KR20180085533A - Biomarker Composition for Diagonsing Nonalcoholic Steatohepatitis or Prognosing Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis Comprising Gnpat - Google Patents

Biomarker Composition for Diagonsing Nonalcoholic Steatohepatitis or Prognosing Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis Comprising Gnpat Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing or prognosticating nonalcoholic fatty liver disease comprising glyceronephosphate O-acyltransferase (Gnpat) or a gene encoding the Gnpat as an effective component. Since the Gnpat is a first enzyme that acts on biosynthesis of plasmalogens which are an important index factor in liver diseases, it was confirmed that when the expression level of Gnpat is low, the level of plasmalogens also decreases, thus exhibiting the symptoms of nonalcoholic fatty liver disease and confirming the possibility of Gnpat as a novel marker for nonalcoholic fatty liver disease. Accordingly, the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease using the expression level of Gnpat and a gene expression promotor may be beneficially used as the effective component of a pharmaceutical composition for treating nonalcoholic fatty liver disease.

Description

Gnpat을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물{Biomarker Composition for Diagonsing Nonalcoholic Steatohepatitis or Prognosing Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis Comprising Gnpat}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a biomarker composition for non-alcoholic steatohepatitis or non-alcoholic steatohepatitis complication Gnpat,

본 발명은 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물, 비알콜성 지방간염 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis or prognosis of non-alcoholic fatty liver disease, a therapeutic agent for non-alcoholic fatty liver disease and a screening method thereof.

간은 영양소 대사의 중심 역할을 하는 장기로서, 정상적인 사람의 간은 약 1,500g의 무게를 가지며 간 질환이 발병하여 간 기능 이상이 초래되면 생체의 영양소 대사에 문제가 생기는 바, 구체적으로 포도당을 글리코겐으로 만들거나 또는 단백질을 알부민으로 전환하거나 불필요한 것을 분해하여 쓸개즙으로 전달하는 등의 간 기능에 이상이 생긴다.The liver is the organ that plays a central role in the nutrient metabolism. The normal human liver weighs about 1,500 g. When liver disease occurs, the metabolism of the nutrients in the body is problematic. Specifically, Or to convert the protein to albumin, or to break down the unwanted substances and transfer them to the gallbladder.

다양한 간 질환 중 비알콜성 지방간 질환(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 개발도상국에서 가장 흔하게 나타나는 간질환으로, 술을 마시지 않거나 거의 마시지 않는 사람에게 주로 생기는 지방간을 일컫는다. 비알콜성 지방간의 증상은 간 손상을 일으키지 않는 단순한 지방증에서 비알콜성 지방간염(Nonalcoholic Steatohepatitis, NASH)에 이르기까지 그 정도가 다양한데, 이중 가장 심각한 형태인 비알콜성 지방간염은 간경변 및 간암으로까지 진행할 수 있다. 이러한 비알콜성 지방간 질환의 원인은 비만, 혈중 지방질의 농도가 높은 고지혈증 또는 당뇨병 등의 질병, 약물, 심각한 영양 부족 등으로 추정되고 있다.Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is one of the most common liver diseases in developing countries. It is a fatty liver that occurs predominantly in people who do not drink or drink. The symptoms of nonalcoholic steatohepatitis vary from simple steatosis without liver damage to nonalcoholic steatohepatitis (NASH), the most serious form of nonalcoholic steatohepatitis being liver cirrhosis and liver cancer You can proceed. The cause of such non-alcoholic fatty liver disease is presumed to be obesity, hyperlipidemia with high concentration of blood lipids or diseases such as diabetes, drugs, and serious nutritional deficiency.

한편, 플라스마로겐(Plasmalogen)은 퍼록시좀 및 소포체(Endoplasmic Reticulum)에서 합성되는, 비닐 에테르 결합을 포함하는 특수한 인지질의 한 종류로, 세포막의 주요 구조적 구성성분임과 동시에 산화적 스트레스로 유발되는 손상에서 세포를 보호하거나 신호전달 물질로 작용하며 세포의 기능을 유지하는 등, 세포에서 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있다. 특히, 플라스마로겐의 분비의 결함 내지 항상성의 변화는 여러 가지 유전적 질병들과 관련되어 신경성 질환, 다양한 대사 질환, 염증 질환 및 암과도 관련이 있을 것으로 판단되고 있다.On the other hand, Plasmalogen is a kind of special phospholipids containing vinyl ether bonds, which are synthesized in peroxisome and endoplasmic reticulum. It is a major structural component of the cell membrane and induces oxidative stress It is known as a substance that plays an important role in cells, such as protecting cells from damage, acting as a signaling substance, and maintaining cell function. In particular, it has been determined that a defect in the secretion of plasma or a change in homeostasis may be related to various genetic diseases, and also to neurogenic diseases, various metabolic diseases, inflammatory diseases and cancer.

이러한 연구를 바탕으로 현재 플라스마로겐을 함유하는 조성물을 이용해 퇴행성 신경질환, 인식장애, 골다공증, 조울증, 혈관 질병과 같은 증가된 막 콜레스테롤과 관련된 노화 질병을 치료 또는 예방하는 기술들이 개발되고 있다. 그러나 아직까지 생체에서 플라스마로겐의 합성 자체를 유도하여 간 질환을 치료하는 기술 개발은 미비한 실정이다.Based on these studies, technologies for treating or preventing aging diseases associated with increased membrane cholesterol, such as degenerative neurological diseases, cognitive disorders, osteoporosis, bipolar disorder, and vascular diseases, have been developed using compositions containing plasmarogens. However, the development of technology to treat liver disease by inducing the synthesis of plasma genome in vivo has not been developed yet.

1. 한국공개특허 제10-2013-0103190호.1. Korean Patent Publication No. 10-2013-0103190.

본 발명의 목적은 플라스마로겐의 생합성에 필요한 효소의 발현량을 측정함으로써 비알콜성 지방간염을 진단 또는 이의 치료 예후를 예측할 수 있는 바이오마커 조성물, 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 조성물, 이를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 키트 및 이를 이용한 비알콜성 지방간염 진단 방법 및 치료 예후 예측방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a biomarker composition capable of diagnosing non-alcoholic fatty liver disease or predicting its prognosis by measuring the expression level of an enzyme necessary for biosynthesis of plasmarogens, a composition for predicting non-alcoholic fatty liver disease, A kit for predicting non-alcoholic fatty liver disease or a therapeutic prognosis, a method for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, and a method for predicting therapeutic prognosis.

본 발명의 다른 목적은 플라스마로겐의 생합성에 필요한 효소의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and a health functional food composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease comprising an expression or activity promoting agent for enzymes necessary for biosynthesis of plasmarogens.

본 발명의 또 다른 목적은 플라스마로겐의 생합성에 필요한 효소의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for screening a therapeutic agent for nonalcoholic fatty liver disease comprising the step of measuring the expression level of an enzyme necessary for biosynthesis of plasmarogens.

따라서 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 글리세론 포스페이트 O-아실트랜스퍼라아제(Glyceronephosphate O-acyltransferase; Gnpat) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오마따라서 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 글리세론 포스페이트 O-아실트랜스퍼라아제(Glyceronephosphate O-acyltransferase; Gnpat) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오마커 조성물 및 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. Accordingly, in order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease comprising glycerophosphate O-acyltransferase (Gnpat) or a gene encoding the same as an active ingredient, The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease comprising glycerophosphate O-acyltransferase (Gnpat) or a gene coding therefor as an active ingredient, and a non-alcoholic fat A biomarker composition for predicting hepatitis treatment prognosis is provided.

또한, 본 발명은 Gnpat의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 조성물 및 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트 및 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.The present invention also provides a composition for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease comprising a preparation capable of measuring the expression level of Gnpat as an active ingredient, a composition for predicting the prognosis of nonalcoholic fatty liver disease, and a kit for the diagnosis of non- And a kit for predicting a treatment prognosis.

또한, 본 발명은 (a) 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 비알콜성 지방간염이라고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting a Gnpat gene, comprising: (a) measuring the mRNA expression level or Gnpat protein expression level of a Gnpat gene from a sample isolated from a patient; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with a normal control sample; And (c) determining that the level of mRNA expression of the Gnpat gene or the level of expression of the Gnpat protein is lower than that of the normal control sample, determining that the non-alcoholic fatty liver disease is non-alcoholic fatty liver disease. to provide.

또한, 본 발명은 (a) 치료받기 전의 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 치료를 시행하기 전의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준보다 높아졌을 경우 비알콜성 지방간염의 치료 효과가 있다고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting a Gnpat gene, comprising the steps of: (a) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of a Gnpat gene from a sample isolated from a patient before treatment; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient after the treatment; And (c) the level of mRNA expression of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein in the sample isolated from the patient after the treatment, wherein the mRNA expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient before the treatment is administered or And determining that the therapeutic effect of the non-alcoholic fatty liver disease is higher than the level of expression of the non-alcoholic fatty liver disease.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.To achieve these and other objects, the present invention provides a pharmaceutical composition and a health functional food composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease comprising Gnpat protein expression or activity promoter as an active ingredient.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질을 처리한 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 단계 (c)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 증가한 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.(A) measuring the level of mRNA expression of Gnpat gene or the level of expression of Gnpat protein in the liver of an animal; (b) treating the animal with the test substance; (c) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene in the liver of the animal treated with the test substance; And (d) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (a) with the expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (c) A method for screening a therapeutic agent for nonalcoholic fatty liver disease characterized by comprising the step of screening a substance.

본 발명의 비알콜성 지방간염 진단용 또는 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 등은 플라스마로겐의 생합성에서 첫 번째 과정에 관여하는 Gnpat 및 이를 코딩하는 유전자를 포함하기 때문에, 보다 근원적인 간 질환의 치료가 가능하고, Gnpat 및 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 이용하여, 이를 활성화할 수 있는 물질을 스크리닝함으로써 비알콜성 지방간염의 치료제를 유용하게 선별할 수 있다. Since the biomarker composition for the diagnosis of nonalcoholic steatohepatitis or for predicting therapeutic prognosis according to the present invention includes Gnpat involved in the first step in the biosynthesis of plasma and its gene encoding it, By using the expression level of Gnpat and the gene encoding the gene, screening for a substance capable of activating it, a therapeutic agent for nonalcoholic steatohepatitis can be advantageously selected.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 모델 마우스의 간에서 병증에 따른 특성들을 확인한 것이다.
(A : 8주 간 정상 식이요법, 고지방 식이요법, 메티오닌 콜린 결핍 식이요법을 수행한 마우스의 간 조직의 모습 확인. B : 간 지방증, 염증, 섬유증의 경도 점수, C : 혈장 ALT 레벨 측정, D : 염증 및 섬유증의 원인인 유전자들의 mRNA 발현량 측정, E : 미토콘드리아 및 퍼록시좀 지방산 산화(Fatty Acid Oxidation)와 관련된 유전자 및 Pparα의 mRNA 발현량 측정, F : Srebp1c의 mRNA 발현량 측정)
도 2는 도 1의 실시예에 따른 NAFLD 모델 마우스의 간에서 플라스마로겐 관련 특성들을 확인한 결과이다.
(A : Gnpat 및 Agps의 mRNA 발현량 측정, B : 간 플라스마로겐의 추출 이온 크로마토그램(LC-MS/MS 수행 결과), C : 정상 식이요법, HFD 및 MCDD 마우스에서 간의 PC 함유 또는 PE 함유 플라스마로겐의 레벨 측정)
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 NAFLD 모델 마우스의 간에서 Gnpat의 Pparα 조절 능을 확인한 결과이다.
(A : siRNA를 이용한 Pparα 및 Gnpat 넉다운 효과 확인, B : siRNA를 처리한 후 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO과 세포 죽음의 확인, C : Gnpat 넉아웃 마우스의 간에서의 Gnpat mRNA 발현량 측정, D : Gnpat 넉아웃 마우스의 간 조직 관찰, E, F : Gnpat 넉아웃 마우스의 식이요법 별 Gnpat, Pparα mRNA 발현량 및 PC 함유 또는 PE 함유 플라스마로겐 측정)
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 NASH 모델 마우스에서 알킬 글리세롤의 지방증 억제효과를 나타낸 것이다.
(A : 플라스마로겐의 생합성 과정의 도식도, B : MCDD 마우스의 AG 처리 및 미처리시의 간 조직 확인, C : 간 지방증, 염증, 섬유증의 경도 점수 및 관련 mRNA 발현량, 간 중성지방 레벨, 혈장 ALT 레벨, Tnfα, Ccl2, Tgfβ mRNA 발현량 측정, D : 정상식이요법 및 MCDD 마우스의 간에서 PC 함유 및 PE 함유 플라스마로겐 측정, E : 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO 및 관련 유전자 발현량 측정, F : 정상 식이요법 및 MCDD 마우스 간에서 유리 콜레스테롤 레벨 측정)
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 고지방 고콜레스테롤 식이요법 마우스의 간에서 나타나는 각종 특성들을 확인한 것이다.
(A : 정상 식이요법 및 MCDD 마우스에서 간의 조직학적 관찰, B : 염증 및 섬유증에 관여하는 mRNA 발현량, 간 중성지방, 혈장 ALT 레벨 측정, C : 상대적인 Pparα mRNA 발현량, 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO 측정, D : 혈장 총 콜레스테롤 및 간 유리 콜레스테롤 레벨 측정, E : Gnpat 및 Agps의 상대적인 발현량 및 간의 PC 함유 또는 PE 함유 플라스마로겐의 함량 측정, F : HFHCD 마우스에서 Fads1 및 Fads2의 mRNA 발현량 및 siRNA 처리 시 Fads1, Fads2, Gnpat, Pparα의 상대적인 발현량 측정)
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 MCDD 마우스에서 플루바스타틴(Fluvastatin)의 NASH 억제 효과를 확인한 것이다.
(A : 플루바스타틴 처리에 따른 MCDD 마우스의 간 조직학적 관찰, B : 간 지방증, 염증 및 섬유증의 경도, 간 중성지방, 혈장 ALT 레벨 측정, C : 간의 유리 콜레스테롤 레벨, 염증 및 섬유증에 관여하는 유전자의 발현 레벨 측정, D : 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO 및 FAO 관련 유전자 발현량 측정, E : Gnpat 및 Agps mRNA 발현량 및 간의 PC 및 PE 함유 플라스마로겐 레벨의 측정, F : Fads1 및 Fads2 mRNA 발현량 측정 및 간의 AA, EPA, DHA 함유 폴리불포화지방산(PUFA) 조성물 분석)
도 7은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 MCDD 마우스에서 비접힘 단백질 반응에 대한 플루바스타틴(A) 및 알킬 글리세롤(B)의 효과를 웨스턴블롯(Western blot)으로 확인한 것이다.
도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 Gnpat 넉아웃 마우스에서 플루바스타틴 및 알킬 글리세롤의 NASH 억제 효과를 확인한 것이다.
(A : MCDD 정상 마우스 및 Gnpat 넉아웃 마우스에서 간의 조직학적 관찰, B : 간 지방증, 염증 및 섬유증의 경도 측정, C : 혈장 ALT 레벨 및 Tnfα, Ccl 2 mRNA 발현 레벨 측정, D : Pparα mRNA 발현 레벨 측정, E : Gnpat mRNA 발현 레벨 및 간의 PC 함유 및 PE 함유 플라스마로겐 레벨의 변화량 비교, F : 간 유리 콜레스테롤 및 DHA-플라스마로겐의 NASH 발병에서의 역할을 나타내는 모식도)FIG. 1 shows the characteristics of liver non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) model mice according to the present invention.
(A: Identification of liver tissue in mice that received 8 weeks of normal diet, high fat diets, and methionine choline deficient diet.) B: Hardness score of hepatic steatosis, inflammation, fibrosis, C: Plasma ALT level measurement, D : Measurement of mRNA expression level of genes causing inflammation and fibrosis, E: measurement of mRNA expression level of Pparα gene and mitochondria and peroxidase fatty acid oxidation (Fatty Acid Oxidation), F: measurement of mRNA expression level of Srebp1c )
FIG. 2 shows the results of confirming the plasma-related characteristics in the liver of the NAFLD model mouse according to the embodiment of FIG.
(A: Measurement of mRNA expression level of Gnpat and Agps , B: Extraction ion chromatogram of liver plasmaprogen (result of LC-MS / MS), C: Normal diet, HFD and MCDD mouse Level measurement of plasmagenogen)
FIG. 3 shows the results of confirming the ability of Gnpat to regulate Ppar alpha in the liver of a NAFLD model mouse according to another embodiment of the present invention.
(A: confirmation of Pparα and Gnpat knockdown effect using siRNA, B: confirmation of mitochondria and peroxisome FAO and cell death after treatment of siRNA, C: measurement of Gnpat mRNA expression in liver of Gnpat knockout mouse, D: Gnpat knock-out mouse liver tissue observed, E, F: Gnpat knock-out mice of diets by Gnpat, Pparα mRNA expression levels and PC containing or containing PE Gen measured in plasma)
FIG. 4 shows the effect of alkylglycerol on the suppression of diabetes in a NASH model mouse according to another embodiment of the present invention.
(A: schematic diagram of plasma biogenesis process, B: liver tissue confirmation at the time of AG treatment and untreated treatment of MCDD mouse, C: hardness score of liver fibrosis, inflammation, fibrosis and related mRNA expression level, Measurement of plasma ALT level, Tnfα , Ccl2 , Tgfβ mRNA expression level, D: Normal diet and measurement of PC containing and PE containing plasma in liver of MCDD mice, E: Measurement of mitochondrial and peroxidase FAO and related gene expression levels, F: Measurement of free cholesterol levels between normal diet and MCDD mice)
FIG. 5 shows various characteristics of the liver of a high-fat, high-cholesterol diet mouse according to another embodiment of the present invention.
(A: Histopathological observation in normal diet and MCDD mouse, B: mRNA expression level involved in inflammation and fibrosis, liver triglyceride, plasma ALT level measurement, C: relative Pparα mRNA expression level, mitochondria and peroxisome FAO E: measurement of the relative expression level of Gnpat and Agps and the content of liver PC or PE-containing plasma; F: mRNA expression level of Fads1 and Fads2 in HFHCD mouse; siRNA treatment when Fads1, Fads2, Gnpat, the relative expression amount measurement of Pparα)
FIG. 6 shows the NASH inhibitory effect of Fluvastatin in an MCDD mouse according to another embodiment of the present invention.
(A: hepatic histology of MCDD mice following treatment with fluvastatin, B: hepatic steatosis, inflammation and fibrosis hardness, liver triglyceride, plasma ALT level measurement, C: free cholesterol level in liver, inflammation and fibrosis Gene expression level, D: mitochondrial and peroxisome FAO and FAO-related gene expression levels, E: Gnpat And AgPS mRNA expression levels and liver levels of PC and PE containing plasma, F: measurement of Fad1 and Fad2 mRNA expression levels and analysis of polyunsaturated fatty acid (PUFA) composition containing AA, EPA, DHA in the liver.
FIG. 7 is a Western blot image showing the effect of fluvastatin (A) and alkyl glycerol (B) on unfolded protein reaction in an MCDD mouse according to another embodiment of the present invention.
8 is a graph showing the NASH inhibitory effect of fluvastatin and alkyl glycerol in a Gnpat knockout mouse according to another embodiment of the present invention.
(A: Histopathological observation of liver in MCDD normal mouse and Gnpat knockout mouse, B: Hardness measurement of hepatic steatosis, inflammation and fibrosis, C: Plasma ALT level and Tnfα , Ccl 2 mRNA expression level measurement, D: Pparα mRNA expression level E: Gnpat mRNA expression level and hepatic PC content, and PE-containing plasma genotypic level change. F: Liver cholesterol and DHA-plasminogen in NASH pathogenesis)

본 발명은 글리세론 포스페이트 O-아실트랜스퍼라아제(Glyceronephosphate O-acyltransferase; Gnpat) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 또는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease or for predicting the prognosis of non-alcoholic fatty liver disease comprising Glycerophosphate O-acyltransferase (Gnpat) or a gene encoding the same as an active ingredient .

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.As used herein, the term "diagnosing" is intended to include determining the susceptibility of an individual to a particular disease or disorder, determining whether an individual currently has a particular disease or disorder, Determining the prognosis of the subject, or therametrics (e.g., monitoring the condition of the subject to provide information about the therapeutic efficacy).

본 명세서에서 용어 "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 비알콜성 지방간 질환 환자에 있어서 치료 예후는 통상적으로 플라스마로겐 합성량의 증가량을 뜻한다. 예후의 예측은 향후 비알콜성 지방간 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.As used herein, the term "prognosis" refers to a prospect of a future symptom or progress that has been diagnosed by diagnosing the disease. In patients with nonalcoholic fatty liver disease, the therapeutic prognosis usually refers to an increase in plasma synthesis. Prediction of prognosis is a very important clinical task because it suggests the direction of future nonalcoholic fatty liver treatment.

또한, 본 발명은 Gnpat의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 조성물 또는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease or a composition for predicting the prognosis of nonalcoholic fatty liver disease, which comprises a preparation capable of measuring the expression level of Gnpat as an active ingredient.

이때, 상기 Gnpat의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Gnpat 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Gnpat 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In this case, the agent capable of measuring the expression level of Gnpat may be a primer or a probe specifically binding to the Gnpat gene, an antibody, peptide, aptamer or a compound specifically binding to the Gnpat protein, It is not.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트 또는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease or a non-alcoholic fatty liver disease prognosis prediction kit comprising the composition.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleotide sequence that can form base pairs with a complementary template with a short free 3'-hydroxyl group and serves as a starting point for template strand radiation Refers to a short nucleic acid sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at appropriate buffer solutions and temperatures. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA 외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.As used herein, the term "probe" means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few nucleotides or hundreds of nucleotides that can specifically bind to an mRNA. The presence or absence of a specific mRNA, Can be confirmed. The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 Gnpat에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.As used herein, the term "antibody" means a specific immunoglobulin as indicated in the art and directed against an antigenic site. The antibody in the present invention means an antibody that specifically binds to Gnpat of the present invention, and the antibody can be produced according to a conventional method in the art. The forms of the antibodies include polyclonal or monoclonal antibodies, including all immunoglobulin antibodies. The antibody refers to a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. The antibody also includes a special antibody such as a humanized antibody.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.As used herein, the term "peptide" has a high binding capacity to the target material and does not cause denaturation during thermal / chemical treatment. In addition, since the molecular size is small, it can be used as a fusion protein by attaching to other proteins. It can be used as a diagnostic kit and a drug delivery material because it can be specifically attached to a polymer protein chain.

본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.The term "aptamer " as used herein refers to a specific type of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid having a stable tertiary structure by itself and having a characteristic capable of binding with high affinity and specificity to a target molecule ). ≪ / RTI > As described above, since the aptamer is composed of a polynucleotide which is capable of specifically binding to an antigenic substance like the antibody and is more stable than the protein, has a simple structure, and is easy to synthesize, .

본 발명의 키트는 바이오마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The kit of the present invention comprises an antibody that specifically binds to a biomarker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a marker that develops upon reaction with the substrate, a chromogenic substrate solution that reacts with the label, a wash solution, and an enzyme A reaction stop solution, and the like, and may be manufactured from a number of separate packaging or compartments including the reagent components used.

또한, 본 발명은 (a) 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 비알콜성 지방간염이라고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting a Gnpat gene, comprising: (a) measuring the mRNA expression level or Gnpat protein expression level of a Gnpat gene from a sample isolated from a patient; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with a normal control sample; And (c) determining that the level of mRNA expression of the Gnpat gene or the level of expression of the Gnpat protein is lower than that of the normal control sample, determining that the non-alcoholic fatty liver disease is non-alcoholic fatty liver disease. to provide.

또한, 본 발명은 (a) 치료받기 전의 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 치료를 시행하기 전의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준보다 높아졌을 경우 비알콜성 지방간염의 치료 효과가 있다고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting a Gnpat gene, comprising the steps of: (a) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of a Gnpat gene from a sample isolated from a patient before treatment; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient after the treatment; And (c) the level of mRNA expression of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein in the sample isolated from the patient after the treatment, wherein the mRNA expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient before the treatment is administered or And determining that the therapeutic effect of the non-alcoholic fatty liver disease is higher than the level of expression of the non-alcoholic fatty liver disease.

구체적으로, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the mRNA expression level can be measured by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA) , Northern blotting, and DNA chips, but are not limited thereto.

보다 구체적으로, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯(Wetsern blot), 방사성면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 및 ELISA 분석을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.More specifically, methods for measuring the level of protein expression include, but are not limited to, Wetsern blot, Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket But are not limited to, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS, protein chips and ELISA assays.

본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 바이오마커인 상기 Gnpat 유전자 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함할 수 있고, 보다 상세하게는 간 조직, 간세포일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term "isolated sample from a patient" refers to a tissue, cell, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine that differ in the level of expression of the Gnpat gene or Gnpat protein as a biomarker But may include the same sample, and more specifically, it may be a liver tissue, a hepatocyte, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease comprising Gnpat protein expression or activity promoter as an active ingredient.

이때, 상기 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 포함될 수 있는 바, 상기 범위보다 너무 적게 포함되는 경우에는 촉진제의 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진 효과가 제대로 나타나지 않고, 너무 많이 포함되는 경우에는, 함량 증가량 대비 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진 효과의 증가량이 저하되므로 바람직하지 않다.In this case, the Gnpat protein expression or activity promoter may be contained in an amount of 0.1 to 50 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition. If the Gnpat protein expression or activity promoter is contained in an amount less than the above range, If it is contained too much, the amount of increase of the Gnpat protein expression or activity promoting effect relative to the content increase amount is undesirably reduced.

본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고 뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain a chemical substance, a nucleotide, an antisense, an siRNA oligonucleotide and a natural product extract as an active ingredient. The pharmaceutical composition or combination preparation of the present invention may be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the active ingredients. Examples of the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants , A lubricant or a flavoring agent may be used.

본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration. Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile solutions suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.Pharmaceutical dosage forms of the pharmaceutical compositions of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, suspending agents or injectable solutions or suspensions . The pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated and administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, percutaneous, intranasal, inhalation, topical, rectal, ≪ / RTI >

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, and the time, but may be suitably selected by those skilled in the art. have.

더욱이, 본 발명은 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating nonalcoholic fatty liver disease comprising Gnpat protein expression or activity promoter as an active ingredient.

이때, 상기 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 90 중량부로 포함될 수 있는 바, 상기 범위에서 촉진제의 Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진 효과가 가장 뛰어나므로 바람직하다.At this time, the Gnpat protein expression or activity promoting agent may be included in an amount of 10 to 90 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition, and it is preferable that the promoter has the most excellent Gnpat protein expression or activity promoting effect in the above range.

상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.The health functional food composition may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts , Organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. It may also contain flesh for the production of natural fruit juices, synthetic fruit juices and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The health functional food composition may be in the form of any one of meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, gum, ice cream, soup, beverage, tea, functional water, drink, alcohol and vitamin complex Lt; / RTI >

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.In addition, the health functional food composition may further include a food additive, and the suitability of the food functional additive as a "food additive" Of the present invention.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.Examples of the products that have been used in the above-mentioned "food additives" include natural products such as ketones, chemical products such as glycine, potassium citrate, nicotinic acid and cinnamic acid, sensory coloring matter, licorice extract, crystalline cellulose, high- - Mixed preparations such as a sodium glutamate preparation, a noodle-added alkaline agent, a preservative preparation, a tar coloring agent and the like.

또한, 본 발명은 (a) 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질을 처리한 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 단계 (c)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 증가한 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.(A) measuring the level of mRNA expression of Gnpat gene or the level of expression of Gnpat protein in the liver of an animal; (b) treating the animal with the test substance; (c) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene in the liver of the animal treated with the test substance; And (d) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (a) with the expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (c) And screening the substance for the non-alcoholic fatty liver disease therapeutic agent.

이때, 상기 치료제는 Gnpat의 유전자의 mRNA 또는 Gnpat 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 간에서 플라스마로겐(plasmalogen)의 양을 증가시킬 수 있는 바, 생체의 생합성 과정 자체에 관여하여 보다 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 선별해낼 수 있다.At this time, the therapeutic agent can increase the amount of plasmalogen in the liver by increasing the expression level of mRNA or Gnpat protein of Gnpat gene, and it is possible to increase the amount of plasmalogen in the liver, Can be selected.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. It is to be understood, however, that these examples are provided for the purpose of providing a more complete understanding of the present invention to those skilled in the art, and that the scope of the present invention is limited only by the following examples It is not.

<< 준비예Preparation Example 1> 동물 준비 1> Animal preparation

8주령의 수컷 C57BL/6N 마우스를 실험 대상으로 삼았으며, 모든 동물들의 사용 및 실험 방법은 아산생명과학연구원의 동물실험윤리위원회(서울, 한국)에서 승인되었다. 실험 조건에 따라, C57BL/6N 마우스의 식이요법으로 정상 식이요법(ND; 지방에서 12%의 에너지를 얻는 정도), 고지방 식이요법(HFD; 지방에서 60%의 에너지를 얻는 정도), 메티오닌 및 콜린 결핍 식이요법(MCDD; 2.5%의 콜레스테롤을 포함하는 지방에서 60%의 에너지를 얻는 정도, 메티오닌 및 콜린 결핍) 또는 고지방 고콜레스테롤 식이요법(HFHCD; 2.5%의 콜레스테롤을 포함하는 지방에서 60%의 에너지를 얻는 정도)을 각각 수행하였다. 이때 MCDD 및 HFHCD 식이요법을 수행한 마우스가 비알콜성 지방간 질환의 동물 모델로 사용되었다.8-week-old male C57BL / 6N mice were used for the experiment. All animals were used and tested in the Animal Experimental Ethics Committee of the Asan Institute of Life Science (Seoul, Korea). Depending on the experimental conditions, a diet regimen of C57BL / 6N mice can be used to regulate normal diet (ND), high fat diets (HFD), methionine and choline (MCDD, a degree of 60% energy gain in fat containing 2.5% cholesterol, methionine and choline deficiency) or high fat high cholesterol diet (HFHCD; 60% energy in fat containing 2.5% cholesterol Respectively) were performed. At this time, MCDD and HFHCD diets were used as an animal model for nonalcoholic fatty liver disease.

<< 준비예Preparation Example 2> 세포배양 2> Cell culture

마우스의 간세포주인 AML12를 변형 이글배지(Eagles Medium) 및 영양 혼합물 F-12(1:1)에 10% 소태아혈청, 5 μg/ml 인슐린, 5 μg/ml 의 트랜스페린, 5 ng/ml의 셀레늄 및 40 ng/ml 덱사메타손을 보충물로 투여하고 37℃, 5% CO2 및 95%의 공기가 있는 습한 환경에서 배양하였다. 이후, 세포들을 성장 배지에서 배양물이 70-80%의 공간을 차지할 정도로 증식할 때까지 2차 배양하였다. Mouse hepatocyte host AML12 was transfected with 10% fetal bovine serum, 5 μg / ml insulin, 5 μg / ml transferrin, 5 ng / ml selenium (1 μg / ml) and administering a 40 ng / ml dexamethasone with supplements and incubated in a humid environment with a 37 ℃, 5% CO 2 and 95% air. Subsequently, the cells were cultured in growth medium until the cultures proliferated to a size of 70-80%.

<실시예 1> 식이요법에 따른 마우스들의 특성 확인Example 1: Characterization of mice according to the diet

통계학적 분석의 결과들은 평균±s.e.m으로 표시되었다. 실험 그룹들 간의 차이점은 스튜던트의 양측꼬리 t-검정(Student's two-tailed t-test) 또는 일원분산분석과 이에 따른 본페로니 사후검정(one-way ANOVA followed by Bonferroni post-hoc test)에 의해 측정되었다. P < 0.05일 경우에 통계학적으로 의미가 있다고 보았다.Results of statistical analysis were expressed as mean ± s.e.m. The differences between the experimental groups were measured by Student's two-tailed t-test or one-way ANOVA followed by Bonferroni post-hoc test . P <0.05 was considered statistically significant.

(1) 조직학적 분석(1) Histological analysis

상기 준비예 1에서 준비한 마우스의 간 조직을 조직학적으로 분석하기 위해, 일정 시간동안 서로 다른 식이요법을 수행한 마우스들을 희생하여 간을 추출하였다. 이후, 간 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드와 혼합하여 파라핀에 담가둔 후에, 5 ㎛ 의 두께로 잘라 연속절편을 얻었다. 이후 이 연속 절편들을 헤마톡실린/에오신(H&E) 및 Masson's Trichrom(MT)로 염색하였다.In order to histologically analyze the liver tissues of the mice prepared in Preparation Example 1, the mice were sacrificed and mice were subjected to different diets for a certain period of time. Subsequently, liver tissue samples were mixed with 4% paraformaldehyde and immersed in paraffin, followed by cutting to a thickness of 5 쨉 m to obtain a serial section. The serial sections were then stained with hematoxylin / eosin (H & E) and Masson's Trichrom (MT).

간의 조직학적 변화의 심각도를 측정하기 위해, NASH-Clinical Research Network(CRN)의 점수 시스템을 사용하여, 다음과 같은 평가 기준과 점수를 마련하였다. 지방증 등급은 실질조직 침범(parenchymal involvement)의 정도에 따라 다음과 같은 점수로 평가되었다: 5% 미만일 때 0점, 5%-33%일 때 1점, 33%-66%일 때 2점, 66% 초과일 때 3점. 또한, 지방증의 부위는 다음과 같은 점수로 평가되었다: 두드러진 3구역(zone)일 때 0점, 두드러진 1구역(zone)일 때 1점, 지역으로 나뉘지 않을 때 2점, 범꽈리형일 때 3점. 소엽성 염증 정도는 x200 현미경 조건에서 염증 병소의 숫자에 따라 다음과 같이 점수를 매겼다: 0개일 때 0점, x200 배율 당 2개 미만일 때 1점, x200 배율 당 2-4개 일 때 2점, x200 배율 당 4개 초과인 경우 3점. 섬유증 단계는 섬유증의 위치와 밀도에 따라 다음과 같이 점수를 매겼다: 0개일 때 0점, 굴맥관주변(perisinusolidal) 또는 문맥 주위 섬유증일 때 1점, 굴맥관주변(perisinusoidal) 섬유증일 때 2점, 가교형 섬유증일 때 3점, 간경변증일 때 4점.To assess the severity of histologic changes in the liver, the following rating criteria and scores were established using the NASH-Clinical Research Network (CRN) scoring system. The degree of lipemia was assessed according to the degree of parenchymal involvement: 0 point at less than 5%, 1 point at 5% -33%, 2 points at 33% -66% 3 points when exceeding%. The site of the lesion was assessed as follows: 0 for the prominent zone, 1 for the prominent zone, 2 for the non-divided zone, 3 point. The degree of lobular inflammation was scored according to the number of inflammatory lesions under x200 microscopic conditions as follows: 0 at 0, 1 at less than 2 x200, 2 at 2 to 4 at x200 magnification, x200 3 points for more than 4 per magnification. The fibrosis stage was scored according to the location and density of fibrosis as follows: 0 at 0, perisinusolidal or periappendiceal fibrosis, 2 at perisinusoidal fibrosis, 3 points for cross-linked fibrosis, and 4 points for cirrhosis.

그 결과, 도 1의 A 및 B를 참조하면, HFD 식이요법을 8주간 수행한 C57BL/6N 마우스는 큰 염증 반응 없이 약간의 간 지방증을 나타낸 반면에, 8주간 MCDD 식이요법을 수행한 마우스는 비알콜성 지방간염(NASH)과 초기 비알콜성 간 섬유증을 나타냈다.As a result, referring to FIGS. 1A and 1B, C57BL / 6N mice that had been subjected to the HFD diet for 8 weeks showed slight hepatic steatosis without significant inflammation reaction, whereas those mice that received the 8-week MCDD diet Alcoholic fatty liver disease (NASH) and early nonalcoholic liver fibrosis.

(2) 혈장의 알라닌 트랜스아미네이스(Alanine transaminase, ALT) 레벨 측정(2) Measurement of plasma alanine transaminase (ALT) levels

상기 준비예 1에서 식이요법에 따라 키운 마우스의 혈장을 채취한 후, 혈장의 알라닌 트랜스아미네이스(Alanine transaminase) 레벨을 IDToxTM Alanine Transaminase Endpoint Assay kit(ID LabsTM Inc., ON, Canada)를 사용하여 측정하였다. Plasma of the mice raised according to the diet in Preparation Example 1 was collected and alanine transaminase levels of the plasma were measured using the IDTox TM Alanine Transaminase Endpoint Assay kit (ID Labs TM Inc., ON, Canada).

그 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이, MCDD 식이요법을 한 마우스에서 ALT 레벨이 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 1C, it was found that the ALT level was remarkably increased in the MCDD-treated mice.

(3) 지방산 산화(Fatty Acid Oxidation, FAO) 관련 효소 유전자의 mRNA 발현 측정(3) Measurement of mRNA expression of enzyme genes related to fatty acid oxidation (FAO)

상기 준비예 1에서 키운 마우스들에서 간을 적출하였다. 간 조직을 TRIzol 시약(Invitrogen, USA) 1 ml에 넣고 혼합한 다음 클로로포름(Merck, Germany) 200 μl를 넣고 5 분간 배양했다. 이후, 13,000 rpm에서 20분 간 원심분리하고 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 이소프로판올(Sigma, USA) 500 μl를 넣고 조심스럽게 혼합한 후 30분 간 -20℃에서 배양했다. 배양된 상층액을 13,500 rpm 30분간 원심분리한 후 에탄올(Merck, Germany)로 세수하고 펠렛을 말려주었다. 이렇게 말린 펠렛을 DEPC-water(Bioneer, Korea)에 녹인 후 cDNA 합성 kit(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. The liver was extracted from the mice raised in Preparation Example 1 above. Liver tissues were mixed in 1 ml of TRIzol reagent (Invitrogen, USA), and then 200 μl of chloroform (Merck, Germany) was added and incubated for 5 minutes. Then, centrifugation was carried out at 13,000 rpm for 20 minutes. The supernatant was transferred to a new tube, and 500 μl of isopropanol (Sigma, USA) was added thereto. The mixture was carefully mixed and incubated at -20 ° C. for 30 minutes. The cultured supernatant was centrifuged at 13,500 rpm for 30 minutes, washed with ethanol (Merck, Germany), and the pellets were dried. The dried pellet was dissolved in DEPC-water (Bioneer, Korea) and cDNA was synthesized using cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo scientific, USA).

실시간 PCR(Real time PCR)은 FastStart Universal SYBR Green Master(Roche, Germany)와 ABI PRISM 7500 Fast real time PCR system(Applied Biosystems Warrington, UK)을 이용하여 수행하였다. 반응 조건은 95℃에서 10분간 반응 시킨 후 95℃에서 10초, 60℃에서 30초가 한 사이클이었고 총 40 사이클로 증폭하였다. Real time PCR의 결과는 역치 주기(CT, Threshold cycle)를 얻은 다음 본 실험의 내부 통제(Internal control)로 사용한 18s rRNA의 발현 정도와 비교하였다. 이러한 모든 계산 과정은 7500 system software를 이용하였고, PCR 수행 시 사용되었던 프라이머 서열은 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.Real time PCR was performed using FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Germany) and ABI PRISM 7500 Fast real time PCR system (Applied Biosystems, Warrington, UK). The reaction conditions were 95 ° C for 10 minutes, followed by 95 ° C for 10 seconds and 60 ° C for 30 seconds. The results of real time PCR were compared with the expression level of 18s rRNA used as the internal control of this experiment after obtaining the threshold cycle (CT). All of these calculations were performed using the 7500 system software, and the primer sequences used in the PCR were as shown in Table 1 below.

유전자gene 프라이머 서열Primer sequence 서열번호SEQ ID NO: TnfαTnfα 정방향Forward 5'-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3'5'-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 ' 1One 역방향Reverse 5'-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3'5'-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3 ' 22 Ccl2Ccl2 정방향Forward 5'-GCATCCACGTGTTGGCTCAG-3'5'-GCATCCACGTGTTGGCTCAG-3 ' 33 역방향Reverse 5'-TGGACCCATTCCTTCTTGGG-3'5'-TGGACCCATTCCTTCTTGGG-3 ' 44 Il6Il6 정방향Forward 5'-ACTCCAGAAGACCAGAGGAAAT-3'5'-ACTCCAGAAGACCAGAGGAAAT-3 ' 55 역방향Reverse 5'-CCAGAGATACAAAGAAATGATGG-3'5'-CCAGAGATACAAAGAAATGATGG-3 ' 66 TgfβTgfβ 정방향Forward 5'-TATAGCAACAATTCCTGGCG-3'5'-TATAGCAACAATTCCTGGCG-3 ' 77 역방향Reverse 5'-CCTGTATTCCGTCTCCTTG-3'5'-CCTGTATTCCGTCTCCTTG-3 ' 88 Acta2
(α-SMA) Acta2
(? -SMA) 정방향Forward 5'-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3'5'-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3 ' 99 역방향Reverse 5'-GTTCAGTGGTGCCTCTGTCA-3'5'-GTTCAGTGGTGCCTCTGTCA-3 ' 1010 Cpt1αCpt1α 정방향Forward 5'-TGGCCGCATGTCAAGCCAGA-3'5'-TGGCCGCATGTCAAGCCAGA-3 ' 1111 역방향Reverse 5'-AGGAGAGCAGCACCTTCAGCGA-3'5'-AGGAGAGCAGCACCTTCAGCGA-3 ' 1212 VlcadVlcad 정방향Forward 5'-TGCTCTGTGATAGCTGGTGC-3'5'-TGCTCTGTGATAGCTGGTGC-3 ' 1313 역방향Reverse 5'-GGCCTTGGAGATGCTTCTGA-3'5'-GGCCTTGGAGATGCTTCTGA-3 ' 1414 Acox1Acox1 정방향Forward 5'-CACGCACATCTTGGATGGTAGTCCG-3'5'-CACGCACATCTTGGATGGTAGTCCG-3 ' 1515 역방향Reverse 5'-ACGCTGGCTTCGAGTGAGGAAGTTA-3'5'-ACGCTGGCTTCGAGTGAGGAAGTTA-3 ' 1616 Dbp1Dbp1 정방향Forward 5'-ACGCCCTGGCGTTTGCAGAA-3'5'-ACGCCCTGGCGTTTGCAGAA-3 ' 1717 역방향Reverse 5'-TGGCCACTGCTTTTCCGCCT-3'5'-TGGCCACTGCTTTTCCGCCT-3 ' 1818 PparαPparα 정방향Forward 5'-AGAGCCCCATCTGTCCTCTC-3'5'-AGAGCCCCATCTGTCCTCTC-3 ' 1919 역방향Reverse 5'-ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA-3'5'-ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA-3 ' 2020 Srebp1cSrebp1c 정방향Forward 5'-CTGGGGGTGAGACAGGGGAC-3'5'-CTGGGGGTGAGACAGGGGAC-3 ' 2121 역방향Reverse 5'-GATGGTGGAGGGGACAAGGG-3'5'-GATGGTGGAGGGGACAAGGG-3 ' 2222

그 결과, 도 1의 D 내지 F에 나타난 바와 같이, MCDD 식이요법을 수행한 마우스에서 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO와 관련된 효소들, 즉, 카르니틴 팔미토일 전이효소-1(carnitine palmitoyl transferase-1, Cpt1a), 초장쇄 acyl-CoA 탈수소효소(very long-chain acyl-CoA dehydronase, Vlcad), Acyl-CoA 산화효소-1(Acyl-coA oxidase-1, Aoox1 ) 및 이기능 단백질(D-Bifunctional protein; Dbp1) 등의 mRNA 발현 레벨이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO를 촉진하는 핵 수용체인 Pparα의 유전자 발현량 또한 현저히 감소하였다. As a result, as shown in Fig. 1 D to F, the enzymes associated with mitochondria and peroxisome FAO, i.e., carnitine palmitoyl transferase-1, Cpt1a ), Acyl-CoA dehydronase ( Vlcad ), Acyl-CoA oxidase-1 ( Aoox1 ) and D- Bifunctional protein ( Dbp1) ) And mRNA expression levels were decreased. In addition, the amount of gene expression of Ppar alpha, a nuclear receptor that promotes mitochondria and peroxisome FAO, was also significantly reduced.

반면에, HFD 식이요법을 수행한 마우스에서, 지질 합성의 주요 전사인자인 스테롤 규정 성분 결합 단백질(Srebp1c)의 발현량을 증가시켰지만 Pparα 및 FAO 관련 효소들의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 Pparα 발현 및 FAO 과정이 비알콜성 지방간염의 병증에 매우 크게 관여한다는 것을 의미한다.On the other hand, in the HFD diet-treated mice, expression of the sterol-specific component binding protein (Srebp1c), which is a major transcription factor of lipid synthesis, was increased but did not affect expression of Pparα and FAO-related enzymes. These results indicate that Pparα expression and FAO process are very involved in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis.

(4) (4) 플라스마로겐Plasmacrogen 생합성 효소 유전자의  Of the biosynthetic enzyme gene mRNAmRNA 발현 측정 Expression measurement

플라스마로겐 생합성 효소인 Gnpat 및 Agps의 mRNA 발현량을 상기 지방산 산화 관련 효소 유전자의 발현 측정 시 수행했던 방법과 동일한 방법으로 측정하였고, 이때 사용한 프라이머는 하기 <표 2>에 나타난 것과 같았다.MRNA expression levels of Gnpat and Agps, plasma plasmogen biosynthesis enzymes, were measured in the same manner as in the measurement of the expression of the fatty acid oxidation-related enzyme gene. The primers used here were as shown in Table 2 below.

유전자gene 프라이머 서열Primer sequence 서열번호SEQ ID NO: GnpatGnpat 정방향Forward 5'-CGGGTTCCTGCTTTGGCCTG-3'5'-CGGGTTCCTGCTTTGGCCTG-3 ' 2323 역방향Reverse 5'-CCGTTGACCACTTGTGACCT-3'5'-CCGTTGACCACTTGTGACCT-3 ' 2424 AgpsAgps 정방향Forward 5'-AGGGGAGTTCAGTTCGCACC-3'5'-AGGGGAGTTCAGTTCGCACC-3 ' 2525 역방향Reverse 5'-CTCTCTAGCAGCTGCCTCAG-3'5'-CTCTCTAGCAGCTGCCTCAG-3 ' 2626

그 결과, 도 2의 A를 참조하면, MCDD 식이요법을 수행한 마우스에서 플라스마로겐 생합성 효소인 Gnpat과 Agps의 발현 레벨이 현저히 감소한 반면, HFD 식이요법을 한 마우스에서는 Gnpat 및 Agps의 발현 레벨에 변화가 없었다.As a result, referring to FIG. 2 A, expression levels of Gnpat and Agps, plasma plasmogen biosynthetic enzymes, in the MCDD-treated mice were remarkably decreased, whereas in the mice treated with HFD, expression levels of Gnpat and Agps There was no change.

또한, Gnpat과 Agps의 발현량 차이를 살펴보면, MCDD 마우스에서 Gnpat의 발현량의 감소폭이 Agps 발현량의 감소폭보다 현저히 큰 것을 알 수 있었다. 즉, 이러한 사실로부터 같은 생합성 과정에 관여하는 효소이더라도, Agps보다 Gnpat이 비알콜성 지방간염에 가장 크게 영향을 미치는 생합성 효소임을 알 수 있다.In addition, the difference in the expression level of Gnpat and Agps revealed that the decrease in the expression level of Gnpat was significantly greater than the decrease in the expression level of Agps in the MCDD mouse. These results suggest that Gnpat is a biosynthetic enzyme that has the greatest effect on nonalcoholic fatty liver disease than Agps even though it is involved in the same biosynthesis process.

(5) 플라스마로겐 레벨 측정(5) Plasmagen level measurement

상기 마우스의 간 조직을 채취한 후, 간에서의 플라스마로겐 레벨은 이중질량분석기(tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)와 1290 HPLC(Agilent, Waldbronm, Germany) 및 QTRAP 5500(AB Sciex, Toronto, Canada)를 구비한 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다.The plasma levels of the liver in the liver were determined by tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) and 1290 HPLC (Agilent, Waldbronm, Germany) and QTRAP 5500 (AB Sciex, Toronto , Canada). &Lt; / RTI &gt;

대부분의 플라스마로겐은 극성 헤드(head)에 에탄올라민(PE-플라스마로겐) 혹은 콜린(PC-플라스마로겐)을 가지고 있고, sn-2 위치에 DHA(22:6n-3) 또는 아라키돈산(AA; 20:4n-6)과 같은 n-3 또는 n-6 폴리불포화지방산(PUFAs)이 풍부하다. Most of the plasma gen is ethanol lamin a polar head (head) (in PE- plasma gen) or choline (as PC- plasma gen) have to have, sn -2 position in DHA (22: 6 n -3) or arachidonic It is rich in n- 3 or n- 6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) such as acids (AA; 20: 4 n -6).

실제 수행한 LC-MS/MS 결과에서 DHA를 포함하는 PC-플라스마로겐 및 PE-플라스마로겐의 대표적인 피크(peak)가 도 2의 B에 나타난 것과 같았다. 또한, 도 2의 C를 참조하면 MCDD 식이요법을 수행한 경우, AA를 함유한 PC-플라스마로겐의 양이 증가했지만 DHA를 함유한 PC 및 PE-플라스마로겐의 양은 감소하였다. 반면에, HFD 식이요법은 간의 플라스마로겐 레벨에 중요한 변화를 일으키지 않았다.Representative peaks of PC-plasmarogens and PE-plasmarogens containing DHA in actual LC-MS / MS results were as shown in Figure 2B. In addition, referring to FIG. 2C, when the MCDD regimen was performed, the amount of PC-plasmagenogen containing AA was increased but the amount of PC and PE-plasma containing DHA was decreased. On the other hand, the HFD regimen did not cause significant changes in the gen level with liver plasma.

(6) Gnpat 및 Pparα의 관계 확인(6) Confirmation of the relationship between Gnpat and Pparα

Pparα는 미토콘드리아와 퍼록시좀 FAO와 관련된 유전자 발현을 조절하는 유전자로, Gnpat 등의 유전자 발현 및 세포에 대한 영향력을 확인하기 위해, 상기 준비예 2에서 준비한 AML12 간세포에 Δ-5 및 Δ-6 불포화효소(Δ-5 and Δ-6 desaturase; 각각 Fads1 및 Fads2에 의해 코딩), Gnpat 및 Ppara를 타겟으로 하는 siRNA를 처리하여 진행하였다. Ppar alpha is a gene that regulates gene expression associated with mitochondria and peroxisome FAO. In order to confirm gene expression and influence on cells such as Gnpat , the AML12 hepatocytes prepared in Preparation Example 2 were treated with?-5 and? -6 unsaturation The siRNAs targeted to the enzymes (Δ-5 and Δ-6 desaturase; encoded by Fads1 and Fads2 , respectively), Gnpat and Ppara were processed and processed.

구체적으로, Fads1(#M-064722-00-0005), Fads2(#M-049816-00-0005), Gnpat (#L-040695-01-0005) 및 Pparα(#M-040740-01-0005) siRNAs들은 Dharmacon(Lafayette, CO)에서 구매하고, 각 siRNA를 세포에 처리하고 상기에서 수행한 방법대로 유전자 발현량을 측정하였다.Specifically, Fads1 (#M-064722-00-0005), Fads2 (#M-049816-00-0005), Gnpat (#L- 040695-01-0005), and Pparα (#M-040740-01-0005) siRNAs were purchased from Dharmacon (Lafayette, CO), treated with each siRNA and the amount of gene expression was measured as described above.

또한, 세포들의 죽음을 확인하기 위하여, 세포의 세포질에서 히스톤 관련 DNA 조각들을 측정하는 cell death ELISA kit(Roche, IN)을 이용하여 kit에 쓰인 방법대로 세포 죽음률을 측정하였다.In order to confirm the death of the cells, the cell death rate was measured using a cell death ELISA kit (Roche, IN) measuring the histone-related DNA fragments in the cell cytoplasm according to the method used in the kit.

더불어, 지방산 산화 능력(FAO)은 Kim JY et al.,(2002)에 개재된 방법을 따라 14C에서 14CO2의 발생 비율을 측정하여 결정되었으며, 특히 Peeters A et al.,(2011)에 개재된 바와 같이 미토콘드리아 산화의 억제제, 즉 안티마이신(antimycin) A와 로테논(rotenone)의 존재 하(최종 농도는 각각 100㎛ 및 12.5㎛)에서 결정되었다. In addition, the fatty acid oxidation capacity (FAO) was determined by measuring the 14 generation rate of CO 2 in 14 C according to the methods interposed. Kim JY et al, (2002 ), especially Peeters A et al., (2011 ) In the presence of inhibitors of mitochondrial oxidation, i.e., antimycin A and rotenone (final concentrations of 100 [mu] m and 12.5 [mu] m, respectively), as intervened.

그 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이, Pparα을 처리한 경우 Gnpat 유전자 발현에 아무 변화가 없었으나, Gnpat siRNA(siGnpat)를 처리하자 Pparα의 발현이 현저히 감소했다. 또한, 도 3의 B를 참조하면, Gnpat 및 Pparα siRNA는 cpt1, vlcad, Aoox1 및 dbp1의 발현량 또한 감소시켰으며, 특별히 siGnpat은 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO를 감소시키고 세포죽음을 현저히 증가시켰다.As a result, as shown in Fig. 3A, Treatment with Pparα showed no change in Gnpat gene expression, but treatment with Gnpat siRNA (siGnpat) significantly reduced the expression of Pparα . Also, referring to FIG. 3B, Gnpat And Pparα siRNA also decreased the expression levels of cpt1 , vlcad , Aoox1 and dbp1 , especially siGnpat reduced mitochondria and peroxisome FAO and significantly increased cell death.

<실시예 2> &Lt; Example 2 > GnpatGnpat 넉아웃(knockout) 마우스에서의 간 대사 확인 Identification of liver metabolism in knockout mice

(1) (One) GnpatGnpat 넉아웃(Knockout) Knockout

먼저 Gnpat이 넉아웃된 마우스는 탈렌(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 방법을 사용하여, Sung YH et al.,(Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol 2013;31:23-24)에 개시된 절차대로 제조하였다.First, Gnpat knockout mice were transfected using a transcription activator-like effector nuclease (TALEN) method, Sung YH et al., (Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol 2013; 31: 23-24 ). &Lt; / RTI &gt;

본 실험에서 Gnpat(+/-) 마우스는 2주까지밖에 살지 못했기 때문에, Gnpat(+/-) 마우스는 실험용으로만 사용되었다. 탈렌-유도 잠복 돌연변이인 개시 마우스는 정상 마우스와 교배되었고 한배 새끼를 얻었다. 이중 조절(Gnpat(+/+)) 마우스들과 Gnpat(+/-) 마우스들에 각각 ND, HFD, MCDD 식이요법을 수행하였다. Since Gnpat (+/-) mice in this experiment did not live kkajibake two weeks, Gnpat (+/-) mice were used only for experiments. Thalne-inducible latency mutant initiation mice were crossed with normal mice and gilted. ND, HFD, and MCDD regimens were administered to dual control (Gnpat (+ / +) ) mice and Gnpat (+/-) mice respectively.

(2) 지질 대사량 및 플라스마로겐 레벨 측정(2) Lipid metabolism and plasma level measurement

상기에서 준비한 마우스들에 실시예 1에서 수행한 방법대로 간에서의 플라스마로겐의 양을 측정하였고, 지질 대사량은 다음과 같은 방법으로 측정하였다 : 지방산 메틸 에스터는 Agilent 7890/5975 GCMSD 시스템 및 HP-5 MS 30m x 250 ㎛ x 0.25 ㎛ 컬럼(Agilent 19091S-433)으로 분석되었다. 또한 총 콜레스테롤 및 간 자유 콜레스테롤 레벨을 Total Cholesterol and Cholesteryl Ester Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(#K603-100; Biovision, CA) 및 tissue free cholesterol assay kit(#E1016; Applygen, Beijing, China)를 이용하여 제조자가 제시한 방법에 따라 효소법으로 측정하고 그 결과를 도 3의 D에 나타내었다.The amount of plasma in the liver was measured in the liver according to the method of Example 1 and the lipid metabolism was measured by the following method. Fatty acid methyl ester was measured by the Agilent 7890/5975 GCMSD system and HP- 5 MS 30 m x 250 m x 0.25 m column (Agilent 19091S-433). Using the Total Cholesterol and Cholesteryl Ester Colorimetric / Fluorometric Assay Kit (# K603-100; Biovision, CA) and tissue free cholesterol assay kit (# E1016; Applygen, Beijing, China), the levels of total cholesterol and liver free cholesterol The results are shown in FIG. 3 D by the enzyme method according to the proposed method.

도 3의 D를 참조하면, HFD 식이요법을 수행한 Gnpat(+/-) 마우스는 간에서 정상 마우스보다 높은 지질 축적량을 나타냈으나, MCDD 식이요법을 수행한 Gnpat(+/-) 마우스는 정상 마우스와 별 다른 차이를 나타내지 않았다. 또한, 도 3의 E 및 F를 참조하면, HFD 식이요법을 수행한 Gnpat(+/-) 마우스의 간에서 DHA 함유 플라스마로겐의 레벨은 같은 식이 요법을 수행한 정상 마우스보다 현저히 낮았지만, MCDD 식이요법을 한 Gnpat(+/-) 마우스의 플라스마로겐 레벨은 MCDD 식이요법을 한 정상 마우스와 별다른 차이가 없었다. Referring to FIG. 3 D, Gnpat (+/-) mice carrying HFD diet showed higher lipid accumulation in liver than normal mice, whereas Gnpat (+/-) mice that underwent MCDD Mice did not show any significant difference. Also, referring to FIGS. 3E and F, the level of DHA containing plasma in the liver of Gnpat (+/-) mice that underwent the HFD regimen was significantly lower than that of the normal mice that received the same regimen, but the MCDD diet Plasma levels of the Gnpat (+/-) mice treated were not significantly different from those of MCDD-treated normal mice.

(3) 유전자 발현량 측정(3) Measurement of gene expression level

상기에서 준비한 마우스들에 실시예 1에서 수행한 방법대로 Gnpat과 Pparα의 발현량을 측정하여 그 결과를 도 3의 C에 나타내었다.The expression levels of Gnpat and Ppar [alpha] were measured in the mice prepared above, and the results are shown in Fig. 3C.

도 3의 C를 참조하면, 기본적으로 Gnpat(+/-) 마우스에서 Gnpat의 발현량은 정상 마우스의 대략 50% 정도였다. 또한, 도 3의 E를 참조하면, HFD 식이요법을 수행한 Gnpat(+/-) 마우스에서 Gnpat 및 Pparα 발현은 HFD 식이요법을 수행한 정상 마우스에서보다 낮았다. 반면에, 도 3의 F를 참조하면, Gnpat 및 Pparα의 발현은 MCDD 식이요법을 수행한 정상마우스에서 현저히 감소하였는데, 이는 MCDD 식이요법을 수행한 Gnpat(+/-) 마우스와 유사한 결과였다. Referring to FIG. 3C, basically, the expression level of Gnpat in Gnpat (+/-) mice was about 50% of the normal mice. Also, referring to FIG. 3E, expression of Gnpat and Ppar [ alpha] in Gnpat (+/-) mice that underwent HFD regimens was lower than in HFD- treated normal mice. On the other hand, referring to FIG. 3F , Gnpat and Pparα expression is significantly reduced in the mice were performed MCDD the diet, which was similar to the results Gnpat (+/-) mice perform MCDD diet.

<< 실시예Example 3>  3> 플라스마로겐Plasmacrogen 전구체의 효과 확인 Check the effect of the precursor

플라스마로겐 전구체인 알킬 글리세롤(AG)은 퍼록시좀 대사 중 에테르 지질 합성 대사의 퍼록시좀의 기능에서 독립적으로 플라스마로겐 전구체로서 작용한다(도 4의 A). 알킬 글리세롤 투여 시의 효과를 확인하기 위하여, 상기 준비예 1에서 준비한 마우스에, 1-O-옥타데실-락-글리세롤(1-O-octadecyl-rac-glycerol; 알킬 글리세롤(AG)의 상업 형태로, 또한 바틸 알콜로 불리기도 함; Sigma-Aldrich, MO)를 MCDD의 보충제로 사용하였다. 8주 또는 12주 후에 마우스는 아침마다 5시간 동안 단식한 후 희생되었다. 추후 실험 과정을 위해 간 조직을 추출하여 70℃에서 보관하였다.Alkyl glycerol (AG), a plasma precursor, acts independently as a plasma precursor for the function of the peroxisome of ether lipid synthesis metabolism in peroxisome metabolism (FIG. 4A). In order to confirm the effect upon administration of alkyl glycerol, the mouse prepared in Preparation Example 1 was administered with 1-O-octadecyl-rac-glycerol (alkyl glycerol (AG) Sigma-Aldrich, MO) was also used as a supplement to MCDD. After 8 or 12 weeks, the mice were sacrificed after fasting for 5 hours each morning. Liver tissues were extracted and stored at 70 ° C for further experiments.

(1) 조직학적 분석 및 플라스마로겐 레벨 측정(1) Histological analysis and plasma level measurement

알킬 글리세롤 처리 후의 상태를 확인하기 위해, 마우스 간 조직의 샘플을 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 얻고 처리한 후 조직을 관찰하였다. 또한, 플라스마로겐 레벨은 이중질량분석기(tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)와 1290 HPLC(Agilent, Waldbronm, Germany) 및 QTRAP 5500(AB Sciex, Toronto, Canada)가 구비된 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 상기 준비예에서 준비한 각 식이요법 별 마우스를 대상으로 수행하였다.To confirm the state after treatment with alkyl glycerol, a sample of mouse liver tissue was obtained and treated according to the method performed in Example 1, and the tissue was observed. Plasma levels were also measured using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) and 1290 HPLC (Agilent, Waldbronm, Germany) and QTRAP 5500 (AB Sciex, Toronto, Canada) Respectively. Each dietary preparation prepared in the above Preparation Example was performed on mice.

그 결과, 도 4의 B 내지 D에 나타난 바와 같이, 알킬 글리세롤은 플라스마로겐 결핍 마우스 모델에서 조직 플라스마로겐 레벨을 회복시켰고, 또한, MCDD 식이요법을 한 마우스에서 간 지방증 및 염증을 현저히 억제하였다.As a result, as shown in FIGS. 4B to 4D, the alkylglycerol restored the tissue level plasma level in the plasma-depleted mouse model and also significantly inhibited hepatic steatosis and inflammation in MCDD-treated mice .

(2) 지질 레벨 측정(2) Measurement of lipid level

알킬 글리세롤 처리에 따른 변화를 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 수행한 방법으로 혈장 유리 콜레스테롤 레벨을 측정하였고, 간 조직 내 중성지방(트리글리세라이드) 측정은 Sigma에서 구입한 triglyceride(GPO-Trinder) kit를 이용하여 측정하였다. 즉, 마쇄한 간 조직 및 혈장을 상온에서 추출 버퍼(extraction buffer)와 4시간 반응시킨 다음 1 N의 H2SO4을 첨가하여 1000 rpm에서 10분간 원심분리하였고, 상층액 윗부분은 버리고 남은 용액에 Na2S2O2 100 mg을 첨가하여 1000 rpm에서 5분간 다시 원심분리하였다. 이후, 상층액에 규산(silicic acid) 0.5 g을 넣고 상온에서 5분 반응시킨 다음 1000 rpm에서 10분간 원심 분리한 상층액을 N2 가스로 증발시켜 시료를 얻었고, 이렇게 얻은 시료를 이소프로판올로 녹였다. 이 시료에 트리글리세라이드 시약 A(Triglyceride reagent A)를 넣고 5분간 상온에서 반응시킨 다음 트리글리세라이드 시약 B(Triglyceride reagent B)를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 Emax precision microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 540 nM에서 흡광도를 측정하였다.In order to confirm the change due to alkyl glycerol treatment, plasma free cholesterol level was measured by the method in Example 1, and triglyceride (GPO-Trinder) kit . That is, the crushed liver tissues and plasma were reacted with extraction buffer at room temperature for 4 hours, and then 1 N H 2 SO 4 was added and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The upper part of the supernatant was discarded and the remaining solution Na 2 S 2 O 2 100 mg was added and centrifuged again at 1000 rpm for 5 minutes. Subsequently, 0.5 g of silicic acid was added to the supernatant, and the reaction was carried out at room temperature for 5 minutes. Then, the supernatant was centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was evaporated with N 2 gas to obtain a sample, which was dissolved in isopropanol. Triglyceride reagent A was added to the sample, and the mixture was reacted at room temperature for 5 minutes. Triglyceride reagent B was added thereto, followed by reaction at 37 ° C for 5 minutes. An Emax precision microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale , CA) at 540 nM.

그 결과, 도 4의 C 및 F에 나타난 바와 같이, 트리글리세라이드 레벨은 현저히 감소하였으나, 간의 유리 콜레스테롤 레벨에는 큰 영향을 미치지 않았다. As a result, as shown in Fig. 4C and Fig. 4F, the triglyceride level was remarkably decreased, but the liver free cholesterol level was not significantly affected.

(3) 혈장의 알라닌 트랜스아미네이스(Alanine transaminase, ALT) 레벨 측정(3) Level measurement of alanine transaminase (ALT) in plasma

상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 혈장의 알라닌 트랜스아미네이스(Alanine transaminase) 레벨을 측정하였다. 그 결과, 도 4의 C에 나타난 바와 같이, ALT 레벨이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다.Alanine transaminase levels of plasma were measured according to the method of Example 1 above. As a result, as shown in Fig. 4C, the ALT level was remarkably decreased.

(4) 유전자 발현 측정(4) Measurement of gene expression

MCDD 식이요법을 수행한 마우스들에 알킬 글리세롤을 처리한 후 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 유전자 발현량을 측정하였다. 그 결과, 도 4의 C에 나타난 바와 같이, 염증 및 섬유증을 야기하는 유전자들의 레벨이 현저히 증가하였다. 반면에 Pparα mRNA와 타겟 유전자들의 발현은 회복되었다.Mice that received the MCDD regimen were treated with alkyl glycerol, and the amount of gene expression was measured according to the method of Example 1 above. As a result, as shown in Fig. 4C, levels of genes causing inflammation and fibrosis were significantly increased. On the other hand, expression of Pparα mRNA and target genes was restored.

(5) 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO 측정(5) Mitochondrial and peroxisome FAO measurements

MCDD 식이요법을 수행한 마우스들에 알킬 글리세롤을 처리한 후 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 FAO를 측정하였다. 그 결과, 도 4의 E에 나타난 바와 같이 알킬 글리세롤의 처리가 간의 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO를 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.MCDD-treated mice were treated with alkyl glycerol and then FAO was measured according to the same procedure as described in Example 1 above. As a result, it was confirmed that treatment with alkylglycerol as shown in FIG. 4E restored the mitochondria and peroxisome FAO in the liver.

<< 실시예Example 4>  4> HFHCDHFHCD 식이요법 마우스에서의 효과 Effects on diet mice

상기 실시예 1 내지 3의 결과에서, 플라스마로겐 레벨, Gnpat 발현량이 MCDD 식이요법 마우스에서는 감소했으나 HFD 식이요법 마우스에서는 변화가 없는 것을 확인하였다. 즉, 이러한 결과로부터 단순한 지방간증은 플라스마로겐 레벨 및 Gnpat 발현과 연관이 없음을 알 수 있었다. In the results of Examples 1 to 3, plasma level and Gnpat expression level were decreased in MCDD-treated mice but not in HFD-treated mice. That is, from these results, it was found that simple fatty testis was not associated with plasma levels of Gnatt and Gnpat expression.

이에, 비알콜성 지방간염의 또 다른 대표적 모델인 HFHCD 식이요법을 수행한 마우스를 대상으로 실험을 수행하였다.Therefore, we performed experiments on mice that received HFHCD diet, another representative model of nonalcoholic fatty liver disease.

(1) 지질 및 (1) lipids and 플라스마로겐Plasmacrogen 레벨 측정 Level measurement

도 5의 A 및 B에 나타난 바와 같이 비알콜성 지방간염이 유도된 C57BL/6N 마우스에 HFHCD 식이요법을 12주간 실시하고, 이 마우스를 대상으로 실시예 1 및 2에서 수행한 방법대로 플라스마로겐 레벨 및 지질 대사량을 측정하였다. As shown in Figs. 5A and 5B, non-alcoholic hepatitis C-induced C57BL / 6N mice were subjected to HFHCD regimen for 12 weeks, and the mice were treated with the plasmalogen Level and lipid metabolism were measured.

그 결과, 도 5의 D 및 E에 나타난 바와 같이 혈장에서의 콜레스테롤 레벨은 현저히 증가하지는 않았으나, 반대로 간에서 유리 콜레스테롤의 레벨은 매우 증가했다. 또한, DHA를 포함하는 PC- 및 PE-플라스마로겐과 AA를 포함하는 PC-플라스마로겐의 양이 현저히 감소되었다.As a result, the levels of cholesterol in the plasma did not significantly increase as shown in D and E of Fig. 5, but the level of free cholesterol in the liver was greatly increased. In addition, PC- and PE-plasma containing DHA significantly reduced the amount of PC-plasmaogens including genogens and AA.

(2) (2) 플라스마로겐Plasmacrogen 생합성 효소 유전자 발현, 미토콘드리아 및  Biosynthetic enzyme gene expression, mitochondria and 퍼록시좀Peroxisome FAO 측정 FAO measurement

상기에서 준비한 마우스에 실시예 1에서 수행한 방법대로 플라스마로겐 생합성 효소 유전자 발현, 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO를 측정하였다. The plasmalogen biosynthesis enzyme gene expression, mitochondria, and peroxisome FAO were measured in the mice prepared above in accordance with the method of Example 1.

그 결과, 도 5의 C에 나타난 바와 같이 HFHCD 식이요법을 수행한 마우스에서 Pparα의 발현량이 현저히 감소하였는데, 이는 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO의 감소와 관련이 되어 있다. 또한, 도 5의 E에 나타난 바와 같이, Agps 발현량은 큰 차이가 없었으나 Gnpat 발현량이 현저히 감소하였다.As a result, as shown in Fig. 5C, the expression level of Ppar alpha was significantly decreased in the mice subjected to the HFHCD regimen, which is associated with the decrease of mitochondria and peroxisome FAO. Further, as shown in FIG. 5E , Agps There was no significant difference in the expression level, but the amount of Gnpat expression significantly decreased.

한편, 고지방-콜레스테롤 식이요법이 간의 △-5 불포화효소 및 △-6 불포화효소(각각 Fads1 및 Fads2 에 의해 코딩됨)의 활성을 감소시키고, 이러한 감소는 총량 및 마이크로솜 간 지질의 AA와 DHA의 퍼센테이지가 감소되는 것과 관련이 있음이 알려져 있다. 즉, 플라스마로겐에서 폴리불포화지방산(PUFA) 조성물이 △-5 불포화효소 및 △-6 불포화효소의 활성에 의해 영향을 받으므로, 이 효소들의 발현을 상기 실시예 1에 나타난 방법으로, 하기 표 3의 프라이머를 사용하여 측정하였다.On the other hand, the high fat-cholesterol diet reduces the activity of the liver-5-unsaturated enzyme and the [Delta] -6-unsaturated enzyme (each encoded by Fads1 and Fads2 ) It is known that the percentage is related to the decrease. Namely, since the polyunsaturated fatty acid (PUFA) composition in the plasmalogen is affected by the activity of the? -5 unsaturated enzyme and the? -6 unsaturated enzyme, the expression of these enzymes was measured by the method shown in the above Example 1 3 &lt; / RTI &gt;

유전자gene 종류Kinds 프라이머 서열Primer sequence 서열번호SEQ ID NO: Fads1
(Δ5-불포화효소) Fads1
(? 5-unsaturated enzyme) 정방향Forward 5'-CATCAGCCACTACGCGGGTC-3'5'-CATCAGCCACTACGCGGGTC-3 ' 2727 역방향Reverse 5'-CGGAGCCAGCTCTCCAATCA-3'5'-CGGAGCCAGCTCTCCAATCA-3 ' 2828 Fads2
(Δ6-불포화효소) Fads2
(? 6-unsaturated enzyme) 정방향Forward 5'-CAATGACTGGTTCAGCGGGC-3'5'-CAATGACTGGTTCAGCGGGC-3 ' 2929 역방향Reverse 5'-TCAGCAACGGCTTCTCCTGG-3'5'-TCAGCAACGGCTTCTCCTGG-3 ' 3030

그 결과, 도 5의 F에 나타난 바와 같이, HFHCD 식이요법 마우스에서 Fads1 및 Fads2의 발현이 현저히 감소하였다.As a result, as shown in Fig. 5F, expression of Fads1 and Fads2 was significantly decreased in the HFHCD regimen mice.

상기 결과들을 토대로, △-5 불포화효소, △-6 불포화효소, Gnpar 및 PPARα 사이의 분자적 체계를 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 사용한 AML12 간세포에서 Fads1 및 Fads2 siRNA를 세포에 처리하고 발현량을 분석하였다.On the basis of the above results, in order to confirm the molecular system between? -5 unsaturated enzyme,? -6 unsaturated enzyme, Gnpar and PPAR ?, Fads1 and Fads2 siRNA were treated in the AML12 hepatocytes used in Example 1, Respectively.

그 결과, 도 5의 F에 나타난 바와 같이, Fads2 siRNA 처리 시 Gnpat과 Pparα의 발현 레벨이 현저히 감소하였다.As a result, as shown in Fig. 5F , Fads2 The siRNA treatment significantly reduced the levels of Gnpat and Pparα expression.

즉, 이러한 결과로부터 HFHCD 마우스의 비알콜성 지방간염 모델에서 플라스마로겐의 생합성이 Agps와는 상관없이, Gnpat의 영향으로 현저하게 감소하였음을 알 수 있다.These results indicate that the biosynthesis of plasmalogen in the nonalcoholic steatohepatitis model of HFHCD mice was significantly reduced by Gnpat regardless of Agps .

<< 실시예Example 5> 플루바스타틴의 효과 확인 5> Confirming the effect of fluvastatin

스타틴 중에서 선택된 플루바스타틴의 마우스에 대한 효과를 알아보기 위해, 상기 준비예 1에서 준비된 MCDD 식이요법 마우스에 플루바스타틴(15 mg/kg/day)을 MCDD의 보충제로 사용하였다. 8주 또는 12주 후에 마우스는 아침마다 5시간 동안 단식한 후 희생되었다. 추후 실험 과정을 위해 간 조직을 추출하여 70℃에서 보관하였다. In order to examine the effect of fluvastatin selected from statins on mice, fluvastatin (15 mg / kg / day) was used as a supplement for MCDD in the MCDD diet mice prepared in Preparation Example 1 above. After 8 or 12 weeks, the mice were sacrificed after fasting for 5 hours each morning. Liver tissues were extracted and stored at 70 ° C for further experiments.

(1) 조직학적 관찰, 혈장 ALT 및 (1) histological observation, plasma ALT and 트리글리세라이드Triglyceride 측정 Measure

상기 실시예 1 및 3에서 실시한 바대로 MCDD 식이요법 마우스의 간 조직을 관찰였고, 혈장 ALT 및 트리글리세라이드를 측정하였다.The liver tissues of the MCDD diet mice were observed as described in Examples 1 and 3 above, and plasma ALT and triglyceride were measured.

그 결과, 도 6의 A 및 B에 나타난 바와 같이, 플루바스타틴은 MCDD 식이요법에서 유도된 간 지방증과 NASH를 거의 완전히 억제하였고, 혈장 ATL 및 간에서의 트리글리세라이드의 양이 감소하였다. As a result, as shown in FIGS. 6A and 6B, fluvastatin almost completely inhibited hepatic steatosis and NASH induced by the MCDD regimen, and decreased the amount of triglyceride in plasma ATL and liver.

(2) (2) 플라스마로겐Plasmacrogen 및 콜레스테롤 레벨 측정 And cholesterol level measurement

상기 실시예 1 및 2에서 실시한 바대로 MCDD 식이요법 마우스의 간에서 유리 콜레스테롤 및 플라스마로겐 레벨을 측정한 결과, 도 6의 C 및 E에 나타난 바와 같이, 자유 콜레스테롤 레벨이 현저히 감소한 반면 플라스마로겐은 증가하였다. 특히, AA 및 DHA 함유 플라스마로겐의 양이 증가하였다.As shown in Examples 1 and 2, the levels of free cholesterol and plasma in the liver of the MCDD-treated mice were measured. As shown in C and E of FIG. 6, the free cholesterol level was markedly decreased while the plasma cholesterol . In particular, the amount of hydrogen in the AA and DHA containing plasmas was increased.

(3) 유전자 발현 측정(3) Measurement of gene expression

상기 실시예 1에서 실시한 바대로 MCDD 식이요법 마우스의 간에서 유전자들의 발현을 측정하여 도 6의 C, D 및 E에 나타내었다. 그 결과, 염증 및 섬유증 마커를 코딩하는 유전자의 발현은 약화되었고, Gnpat, Agps , Pparα , Cpt - 1α , Acox1 , Dbp1 등의 유전자 발현은 증가하였다. 특히, Agps에 비해 Gnpat의 유전자 발현 회복량이 현저히 증가한 바, 이는 비알콜성 지방간염의 치료 효과에 Agps보다 Gnpat의 역할이 더 큰 것임을 의미한다.The expression of genes in the liver of the MCDD-treated mouse as measured in Example 1 was measured and shown in C, D and E of FIG. As a result, the expression of genes encoding inflammation and fibrosis markers was weakened, and the expression of genes such as Gnpat, Agps , Pparα , Cpt - 1α , Acox1 and Dbp1 increased. In particular, compared to Agps amount of gene expression significantly increased recovery of Gnpat bar, which means that the role of Gnpat greater than Agps the treatment of non-alcoholic steatohepatitis.

또한, 도 6의 F에 나타난 바와 같이, 정상 식이요법을 한 마우스에서보다 MCDD 식이요법을 한 마우스에서, 지방질 생합성의 억제에 대한 적응 반응으로 △-5 및 △-6 불포화효소의 발현이 증가하였다. 반면에, 간의 폴리불포화지방산 조성물을 가스크로마토그래피/질량분석기(GC/MS)로 측정한 결과, MCDD 식이요법이 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및 DHA의 레벨을 현저히 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. 플루바스타틴을 처리한 MCDD 식이요법 마우스에서는 △-5 및 △-6 불포화효소의 발현이 더 증가하였고, AA, EPA 및 DHA 함량이 현저히 증가하였다. In addition, as shown in Fig. 6F, in the MCDD-treated mice than in the mice subjected to the normal diet, the expression of? -5 and? -6 unsaturated enzymes was increased by an adaptive response to inhibition of lipid biosynthesis . On the other hand, when the liver polyunsaturated fatty acid composition was measured by gas chromatography / mass spectrometry (GC / MS), it was confirmed that the MCDD diet significantly reduced the level of eicosapentaenoic acid (EPA) and DHA I could. In the MCDD diet mice treated with fluvastatin, the expression of Δ5 and Δ6 unsaturated enzymes was further increased, and the contents of AA, EPA and DHA were significantly increased.

이러한 결과를 HFHCD 식이요법 마우스에서 △-5 및 △-6 불포화효소의 발현이 감소된 결과와 함께 고려해보면, 간의 유리 콜레스테롤은 세포의 폴리불포화 지방산 조성물과 관련이 있고, 이것이 변경된 플라스마로젠 대사로 이끈다는 것을 알 수 있다.Considering these results together with the results of reduced expression of? -5 and? -6 unsaturated enzymes in HFHCD diet mice, the liver free cholesterol is associated with the polyunsaturated fatty acid composition of the cells, which leads to altered plasmarogen metabolism .

(4) 미토콘드리아 및 (4) mitochondria and 퍼옥시좀Peroxisome FAO 측정 FAO measurement

상기 실시예 1에서 실시한 바대로 MCDD 식이요법 마우스의 간에서 미토콘드리아 및 퍼록시좀 FAO를 측정한 결과, 도 6의 D에 나타난 바와 같이 현저히 증가되었다.As shown in Example 1, mitochondria and peroxisome FAO in the liver of the MCDD-treated mice were significantly increased as shown in Fig. 6D.

<< 실시예Example 6>  6> 비접힘단백질Unfolded protein 반응에 대한 효과 Effect on response

소포체(ER)에서의 약간의 변화는 항상성을 깨뜨리고 비접힘 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)이라고 불리는 ER 스트레스 상태를 초래하는데, 이 상태는 복합 신호 캐스케이드(cascade)를 활성화하여 비정상적인 단백질 축적을 감지하고 항상성을 회복시키거나, 세포죽음이나 염증을 일으켜 알콜성 또는 비알콜성 간 손상을 야기한다. 특히, 간에서 유리 콜레스테롤의 축적 또는 Pparα 신호과정의 결핍은 미토콘드리아 손상 및 ER 스트레스를 유발한다. 이에, 플루바스타틴 또는 알킬 글리세롤이 UPR을 완화시킬 수 있는지 여부를 확인하였다.A small change in the ER (ER) results in an ER stress state called the unfolded protein response (UPR) that breaks homeostasis and activates the complex signal cascade to detect abnormal protein accumulation Restoring homeostasis, or causing cell death or inflammation, resulting in alcoholic or non-alcoholic liver damage. In particular, the accumulation of free cholesterol in the liver or the deficiency of the Ppar alpha signaling pathway leads to mitochondrial damage and ER stress. Thus, it was confirmed whether fluvastatin or alkyl glycerol could alleviate UPR.

구체적으로 상기 준비예 1에서 MCDD 식이요법을 수행한 마우스에 플루바스타틴 또는 알킬 글리세롤(15 mg/kg/day)을 MCDD의 보충제로 사용하였다. 8주 또는 12주 후에 마우스는 아침마다 5시간 동안 단식한 후 희생되었다. 이후, 단백질의 양 및 단백질의 인산화 정도를 측정하기 위하여, 웨스턴 블롯을 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 용해 버퍼(Lysis buffer; 50 mM Tris-HCL pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% SDS, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 2 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin))를 이용하여 세포 용해액을 만들고, 조직을 넣고 4℃에서 1시간 용해한 다음 4℃, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 Bio-RAD kit(Bio-Rad, Richmond, CA)를 이용한 Bradford 방법으로 정량한 후 SDS와 β-머캅토에탄올이 포함된 샘플 버퍼(sample buffer)와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓였고, 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔(sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 전이시켰다. 각각의 일차 항체로 3시간 동안 실온에서 반응시키고 세척한 후, 이차항체로 1시간 반응시킨 다음 다시 세척하였고, ECL 시약(Amersharm Kife Science, Little Chalfont, UK)으로 반응시킨 후 방사선 자동 사진법(autoradiography)을 시행하였다.Specifically, fluvastatin or alkyl glycerol (15 mg / kg / day) was used as a supplement to MCDD in the mice that had undergone the MCDD regimen in Preparation Example 1 above. After 8 or 12 weeks, the mice were sacrificed after fasting for 5 hours each morning. To determine the amount of protein and the degree of phosphorylation of the protein, Western blots were performed as follows: Lysis buffer (50 mM Tris-HCL pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% SDS, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 μg / ml leupeptin), and the cells were lysed at 4 ° C. for 1 hour at 4 ° C. and 14,000 rpm Proteins were extracted by centrifugation for 30 minutes. The extracted proteins were quantified by the Bradford method using Bio-Rad kit (Bio-Rad, Richmond, Calif.), Mixed with a sample buffer containing SDS and β-mercaptoethanol and boiled at 95 ° C for 5 minutes , Electrophoresed on a 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, and then transferred to a nitrocellulose membrane. After reacting with each primary antibody for 3 hours at room temperature, the cells were reacted with secondary antibody for 1 hour and then washed again. After reaction with ECL reagent (Amersharm Kife Science, Little Chalfont, UK), autoradiography ) Were performed.

그 결과, 도 7의 A(플루바스타틴 처리) 및 B(알킬 글리세롤 처리)에 나타난 바와 같이, 상기 마우스의 간에서 활성화 전사인자 6, CHOP 단백질의 레벨 및 진핵성 번역 개시 인자 2α의 인산화가 감소하였다. 즉, 이러한 결과로부터 알킬 글리세롤 또는 플루바스타틴을 처리할 경우 간의 UPR 및 ER 스트레스를 완화할 수 있다는 것을 의미한다.As a result, the level of activated transcription factor 6, the level of CHOP protein and the phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2 &lt; alpha &gt; decreased in the liver of the mice, as shown in A (fluvastatin treatment) and B (alkyl glycerol treatment) Respectively. That is, from these results, it is understood that treatment of alkylglycerol or fluvastatin can alleviate UPR and ER stress in the liver.

<실시예 7> Gnpat 넉아웃(knockout) 마우스에서의 플루바스타틴의 효과Example 7: Effect of fluvastatin on Gnpat knockout mice

플루바스타틴의 효과를 매개하는 데에 내재 플라스마로겐의 역할을 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 준비된 Gnpat(+/-) 마우스에 플루바스타틴을 실시예 5에서 수행한 것과 같은 방법으로 처리하였다. 이후, 상기 실시예 1에서 수행한 방법대로 유전자 발현량 및 플라스마로겐 레벨을 측정하고 조직학적 관찰을 수행하였다.To confirm the role of the intrinsic plasmaogen in mediating the effect of fluvastatin, fluvastatin was administered to Gnpat (+/-) mice prepared in Example 2 above in the same manner as in Example 5 Respectively. Thereafter, gene expression level and plasma level were measured according to the method of Example 1, and histological observation was performed.

그 결과, 도 8의 A 내지 C에 나타난 바와 같이 비알콜성 지방간염의 발달 억제 효과가 감소되었고, 도 8의 D 내지 E에 나타난 바와 같이, Gnpat , Pparα 유전자 발현 증가 효과 및 플라스마로겐 레벨의 증가 효과도 일부 감소하였다.As a result, as shown in Figs. 8A to 8C, the effect of inhibiting the development of nonalcoholic fatty liver disease was reduced. As shown in D to E of Fig. 8, the effect of increasing Gnpat and Ppar alpha gene expression, The increase effect was also partially reduced.

따라서 상기 실험들의 결과를 종합해보면, 도 8의 F에 나타난 바와 같이, 간의 플라스마로겐은 PPARα에 의존적인 지방산 산화활성 및 소포체 스트레스 완화를 통해 간을 지방간 및 NASH로부터 보호하는 것을 알 수 있다.Therefore, as a result of the above experiments, it can be seen that the plasma plasmogen of the liver protects liver from fatty liver and NASH through PPARα-dependent fatty acid oxidative activity and ER stress relaxation, as shown in FIG.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.Having described specific portions of the invention in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific details are merely exemplary and that the scope of the invention is not limited thereby . The actual scope of the invention is thus defined by the appended claims and their equivalents.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Biomarker Composition for Diagonsing Nonalcoholic Steatohepatitis or Prognosing Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis Comprising Gnpat <130> ADP-2016-0410 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcccccagt ctgtatcctt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctccctttgc agaactcagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcatccacgt gttggctcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggacccatt ccttcttggg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actccagaag accagaggaa at 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccagagatac aaagaaatga tgg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tatagcaaca attcctggcg 20 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<223> primer <400> 26 ctctctagca gctgcctcag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 catcagccac tacgcgggtc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cggagccagc tctccaatca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 caatgactgg ttcagcgggc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcagcaacgg cttctcctgg 20 <110> University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation <120> Biomarker Composition for Diagonsing Nonalcoholic Steatohepatitis          or Prognosing Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis          Comprising Gnpat <130> ADP-2016-0410 <160> 30 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcccccagt ctgtatcctt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctccctttgc agaactcagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims (14)

글리세론 포스페이트 O-아실트랜스퍼라아제(Glyceronephosphate O-acyltransferase; Gnpat) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오마커 조성물.A biomarker composition for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease comprising glycerophosphate O-acyltransferase (Gnpat) or a gene encoding the same as an active ingredient. Gnpat 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물.A biomarker composition for predicting the therapeutic prognosis of nonalcoholic steatohepatitis comprising Gnpat or a gene coding therefor as an active ingredient. Gnpat의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 조성물.A composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease comprising as an active ingredient a preparation capable of measuring the expression level of Gnpat. 제 3 항에 있어서, 상기 Gnpat의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Gnpat 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Gnpat 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 진단용 조성물.[Claim 4] The method according to claim 3, wherein the agent capable of measuring the expression level of Gnpat is a primer or a probe specifically binding to the Gnpat gene, an antibody, a peptide, an aptamer or a compound specifically binding to the Gnpat protein Wherein the composition is for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease. Gnpat의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 조성물.A composition for predicting the therapeutic prognosis of nonalcoholic fatty liver disease comprising as an active ingredient a preparation capable of measuring the expression level of Gnpat. 제 5 항에 있어서, 상기 Gnpat의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Gnpat 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Gnpat 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 조성물.[Claim 6] The method according to claim 5, wherein the agent capable of measuring the expression level of Gnpat is a primer or a probe specifically binding to the Gnpat gene, an antibody, a peptide, an aptamer or a compound specifically binding to the Gnpat protein A composition for predicting the prognosis of nonalcoholic fatty liver disease. 제 3 항 또는 제 4 항의 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트.A kit for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease comprising the composition of claim 3 or 4. 제 5 항 또는 제 6 항의 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측용 키트.A kit for predicting the therapeutic prognosis of nonalcoholic steatohepatitis comprising the composition of claim 5 or 6. (a) 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 비알콜성 지방간염이라고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene from the sample isolated from the patient; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with a normal control sample; And (c) determining that the mRNA expression level of the Gnpat gene or the Gnpat protein expression level is lower than that of the normal control sample, the non-alcoholic fatty liver disease is diagnosed as non-alcoholic fatty liver disease. (a) 치료받기 전의 환자에서 분리된 시료로부터 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 치료를 시행하기 전의 환자에서 분리된 시료의 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준보다 높아졌을 경우 비알콜성 지방간염의 치료 효과가 있다고 판단하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene from a sample isolated from the patient before treatment; (b) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein with the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient after the treatment; And (c) the level of mRNA expression of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein in the sample isolated from the patient after the treatment, wherein the mRNA expression level of the Gnpat gene of the isolated sample in the patient before the treatment is administered or Wherein the method comprises the step of determining the therapeutic effect of non-alcoholic fatty liver disease when the level of expression of the non-alcoholic fatty liver disease is higher than the level of expression. Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease characterized by containing Gnpat protein expression or activity promoter as an active ingredient. Gnpat 단백질 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.A health functional food composition for prevention or improvement of nonalcoholic steatohepatitis characterized by containing Gnpat protein expression or activity promoter as an active ingredient. (a) 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질을 처리한 동물의 간에서 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 단계 (c)에서 측정한 Gnpat 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 Gnpat 단백질의 발현 수준이 증가한 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법.(a) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene in the liver of an animal; (b) treating the animal with the test substance; (c) measuring the mRNA expression level or the Gnpat protein expression level of the Gnpat gene in the liver of the animal treated with the test substance; And (d) comparing the mRNA expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (a) with the expression level of the Gnpat gene or the expression level of the Gnpat protein measured in the step (c) And screening the substance for the non-alcoholic fatty liver disease therapeutic agent. 제 13 항에 있어서, 상기 치료제는 Gnpat의 유전자의 mRNA 또는 Gnpat 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 간에서 플라스마로겐(plasmalogen)의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법.14. The screening method for a non-alcoholic hepatitis hepatitis therapeutic agent according to claim 13, wherein the therapeutic agent increases the amount of plasmalogen in the liver by increasing the expression level of mRNA or Gnpat protein of Gnpat gene.
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