (예를 들어 NH₃); 3: 완충 용액 (예를 들어 NaOH); 4: 공기; 5A 및 5B 및 5C 및 5D 및 5E: 선택적으로 또는 조합되어 사용될 수 있는, HCl에 대한 공급 지점 6: 배기 공기; 7: 발효 브로쓰 (바이오매스, 물, oAB); 9: 용출액, 예를 들어, 묽은 NaOH; 10: HCl; 11: 폐수; 12: 폐수; 13: CO₂; 16: 아닐린 생성물; 17: 바이오매스; 18: 추출기에 공급되는 용매; 19: 반응에 공급하는 용매 내 oAB 용액; 20: 용매 퍼징; 21: 용매 구성

도 7: pH에 따른 물에서의 oAB의 용해도를 나타내는 도표. 용해도가 pH 3과 pH 4 사이에서 그의 최소에 도달한다는 것을 알 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이다. 이는 어떠한 방식으로도 청구 범위를 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1 (본 발명): 효모를 이용한 o-아미노벤조산의 제조

균주, 배지 및 성장 조건.

사카로마이세스 세레비지아에 TRP4 녹 아웃 균주를 지이 헬스케어 다마콘 인크.(GE Healthcare Dharmacon Inc.)로부터 구입했다. 다르게 표시되지 않는 경우 모든 화학 물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (슈테른하임(Sternheim))로부터 매입했다. 사카로마이세스 세레비지아에는 트립토판이 없는 효모 합성 드롭-아웃 배지 보충물(Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)(아데닌, 18 mg/L, 미오-이노시톨, 76 mg/L, p-아미노벤조산, 8 mg/L, 우라실, 76 mg/L, L-류신, 380 mg/L, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-티로신, L-발린, 각각 76 mg/L), G418 (200 μg/mL), α-D-글루코스 (20 g/L), 및 한계 양의 L-트립토판 (각각, 호기성에 대해 5 mg/L 및 혐기성 조건에 대해 1.5 mg/L)로 보충된 아미노산 미네랄 배지(Amino Acids Mineral Medium) (황산암모늄, 5.0 g/L, 바이오틴, 2.0 μg/L, 판토테산칼슘, 400 μg/L, 엽산, 2.0 μg/L, 이노시톨, 2.0 mg/L, 니코틴산, 400 μg/L, p-아미노벤조산, 200 μg/L, 피리독신 HCl, 400 μg/L, 리보플라빈, 200 μg/L, 티아민 HCL, 400 μg/L, 시트르산, 0.1 g/L, 붕산, 500 μg/L, 황산 구리, 40 μg/L, 아이오딘화칼륨, 100 μg/L, 염화제2철, 200 μg/L, 황산마그네슘, 400 μg/L, 몰리브덴산나트륨, 200 μg/L, 황산아연, 400 μg/L, 제1인산칼륨, 1.0 g/L, 황산마그네슘, 0.5 g/L, 염화나트륨, 0.1 g/L, 염화칼슘, 0.1 g/L)가 없는 정의된 효모 질소 염기(Yeast Nitrogen Base) (YNB) 또는 G418 (200 μg/mL)로 보충된 YPD 브로쓰 (세균 사용의 펩톤, 20 g/L, 효모 추출물, 10 g/L, 글루코스, 20 g/L)에서 30 ℃에서 멸균 조건 하에 성장했다. 균주는 1 L의 배양 부피를 가진 (공급형)-배치 발효조 (옴니페름, 하이텍 창(OmniFerm, HiTec Zang), 독일, 헤르조겐라트(Herzogenrath))에서 특성화 되었다. 사전-배양물이 -80 ℃에서 보관한 글리세롤 스톡 [15 % (v/v) 글리세롤]으로부터 접종되었다. 시드 트레인(train)은 12 시간 동안 200 rpm에서 일정하게 흔드는 시험관 내 3 ml YPD 배양물 (사전-배양물 I), 8 시간 동안 200 rpm에서 일정하게 흔드는 회전 진탕기 상의 1000 ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내 50 ml YPD 배양물 (사전-배양물 II) 및 12 시간 동안 200 rpm에서 일정하게 흔드는 회전 진탕기 상의 1000 ml 에를렌마이어 플라스크 내 50 ml YNB 배양물 (사전-배양물 III)을 포함한다. 사전-배양물 I로부터 1 ml를 사전-배양물 II의 새 멸균 YPD 배지로 옮겨 사전-배양물 II를 접종시켰다. 사전-배양물 III는 적절한 양의 세포를 멸균 원뿔형 원심분리 튜브로 옮겨 1의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD₆₀₀)로 접종했다. 원심분리 (1,500 × g, 5 min, RT) 후 세포는 멸균 1 ml 염수 (9 g/L 염화나트륨)에 현탁되고 사전-배양물 III의 멸균 YNB 배지로 옮겨졌다. 사전-배양물 III으로부터 1의 OD₆₀₀로의 발효조의 접종을 위한 절차는 사전-배양물 III의 접종에 대해 기재된 바와 동일했다. 호기성 조건 하 효모 배양을 위해 초기 교반 속도는 500 rpm으로 설정되었고 공기는 0.2 L/min으로 공급되었다. 혐기성 조건에서 300 rpm의 일정한 교반 속도가 사용되었고 N₂는 0.2 L/min으로 공급되었다. 발효조의 배기 가스의 산소 및 이산화탄소 수준은 오프-가스 분석기 (하이센스(HiSense), 하이텍 창, 독일, 헤르조겐라트)를 사용하여 온라인으로 지속적으로 모니터링되었다. 호기성 조건에서 용존 산소는 교반 속도의 자동 조정에 의해 >30 %의 공기 포화도로 유지되었다. 각 조건에 대해 pH가 측정되었고 (이지펌 플러스(Easyferm Plus) VP 225, 해밀턴 훽스트(Hamilton Hoechst), 독일) 1.0 M (NH₄)OH 및 1 M HCl의 자동 첨가에 의해 4.0으로 유지되었다. 각 조건에서 온도는 30 ℃로 유지되었다. 발효 동안 1.5 ml 샘플이 채취되었다. 에펜도르프 바이오포토미터(Eppendorf BioPhotometer) (에펜도르프, 함부르크(Hamburg))가 광학 밀도 측정을 위해 사용되었다. 각 샘플의 1 mL 분취액이 16,000 × g에서 5 분 동안 원심분리되었다 (5415R; 에펜도르프, 함부르크). 상등액 내 글루코스, o-아미노벤조에이트 및 에탄올의 농도가 각각, CuBiAn XC (옵토셀 테크놀로지(Optocell technology)) 생화학 분석기, HPLC-DAD (1100; 애질런트 테크놀로지(Agilent Technologies), 미국, 산타 클라라), 및 GC-FID (7890A 애질런트 테크놀로지, 미국, 산타 클라라)로 측정되었다.

고성능 액체 크로마토그래피

애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC-DAD 시스템 [다이오드 어레이 검출기가 장착됨; 애질런트 테크놀로지, 산타 클라라 (미국)]을 사용하여 배양 상등액 내 o-아미노벤조에이트 농도를 정량화하였다. 고정상으로서 C18 컬럼 루나(Luna) HPLC-컬럼 (4.6 x 250 mm; 3 pm; 페노메넥스(Phenomenex))가 20 ℃에서 메탄올 (용매 B) 및 0.1 % (v/v) 포름산을 함유하는 물 (용매 A)로 이루어진 이성분 용매 시스템과 함께 사용되었다. 10 μL의 희석된 배양 상등액이 적용되었다. 분리는 0.5 mL/min의 유속으로 다음의 구배에 의해 달성되었다: 0-1 min, 2 % B; 1-2 min, 2-10 % B; 2-12 min, 10-70 % B; 12-23 min, 70-90 % B; 23-25 min, 90 -98 % B, 25-27 min, 98 % B; 27-27.5 min, 98 %-2 % B; 27.5-30 min, 2 % B. o-아미노벤조에이트 농도는 254 nm에서의 피크 적분 (체류 시간: 18.9 min) 및 외부 보정 곡선과의 비교에 의해 측정되었다.

기체 크로마토그래피

애질런트 7890A GC-시스템 [애질런트 테크놀로지, 산타 클라라 (미국)]이 배양 상등액 내 에탄올 농도를 정량하기 위해 사용되었다. 스타빌왁스(Stabilwax)-DB 컬럼 (30 m x 0,32 mm, ID 1 μm, 레스텍(Restek))이 사용되었다. 분리는 다음의 오븐 프로그램에 의해 달성되었다: 0-3 min, 30 ℃; 3-6 min, 40-150 ℃; 6-8.4 min, 150-220 ℃. 1 μL의 희석된 배양 상등액이 적용되었다. 주입기는 787.43 mL/min의 총 유량 및 100:1의 분할 비율로 250 ℃로 설정되어, 7.7666 ml/min의 유량이 생성된다. 신호는 300 ℃로 설정된 FID를 통해 감지되었다.

결과 및 논의

효모 녹-아웃 균주 사카로마이세스 세레비지아에 TRP4는 HPLC-DAD (254 nm)에 의해 측정된 바와 같이 75 시간의 배양 후 호기성 조건 하에서 320 mg/L o-아미노벤조산을 생산했다. 혐기성 조건 하에서 그 것은 73 시간의 배양 후 92 mg/L o-아미노벤조산을 생산했다. 정지기에서 뿐만 아니라 성장 동안에도 o-아미노벤조에이트의 일정한 축적이 관찰되었기 때문에 생산은 성장과 결부되지 않은 것으로 보인다. 1의 OD₆₀₀이 0.45 g/L의 건조 중량과 연관성이 있다고 가정하면, 정지기에서의 o-아미노벤조산의 비(比)생산성은 호기성 및 혐기성 조건 하에서, 각각, 약 1.0 및 1.3 mg gDW^-1 h^-1이다. 예상대로, GC-FID에 의해 측정된 바에 따르면 혐기성 조건 하에서 상당한 양의 에탄올이 생산되었다.

Claims (15)

1. a) 적어도 하나의 발효성 기질을 o-아미노벤조산으로 전환시킬 수 있는 효모 세포를 사용하여 발효 용기 내에서 적어도 하나의 발효성 기질을 발효시키는 단계; 및
   b) 발효 브로쓰로부터 생성된 o-아미노벤조산을 분리하는 단계
   를 포함하는 o-아미노벤조산의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 방법의 단계 b)에서 o-아미노벤조산의 분리가 발효 브로쓰의 pH를 낮춘 후 수행되는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방법의 단계 b)에서 생성된 고체 o-아미노벤조산의 분리가 발효 용기 내 교반기의 회전 속도를 조정함으로써 수행되는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방법의 단계 b)에서 생성된 고체 o-아미노벤조산의 분리가 여과, 침전, 히드로사이클론 및 원심분리에 의해 수행되는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방법의 단계 b)에서 생성된 o-아미노벤조산의 분리가 적합한 용매를 이용한 추출에 의해 수행되는 방법.
6. 제5항에 있어서, o-아미노벤조산이 발효 용기로부터 제거된 발효 브로쓰로부터 추출되는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 용매가 발효 용기 내 발효 브로쓰에 첨가되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계 a)에서 발효가 무산소 조건 하에서 수행되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계 a)에서 발효가 7.0 미만의 pH에서 수행되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, o-아미노벤조산의 일부가 효모 세포의 정지된 증식기 동안 생성되는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 방법의 단계 및 분리된 o-아미노벤조산을 아닐린으로 전환시키는 추가의 방법의 단계 c)를 포함하는 아닐린의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, o-아미노벤조산이 촉매의 존재 또는 부재 하에 열 탈카르복실화에 의해 아닐린으로 전환되는 것인 방법.
13. 해당 효소의 활성을 감소시키는 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성의 변형을 포함하는 재조합 효모 세포.
14. 적어도 하나의 발효성 기질로부터 o-아미노벤조산을 제조하기 위한 제13항의 재조합 효모의 용도.
15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 발효성 기질로부터의 o-아미노벤조산의 제조가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수행되는 것인 용도.
    
    

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