KR20180083868A - 종양 형질도입용 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료제, 특히 세포 치료 표적의 암 세포 내로의 도입에 의해, 암 세포가 이펙터 세포에 더욱 민감하도록 만드는 시스템에 관한 것이다.

Description

종양 형질도입용 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가특허 출원 62/249,183호(2015년 10월 30일)에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
고형 종양에 대한 키메라성 항원 수용체(CAR) T 세포의 최근의 예는 임상적으로(또는 임상 전) 실패하여 왔다. 본 명세서에 기재된 발명은 고형 종양 및 기타 종양학적 징후에 대한 해결책을 제시한다.
암 환자 내로 도입되고 종양 미세환경 내로 수송되는 세포 치료제는 그의 효능을 제한하는 다수의 장벽에 마주친다. 이들 장벽은: 세포성 면역 저하(anergy), 내인성 세포사(cell death), 차선의(suboptimal) 세포 유통, 한정된 증식, 한정된 이펙터 기능, 불량한 "취득(take)"(생존, 지속 및 분화), 종양으로부터의 적극적인 배제, 종양 미세환경에서의 지속적인 면역억제, 및 종양-유도된 세포사를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이들 제한을 극복하고자 하는 오늘날까지의 거의 모든 시도는 시험관 내 및 생체 내 모두에서의 세포 치료제의 비생리학적 조작을 필요로 한다. 세포 치료제의 효능은 따라서 내인성 및 외인성 인자 모두에 의해 광범위하게 방해된다.
고형 종양 표적화는 극복해야 할 일련의 부가적인 도전들, 예를 들어 T 세포 매개된 세포독성에 대한 전체적으로 더욱 적은 민감도, 종양 유형들 간에 상이한 면역억제성 기작을 갖는 미세환경, 및 양호한 발현 프로파일을 갖는 표적 항원의 결여를 제시한다. 부가적으로, 고형 종양은 관통할 수 없는 세포외 기질, 산소 결핍 및 산성 pH를 효율적으로 사용함에 따라 세포 치료제 공격에 대항하여 매우 강화되어 있다. 연구된 방대한 수의 표적에도 불구하고, 단지 소수만이 종양-특이적이며(예를 들어, 발현이 종양 세포에 제한됨), 이러한 발견은, 이와 같이 종양을 제거 또는 감소시키기 위한 효과적인 해결책을 발견하는 것에 대한 어려움 및 필요를 예시한다. 종양을 표적하는 또 다른 문제는, 상이한 항원 및 상이한 수준의 항원을 발현하는 종양 세포의 이질성이다. 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 문제를 다루며, 부가적인 이점 또한 제공한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 암 세포를 제거 및/또는 감소시킬 수 있는 이펙터 세포에 대해 더욱 민감하도록, 세포 치료법 표적의 암 세포(예를 들어, 고형 종양 세포와 같은 종양 세포) 내로의 도입에 기반한다. 본 명세서에서 더욱 상술되는 바와 같이, 암 세포(예를 들어, 종양)는 융합 단백질을 이용하여 형질도입될 수 있다. 그러한 융합 단백질은 표적 성분에 융합된 결합 성분으로 이루어진다. 예를 들어, 융합 단백질은 세포 치료용 표적, 예를 들어 CD19; 시토카인-표적 융합물; 2특이적 T-세포 인게이저(engager)(BiTE)에 융합된, 하나 이상의 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이들은 CD19 변이체(또는 돌연변이체)로 형질도입될 수도 있다. 이들 융합 단백질 또는 변이체(또는 돌연변이체)는 종양 세포에 의해 분비될 수 있고/거나 종양 미세환경을 침투할 수 있다.
이에 따라, 일 양태에서, 본 발명은 융합 단백질로서, 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 암호화하는 재조합 벡터를 제공한다. 다른 구현예에서, 치료제는 시토카인, 펩티드, 단백질, 항체, 항체 단편, T-세포 인게이저 및 NK-세포 인게이저로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 치료제는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 시토카인은 상기 벡터를 포함하는 종양 세포에 의해 분비될 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 다른 구현예에서, 벡터는 암 세포의 유전체 내로 통합된다. 다른 구현예에서, 치료제는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 대한 항원이다. 다른 구현예에서, 치료제는 T 세포 수용체(TCR)에 대한 항원이다. 다른 구현예에서, 치료제는 ADC 항체, ADCC 항체, 및/또는 방사선치료 항체에 대한 항원이다. 다른 구현예에서, 치료제는 면역자극성 시토카인, 또는 TLR 작용제, PAMP, DAMP 및 기타 자극제로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자이다. 다른 구현예에서, 치료제는 면역조절성 또는 항-종양 특성을 갖는 펩티드이다. 다른 구현예에서, TAA 또는 TSA 및 치료제는 융합 단백질로서 발현된다. 다른 구현예에서, TAA 또는 TSA는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질로서, 종양 발현된 시토카인 수용체에 대한 시토카인 및 치료제를 암호화하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 시토카인 수용체는 제I형 수용체 또는 제II형 수용체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서에서 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 재조합 종양 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 하나 이상의 융합 단백질을 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 종양 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 및 본 명세서에서 기재된 바와 같은 벡터를 종양 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 벡터가 종양 세포로 형질도입되도록 종양 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 및/또는 그의 성분은 종양 세포의 유전체 내로 통합된다. 일부 구현예에서, TAA 또는 TSA는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, TAA 또는 TSA는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 대한 항원이다. 일부 구현예에서, TAA 또는 TSA는 T 세포 수용체(TCR)에 대한 항원이다. 일부 구현예에서, 치료제는 ADC 항체, ADCC 항체, 및/또는 방사선치료 항체에 대한 항원이다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역자극성 시토카인, 또는 TLR 작용제, PAMP, DAMP 및 기타 자극제로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자이다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역조절성 또는 항-종양 특성을 갖는 펩티드이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서에서 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 조성물을, 암 치료를 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질이 발현된다. 다른 구현예에서, 암 세포는 암 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 치료제를 발현한다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CAR에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 펩티드 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 암 세포는 TCR에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 펩티드 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 암세포는 개인에서 면역 세포에 의해 인식될 수 있는 치료제를 함유하는 하나 이상의 융합 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 CAR T 세포의 개인에게의 투여를 추가로 포함한다.
도 1은 세포 치료 표적의 고형 종양 세포로의 도입 방법의 비제한적인 예를 보여주는 도식이다. 제1 단계는 형질도입 구축물(예를 들어, 바이러스성 형질도입, RNA 형질도입, 및 유전자 삽입을 통한 예를 들어, 종양-선택적 형질도입), 및/또는 생체 내 형질도입 및 통합에 상응한다. 제2 단계는 융합 단백질(예를 들어, CAR 항원에 융합된 종양 항원에 대한 항체 단편, 예를 들어 CD19에 융합된 scFv 항-종양 연관 항원(TAA) 또는 그의 단편)의 발현에 상응한다. 제3 단계는, 항원, 예를 들어 CD19에 융합된 항체 단편에 상응하며, 이는 종양 세포에 결합하고 항원을 제시하고, 모든 부근의 종양 세포가 단백질, 펩티드, 또는 다른 작용 물질, 예를 들어 CAR T 세포에 의해 인식되는 항원인, CD19에 융합된 항체 단편으로 코팅된다. 제4 단계는 CAR 항원을 인식하는 CAR T 세포(예를 들어, 항-CD19 CAR T 세포)의 생체 내 주입에 상응한다. 반응은 CD19-코팅된 종양 세포에 대해 세포독성이 된다.
도 2a 내지 도 2c는 AAV 형질도입된 세포로부터의 융합 단백질의 발현을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 발현된 융합 단백질에 의한 CAR19 T-세포 내 IFNγ의 유도를 측정하는 IFNγ ELISA의 요약 결과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 CAR19 T 세포를 AAV-1-발현된 상등액 및 BT474 세포와 함께 인큐베이션함에 따른 세포독성의 유도를 보여준다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 세포 치료 표적의 고형 종양 세포 내로의 도입에 기반한다. 종양 세포는, 융합 단백질이 종양 세포에 의해 분비되고 종양과 싸우기 위해 종양 미세환경으로 방출되도록, 융합 단백질로 형질도입될 수 있다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당 기술 분야에 알려진 바와 같이, 자연에서 생산된 바와 같은 온전한 항체는 대략 150 kD 4량체 작용 물질로서, 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 구성되며, 이들은 서로 연결되어 흔히 "Y-형" 구조로 지칭되는 것으로 연결된다. 각각의 중쇄는 적어도 4 개의 도메인(각각 약 110 개 아미노산 길이)- 아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 끝단에 위치)에 이어, 3 개의 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3(Y의 줄기의 기부에 위치)으로 구성된다. "스위치(switch)"로서 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 및 불변 영역을 연결한다. "힌지(hinge)"는 CH2와 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결한다. 이러한 힌지 영역 내의 두 개의 이황화물 결합은 온전한 항체 내에서 두 개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결한다. 각각의 경쇄는 두 개의 도메인 -아미노-말단 가변(VL) 도메인에 이어, 카르복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성되며, 이들은 또 다른 "스위치"에 의해 서로 구분된다. 온전한 항체 4량체는 두 개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되며, 여기서 중쇄 및 경쇄는 하나의 이황화물 결합에 의해 서로 결합되고; 두 개의 다른 이황화물 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여, 이량체가 서로 연결되어 4량체가 형성되도록 한다. 자연에서 생성되는 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 천연 항체에서 각각의 도메인은 압착된 역평행 베타 배럴(beta barrel)에서 서로에 대해 밀집된 두 개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 접힘"에 의해 특징화되는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"으로서 알려진 3 개의 초가변성 루프(hypervariable loop)(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 4 개의 다소 불변성인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 접힌 경우, FR 영역은 도메인에 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 CDR 루프 영역은 3차원 공간으로 함께 모아져서 이들이 Y 구조물의 끝단에 위치된 단일한 초가변성 항원 결합 부위를 창출하도록 한다. 자연발생 항체의 Fc 영역은 보체계의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함하는, 이펙터 세포 상에서 수용체에 결합한다. 당 기술 분야에 알려진 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 기타 결합 특성은 글리코실화 또는 기타 변경을 통하여 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용에 따라 생성되고/거나 사용된 항체는 글리코실화된 Fc 도메인을 포함하며, 변경되거나 엔지니어링된 그러한 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함한다. 본 개시 내용의 목적을 위하여, 특정 구현예에서, 천연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체는, 그러한 폴리펩티드가 자연적으로 생성되거나(예를 들어, 항원에 반응하여 생물에 의해 생성), 또는 재조합 엔지니어링, 화학 합성, 또는 기타 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생성되는지의 여부에 관계 없이, "항체"로서 지칭되고/거나 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성이고; 일부 구현예에서, 항체는 단일클론성이다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 완전히 인간이거나, 당 기술 분야에 알려진 바와 같이, 인간화, 영장류화, 키메라성 등이다. 나아가, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는, 적절한 구현예에서(달리 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한), 항체 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 제시로 이용하기 위한 당 분야에서 알려지거나 개발된 임의의 구축물 또는 포맷을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시 내용에 따라 사용된 항체는 온전한 IgG, IgE 및 IgM, 2-특이적 또는 다중-특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등), 단일 사슬 Fv, 폴리펩티드-Fc 융합물, Fab, 카멜로이드(cameloid) 항체, 마스크된 항체(예를 들어, Probodies®), 소형 모듈 면역제제(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)("SMIPsTM"), 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디(Tandem diabodies)(TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, 미니바디(minibodies), BiTE®, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProteins®, Fynomers®, Centyrins®, 및 KALBITOR®로부터 선택된 포맷이지만, 이로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생성된 경우라면 공유결합 변경(예를 들어, 글리칸의 부착)이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유결합 변경(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드(payload)(예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등), 또는 다른 현수기(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등))을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "항체 단편"은 예를 들어 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 트리아바디; 테트라바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 분리된 단편, (중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진) "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변성 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 많은 구현예에서, 항체 단편은 부모 항체가 결합하는 것과 같이 동일한 항원에 결합하는 부모 항체의 단편의 충분한 서열을 함유한다; 일부 구현예에서, 단편은 부모 항체의 친화성에 필적하는 친화성으로 항원에 결합하고/거나 항원에의 결합에 대하여 부모 항체와 경쟁한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체 단편을 선택적으로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체의 항원 결합 단편은 예를 들어 이황화물 결합에 의해 함께 결합되는 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체의 항원 결합 단편은 다중분자 복합체를 선택적으로 포함할 수 있다. 기능성 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50 개의 아미노산을 포함하고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 200 개의 아미노산을 포함한다.
"항원"이라 함은 면역 반응을 일으키는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역세포(immunologically-competent cell)의 활성화 중 어느 하나, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 당업자는, 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 나아가, 항원은 재조합 또는 유전체성 DNA로부터 유도될 수 있다. 당업자는, 면역 반응을 끌어내는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 이에 따라 본 명세서에서 사용된 용어와 같은 "항원"을 암호화한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해 단독으로 암호화될 필요가 없음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 생성 또는 합성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유도될 수 있다. 그러한 생물학적 샘플은, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "자가"는 이후에 동일한 개인으로 재도입되는 개인으로부터 유도된 임의의 재료를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "세포 치료 항원"은 이펙터 세포에 의해 인식될 수 있는(유전학적으로 엔지니어링되거나 자연발생적인) 하나 이상의 항원(예를 들어, 유전학적으로 엔지니어링된 CAR T 세포 또는 유전학적으로 엔지니어링된 또는 자연발생적인 TCR)을 지칭하는 것을 의미한다. 종양 상에서 발현된 항원(즉, "종양-연관 항원" 또는 TAA)은 세포 치료 항원의 일 유형이다. 종양 상에서 선택적으로 발현된 항원(즉, "종양-선택적 항원" 또는 TSA) 또한 세포 치료 항원의 일 유형이다. 항원은 치료적 개재를 통해, 예를 들어 종양 세포를, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 유전 물질을 생체 내 형질도입함으로써 종양 세포 상에서 발현될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "융합 단백질"은, 둘 이상의 절편을 포함하고, 이들 각각은 (1) 자연에서 발생하는 및/또는 (2) 폴리펩티드의 기능성 도메인을 나타내는 펩티드 모이어티에 대해, 고도의 아미노산 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다. 전형적으로, 둘 이상의 그러한 단편을 함유하는 폴리펩티드는, 그 두 절편이 (1) 자연적으로 동일한 펩티드 내에 포함되지 않고/거나, (2) 단일한 폴리펩티드에서 서로 미리 결합되지 않고/거나, (3) 사람의 수작업을 통해 서로 결합된 모이어티인 경우, 융합 단백질로 여겨진다.
용어 "프로모터"는 유전자의 발현을 유도하는 DNA 서열의 영역을 지칭한다. 프로모터는 전사 시작 위치의 시작부로부터 전형적으로 업스트림(upstream)이며, RNA 중합효소의 인식 및 결합 및 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하는 기타 전사 기구(예를 들어, 기타 단백질)에 연관된다.
용어 "고형 종양"은 낭포 또는 액체 영역을 일반적으로 함유하지 않는 비정상적 덩어리를 의미한다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 그를 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다(예컨대, 육종, 암종, 림프종). 고형 종양, 예컨대 육종 및 암종의 예는, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유윙(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 악성 림프종, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평상피세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종, 갑상선 수질(medullary) 암종, 유두상 갑상선 암종, 갈색세포종 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 수질 암종, 기관지유래 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환암, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양(예컨대, 신경교종(예컨대, 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형 교모세포종으로도 알려져 있음), 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종(Schwannoma) 두개인두종(craniopharyogioma), 뇌실상의종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종, 청신경 종양, 핍지교종(oligodendroglioma), 메난지오마(menangioma), 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이를 포함한다.
"개인" 또는 "피험체"는 척추동물, 포유동물, 또는 인간일 수 있다. 포유동물은 가축, 스포츠용 동물, 반려동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 일 양태에서, 피험체는 인간이다. "개인" 또는 "피험체"는(예를 들어, 의사의 돌봄 하에 있는) "환자"이지만, 일부 경우에는 개인 또는 피험체는 환자가 아니다.
"슈도바이러스" 또는 "유두종 슈도바이러스" 또는 "유두종바이러스 유전자 수송(gene transfer) 벡터"는 바이러스성 핵산(예를 들어, DNA)을 갖거나 갖지 않는 이종성 핵산(예를 들어, DNA)을 감염성 입자로 조립 및 포장하는(package) 하나 이상의 유두종바이러스 캡시드(capsid) 단백질을 지칭한다. 유두종 슈도바이러스를 생산하기 위하여 사용된 방법은 당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 6,599,739호, 7,205,126호, 및 6,416,945호; 및 문헌[Buck and Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, December 2007]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 림프구의 표면 상에서 발견되는 헤테로다이머성 수용체를 지칭한다. TCR은 항원 제시 세포(APC) 또는 임의의 기타 유핵세포의 표면 상에서 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 항원성 펩티드를 인식하는 원인이 되는 항원-특이적 분자이다. 이들은 면역글로불린 상위족(superfamily)의 원이며, 전형적으로 두 개의 사슬: 알파(α) 및 베타(β)로 이루어지는 한편, TCR의 작은 하위 세트는 가변성 감마(γ) 및 델타(δ) 사슬에 의해 형성된다. 사슬은 T 세포에 표면 상에서 쌍을 이루어 헤테로다이머성 수용체를 형성한다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은, 외생의 핵산이 숙주 세포 내로 수송 또는 도입되어지는 과정으로서 정의된다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외생의 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 것이다. 세포는 일차 피험체 세포 및 그의 자손을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 암 세포이며, 예를 들어 고형 종양 세포와 같은 종양 세포이다.
용어 "굴성(tropism)"은 수용체에 대한 바이러스성 벡터의 움직임 또는 표적을 지칭한다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하는 조성물로, 이는 분리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있다. 다양한 벡터가 본 기술 분야에 알려져 있으며, 이는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 이에 따라, 용어 "벡터"는 자율적 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산의 세포 내로의 전달을 촉진하는, 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 아데노바이러스성 벡터, 아데노-연관 바이러스 및 파지 벡터(AAVP), 레트로바이러스성 벡터, 인간 유두종 바이러스(HPV) 슈도바이러스 벡터 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
II. 조성물
본 발명은 융합 단백질을 암 세포(예를 들어, 종양 세포) 내로 도입하는 데 사용될 수 있는 조성물을 제공하며, 이는 그 암 세포를 개인의 면역계 및/또는 추가 치료제 중 어느 하나에 의한 파괴에 더욱 민감하게 할 것이다. 조성물은 본 명세서에 기재된 벡터 및 각종 구축물, 그러한 벡터 및/또는 구축물을 함유하는 숙주 세포(종양 세포 포함), 이들 벡터 및/또는 구축물을 발현하는 또는 발현할 수 있는 숙주 세포, 벡터, 구축물, 지시사항 및/또는 시약을 함유하는 키트 등을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
암 세포(예를 들어, 종양)는 융합 단백질로 형질도입될 수 있다. 융합 단백질이 발현(및/또는 분비)됨에 따라, 단백질은 종양 미세환경도 침투할 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 융합 단백질의 비제한적인 예는: 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 결합하도록 하는 항체 융합물, 시토카인 표적 융합물, 2-특이적 T-세포 인게이저(BITES) 또는 CD19 변이체를 포함한다.
벡터 설계
관심 분야의 바람직한 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드 내로 클로닝될 수 있다. 다른 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터, 및 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 포말(foamy) 바이러스성(FV) 벡터, 스푸마바이러스(spumavirus)로 제조된 일 유형의 레트로바이러스성 벡터일 수 있다. 바이러스성 벡터 설계 및 기술은 당 기술 분야에서 공지이며, 문헌[Sambrook et al,(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001)], 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재된 바와 같다.
형질도입 방법
세포가 관심 분야의 유전자를 발현하도록 하기 위하여, 세포의 유전자-변경을 위한 핵산의 세포로의 수송은 형질 도입(예를 들어, 바이러스성 형질도입)을 통해 광범위하게 수행된다. 관심 대상의 바람직한 유전자 또는 그의 부분(예를 들어, 종양 연관 항원)을 코딩하는 핵산 서열은 당 기술 분야에서 알려진 재조합 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 예시적인 방법은 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 벡터로부터 유전자를 유도하는 단계, 또는 세포 또는 조직으로부터 직접 분리하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 표준 기술을 이용하여 수행된다. 다른 구현예에서, 관심 대상의 유전자는 클로닝되기보다는 합성 생산될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당 기술 분야에서 공지이며, 예를 들어 미국 특허 5,399,346호가 있다.
바이러스 형질도입
바이러스는, 감염된 숙주 면역계에 의한 검출을 종종 피하면서, 특이적 세포 유형으로 핵산을 전달하는 데 매우 효율적이다. 이들 특징으로 특정 바이러스는 세포 치료 표적을 암 세포, 예를 들어 고형 종양 세포 내로 도입하기 위한 비히클(vehicle)로서 매력적인 후보가 된다. 다수의 바이러스 기반 계가 포유동물 세포 내로의 유전자 수송을 위해 개발되어 왔다. 바이러스성 벡터의 예로는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 수두바이러스, 단순 헤르페스 1 바이러스, 헤르페스 바이러스, 종양 바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스) 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 생물, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 자리, 및 하나 이상의 선택가능한 마커에서 작용하는 복제 기원을 함유한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 6,326,193호).
렌티바이러스성 및 레트로바이러스성 형질도입은 레트로바이러스 형질도입의 효율성을 증가시키는 데 사용되는 양이온 중합체(헥사메트린 브로마이드로서도 알려짐)인, 폴리브렌(polybrene)의 첨가에 의해 증진될 수 있다(문헌[SantaCruz sc-134220; Millipore TR-1003-G; Sigma 107689]).
예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달계를 위한 플랫폼을 제공한다. 레트로바이러스는 레트로바이러스 바이러스과에 속하는 외피보유 바이러스이다. 일단 숙주 세포 내에서, 바이러스는 그의 RNA의 DNA로 전사하기 위하여 바이러스 역전사제 효소를 이용하여 복제한다. 레트로바이러스성 DNA는 숙주 유전체의 일부로서 복제하며, 이는 프로바이러스로서 지칭된다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입될 수 있고, 당 분야에 알려진 기술을 이용하여 레트로바이러스성 입자 내에 패키징될 수 있다. 재조합 바이러스는 이후 분리되고 생체 내 또는 생체 외 중 어느 하나로 피험체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스성 계는 당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 5,994,136호, 6,165,782호 및 6,428,953호를 참조한다.
레트로바이러스는 알파레트로바이러스 속(예를 들어, 조류 백혈증 바이러스), 베타레트로바이러스 속;(예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스) 델타레트로바이러스 속(예를 들어, 소 백혈병 바이러스 및 인간 T-림프친화성 바이러스), 엡실론레트로바이러스 속(예를 들어, 각막 피부 육종 바이러스), 및 렌티바이러스 속을 포함한다.
다른 구현예에서, 레트로바이러스는, 긴 인큐베이션 기간을 특징으로 하는, 레트로바이러스과의 바이러스 속인 렌티바이러스이다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하다; 이들은 유의한 양의 유전학적 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어서, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. 렌티바이러스성 벡터는 비-증식 세포를 형질도입하고 낮은 면역원성을 나타낼 수 있다는 점에서 다른 바이러스성 벡터에 대한 장점을 갖는다. 일부 예에서, 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염 빈혈증(EIA), 및 비스나(visna) 바이러스를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 렌티바이러스로부터 유도된 벡터는 상당한 수준의 생체 내 유전자 수송을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 이중가닥 DNA를 함유하는 거대한 바이러스과이다. 이들은 숙주의 세포 기구를 이용하여 바이러스성 RNA DNA 및 단백질을 합성하는 한편, 숙주 세포의 DNA를 복제한다. 아데노바이러스는 복제 및 비-복제 세포 모두에 영향을 미치고, 많은 이식유전자를 수용하고, 숙주 세포 게놈 내로 통합시키지 않으면서 단백질을 코딩하는 것이 당 분야에 알려져 있다.
일부 구현예에서, AAVP 벡터가 사용된다. AAVP 벡터는 원핵성-진핵성 벡터의 하이브리드이며, 재조합 아데노-연관 바이러스 및 파지의 유전학적 시스-요소의 키메라이다. AAVP는 파지 및 AAV 벡터 시스템 모두의 선택된 요소를 조합하여, 숙주 염색체 내로의 통합과 함께 포유동물 세포의 감염을 가능하게 하면서, 패키지 한계 없이 박테리아 내에서 간단하게 생산하는 벡터를 제공한다. 다수의 적절한 요소를 함유하는 벡터는 상업적으로 입수가능하며, 필요한 서열을 포함하도록 표준 방법에 의해 추가로 변경될 수 있다. 특히, AAVP는 헬퍼(helper) 바이러스 또는 트랜스-작용(trans-acting) 인자를 필요로 하지 않는다. 추가적으로, 포유동물 세포의 경우 AAV의 천연 굴성은, AAV 캡시드 형성이 없기 때문에 제거된다. 다른 방법 및 상세한 내용이 미국 특허 8,470,528호 및 문헌[Hajitou A. et al., Cell, 125: 358-398]에 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
다른 양태에서, 인간 유두종(HPV) 슈도바이러스가 사용된다. 최근의 연구는 DNA 플라스미드가 유두종바이러스 L1 및 L2 캡시드 단백질 내로 패키징되어 DNA를 효율적으로 전달할 수 있는 슈도비리온(pseudovirion)을 생성할 수 있음을 보여준다. 캡슐화는 DNA를 뉴클레아제로부터 보호하고, 안정성이 큰 표적화된 전달을 제공한다. 바이러스성 벡터의 이용과 연관된 안전에 대한 많은 염려가 HPV 슈도바이러스로 완화되는데, 이는 그의 구축물이 천연 HPV 바이러스성 유전체와 상이하기 때문이다. 다른 방법 및 예들이 문헌[Hung, C., et al.,Plos One, 7:7(e40983); 2012], 미국 특허 8,394,411호 및 문헌[Kines, R., et al Int J of Cancer, 2015]에 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
일부 양태에서, 종양세포붕괴(oncolytic) 바이러스가 사용된다. 종양세포붕괴 바이러스 치료법은 암 세포에서 바이러스를 선택적으로 복제하고, 이어서 정상 조직에 영향을 미치지 않으면서 종양 내에서 퍼진다. 대안적으로, 종양세포붕괴 바이러스는 정상 조직에 손상을 일으키지 않으면서 세포를 우선적으로 감염 및 사멸시킨다. 종양세포붕괴 바이러스는 또한 면역 반응을 그 자신에게 뿐만 아니라 감염된 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다. 전형적으로, 종양세포붕괴 바이러스는 두 개의 부류에 속한다: (I) 암 세포 내에서 우선적으로 천연적으로 복제되며 인간에서 비병원성인 바이러스. 예시적인 (I) 부류의 종양세포붕괴 바이러스는 자율적 파보바이러스(parvovirus), 점액종 바이러스(수두 바이러스), 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스(NDV; 파라믹소바이러스(paramyxovirus)), 레오바이러스, 및 세네카 밸리(Seneca valley) 바이러스(피코르나바이러스(picornavirus))를 포함한다. 두 번째로 (II) 부류는, 홍역바이러스(파라믹소바이러스), 소아마비바이러스(피코르나바이러스), 및 우두종 바이러스(수두 바이러스)를 포함하는, 백신 벡터로서의 이용을 위해 유전학적으로 조작되는 바이러스를 포함한다. 추가적으로, 종양세포붕괴 바이러스는 정상 세포에서는 복제를 위해 요구되지만 암 세포에서는 그렇지 않은 유전자에서의 돌연변이/결실을 갖는 유전학적으로 엔지니어링된 것들을 포함할 수 있으며, 이는 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스를 포함한다. 종양세포붕괴 바이러스는, 그들은 종양-선택적 방법에서 다중 경로를 표적하고 복제할 수 있기 때문에, 그들의 유전학적 내성 확률이 낮아서, 바이러스성 형질도입 방법으로서 사용될 수 있다. 종양 내 바이러스성 도스는 제자리 바이러스성 확장으로 인하여, (시간에 따라 감소되는 소분자 치료법에 비교 시) 시간에 따라 증가될 수 있으며, 안전성 특징부가 내장될 수 있다(즉, 약물 및 면역 감도).
통합
본 발명의 일부 양태에서, 세포 치료 표적(들) 또는 종양-연관 항원(들)을 암호화하는 핵산은 종양 세포의 유전학적 구조의 일부로서 통합된다. 이론에 구애됨이 없이, 세포 치료 표적(들)을 암호화하는 핵산의 통합은 종양 세포가 복제함에 따라, 자손 종양 세포가 세포 치료 표적(들)을 발현할 수 있을 것이고, 그에 따라 이펙터 세포 및 다른 치료제(병용 요법 작용 물질 포함)에 민감할 수 있을 것이라는 점에서 도움이 될 수 있다. 결과적으로 전이성 질환과 같은 일부 징후에서, 신속한 종양 세포 증식 상태는 본 발명의 치료제를 퍼뜨리는 데 유용하게 된다.
일 구현예에서, 통합은 숙주 세포 내로 자연적으로 통합되는 바이러스를 이용함으로써 달성될 수 이다. 통합은, 숙주 세포의 DNA 내로 통합되는 바이러스 유전체이기 때문에, 레트로바이러스의 복제에서 결정적인 단계이다. 통합은 바이러스 복제 사이클의 일부는 아니지만, 때때로 발생할 수 있다. 바이러스는 숙주 유전체 내로 통합되는 동안 그 자신의 신규 DNA 복제물을 직접 만들지 않는다; 대안적으로, 이는 숙주 유전체와 함께 수동적으로 복제되며, 원래의 세포 자손으로 전해진다. 바이러스성 DNA의 통합은 바이러스성 유전체의 숙주 염색체 DNA 내로의 영구적인 삽입을 초래하며, 이는 레트로바이러스의 경우 프로바이러스로서 지칭된다.
다른 구현예에서, 통합은 인간 염색체 19번 상에서 아데노-연관 바이러스 통합 자리 1(AAVS1) 내로 관심 대상의 유전자를 통합하도록 설계된, CompoZr® 표적화 통합 키트를 포함하는 상업적으로 입수가능한 키트에 의해 통합이 달성될 수 있다.
TAA의 발현에 추가하여, 암 세포(예를 들어, 고형 종양 세포)는, 이펙터 세포가 인식할 항원에 커플링된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)의 하나 이상의 융합 단백질을 또한 발현하도록 엔지니어링될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 종양 세포를 인식하며, 이펙터 세포가 인식하는 항원에 결합하고 그를 제시한다. 비제한적인 일 예에서, 고형 종양 세포는 종양 세포에 결합하는 항-종양 TAA scFv 및 또한 인간 CD19 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질로 형질도입될 수 있다. scFv 부분은 종양 세포에 결합되고, CD19는 이펙터 세포가 종양 세포를 표적하고 종양 세포를 파괴하도록 이펙터 세포에 제공된다. 이펙터 세포는 자연발생적이거나 유전학적으로 엔지니어링될 수 있다.
고형 종양 표적화를 위한, 발현된 유전자 접근
종양 세포 내에 생산적으로 도입된 유전자는, 효능에 대한 치명적 장벽을 다루거나 회피함으로써 개선된 세포 치료 활성을 제공할 것이다. 이들 유전자는 항-종양 반응을 "번식"함에 의해 치료 효능을 개선하고, 국소 환경에서 시토카인 지지를 최적화하고, 국소 면역억제를 역전시키고, 세포 이펙터 기능을 개선하고, 종양에 대한 세포 접근을 촉진시킬 것이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 발현된 구축물 내에 임의의 유전자가 포함될 수 있으며, 본 개시 내용은 임의의 특정 유전자로 한정되지 않는다. 세포 치료 표적으로서 포함될 수 있는 예시적인 비제한적인 유전자의 유형은 예를 들어, 추가적인 세포 치료제, 폴리펩티드 항원, 항체, 시토카인, 종양 미세환경 표적제, 및 면역 세포 성장/증식을 지원하는 작용 물질에 대한 표적을 포함한다.
발현된 유전자는 그의 관련 요소를 갖는 프로모터, 및 유전자 서열을 함유한다. 발현된 유전자는 3 개의 필수적인 특징: 1) 종양 세포 내 발현을 위한 최적 프로모터, 2) 최적 발현된 유전자 서열, 및 3) 규정된 동력학으로 최적화된 발현 패턴을 함유한다.
일련의 프로모터가 다양한 발현 패턴을 유도하기 위해 개발된다. 예로는, 주간에 측정된 신속하고 지속된 발현, 또는 신속하지만 가역적인 발현, 또는 지연된 발현이 포함된다. 또한, 발현의 수준은 조절 및 프로모터 요소의 선택적인 이용에 의해 변경될 수 있다. 그러한 방법은 잘 이해되며, 예를 들어 문헌[E.D. Papadakis, et al., Current Gene Therapy, 4: 89-113(본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)]이 있다.
III. 암 치료를 위한 방법
본 발명은, 암 세포(예를 들어, 종양 세포 또는 고형 종양 세포)가 TAA 또는 TSA 및 치료제를 포함하는 융합 단백질을 분비하도록 하는 시스템을 엔지니어링함으로써 암 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 암을 갖는 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 개인은 그의 암 세포의 생체 내 형질도입을 허용하는 조성물을 투여받을 수 있다. 투여는 정맥내, 전신, 근육내, 복강내, 또는 종양내 주사를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 임의의 수단에 의할 수 있다.
추가적인 세포 치료제에 대한 표적
일부 구현예에서, 형질도입 및 융합 단백질의 분비에 이어 국소 종양 세포 위에서 발현된 세포 치료 항원은 이펙터 세포에 의해 인식되며, 종양 연관 항원(TAA)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TAA 발현은, 모든 종양 세포에 의해 발현되고, 종양 세포 표면 상에서 발현된, 종양 세포 개체군으로만 제한될 수 있다. 다른 항원은 종양 세포 상에서 과발현되지만, 정상 세포에서 보다 낮은 발현 수준으로 발견될 수 있으며, 따라서 종양-선택적 항원(TSA)이다. 추가적으로, 일부 종양 항원은 "패신저(passenger) 돌연변이"로서 발달하는데, 즉 DNA 복구에 대한 제어에 결함이 있는 종양 세포에 의해 발현된 비-필수 항원으로, 이에 따라 다양한 단백질에서의 돌연변이를 축적한다. 일부 종양 항원은 면역 반응; 특히 T-세포 매개 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 세포 치료 표적에 의해 표적될 수 있는 종양-특이적 분자는 당 분야에 공지된 종양 연관 항원을 포함할 수 있으며, 예를 들어 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함할 수 있다. 종양 유전체 및 진유전체의 다음 세대 서열분석(NGS), 및 종양 프로테옴의 고감도 질량 분광(단백질 서열분석) 분석을 포함하는 기술들을 적용하여 본 발명의 신규 TAA 및 TSA 항원의 이용을 동정하는 것을 지속하고 있다.
NGS는 평행 서열분석을 대량으로 수행하는 고-산출량 서열분석 방법으로, 이 동안 단일 샘플로부터 수백만의 DNA 단편이 일제히 서열분석된다. NGS는 고-산출량 서열분석을 촉진하며, 전체 유전체를 하루 미만 내로 서열분석할 수 있게 한다. NGS 플랫폼의 창출은 더욱 많은 랩에서 서열분석을 이용할 수 있게 만들어서, 핵산 서열분석을 이용하여 수행되는 연구 및 이상 진단의 양을 신속하게 증가시키고, 이에 따라 유전체학 및 분자 생물학을 변혁시켜 왔다. 일부 NGS 기술은 Illumina(Solexa) 서열분석, Roche 454 서열분석, 이온 토렌트(Ion torrent): 양자/PGM 서열분석, 및 SOLiD 서열분석을 포함한다.
종양 특이적 항원을 동정하는 것에 대한 대안적인 방법은 직접 단백질 서열분석이다. 탠덤(tandem) 질량 분광분석(MS/MS)을 포함하는 다차원 MS 기술(MSn)을 이용하는 효소 분해물의 단백질 서열분석은 항원을 동정하는 데 사용될 수도 있다. 그러한 프로테오믹(proteomic) 시도는 신속하고 고도로 자동화된 분석을 허용한다(예를 들어, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 문헌[K. Gevaert and J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21: 1145-1154 (2000) 참조]). 나아가, 미지의 단백질의 새로운(de novo) 서열분석을 위한 고-산출량 방법은 발현된 항원을 동정하기 위하여 환자의 종양의 프로테옴을 분석하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 메타 산탄총 단백질 서열분석은 발현된 항원을 동정하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, 문헌[Guthals et al. (2012), Molecular and Cellular Proteomics 11(10): 1084-96] 참조).
사용될 수 있는 종양 항원의 비제한적인 예는 EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 예시적인 항원은, 피브로넥틴의 종양태아성(oncofetal) 변이체, 테나신, 또는 종양의 괴사성 영역과 같은 종양의 세포외 기질 내 존재하는 항원이다.
추가로 사용될 수 있는 종양-선택적 분자는 종양 세포 내에서 발현된 또는 과발현된 임의의 막 단백질 또는 바이오마커를 포함하며, 인테그린(예를 들어, 인테그린 ανβ3, α5qβ1), EGF 수용체 족(예를 들어, EGFR2, Erbb2/HER2/neu, Erbb3, Erbb4), 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸), 디시알로강글리오시드(disialoganglioside)(예를 들어, GD2, GD3), B7-H3(CD276으로도 알려짐), 암 항원 125(CA- 125), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 혈관 표피 성장 인자 수용체 1 및 2(VEGFR-1, VEGFR-2), CD52, 암배아 항원(CEA), 종양 연관 당단백질(예를 들어, TAG-72), 분화 클러스터 19(CD19), CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD74, CD152, 뮤신 1(MUC1), 종양 괴사 인자 수용체(예를 들어, TRAIL-R2), 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 엽산 수용체 a, 막관통 당단백질 NMB(GPNMB), C-C 케모카인 수용체(예를 들어, CCR4), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 낭트 기원 수용체(recepteur d'origine nantais: RON) 수용체, 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA4), 및 기타 종양 특이적 수용체 또는 항원을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 언급된 TAA 및 TSA 표적의 비제한적인 예에 의해 예시되는 바와 같이, 당업자가 본 명세서에 기재된 형질도입 및 발현된 치료제를 그로 유도할 수 있는 많은 다양한 선택목록의 항원이 존재한다. 예를 들어, 치료제는 CAR T 세포에 의해 인식될 수 있는 표적 항원(예를 들어, CD19)에 융합된 scFv 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-MUC16, 항-CEA, 항-PSMA)을 함유하는 분비된 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 분비된 융합 단백질은 두 개의 작용 도메인인, 표적 종양 세포 표면에 결합하는 scFv, 및 CAR T 세포에 대한 표적으로서 제시되는 CD19 단백질 도메인을 갖는다(도 1). scFv가 많은 다양한 항원들 중 하나를 표적하도록 선택될 수 있고, 세포 치료제(또한, 본 발명의 "이펙터 세포")에 의해 인식되는 단백질 도메인 또한 다양할 수 있고, 예를 들어 특정 CAR T 세포 또는 TCR T 세포, 또는 특징지어진 TIL 또는 NK 세포에 의해 인식된다는 것은 즉각적으로 명백할 것이다. 현대의 항체 엔지니어링은, 종양 세포로의 효과적인 결합이 2특이적 scFV의 두 아암이 결합할 수 있는 경우에만 달성되도록, 2특이적 인식의 이용이 치료제의 scFv 부분 내로 구축되는 것을 가능하게 한다는 것이 추가로 인지될 것이다. 이용가능한 2특이적 기술의 범위는 광범위하며, 효과적인 2특이적 항체 엔지니어링에 요구되는 분자 생물학 및 단백질 화학 도구 및 원리는 잘 이해되어 있으며, 예를 들어 문헌[Kontermann, R. MAbs 2012; 4(2) 182-97(본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)]을 참조한다.
나아가, 다수의 유전자는 예를 들어 개별 요소에 대해 인프레임 또는 독립적인 IRES 개시 위치를 이용함으로써 단일 CAR 발현 구축물에서 암호화될 수 있다. 대안적으로, 유도가능한 방법이 설명되어 왔으며, 이에 의해 소분자의 적용이 하나 이상의 CAR 요소의 발현을 유도 또는 차단할 수 있다. 그러한 광범위한 각종 방법이 개시되어 있으며, 예컨대 스위치(switch) 상에서, 저해성 CAR, 공동자극성 CAR, "cideCAR", 및 그의 사용이 CAR T 세포의 활성을 추가로 변경 또는 변형할 수 있는 것들이 있다(문헌[Baas, T. SciBX 7(25); doi:10.1038/scibx.2014.725] 참조).
항체-약물 컨쥬게이트 표적
다 른 구현예에서, 형질도입된 종양 세포는 알려진 항체-약물 컨쥬게이트에 의해 표적된 융합 단백질을 분비하며, 이는 예를 들어 브렌툭시맙 베도틴(ADCETRIS, Seattle Genetics); 트라스투주맙 엠탄신(Roche); 젬투주맙 오조가마이신(Pfizer); CMC-544; SAR3419; CDX-011; PSMA-ADC; BT-062; CD30, HER2, 및 IMGN901을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sassoon et al., Methods Mol. Biol. 1045:1-27 (2013); Bouchard et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 24: 5357-5363 (2014)] 참조). 다른 구현예에서, 형질도입된 종양 세포는 항체 의존성 세포성 세포독성 기능을 갖는 항체, 예컨대 리툭시맙, 오크렐리주맙, 이필리무맙, 시툭시맙, 에르비툭스 및 많은 다른 것들에 의해 인식되는 것들에 의해 표적될 수 있는 융합 단백질을 분비한다. 따라서, 일부 구현예에서, 그러한 알려진 하나 이상의 항체-약물 컨쥬게이트에 결합하는 융합 단백질의 일부로서 폴리펩티드 항원을 암호화하는 핵산은 본 명세서에 기재된 세포성 치료 표적에서와 같이 포함될 수 있다.
시토카인 융합 단백질
일부 구현예에서, 종양 및 종양 미세환경은 시토카인 융합 단백질, 예를 들어, 시토카인(예를 들어, 항-종양 시토카인) 및 본 명세서에 기재된 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적(예를 들어, CAR-T 표적)의 융합 단백질로 형질도입된다. 예시적인 시토카인은 종양에 결합할 수 있어서, 시토카인을 갖는 종양을 제시한다. 예를 들어, 일부 고려되는 표적은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, 및 BCMA를 포함한다. 그러한 세포 치료는 하나 이상의 추가적인 세포 치료제를 위한 표적(예를 들어, CAR-T 표적) 및 종양 표면에서 자극성 시토카인을 모두 제공할 수 있다. 예를 들어, 발현된 및/또는 분비된 구축물은 시토카인-CD19 융합 단백질, 또는 시토카인과 CD19 단편, 예를 들어 CD19- CAR-T 세포가 결합되는 CD19 단편의 융합물을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, CD19 단편은 CD19 IgC 도메인이다. 이론에 구애되고자 하지는 않지만, 그러한 융합 단백질을 암호화하는 하나의 발현된 구축물은 유리하게는 최소의(예를 들어 단일의) 이식유전자를 이용하여 세포성 치료제가 유전학적으로 엔지니어링되는 것을 가능하게 한다. 시토카인 융합 단백질을 이용하는 추가의 이익은, 시토카인 작용 효과에 추가하여, 그들의 그의 수용체에 대한 단단한 결합을 이용하는 것이다.
일부 구현예에서, 시토카인 융합 단백질의 일부로서 분비된 하나 이상의 시토카인은 높은 친화성(예를 들어, 약 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 이하의 KD)으로 세포에 결합하고/거나, 낮은 내재화 속도(예를 들어, 하루 및 세포 당 약 10, 102, 103, 104 또는 105 미만의 시토카인 분자)를 갖는다. 각종 시토카인의 결합 친화도 및 내재화 속도는 당 기술 분야에 알려져 있고/거나 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
프로-면역(Pro-immune) 반응제
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양은, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 융합 단백질로서, 하나 이상의 프로-면역 반응제, 예를 들어 암 치료에서 사용되는 하나 이상의 시토카인을 암호화한다. 포함될 수 있는 비제한적이며 예시적인 시토카인은 예를 들어, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-1, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-36, TNF, LTα, GM-CSF, G-CSF, TLR 작용제, 및 면역 체크포인트(checkpoint) 항체 단편을 포함한다.
시토카인 치료와 관련된 알려진 문제로는, 예를 들어 높은 도스 요구, 독성, 및 제한된 효능이 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 발현된 구축물은 하나 이상의 시토카인을 특이적 위치에서 및/또는 특이적 도스로(예를 들어, 시토카인 치료와 연관된 하나 이상의 위험을 감소시키거나 제거하기 위하여) 전달하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 종양의 표면에서 또는 가까이에서 시토카인(예를 들어, 면역자극성 시토카인)의 발현은 종양에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 발현된 시토카인 융합 단백질은 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 부가적인 CAR-T 세포). 일부 구현예에서, 종양 표면 가까이에서의 시토카인 융합 단백질의 분비는 종양에 대한 면역 반응을 유도하며, 또한 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적으로서 사용된다(예를 들어, 하나 이상의 부가적인 CAR-T 세포). 예로는 CD19 반응성을 갖는 CAR T 세포에 의해 인식된 CD19 단백질 도메인에 융합된 인터페론 알파 시토카인이 있다. IFN알파 분자는 종양 세포 상 또는 그 가까이에서 인터페론 수용체에 대한 높은 친화도로 결합하여, 이에 따라 CD19로 유도된 세포 치료적 활성을 지지한다. 또 다른 예에서, 인터페론 알파 시토카인은 동일한 종양 세포 유형 상에서 TAA 또는 TSA를 인식하는 scFV에 융합되어, 이에 따라 세포 상에 또는 세포 주위에 다시 결합하고, IFN알파-유도된 면역 반응을 유도 또는 지지한다.
예를 들어, IL-21의 방출은 CD8+ T 세포의 확장 및/또는 이펙터 분화를 유도하고/거나 NK 세포 활성화 및 세포용해 활성을 지지하는 데 사용될 수 있다. 일 예시적인 방법에서, 발현된 구축물은 IL-21을 암호화한다. 종양 세포 상에서 scFv 유도된 항원의 결합 시, 본 명세서에 기재된 세포 치료제는 IL-21의 연장된 방출을 나타낸다. 예시적인 세포 치료제는 예를 들어, CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 및 자가유래 NK 세포를 포함한다.
또 다른 예시적인 방법에서, IL-15 융합 단백질의 유도된 방출은 NK 세포 확장을 지지하고/거나 NK 세포를 리크루트하는 데 사용되어 항-종양 반응을 공포하고 세포 치료제의 생존 및 확장을 지지할 수 있다. 예시적인 세포 치료제는 예를 들어, CAR-T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포, 및 자가유래 NK 세포를 포함한다. 이 예에서, 표적 종양 세포 유형 상에서 TAA 또는 TSA를 인식하는 scFv는 국소 환경에서 IL-15를 결합하고 그를 제시한다. 추가의 예시에서, 제안된 모든 시토카인 예와 관련하여, 분비된 융합 단백질은 3작용성으로, 표적 종양 세포 유형 상에서 TAA 또는 TSA를 인식하는 scFV, 항원 결합에 연루되지 않는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 내에서 베타 루프 또는 베타 가닥으로 암호화된 시토카인을 갖고, 세포 치료제의 결합에 대한 표적 항원을 발현한다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 내에서 CDR의 이용은 CDR의 서열로부터, 또한 어떤 잔기가 항원 결합에 관련되는지 및 어떤 것이 관련되지 않지만 다른 용매에 노출되는지, 즉 시토카인과 같이 암호화된 서열의 발현에 유용한지를 나타내는 데이터베이스의 이용을 통하여 쉽게 결정된다.
세포 리크루팅 모이어티(moiety)
일부 예에서, 재조합 종양 세포는, 융합 단백질의 일부로서, 세포 리크루팅(recruiting) 모이어티(예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD16)에 융합할 수 있는 scFv 또는 TCR을 발현할 수 있다. 다른 구현예에서, 2특이적 T 세포 인게이저(BiTE®) 기술은 신체의 내생의 T 세포와 맞물리는 것을 돕고 하나 이상의 TAA를 발현하도록 엔지니어링된 암 세포를 표적하는 데 사용된다. BiTE® 기술의 항체 구축물은 TAA 또는 종양-연관된 표면 항원 및 T 세포 수용체-연관된 분자에 대한 단일클론성 항체의 최소 결합 도메인을 유전학적으로 결합함으로써, 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 구축된다. 하나의 항체는 표적된 종양 세포 상에서 선택된 표면 항원에 특이적이며, 다른 항체는 T 세포의 표면 상에서 T-세포 수용체 복합체에 연결된, 모이어티(예를 들어, CD3)에 대해 특이적이다. BiTE® 기술은 다클론성 세포독성 T 세포 및 표적된 악성 세포에 결합한다.
폴리펩티드 항원
일부 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적은 폴리펩티드 항원이거나 또는 그를 포함한다. 발현된 구축물에 의해 발현되는 폴리펩티드 항원은, 부가적인 세포 치료제(예를 들어, CAR-T 세포)가 그러한 폴리펩티드 표적을 인식하고 그에 결합되도록 엔지니어링될 수 있는 한, 임의의 특정 폴리펩티드 또는 그의 일부로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 표적은 종양-연관 항원이 아닌 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표적은 종양 항원, 예를 들어 BCMA, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 글리코리피드 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, 또는 MAGE A3 TCR이다.
항체 융합 단백질
일부 구현예에서, 종양 및 종양 미세환경은 항체(또는 그의 항체-결합 단편, 예를 들어 분비된 scFv 또는 기타 항체 포맷) 및 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적(예를 들어, CAR-T 표적)을 포함하는 융합 단백질로 형질도입된다. 항체(또는 단편)는, 예를 들어 종양 항원(예를 들어, 본 명세서에 기재된 종양 항원)에 결합하도록 선택될 수 있고, 그의 융합 파트너는 하나 이상의 부가적인 세포 치료제에 대한 표적을 포함할 수 있다. 그러한 항체(또는 항원-결합 단편)는, 예를 들어 scFv 및 전장 mAb, VHH 도메인, 디아바디, 나노바디 등을 포함하는, 예를 들어 단일클론성 항체(mAb)를 포함한다. 일 예에서, 구축물은 mAb(예를 들어, 항-종양 연관 항원 mAb 또는 항원-결합 단편) 및 CD19 또는 그의 단편(예를 들어, CD19 Ig 도메인)으로 이루어지는 분비된 융합 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 세포의 몇몇 유형 상에서 발현된 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 종양-선택적인 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 종양-선택적이지만, 특이적이지 않은 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 혈액학적 악성 종양과 관련된 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 고형 종양과 관련된 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 단편)는 BCMA, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 글리코리피드 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, 및 MAGE A3 TCR 중 하나 이상에 결합한다.
종양 세포 상에 위치된, 표적은 CD19일 수 있다. 기타 B 세포 표적이 사용될 수 있으며, 이는 CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD72, CD79a, CD79b, 및 BCMA를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이들 B 세포 표적은, 다른 표적의 목록과 함께, CAR T 세포 표적으로서 특정 장점을 갖는다. 추가적으로, 표적은 CD30, Her 2, ADC에 대한 표적 또는 방사선면역치료법(예를 들어, 방사성 동위 원소를 운반하는 단일클론성 항체)을 포함할 수 있다.
국소(예를 들어, 종양 미세환경) 인자를 억제하는 펩티드
일부 구현예에서, 국소 인자를 억제하는 펩티드(예를 들어, 폴리펩티드 및 그의 단편)는 종양 세포에 의해 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이들 펩티드를 코딩하는 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 펩티드(들)이 발현되도록 엔지니어링될 수 있다. 비제한적인 예는 TGF베타, 아데노신 수용체 2, 혈관 표피 성장 인자(VEGF), 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF), 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 1(IDO1), 및 기질금속단백질분해효소(MMP)를 포함한다.
유도성 CD19 변이체 단백질 및 CD19 변이체 융합 단백질에 대한 스캐폴드로서의 CD19
CD19는 Ig 상위족(superfamily)에 속하는 95 kd 막관통 당단백질이고, 두 개의 세포외 C2-형 Ig 도메인(예를 들어, 문헌[Tedder Nature Rev. Rheum. 5:572-577 (2009); Wang et al., Exp. Hematol. Oncol. 2012 Nov 29;1(1):36. doi: 10.1186/2162-3619-1-36.)] 참조)를 포함한다. 일부 구현예에서, C2-형 Ig 도메인의 하나 또는 둘 모두는 돌연변이 유발에 대한 스캐폴드로서 사용되고, CD19 변이체(예를 들어, C2-형 Ig 도메인의 하나 또는 둘 모두 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CD19 또는 그의 일부)는 본 명세서에 기재된 표적 항원에 대한 결합을 위해 스크리닝되고 선택될 수 있다.
인간 CD19의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다(Genbank 등록 번호 M84371.1 참조). 특정 항원에 결합하는 CD19 변이체를 암호화하는 변이체 핵산 서열을 제공하기 위하여 당 기술 분야에 알려진 많은 방법들이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 항원에 결합하는 CD19 변이체를 암호화하는 핵산을 확인하고/거나 분리할 수 있게 하는 스크리닝 절차가 사용된다. 예시적인 방법은 파지 디스플레이와 같은 기술로부터 알려진, 소위 바이오패닝(biopanning) 단계(문헌[Kang, A. S. et al. 1991. Proc Natl Acad Sci USA 88, 4363-4366]), 리보솜 디스플레이(문헌[Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119-135]), DNA 디스플레이(문헌[Cull, M. G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1865-1869]), RNA-펩티드 디스플레이(문헌[Roberts, R. W., Szostak, J. W., 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-12302]), 공유결합 디스플레이(WO 98/37186), 세균 표면 디스플레이(문헌[Fuchs, P. et al. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372]), 효모 표면 디스플레이(문헌[Boder, E. T., Wittrup, K. D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557]) 및 진핵성 바이러스 디스플레이(문헌[ Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192])를 포함한다. FACS 및 자석 비드 분급(magnetic bead sorting)은 라벨링된 항원을 이용하여 풍부화(패닝) 목적을 위해 또한 적용가능하다. 면역검출 분석 예컨대 ELISA(문헌[Dreher, M. L. et al. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205]) 및 ELISPOT(문헌[Czerkinsky, C. C. et. al. 1983. J Immunol Methods. 65, 109-21])은 바이오패닝 단계 이후 또는 단독으로 사용될 수도 있다.
이에 따라, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유도성 구축물은, 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 일부로서 또는 단독으로, CD19 변이체(또는 단편)를 암호화한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유도성 구축물은, 종양 작용 물질에 결합하도록 선택된 CD19 변이체(또는 단편)를 암호화할 수 있고, 이는 발현 시, 종양 항원에 결합할 수 있고, 그 자체는 추가의 세포 치료제(예를 들어, CD19에 결합하는 CAR-T 세포)에 대한 표적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유도성 구축물은, 종양 항원에 결합하도록 선택된 C2-형 Ig 도메인 변이체를 포함하는 CD19 변이체를 암호화한다. CD19 변이체의 발현 시, C2-형 Ig 도메인은 종양 세포 상에서 종양 항원에 결합한다. 이어서, CD19를 인식하는 CAR-T 세포를 이용한 처리(예를 들어, 피험체에 대한 그의 투여)는 CD19 변이체가 결합되는 종양 세포를 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 유도성 구축물은, 각각이 종양 항원(예를 들어, 종양 항원의 상이한 에피토프)에 결합하도록 선택되는, C2-형 Ig 도메인 둘 모두의 변이체를 포함하는 CD19 변이체를 암호화한다. CD19 변이체의 발현 시, C2-형 Ig 도메인은 종양 세포 상에서 종양 항원에 결합한다. 이후, CD19를 인식하는 CAR-T 세포를 이용한 치료(예를 들어, 피험체에 대한 그의 투여)는 CD19 변이체가 결합되는 종양 세포를 사멸시킨다.
일부 구현예에서, 종양 항원에 대한 결합을 위하여 선택된 CD19 변이체는 융합 단백질 내에 포함된다. 예를 들어, 종양 항원에 결합하도록 선택된 C2-형 Ig 도메인 변이체를 포함하는 CD19 변이체는 종양 항원(예를 들어, 종양 항원 상의 상이한 에피토프에)에도 결합하는 항체 또는 그의 단편에 융합될 수 있다. 예시적인 융합 단백질은 예를 들어, CD19 변이체/scFv 융합 단백질 및 CD19 변이체/VHH 융합 단백질을 포함한다. 본 명세서에 기재된 유도성 구축물은 그러한 CD19 변이체/항체 융합 단백질을 암호화할 수 있고, 발현 시에 융합 단백질의 CD19 변이체 및 항체는 종양 세포 상에서 종양 항원에 결합한다. 이후, CD19를 인식하는 CAR-T 세포를 이용한 처리(예를 들어, 피험체로의 그의 투여)는 CD19 변이체/항체 융합 단백질이 결합된 종양 세포를 사멸시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 유도성 발현의 맥락에서 유용한 CD19 스캐폴드 유전자는 가용성의 정제된 융합 단백질의 시험관 내 생산을 위해 변경된 경우 유용할 수도 있을 것이다. 부가적으로, 스캐폴드로서 CD19 변이체(또는 단편)를 포함하는 융합 단백질의 비제한적인 예로는, 예를 들어 CD19 변이체/시토카인 융합 단백질 및 CD19 변이체/TLR 작용제 융합 단백질이 포함된다.
부가적으로, 스캐폴드로서 CD19(또는 단편)을 포함하는 융합 단백질의 비제한적인 예는, 예를 들어 CD19-시토카인 융합 단백질, CD19-TLR 작용제 융합 단백질을 포함한다. 면역글로불린-유사 도메인을 함유하는 다른 B 세포 제한된 세포 표면 마커는 CD22, CD79a 및 CD79b를 포함한다. 이들 Ig 도메인은 또한 돌연변이 유발되어 TAA 및 TSA를 결합하는 변이체를 생성할 수 있다.
폴리펩티드 항원 및 항체
표 1은 알려진 이용가능한 항체 작용 물질에 의해 표적되는 특정 인간 폴리펩티드 항원의 전체는 아닌 목록을 제시하며, 항체 작용 물질이 유용한 것으로 제안된 특정의 암의 징후를 나타낸다:
인간 항원 항체(상품명 또는 학명) 암 징후
CD2 시플리주맙(Siplizumab) 비-호지킨성 림프종
CD3 UCHT1 말초 또는 피부 T-세포 림프종
CD4 HuMax-CD4
CD19 SAR3419, MEDI-551 광범위하고 큰 B-세포 림프종
CD19 및 CD3 또는 CD22 2특이적 항체, 예컨대 블리나투모맙(Blinatumomab), DT2219ARL 비-호지킨성 림프종
CD20 리툭시맙, 벨투주맙, 토시투모맙, 오파투무맙, 이브리투모맙, 오비누투주맙 B 세포 악성 종양(비-호지킨성 림프종, 만성 림프구성 백혈병)
CD22(SIGLEC2) 이노투주맙, 테트라세탄, CAT-8015, DCDT2980S, 벡투모맙 화학요법-내성 모발 세포 백혈병, 호지킨성 림프종
CD30 브렌툭시맙 베도틴
CD33 젬투주맙 오조가마이신(마일로타르그(Mylotarg)) 급성 골수성 백혈병
CD37 TRU-016 만성 림프구성 백혈병
CD38 다라투무맙 다발성 골수종, 혈액학적 종양
CD40 루카투무맙 비-호지킨성 림프종
CD52 알렘투주맙(캄파트(Campath)) 만성 림프구성 백혈병
CD56(NCAM1) 로르보투주맙 소세포 폐암
CD66e(CEA) 라베투주맙 유방, 결장 및 폐 종양
CD70 SGN-75 비-호지킨성 림프종
CD74 밀라투주맙 비-호지킨성 림프종
CD138(SYND1) BT062 다발성 골수종
CD152(CTLA-4) 이필리무맙 전이성 흑색종
CD221(IGF1R) AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R150, CP 751871 신경교종, 폐, 유방, 두경부, 전립선 및 갑상선 암
CD254(RANKL) 데노수맙 유방 및 전립선 암종
CD261(TRAILR1) 마파투무맙 결장, 폐 및 췌장 종양 및 혈액학적 악성 종양
CD262(TRAILR2) HGS-ETR2, CS-1008
CD326(Epcam) 에드레콜로맙, 17-1A, IGN101, 카투막소맙, 아데카투무맙 대장암, 악성 복수, 상피 종양(유방, 결장, 폐)
CD309(VEGFR2) IM-2C6, CDP791 상피-유도된 고형 종양
CD319(SLAMF7) HuLuc63 다발성 골수종
CD340(HER2) 트라스투주맙, 퍼투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신 유방암
CAIX(CA9) cG250 신장 세포 암종
EGFR(c-erbB) 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 및 806 신경교종, 폐, 유방, 결장, 및 두경부 종양을 포함하는, 고형 종양
EPHA3(HEK) KB004, IIIA4 폐, 신장 및 결장 종양, 흑색종, 신경교종 및 혈액학적 악성 종양
에피시알린 에피투모맙 상피 난소 종양
FAP 시브로투주맙 및 F19 결장, 유방, 폐, 췌장, 및 두경부 종양
HLA-DR 베타 아폴리주맙 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨성 림프종
FOLR-1 팔레투주맙 난소 종양
5T4 아나투모맙 비-소세포 폐암
GD3/GD2 3F8, ch14.18, KW-2871 신경외배엽 및 상피 종양
gpA33 huA33 대장 암종
GPNMB 글렘바투무맙 유방암
HER3(ERBB3) MM-121 유방, 결장, 폐, 난소, 및 전립선 종양
인테그린 αVβ3 에타라시주맙 종양 맥관구조
인테그린 α5β1 볼록시시맙(Volociximab) 종양 맥관구조
루이스-Y 항원 hu3S193, IgN311 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양
MET(HGFR) AMG 102, METMAB, SCH900105 유방, 난소 및 폐 종양
뮤신-1/CanAg 펨투모맙, 오레고보맙, 칸투주맙 유방, 결장, 폐 및 난소 종양
PSMA ADC, J591 전립선암
포스파티딜세린 바비툭시맙 고형 종양
TAG-72 민레투모맙 유방, 결장 및 폐 종양
테나신 81C6 신경교종, 유방 및 전립선 종양
VEGF 베바시주맙 종양 맥관구조
이에 따라, 폴리펩티드 항원을 암호화하는 발현된 구축물을 표적하는 세포 치료제는 하나 이상의 이들(또는 다른) 알려진 항체와 조합되어 사용될 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공되며, 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 항원-활성화 제어된 프로모터는 세포 치료 세포가 항원에 마주한 후 시토카인 방출을 촉진한다(예를 들어, 종양 세포 또는 이들의 국소 환경)
암 치료학에 대한 시토카인 지지는 오랜 역사를 갖고 있다(예를 들어, TNF, LTa, IFNa 및 IL-2의 전신 이용). 전신 시토카인 치료법이 갖는 고유한 문제로는 높은 투약량 요구, 최소 효능, 및 독소(TNF 및 LTa의 경우 치명적)가 포함된다. 그러한 독성은 IL-12 및 IL-15의 이용을 제한한다.
예를 들어, 전신 재조합 IL-12는 다수의 심각한 부작용을 유도하였으며, 이는 신장 및 전신 독성을 포함한다. 높은-도스 수준은 일시적 면역 억제와 연결되어 있으며, 이는 효과적인 면역치료법에 불리할 수 있다.(본 명세서에서 참고문헌으로 통합된, 문헌[Leonard et al., Blood 1997;90:2541-8, 및 Colombo, MP et al., Cytokine Growth Factor Rev 2002;13:155-68] 참조. 시토카인은 충분한 농도로 종양 위치(들)에 도달하지 않았기 때문에, 전신 IL-12 시험의 대다수는 독성 부작용 및 제한된 효능과 연관되었다(본 명세서에서 참고문헌으로 통합된, 문헌[S Tugues, et al., 2015 Cell Death Differ 22: 237-246].
재조합 IL-15는 NK 및 CD8 세포 매개된 독성을 유도한다. rIL-15를 수령하는 환자에서 관찰된 도스-제한 독성은 3 등급의 저혈압, 혈소판감소증, 및 ALT 및 AST의 상승을 포함하여, 최소 임상 효능을 갖는 차선의 최대-허용 도스를 초래하였다(본 명세서에서 참고문헌으로 통합된, 문헌[Conlon, K., et al., J. of Clinical Oncology Jan 1, 2015: 74-82] 참조).
이들 및 유사한 연구는 시토카인의 제어되지 않은 투여 및 전신 분포와 연관된 도스-제한 독성 및 최소 효능을 예시한다. 이에 따라, 암 또는 암(예를 들어 종양)을 가진 것으로 의심되는 개인은, 시토카인 및 표적의 융합 단백질을 위해, 종양 세포의 직접적인 형질도입을 허용하는 조성물을 투여받는다. 투여는 정맥 내 또는 종양 내일 수 있다.
실시예 2 형질도입된 종양 세포로부터의 시토카인의 방출
CAR T 세포, CAR NK 세포, TCR T 세포, TIL, 동종이계 NK 세포 및 자가유래 NK 세포는 TAA를 갖는 시토카인 융합 단백질로서 IL-21의 연장된 방출을 위해 엔지니어링된다. 확장 및 이펙터 분화가 CD8+ T 세포 내에서 유도되고, NK 세포 활성화 및 세포용해 활성이 지지된다.
활성화 신호의 관여는 TNF 프로모터의 제어 하에서 IL-15를 신속히 분비하며, 이는 NK 세포 확장을 지지하거나(예를 들어, CAR NK, 동종이계 NK 세포, 및 자가유래 NK 세포), 항-종양 반응에서 NK 세포 공포를 리크루트한다(예를 들어, CAR T, TCR, TIL). 대안적으로, 발현된 시토카인 및 프로모터의 각종 조합이 사용되고, 적합한 방식으로 융합 단백질로서 발현된다(IL-2, IL-12, IL-36g, IFNg).
IL-12에 융합된 항-TAA scFv 항체의 지속된 국소 생산은 면역 세포를 리크루트하여 CAR T 세포 또는 다른 세포 치료제와의 관여에 의해 촉발된 항-종양 면역 반응을 지지 및 확장한다.
실시예 3: 표적 방법은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체(또는 그의 단편)를 이용하거나, 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬은 항체-약물 컨쥬게이트 표적에 융합된다 .
표적은 독소에 커플링된 항체인 ADC에 의해 인식되는, 폴리펩티드 서열, 단백질 도메인 또는 도메인이다. ADC 표적은 많은 다른 것들 중 특히, HER2 수용체, CD30 세포 표면 단백질, 엽산 수용체 알파, 및 CD19이다.
표적 방법은 scFv 항체 또는 그의 단편을 이용하며, 항체-약물 컨쥬게이트 표적에 융합된다. 대안적으로, 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬 표적 방법이 사용된다. 항체-약물 컨쥬게이트 표적의 예는 CD30, HER2, 또는 ADCC 항체 표적을 포함한다.
실시예 4: 표적 방법은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체(또는 그의 단편)을 이용하거나, 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬은 프로-면역 반응제에 융합된다.
"프로-면역 반응제"는 면역 반응 세포 개체군을 포함하는 자극 세포에 의해 면역 반응을 자극할 수 있는 임의의 작용물질이다. 면역 반응을 직접적으로 자극하는 작용물질은 시토카인, "위험 신호"(DAMP, PAMP, TLR 작용제 등), 작용제 항체 또는 리간드(예를 들어, 항-4-1BB, CD40L, B7-1, 및 기타 다수의 것들), 면역억제성 신호의 억제제(PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag-3, TIM-3, IDO1, 아데노신 수용체, TGF베타의 길항제 및 기타 다수의 것들)를 포함한다.
표적 방법은 scFv 항체(또는 그의 단편)를 이용하며, 대안적으로 표적 방법은 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬이다. 두 표적 방법 모두에서, 프로-면역 반응제는 IL-2, IFN알파, IL-12, IL-15, IL-21, 임의의 TLR 작용제 및 임의의 면역 체크포인트 항체(또는 그의 단편)를 포함한다.
실시예 5: 표적 방법은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체(또는 그의 단편), 또는 세포 리크루팅 모이어티에 융합된 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬을 이용한다.
면역 이펙터 세포의 리크루트를 위한 또 다른 방법은 2특이적 T-세포 인게이저(예를 들어, BiTE)의 발달이며, 이는 링커에 의해 연결된 두 개의 scFv로 이루어진다. 하나의 아암은 항-TAA scFv이며, 제2의 scFv는 TCR 복합체의 CD3ε 서브유닛에 결합하고, 이에 따라 T 세포 활성화를 촉발한다. 중요하게는, BiTE 및 관련 분자(DART, 디아바디, fCab, 등)는 매우 낮은 이펙터/표적(E/T) 세포 비로 T 세포에 의한 종양 세포 분해의 반복된 라운드를 유도한다. 막 천공 및 이후 그랜자임(grnazyme)의 유도 및 항-종양 설정에서 유도되기를 바랬던 사멸 유형인, 세포자멸에 의해, 세포독성이 매개된다. 정상적으로는, 항-TAA scFv 종양-연관 항원의 친화도는 CD3에 대해 유도된 것보다 훨씬 더 높다 - 이는 표적화된 종양에 대한 특이성을 강화시킨다. 많은 BiTE가 생성되었으며, 이는 CD19, EpCAM, HER2, 암배아 항원(CEA), 에프린 A2(EphA2), CD33, 및 흑색종-연관된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)을 표적하는 BiTE를 포함한다. 임상 연구 중에 있는 다른 BiTE는 EpCAM, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 또는 CD3-결합 분자와 조합된 CEA-결합 분자로 구성된다.
일부 예에서, 표적 방법은 scFv 항체(또는 그의 단편)을 이용하며, 대안적으로 표적 방법은 분비된 헤테로다이머 TCR 알파/베타 또는 감마/델타 사슬을 포함한다. 두 표적 방법 모두에서, 세포 리크루팅 모이어티는 항-CD16에 융합된다. 대안적인 예에서, 세포 리크루팅 모이어티는 항-CD3 모이어티에 융합되고, 본 명세서에 기재된 BiTE® 기술을 이용한다.
실시예 6 ScFv가 TAA Her2에 결합하고, 종양이 CD19-유도된 CAR T 세포에 의해 사멸되는, ScFv-CD19 융합 단백질을 갖는 HPV 슈도바이러스를 이용한 생체 내 종양의 형질감염
Her2를 발현하는 유방암의 이종이식 마우스 모델에서 종양세포를 형질도입하기 위하여 ScFv-CD19 융합 단백질을 포함하는 HPV 슈도바이러스가 IV 주사된다. 형질도입된 종양은 ScFv-CD19 융합 단백질을 분비하여, 그 결과 종양 세포를 Her2에 대한 ScFv 결합을 통한 ScFv-Cd19 융합 단백질로 코팅시킨다. CD19-유도된 CAR T 세포의 첨가는 CD19로 코팅된 종양 세포를 사멸시킨다. CD19에 대해 유도된 CAR T 세포는 표준 방법에 의해 제조된다.
실시예 7: ScFv가 TAA Her2에 결합하고, 종양이 CD19-유도된 CAR T 세포에 의해 사멸되는, ScFv-CD19 융합 단백질을 갖는 AAV-파지 키메라성 바이러스를 이용한 생체 내 종양의 형질감염
Her2를 발현하는 유방암의 이종이식 마우스 모델에서 종양 세포를 형질도입하기 위하여 키메라성 AAV/파지 바이러스가 IV 주사된다. 형질도입된 종양은 ScFv-CD19 융합 단백질을 분비하여, 그 결과 종양 세포를 Her2에 대한 ScFv 결합을 통한 ScFv-Cd19 융합 단백질로 코팅시킨다. CD19-유도된 CAR T 세포의 첨가는 CD19로 코팅된 종양 세포를 사멸시킨다. CD19 유도된 CAR T 세포의 생성은 잘 수립되어 있다.
실시예 8: ScFv가 TAA Her2에 결합하고, 종양이 CD30-표적된 ADC에 의해 사멸되는, ScFv-CD30 융합 단백질을 갖는 HPV 슈도바이러스를 이용한 생체 내 종양의 형질감염
Her2를 발현하는 유방암의 이종이식 마우스 모델에서 종양 세포를 형질도입하기 위하여 ScFv-CD30 융합 단백질을 포함하는 HPV 슈도바이러스가 IV 주사된다. 형질도입된 종양은 ScFv-CD30 융합 단백질을 분비하여, 그 결과 종양 세포를 Her2에 대한 ScFv 결합을 통한 ScFv-Cd30 융합 단백질로 코팅시킨다. CD30-유도된 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)의 첨가는 CD30으로 코팅된 종양 세포를 사멸시킨다. CD19 유도된 CAR T 세포의 생성은 잘 수립되어 있다. 애드세트리스(Adcetris)는 Seattle Genetics로부터 구매가능한 ADC이다.
실시예 9: 융합 단백질을 암호화하는 AAV 바이러스 입자를 갖는 세포의 형질도입은 CAR19 T 세포 표적화 및 활성화를 유도할 수 있는 분비된 기능성 융합 단백질을 초래한다.
본 실시예는 융합 단백질을 암호화하는 AAV 바이러스성 입자로 형질도입된 세포로부터의 융합 단백질의 발현을 증명한다. 나아가, 본 실시예는 발현된 융합 단백질이 항-CD19 항체 FMC63에 의해 결합될 수 있고 C-말단 His 태그에 대한 항-His 항체 결합에 의해 검출될 수 있음을 증명한다. 일단 발현되면, 융합 단백질은 CD19 음성인 세포 존재 하에서 CAR19 T 세포를 활성화할 수 있다.
하기 표는 본 실시예에서 시험된 각종 구축물을 열거한다:
Figure pct00001
방법
12 웰 플레이트를 DMEM+10% FBS 매질 내 약 4×10e5 세포/웰의 A431 또는 293T 세포 중 하나로 접종하였다. 다음 날, 하나의 웰을 계수하여 바이러스 감염에 대한 정확한 수를 수득하였다. 세포는 1×106 또는 5×106의 감염 다중도(MOI)로 감염되었다. AAV2 바이러스성 입자를 Vigene(Rockville, MD)에 의해 제조하였다. 바이러스성 입자는, CD19 D1+D2-scFv-His 서열을 함유하는 삽입물이 pAV-FH 내로 클로닝된 플라스미드로부터 생성되었다. 바이러스성 입자 AAV-1(CD19-D1+2-트라스투주맙 scFv(VH/VL), 서열번호 1), AAV-3(CD19 D1+D2-MOC31 scFv(VH/VL), 서열번호 3), AAV-5(CD19 D1+D2-LY2875358 scFv(VH/VL), 서열번호 5) 및 AAV-7(CD19 D1+D2-파니투무맙 scFv(VH/VL), 서열번호 7)은 각각 8.39×1013, 1.51×1014, 3.03×1014 및 2.13×1014 GC/ml의 역가를 가졌다. 감염은 바이러스가 매질 내에 직접 첨가된 DMEM+2% FBS 웰 당 0.6 ml 내에서 수행되었다. 상이한 농도의 바이러스가 104("104" 또는 "10e4"로도 알려짐) 내지 5×106("5×106" 또는 "5×10e6"로도 알려짐)으로 사용되었다. 다음 날, 매질을 DMEM+10%FBS로 바꾸고, 3 일 또는 6 일 동안 인큐베이션을 지속하였다.
ELISA
발현 분석은 ELISA를 이용하여 상등액 내에서 검사하였으며, 여기서 항-CD19 FMC63이 포획에 사용되었으며 항-His가 검출을 위해 사용되었다. 간략하게는, 96 웰 플레이트(Pierce, Cat# 15041)를 4C에서 하룻밤 동안 pH 9.5, 0.1 M 탄산염 내 1.0 ㎍/ml 시약으로 코팅하였다. 플레이트를 이후 실온에서 1 시간 동안 TBS (200 ㎕/웰) 내 0.3% 탈지분유(NFD)로 차단하였다. 플레이트를 이후 세척 버퍼(1×TBST: 0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween20)로 3 회 세척하였다. 희석되지 않은 세포 배양 상등액으로부터 또는 연속 3× 희석한 1.0 ㎍/ml에서 정제된 단백질로부터, 웰 당 100 ㎕로 적정을 수행하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 희석 버퍼는 1×TBS(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl) 내 1% BSA로, 이어서 세척 버퍼로 3 회 세척하였다. 비오티닐화된-시약과 같은 2차 시약을(필요한 경우) 1 ㎍/ml 농도로 RT에서 1 시간 동안 첨가하였다. HRP-컨쥬게이트된 시약을 1:2000에서 첨가하고, 웰 당 100 ㎕ 적용하고, 암조건 하에 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 웰 당 100 ㎕ 1-스텝 울트라 TMB-ELISA(Thermo Fisher, Prod#34028)를 첨가하였다. 색상이 전개되었을 때, 플레이트를 405 nm에서 판독하였다.
XTT 세포 증식 분석(ATCC, Cat# 30-1011K)
XTT 시약 및 활성화 시약의 분취액을 이용 전에 37℃에서 신속히 해동시켰다. 0.1 ml의 활성화 시약을 이후 5.0 ml의 XTT 시약에 첨가하였다. 50 ㎕의 활성화된 -XTT 용액을 그 후 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2~4 시간 동안 세포 배양 인큐베이터 내에 위치시키고, 색상 전개에 대해 감독하였다. 플레이트의 흡광도를 파장 450 nm에서 판독하였다. % 세포 사멸(세포독성으로도 알려짐)을 다음과 같이 계산하였다:
사멸 % =[1-OD(실험 웰-T 세포의 대응 수)/OD(T 세포 없는 종양 세포-매질)]×100
ELISA에 의한 인터페론 감마 농도 분석
96 웰 플레이트(Pierce, 제품 #15041)를, 4℃에서 하룻밤 동안 pH 9.5의 0.1 M 탄산염 완충액 내 1.0 ㎍/ml의 마우스 항-인간 IFNγ(BD Pharmingen, Cat# 551221)으로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 200 ㎕/웰을 이용하여 트리스-완충된 식염수(TBS) 중 0.3% 탈지분유 용액으로 차단하였다. 플레이트를 세척 완충액을 이용하여 3 회 세척하였다(1×TBS/Tween: 0.1 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween20). 24 시간 또는 48 시간의 배양 플레이트로부터의 100 ㎕ 배양물 상등액(상기 참조)을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 재조합 인간 IFNγ(Thermo Fisher, Cat# RIFNG100)의 적정 또한 일련의 300 ng/ml에서 3× 희석으로 2 pg/ml까지 동일한 플레이트 내에서 수행되어 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트를 이후 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 희석 완충액은 1% BSA가 더해진 1× TBS(0.1 M Tris, 0.5 M NaCl)였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 비오티닐화된 마우스 항-인간 IFNγ(BD Pharmingen, Cat# 554550)는 1 ㎍/ml 농도로 첨가되었으며, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트는 세척 완충액을 이용하여 3 회 다시 세척하였다. HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(Thermo Fisher, Cat# 21130)이, 저장액으로부터 1:2000 희석액으로 웰 당 100 ㎕로 첨가되었다. 플레이트는 이후 실온에서 1 시간 동안 암소에서 인큐베이션되었다. 플레이트를 세척 버퍼로 다시 3 회 세척하였다. 웰 당 100 ㎕의 1-Step Ultra TMB-ELISA 전개 용액(Thermo Fisher, Cat #34028)이 웰 하나당 첨가되었다. 색상이 충분히 전개되었을 때 플레이트를 405 nm 파장에서 판독하였다.
결과
도 2a 내지 도 2c는 형질도입된 세포로부터 융합 단백질의 발현을 보여준다. 도 2a는 융합 단백질을 암호화하는 AAV 바이러스성 입자를 이용한 A431 또는 293T 세포의 형질도입 후 발현된 융합 단백질 CD19-D1+2-트라스투주맙 scFv(VH/VL)(AAV#1)의 검출을 보여준다. 발현된 융합 단백질은 항-CD19 항체 FMC63에 의해 결합될 수 있고, C-말단 His 태그에 대한 항-His 항체 결합에 의해 검출될 수 있다. 도 2b는 나타낸 융합 단백질을 암호화하는 AAV 입자를 이용하여 293T 세포의 형질도입으로 초래되는 융합 단백질 AAV-3(CD19 D1+D2-MOC31 scFv(VH/VL), 서열번호 3), AAV-5(CD19 D1+D2-LY2875358 scFv(VH/VL), 서열번호 5) 및 AAV-7(CD19 D1+D2-파니투무맙 scFv(VH/VL), 서열번호 7)의 발현의 검출을 보여준다. 도 2c는, 융합 단백질을 암호화하는 AAV 입자를 이용한 A431 세포의 형질도입으로 초래되는, 융합 단백질 AAV-3(CD19 D1+D2-MOC31 scFv(VH/VL)의 발현의 검출을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 AAV-1-발현된 상등액 및 BT474 세포와 함께 CAR19 T 세포(Promab)를 인큐베이션함에 따른, IFNγ의 유도를 측정하는 IFNγ ELISA의 결과의 요약을 보여준다. 도 3a는 10:1 이펙터:표적 비율로 24 시간에서 IFNγ ELISA의 결과를 보여준다. 도 3b는 10:1 이펙터:표적 비율로 48 시간에서 IFNγ ELISA의 결과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 AAV-1-발현된 상등액 및 BT474 세포와 CAR19 T 세포(Promab)의 인큐베이션에 따른 세포독성의 유도를 보여준다. 도 4a는 24 시간 후 2:1 이펙터:표적 비율에 대한 XTT-세포독성 결과 요약을 보여준다. 도 4b는 48 시간 후 2:1 이펙터:표적 비율에 대한 XTT-세포독성 결과 요약을 보여준다. 도 4c는 48 시간 후 10:1 이펙터:표적 비율에 대한 XTT-세포독성 결과 요약을 보여준다. 이들 결과는 세포(예를 들어, 종양 세포)의 AAV 형질도입이 CAR19 T 세포 활성화 및 세포독성을 유도할 수 있는 기능성 융합 단백질의 발현을 초래할 수 있음을 보여준다.
균등물
당업자는 단지 일상적 실험을 이용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인하는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 범주는 상기 발명의 상세한 설명으로 한정시키고자 의도되지 않으며, 그보다는 하기 청구범위에서 설명되는 바와 같다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> ALETA BIOTHERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR TRANSDUCTION <130> 2012106-0008 <140> PCT/US2016/059578 <141> 2016-10-28 <150> 62/249,183 <151> 2015-10-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 305 310 315 320 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 325 330 335 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr 340 345 350 Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 355 360 365 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 370 375 380 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 405 410 415 Ser Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 435 440 445 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 450 455 460 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 465 470 475 480 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 485 490 495 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 500 505 510 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 515 520 525 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 530 535 540 Thr Ser Arg His His His His His His 545 550 <210> 2 <211> 1659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccaggggga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gtggaggtgg gtctgaggtg 900 cagctggtgg agtctggtgg tggtcttgtt caacctggtg gttctcttcg tctttcttgt 960 gctgcttctg gttttaatat taaagatact tatattcatt gggttcgtca agctcctggt 1020 aaaggtcttg aatgggttgc tcgtatttat cctactaatg gttatactcg ttatgctgat 1080 tctgttaaag gtcgttttac tatttctgct gatacttcta aaaatactgc ttatcttcaa 1140 atgaactctc ttcgtgctga agatactgct gtttattatt gttctcgttg gggtggtgat 1200 ggtttttatg ctatggatta ttggggtcaa ggtactcttg tcaccgtctc ctcagctagc 1260 accgggggag gtgggtctgg aggtggagga tctggtggag gtgggtctga catccagatg 1320 acccagtctc cttcttctct ttctgcttct gttggtgatc gtgttactat tacttgtcgt 1380 gcttctcaag atgttaatac tgctgttgct tggtatcaac aaaaacctgg taaagctcct 1440 aaacttctta tttattctgc ttcttttctt tattctggtg ttccttctcg tttttctggt 1500 tctcgttctg gtactgattt tactcttact atttcttctc ttcaacctga agattttgct 1560 acttattatt gtcaacaaca ttatactact cctcctactt ttggtcaagg taccaaggtg 1620 gagatcaaac gtacgtctag acatcatcac catcaccat 1659 <210> 3 <211> 557 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 290 295 300 Ser Gly Ala Glu Asp Lys Lys Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys 305 310 315 320 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg 325 330 335 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr 340 345 350 Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe 355 360 365 Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu 370 375 380 Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys 385 390 395 400 Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 405 410 415 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 420 425 430 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 435 440 445 Glu Val Ser Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys 450 455 460 Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Leu Ser Asn Leu 485 490 495 Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp 500 505 510 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Glu Gly Thr Tyr 515 520 525 Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr 530 535 540 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr His His His His His His 545 550 555 <210> 4 <211> 1671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccaggagga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gaggaggtgg gtctcaggtg 900 cagctggtgc agagcggcgc cgaggacaag aagcccggcg agagcgtgaa gatcagctgc 960 aaggccagcg gctacacctt caccaactac ggcatgaact gggtgaggca ggcccccggc 1020 cagggcctga agtggatggg ctggatcaac acctacaccg gcgagagcac ctacgccgac 1080 gacttcaagg gcaggttcgc cttcagcctg gacaccagcg ccagcaccgc ctacctgcag 1140 ctgagcagcc tgaggggcga ggacaccgcc gtgtacttct gcgccaggtt cgccatcaag 1200 ggcgactact ggggccaggg caccaccgtg accgtgagca gcgccagcac cggcggcggc 1260 ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cgacatcgtg 1320 atgacccaga gccccctgag cctggaggtg agccccggcg agcccgccag catcagctgc 1380 aggagcacca agagcctgct gcacagcgac ggcatcacct acctgtactg gtacctgcag 1440 aagcccggcc agagccccca gctgctgatc taccagctga gcaacctggc cagcggcgtg 1500 cccgacaggt tcagcagcag cggcagcggc accgacttca ccctgaagat cagcagggtg 1560 gaggccgagg acgagggcac ctactactgc gcccagaacc tggagatccc caggaccttc 1620 ggccagggca ccaagctgga gatcaagagg acccatcatc accatcacca t 1671 <210> 5 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 290 295 300 Ser Gly Ala Glu Asp Val Lys Pro Asp Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys 305 310 315 320 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg 325 330 335 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asn Pro Asn 340 345 350 Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr Met 355 360 365 Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 370 375 380 Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp Leu 385 390 395 400 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 405 410 415 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Glu 435 440 445 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser 450 455 460 Val Ser Ser Ile Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser 465 470 475 480 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 485 490 495 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 500 505 510 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr 515 520 525 Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 530 535 540 Arg Thr His His His His His His 545 550 <210> 6 <211> 1656 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccaggagga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gaggaggtgg gtctcaggtt 900 cagctggtgc agtctggtgc tgaggatgtg aagcctgatg cctcagtgaa gctctcctgc 960 aaggcttctg gttacacatt cactgactac tacatgcact gggtgcgtca ggcccctggt 1020 caaggtcttg agtggatggg tcgtgttaat cctaaccgga ggggtactac ctacaaccag 1080 aaattcgagg gccgtgtcac catgaccaca gacacatcca cgagcacagc ctacatgcag 1140 ctgagtagcc tgcgtggtga agacacggcc gtgtattact gtgcgcgtgc gaactggctt 1200 gactactggg gccagggcac caccgtcacc gtctcctccg cctccaccgg gggaggtggg 1260 tctggaggtg gaggatctgg tggaggtggg tctggtggag gtgggtctga catccagatg 1320 acccagtctc catcctccct ggaggcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgcagt 1380 gtcagctcaa gtgtatcctc catttacttg cactggtatc agcagaaacc agggaaaagc 1440 cctaagctcc tgatctatag cacatccaac ttggcttctg gagtcccaga taggttcagt 1500 ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gtctgcaagc cgaagatgag 1560 ggcacttact actgtcaagt ctacagtggt tacccgctca cgttcggcgg agggaccaag 1620 ctggagatca aacgaactca tcatcaccat caccat 1656 <210> 7 <211> 555 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu 290 295 300 Ser Gly Pro Gly Asp Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 305 310 315 320 Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp 325 330 335 Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr 340 345 350 Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr 355 360 365 Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Thr Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser 370 375 380 Val Thr Gly Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Val 385 390 395 400 Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 405 410 415 Ser Ala Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 435 440 445 Ser Ser Leu Glu Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln 450 455 460 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 465 470 475 480 Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 485 490 495 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 500 505 510 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Phe Cys 515 520 525 Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 530 535 540 Glu Ile Lys Arg Thr His His His His His His 545 550 555 <210> 8 <211> 1665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccaggagga 840 ggtgggtctg gaggtggagg atctggtgga ggtgggtctg gaggaggtgg gtctcaggtg 900 cagctgcagg agagcggccc cggcgacgtg aagcccagcg agaccctgag cctgacctgc 960 accgtgagcg gcggcagcgt gagcagcggc gactactact ggacctggat caggcagagc 1020 cccggcaagg gcctggagtg gatcggccac atctactaca gcggcaacac caactacaac 1080 cccagcctga agagcaggct gaccatcagc atcgacacca gcaagaccac cttcagcctg 1140 cagctgagca gcgtgaccgg cgaggacacc gccatctact actgcgtgag ggacagggtg 1200 accggcgcct tcgacatctg gggccagggc accaccgtga ccgtgagcag cgccagcacc 1260 ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1320 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctggaggcca gcgtgggcga cagggtgacc 1380 atcacctgcc aggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 1440 ggcaagagcc ccaagctgct gatctacgac gccagcaacc tggagaccgg cgtgcccgac 1500 aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcaggcc 1560 gaggacgagg gcacctactt ctgccagcac ttcgaccacc tgcccctggc cttcggcggc 1620 ggcaccaagc tggagatcaa gaggacccat catcaccatc accat 1665

Claims (32)

  1. 융합 단백질로서, 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 암호화하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 치료제는 시토카인, 펩티드, 단백질, 항체, 항체 단편, T-세포 인게이저(engager) 및 NK-세포 인게이저로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 치료제는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 시토카인은 상기 벡터를 포함하는 종양 세포에 의해 분비될 수 있는 것인, 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 바이러스성 벡터인, 벡터.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 암 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 대한 항원인, 벡터.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 T 세포 수용체(TCR)에 대한 항원인, 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 ADC 항체, ADCC 항체, 및/또는 방사선치료 항체에 대한 항원인, 벡터.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 TLR 작용제, PAMP, DAMP 및 기타 자극제로 이루어진 군으로부터 선택된 면역자극성 시토카인 또는 분자인, 벡터.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 면역조절성 또는 항-종양 특성을 갖는 펩티드인, 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, TAA 또는 TSA 및 치료제는 융합 단백질로서 발현된 것인, 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA 또는 TSA는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 벡터.
  14. 융합 단백질로서 종양 발현된 시토카인 수용체에 대한 시토카인 및 치료제를 암호화하는 재조합 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 시토카인 수용체는 제I형 수용체 또는 제II형 수용체인, 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 재조합 종양 세포.
  17. 제16항에 있어서, 종양 세포는 하나 이상의 융합 단백질을 발현하는 것인, 종양 세포.
  18. 종양-연관 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 종양 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은 (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 종양 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 벡터가 종양 세포 내로 형질도입되도록 종양 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 벡터 및/또는 그의 성분은 종양 세포의 유전체 내에 통합되는 것인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, TAA 또는 TSA는 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, ανβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 a, GD2, GD3, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, ILl lRa, IL13Ra2, KDR, 람다, 루이스-Y, MCSP, 메소텔린, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, 암배아 항원, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, TAA 또는 TSA는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 대한 항원인, 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, TAA 또는 TSA는 T 세포 수용체(TCR)에 대한 항원인, 방법.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 ADC 항체, ADCC 항체, 및/또는 방사선치료 항체에 대한 항원인, 방법.
  24. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 TLR 작용제, PAMP, DAMP 및 기타 자극제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역자극성 시토카인 또는 분자인, 방법.
  25. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 면역조절성 또는 항-종양 특성을 갖는 펩티드인, 방법.
  26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 개인에서 암 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 융합 단백질은 발현되는 것인, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 암 세포는 암 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 치료제를 발현하는 것인, 방법.
  29. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암 세포는 CAR에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 펩티드 항원을 발현하는 것인, 방법.
  30. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암 세포는 TCR에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 펩티드 항원을 발현하는 것인, 방법.
  31. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암 세포는 개인에서 면역 세포에 의해 인식될 수 있는 치료제를 함유하는 하나 이상의 융합 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  32. 제17항 또는 제18항에 있어서, CAR T 세포의 개인에게의 투여를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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