KR20180072014A - Material for diagnosis comprising antibody-fixed magnetic nanoparticle cluster and method for preparing the same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a diagnostic material comprising magnetic nanoparticle clusters immobilized with antibodies, and a production method thereof. By immobilizing antibodies onto surfaces of the magnetic nanoparticle clusters which are obtained by modifying the surface of magnetized nanoparticles having uniform size, hemocytes and the pathogenic microorganism can be separated. In addition, a simple protocol has been demonstrated to optimize the size of magnetic nanoparticle clusters for effective capture and separation, it is possible to increase efficiency of a conventional blood test and a pathogenic microorganism detection system and to miniaturize an inspection equipment.

Description

항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재 및 그의 제조방법{MATERIAL FOR DIAGNOSIS COMPRISING ANTIBODY-FIXED MAGNETIC NANOPARTICLE CLUSTER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME} FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a diagnostic material comprising magnetic nanoparticle clusters immobilized on an antibody, and a method for producing the same. [0002]

본 발명은 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 자성 특성이 활성화된 균일한 크기의 나노입자 표면을 개질하여 형성된 나노입자 클러스터의 표면에 항체를 고정시킴으로써, 혈구세포 및 병원성 미생물을 효율적으로 분리할 수 있는 진단용 소재에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic material comprising magnetic nanoparticle clusters immobilized with an antibody and a method for producing the same, and more particularly, to a diagnostic material comprising a nanoparticle cluster formed by modifying a nanoparticle surface of a uniform size, To a diagnostic material capable of efficiently separating blood cells and pathogenic microorganisms by immobilizing the antibody against the cells.

분자생물학 분야에 있어서 핵산 또는 단백질이나 세포를 분리하는 것은 매우 중요하고 필수적인 기술로서, 분자생물학 연구의 근간이 될 뿐만 아니라 질병 진단의 핵심을 이루고 있다. 특히, 혈구세포를 분리하고 각종 병원성 미생물을 분리하는 것은 인간의 질병 유무의 진단에 응용될 뿐만 아니라, 의료산업상·공중보건상의 미생물 오염을 방지하기 위한 확실한 방법을 제공할 수 있는 가능성을 열어준다. In the field of molecular biology, separating nucleic acids or proteins or cells is a very important and indispensable technology, not only the basis of molecular biology research but also the core of disease diagnosis. Particularly, separating hemocyte cells and isolating various pathogenic microorganisms opens up the possibility of providing a reliable method for preventing microbial contamination in the medical industry and public health as well as in diagnosing the presence or absence of human diseases .

각종 병원성 미생물 중 살모넬라는 가공식품 및 날음식의 오염에 의해 자주 나타나는 치명적인 병원체이다. 세계적으로 매년 살모넬라 감염에 의해, 대략 9천3백8십만의 위장염의 발병과 155,000 사망이 야기된다고 보고된바 있다(Hoelzer, K. et al., Vet . Res . 42, 34, 2011). 대부분의 식품매개 질병은 주로 비장티푸스(non-typhoid) 살모넬라에 의한 것인데, 이는 많은 경우 사망을 일으키기도 한다. 감염된 세포내에서, 살모넬라는 무성 생식하고, 적절한 환경 조건에서, 세포 수가 매 20분마다 두 배가 될 수 있는데, 이는 다른 종과 비교할 때 상대적으로 신속한 것이다. 그러므로 번식 및 환경에의 저항 전에 병원성 박테리아의 효율적인 포획과 분리를 허용하는, 유전적이고, 효과적이고, 실용적인 물질이 필요한 실정이다. 따라서, 이러한 의료산업상·공중보건상 요구에 따라 세포를 신속하게 검출하기 위한 여러 가지 방법이 제안되어 왔다. Among various pathogenic microorganisms, Salmonella is a deadly pathogen frequently seen by contamination of processed food and raw food. Globally, Salmonella infections have been reported to cause approximately 93.8 million gastroenteritis cases and 155,000 deaths each year (Hoelzer, K. et al., Vet . Res . 42, 34, 2011). Most foodborne illnesses are mainly caused by non-typhoid salmonella, which in many cases can lead to death. Within infected cells, Salmonella is asexually reproducible and under appropriate environmental conditions, cell numbers can be doubled every 20 minutes, which is relatively rapid compared to other species. Therefore, there is a need for genetic, effective, and practical materials that allow efficient capture and isolation of pathogenic bacteria prior to propagation and resistance to the environment. Accordingly, various methods have been proposed for rapidly detecting cells in accordance with such medical industry and public health requirements.

이러한 예로서는 극미배양법, 항원항체반응을 이용한 형광표지법, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 기반을 둔 방법 등이 있다. 그러나 제시된 방법들은 신속한 검출과 민감도를 동시에 만족시킬 수 없고, 숙달된 전문가의 조작이 필요하거나, 유독성 물질을 발생시키는 등의 한계를 가지고 있다. 따라서 신속하고 효율적인 실시간 진단 및 분리를 위해서는 생체적합성과 표적 세포를 특이적으로 검출하기 위한 다양한 기능성이 요구된다.Examples include micro-culture, fluorescent labeling using an antigen-antibody reaction, and polymerase chain reaction (PCR) -based methods. However, the proposed methods are not able to satisfy the rapid detection and sensitivity at the same time, require the manipulation of a skilled expert, or generate toxic substances. Therefore, for rapid and efficient real-time diagnosis and separation, various functionalities are required for biocompatibility and specific detection of target cells.

한편, 우수한 자기적 성질과 구조적 안정성을 동시에 갖는 철 금속 자성소재인 산화철 자성입자 클러스터를 사용한 방법은, 소재의 다양한 크기와 표면 상태 등을 필요에 따라 최적화된 형태로 변형 가능하고, 핵자기공명영상 시스템의 조영제로도 사용될 만큼의 생체 친화도가 크다. 따라서 생명과학분야에 있어서 특정 세포에 대한 약물 및 유전체 같은 다양한 물질을 특이적으로 전달하는데 응용되고 있고, 진단 응용분야에 대해 다기능 융합 진단소재로 개발될 수 있는 가능성을 가진다. On the other hand, the method using iron oxide magnetic particle clusters, which is an iron metal magnetic material having excellent magnetic properties and structural stability at the same time, is capable of transforming various sizes and surface states of the material into an optimized form as needed, The biocompatibility is large enough to be used as a contrast agent of the system. Therefore, in the field of life sciences, it has been applied to the specific transfer of various substances such as drugs and dielectrics to specific cells, and has possibility to be developed as a multifunctional fusion diagnostic material for diagnosis application field.

한국등록특허 제10-1151147호Korea Patent No. 10-1151147 한국등록특허 제10-1402390호Korean Patent No. 10-1402390

본 발명은 자성 나노입자 클러스터를 이용하여 병원성 미생물 및 혈구세포 분리함으로써 체외진단이 가능한 다기능성의 진단용 소재를 제공하는 것을 목적으로 한다.Disclosed is a multifunctional diagnostic material capable of in vitro diagnosis by separating a pathogenic microorganism and a hemocyte cell using magnetic nanoparticle clusters.

또한, 본 발명은 자성 나노입자의 표면을 개질하여 형성된 자성 나노입자 클러스터의 표면의 기능성을 최적화하고, 자성효율을 극대화함과 동시에, 자성 나노입자가 가지는 분산성을 향상시킴으로써, 표적 특이성을 조절하여 감염성 질환의 신속하고 효율적인 현장 진단 및 체외진단이 가능한 다기능성의 진단용 소재의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention also optimizes the surface function of the magnetic nanoparticle clusters formed by modifying the surface of the magnetic nanoparticles, maximizes the magnetic efficiency, and improves the dispersibility of the magnetic nanoparticles, thereby controlling the target specificity It is an object of the present invention to provide a method for producing a multifunctional diagnostic material capable of prompt and efficient in-situ diagnosis and in vitro diagnosis of an infectious disease.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는, 진단용 소재를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a diagnostic material comprising an antibody-immobilized magnetic nanoparticle cluster.

또한, 본 발명은 (a) 자성 나노입자를 합성하는 단계; (b) 상기 합성된 자성 나노입자의 표면을 개질하고 자성 나노입자 클러스터를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 형성된 자성 나노입자 클러스터의 표면에 항체를 고정시키는 단계를 포함하는, 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재의 제조방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for producing a magnetic nanoparticle comprising: (a) synthesizing magnetic nanoparticles; (b) modifying the surface of the synthesized magnetic nanoparticles to form magnetic nanoparticle clusters; And (c) immobilizing the antibody on the surface of the formed magnetic nanoparticle cluster. The present invention also provides a method for producing a diagnostic material comprising an antibody-immobilized magnetic nanoparticle cluster.

본 발명에 따른 진단용 소재는, 기존 혈액검사와 병원성 미생물 검지 시스템의 효율성 증가 및 검사장비 소형화를 가능하게 하는 장점이 있다.The diagnostic material according to the present invention is advantageous in that it can increase the efficiency of existing blood test and pathogenic microorganism detection system and miniaturize test equipment.

또한, 본 발명에 따른 진단용 소재는, 다양한 응용이 가능하여 생명과학분야 및 의료산업에서 필요한 진단용 소재 제작에 이용될 수 있는 장점이 있다.In addition, the diagnostic material according to the present invention has various merits that can be used in the production of diagnostic materials required in the life science field and the medical industry, because of various applications.

도 1은 본 발명의 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 2의 A는 자성 나노입자의 TEM 이미지이고, B는 폴리소르베이트 80-코팅된 자성 나노입자(PCMNC)의 TEM 이미지이며, C는 PCMNC의 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 3은 본 발명에서 합성된 자성 나노입자(붉은 선) 및 폴리소르베이트 80-코팅된 자성 나노입자(PCMNC)(푸른 선)를 동적 광산란(DLS)으로 측정하여 신호 세기에 의한 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 4의 A는 DLS로 측정한 PCMNC의 크기 데이터를 나타낸 것이고, B는 PCMNC의 크기에 따른 분리 속도 시간과 자기장 경도 사이의 상관관계를 나타낸 것이며, C는 생접합의 정도와 포획 효율 사이의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 5의 A는 카르복실화된 폴리소르베이트 80으로 코팅 전후의 FT-IR 변화 데이터를 나타낸 것으로, 검은색 선은 폴리소르베이트 80으로 코팅하기 전의 자성 나노입자의 FT-IR 데이터이며, 붉은색 선은 카르복실화된 폴리소르베이트 80으로 코팅된 자성 나노입자 클러스터(PCMNC)의 FT-IR 데이터이다. 도 5의 B는 폴리소르베이트 80의 카르복실화 반응 전후의 구조 변화를 나타낸 데이터이며, 도 5의 C는 폴리소르베이트 80의 카르복실화되기 전후의 변화에 따른 NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 진단용 소재를 이용하여 검출한 균을 미세 박절한 후 TEM으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 A는 항체-접합 PCMNC를 이용한 검출 방법을 도식화한 것이고, B는 H 항원 및 O 항원의 포획 효율을 나타낸 것이다.
도 8은 H-항체-코팅된 PCMNC(A) 및 O-항체-코팅된 PCMNC(B)의 TEM 분석 결과를 나타낸 것으로, 확대된 이미지는 H- 및 O- 항원 특이적 PCMNC가 각각 세포체의 표면 및 편모 내에 위치한 것을 나타낸다.FIG. 1 is a diagram illustrating a method for producing a diagnostic material including the magnetic nanoparticle cluster of the present invention.
FIG. 2A is a TEM image of magnetic nanoparticles, B is a TEM image of polysorbate 80-coated magnetic nanoparticles (PCMNC), and C is a scanning electron microscope (SEM) image of PCMNC.
FIG. 3 shows the magnitude distribution by signal intensity measured by dynamic light scattering (DLS) of the magnetic nanoparticles (red line) synthesized in the present invention and the polysorbate 80-coated magnetic nanoparticles (PCMNC) will be.
FIG. 4A shows the size data of PCMNC measured by DLS, B shows the correlation between separation speed time and magnetic field hardness according to the size of PCMNC, C shows the correlation between the degree of bio- .
FIG. 5A shows FT-IR change data before and after coating with carboxylated polysorbate 80, black line is FT-IR data of magnetic nanoparticles before coating with polysorbate 80, The line is FT-IR data of a magnetic nanoparticle cluster (PCMNC) coated with carboxylated polysorbate 80. FIG. 5B shows the data showing the structural change before and after the carboxylation reaction of the polysorbate 80, and FIG. 5C shows the NMR data according to the change of the polysorbate 80 before and after the carboxylation.
Fig. 6 shows the result of TEM observation of microbial cells detected using the diagnostic material of the present invention.
FIG. 7A is a schematic representation of the detection method using antibody-conjugated PCMNC, and B shows the capture efficiency of H antigen and O antigen.
FIG. 8 shows the TEM analysis results of H-antibody-coated PCMNC (A) and O-antibody-coated PCMNC (B), wherein the magnified image shows that H- and O- And located within the flagella.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. To fully disclose the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한, 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms (including technical and scientific terms) used herein may be used in a sense commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In addition, commonly used predefined terms are not ideally or excessively interpreted unless explicitly defined otherwise.

본 발명은 일 관점에서, 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는, 진단용 소재에 관한 것이다. In one aspect, the present invention relates to a diagnostic material comprising an antibody-immobilized magnetic nanoparticle cluster.

구체적으로는 상기 진단용 소재는, 자성 나노입자의 표면을 양쪽 친매성 고분자로 개질하고, 이 개질된 나노입자의 클러스터 표면에 검출하고자 하는 대상물질의 항체를 고정시킴으로써, 대상물질을 분리할 수 있다. 대상물질은 사용 목적에 따라 특정할 수 있다. 상기 대상물질은 바람직하게는 혈구세포 또는 병원성 미생물일 수 있다.Specifically, the diagnostic material can separate the target substance by modifying the surface of the magnetic nanoparticle with both of the affinity polymer and immobilizing the antibody of the target substance to be detected on the cluster surface of the modified nanoparticle. The target substance may be specified depending on the purpose of use. The subject substance may preferably be a blood cell or a pathogenic microorganism.

본 발명에 따른 소재는 산업분야에서 통상적으로 사용되는 소재라면 특별히 한정되지 않는다.The material according to the present invention is not particularly limited as long as it is a material commonly used in industry.

본 발명에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the pathogenic microorganism may be Salmonella but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 항-살모넬라 H 항체, 항-살모넬라 O 항체, 항-CD45 항체, 및 항-적혈구 항체 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the antibody may be at least one of an anti-Salmonella H antibody, an anti-Salmonella O antibody, an anti-CD45 antibody, and an anti-red blood cell antibody, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 소재의 다양한 크기와 표면 상태 등을 필요에 따라 최적화된 형태로 변형 가능한, 산화철 자성 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 자성 나노입자로 철(Fe) 외에, 니켈(Ni) 및 코발트(Co)가 이용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the iron oxide magnetic nanoparticles can be modified into various shapes and surface states of the material in an optimized form as required. As the magnetic nanoparticles, nickel (Ni) and cobalt (Co) may be used in addition to iron (Fe), but the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자 클러스터의 크기가 127 nm 이상인 것을 특징으로 할 수 있는데, 이는 자성 나노입자 클러스터의 크기가 127 nm 이상의 크기를 가져야 그들이 가지는 브라운 힘(Brownian force)을 넘어설 수 있기 때문에, 127 nm 이상의 크기를 가져야만 외부 자기력에 의해 분리가 가능하기 때문이다.In the present invention, the magnetic nanoparticle clusters may have a size of 127 nm or more because the size of the magnetic nanoparticle clusters should be greater than 127 nm so that they can exceed the Brownian force Therefore, if it has a size of 127 nm or more, it can be separated by an external magnetic force.

본 발명에 있어서, 생접합의 정도가 2.5 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the degree of bioadhesion may be 2.5 or more.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 자성 나노입자를 합성하는 단계; (b) 상기 합성된 자성 나노입자의 표면을 개질하고 자성 나노입자 클러스터를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 형성된 자성 나노입자 클러스터의 표면에 항체를 고정시키는 단계를 포함하는 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재의 제조방법에 관한 것이다(도 1).According to another aspect of the present invention, there is provided a magnetic nanoparticle comprising: (a) synthesizing magnetic nanoparticles; (b) modifying the surface of the synthesized magnetic nanoparticles to form magnetic nanoparticle clusters; And (c) immobilizing the antibody on the surface of the formed magnetic nanoparticle cluster (Fig. 1).

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 계면활성제와 용매, 자성 금속 선구물질을 혼합한 후, 자성 금속 선구 물질이 자성 나노입자의 핵을 형성하여 입자의 크기가 커지게 되면, 자성 나노입자의 성장을 종료시킨 후 세척하여 정제된 자성 나노입자를 합성하는 단계이다.In the step (a) of the present invention, when the magnetic metal precursor forms nuclei of the magnetic nanoparticles after the surfactant, the solvent and the magnetic metal precursor are mixed, the size of the magnetic nanoparticles increases, Followed by washing and then washing to synthesize the purified magnetic nanoparticles.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 합성된 자성 나노입자에 양쪽 친매성 고분자를 처리하여 표면을 개질하고, 개질화된 나노입자의 집합체인 클러스터를 형성하는 단계이다. 구체적으로는 상기 합성된 자성 나노입자에 상기 양쪽 친매성 고분자를 처리하고, 초음파를 가하여 표면을 개질하는 것으로, 초음파 화학적 방법을 이용하여 자성 나노입자 클러스터의 콜로이드를 형성하는 단계이다. 상기 양쪽 친매성 고분자 처리를 통해, 자성 나노입자의 표면이 카르복시기로 개질되어 항체가 결합될 수 있는 클러스터를 형성할 수 있다.In the present invention, the step (b) is a step of modifying the surface of the magnetic nanoparticles synthesized in the step (a) by treating the biocompatible polymer to form a cluster which is an aggregate of the modified nanoparticles. Specifically, the synthesized magnetic nanoparticles are treated with the bi-affinity polymer, and the surface is modified by applying ultrasonic waves, thereby forming a colloid of the magnetic nanoparticle cluster using an ultrasonic chemical method. Through the treatment of the bi-affinity polymer, the surface of the magnetic nanoparticle can be modified with a carboxyl group to form a cluster in which the antibody can bind.

본 발명에 있어서, 상기 양쪽 친매성 고분자는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 할 수 있으나, PEG(폴리에틸렌글리콜), 폴리소르베이트 20, Brji 35 등의 양쪽 친매성 고분자가 사용될 수 있다.In the present invention, the amphiphilic polymer may be polysorbate 80, but both hydrophilic polymers such as PEG (polyethylene glycol), polysorbate 20 and Brji 35 may be used.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 클러스터화 된 진단용 소재의 표면에 특정 표적 세포에 존재하는 항원 인자를 인식하는 항체를 결합시켜 진단 기능성을 부여하는 단계이다. 즉, 상기 형성된 자성 나노입자 클러스터에 EDC와 sulfo-NHS를 처리하여 클러스터 표면을 활성화시켜, 항체가 효율적으로 고정될 수 있도록 일정한 배향을 갖도록 하는 단계이다. In the present invention, the step (c) is a step of binding an antibody recognizing an antigenic factor present in a specific target cell to the surface of the clustered diagnostic material to impart diagnostic functionality. That is, EDC and sulfo-NHS are applied to the formed magnetic nanoparticle clusters to activate the cluster surface so that the antibody has a uniform orientation so that the antibody can be efficiently fixed.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 진단용 소재는, 벤질 에테르 내 전구물질로써 철(Ⅲ) 아세틸아세토네이트 및 1차 리간드로써 올레산의 열적 분해에 의하여 올레산-코팅된 자성 나노입자를 제조하고; 폴리소르베이트 80의 말단 수산기를 무수 숙신산을 이용하여 카르복시기로 바꾼 후, 폴리소르베이트 80으로 자성 나노입자의 표면 코팅을 변형하고; 친수성 폴리소르베이트 80-코팅된 자성 나노입자 클러스터를 유중수 마이크로에멀션 기술을 이용하여 합성하고; 폴리소르베이트 80-코팅된 자성 나노입자 클러스터 상의 폴리소르베이트 80의 카르복시기를 항체의 아민기와 접합시켜 제조될 수 있다(도 1).In one embodiment of the present invention, the diagnostic material of the present invention comprises oleic acid-coated magnetic nanoparticles by thermal decomposition of oleic acid as iron (III) acetylacetonate and a primary ligand as precursors in benzyl ether; Replacing the terminal hydroxyl groups of polysorbate 80 with carboxy groups using succinic anhydride and then modifying the surface coating of the magnetic nanoparticles with polysorbate 80; Hydrophilic polysorbate 80-coated magnetic nanoparticle clusters were synthesized using a water-in-water microemulsion technique; Can be prepared by conjugating the carboxyl group of polysorbate 80 on the polysorbate 80-coated magnetic nanoparticle cluster with the amine group of the antibody (Fig. 1).

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 하기 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 하나 이는 본 발명의 예시목적을 위한 것으로, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, which should not be construed as limiting the scope of protection defined by the appended claims.

[실시예][Example]

실시예Example 1: 자성 나노입자의 제조 1: Preparation of magnetic nanoparticles

1-1: 자성 나노입자의 합성1-1: Synthesis of magnetic nanoparticles

산화철(III) 3mmol과 올레익 산(oleic acid) 26 mmol, 9.0 mL를 three-necked 둥근바닥 플라스크에 넣고 혼합해준 후, 15분 내로 320°C까지 온도를 올려 주었다. 온도는 heating mantle과 열전대를 이용하여 조절하였다. 반응이 진행되는 동안 혼합물에서 물이 생성되기 때문에 거품 및 갈라짐 현상이 나타난다. 또한 색이 빨간색에서 갈색으로, 마지막엔 검은색으로 변화하게 된다. 이 과정을 통해 얻어진 산물을 헥세인(hexane)을 통하여 희석하였고 5000rpm에서 초원심분리한 후, 에탄올(ethanol)을 이용하여 정제한 후 건조시켰다. 다시 충분한 양의 아세톤(acetone)을 이용하여 재분산 시켜준 후, 이로 인하여 만들어진 상층액을 에탄올과 아세톤을 이용하여 3번 정제시킨다. 이를 통하여 만들어진 최종 산물을 열중량분석기(thermogravimetric measurements)를 이용하여 건조된 산물의 양을 측정하였다. 후에 다음 사용을 위하여 헥세인에 재분산 시켜주었다.3 mmol of iron oxide (III) and 26 mmol of oleic acid (9.0 mL) were mixed in a three-necked round-bottomed flask and heated to 320 ° C within 15 min. Temperature was controlled by heating mantle and thermocouple. As the reaction proceeds, water is formed in the mixture, resulting in bubbles and cracks. Also, the color changes from red to brown and finally to black. The resulting product was diluted with hexane, centrifuged at 5000 rpm, purified with ethanol, and dried. After re-dispersing again with a sufficient amount of acetone, the supernatant thus obtained is purified three times using ethanol and acetone. The resulting product was then thermogravimetrically measured to determine the amount of the dried product. And then redispersed in hexane for subsequent use.

1-1-1: 자성 나노입자의 특성 분석1-1-1: Characterization of magnetic nanoparticles

합성된 자성 나노입자의 크기를 고해상 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 자성 나노입자는 각각의 크기가 17 내지 20nm임을 확인하였다(도 2의 A).The size of the synthesized magnetic nanoparticles was measured using a transmission electron microscope (TEM). As a result, it was confirmed that the sizes of the magnetic nanoparticles were 17 to 20 nm (FIG. 2A).

또한, 합성된 자성 나노입자를 동적 광산란 분석기인 제타 사이저(zeta sizer, malvern, England)를 이용하여, 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 분석하였다. 그 결과, 자성 나노입자의 입도 분포가 10nm 전후에서 형성되어 있음을 확인하였다(도 3, 붉은 선).The synthesized magnetic nanoparticles were analyzed by Dynamic Light Scattering (DLS) using a dynamic light scattering analyzer (zeta sizer, malvern, England). As a result, it was confirmed that the particle size distribution of the magnetic nanoparticles was formed around 10 nm (Fig. 3, red line).

1-2: 양쪽 1-2: Both sides 친매성Affinity 고분자의 준비 Preparation of polymer

자성 나노입자의 클러스터를 형성하기 위해서, 양쪽 친매성 고분자로서 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80)을 이용하여, 트윈 80의 하이드록시기를 카르복시기로 바꾸었다. 이는 교질 구형 집합체의 표면에 진단 및 세포분리 기능성을 부여하기 위한 준비 단계로서 EDC(Ethyl-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 이용한 표면 활성화에 필수적인 단계이다.To form clusters of magnetic nanoparticles, the hydroxy group of Tween 80 was changed to a carboxyl group by using Polysorbate 80 (Tween 80) as an amphiphilic polymer. This is an essential step for surface activation using EDC (Ethyl-dimethylaminopropyl carbodiimide) as a preparation step for imparting diagnostic and cell separation functions to the surface of the colloidal spherical aggregate.

먼저, 6g의 폴리소르베이트 80을 무수 숙신산 2g과 함께 1,4-디옥산(dioxane) 100㎖에 한 시간 동안 교반기로 녹여주었다. 연속적으로 4-디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine) 2.5g과 트리에틸아민(triethylamine) 2.5g을 반응 용기 내에 넣고 24시간 동안 지속적으로 교반하였다. 24시간 정도 경과한 후, 뿌옇게 흐려진 용액을 회전식 증발기로 용매를 급속히 증발시켜 보라색이 감도는 점성의 물질을 얻었다. 이것을 초순수 10㎖에 녹인 후, 2kDa 투석막을 이용하여 투석한 뒤 동결건조시켰다. 동결건조가 끝난 상태는 노란색을 띄는 점성의 액체로서 다음 사용을 위해 냉장보관하였다.First, 6 g of polysorbate 80 was dissolved in 100 ml of 1,4-dioxane together with 2 g of succinic anhydride for one hour with a stirrer. 2.5 g of 4-dimethylaminopyridine and 2.5 g of triethylamine were successively placed in a reaction vessel and stirred continuously for 24 hours. After about 24 hours, the cloudy solution was evaporated rapidly with a rotary evaporator to obtain a viscous substance with a purple color. This was dissolved in ultrapure water (10 ml), dialyzed using a 2 kDa dialysis membrane, and lyophilized. The lyophilized state was viscous liquid with yellow color and was refrigerated for next use.

1-2-1: 양쪽 1-2-1: Both sides 친매성Affinity 고분자의 특성 분석 Characterization of Polymers

퓨리에 변환 적외선 분광계(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)를 이용하여 하이드록시기가 카르복시기로 바뀐 것을 확인하였다. 또한, 무수 숙신산이 카르복시기로 에스테르화 되어 1730㎝-1과 1640 ㎝-1에서 특징적인 신호가 관찰되었다(도 4의 A).A Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) was used to confirm that the hydroxy group was changed to a carboxyl group. In addition, the screen is a succinic anhydride ester with a carboxyl group is a characteristic signal in 1730㎝ -1 and 1640 ㎝ -1 was observed (A of FIG. 4).

더 나아가, 1H NMR 스펙트럼을 통하여 폴리소르베이트 80의 말단이 무수 숙신산에서 카르복시기로 에스테르화 되는 과정의 전후를 측정하였으며, 그 결과 에스테르화 과정을 거친 후 2.6 ppm(H peak)에서 특징적인 신호가 관찰되는 것을 확인하였다(도 4의 C).Further, the 1 H NMR spectrum was used to measure the esterification of polysorbate 80 from the anhydrous succinic acid to the carboxyl group. As a result, a characteristic signal at 2.6 ppm (H peak) after esterification was obtained (FIG. 4C).

실시예Example 2: 자성 나노입자 클러스터의 제조 2: Preparation of magnetic nanoparticle clusters

실시예 1-1에서 건조시킨 합성된 자성 나노입자를 적당량의 클로로포름에 분산시킨 후, 외부 자기장에 의해 응집되지 않는 상층부를 취하였다. 분산액의 상층부는 20㎎의 자성 나노입자를 포함하는 것이 바람직하다. The synthesized magnetic nanoparticles dried in Example 1-1 were dispersed in an appropriate amount of chloroform, and an upper layer portion which was not aggregated by an external magnetic field was taken. The upper layer of the dispersion preferably contains 20 mg of magnetic nanoparticles.

100㎖의 초순수에 상기 분산액의 상층부와 실시예 1-2에서 준비된 양쪽 친매성 고분자의 5% 수용액 10㎖를 첨가하고, 150W 출력의 초음파를 가하여 기계식 교반기로 분당 450회 회전시켰다. 40분 내지 60분이 경과 한 뒤, 반응이 완료되어 갈색의 자성 나노입자의 클러스터 분산액을 획득하였다. The upper layer of the dispersion and 10 ml of a 5% aqueous solution of both hydrophilic polymer prepared in Example 1-2 were added to 100 ml of ultrapure water, and the resultant was subjected to ultrasonic wave with a power of 150 W and rotated at 450 revolutions per minute by a mechanical stirrer. After 40 to 60 minutes, the reaction was completed to obtain a cluster dispersion of brown magnetic nanoparticles.

제조된 자성 나노입자 클러스터를 원심분리기를 이용하여 분당 7000회의 회전으로 30분 동안 원심분리한 다음, 과량의 양쪽 친매성 고분자를 초순수로 세척하여 제거한 후, 정제된 자성 나노입자 클러스터를 회수하였다. 이러한 방법을 통하여 합성된 자성 나노입자 클러스터의 크기를 고해상투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)(도 2의 B)과 고해상주자전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)(도 2의 C)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 자성 나노입자 클러스터의 크기는 약 200nm임을 확인하였다.The prepared magnetic nanoparticle clusters were centrifuged at 7,000 revolutions per minute for 30 minutes using a centrifuge. The excess of the biocompatible polymer was removed by washing with ultrapure water, and the purified magnetic nanoparticle clusters were recovered. The size of the magnetic nanoparticle clusters synthesized through this method was measured using a high-resolution transmission electron microscope (TEM) (FIG. 2B) and a high-resolution scanning electron microscope (SEM) Respectively. As a result, it was confirmed that the size of the magnetic nanoparticle cluster was about 200 nm.

실시예Example 3:  3: 생접합(Bioconjugation)을Bioconjugation 통한 자성 나노입자 클러스터의 기능화 Functionalization of magnetic nanoparticle clusters through

3-1: 자성 나노입자 클러스터에의 항체 고정화3-1: Antibody immobilization to magnetic nanoparticle clusters

실시예 2에 따라 제조된 자성 나노입자 클러스터를 생접합 방법을 통해 화학적으로 기능화하였다. 자성 나노입자 클러스터의 표면은 카르복시기가 형성되어 있으므로, 항체에 존재하는 일차 아민과 아마이드 결합을 형성할 수 있다. The magnetic nanoparticle clusters prepared according to Example 2 were chemically functionalized by the bioadhesion method. Since the surface of the magnetic nanoparticle cluster is formed with a carboxyl group, it can form an amide bond with the primary amine present in the antibody.

먼저, 5μ㏖ 에틸-디메틸아미노프로필 카보디아미드(Ethyl-dimethylaminopropyl carbodiimide, EDC) 100㎕와 12.5μ㏖ 설포-NHS(Sulfo N-hydroxysuccinimide) 100㎕로 0.8㎎의 자성 나노입자 클러스터 표면에 있는 카르복시기를 활성화시켰다. 이때 총 반응 부피는 1㎖가 되게 하였다. 상온에서 15분간 잘 섞고, 자석으로 시료를 모은 후 상층액을 PBS 완충액 500㎕로 교환해 주었다. 그 다음 PBS 완충액 500㎕에 녹아있는 항체 0.8㎎과 섞고, 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 항체는 O 항원의 경우에는 Anti-salmonella Omnivalent 항체(ab78688, abcam)를 사용하였고, H 항원의 경우에는 Polyclonal Anti-salmonella IgG ab(Abclon)를 단백질 G 컬럼을 이용하여 정제하여 사용하였다.First, 100 μl of 5 μ mol ethyl-dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC) and 100 μl of 12.5 μ mol sulfo-N-hydroxysuccinimide were added thereto to prepare a solution containing 0.8 mg of a carboxyl group on the surface of a magnetic nanoparticle cluster Lt; / RTI > At this time, the total reaction volume was made to be 1 ml. After mixing well at room temperature for 15 minutes and collecting the samples with magnets, the supernatant was replaced with 500 μl of PBS buffer. Then, the mixture was mixed with 0.8 mg of antibody dissolved in 500 μl of PBS buffer, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. Anti-Salmonella Omnivalent antibody (ab78688, abcam) was used for the O antigen and Polyclonal Anti-salmonella IgG ab (Abclon) for the H antigen was purified using Protein G column.

자석으로 시료를 모은 후, 상층액을 PBS 완충액 1㎖로 교환해 주는 과정을 5회 반복하였다. 4℃에서 소 혈청알부민 0.25%(v/v)를 첨가하여 보관하였다.After the sample was collected with the magnet, the process of exchanging the supernatant with 1 ml of PBS buffer was repeated 5 times. 0.25% (v / v) of bovine serum albumin was added at 4 ° C and stored.

3-2: 자성 나노입자 클러스터의 기능화 정도의 측정3-2: Measurement of functionalization degree of magnetic nanoparticle cluster

표면에 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 ELISA(효소결합면역침강분석법)를 이용하여 클러스터의 기능화된 정도를 측정하였다. Magnetic nanoparticle clusters with antibody immobilized on their surface were measured for functionalization of clusters using ELISA (enzyme linked immunoassay).

즉, 0.1㎎/㎖의 자성 나노입자 클러스터 1㎖에 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 부착된 항-토끼(anti-rabbit) IgG 0.8㎍을 첨가하였다. 한 시간 동안 상온에서 잘 섞어준 후 자석으로 분리하고 상층액을 교환해주는 과정을 5회 반복하였다. 최종적으로는 상층액과 자석으로 분리된 부분의 분산액 각각에 p-니트로페닐포스페이트(p-Nitrophenyl Phosphate, pNPP) 100㎕를 적용한 뒤, 405nm에서의 흡광도를 측정하여 비교한 값으로 기능화된 정도를 나타내었다. 5분 간격으로 총 30분 측정하였을 때, 그 차이의 정도가 2.5 이상이 되면 바람직하다(도 4). That is, 0.8 ml of anti-rabbit IgG to which alkaline phosphatase was added was added to 1 ml of a 0.1 ng / ml magnetic nanoparticle cluster. After mixing well at room temperature for one hour, the magnet was separated and the supernatant was exchanged five times. Finally, 100 μl of p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP) was applied to each of the supernatant and the separated portions of the magnet, and the absorbance at 405 nm was measured, . When a total of 30 minutes is measured at intervals of 5 minutes, the degree of difference is preferably 2.5 or more (FIG. 4).

구체적으로, MNP 및 PCMNP의 자성 이력 현상 루프를 298K에서 진동 시료 자력계(vibration sample magnetometer)를 이용하여 분석하였다. 15T에서 자기 포화도는 MNP 및 PCMNC 각각에 대해서 67.7 및 68.3 emu g-1로 측정되었다. 자기 포화도는 클러스터 크기 효과가 증가함에 따라 커진다(Choi, Y. S. et al., J. Appl . Phys., 115, 17B517, 2014). FT-IR 및 NMR 스펙트럼 둘 다 PCMNC 변형과 상응하는 결과를 나타낸다. 폴리소르베이트 80의 본래 형태는 1735 cm-1에서 C=O 신축 진동 밴드를 포함하는데, 이는 변형된 형태에 있어서는 1733 cm-1로 약간 이동하였다; 이는 PCMNC 상의 음전하 트리카르복시레이트기의 존재에 의한 것이다(도 5의 A). 도 5의 B는 카르복실화된 폴리소르베이트 80의 모식도이다. PCMNC의 변형된 구조는 1H NMR 스펙트럼의 2.6 ppm에서 관찰되는 특징적인 피크로 뒷받침된다(도 5의 C). DLS 분석으로 확인된, 합성된 회전 타원체의 PCMNC의 유체역학적 크기는 40 내지 250 nm의 범위이다(도 4의 A).Specifically, the magnetic hysteresis loops of MNP and PCMNP were analyzed at 298K using a vibration sample magnetometer. At 15 T the magnetic saturation was measured at 67.7 and 68.3 emu g -1 for MNP and PCMNC, respectively. Self-saturation increases with increasing cluster size effect (Choi, YS et al., J. Appl . Phys. , 115, 17B517, 2014). Both FT-IR and NMR spectra show results corresponding to PCMNC strain. The original form of polysorbate 80 included a C = O stretching vibration band at 1735 cm -1 , which shifted slightly to 1733 cm -1 for the modified form; This is due to the presence of negatively charged tricarboxylate groups on PCMNC (FIG. 5A). FIG. 5B is a schematic diagram of carboxylated polysorbate 80. FIG. The modified structure of PCMNC is backed by a characteristic peak observed at 2.6 ppm of 1 H NMR spectrum (FIG. 5C). The hydrodynamic size of the synthesized spheroid PCMNC, identified by DLS analysis, is in the range of 40 to 250 nm (Fig. 4A).

PCMNC는 PCMNC 크기 및 분리 시간 사이의 관계, 뿐만 아니라 크기와 이론적 자기장 경도 사이의 관계에 따라, 밀집하여 자기 조립된 단일 MNP이다(도 8의 B). 분리 시간은 감소된 자기력에 따른 PCMNC의 크기 감소에 따라 기하급수적으로 증가한다. 유체학적 크기가 200 nm 보다 큰 PCMNC의 경우 (DLS 분석에 따라), 분리 시간이 10분 미만이다(도 4의 B). PCMNC의 신속한 분리를 위하여, 표류 확산 방정식을 이용하여 MNP와 폴리소르베이트 80의 상대적인 양을 조절하였다. 생물학적 기능 MNP에서, 분리 시간의 조절은 (i) 실험 과정의 시간 및 비용이 극적으로 감소하는 것, 및 (ii) 신속한 분리가 생물질의 변형을 감소시킨다는 것을 포함하여, 현저한 이점이 있다. 표류 확산 방정식 모델은 입자 수송의 물리학에 대한 통찰력을 제공하며, 항체의 분리 시스템에서의 성능을 최적화하는데 유용하다. 이 모델에서, 자기력 Fmag은 클러스터를 가지는 단일 입자에 적용될 수 있다.PCMNC is a single dense, self-assembled MNP (Fig. 8B), depending on the relationship between PCMNC size and separation time, as well as the relationship between size and theoretical magnetic field hardness. The separation time increases exponentially with decreasing size of PCMNC due to reduced magnetic force. For PCMNC with a fluidic size greater than 200 nm (according to DLS analysis), the separation time is less than 10 minutes (FIG. 4B). For the rapid separation of PCMNC, the relative amounts of MNP and polysorbate 80 were controlled using the drift diffusion equation. In biological function MNPs, the regulation of the separation time has a significant advantage, including (i) a dramatic decrease in the time and cost of the experimental procedure, and (ii) rapid separation reduces biodegradation. The drift diffusion equation model provides insight into the physics of particle transport and is useful for optimizing performance in antibody separation systems. In this model, the magnetic force F mag can be applied to a single particle having a cluster.

Figure pat00001
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여기서, dp는 단일 MNP의 직경이고, Msat는 물질의 포화 자화이고, ▽B는 외부장 경도이며, x는 자성 클러스터의 자기장이다. 자기장은 클러스터 크기의 증가에 따라 증가한다(Kelland, D. R., IEEE Trans. Magn., 34, 2123-2125, 1998). Where d p is the diameter of a single MNP, M sat is the saturation magnetization of the material, B is the external longitude hardness, and x is the magnetic field of the magnetic cluster. The magnetic field increases with increasing cluster size (Kelland, DR, IEEE Trans. Magn. , 34, 2123-2125, 1998).

Fe3O4를 가진 MNP의 경우, 포화 자화가 300 K에서 Msat = 4.69 X 105 A/m이다. 외부장 경도를 가우스미터(Gaussmeter)로 계산하였다. 자기장 경도는 다음 방정식에 적합하다(Griffiths, D. J., Introduction to Electrodynamics, 3rd ed., p576, 1999).For MNP with Fe 3 O 4 , the saturation magnetization is M sat = 4.69 × 10 5 A / m at 300 K. The external longitude hardness was calculated by Gaussmeter. The magnetic field hardness is suitable for the following equation (Griffiths, DJ, Introduction to Electrodynamics , 3rd ed., P576, 1999).

Figure pat00002
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여기서, x는 자석으로부터의 거리이고, r은 자석의 반지름이고, C는 상수이다(▽B = 15 T/m). 클러스터 모델에 적용하기 위하여, 클러스터 마다 1차 나노입자의 수(N),

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를 도입하였는데, 여기서 ka는 투영 면적 전인자이고, Aa는 응집체의 투영 면적이고, Ap는 1차 입자의 단면적이고 (πd2 p/4), αα는 투영 면적 지수이다(Brasil, A. M. et al., J. Aerosol Sci ., 30, 1379-1389, 1999). 그러므로, PCMNC의 총 자기력은 Fmag X N이다(표 1).Where x is the distance from the magnet, r is the radius of the magnet, and C is a constant (B = 15 T / m). To apply to the cluster model, the number (N) of primary nanoparticles per cluster,
Figure pat00003
Were introduced into a, where k a is the entire projected area parameters, A a is the projected area of the aggregates, A p is the cross-section and (πd 2 p / 4), α α is the projection area index of the primary particles (Brasil, AM et al., J. Aerosol Sci . , 30, 1379-1389, 1999). Therefore, the total magnetic force of PCMNC is F mag XN (Table 1).

[표 1][Table 1]

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최종적으로, PCMNC를 신속하게 분리하기 위하여, 대항되는 힘(브라운 힘; Brownian force)을 극복할 수 있을 만큼 충분히 큰 총 자기력이 필요하다. 전형적인 브라운 힘은

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으로 정의되는데, 여기서 T는 온도 (300 K)이고, kb는 볼츠만 상수이고, d는 클러스터 직경이다. 브라운 힘을 극복하기 위하여, 클러스터는 실험 결과에 따라 127 nm 보다 커야만 한다(표 1). Finally, in order to quickly separate the PCMNC, a total magnetic force large enough to overcome the brownian force is required. A typical Brown force
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, Where T is the temperature (300 K), k b is the Boltzmann constant, and d is the cluster diameter. To overcome the Brownian forces, the clusters should be greater than 127 nm depending on the experimental results (Table 1).

생접합의 정도와 분리 효율 사이의 관계를 확인하였다. 생접합의 정도는 405 nm에서의 증가하는 흡광도에 의해 측정될 수 있는 ELISA로 결정된다. 평균 흡광도 값의 차이는 PCMNC의 산란이 없는 생접합의 정도를 결정하여 계산된다. 생접합의 정도는 자성 분리에 의한 포획 효율과 관련된 것으로 확인되었다. 흡광도 값은 생접합의 정도와 분리 비율의 관계를 결정하기 위한 지표이다. 그 결과, 생접합의 정도가 2.5 또는 이상인 경우, 포획 효율이 바람직한 것을 확인할 수 있었다(도 4의 C).The relationship between the degree of bioadhesion and the separation efficiency was confirmed. The degree of bioadhesion is determined by ELISA, which can be measured by increasing absorbance at 405 nm. The difference in the average absorbance values is calculated by determining the degree of scattering free bio junction of PCMNC. The degree of bioadhesion was confirmed to be related to the capture efficiency by magnetic separation. The absorbance value is an index for determining the relationship between the degree of bio junction and the separation rate. As a result, it was confirmed that the capture efficiency was preferable when the degree of bioadhesion was 2.5 or more (FIG. 4C).

3-3: 기능화된 자성 나노입자 클러스터의 균 검출능력의 측정3-3: Measurement of bacterial detection ability of functionalized magnetic nanoparticle clusters

108cfu/㎖ 정도로 배양된 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium stock, KCCM:40253, IFO:12529) 배양액을 순차적으로 100㎕당 10, 100, 1000 cfu가 되도록 희석하였다. 0.1㎎/㎖의 기능화된 자성 나노입자 클러스터 100㎕를 상기 균 희석액과 한 시간 동안 섞어 주었다. 혼합액을 자석을 이용하여 분리한 후, 200㎕의 PBS 완충액에 분산시켰다. 분리 직후의 상층액과 분리된 부분의 재분산액을 고체배지에서 하루 동안 배양한 뒤, 분리된 균 수의 백분율을 계산하였다.The culture medium of Salmonella typhimurium stock (KCCM: 40253, IFO: 12529) cultured at about 10 8 cfu / ml was diluted sequentially to 10, 100, and 1000 cfu per 100 μl. 100 μl of 0.1 mg / ml functionalized magnetic nanoparticle clusters were mixed with the bacterial dilution for one hour. The mixed solution was separated using a magnet, and then dispersed in 200 μl of PBS buffer. The redispersion of the supernatant and the separated fraction immediately after separation were cultured in a solid medium for one day, and the percentage of the isolated bacteria was calculated.

3-4: 기능화된 자성 나노입자 클러스터와 검출된 균의 상호작용 분석3-4: Analysis of the interaction between the functionalized magnetic nanoparticle cluster and the detected bacteria

기능화된 자성 나노입자 클러스터를 이용하여 검출된 균을 박절기를 이용하여 미세절편 형태로 가공한 후 TEM으로 관찰하였다. The microorganisms detected by using the functionalized magnetic nanoparticle clusters were processed into microspheres using the periodic table and then observed by TEM.

즉, 기능화된 자성 나노입자 클러스터와 배양된 균을 혼합한 후 자석으로 분리한 부분의 재분산액을 신속히 조직고정액 약 1㎖와 혼합하였다. 조직고정액은 0.1M 인산 완충액(phosphate buffer)에 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)와 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 혼합한 것으로 사용 전 냉장 보관하였다. 고정액과 혼합된 샘플을 파라핀 블록으로 만든 후 박절기를 이용하여 미세절편 형태로 가공한 뒤 TEM으로 관찰하였다. 그 결과, 진단용 소재는 균의 편모를 특이적으로 검출하는 것이 관찰되었는데(도 6, 이는 진단용 소재와 검출된 균의 상호작용이 있음을 나타낸다.That is, the redispersion of the portion of the functionalized magnetic nanoparticle clusters and the cultured bacteria mixed with the magnet was quickly mixed with about 1 ml of the tissue fixative. The tissue fixation solution was prepared by mixing 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer and refrigerated before use. The sample mixed with the fixative was made into paraffin blocks, processed into a micro slice form using a round slope and observed with a TEM. As a result, it was observed that the diagnostic material specifically detected the flagella of the germ (Fig. 6, which indicates that there is interaction between the diagnostic material and the detected germ.

3-5: 자성 나노입자 클러스터의 기능화 및 3-5: Functionalization of magnetic nanoparticle clusters and 살모넬라 균Salmonella 분리 효율 평가 Evaluation of separation efficiency

살모넬라 분리의 효율성을 평가하기 위하여, PCMNC를 체세포(somatic) O 항원에 대한 항체(지질다당류 캡슐) 및 H 항원에 대한 항체(편모 단백질)로 기능화하였다. 도 7의 A는 항체-결합 PDMNC를 이용한 검출 방법의 개요를 나타낸 것이다. 외부 자기장에 10분 동안 노출된 PCMNC-처리된 살모넬라 클러스터는 PCMNC가 우수한 자성 특성을 가진다는 것을 나타낸다. 표적 병원체를 포획하는 생접합된 PCMNC의 능력을 확인하기 위하여, 분리 후에 플레이트에 형성된 콜로니의 수를 측정하였다. 항체-접합된 PCMNC를 S. typhimurium의 희석된 배양 배지에 1시간 동안 혼합하였다. 그 후 자기장을 이용하여 용액을 분리하고, 분리된 시료를 하루 동안 아가 플레이트에서 배양하였다. 분리된 세포를 상청액 내 세포와 비교하여, 각각의 시료의 백분율을 계산하였다(도 7의 B). 그 결과 O 항원의 99%, H 항원의 57%가 포획되었음을 확인할 수 있었다. 게다가, O 항원의 포획 효율은 10 내지 103 CFU mL-1의 S. typhimurium 범위의 농도에서 일정하였다(도 7의 B). 이는 살모넬라가 O 항체와 접합된 PCMNC에 의해 효율적으로 포획될 수 있음을 나타낸다.To evaluate the efficiency of salmonella isolation, PCMNC was functionalized with an antibody to somatic O antigen (lipopolysaccharide capsule) and an antibody against H antigen (flagella protein). FIG. 7A shows an outline of the detection method using the antibody-binding PDMNC. PCMNC-treated Salmonella clusters exposed for 10 minutes to an external magnetic field indicate that PCMNC has excellent magnetic properties. The number of colonies formed in the plate after separation was determined to confirm the ability of the bioadhesive PCMNC to capture the target pathogen. Antibody-conjugated PCMNC was mixed in a diluted culture medium of S. typhimurium for 1 hour. The solution was then separated using a magnetic field and the separated samples were incubated in agar plates for one day. Separated cells were compared to cells in the supernatant, and the percentage of each sample was calculated (Figure 7B). As a result, it was confirmed that 99% of O antigen and 57% of H antigen were captured. In addition, the capture efficiency of the O antigen was constant at concentrations ranging from 10 to 10 3 CFU mL -1 S. typhimurium (FIG. 7B). Indicating that Salmonella can be efficiently captured by PCMNC conjugated with O antibody.

PCMNC 장식된 살모넬라의 TEM 분석은 O-항체- 및 H-항체- 코팅된 PCMNC에 대한 세포 분리 효율의 차이에 근본적인 원인을 나타낸다. 살모넬라는 0.7-1.5 μm의 직경과 2-5μm의 길이를 가진 막대기꼴의 그람-음성 박테리아이다. 이는 주모성 편모를 가지는데, 이는 미생물에게 운동성(locomotion)을 부여하는 주된 요소이다; 그러나, 생존에 필수적인 성분은 아니다. 때문에 pH 및 온도의 급격한 변화와 같은 미생물이 생장하기 어려운 척박한 환경 및 자극에 노출되면 쉽게 포기될 수 있는 미생물의 구성성분이다. 다른 표적 항원을 이용하여 생접합된 PCMNC의 포획 효율을 결정하기 위하여 자기적으로 분리된 얇은 횡단면 시료 상에서 TEM 분석을 수행하였다. H-항체-코팅된 PCMNC는 편모에 축적되는 반면(도 8의 A), O-항체-코팅된 PCMNC는 살모넬라 몸체에 축적되었는데(도 8의 B), 이는 항원-항체 상호작용을 통한 두 항원 타입에 따른 공간 지역화(spatial localization)를 나타내는 것이다. O- 및 H- 항원 특이적 PCMNC가 각각 세포체의 표면 및 편모 내에 위치한 것을 확인할 수 있었다(도 8의 확대 이미지). 결과적으로, O-항원에 대한 항체를 가진 PCMNC가 H-항원에 대한 항체를 가진 클러스터 보다 높은 분리 효율을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. (i) 편모의 움직임이 항체의 H-항원에의 결합을 물리적으로 방해하여 검출을 막는 것; (ii) 항체 및 자기력과 같은, 외부 물질 또는 외부 환경의 변화에 노출되었을 때, 편모가 쉽게 세포체로부터 분리되는 것; 또는 (iii) 셀룰로오스 및 다당류와 같은 다양한 물질을 포함하는 점성의 생물막과 생접합된 PCMNC가 엉기는 것을 포함하여, 몇몇 원인들이 효율의 차이를 잠재적으로 설명할 수 있는 것으로 파악된다. 그러므로 H-항원 표적은 편모의 운동성 특성 때문에 O-항원 표적보다 덜 효율적이다. 이러한 결과를 근거로, 선택적인 O-항원 표적 PCMNC가 살모넬라의 신속하고 선택적인 포획에 큰 잠재성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.TEM analysis of PCMNC decorated Salmonella shows the root cause for differences in cell sorting efficiency for O-antibody- and H-antibody-coated PCMNC. Salmonella is a rod-shaped gram-negative bacteria with a diameter of 0.7-1.5 μm and a length of 2-5 μm. It has a main maternal flagella, which is a major contributor to microbial locomotion; However, it is not essential for survival. It is a component of microorganisms that can easily be given up if they are exposed to unfavorable environments and stimuli that are difficult to grow, such as rapid changes in pH and temperature. TEM analysis was performed on magnetically isolated thin cross-sectional samples to determine the capture efficiency of bioadhesive PCMNC using different target antigens. 8A), O-antibody-coated PCMNCs accumulated in the Salmonella body (FIG. 8B), indicating that the two antigen-antibody interactions And spatial localization according to type. O- and H-antigen-specific PCMNC were located in the surface and flagella of the cell body, respectively (enlarged image of FIG. 8). As a result, it was confirmed that PCMNC having the antibody against the O-antigen had a higher separation efficiency than the cluster having the antibody against the H-antigen. (i) the movement of the flagella physically interferes with the binding of the antibody to the H-antigen, thereby preventing detection; (ii) the flagella are easily separated from the cell body when exposed to changes in external material or external environment, such as antibodies and magnetic forces; Or (iii) PCMNC bioadhesion with a viscous biofilm comprising various materials such as cellulose and polysaccharides, may be potentially explaining differences in efficiency. H-antigen targets are therefore less efficient than O-antigen targets because of the motility properties of the flagella. Based on these results, it was confirmed that the selective O-antigen target PCMNC had a great potential for rapid and selective capture of Salmonella.

Claims (16)

항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는, 진단용 소재.
A diagnostic material comprising an antibody immobilized magnetic nanoparticle cluster.
제1항에 있어서, 혈구세포 또는 병원성 미생물 검출용인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material according to claim 1, which is for detecting blood cells or pathogenic microorganisms.
제2항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material according to claim 2, wherein the pathogenic microorganism is salmonella.
제1항에 있어서, 상기 항체는 항-살모넬라 H 항체, 항-살모넬라 O 항체, 항-CD45 항체, 및 항-적혈구 항체 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material of claim 1, wherein the antibody is at least one of an anti-Salmonella H antibody, an anti-Salmonella O antibody, an anti-CD45 antibody, and an anti-red blood cell antibody.
제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material according to claim 1, wherein the magnetic nanoparticles are iron oxide nanoparticles.
제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자 클러스터의 크기가 127 nm 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material according to claim 1, wherein the magnetic nanoparticle cluster has a size of 127 nm or more.
제1항에 있어서, 생접합(bioconjugation)의 정도가 2.5 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 소재.
The diagnostic material according to claim 1, wherein the degree of bioconjugation is 2.5 or more.
하기 단계를 포함하는 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재의 제조방법:
(a) 자성 나노입자를 합성하는 단계;
(b) 상기 합성된 자성 나노입자의 표면을 개질하고 자성 나노입자 클러스터를 형성하는 단계; 및
(c) 상기 형성된 자성 나노입자 클러스터의 표면에 항체를 고정시키는 단계.
A method for producing a diagnostic material comprising an antibody-immobilized magnetic nanoparticle cluster comprising the steps of:
(a) synthesizing magnetic nanoparticles;
(b) modifying the surface of the synthesized magnetic nanoparticles to form magnetic nanoparticle clusters; And
(c) immobilizing the antibody on the surface of the formed magnetic nanoparticle cluster.
제8항에 있어서, 상기 진단용 소재는 혈구세포 또는 병원성 미생물 검출용인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
9. The method according to claim 8, wherein the diagnostic material is for detecting blood cells or pathogenic microorganisms.
제9항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
10. The method according to claim 9, wherein the pathogenic microorganism is salmonella.
제8항에 있어서, 상기 항체는 항-살모넬라 H 항체, 항-살모넬라 O 항체, 항-CD45 항체, 및 항-적혈구 항체 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
9. The method of claim 8, wherein the antibody is at least one of an anti-Salmonella H antibody, an anti-Salmonella O antibody, an anti-CD45 antibody, and an anti-red blood cell antibody.
제8항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The manufacturing method according to claim 8, wherein the magnetic nanoparticles are iron oxide nanoparticles.
제8항에 있어서, 상기 자성 나노입자 클러스터의 크기가 127 nm 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The manufacturing method according to claim 8, wherein the magnetic nanoparticle cluster has a size of 127 nm or more.
제8항에 있어서, 생접합(bioconjugation)의 정도가 2.5 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
The method according to claim 8, wherein the degree of bioconjugation is 2.5 or more.
제8항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 합성된 자성 나노입자에 양쪽 친매성 고분자를 처리하여 표면을 개질하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
[9] The method according to claim 8, wherein the step (b) comprises modifying the surface of the magnetic nanoparticles synthesized in step (a) by treating both of the fibrinolytic polymers.
제15항에 있어서, 상기 양쪽 친매성 고분자는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는, 제조방법.16. The method according to claim 15, wherein the bi-affinity polymer is polysorbate 80.
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