KR101402390B1 - Surface-modified nanoparticles and method isolating nucleic acid using it - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체기능화된 자성 나노입자에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 생체기능화된 자성 나노입자, 이의 제조방법, 상기 자성 나노입자에 생체분자가 결합된 자성 나노복합체, 상기 자성 나노입자를 이용한 핵산의 분리방법에 관한 것이다. The present invention relates to a bio-functionalized magnetic nanoparticle, and more particularly, to a bio-functionalized magnetic nanoparticle, a method of producing the same, a magnetic nanocomposite in which a biomolecule is bonded to the magnetic nanoparticle, Separation method.
Description
본 발명은 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법에 관한 것이다.
The present invention relates to biofunctionalized magnetic nanoparticles and a method for separating nucleic acids using the same.
생물제재(DNA, RNA, 단백질, 세포) 분리는 분자 생물학 분야에 있어 필수적인 기술이다. 특히, DNA의 분리 및 정제 기술의 경우, DNA sequencing, DNA 개체증폭, DNA hybridization, DNA ligation, DNA 복제 그리고 생체검지와 같은 기술의 근간이 되는 기본 기술이며, 이러한 DNA 분리 기술을 질병 진단, 병원균 감지, 유전자 치료와 같은 분야에 적용될 수 있다. Separation of biological agents (DNA, RNA, proteins, cells) is an essential skill in molecular biology. Particularly, in the case of separation and purification of DNA, it is the basic technology that is the basis of technology such as DNA sequencing, DNA amplification, DNA hybridization, DNA ligation, DNA replication and biomolecule detection. , And gene therapy.
생체조직으로부터 DNA를 분리하기 위하여, 다양한 방법이 수행되고 있는데, 이들은 크게 액상법과 고상법으로 분류된다. 액상추출법의 경우, 원심분리, 침전, 여과와 같은 복잡한 절차를 수반함에 따라 수행하는데 있어서 많은 시간이 요구되며, 더욱이 독성이 있는 화학물질을 사용해야 하는 단점을 가지고 있다. In order to isolate DNA from living tissue, various methods have been carried out, which are largely divided into a liquid phase method and a solid phase method. In the case of the liquid extraction method, a complicated procedure such as centrifugation, sedimentation and filtration is accompanied by a great deal of time in performing the process, and further, there is a disadvantage that a toxic chemical must be used.
이러한 이유로 실리카, 유리섬유, 탄소나노튜브, 자성나노입자와 같은 고상 물질을 이용한 대체 기술이 관심을 받고 있다. 고상 매개체 중에서도 자성 나노입자는 손쉬운 조작과 경제성으로 인해 가장 큰 주목을 받아왔다. 자성 나노입자를 이용한 분리기술은 기존의 공정 방식에 비해 짧은 공정 시간과 경제성을 지니고 있어 자동화가 용이하고, 공정에 소모되는 화학물질의 양을 줄일 수 있어 물리/화학적 손상을 경감시킬 수 있는 장점을 지니고 있다.For this reason, alternative technologies using solid materials such as silica, glass fibers, carbon nanotubes, and magnetic nanoparticles are attracting attention. Among solid mediums, magnetic nanoparticles have received the greatest attention because of their easy operation and economical efficiency. The separation technology using magnetic nanoparticles has advantages such as ease of automation and reduction of amount of chemicals consumed in the process because it has a short process time and economical efficiency compared with the conventional process method, thereby reducing physical / chemical damage .
DNA가 고상 매개체 표면에 부착되는 원리는 보통 수소결합, 소수성 결합 혹은 정전기적 결합으로 설명된다. 이와 같은 결합들은 고상 매개체의 표면 상태와 밀접한 연관성을 지닌다. 이런 점에서 DNA의 부착 및 전달 효율을 높이기 위한 새로운 고상 매개체 표면 수식법에 많은 연구가 집중되고 있다. The principle that DNA attaches to the surface of solid phase media is usually explained by hydrogen bonding, hydrophobic bonding or electrostatic bonding. These associations are closely related to the surface state of the solid medium. In this regard, much research has been focused on the new method of solid medium surface modification to increase DNA attachment and transfer efficiency.
최근 진단의학에 있어서는, 질병의 조기진단과 환자의 고통 감소, 간편하고 휴대가 가능한 진단 방향으로 연구가 진행되고 있으며, 특히 핵산 분리에 있어서도 미세유로(Microfluidic channel)를 이용한 랩온어칩(lab-on-a-chip)이 개발되고 있다[비특허문헌 1]. 이에 따라 초고감도를 갖는 진단방법, 적은 샘플 양으로도 기존의 높은 진단감도를 유지할 수 있는 진단 방법 개발이 요구되고 있다. Recently, in the field of diagnostic medicine, researches are being conducted on early diagnosis of diseases, reduction of suffering of patients, and easy and portable diagnosis. Particularly, in the nucleic acid separation, a lab-on-a-chip using a microfluidic channel -a-chip) has been developed [Non-Patent Document 1]. Accordingly, it is required to develop a diagnostic method having an extremely high sensitivity and a diagnostic method capable of maintaining a high diagnostic sensitivity even with a small sample amount.
이를 위해서는 인체에 존재하는 특정 목표핵산이나 생체물질을 효율적으로 추출 분리하여 검사에 사용하는 것이 고민감도 결과를 위해 매우 중요하다.
For this purpose, it is very important to extract and isolate a specific target nucleic acid or biomaterial present in the human body and use it for the inspection in order to achieve the sensitivity result.
이에, 본 발명자들은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자 및 상기 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have developed a magnetic nanocomposite comprising a magnetic nanoparticle coated with a biocompatible amphipathic polymer and a surface modified with a carboxyl group, and a biomolecule bonded to the surface of the magnetic nanoparticle, .
따라서, 본 발명은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 자성 나노복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a magnetic nanoparticle in which a biocompatible amphipathic polymer is coated on a magnetic nanoparticle and the surface thereof is modified with a carboxyl group, a method for producing the same, and a magnetic nanocomposite comprising the same.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은As means for solving the above problems,
자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자를 제공한다.
The magnetic nanoparticle is coated with a biocompatible amphipathic polymer and the surface is modified with a carboxyl group to provide magnetic nanoparticles.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은Further, as another means for solving the above-mentioned problems,
자성 나노입자의 전구체를 환원제 및 생체친화적 양친매성 고분자를 이용하여 환원시키고, 상기 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 형성하는 단계; 및 Reducing the precursor of the magnetic nanoparticles using a reducing agent and a biocompatible amphipathic polymer to form the polymer-coated magnetic nanoparticles; And
상기 자성 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질시키는 단계Modifying the surface of the magnetic nanoparticles to a carboxyl group
를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법을 제공한다
A method for producing magnetic nanoparticles comprising the steps of:
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은Further, as another means for solving the above problems,
상기 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 제공한다.
And a biomolecule bonded to the surface of the magnetic nanoparticles.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은Further, as another means for solving the above problems,
상기 자성 나노입자로 핵산과의 흡착 및 탈착을 통하여 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
And separating the nucleic acid by adsorption and desorption of the magnetic nanoparticle with the nucleic acid.
본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자는 생체적합한 고분자로 코팅되어 있으며, 생체기능기를 포함하고 있는 유기/무기 분자에 의해 안정적으로 생체 기능화 되어 있어서 생물 제재의 효과적인 탑재가 가능할 뿐 아니라 세포 및 생체 내로 생리 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자는 질병 진단 장치, 약물 전달체 등 다양한 바이오 메디컬 분야에 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자를 이용한 핵산 분리 방법은 90% 이상의 분리 효율을 보였다.
The physiologically functionalized magnetic nanoparticles of the present invention are coated with a biocompatible polymer and are stably biofunctionalized by an organic / inorganic molecule containing a biofunctional group, so that it is possible to effectively mount a biological agent, Thereby effectively transferring the active substance. Accordingly, the bio-functionalized magnetic nanoparticles of the present invention can be utilized in various biomedical fields such as a disease diagnosis apparatus, a drug delivery system, and the like. In particular, the nucleic acid separation method using the biofunctionalized magnetic nanoparticles of the present invention showed a separation efficiency of 90% or more.
도 1은 본 발명에 따른 생체 기능성 자성나노입자에 DMSA 코팅을 푸리에 변형 적외선 분광기(Fourier Transform Infrared Spectrometer, FTIR)로 확인한 것이다[(a) 양친매성 고분자가 첨가된 열분해법으로 만든 산화철나노입자를 DMSA 코팅한 샘플, (b) 양친매성 고분자가 첨가된 열분해법으로 만든 산화철 나노입자].
도 2는 표면 수식을 가해주기 전과 후의 나노입자를 이용한 DNA 분리 실험 효율을 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지, (b) DNA 분리 효율]
도 3은 실시예 1에 따른 DMSA 표면 수식을 가해준 자성 나노입자와 시중 판매되는 DNA 분리용 나노구조체와의 DNA 분리 효율을 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지, (b) DNA 분리 효율]
도 4는 극미량의 나노입자를 이용하여 얻은 DNA 분리 효율 실험 결과로. DMSA 표면수식을 가해준 자성 나노입자와 시중 판매되는 DNA 분리용 나노구조체를 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지 (b) 나노입자의 농도에 따른 분리효율 비교 그래프]FIG. 1 shows DMSA coating on a biofunctional magnetic nanoparticle according to the present invention by Fourier Transform Infrared Spectrometer (FTIR). [(A) Iron oxide nanoparticles prepared by pyrolysis with an amphipathic polymer were dissolved in DMSA (B) iron oxide nanoparticles made by pyrolysis with an amphipathic polymer added.
FIG. 2 compares the efficiency of DNA separation experiments using nanoparticles before and after applying the surface modification. [(A) Image of DNA separated by agarose gel electrophoresis, (b) DNA separation efficiency.
FIG. 3 compares the efficiency of DNA separation between magnetic nanoparticles subjected to DMSA surface modification according to Example 1 and commercially available nanoparticles for DNA separation. [(A) Image of DNA isolated by agarose gel electrophoresis , (b) DNA isolation efficiency]
FIG. 4 shows the result of DNA separation efficiency test using trace amounts of nanoparticles. (A) Image of DNA isolated by agarose gel electrophoresis. (B) Comparison of separation efficiencies according to the concentration of nanoparticles. (A) Comparison of magnetic nanoparticles subjected to DMSA surface modification and commercially available DNA separation nanoparticles ]
본 발명은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a magnetic nanoparticle in which a biocompatible amphipathic polymer is coated on a magnetic nanoparticle and the surface of the magnetic nanoparticle is modified with a carboxyl group, and a method for producing the same.
상기 자성 나노입자(nanoparticles)는 자성을 가지고, 직경이 1nm 내지 1000nm, 바람직하게는 2nm 내지 100nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material), 또는 자성 합금(magnetic alloy)인 것이 바람직하다. 상기 금속은 특별히 제한되지는 않으나, Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 자성 합금 역시 특별히 제한되지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, CoPtAu, FePtAu, CoFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.The magnetic nanoparticles can be used without limitation as long as they are magnetic and have a diameter of 1 nm to 1000 nm, preferably 2 nm to 100 nm, but they may be metal materials, magnetic materials, (magnetic alloy). The metal is not particularly limited, but is preferably selected from the group consisting of Pt, Pd, Ag, Cu and Au. But not the magnetic substance is also not particularly limited, Co, Mn, Fe, Ni , Gd, Mo, MM '2
특히, 상기 자성 나노입자는 열분해법으로 합성된 것이 결정성이 우수하며, 10 nm 이하의 작고, 균일한 크기를 가지므로 바람직하다. 이러한 열분해법으로 합성된 자성 나노입자의 경우, 작은 크기가 나노입자의 볼륨 대비 면적이 커지는 효과를 가져왔으며, 이는 DNA 부착을 증대하는데 기여할 수 있다. Particularly, the magnetic nanoparticles synthesized by the pyrolysis method are excellent in crystallinity and are preferable because they have a small and uniform size of 10 nm or less. In the case of the magnetic nanoparticles synthesized by the pyrolysis method, the small size has an effect of increasing the volume area of the nanoparticles, which can contribute to the increase of DNA attachment.
상기 생체친화적 양친매성 고분자는 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 또는 그 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리프로필렌글리콜(PPG), 폴리옥시프로필렌(PPO) 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리 알킬(메타)아크릴레이트 및 폴리비닐 피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 소수성 영역과 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌(PEO), 폴레에테르이미드(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 친수성 영역을 포함한다.Wherein the biocompatible amphipathic polymer is selected from the group consisting of polyphosphazene, polylactide, polylactide-co-glycolide, polycaprolactone, polyanhydride, polymalic acid or derivatives thereof, polyalkylcyanoacrylate, polyhydroxy (Meth) acrylate, and polyvinylpyrrolidone, a group consisting of polybutylene glycol, butyrate, polycarbonate and polyorthoesters, polypropylene glycol (PPG), polyoxypropylene (PPO) poly-L-lysine, polyglycolide, (PEO), polyvinylpyrrolidone (PVP), and N-isopropylacrylamide (NIPAM), as well as hydrophilic regions selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyoxyethylene (PEO), polyetherimide do.
본 발명은 자성 나노입자의 전구체를 환원제 및 생체친화적 양친매성 고분자를 이용하여 환원시키고, 상기 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 형성하는 단계; 및 The present invention provides a method for preparing a magnetic nanoparticle comprising: reducing a precursor of magnetic nanoparticles using a reducing agent and a biocompatible amphipathic polymer to form magnetic nanoparticles coated with the polymer; And
상기 자성 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질시키는 단계Modifying the surface of the magnetic nanoparticles to a carboxyl group
를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.And a method for producing the magnetic nanoparticle.
본 발명에 따른 자성 나노입자를 제조하기 위하여, 우선 (a) 단계 이전에 자성금속 산화물의 전구체 및 환원제를 용매에 용해시켜 균일하게 혼합하는 단계를 수행할 수 있다. In order to prepare the magnetic nanoparticles according to the present invention, a step of uniformly mixing the precursor of the magnetic metal oxide and the reducing agent in a solvent may be performed before the step (a).
상기 자성 나노입자의 전구체로는 자성 금속 산화물의 전구체로서 금속과 -CO, -NO, -C5H5, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로 아이언펜타카르보닐(iron pentacarbonyl, Fe(CO)5), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn2(CO)10) 등의 금속 카르보닐계열의 화합물; 또는 철 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 다양한 유기금속 화합물들을 사용할 수 있다. 또한, 나노입자 전구체는 금속과 Cl 또는 NO3 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 구체적으로 삼클로로화철(FeCl3), 이클로로화철(FeCl2), 또는 철 나이트레이트 (Fe(NO3)3) 등을 사용할 수 있다.The precursor of the magnetic nanoparticles may be a metal compound in which a metal is combined with a metal, -CO, -NO, -C 5 H 5 , an alkoxide or other known ligand as a precursor of a magnetic metal oxide, Metal carbonyl-based compounds such as iron pentacarbonyl (Fe (CO) 5 ), ferrocene, or manganese carbonyl (Mn 2 (CO) 10 ); Or a metal acetylacetonate series compound such as iron acetylacetonate (Fe (acac) 3 ) can be used. The nanoparticle precursor may be a metal salt containing a metal and a metal ion combined with a known anion such as Cl or NO 3. Specific examples thereof include iron chloride (FeCl 3 ), ferric chloride (FeCl 2 ), or Iron nitrate (Fe (NO 3 ) 3 ) and the like can be used.
본 발명에서 상기 환원제는 자성 금속 산화물의 전구체를 각각 산화-환원 반응을 통해 환원시켜 자성 금속 산화물이 하나의 나노 입자로 응집될 수 있도록 도와 준다. In the present invention, the reducing agent reduces the precursor of the magnetic metal oxide through oxidation-reduction reaction, thereby helping the magnetic metal oxide to aggregate into one nanoparticle.
상기 환원제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 자성 나노입자의 전구체를 모두 환원시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 가능하다. 본 발명에서는 예를 들면, 상기 환원제로서 다이올(예: 헥사데카네디올), 폴리알코올(예: 에틸렌 글리콜, 글리세롤) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The kind of the reducing agent is not particularly limited, and any reducing agent capable of reducing all the precursors of the magnetic nanoparticles is possible without limitation. In the present invention, for example, the reducing agent may include, but is not limited to, a diol (e.g., hexadecanediol), a polyalcohol (e.g., ethylene glycol, glycerol) and the like.
상기 환원제의 함량은 특별히 한정되지 않고, 상기 자성 금속 산화물의 전구체를 모두 환원시킬 수 있는 함량 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다. The content of the reducing agent is not particularly limited and may be appropriately selected within a range capable of reducing all the precursors of the magnetic metal oxide.
상기 용매는 특별히 한정되지 않고, 자성 금속 산화물의 전구체 및 환원제를 용해시킬 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하다. 본 발명에서는 탄소수 1 내지 12의 알킬기를 가지는 알킬에테르, 탄소수 6 내지 18의 아릴기를 가지는 아릴에테르, 탄소수 7 내지 21의 아랄킬에테르 또는 탄소수 2 내지 12의 알케닐기를 가지는 알케닐에테르 등을 사용할 수 있다. The solvent is not particularly limited, and any solvent can be used as long as it can dissolve the precursor of the magnetic metal oxide and the reducing agent. In the present invention, an alkyl ether having an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, an aryl ether having an aryl group having 6 to 18 carbon atoms, an aralkyl ether having 7 to 21 carbon atoms, or an alkenyl ether having an alkenyl group having 2 to 12 carbon atoms have.
상기 용매의 함량은 특별히 한정되지 않고, 상기 자성 금속 산화물의 전구체 및 환원제를 모두 용해시킬 수 있는 함량 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다. The content of the solvent is not particularly limited and may be suitably selected within the range of content capable of dissolving both the precursor of the magnetic metal oxide and the reducing agent.
본 발명의 자성 나노입자의 제조방법은 상기와 같이, 혼합 용액을 제조한 후, 자성 금속 산화물의 전구체를 환원시키는 단계를 수행할 수 있다. 상기 혼합 용액에 포함된 전구체 성분 및 환원제는 산화-환원 반응을 통해 환원제는 산화되고, 상기 각각의 전구체 성분들은 자성 금속 산화물로 각각 환원될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 상기 환원시키는 단계는 상기 혼합 용액을 220℃ 내지 300℃로 가열하고, 상기 온도에서 1 시간 내지 2 시간 동안 유지시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 환원 단계에서 가열 온도가 220℃ 미만이면, 전구체 성분과 환원제의 산화-환원 반응이 미미할 우려가 있고, 300℃를 초과하면, 나노입자의 응집 현상이 발생할 우려가 있다. 또한, 상기 가열 온도의 유지 시간을 상기와 같이 조절함으로써, 각각의 전구체 성분의 환원이 원활히 이루어질 수 있도록 할 수 있다. The method of manufacturing the magnetic nanoparticles of the present invention may include a step of reducing the precursor of the magnetic metal oxide after preparing the mixed solution as described above. The reducing agent may be oxidized through the oxidation-reduction reaction of the precursor component and the reducing agent contained in the mixed solution, and the respective precursor components may be reduced to the magnetic metal oxide, respectively. Specifically, in the present invention, the reducing step may be performed by heating the mixed solution to 220 to 300 캜 and holding the mixed solution at the above temperature for 1 to 2 hours. If the heating temperature is lower than 220 deg. C in the reducing step, the oxidation-reduction reaction of the precursor component and the reducing agent may be insignificant. If the heating temperature exceeds 300 deg. C, agglomeration of nanoparticles may occur. In addition, by adjusting the holding time of the heating temperature as described above, it is possible to smoothly reduce the respective precursor components.
본 발명의 자성 나노입자의 제조 방법은 혼합 용액에 포함된 각각의 전구체 성분을 자성 금속 산화물로 환원시키고, 이를 냉각시켜 자성 나노입자를 형성하는 단계를 수행할 수 있다. The method of producing magnetic nanoparticles of the present invention can reduce the precursor components contained in the mixed solution to magnetic metal oxides and cool them to form magnetic nanoparticles.
상기와 같이, 각각의 전구체 성분을 자성금속 산화물이 서로 응집되면서 나노 크기의 입자를 형성할 수 있다. 본 발명에서 상기 냉각 온도는 특별히 한정되지 않고, 상기 나노 크기의 입자가 형성될 수 있는 온도라면 제한이 없지만, 바람직하게는 상온으로 냉각시킬 수 있다. 본 발명에서 상기 혼합 용액을 냉각시키는 방법은 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 수단이라면 제한 없이 사용할 수 있다. As described above, nano-sized particles can be formed while the magnetic metal oxides coalesce with each other in the respective precursor components. In the present invention, the cooling temperature is not particularly limited and may be any temperature at which the nano-sized particles can be formed, but it may be cooled to room temperature, preferably. The method of cooling the mixed solution in the present invention is not particularly limited, and any means that can be used in this field can be used without limitation.
본 발명의 자성 나노입자의 제조 방법은 상기 (a) 단계 이후, 원심 분리 및 자성분리를 이용하여 (a) 단계에서 형성된 자성 나노입자를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (a) 단계 이후, 무수 에탄올(anhydrous ethanol)을 상기 자성 나노입자에 첨가하고, 원심 분리 및 자성 분리를 수행함으로써, 전구체 성분 및 환원제의 잔여물을 제거하고, 자성 나노입자만을 분리할 수 있다. The method of manufacturing a magnetic nanoparticle of the present invention may further include, after the step (a), washing the magnetic nanoparticles formed in step (a) using centrifugation and magnetic separation. Specifically, after step (a), anhydrous ethanol is added to the magnetic nanoparticles, centrifugal separation and magnetic separation are performed to remove the precursor component and reductant residue, and only the magnetic nanoparticles are separated can do.
다음으로, 상기 분리된 자성 나노입자를 카르복실기로 표면을 개질하는 단계로서, 구체적으로 DMSA(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid) 또는 N-(포스포노메틸)이미노디아세틱에시드 하이드레이트(N-(Phosphonomethyl)iminodiacetic acid hydrate)로 표면 코팅한다. 이때, DMSA 코팅 시 DMSO를 에탄올에 분산시킴으로써 기존 헥산을 사용하여 DMSO를 코팅시키는 것보다 핵산 부착 효율을 증가시킬 수 있다. 이는 DMSA가 보통 DMSO에 잘 용해되며, DMSO가 에탄올에 잘 섞이는 점을 이용하였다. 또한, DMSA는 티올기에 의하여 탈수소화 반응을 통하여 단단히 결합하게 되므로, 다른 물질에 비해 더 많은 카르복실기가 표면에 존재할 수 있어 부착 효율이 증가될 수 있다.Next, the step of modifying the surface of the separated magnetic nanoparticles with a carboxyl group, specifically, a step of modifying the surface of the magnetic nanoparticles with DMSA (meso-2,3-dimercaptosuccinic acid) or N- (phosphonomethyl) iminodiacetic acid hydrate (N- Phosphonomethyl) iminodiacetic acid hydrate. In this case, when DMSA is coated, DMSO may be dispersed in ethanol, which may increase the efficiency of nucleic acid attachment, rather than coating DMSO with conventional hexane. This is because DMSA is usually soluble in DMSO and DMSO is well mixed in ethanol. In addition, DMSA binds tightly through the dehydrogenation reaction by the thiol group, so that more carboxyl groups can be present on the surface than other substances, and the adhesion efficiency can be increased.
이렇게 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자는 생체 분자와 결합이 가능하다.The magnetic nanoparticles surface-modified with a carboxyl group can bind with biomolecules.
본 발명은 또한, 상기 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 포함한다.The present invention also includes a magnetic nanocomposite comprising a biomolecule bound to the surface of the magnetic nanoparticle surface-modified with the carboxyl group.
상기 생체 분자는 항원, 항체, 핵산, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. The biomolecule may be an antigen, an antibody, a nucleic acid, a hapten, an avidin, a streptavidin, a neutravidin, a protein A, a protein G, a lectin, a selectin, But is not limited to, at least one selected from the group consisting of isotope labeled components and substances capable of specifically binding to tumor markers.
특히, 상기 생체 분자 중 핵산의 경우에는 혈액, 조직, plant, 배양된 동물세포, 박테리아, 파지, 바이러스에서 얻은 모든 핵산(genomic DNA 와 RNA)을 포함할 수 있으며, 박테리아에서 얻은 모든 플라스미드 DNA, PCR을 통해 증폭한 모든 PCR 산물을 포함할 수 있다.Particularly, in the case of nucleic acid in the biomolecules, it may include all nucleic acids (genomic DNA and RNA) obtained from blood, tissue, plant, cultured animal cell, bacteria, phage and virus, and all plasmid DNA obtained from bacteria, PCR Lt; RTI ID = 0.0 > PCR < / RTI >
본 발명은 또한, 상기 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자로 핵산과의 흡착 및 탈착을 통하여 핵산을 분리하는 방법을 포함한다.The present invention also includes a method for separating nucleic acids by adsorption and desorption of the magnetic nanoparticles surface-modified with the carboxyl group with a nucleic acid.
카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자로의 핵산의 흡착과 탈착 기술의 원리는 다음과 같다. The principles of adsorption and desorption of nucleic acids onto magnetic nanoparticles surface-modified with carboxyl groups are as follows.
핵산은 바인딩버퍼(5 내지 20 wt% polyethylene glycol과 1 내지 5M NaCl)에 의해 침전이 되는데, 이때 NaCl은 salting out 효과를 나타나게 해주고, 폴리에틸렌글리콜은 핵산의 나노입자로의 흡착 효율을 증가시킨다. 바인딩 버퍼를 섞은 핵산에 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자를 넣어 줌으로써 핵산과 나노입자의 카르복실기 사이에 수소결합을 유도하여 핵산이 나노입자에 흡착이 된다. 세척을 통해 폴리에틸렌글리과 NaCl이 제거되며, 자성 나노입자를 상온에서 1 내지 10분간 말려준 후 중성의 TE 버퍼(Tris-HCl, EDTA)를 넣어주는데, 이때 카르복실기가 COO- 상태가 되므로 음전하를 띄게 되어 동일한 음전하를 갖는 핵산을 미뤄내게 되며, 또한 낮은 염 농도의 TE 버퍼에서는 DNA가 물로의 친화도가 증가한다. 따라서 같은 전하끼리의 반발력과 DNA의 물 친화도 증가로 인해 DNA가 나노입자로부터 분리된다. 그리고 바인딩버퍼, 세척액, TE 버퍼로부터 자성 나노입자의 분리는 자석을 이용하여 나노입자를 한곳으로 모이게 함으로서 쉽게 상층액을 제거할 수 있다.
The nucleic acid is precipitated by binding buffer (5 to 20 wt% polyethylene glycol and 1 to 5 M NaCl), which causes the salting out effect, and polyethylene glycol increases the adsorption efficiency of the nucleic acid to the nanoparticles. By adding magnetic nanoparticles surface-modified with a carboxyl group to a nucleic acid containing a binding buffer, the nucleic acid is adsorbed on the nanoparticles by inducing a hydrogen bond between the nucleic acid and the carboxyl group of the nanoparticle. The polyethylene glycol and NaCl are removed by washing. The magnetic nanoparticles are dried at room temperature for 1 to 10 minutes, and then a neutral TE buffer (Tris-HCl, EDTA) is added. At this time, the carboxyl group becomes COO- And the affinity of the DNA to water increases in the TE buffer of low salt concentration. Therefore, the DNA is separated from the nanoparticles due to the repulsive force between the same charges and the water affinity of the DNA. Separation of the magnetic nanoparticles from the binding buffer, the washing solution and the TE buffer can easily remove the supernatant by collecting the nanoparticles into one place using a magnet.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1: One: DMSADMSA 가 코팅된Coated 자성 나노입자 합성Magnetic nanoparticle synthesis
마그네타이트(Fe3O4) 나노입자의 합성은 변형된 폴리올 방법을 통해 수행되었다. Synthesis of magnetite (Fe 3 O 4 ) nanoparticles was carried out through a modified polyol process.
전구체인 철 아세틸아세토네이트(iron acetylacetonate,Fe(acac)3, 0.1766 g), 환원제인 1,2-헥사데카네디올(hexadecanediol, 0.6468 g), 계면활성제로 poly(enthylene oxide)-block-poly (propylene oxide)-block-poly(ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO) 또는 poly(ethylene glycol)-poly(propylene glycol)-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) (0.4~1.2 g)를 사용하였다. 상기 화학 재료들을 디옥틸에테르(Wako사(제)) (10~15 ㎖)에 넣어서 섞은 후, 섞은 용액을 자기 스터어링을 유지한 채로 240 ~ 300℃까지 가열시켰다. 그리고 반응 용액을 상온까지 냉각시킨 후, 에탄올을 추가한 후 원심분리기를 이용해서 세척과정을 행하였다. 그 후 외부의 자기장을 이용한 추출 과정을 통해 양친매성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 얻었다. Precursor of iron acetylacetonate (iron acetylacetonate, Fe (acac) 3, 0.1766 g), the reducing agent is 1,2-hexamethylene diol big four (hexadecanediol, 0.6468 g), as a surface active agent poly (enthylene oxide) -block-poly ( propylene oxide-block-poly (ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO) or poly (ethylene glycol) -poly (ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) Respectively. The chemical materials were mixed in dioctyl ether (Wako Co., Ltd.) (10 to 15 ml), and the mixed solution was heated to 240 to 300 ° C while maintaining magnetic stirrering. After the reaction solution was cooled to room temperature, ethanol was added thereto, followed by washing using a centrifuge. After that, magnetic nanoparticles coated with amphipathic polymer were obtained through an extraction process using an external magnetic field.
자성 나노입자의 표면 처리는 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 안의 DMSA(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid)를 나노입자 에멀젼에 추가함으로 이루어진다. 구체적으로, DMSA를 50 mM의 농도로 DMSO에 용해시킨 용액 중 20 ml를 취하였다. 그 뒤 Fe3O4 나노입자를 20 mM의 농도로 에탄올에 분산시킨 용액 중 10 ml를 추출하여 20 ml의 DMSA/DMSO 용액과 섞어주었다. 이후 혼합용액을 수조 상에서 3시간 이상 초음파 처리하였다. 이때 수조의 온도는 4℃로 유지시켰다. 초음파 처리가 끝난 뒤, 2~3 차례 에탄올과 원심분리기를 이용한 세척과정을 통해 잔여물을 제거해주었다. 최종적으로 석출된 나노입자들은 에탄올 혹은 증류수에 분산시켜 보관하였다. 이 자성 나노입자는 고해상도투과전자현미경(HRTEM)을 포함한 전자현미경(TEM)과 제타 전위 측정기(zeta potential) 측정, 진동 시료형 자성 측정계(vibrating sample magnetometer, VSM), 푸리에 변형 적외선 분광기(Fourier transformation infrared spectroscopy, FTIR)에 의해서 분석될 수 있다.
Surface treatment of magnetic nanoparticles consists of adding meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA) in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the nanoparticle emulsion. Specifically, 20 ml of a solution in which DMSA was dissolved in DMSO at a concentration of 50 mM was taken. Then, 10 ml of Fe 3 O 4 nanoparticles dispersed in ethanol at a concentration of 20 mM was extracted and mixed with 20 ml of DMSA / DMSO solution. Then, the mixed solution was ultrasonicated for 3 hours or more on a water bath. At this time, the temperature of the water tank was maintained at 4 캜. After the ultrasonic treatment, the residue was removed by washing with ethanol and centrifuge two to three times. Finally, the precipitated nanoparticles were dispersed in ethanol or distilled water. These magnetic nanoparticles were characterized by electron microscopy (TEM), zeta potential measurement including high resolution transmission electron microscopy (HRTEM), vibrating sample magnetometer (VSM), Fourier transformation infrared spectroscopy, FTIR).
실시예Example 2: 자성 나노입자의 2: Magnetic nanoparticles DNADNA 의 흡·탈착 방법 Absorption / desorption method of
자성 나노입자의 DNA의 흡·탈착 효율을 확인하기 위해 DMSA 코팅된 자성 입자를 이용하여 DNA 흡·탈착 실험을 수행하였다.To confirm the adsorption / desorption efficiency of DNA of magnetic nanoparticles, DNA adsorption / desorption experiments were carried out using DMSA coated magnetic particles.
핵산의 흡·탈착 실험에 사용할DNA source로는 모든 종류의 PCR 산물이 가능하며, 본 흡·탈착 실험에서 사용한 PCR 산물은 invitrogen사의 topo TA cloning kit의 control DNA와 control 프라이머를 이용하여 kit의 매뉴얼에 따라 증폭한 700 bp의 PCR 산물을 사용하였다. 15 ㎕의 PCR 산물(1 ㎍ DNA)를 15 ㎕의 바인딩 버퍼(18.2 wt% polyethylene glycol 8000 (시그마), 4M NaCl (시그마))와 섞어 준 후, 250 ㎍의 자성 나노입자를 넣고 상온에서 10분간 반응시켰다. 자석을 이용하여 DNA가 흡착된 자성 입자를 분리하고, 상층액을 제거 후 분리된 자성 입자에 세척액(70% 에탄올 - 30% 3차 증류수) 200 ㎕ 넣어 세척하였다. 이러한 세척을 2회 수행 후 자석을 이용 자성 입자를 분리하여 세척액을 제거하였고, 자성 입자를 상온에서 3분간 말려주었다. 여기에 30 ㎕의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.8)를 넣고 50℃에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 자성 입자를 분리하고 DNA가 탈착된 TE 버퍼를 회수하여 흡·탈착 효율을 분석하였다.
The PCR products used in this adsorption / desorption experiment can be obtained by using the control DNA of the topo TA cloning kit of Invitrogen and the control primer according to the manual of the kit. The amplified 700 bp PCR product was used. After mixing 15 μl of the PCR product (1 μg DNA) with 15 μl of binding buffer (18.2 wt% polyethylene glycol 8000 (Sigma), 4M NaCl (Sigma)), 250 μg of magnetic nanoparticles were added and incubated at room temperature for 10 minutes Lt; / RTI > The magnetic particles adsorbed DNA were separated using a magnet, and the supernatant was removed. Then, 200 μl of a washing solution (70% ethanol-30% tertiary distilled water) was added to the separated magnetic particles and washed. After washing twice, the magnetic particles were separated by using a magnet to remove the washing solution, and the magnetic particles were dried at room temperature for 3 minutes. Thereto was added 30 占 퐇 of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.8) and incubated at 50 占 폚 for 10 minutes. The magnetic particles were separated using a magnet and the TE buffer desorbed from the DNA was collected to analyze the adsorption / desorption efficiency.
실시예Example 3: 3: DNADNA 의 흡·탈착 효율 분석 Absorption / desorption efficiency analysis
DNA의 흡·탈착 효율 분석은 아가로스 겔 전기영동 후 DNA 밴드 분석과, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용한 흡광도 측정을 통해 분석하였다. 아가로스 겔 전기영동 분석은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 1 L 당 0.5 mg이 첨가된 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 150 V에서 15분간 전기영동 후 겔 이미지 시스템(Molecular Imager ChemicDocTM XRS Imaging system (Bio Rad laboratories))을 이용하여 DNA 밴드를 가시화 하였고 Quantity One software(Bio Rad laboratories)를 이용하여 DNA 정량 분석하였다. 흡광도 측정은 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 통해 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 DNA 정량 분석하였다.
DNA adsorption / desorption efficiency was analyzed by DNA band analysis after agarose gel electrophoresis and absorbance measurement using a spectrophotometer. Agarose gel electrophoresis analysis was carried out using a 1.5% agarose gel to which 0.5 mg of ethidium bromide was added per liter, and then electrophoresis at 150 V for 15 minutes. The gel image system (Molecular Imager ChemicDocTM XRS Imaging system The DNA band was visualized using Bio Rad Laboratories) and analyzed quantitatively using Quantity One software (Bio Rad Laboratories). The absorbance was quantified by measuring the absorbance at 260 nm and 280 nm using a
실시예Example 4: 4: DMSADMSA 코팅된 자성 나노입자의 Of coated magnetic nanoparticles DNADNA 흡·탈착 효율 분석 Adsorption / desorption efficiency analysis
상기 실시예 1에 따라 제작된 DMSA 코팅된 자성 나노입자의 DNA 흡·탈착 효율을 확인하기 위해 코팅하지 않은 자성 입자의 DNA 흡·탈착 효율과 비교하였다. To confirm the DNA adsorption / desorption efficiency of the DMSA coated magnetic nanoparticles prepared according to Example 1, the efficiency of DNA adsorption / desorption of uncoated magnetic particles was compared.
DNA 흡·탈착 실험은 상기 실시예 2에 따라 수행하였고, 단 자성 나노입자는 DMSA 코팅한 것과 코팅하지 않은 것을 각각 사용하여 실시하였다. 분석은 상기 실시예 3에 따라 수행하였으며, 아가로스 겔 전기영동 시 Input DNA는 30 ㎕의 볼륨에 1 ㎍ PCR 산물이 되도록 한 것으로 흡,탈착이 100 %인 경우를 보여주는 대조군이며, 각 탈착된 DNA가 녹아있는 샘플과 대조군을 각각 4 ㎕씩 아가로스 겔에 로딩하여 분석하였다. 또한, 각 탈착된 DNA는 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 이용하여 정량분석을 하였다. DNA adsorption / desorption experiments were carried out in accordance with Example 2, except that the magnetic nanoparticles were DMSA coated and uncoated, respectively. The analysis was carried out according to the above Example 3. In the agarose gel electrophoresis, the input DNA was set to be 1 μg PCR product in a volume of 30 μl, which was a control group showing 100% absorption and desorption, and each desaturated DNA And the control group were loaded on agarose gel by 4 쨉 l each. Each desorbed DNA was quantitatively analyzed using a
도 2 (a)의 아가로스 겔 전기영동 분석 결과와, (b) 의 DNA 흡·탈착 효율을 정량화한 결과를 보면, DMSA 코팅한 자성 입자의 경우 DNA 흡·탈착 효율(93%)이 코팅하지 않은 자성 입자의 효율(21%)에 비해 상당히 증가함을 보여준다.
As a result of quantitative analysis of the agarose gel electrophoresis analysis of FIG. 2 (a) and the DNA adsorption / desorption efficiency of (b), the DNA adsorption / desorption efficiency (93%) of DMSA coated magnetic particles was not coated Compared to the efficiency of the non-magnetic particles (21%).
실시예Example 5: 상용화 비드( 5: Commercialized beads ( NucliSENSNucliSENS easyeasy MAGMAG MagneticMagnetic SilicaSilica )와의 분리 효율 비교)
DMSA 코팅된 자성 입자의 DNA 흡·탈착 효율을 기존에 시판되고 있는 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica (BIOMERIEUX))와 비교하였다. The efficiency of DNA adsorption / desorption of DMSA coated magnetic particles was compared with commercially available commercialized beads (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica (BIOMERIEUX)).
NucliSENS easy MAG Magnetic Silica를 이용한 실험은 상기 실시예 2에서 사용한 동일한 PCR 산물을 DNA source로 이용하였고, DNA easy MAG system 방법에 따라 수행하였다. 15 ㎕의 PCR 산물(1 ㎍ DNA)를 150 ㎕의 easy MAG lysis buffer(BIOMERIEUX)와 섞은 후 NucliSENS easy MAG Magnetic Silica를 250 ㎍를 넣고 상온에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 Magnetic Silica를 분리 후 상층액을 제거하고, 500 ㎕의 easyMAG Extraction buffer 1 (BIOMERIEUX)에 1회 세척하였다. 세척액을 제거 후 다시 500 ㎕의 easyMAG Extraction buffer 2(BIOMERIEUX)를 이용 세척하였다. 자석을 이용 자성 실리카(Magnetic Silica)를 분리 후 세척액을 제거하고 Extraction buffer 3(BIOMERIEUX)을 30 ㎕ 넣고 50℃에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 자성 입자를 분리하고 DNA가 탈착된 Extraction buffer 3을 회수하여 흡·탈착 효율을 분석하였다. DMSA 코팅된 자성 나노입자의 DNA 흡·탈착 실험은 상기 실시예 2와 동일하게 수행하였다. 분석은 상기 실시예 3에 따라 분석하였는데, 아가로스 겔 전기영동 시 로딩 DNA 용액의 부피는 4 ㎕와 2 ㎕로 하였으며, 대조군으로 30 ㎕의 부피에 1 ㎍ PCR 산물을 녹인 샘플을 이용하였다. The experiment using NucliSENS easy MAG Magnetic Silica was carried out using the same PCR product used in Example 2 as a DNA source and a DNA easy MAG system. 15 μl of the PCR product (1 μg DNA) was mixed with 150 μl of easy MAG lysis buffer (BIOMERIEUX), and 250 μg of NucliSENS easy MAG Magnetic Silica was added and incubated at room temperature for 10 minutes. After separating the magnetic silica using a magnet, the supernatant was removed and washed once with 500 μl of easyMAG Extraction buffer 1 (BIOMERIEUX). After removing the washing solution, they were washed again with 500 μl of easyMAG Extraction buffer 2 (BIOMERIEUX). After separating the magnetic silica from the magnet, the washing solution was removed and 30 μl of Extraction buffer 3 (BIOMERIEUX) was added and incubated at 50 ° C. for 10 minutes. The magnetic particles were separated by using a magnet, and the
도 2에서 (a)의 아가로스 겔 전기영동 분석 사진과, (b)의 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 이용한 정량 분석 결과 상용화 비드(NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 경우 75% 정도의 효율을 보이는 반면, DMSA 첨가된 자성 나노입자의 경우 91%의 높은 DNA 흡·탈착 효율을 보여주고 있다.
As a result of quantitative analysis using the agarose gel electrophoresis analysis of FIG. 2 (a) and the
실시예Example 6: 극미량의 6: Extremely low DMSADMSA 코팅 자성 입자와 상용화 비드( Coated magnetic particles and compatibilizing beads ( NucliSENSNucliSENS easyeasy MAGMAG Magnetic Magnetic SilicaSilica )를 이용한 ) DNADNA 흡· Absorption 탈착Desorption 효율 비교 Comparison of efficiency
극미량의 입자를 이용하였을 시 DMSA 코팅 자성 나노입자와 상용화 비드(NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 DNA 흡·탈착 효율 비교 실험을 수행하였다. A comparison of DNA adsorption / desorption efficiencies of DMSA coated magnetic nanoparticles and commercialization beads (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica) was performed when using very small amount of particles.
DMSA 코팅 자성 입자를 이용한 실험은 상기 실시예 2와 동일하고, 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)를 이용한 실험은 상기 실시예 5와 동일하다. 단, DNA 결합 시 사용된 입자의 최종 농도는 0.04 ㎍/㎕, 0.08 ㎍/㎕, 0.16 ㎍/㎕, 0.32 ㎍/㎕, 0.64 ㎍/㎕, 1.28 ㎍/㎕이다.Experiments using DMSA coated magnetic particles were the same as in Example 2, and experiments using commercialized beads (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica) were the same as in Example 5 above. However, the final concentrations of the particles used in DNA binding are 0.04 / /,, 0.08 / /,, 0.16 / /,, 0.32 / /,, 0.64 / /, and 1.28 / / ㎕.
도 4의 (a) 아가로스 겔 전기영동 결과와, (b) NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)을 통한 정량분석을 이용하여 계산된 DNA 흡·탈착 효율 그래프를 보면, 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 경우 0.2 ㎍/㎕ 이하의 농도에서는 DNA 흡·탈착이 보여 지지 않는 반면, DMSA 코팅 자성 입자의 경우 0.2 ㎍/㎕ 이하의 극미량에서 50 % 내외의 효율로 DNA 흡·탈착이 확인되었다.The DNA adsorption / desorption efficiency graphs calculated using the agarose gel electrophoresis results of FIG. 4 (a) and (b) quantitative analysis using the
Claims (10)
폴리프로필렌글리콜(PPG) 및 폴리옥시프로필렌(PPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 소수성 영역과 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 폴리옥시에틸렌(PEO)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 친수성 영역을 포함하는 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고,
표면이 메소-2,3-디디머캅토숙시니산(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid, DMSA)로 코팅된 핵산 분리용 자성 나노입자.
In magnetic nanoparticles,
A biocompatible amphipathic polymer comprising a hydrophilic region selected from the group consisting of polypropylene glycol (PPG) and polyoxypropylene (PPO) and a hydrophilic region selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG) and polyoxyethylene (PEO) Coated,
Wherein the surface is coated with meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA).
상기 자성 나노입자는 열분해법으로 합성된 자성 나노입자.
The method according to claim 1,
The magnetic nanoparticles are synthesized by pyrolysis.
상기 자성 나노입자의 표면을 메소-2,3-디머캅토숙시니산(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid, DMSA)로 개질시키는 단계
를 포함하는 청구항 1의 자성 나노입자의 제조방법
Reducing the precursor of the magnetic nanoparticles using a reducing agent and a biocompatible amphipathic polymer to form the polymer-coated magnetic nanoparticles; And
Modifying the surface of the magnetic nanoparticles with meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA)
The method of producing magnetic nanoparticles of claim 1, comprising
자성 금속 산화물의 전구체는 금속 카르보닐계열의 화합물; 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 또는 금속염인 자성 나노입자의 제조방법.
5. The method of claim 4,
The precursor of the magnetic metal oxide is a compound of a metal carbonyl series; A method for producing magnetic nanoparticles, which is a metal acetylacetonate-based compound or a metal salt.
환원제는 다이올 또는 폴리알코올인 자성 나노입자의 제조방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the reducing agent is a diol or a polyalcohol.
A magnetic nanocomposite comprising a nucleic acid bound to the surface of the magnetic nanoparticle of claim 1.
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| Philosophical Transactions of The Royal Society A, Vol. 368, Pages 1333-1383(공개일: 2010. 2. 15.). * |
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