KR20180068982A - 혈관신생 인자에 대한 매우 강력한 모노클로날 항체 - Google Patents

혈관신생 인자에 대한 매우 강력한 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 안지오포이에틴 2(Ang-2)에 대한 중화 모노클로날 항체, 이를 포함하는 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

혈관신생 인자에 대한 매우 강력한 모노클로날 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전체 내용이 본원에 참조로서 포함되는 2015년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/218,226호에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 새로운 생물제제를 개발하기 위한 모노클로날 항체(mAb) 및 재조합 DNA 기술의 조합에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 또는 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2)에 결합하여 이를 중화시키는 모노클로날 항체의 생성에 관한 것이다.
혈관신생은 기존 혈관구조로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생은 정상 발달 및 조직 재생에 필요할 뿐만 아니라, 종양에 산소 및 영양소를 공급하기 위해 2-3 mm 크기를 넘어서는 종양의 성장에도 필요하다(문헌[N. Vasudev et al., Angiogenesis 17:471-494, 2014]에 개관됨). 따라서, 혈관신생의 억제가 종양 성장을 억제할 수 있다고 제안되었다(J. Folkman, N Eng J Med 285:1182-1186, 1971). 또한, 비정상적인 혈관신생은 연령-관련 황반 변성, 당뇨망막병증 및 류마티스 관절염을 포함하는 다른 병리 질환과 관련된다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유모세포 성장 인자 1 및 2(FGF1 및 FGF2), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 태반 성장 인자(PGF 또는 PIGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 안지오포이에틴 1 및 2(Ang-1 및 Ang-2), 및 간세포 성장 인자(HGF)를 포함하는 많은 수의 세포 인자가 혈관신생을 촉진한다(문헌[R. Gacche et al., Prog Biophys Mol Biol 113:333-354, 2013]에 개관됨). VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D로 구성된 동종 성장 인자의 VEGF 계열은 내피 세포 증식, 이동 및 관 형성을 매개함으로써 중요한 역할을 한다(문헌[T. Veikkola et al., Semin Cancer Biol 9: 211-220, 1999]에 개관됨). 이들 중, VEGF-A가 가장 잘 연구되어 있고, 정상 및 신생물 혈관신생에서 중요한 역할을 하며; 문자 식별자가 없는 VEGF는 본원에서 VEGF-A를 의미한다.
VEGF(즉, VEGF-A)는 2개의 동일한 23 kDa 단량체로 구성된 동종이량체 당단백질이다. VEGF121, VEGF165, VEGF189, 및 VEGF206을 포함하는 인간 VEGF의 여러 대안적으로 스플라이싱된 아이소형(isoform)이 존재한다(N. Ferrara et al. Nature Med 9:669-676, 2003). 이들 중, VEGF165가 가장 풍부하고, 분열촉진 아이소형이며, 23 kDa 서브유닛에 해당한다. VEGF189 및 VEGF206은 헤파린에 결합하고, 따라서 세포외 기질에 결합하며; VEGF165는 확산 가능하다(문헌[Q.T. Ho et al., Int J Biochem Cell Biol 39:1349-1357, 2007]에 개관된 VEGF의 구조 및 생물학). VEGF 계열 구성원은 VEGFR1(Flt-1), VEGFR2(Flk-1; KDR) 및 VEGFR3의 3개의 티로신 키나제 세포 수용체에 결합하며, VEGF-A는 주로 VEGFR2를 통해 신호전달하고(문헌[C. Fontanella et al., Ann Transl Med 2:123, 2014]에 개관됨), 따라서 VEGFR2는 본원에서 VEGFR로도 언급될 것이다. VEGFR2에 대한 VEGF의 결합은 수용체 이량체화, 자가인산화, 및 MEK-MAP 및 PI3K-AKT 신호전달 경로의 활성화를 유도하여, 세포 증식 및 내피 세포 생존을 유발한다.
VEGF는 종양에서 혈관신생의 주요 조종자이므로, VEGF의 억제제는 암을 치료할 잠재성을 갖는다. 인간 VEGF에 대한 모노클로날 항체(mAb)는 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하는데 효과적이었다(K.J. Kim et al., Nature 362:841-844, 1993). 이러한 항체의 인간화 형태인 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®)은 여러 유형의 암에 대한 환자 생존을 개선시키기 위해 일련의 임상 시험에서 제시되었으며(문헌[N. Vasudev, op. cit.]에서 개관됨), 다양한 다른 약물과 조합된 결장직장암, 폐암, 신장암, 자궁경부암 및 난소암 유형의 치료, 및 아교모세포종(Avastin® package label)에 승인되었다. 그러나, 베바시주맙의 무진행 또는 전체 생존 이익은 일반적으로 수개월로 매우 적다(R.S. Kerbel, The Breast S3: S56-S60, 2011). 베바시주맙을 개선시키기 위한 시도로, MAb7392(WO 2011/159704), 인간화 토끼 mAb hEBV321(Y. Yu et al., PLOS ONE 5:e9072, 2010; US Patent No. 7,803,371; US 2012/0231011), 인간화 mAb Y0317(Y. Chen et al., J Mol Biol: 293:865-81, 1999), 및 인간 mAbs B20.4.1 및 B20.4.1.1(US 2009/0142343)을 포함하는 다른 항-VEGF mAb가 생성되었다. 그러나, 이들 mAb는 시판 승인을 받지 못했다.
안지오포이에틴 계열의 사이토카인은 안지오포이에틴 1(Ang-1), 안지오포이에틴 2(Ang-2) 및 인간에서 덜 연구된 안지오포이에틴 4로 구성된다(안지오포이에틴 및 이의 수용체의 구조 및 기능의 개관을 위해, 문헌[M. Thomas et al. Angiogenesis 12:125-137, 2009 및 E. Fagiani et al., Cancer Letters 328: 18-26, 2013] 참조). 안지오포이에틴은 70-75 kDa의 이량체 분자량을 갖는 분비되는 당단백질이나, 이는 또한 삼량체 및 사량체와 같은 이종성 다합체를 형성하며; 상기 올리고머화는 수용체 활성화에 필수적이다. 안지오포이에틴은 Tie-2 티로신 키나제 수용체에 결합하고, 이를 통해 신호전달하며; Tie-1은 Tie-2와 이종이량체화될 수 있는 고아 수용체고, 신호전달을 조절할 수 있다. Ang-1은 Tie-2를 통해 양성으로 신호전달하는 반면, Ang-2는 상황에 따라 효능제 또는 길항제로 보고되어 있다. 안지오포이에틴은 복잡한 방식으로 혈관구조에 대해 작용한다. Ang-1은 일반적으로 혈관을 안정화시키고, 배아에서 혈관 발달에 중요한 반면, 내피 세포에 의해 방출되는 Ang-2는 Ang-1에 대한 경쟁적인 길항제로 작용할 수 있고, 따라서 내피 세포로부터 혈관주위세포의 분리, 끝세포의 발아, 및 VEGF의 존재하에서 혈관신생을 촉진한다.
Ab536(J. Oliner et al., Cancer Cell 6:507-16, 2004), MEDI-3617(C.C. Leow et al., Int J Oncol 40:1321-30, 2012, 및 A. Buchanan et al., MAbs 5:255-62, 2013), LC06(M. Thomas et al., PLoS One. 8:e54923, 2013) 및 REGN910(C. Daly et al., Cancer Res 73:108-18, 2012)을 포함하는 Ang-2에 특이적으로 결합하고 이를 중화시키는 여러 인간 mAb가 파지 디스플레이 또는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성되었다. 이들 mAb는 Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 차단하고, 혈관신생을 억제하고, 다양한 모델에서 종양 이종이식편 성장을 억제한다. VEGF 및 Ang-2 둘 모두에 결합하는 이특이적 항체가 또한 보고되었다(Y. Kienast, Clin Cancer Res 19:6730-6740, 2013).
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 VE1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 중화 모노클로날 항체(mAb)를 제공한다. 예시적 항체는 VE1 및 VE1의 경쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역 및 VE1의 중쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb, 예를 들어, VE1의 키메라 및 인간화 형태, 예를 들어, 도 3에 나열된 인간화 경쇄 및 중쇄를 포함하는 mAb이다. mAb는 세포 수용체로의 결합을 포함하는 VEGF의 적어도 하나, 바람직하게는 몇몇 및 모든 생물학적 활성을 억제한다. 유리하게는, 항-VEGF mAb는 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제한다. 임의의 상기 mAb를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 상기 약학적 조성물을 투여함으로써 질병, 예를 들어, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 A2T 항체와 동일한 에피토프를 갖는 인간 안지오포이에틴 2(Ang-2)에 대한 중화 모노클로날 항체(mAb)를 제공한다. 예시적 항체는 A2T 및 A2T의 경쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역 및 A2T의 중쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb, 예를 들어, A2T의 키메라 및 인간화 형태, 예를 들어, 도 13에 나열된 인간화 경쇄 및 중쇄를 포함하는 mAb이다. mAb는 세포 수용체로의 결합 및 혈관신생의 자극을 포함하는 Ang-2의 적어도 하나, 바람직하게는 몇몇 및 모든 생물학적 활성을 억제한다. 임의의 상기 mAb를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 상기 약학적 조성물을 투여함으로써 질병, 예를 들어, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
또 다른 표적을 갖는 상이한 항체로부터의 하나 이상의 결합 도메인과 함께 상기 언급된 항체 중 임의의 항체로부터의 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 이특이적 항체가 또한 제공된다. 바람직한 구현예에서, 다른 표적은 인간 간세포 성장 인자(HGF)이고, 상이한 항체는 HuL2G7일 수 있거나, 다른 표적은 인간 FGF2이고, 상이한 항체는 인간화 GAL-F2 mAb일 수 있다. 예시적 구현예에서, 하나 이상의 결합 도메인은 인간화 VE1 mAb로부터 유래되며, 하나 이상의 결합 도메인은 Ang-2에 대한 인간화 또는 인간 mAb, 예를 들어, 인간화 A2T mAb로부터 유래된다. 종종, 이특이적 항체는 단량체의 동종이량체이며, 이들 각각은 VEGF에 결합하는 제1 결합 도메인 및 HGF 또는 FGF2 또는 Ang-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다.
도 1. Bs(scFv)4-IgG 이특이적 항체 포맷의 개략도. 상단 다이어그램 (A)는 개별적 가변 및 불변 영역을 제시하며; 하단 다이어그램 (B)는 각각의 경쇄 영역과 각각의 중쇄 영역을 함께 폴딩시킴으로써 형성된 도메인을 제시한다. VH1(각각 VL1) = 제1 항체의 중쇄(각각 경쇄) 가변 영역; 및 제2 항체의 VH2 및 VL2에 대해서도 유사함. CH1, CH2, CH3(각각 CL) = 중쇄(각각 경쇄) 불변 영역 도메인; V1(각각 V2) = 제1(각각 제2) 항체의 전체 가변 도메인.
도 2. (A) VE1은 VEGF를 포획하나, 대조군 마우스 mAb mIgG는 VEGF를 포획하지 않음을 제시하는 ELISA 검정. (B) VE1이 VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 A4.6.1보다 잘 차단하는 것을 제시하는 ELISA 검정.
도 3. HuVE1-L1 및 HuVE1-L2 경쇄 (A) 및 HuVE1-H1 및 HuVE1-H2 중쇄 (B)의 성숙 가변 영역의 아미노산 서열이 마우스 VE1 및 인간 수용체 V 영역과 정렬되어 제시된다. CDR은 VE1 서열에서 밑줄로 표시되고, 마우스 VE1 아미노산으로 치환된 아미노산은 HuVE1 서열에서 이중 밑줄로 표시된다. 본원에서 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 대해 1-문자 아미노산 부호 및 케이뱃(Kabat) 넘버링 시스템이 이용된다.
도 4. ChVE1 및 HuVE1 변이체 #1, #2, #3, #4, 및 음성 대조군 항체 hIgG의 결합 (A) 및 수용체 차단 (B) 활성을 비교하는 ELISA 검정.
도 5. HuVE1 변이체 #3 및 #4와 베바시주맙 및 음성 대조군 hIgG의 결합 (A) 및 수용체 차단 (B) 활성을 비교하는 ELISA 검정.
도 6. (A) HuVE1 #4가 베바시주맙보다 인간 제대혈 혈관 내피 세포(HUVEC)의 VEGF-유도 증식을 잘 억제하는 것을 제시하는 생물학적 검정. (B) VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 차단하는 표시된 항-VEGF mAb의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 7. (A) HuVE1 #4(및 베바시주맙)가 VEGF-A(VEGF)에 결합하나, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, HGF 및 FGF2에 결합하지 않고, (B) VEGF의 VEGF-165, VEGF-121 및 VEGF-189 아이소형에 결합하는 것을 제시하는 ELISA 검정.
도 8. (A) VEGF의 인간(Hu 또는 h)/마우스(Mu 또는 m) 키메라 형태의 개략도. 음영, 인간 서열; 교차선, 마우스 서열; KF, 카파-플래그(kappa-flag). (B) (A)의 작제물 각각에 대한 HuVE1 #4 및 베바시주맙 결합의 ELISA 검정.
도 9A,B. 표지된 바와 같은 VEGF의 다양한 돌연변이체에 대한 HuVE1 #4 및 베바시주맙의 결합. WT; 야생형 VEGF.
도 10. (A) 인간(h), 마우스(m) 및 시노몰구스 원숭이(cyno) Ang-2 작제물에 대한 표시된 항-Ang-2 mAb 결합의 ELISA 검정. (B) 인간, 마우스, 인간-마우스 키메라(h/m) 및 마우스-인간(m/h) 키메라 Ang-2 작제물에 대한 표시된 항-Ang-2 mAb 결합의 ELISA 검정.
도 11. (인간) Tie-2에 대한 (인간) Ang-2의 결합을 차단하는 표시된 mAb의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 12. A2B mAb의 (성숙) 경쇄 (A) 및 중쇄 (B) 가변 영역의 아미노산 서열.
도 13. HuA2T-L1 및 HuA2T-L2 경쇄(A) 및 HuA2T-H1 및 HuA2T-H2 중쇄(B)의 성숙 가변 영역의 아미노산 서열이 마우스 A2T 및 인간 수용체 V 영역과 정렬되어 제시된다. CDR은 A2T 서열에서 밑줄로 표시되고, 마우스 A2T 아미노산으로 치환된 아미노산은 HuA2T 서열에서 이중 밑줄로 표시된다. 잠재적 당화 부위를 제거하기 위해 마우스 T에서 인간 A로 전환된 위치 60의 아미노산이 음영으로 제시된다.
도 14. Ang-2에 결합하고(A), Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 억제하는(B) 표시된 HuA2T 변이체의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 15. Ang-2에 결합하고(A), Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 억제하는(B) 표시된 HuA2T 변이체의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 16. (A) Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 억제하는 표시된 항-Ang-2 mAb의 능력을 비교하는 ELISA 검정. (B) HEK293-Tie-2 세포에서 Tie-2의 Ang-2 유도 인산화를 억제하는 표시된 항-Ang-2 mAb의 능력을 비교하는 검정.
도 17. (A) Ang-2 및 VEGF에 동시에 결합하는 B-HuA2T/HuVE1 이특이적 항체의 능력을 제시하나, HuVE1은 그렇지 않음을 제시하는 ELISA 검정. (B) VEGF에 결합하는 B-HuA2T/HuVE1, HuVE1 및 베바시주맙의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 18. VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 억제하는 B-HuA2T/HuVE1 및 HuVE1 (A), 및 Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 억제하는 B-HuA2T/HuVE1 및 HuA2T (B)의 능력을 비교하는 ELISA 검정.
도 19. (A) 주 당 2회 VE1(5 ㎎/㎏) 또는 비히클(PBS) 단독으로 처리된 마우스에서의 COLO 205 이종이식편의 성장. (B) 주 당 2회 HuVE1 #3(5 ㎎/㎏) 또는 PBS 단독으로 처리된 마우스에서의 COLO 205 이종이식편의 성장.
도 20. (A) 주 당 2회 HuVE1 또는 베바시주맙(2.5 ㎎/㎏) 또는 비히클(PBS) 단독으로 처리된 마우스에서의 원발성 간 종양 이종이식편의 성장. (B) 화살표에 의해 표시된 바와 같은 6일 및 9일에서 HuVE1 또는 베바시주맙(1 ㎎/㎏) 또는 PBS 단독으로 처리된 마우스에서의 RPMI 4788 결장 종양 이종이식편의 성장.
도 21. 주 당 1회 HuVE1 또는 베바시주맙(5 ㎎/㎏) 또는 비히클(PBS) 단독으로 처리된 마우스에서의 원발성 유방 종양 이종이식편의 성장.
1. 항체
본원에서 사용되는 "항체"는 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 도메인을 함유하는 단백질을 의미하며, 상기 도메인(들)은 천연 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 이와 동종이다. 모노클로날 항체("mAb")는 간단히 다양한 항체의 혼합물과 대조적인 항체의 단일 종이다. 본원에 기재된 항체는 일반적으로 문맥에 의해 달리 명시되지 않는 한 모노클로날 항체이다. 항체의 "항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 화합물을 의미하며, 통상적으로 폴리펩티드이나, 작은 펩티드 또는 소분자 합텐 또는 탄수화물 또는 다른 모이어티일수도 있다. 항체의 예는 천연의 전장 사량체 항체; 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab' 및 (Fab')2; 단일쇄(scFv) 항체(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 단일-아암(arm) 항체(Nguyen et al., Cancer Gene Ther 10:840, 2003); 및 이특이적, 키메라 및 인간화 항체를 포함하며, 이들 용어는 하기에 추가로 설명된다. 항체는 닭, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터), 토끼, 영장류 및 인간을 포함하는 임의의 척추동물 종으로부터 유래될 수 있다. 불변 도메인을 포함하는 항체는 공지된 동형 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 및 이들의 아형, 즉, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, 및 이들의 알로타입(allotype) 및 이소알로타입(isoallotype), 예를 들어, 알로타입 및 이소알로타입 내의 다형성 위치를 차지하는 잔기의 조합 중 임의의 것일 수 있다. 항체는 또한 키메라 동형의 항체일 수 있으며, 즉, 불변(C) 영역 중 하나 이상은 상이한 동형으로부터의 영역, 예를 들어, 감마-1 CH1 영역과 함께 힌지, 감마-2, 감마-3 및/또는 감마-4 유전자로부터의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유할 수 있다. 항체는 또한 보체-매개 세포독성 또는 ADCC와 같은 효과기 기능을 감소시키거나 증가시키거나(예를 들어, 문헌[Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597; 및 Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4005, 2006] 참조), 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J Biol Chem 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 대체를 함유할 수 있다.
천연 항체 분자는 일반적으로 각각 1개의 중쇄와 쌍을 이룬 1개의 경쇄를 포함하는 2개의 동일한 이종이량체로 구성된 사량체이다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 가변(VL 또는 VH, 또는 단순히 V) 영역에 이어서 불변(CL 또는 CH, 또는 단순히 C) 영역으로 구성된다. CH 영역 자체는 CH1, 힌지(H), CH2, 및 CH3 영역을 포함한다. 3차원(3D) 공간에서, VL 및 VH 영역은 함께 폴딩되어 V 도메인을 형성하며, 이는 항원에 결합하기 때문에 결합 도메인으로도 공지되어 있다. CL 영역은 CH1 영역과 함께 폴딩되어, 경쇄 VL-CL 및 중쇄의 VH-CH1 영역이 함께 Fab로 공지된 항체의 일부를 형성하고, 자연적으로 "Y-형태" 항체는 따라서 각각의 이종이량체로부터 1개씩 2개의 Fab를 함유하여 Y의 아암을 형성한다. 하나의 이종이량체의 CH2 영역은 다른 이종이량체의 CH2 영역에 마주하여 위치되고, 각각의 CH3 영역은 서로 폴딩되어 함께 항체의 단일 Fc 도메인(Y의 베이스)을 형성하며, 이는 면역계의 다른 성분과 상호작용한다.
각각의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에는 상보성 결정 영역("CDR")으로 언급되는 3개의 짧은 세그먼트(평균 약 10개의 아미노산 길이)가 존재한다. 항체 가변 도메인 내의 6개의 CDR(경쇄로부터 3개 및 중쇄로부터 3개)은 3D 공간에서 함께 폴딩되어, 표적 항원에 고정되는 실제 항체 결합 부위를 형성한다. CDR의 위치 및 길이는 문헌[Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987]에 의해 정확하게 정의되었다. CDR에 함유되지 않은 가변 영역의 부분은 프레임워크로 언급되며, 이는 CDR에 대한 환경을 형성한다. 문헌[Chothia et al., J Mol Biol 196:901, 1987]에서는 구조에 의해 결정되는 과가변 영역 또는 루프의 관련 개념을 정의하였다.
본원에서 사용되는 "유전학적으로 조작된" mAb는 유전자가 재조합 DNA 기술의 도움으로 작제되거나 비천연 환경에 놓인(예를 들어, 마우스 내 또는 박테리오파지 상의 인간 유전자) 것이며, 따라서 하기 기재되는 바와 같은 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하나, 통상적인 하이브리도마 기술로 제조된 마우스 또는 다른 설치류 mAb는 포함하지 않는다. 키메라 항체(또는 각각 키메라 항체 경쇄 또는 중쇄)는 마우스(또는 다른 비-인간 종) 항체(또는 각각 항체 경쇄 또는 중쇄)의 가변 영역이 인간 항체의 불변 영역과 조합된 항체(또는 각각 항체 경쇄 또는 중쇄)로, 유전학적 조작에 의한 이의 작제는 널리 공지되어 있다. 상기 항체는 약 2/3은 인간이면서 마우스 항체의 결합 특이성을 유지한다.
인간화 항체는 비-인간 "공여체" 항체(예를 들어, 닭, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)로부터의 CDR이 인간 "수용체" 항체 서열에 이식된 유전학적으로 조작된 항체이며, 인간화 항체는 공여체 항체의 결합 특이성을 유지한다(예를 들어, 문헌[Queen, U.S. Pat. Nos. 5,530,101 및 5,585,089; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539; Carter, U.S. Pat. No. 6,407,213; Adair, U.S. Pat. Nos. 5,859,205 6,881,557; Foote, U.S. Pat. No. 6,881,557] 참조). 수용체 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 점라인(germline) 인간 항체 서열, 또는 2개 이상의 상기 서열의 복합물일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체로부터의 일부 또는 전부의 CDR 및 가변 영역 프레임워크 서열, 및 존재시 전적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 경쇄(각각 중쇄)는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 경쇄(각각 중쇄)로부터의 적어도 1개, 2개 및 일반적으로 3개 모두의 CDR, 및 경쇄(각각 중쇄) 가변 영역 프레임워크, 및 존재시 실질적으로 인간 경쇄(각각 중쇄) 수용체 사슬로부터 경쇄(각각 중쇄) 불변 영역을 갖는다. 인간화 항체는 일반적으로 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체 내의 CDR은 상응하는 아미노산(케이뱃에 의해 정의됨)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에서 동일한 경우에 비-인간 항체 내의 상응하는 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 또는 불변 영역은 상응하는 아미노산(케이뱃에 의해 정의됨)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우에 인간 가변 영역 또는 인간 불변 영역으로부터 각각 실질적으로 유래된다.
본원에서, 본 출원 내의 다른 곳에서와 같이, 서열 동일성 백분율은 케이뱃 넘버링 규약(CH 영역에 대한 Eu 지수)에 의해 최대로 정렬된 항체 서열로 결정된다. 정렬 후, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 참조 항체의 동일 영역과 비교되는 경우, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은 대상 및 참조 항체 영역 둘 모두에서 동일 아미노산에 의해 점유된 위치의 수를 2개의 영역의 정렬된 위치의 전체 수로 나누고(갭은 계수되지 않음), 100을 곱하여 백분율로 전환시킨 것이다.
인간화 항체에서 높은 결합 친화성을 유지시키기 위해, 2개의 추가 구조 요소 중 적어도 하나가 이용될 수 있다. 인간화 항체의 작제를 위한 상세한 설명을 제공하는 미국 특허 번호 5,530,101호 및 5,585,089호(참조로서 본원에 포함됨)를 참조한다. 첫번째 구조적 요소에서, 수용체 또는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크는 많은 공지된 인간 항체 중에서 수용체 항체 중쇄를 적합하게 선택함으로써 공여체 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크와 높은 서열 동일성(65% 내지 95%)을 갖도록 선택된다. 두번째 구조적 요소에서, 인간화 항체의 작제에서, 인간 수용체 항체의 프레임워크에서 선택된 아미노산(CDR 외부)은 특정 규칙에 따라 공여체 항체로부터의 상응하는 아미노산으로 대체된다. 특히, 프레임워크에서 대체되는 아미노산은 CDR과 상호작용하는 이의 능력을 기초로 하여 선택된다. 예를 들어, 대체된 아미노산은 공여체 항체 서열 내의 CDR과 인접할 수 있거나, 3차원 공간에서 측정되는 바와 같이 인간화 항체 내의 CDR의 4-6 옹스트롬 이내에 존재할 수 있다.
인간화 항체를 설계하기 위한 다른 접근법은 또한 상기 기재된 미국 특허 번호 5,530,101호 및 5,585,089호의 방법, 예를 들어, "초인간화(superhumanization)"(문헌[Tan et al. J Immunol 169:1119, 2002, 및 U.S. Patent No. 6,881,557] 참조) 또는 문헌[Studnicak et al., Protein Eng 7:805, 1994]의 방법과 동일한 결과를 달성하도록 이용될 수 있다. 또한, 유전학적으로 조작된 감소된 면역원성 mAb를 생성하기 위한 다른 접근법은, 예를 들어, 문헌[Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998; Roguska et al. Protein Eng 9:895, 1996; 및 U.S. Pat. Nos. 6,072,035 및 5,639,641]에 기재된 바와 같은 "재형성(reshaping)", "초키메라화(hyperchimerization)" 및 베니어링(veneering)/재표면화(resurfacing)를 포함한다. 베니어링된 항체는 B-세포 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 비-인간 공여체 항체의 가변 영역 프레임워크 내의 특정 아미노산, 예를 들어, 노출된 잔기를 대체함으로써 더욱 인간과 유사하게 만들어진다(Padlan, Mol Immunol 28:489, 1991). 다른 유형의 유전학적으로 조작된 항체는 파지 디스플레이 방법(Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; 및 Winter, FEBS Lett 23:92, 1998, 각각은 참조로서 본원에 포함됨)을 이용하거나, 트랜스제닉 동물(Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, 각각은 참조로서 본원에 포함됨)을 이용하여 의해 제조된 인간 항체를 포함한다.
용어 "항체" 또는 "mAb"는 또한 이특이적 항체를 포함한다. "이특이적 항체"는 제1 항원에 결합하는 제1 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2(상이한) 도메인을 함유하는 항체이며, 제1 및 제2 도메인은 천연 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 이와 동종이다. 제1 항원 및 제2 항원은 동일한 항원일 수 있으며, 이러한 경우 제1 및 제2 도메인은 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 용어 이특이적 항체는 제1 및 제2 도메인에 더하여 항원에 결합하고 천연 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 이와 동종인 하나 이상의 다른 도메인을 함유하는 다중특이적 항체를 포함한다. 용어 이특이적 항체는 또한 천연 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 이와 동종인 제1 결합 도메인, 및 다른 유형의 단백질로부터 유래되는 제2 결합 도메인, 예를 들어, 수용체의 세포외 도메인을 함유하는 항체("이특이적 항체-면역부착소")를 포함한다.
이특이적 항체는 다양한 형태(예를 들어, 문헌[Kontermann, MAbs 4:182-197, 2012] 및 이에 인용된 참고문헌 참조), 예를 들어, 단일쇄 가변 단편(scFv), Fab-scFv, 및 scFv-scFv 융합 단백질(Coloma et al., Nat Biotechnol 15:125-6, 1997; Lu et al., J Immunol Methods 267:213-26, 2002; Mallender, J Biol Chem 269:199-206, 1994), Bs(scFv)4-IgG(Zuo et al., Protein Eng 13: 361-367, 2000), 이중 가변 도메인 항체(Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290-7, 2007), 및 디아바디(diabodies)(Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-8, 1993)로 생성되었다. 이특이적 F(ab')2 항체 단편은 화학적 커플링(Brennan et al., Science 229:81, 1985)에 의하거나, 류신 지퍼(leucine zipper)(Kostelny et al., J Immunol 148:1547-53, 1992)를 이용하여 생성되었다. 각각 상이한 V 영역을 갖는 중쇄-경쇄 쌍을 갖는 더욱 천연 형태의 이특이적 항체는, 예를 들어, 별도로 생성된 2개의 중쇄-경쇄 쌍을 화학적으로 가교시킴으로써 제조될 수 있고(Karpovsky et al., J Exp Med 160:1686-701, 1984), 천연 형태의 이특이적 항체는 또한 2개의 하이브리도마 세포주를 융합시킴으로써 제조된 단일 세포("콰드로마(quadroma)"; Milstein et al., Nature 305: 537-40)에서 필요한 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 발현시키거나 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 원하는 이특이적 항체를 형성시키기 위해 세포에서 발현되는 정확한 경쇄 및 중쇄의 회합은 임의로 하나의 경쇄-중쇄 쌍의 항원 결합 단편(Fab) 내의 중쇄 및 경쇄 도메인의 교환 또는 "교차"를 가져, 이에 따라 "CrossMab"(Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92, 2011; WO 2009/080251; WO 2009/080252; WO 2009/080253)로 언급되는 이특이적 항체를 생성시키는 "노브-인투-홀(knobs-into-holes)" 기술(Ridgway et al., Protein Eng 9:617-21, 1996; Atwell et al., J Mol Biol 270:26-35, 1997; 및 US Patent No. 7,695,936)을 이용함으로써 촉진될 수 있다.
항체는 항원에 결합하지 않는 관련이 없는 항체보다 유의하게 큰 정도로 결합하는 경우에 항원에 "특이적으로" 결합하는 것으로 언급되며, 따라서 통상적으로 항원에 대해 적어도 약 106, 바람직하게는 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 결합 친화성(Ka)을 갖는다. 일반적으로, 항체가 항원에 결합한다고 언급되는 경우, 특이적 결합을 의미한다. 항체가 항원에 결합하지 않는다고 언급하는 경우, 이는 결합을 나타내는 임의의 신호가 관련이 없는 대조군 항체의 신호로부터 실험 오차 내에서 구별할 수 없는 것을 의미한다. mAb의 에피토프는 mAb가 결합하는 항원의 영역이다. 2개의 항체가 각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우에 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합하는 것으로 판단된다. 결합을 경쟁적으로 억제하는 것은 경쟁 결합 검정으로 측정시 한 항체의 1x 또는 5x 과량이 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75% 억제하거나, 한 항체의 10x, 20x 또는 100x 과량이 다른 항체의 결합을 적어도 75%, 바람직하게는 90% 또는 심지어 95% 또는 99% 억제하는 것을 의미한다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res 50:1495, 1990] 참조). 하나의 mAb(제2 mAb)는 (제1 mAb의) 결합을 억제하는 제2 mAb의 억제 농도 50(IC50)이 경쟁 결합 검정에서 자신의 결합을 억제하는 제1 mAb의 IC50과 동등한 경우, 즉, 이의 2배 또는 3배 내인 경우에 또 다른 mAb(제1 mAb)와 항원 결합에 대해 "완전히" 경쟁하는 것으로 언급된다. 제2 mAb는 (제1 mAb의) 결합을 억제하는 제2 mAb의 IC50이 결합을 억제하는 제1 mAb의 IC50보다 실질적으로 더 큰 경우, 예를 들어, 이보다 3배 또는 5배 또는 10배 더 큰 경우에 제1 mAb와 항원 결합에 대해 "부분적으로" 경쟁하는 것으로 언급된다. 일반적으로, 2개의 mAb는 각각이 다른 것과 항원에 대한 결합에 대해 완전히 경쟁하는 경우에 항원 상에 동일한 에피토프를 가지며, 적어도 하나의 mAb가 다른 mAb와 결합에 대해 부분적으로 경쟁하는 경우에 중복 에피토프를 갖는다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우에 동일한 에피토프를 갖는 반면, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 전부가 아닌 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우에 중복 에피토프를 갖는다.
2. 항-VEGF 및 항-Ang-2 항체
VEGF, Ang-2, HGF 및 FGF2와 같은 성장 인자 또는 수용체를 본원에서 언급하는 경우, 달리 명시되지 않는 한 성장 인자 또는 수용체의 인간 형태를 의미한다.
VEGF에 결합하는 모노클로날 항체, 즉, 항-VEGF mAb(또는 각각 Ang-2에 결합하는 mAb, 즉, 항-Ang-2 mAb)는 결합이 VEGF(각각 Ang-2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 경우, 즉, mAb가 단일 제제로서 사용되는 경우에 VEGF(각각 Ang-2)를 중화시키거나, 중화하는 것으로 언급된다. 중화 항체가 억제할 수 있는 VEGF의 생물학적 특성 중에는 이의 세포 수용체에 결합하고, 이의 수용체의 인산화를 유도하고, 인간 제대혈 혈관 내피 세포(HUVEC)의 증식을 유도하거나 혈관신생을 유도하는 VEGF의 능력이 있다. 중화 항체가 억제할 수 있는 Ang-2의 생물학적 특성 중에는 이의 세포 수용체에 결합하고, 이의 수용체의 인산화를 유도하고, 혈관신생을 유도하는 Ang-2의 능력이 있다. 예를 들어, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 ㎍/㎖ 농도의 본 발명의 중화 mAb는 실시예에 기재되거나 당 분야에 공지된 방법에 의해 검정시 VEGF(각각 Ang-2)의 생물학적 기능을 적어도 약 50% 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 또는 심지어 99%, 가장 바람직하게는 약 100%(본질적으로 완전히)만큼 억제한다. 통상적으로, 사용되는 VEGF(각각 Ang-2)의 양이 생물학적 활성을 충분히 자극하기에 단지 충분한 경우, 또는 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 또는 10 ㎍/㎖인 경우에 억제의 정도가 측정된다. 바람직하게는, mAb는 상기 나열된 생물학적 활성 중 단지 1개가 아닌 2개, 3개 또는 여러개를 중화시키고; 본원의 목적상, 단일 제제로 사용되는 mAb는 VEGF(각각 Ang-2)의 모든 생물학적 활성을 중화시키고, 이는 "완전 중화"로 언급되며, 상기 mAb가 가장 바람직하다.
본 발명의 항-VEGF mAb는 바람직하게는 VEGF(즉, VEGF-A)에 특이적이며, 즉, 이들은 VEGF와 관련된 단백질, 예를 들어, VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D 뿐만 아니라 다른 혈관신생 인자, 예를 들어, HGF 및 FGF2에 (특이적으로) 결합하지 않거나, 훨씬 덜한 정도(예를 들어, 또한 10배 미만)로만 결합한다. 유사하게, 본 발명의 항-Ang-2 mAb는 바람직하게는 Ang-2에 특이적이며, 즉, 이들은 Ang-2와 관련된 단백질, 예를 들어, Ang-1 및 Ang-4 뿐만 아니라 다른 혈관신생 인자, 예를 들어, HGF 및 FGF2에 (특이적으로) 결합하지 않거나, 훨씬 덜한 정도(예를 들어, 또한 10배 미만)로만 결합한다. 본 발명의 mAb는 통상적으로 적어도 107 M-1, 바람직하게는 108 M-1 이상, 가장 바람직하게는 109 M-1 이상 또는 심지어 1010 M-1 이상의 이들의 특정 표적에 대한 결합 친화성(Ka)을 갖는다. 항-VEGF mAb는 인간 VEGF에 결합하고, 항-Ang-2 mAb는 인간 Ang-2에 결합하나, 유리하게는 인간 VEGF(각각 인간 Ang-2)에 대한 결합 친화성과 유사한(예를 들어, 10배 이내) 결합 친화성을 이상적으로 갖는 다른 종, 예를 들어, 마우스 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이로부터의 VEGF(각각 Ang-2)에 또한 결합한다. 본 발명의 mAb는 VEGF 또는 Ang-2에 결합하는 결합 도메인을 갖는 이특이적 항체를 포함하여 상기 기재된 항체의 모든 다양한 형태를 포함한다. 인간 VEGF의 서열은 Swiss-Prot P15692에서 제공되며, 이의 처음 26개의 잔기는 성숙 VEGF-A에서 제거된 신호 펩티드이다.
본원에 기재된 항-VEGF mAb VE1이 본 발명의 예이다. VE1와 동일하거나, 중복되는 에피토프를 갖는 중화 mAb가 다른 예를 제공한다. 키메라, 인간화 또는 인간 중화 항-VEGF mAb, 예를 들어, HuVE1과 같은 VE1의 키메라 또는 인간화 형태가 특히 바람직한 구현예이다. 다른 바람직한 구현예에서, mAb는 상기 언급된 특성(예를 들어, VEGF 중화) 중 하나 이상을 갖는 본 발명의 항-VEGF mAb(예를 들어, VE1 또는 VE1의 인간화 형태)로부터의 하나 이상의 결합 도메인, 및 HGF(예를 들어, 미국 특허 번호 7,220,410호 및 7,632,926호에 기재된 바와 같은 L2G7 mAb 또는 이의 인간화 형태, 예를 들어, HuL2G7) 또는 FGF2(예를 들어, 미국 특허 번호 8,101,725호에 개시된 바와 같은 GAL-F2 mAb 또는 이의 인간화 형태)에 임의로 결합하고 이들을 중화시키는 mAb로부터의 제2의 결합 도메인을 포함하는 이특이적 항체이다. 가장 바람직하게는, 항-VEGF mAb는 실시예 중 또는 당 분야에 달리 공지된 검정 중 임의의 검정에 의해 평가시 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제한다. 아미노산 서열에 있어서 VE1의 CDR과 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 90%, 95% 또는 98% 동일하거나 완전히 동일한 CDR을 갖고, 이의 기능적 특성을 유지하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 하기에 정의되는 바와 같은 보존성 치환), 결실 또는 삽입에 의해 VE1과 상이한 mAb가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된 항-Ang-2 mAb A2T 및 A2B가 또한 본 발명의 예이다. A2T 또는 A2B와 동일하거나, 중복되는 에피토프를 갖는 중화 mAb가 다른 예를 제공한다. 키메라, 인간화 또는 인간 중화 항-Ang-2 mAb, 예를 들어, HuA2T와 같은 A2T 또는 A2B의 키메라 또는 인간화 형태가 특히 바람직한 구현예이다. 특정 구현예에서, mAb는 상기 언급된 특성(예를 들어, Ang-2 중화) 중 하나 이상을 갖는 본 발명의 항-Ang-2 mAb(예를 들어, A2T 또는 A2B 또는 이들의 인간화 형태)로부터의 하나 이상의 결합 도메인, 및 상기 언급된 항-HGF 및 항-FGF2 mAb와 같은 또 다른 mAb로부터의 제2의 결합 도메인을 포함하는 이특이적 항체이다. 이상적으로, 항-Ang-2 mAb는 실시예 중 또는 당 분야에 달리 공지된 검정 중 임의의 검정에 의해 평가시 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제한다. 아미노산 서열에 있어서 A2T 또는 A2B의 CDR과 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 90%, 95% 또는 98% 동일하거나 완전히 동일한 CDR을 갖고, 이의 기능적 특성을 유지하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 하기에 정의되는 바와 같은 보존성 치환), 결실 또는 삽입에 의해 A2T 또는 A2B와 상이한 mAb가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된 바람직한 특성을 갖는 단일한 원형의 항-VEGF 또는 항-Ang-2 mAb, 예를 들어, VE1 또는 A2T가 각각 분리되면, VEGF에 대한 결합에 대해 VE1과 경쟁하고/하거나 VE1과 동일한 에피토프를 갖는 mAb를 포함하는 당 분야에 공지된 방법을 이용한 유사한 특성을 갖는 다른 mAb를 생성시키는 것은 간단하다. 예를 들어, 마우스가 VEGF로 면역화되고, 하이브리도마가 생성될 수 있으며, 생성된 mAb가 VEGF에 대한 결합에 대해 VE1과 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 마우스는 또한 VE1이 결합하는 에피토프를 함유하는 VEGF의 더 작은 단편으로 면역화될 수 있다. 에피토프는, 예를 들어, VEGF에 걸친 일련의 중복 펩티드에 대한 결합을 스크리닝함으로써 국소화될 수 있다. 이들 방식으로 생성된 마우스 mAb는 이후 인간화될 수 있다. 대안적으로, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994]의 방법은 동일 에피토프를 가져 이에 따라 VE1에 대한 유사한 특성을 갖는 mAb의 선택을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 파지 디스플레이를 이용하여, 먼저 VE1의 중쇄는 VEGF-결합 mAb를 선택하기 위해 (바람직하게는, 인간) 경쇄의 레퍼토리와 쌍을 이루고, 이후 새로운 경쇄가 VE1와 동일한 에피토프를 갖는 (바람직하게는, 인간) VEGF-결합 mAb를 선택하기 위해 (바람직하게는, 인간) 중쇄의 레퍼토리와 쌍을 이룬다. 대안적으로, VE1의 변이체는 VE1의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 획득될 수 있다. Ang-2에 대한 결합에 대해 A2T 또는 A2B와 경쟁하고/하거나 A2T 또는 A2B와 동일한 에피토프를 갖는 mAb를 개발하기 위해 동일 절차가 적용될 수 있다.
에피토프가 중복되어 항체가 VEGF에 대한 결합에 대해 베바시주맙과 경쟁할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 항-VEGF mAb, 예를 들어, HuVE1은 베바시주맙의 에피토프와 상이한, 즉, 동일하지 않은 에피토프에 결합한다. 구체적으로, VEGF에 대한 베바시주맙의 결합을 실질적으로 손상시키는 VEGF에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 본 발명의 mAb에 대해 손상시키지 않거나 동일한 정도로 손상시키거나, 그 반대도 마찬가지이다. 본 발명의 바람직한 항체는 베바시주맙보다 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 심지어 10배 더 높은 VEGF에 대한 결합 친화성을 갖는다. 유사하게, 본 발명의 바람직한 항체는 통상적으로 베바시주맙에 의한 억제에 대한 억제 농도-50%(IC50) 대 바람직한 항체에 의한 억제에 대한 IC50의 비에 의해 측정시 VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 베바시주맙보다 적어도 2배, 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 심지어 10배 더 억제한다.
유전학적으로 조작된 mAb, 예를 들어, 키메라 또는 인간화 또는 이특이적 mAb는 다양한 당 분야에 공지된 방법에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄 V 영역을 인코딩하는 유전자는 중복 올리고뉴클레오티드로부터 합성될 수 있고, 필요한 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 부위 등을 제공하는 발현 벡터(예를 들어, Invitrogen으로부터 상업적으로 이용 가능함)로 이용 가능한 C 영역과 함께 삽입될 수 있다. CMV 프로모터-인핸서의 사용이 바람직하다. 이후, 발현 벡터는 다양한 포유동물 세포주, 예를 들어, CHO 또는 Sp2/0 및 NS0를 포함하는 비-생성 골수종, 및 적절한 항생제 선택에 의해 선택되는 항체를 발현하는 세포로 리포펙션 또는 전기천공과 같은 다양한 널리 공지된 방법을 이용하여 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101호를 참조한다. 상업적으로 이용 가능한 생물반응기에서 세포를 성장시킴으로써 많은 양의 항체가 생성될 수 있다.
일단 발현되면, 이특이적 mAb를 포함하는 본 발명의 mAb는 당 분야의 표준 절차, 예를 들어, 미세여과, 초여과, 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 유기 염료를 기초로 한 다른 형태의 친화성 크로마토그래피 등에 따라 정제될 수 있다. 약학적 용도를 위해 적어도 약 90 또는 95%의 균질성의 실질적으로 순수한 항체가 바람직하고, 98% 또는 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. mAb가 통상적인 절차에 의해 제조되는 경우, 경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단의 1 내지 수 개의 아미노산, 예를 들어, 중쇄의 C-말단 리신이 분자의 일부 또는 전부에서 누락되거나 유도체화될 수 있음이 또한 이해되며, 상기 조성물은 여전히 동일한 mAb인 것으로 간주된다.
3. 이특이적 항체
상기 언급된 mAb 중 임의의 것, 바람직하게는 VE1 또는 A2T 또는 A2B, 또는 VE1 또는 A2T 또는 A2B와 동일한 에피토프 또는 VE1 또는 A2T 또는 A2B로부터의 CDR을 갖는 mAb, 예를 들어, HuVE1 또는 HuA2T와 같은 VE1 또는 A2T 또는 A2B의 인간화 형태로부터의 결합 도메인을 포함하는 이특이적 항체가 본 발명에 포함된다. 상기 이특이적 항체의 제2 결합 도메인은, 예를 들어, 또 다른 성장 인자, 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF), 임의의 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어, FGF2, 간세포 성장 인자(HGF), 종양 괴사 인자(TNF), 전환 성장 인자 베타(TGF-β1, TGF-β2, 또는 TGF-β3), 임의의 형태의 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 또는 뉴레귤린(neuregulin) 또는 헤레귤린(heregulin), 및 안지오포이에틴 1 또는 2, 또는 대안적으로 이들 성장 인자에 대한 임의의 수용체의 임의의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 제2 결합 도메인은 인간화 또는 인간 mAb로부터 유래될 것이다. 이들 성장 인자 또는 수용체의 인간 형태에 대한 결합이 바람직하다. 이들 성장 인자 및 수용체의 예시적 서열은, 예를 들어, Swiss-Prot 데이터베이스로부터 용이하게 이용 가능하다. 미국 특허 번호 7,632,926호(모든 목적상 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 항-HGF mAb HuL2G7의 결합 (가변) 도메인, 또는 이의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 결합 도메인이 특히 바람직한데, 이는 항-FGF2 mAb GAL-F2(미국 특허 번호 8,101,725호의 도 11에 제시된 서열)의 인간화 형태의 결합 도메인이기 때문이다. 특히 바람직한 구현예에서, 하나의 결합 도메인은 HuVE1과 같은 본원에 개시된 항-VEGF mAb 중 임의의 것으로부터 유래되고, 제2 결합 도메인은 HuA2T와 같은 본원에 개시된 항-Ang2 mAb 중 임의의 것으로부터 유래된다.
본 발명의 이특이적 항체는 임의의 포맷, 예를 들어, 문헌[Kontermann, op. cit]에 나열된 것 중 임의의 것일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이특이적 항체는 문헌[Zuo et al., op. cit]에 기재되고, 도 1에 예시된 Bs(scFv)4-IgG 포맷이다. 이러한 포맷에서, 단일쇄(scFv) 형태의 하나의 결합 도메인은 CL 영역에 연결되고, 따라서 경쇄의 N-말단 도메인이 되는 반면, scFv 형태의 다른 결합 도메인은 CH1 도메인에 결합되고, 따라서 중쇄의 N-말단 도메인이 되며; 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄는 일반 IgG 항체에서와 같이 동종이량체를 형성하나, 각각의 결합 도메인 2개를 함유한다. 따라서, Bs(scFv)4-IgG 포맷의 장점은 각각의 단량체에서 동일한 중쇄 및 경쇄를 가져 정확한 이종이량체화를 보장하기 위해 주의할 필요가 없는 동종이량체라는 점이다. VL 및 VH 영역을 연결시키는 각각의 scFv 내의 링커는 종종 (G4S)3GS로 선택된다. 각각의 scFv 결합 도메인은 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL 형태일 수 있고(도 1a에 제시된 바와 같음), 어느 하나의 결합 도메인은 경쇄의 일부일 수 있는 반면, 다른 하나는 중쇄의 일부여서, 2개의 제공된 결합 도메인(예를 들어, HuVE1 및 HuL2G7 또는 HuA2T의 결합 도메인)으로부터 Bs(scFv)4-IgG 항체의 전체 2 x 2 x 2 = 8개의 변이체가 제조될 수 있으며, 이들은 상이한 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, scFv VH-링커-VL 형태의 HuVE1 V 도메인은 CH1에 연결되는 반면, scFv VH-링커-VL 형태의 HuL2G7 또는 HuA2T V 도메인과 같은 다른 항체 도메인은 CL에 연결된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 이특이적 항체는, 예를 들어, 문헌[Wu et al., op. cit.]에 기재된 이중 가변 도메인 포맷이다(예를 들어, 표지를 갖는 도 1a 참조). 상기 이특이적 mAb는 2개의 각각의 결합 도메인을 함유하며, 각각의 결합 도메인 중 하나는 순서대로 연결된다. 다양한 펩티드 링커, 예를 들어, 중쇄에서 ASTKGPSVFPLAP 및 경쇄에서 RTVAAPSVIFIPP, 또는 둘 모두의 사슬에서 (G4S)3GS가 제1 및 제2 도메인을 연결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, HuL2G7 또는 HuA2T의 가변 도메인이 제1 도메인(VL1-VH1)일 수 있는 반면, HuVE1의 가변 도메인이 제2 도메인(VL2-VH2)일 수 있고; 링커는 상기 언급된 전자의 것일 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 경쇄 및 중쇄를 포함하는 HuVE1 mAb의 하나의 단량체가 경쇄 및 중쇄를 포함하는 HuL2G7 또는 HuA2T mAb의 하나의 단량체와 쌍을 이루어 IgG 분자의 정상 입체형태를 갖는 이종이량체를 형성한다. 4개 모두의 사슬이 세포에서 발현되는 경우, 각각의 중쇄의 CH3 영역에 노브 앤 홀(knobs and holes)을 삽입시킴으로써 동종이량체 대신 원하는 이종이량체의 이특이적 항체의 형성이 촉진되는 반면(Ridgway et al., Protein Eng 9:617-21, 1996; Atwell et al., J Mol Biol 270:26-35, 1997; 및 US Patent No. 7,695,936), 각각의 HuVE1 및 HuL2G7 또는 HuA2T 단량체를 형성시키기 위한 경쇄 및 중쇄의 정확한 쌍형성은 단량체 중 하나 내에서의 중쇄 및 경쇄 도메인의 "교차(crossing over)"에 의해 촉진된다(Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92, 2011; WO 2009/080251; WO 2009/080252; WO 2009/080253).
본 발명은 또한 CDR 내에서도 가능하나 일반적으로는 C 영역 또는 V 영역 프레임워크 내에서의 적은 수(예를 들어, 통상적으로 1, 2, 3, 5 또는 10개 이하)의 대체, 결실 또는 삽입에 의해 상기 구체적으로 기재된 것과 경쇄 및 중쇄가 상이한 변이체 이특이적 항체를 제공한다. 가장 흔하게는, 변이체 서열 내에서 이루어지는 대체는 대체된 아미노산과 관련하여 보존성이다. 아미노산은 보존성 치환, 즉, 그룹 내에서의 치환을 결정하기 위해 다음과 같이 그룹화될 수 있다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe.
바람직하게는, 이특이적 항체에서의 대체는 항체의 결합 친화성 또는 효력, 즉, VEGF 및 제2 결합 도메인의 표적, 예를 들어, HGF 또는 Ang-2의 생물학적 활성을 중화시키는 이의 능력에 대해 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, 변이체 서열은 본래의 서열과 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일하다. 또한, 불변 영역의 다른 알로타입 또는 아이소형이 사용될 수 있다.
4. 치료 방법
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 약학적 제형은 동결건조된 용액 또는 수용액 형태의 임의로 부형제 또는 안정화제를 갖는 생리학적으로 허용되는 담체 중 mAb를 함유한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 통상적으로 5.0 내지 8.0, 가장 흔하게는 6.0 내지 7.0의 pH의 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 또는 아세테이트; 등장성으로 만들기 위한 염, 예를 들어, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 등; 항생제, 보존제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리소르베이트 80, 아미노산, 탄수화물, 킬레이트제, 당, 및 당업자에게 공지된 다른 표준 성분을 포함한다(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980). mAb는 통상적으로 1-100 ㎎/㎖, 가장 흔하게는 10-50 ㎎/㎖, 예를 들어, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎎/㎖의 농도로 존재한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 통상적으로 질병과 관련된 혈관신생을 억제하기 위해 약학적 제형의 본 발명의 항-VEGF 또는 항-Ang-2 mAb, 예를 들어, VE1 또는 A2T 또는 이들의 인간화 및/또는 이특이적 형태를 투여함으로써 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 약학적 제형으로 제조된 mAb는 임의의 적합한 경로, 특히 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구, 근내 또는 피하에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 정맥내 주입은 15분만큼 적게, 더욱 흔하게는 30분 동안, 또는 1, 2 또는 심지어 3시간에 걸쳐 제공될 수 있다. mAb는 또한 질병 부위(예를 들어, 종양)에 직접 주사될 수 있거나, 리포솜과 같은 운반 제제로 캡슐화될 수 있다. 제공된 용량은 치료되는 질환을 완화시키기에 충분하고("치료적 유효 용량"), 0.1 내지 5 ㎎/㎏ 체중, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 ㎎/㎏일 수 있으나, 10 ㎎/㎏ 또는 심지어 15 또는 20 또는 30 ㎎/㎏, 예를 들어, 1-10 ㎎/㎏ 또는 1-20 ㎎/㎏의 범위만큼 높을 수 있다. 고정된 단위 용량, 예를 들어, 50, 100, 200, 500 또는 1000 ㎎이 또한 제공될 수 있거나, 용량은, 예를 들어, 1000 ㎎/㎡와 같이 환자의 표면적을 기초로 할 수 있다. 일반적으로, 암을 치료하기 위해 1 내지 8회 용량(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)이 투여되나, 10, 20회 또는 그 이상의 용량이 제공될 수 있다. mAb는 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 3-6개월 이상 동안, 예를 들어, mAb의 반감기에 따라 매일, 1주일에 2회, 매주, 격주, 매월 또는 일부 다른 간격으로 투여될 수 있다. 만성 투여와 같이 반복된 치료 과정이 또한 가능하다.
본 발명의 항-VEGF 및/또는 항-Ang-2 mAb로 특히 치료하기 쉬운 질병은 고형 종양, 예를 들어, 난소암, 유방암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 결장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 간암(간세포 암종), 신장암(신장 세포 암종), 두경부 종양, 흑색종, 육종, 및 뇌종양(예를 들어, 아교모세포종)을 포함하는 혈관신생 및/또는 VEGF 및/또는 Ang-2의 상승된 수준과 관련된 질병을 포함한다. 백혈병 및 림프종과 같은 혈액학적 악성종양이 또한 민감할 수 있다. 바람직한 구현예에서, mAb는 다른 요법과 조합하여(즉, 함께, 즉, 전, 동안 또는 후에) 투여된다. 예를 들어, 암을 치료하기 위해, 본 발명의 mAb는 공지된 화학치료 약물, 예를 들어, 알킬화제, 예를 들어, 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 프로카르바진(procarbazine), 및 사이클로포스파미드; 항대사물질, 예를 들어, 플루오로우라실(fluorouracil), 플록스우리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 하이드록시우레아(hydroxyurea); 식물 알칼로이드 및 항생제를 포함하는 천연 생성물, 예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 에토포시드(etoposide), 미토마이신(mitomycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 및 탁솔(Taxol)(파클리탁셀(paclitaxel)) 또는 관련 화합물, 예를 들어, Taxotere®; 국소이성화효소 1 억제제 이리노테칸(irinotecan); 티로신 키나제의 억제제, 예를 들어, Gleevec®(이마티니브(imatinib)), Sutent® (수니티니브(sunitinib)), Nexavar®(소라페니브(sorafenib)), Tarceva®(에를로티니브(erlotinib)), Tykerb®(라파티니브(lapatinib)), Iressa®(제피티니브(gefitinib)) 및 Xalkori®(크리조티니브(crizotinib)); Rapamycin®(시롤리무스(sirolimus)) 및 다른 mTOR 억제제; 및 혈관신생의 억제제; 및 WO 2005/017107 A2호(참조로서 본원에 포함됨)에 나열된 모든 승인되고 실험적인 항암제 중 하나 이상과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 표준 화학치료 요법에서 1, 2, 3개 이상의 이들 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 다른 제제는 치료되는 암 유형에 효과적인 것으로 이미 생각되거나 공지된 것이다.
암을 치료하기 위해 본 발명의 항-VEGF 및/또는 항-Ang-2 mAb와 함께 투여될 수 있는 다른 제제는 생물제제, 예를 들어, 모노클로날 항체, 예를 들어, HER2 항원에 대한 Herceptin® 또는 Perjeta®(퍼투주맙(pertuzumab)); VEGF에 대한 Avastin®; 또는 표피 성장 인자(EGF) 수용체에 대한 항체, 예를 들어, Erbitux®(세툭시맙(cetuximab)) 및 Vectibix®(파니투무맙(panitumumab)), 뿐만 아니라 항체-약물 컨쥬게이트, 예를 들어, Kadcyla™(아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine))을 포함한다. HGF에 대한 mAb는 mAb L2G7(Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006 및 US Patent No. 7,220,410) 및 특히 이의 키메라 및 인간화 형태, 예를 들어, HuL2G7(US patent No. 7,632,926); WO 2005/017107 A2호에 기재된 인간 항-HGF mAb, 특히 2.12.1; 및 WO 07143090 A2호 또는 WO 07143098 A2호에 기재된 HGF 결합 단백질; 및 상기 언급된 mAb 중 임의의 것과 결합에 대해 경쟁하는 다른 중화 항-HGF mAb를 포함하는 항-VEGF 또는 항-Ang-2 mAb와의 사용에 특히 바람직하다. RON 또는 HGF의 Met 수용체에 결합하는 mAb, 예를 들어, 단지 하나의 "아암(arm)", 즉, 결합 도메인을 갖도록 유전학적으로 조작된 항-cMet mAb OA-5D5(Martens et al., Clin Cancer Res 12:6144, 2006)가 또한 바람직하다. 미국 특허 번호 8,101,725호에 개시된 바와 같은 GAL-F2의 인간화 형태와 같은 FGF2에 결합하는 mAb가 또한 바람직하다. 또한, 항-VEGF 또는 항-Ang-2 mAb는 수술 및/또는 방사선요법 중 임의의 형태와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 항-VEGF 및/또는 항-Ang-2 mAb를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)는 상기 나열된 것과 같은 특정 유형의 암을 갖는 환자의 중간 무진행 생존 또는 전체 생존 시간을 mAb가 없는 동일 치료(예를 들어, 화학요법)에 비해 적어도 20% 또는 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 이상만큼, 또는 (적어도) 2, 3, 4, 6 또는 12개월만큼 증가시킬 수 있다. 또한 또는 대안적으로, mAb를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)는 환자(특히, 재발성 또는 난치성인 경우)의 완전한 반응률, 부분적 반응률, 또는 객관적 반응률(완전 + 부분)을 항-VEGF mAb가 없는 동일 치료(예를 들어, 화학요법)에 비해 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%만큼 증가시킬 수 있다.
통상적으로, 임상 시험(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 화학요법 단독(또는 위약을 더함)을 제공한 환자의 대조군 그룹에 비해 화학요법 및 본 발명의 항-VEGF 및/또는 항-Ang-2 mAb로 치료된 환자의 중간 무진행 또는 전체 생존 및/또는 반응률에서의 상기 언급된 증가는, 예를 들어, p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 통계적으로 유의하다. 반응률은, 예를 들어, 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute) 및/또는 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)에 의해 승인된 바와 같은 암에 대한 임상 시험에서 일반적으로 이용되는 객관적 기준, 예를 들어, RECIST 기준(고형 종양에서의 반응 평가 기준)에 의해 결정되는 것이 또한 이해된다.
본 발명의 항-VEGF 및/또는 항-Ang-2 mAb는 또한 자궁내막증 및 염증 및 자가면역 질병, 특히 혈관신생 또는 VEGF 또는 Ang-2와 관련된 질병, 예를 들어, VEGF의 역할이 밝혀진 염증성장질환(크로병 및 궤양성 대장염)(문헌[Gorlatova et al., PLoS One 6:e27269, 2011 및 Hauser et al., Genes Immun 13:321-7, 2012] 참조), 류마티스 관절염, 건선, 및 신장병, 예를 들어, 사구체신염, 뿐만 아니라 안구 질환, 예를 들어, 연령-관련 황반 변성 또는 당뇨병-관련 망막병증을 치료하는데 사용될 수 있다. 안구 질환에 대해, 눈에 직접 주사될 수 있는 mAb의 단편, 예를 들어, Fab 또는 (Fab')2가 특히 적합할 수 있다.
5. 기타 방법
본 발명의 mAb는 또한 진단적, 예후적 및 실험실 방법에서 사용된다. 이들은 종양을 갖는 환자의 종양 또는 순환에서 VEGF 또는 Ang-2의 수준을 측정하고, 이에 따라 종양의 치료를 수행하고 안내하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상승되거나 높은 수준의 VEGF(각각 Ang-2)와 관련된 종양이 항-VEGF(각각 항-Ang-2) mAb로 특히 치료하기 쉽다. 특정 구현예에서, mAb는, 예를 들어, 종양 생검 표본 또는 혈청 또는 세포 배양에서의 VEGF-분비 세포의 배지 상층액에서 VEGF 또는 Ang-2의 수준을 측정하기 위해 ELISA 또는 방사면역측정법에서 사용될 수 있다. 상이한 에피토프에 결합하는(즉, 결합에 대해 경쟁하지 않는) 2개의 항-VEGF(각각 항-Ang-2) mAb의 사용은 VEGF(각각 Ang-2)를 검출하기 위한 민감한 "샌드위치" ELISA를 개발하는데 특히 유용하다. 다양한 검정에 대해, mAb는 형광 분자, 스핀-표지 분자, 효소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고, VEGF 또는 Ang-2에 대함 검정을 수행하기 위한 모든 필요한 시약을 갖는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 다른 용도에서, 항-VEGF(각각 항-Ang-2) mAb는 친화성 크로마토그래피에 의해 VEGF(각각 Ang-2)를 정제하는데 사용된다.
6. 실시예
실시예 1: 항- VEGF mAb의 생성
인간 VEGF에 결합하고 이의 활성을 차단하는 mAb를 생성시키고 검정하기 위해, 글루타티온 신세타제 - VEGF 융합 단백질, GST-VEGF를 먼저 생성시켰다. 이러한 목적을 위해, 전장 인간 VEGF165를 인코딩하는 cDNA를 작제하고, pGEX 발현 벡터(Invitrogen)의 유도체에 삽입하고, 분자생물학의 표준 방법을 이용하여 BL21(DE3) E.coli 세포(Novagen)를 형질전환시키고, 여기에서 발현시켰다. GST-VEGF를 글루타티온-아가로스 컬럼(Sigma-Aldrich)을 이용하여 E. 콜리 용해질로부터 정제하였다. pCI 벡터(Invitrogen)의 유도체에서 인간 VEGF165의 카르복시(각각 아미노) 말단에 FLAG 태그(아미노산 DYKDDDDK)를 연결시키고, 포유동물 293F 세포에서 발현시킴으로써 2개의 다른 융합 단백질, VEGF-FLAG(각각 FLAG-VEGF)를 생성시켰다. 배양액에 분비된 VEGF-FLAG 또는 FLAG-VEGF의 양을 VEGF 특이적 ELISA를 이용하여 정량하였다. 차단 검정에 대해, 인간 VEGF 수용체 2(VEGFR2)의 세포외 도메인(아미노산 1 내지 760)을 인간 Ig 감마-1 Fc 불변 영역(힌지-cH2-cH3)에 연결시켜 인간 VEGFR-Fc를 생성시켰고, 이는 포유동물 세포에서 생성되고, 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제되었다. 인간 VEGF-121, VEGF-165, VEGF-186, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1 및 마우스 VEGF-A를 구입하였다(R&D Systems).
Balb/c 마우스를 Ribi 애쥬번트 중 정제된 GST-VEGF(첫번째 주사에 대해 10 ㎍ 및 이후 주사에 대해 5 ㎍)로 매주 2회 각각의 뒷 발바닥에서 16-18회 면역화시켰다. 최종 부스트 3일 후, 오금 림프절 세포를 35% 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 뮤린 골수종 세포, P3X63AgU.1(ATCC CRL 1597)과 융합시켰다. 하이브리도마를 기재된 바와 같이 HAT 배지에서 선택하였다(Chuntharapai and Kim, J Immunol 163:766, 1997). 융합 10일 후, 하이브리도마 배양 상층액을 VEGF 결합 ELISA 및 이후 하기 기재되는 VEGF/VEGFR 차단 ELISA에서 스크리닝하였다. 선택된 하이브리도마를 VEGF 결합뿐만 아니라 VEGF/VEGFR 차단에 대한 스크리닝에 의해 2회 클로닝하였다. 13개의 융합체로부터 약 20,000개의 하이브리도마를 스크리닝한 후, VE1.7을 최적의 항-VEGF 항체로 선택하였다. 이러한 항체는 본원에서 VE1로 명명될 것이다. VE1의 동형은 아이소타이핑(isotyping) 키트를 이용하여 IgG2a, 카파인 것으로 결정되었다.
실시예 2: 항- VEGF mAb를 특성규명하기 위해 사용된 검정
본 특허 출원에 기재된 각각의 ELISA 검정의 각각의 단계를, 초기 플레이트 코팅 단계(들)를 4℃에서 밤새 수행한 후, 1시간 동안 2% BSA로 차단한 것을 제외하고는 1시간 동안 적절한 시약을 이용한 실온 인큐베이션에 의해 수행하였다. 각각의 단계 사이에서, 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS 중에서 3회 세척하였다. 데이터 포인트는 일반적으로 3중이었고, 일반적으로 3중 데이터 포인트 사이에서 거의 변동성이 없었다. VEGF에 대한 mAb의 직접 결합을 측정하기 위해, 플레이트를 먼저 밤새 헤파린(50 ㎍/㎖)으로 코팅한 후, 밤새 인간 VEGF165(0.3 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션한 후, BSA로 차단시켰다. 웰을 스크리닝을 위해 하이브리도마 상층액 또는 증가하는 농도의 시험되는 정제된 VE1 mAb 또는 다른 항-VEGF mAb와 함께 인큐베이션하였고, 결합된 mAb를 HRP-염소 항-마우스 IgG 및 이후 TMB 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 용액에서 VEGF에 결합하는 mAb의 능력을 측정하기 위해(포획 검정), 플레이트를 먼저 염소 항-mIgG-Fc(2 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 웰을 증가하는 농도의 시험되는 정제된 VE1 mAb 또는 다른 항-VEGF mAb 및 이후 정제된 mAb에 대해 VEGF-Flag(0.5 ㎍/㎖) 또는 하이브리도마 상층액에 대해 VEGF-FLAG + FLAG-VEGF, 및 마우스 IgG(30 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 VEGF-Flag를 마우스 IgG(15 ㎍/㎖) 및 이후 TMB 기질의 존재하에서의 HRP-항-Flag M2(Sigma)의 첨가에 의해 검출하였다. mAb의 차단 활성을 측정하기 위해, 플레이트를 먼저 염소 항-hIgG-Fc(2 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 이후, 웰을 VEGFR-Fc(0.5 ㎍/㎖), 및 이후 스크리닝을 위해 하이브리도마 상층액 또는 VEGF-Flag(0.5 ㎍/m)와 미리 혼합된 증가하는 농도의 시험되는 정제된 VE1 mAb 또는 다른 항-VEGF mAb와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 VEGF-Flag를 HRP-항-Flag M2 및 이후 TMB 기질의 첨가에 의해 검출하였다.
실시예 3: VE1 항체의 결합 및 차단 활성.
VEGF에 결합하는 VE1의 능력은 상기 기재된 직접 결합 및 포획 검정에서 입증되었다(도 2a). 항-VEGF mAb를 중화시키는 주요 특성인 VEGF의 이의 수용체 VEGFR(VEGFR2)로의 결합을 억제하는 VE1의 능력을 상기 기재된 차단 검정을 이용하여 베바시주맙을 제조하기 위해 인간화된 A4.6.1 mAb의 능력과 비교하였다. 도 2b에 제시된 바와 같이, VE1은 A4.6.1보다 실질적으로 낮은 농도에서 VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 완전히 억제하였다.
실시예 4: 인간화 VE1 항체의 작제 및 특성규명
VE1 mAb의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 클로닝, 키메라 mAb의 작제 및 발현, 및 인간화 VE1 mAb의 설계, 작제, 발현 및 정제를 모두, 예를 들어, 모든 목적상 참조로서 본원에 포함되는 L2G7 mAb에 대한 미국 특허 번호 7,632,926호에 기재된 바와 같은 표준 분자생물학 방법을 이용하여 수행하였다. VE1의 (성숙) 경쇄 및 중쇄 가변(V) 영역의 아미노산 서열은 각각 도 3a 및 3b에서 VE1로 표지된 상단 라인으로 제시된다. 더욱 구체적으로, 인간화 VE1 mAb를 설계하기 위해, 퀸 등(Queen et al.)의 미국 특허 번호 5,530,101호 및 5,585,089호의 방법이 일반적으로 수행되었다. 도 3a 및 3b, 하부 라인에 각각 제시된 인간 VK 서열 AAS01771 및 VH 서열 AAC18292를 각각 VE1 VL 및 VH 서열에 대한 수용체 서열로 제공하기 위해 선택하였는데, 이는 이들이 이들에 대해 특히 높은 프레임워크 상동성(즉, 서열 동일성)을 갖기 때문이다. CDR이 잠재적으로 상호작용하기에 충분히 가까운 VE1 프레임워크 내의 아미노산의 위치를 정하기 위해 VE1 가변 도메인의 컴퓨터-발생 분자 모델을 이용하였다. 인간화 VE1 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 설계하기 위해, 마우스 VE1 mAb로부터의 CDR을 먼저 수용체 프레임워크 영역으로 개념적으로 이식하였다. 컴퓨터 모델이 CDR 입체형태를 유지하는데 필요할 수 있는 CDR과의 유의한 접촉을 제시한 프레임워크 위치에서, 마우스 항체로부터의 아미노산을 인간 프레임워크 아미노산에 대해 대체하였다. 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 각각의 2개의 형태를 상기 방식으로 설계하였다. 경쇄에 대해, 상기 치환이 이루어지지 않았거나(HuVE1-L1), 위치 46 및 81에서 치환이 이루어졌고(HuVE1-L2); 중쇄에 대해, 중쇄의 잔기 46, 69 및 71이 치환되었거나(HuVE1-H1), 이들 잔기 및 추가 잔기 2 및 67이 치환되었으며(HuVE1-H2), 모두 케이뱃 넘버링을 참조하였다. 이들 인간화 경쇄 및 중쇄 V 영역 서열은 도 3a 및 3b에서 각각 중간선으로 표시된 바와 같이 제시되고, 여기서 이들은 각각의 VE1 공여체 및 인간 수용체 V 영역에 대해 정렬되고 - CDR(케이뱃에 의해 정의됨)은 밑줄로 표시되고, 상기 나열된 치환된 아미노산은 이중 밑줄로 표시된다. V 영역 서열을 인간 카파 및 감마-1 C 영역과 연결시켰다. 인간화 경쇄 각각과 인간화 중쇄 각각을 조합시킴으로서, 하기 표에 제시된 바와 같이 HuVE1 #1, #2, #3 및 #4로 명명된 4개의 상이한 인간화 VE1 항체를 제조하였고, 여기서 각 사슬에서의 치환의 수는 괄호 내에 제공된다. 또한, (마우스) VE1의 V 영역과 인간 카파 및 감마-1 C 영역을 조합함으로써 ChVE1로 명명된 키메라 VE1 mAb를 작제하였다.
표: HuVE1 변이체
Figure pct00001
VEGF에 결합하는 ChVE1 및 HuVE1의 4개 형태의 능력을 플레이트에 mAb를 결합시키는데 사용된 항-mIgG-Fc 대신 염소 항-hIgG-Fc를 이용하여 실시예 2에 상기 기재된 바와 같이 포획 검정에서 비교하였다. VE1이 아니라 ChVE1을 이용하여 모든 mAb가 동일 시약을 이용하는 하나의 검정에서 비교될 수 있도록 하였고; ChVE1은 동일한 V 영역을 갖기 때문에 VE1과 동일하게 결합할 것으로 예상된다. 도 4a에서 관찰되는 바와 같이, 모든 항체는 VEGF에 잘 결합하였으나, HuVE1 #3 및 #4는 대략 ChVE1만큼 잘 결합한 반면, HuVE1 #1 및 HuVE1 #2는 매우 잘 결합하지는 않았다. VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 차단하는 ChVE1 및 HuVE1의 4개 형태의 능력을 실시예 2에서 상기 기재된 검정에서 비교하였다. 도 4b에서 관찰되는 바와 같이, 모든 항체는 VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 차단하였으나, HuVE1 #3 및 #4는 대략 ChVE1만큼 잘 억제한 반면, HUVE1 #1 및 HuVE1 #2는 매우 잘 억제하지는 않았다. 이들 결과는 HuVE1-L2에서 이루어진 2개의 아미노산 치환이 상기 경쇄를 함유하는 인간화 mAb의 활성을 개선시키고, 인간화 VE1 제공 HuVE1-L2가 경쇄에 사용된 경우 친화성이 상실되지 않은 것을 제시한다. 추가 연구를 후속되는 것에서 HuVE1로 명명될 HuVE1 #4로 주로 수행하였다.
(포획) VEGF에 결합하고, VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 차단하는 HuVE1 #3 및 HuVE1 #4의 능력을 도 5a에서 결합 및 도 5b에서 차단에 대해 제시된 바와 같이 상기 이용된 동일 검정에서 베바시주맙과 비교하였다. 소프트웨어를 이용하여, 결합에 대한 유효 농도 50%(EC50)를 베바시주맙에 대해 0.09 ㎍/㎖ 및 HuVE1 #3 및 HuVE1 #4 둘 모두에 대해 단지 0.02 ㎍/㎖로 상기 데이터로부터 계산하였다. 유사하게, 차단에 대한 억제 농도 50%(IC50)는 베바시주맙에 대해 0.34 ㎍/㎖ 및 HuVE1 #3에 대해 단지 0.05 ㎍/㎖ 및 HuVE1 #4에 대해 0.06 ㎍/㎖로 계산되었으므로, VEGFR에 대한 VEGF의 결합을 억제하는 중요한 활성에서, HuVE1 #3 및 HuVE1 #4는 각각 베바시주맙보다 약 7배 및 6배 더 강력하였다.
최종적으로, mAb의 중화 활성에 대한 검정인 인간 제대혈 혈관 내피 세포(HUVEC)의 VEGF-유도 증식을 억제하는 HuVE1(HuVE1 #4)의 능력을 베바시주맙과 비교하여 결정하였다. 이러한 검정을 수행하기 위해, 1% FCS 및 0.1% BSA를 갖는 EBM-2 배지에서 96-웰 ELISA 플레이트의 웰 당 5,000개의 HUVEC를 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션한 후, 24시간 동안 0.1% FCS 및 0.1% BSA를 갖는 EBM-2에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 3일 동안 20 ng/㎖의 VEGF 및 증가하는 농도의 mAb를 갖는 동일 배지에서 인큐베이션하였고; 제조업체의 지침에 따라 WST-8을 이용하여 증식의 정도를 결정하였다. 도 6a에서 관찰되는 바와 같이, HuVE1은 베바시주맙에 대한 0.36 ㎍/㎖와 비교하여 0.057 ㎍/㎖로 계산된 IC50으로 백그라운드 수준(VEGF 없음)까지 증식을 억제할 수 있었고, 즉, HuVE1은 이러한 생물학적검정에서 베바시주맙보다 약 6배 더 강력하였고, 이는 수용체 차단 검정에서의 상기 결과와 완전히 일치하였다.
본 발명자는 또한 상기 기재된 검정에서 VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 억제하는 능력에 의해 측정된 바와 같이 HuVE1의 활성을 높은 결합 친화성 또는 활성을 갖는 것으로 주장된 여러 이전에 공개된 항-VEGF mAb의 활성과 비교하였다. 다른 mAb를 먼저 인간화 토끼 mAb hEBV321(US 2012/0231011), 친화성-성숙된 인간화 mAb Y0317(EP 1 787 999), 및 인간 mAbs B20.4.1 및 B20.4.1.1(US 2009/0142343)과 같은 공개된 서열을 기초로 하여 합성하였다. 도 6b로부터 관찰되는 바와 같이, 이들 mAb 중 어느 것도 검정에서 HuVE1만큼 활성이 없었고, 일부는 특히 덜 활성이었다.
HuVE1이 VEGF-A에 특이적으로 결합하는 것을 제시하기 위해, 0.2 ㎍/㎖의 상기 단백질뿐만 아니라 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 2개의 다른 성장 인자 HGF 및 FGF2를 헤파린(50 ㎍/㎖)으로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 먼저 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 2 ㎍/㎖의 HuVE1 또는 대조군 mAb 베바시주맙, HuL2G7, 인간화 GAL-F2 항-FGF2, 또는 음성 대조군 hIgG와 함께 인큐베이션한 후, HRP-염소 항-인간 IgG 및 이후 TMB 기질로 검출하였다. 도 7a에서 관찰되는 바와 같이, 대조군 mAb HuL2G7 및 인간화 GAL-F2는 각각 HGF 및 FGF2에만 결합한 반면, HuVE1(및 베바시주맙)은 백그라운드 수준(hIgG의 결합) 이상으로 VEGF-A에만 결합하였고, 이는 VEGF-A에 대한 HuVE1의 특이성을 나타낸다. (마우스) VE1은 인간화 형태와 동일한 방식으로 결합하므로, 이는 VEGF-A에도 특이적이어야 한다. 유사한 방식으로 수행되나, VEGF를 포획하기 위해 헤파린이 아닌 A4.6.1(2 ㎍/㎖)로 ELISA 플레이트를 코팅한 또 다른 실험에서, HuVE1(및 베바시주맙)은 가장 짧은 형태 VEGF121, 가장 풍부한 형태 VEGF165 및 VEGF189의 VEGF-A의 3개의 상이한 아이소형에 결합하였다(도 7b).
실시예 5: HuVE1의 에피토프
HuVE1(및 따라서 VE1)의 에피토프를 결정하기 위해, 본 발명자는 카르복시 말단에서 인간 카파 불변 영역 및 이어서 Flag 펩티드에 연결된 VEGF의 일련의 유도체(VEGF-KF)에 결합하는 이의 능력을 측정하였다. 상기 목적을 위해, ELISA 웰을 염소 항-인간-Ig-Fc(2 ㎍/㎖)로 코팅하고, 2% BSA로 차단하고, 0.1 ㎍/㎖의 HuVE1(HuVE1 #4) 또는 비교를 위해 베바시주맙 및 이어서 적절한 형태의 VEGF-KF와 인큐베이션하고, HRP-M2-항-Flag 및 기질로 검출하였다. HuVE1 및 베바시주맙이 마우스 VEGF에 결합하지 않는 것이 처음 인지되었다(표지된 바와 같은 도 8b의 두번째 컬럼). 당 분야에서 널리 사용되는 접근법에 따라, 본 발명자는 따라서 인간 VEGF와 마우스 VEGF 사이에 일련의 키메라 분자를 제조하고(도 8a), 각각에 대한 HuVE1 및 베바시주맙의 결합을 측정하였다. 도 8b에서 관찰되는 바와 같이, 이들 mAb는 아미노산 영역 79-104가 인간 VEGF로부터 유래된 키메라 VEGF에만 결합하였고(도 8a에서 짧은 이중 화살표로 제시됨), 따라서 이러한 영역이 mAb의 에피토프를 함유하는 것으로 확인하였고, 이는 베바시주맙에 대한 이전의 보고와 일치하였다.
HuVE1의 에피토프를 베바시주맙의 에피토프와 더 정확하게 비교하기 위해, VEGF의 일련의 돌연변이체에 대한 이들 mAb의 결합을 측정하였다(도 9). 특정 돌연변이, 예를 들어, M81A 및 K84A(도 9a) 및 G88S 또는 G88A(도 9b)는 HuVE1 및 베바시주맙 둘 모두의 결합을 실질적으로 감소시켰고, 이는 아미노산 위치 81, 84 및 88이 이들 mAb의 에피토프에 존재함을 나타낸다. 그러나, 83 및 92와 같은 아미노산에서의 돌연변이는 베바시주맙의 결합을 실질적으로 감소시켰으나, HuVE1의 결합에 대해서는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 이는 베바시주맙의 결합을 본질적으로 제거하나, HuVE1의 결합에 대해서는 많아야 약간의 효과를 미친 이중 돌연변이 M83A/G92A로 더욱 명백히 관찰된다. 본 발명자는 M83 및 G92와 같은 특정 아미노산이 베바시주맙의 에피토프에 존재하나 HuVE1에는 존재하지 않고, 따라서 이들 mAb가 VEGF에 대해 중복되나 동일하지 않은 에피토프를 가져야 한다고 결론내린다.
실시예 6: 항- Ang -2 mAb의 생성
인간 Ang-2에 결합하고 이의 활성을 차단하는 mAb를 생성시키고 검정하기 위해, 여러 Fc-융합 단백질을 분자생물학의 표준 방법을 이용하여 작제하였다. 이러한 목적을 위해, 인간, 뮤린, 및 뮤린-인간 또는 인간-뮤린 키메라 Ang-2의 피브리노겐-유사(F) 도메인(아미노산 274 내지 496)(각각 hAng-2(F), mAng-2(F), m/hAng-2(F) 및 h/mAng-2(F)로 표시됨)을 인코딩하는 cDNA를 작제하였고, 키메라 형태는 각각 인간 Ang-2의 아미노산 411-496에 연결된 뮤린 Ang-2의 아미노산 274-410 또는 그 반대로 구성된다. 이들 cDNA를 N-말단 또는 C-말단에서 인간 Ig 감마-1 Fc 영역(힌지-cH2-cH3)(각각 적절한 수식자를 갖는 Fc-Ang-2(F) 및 Ang-2(F)-Fc로 표시됨), 또는 C-말단에서 인간 카파 불변 영역 및 이어서 Flag 펩티드(hAng-2(F)-KF 등으로 표시됨)에 연결시켰고, pCI 벡터(Invitrogen)의 유도체에 삽입하고, 293F 포유동물 세포를 형질감염시키고, 여기에서 발현시켰다. Fc 융합 단백질을 단백질 A 컬럼(Sigma-Aldrich)을 이용하여 293F 배양 상층액으로부터 정제하였다. pCI 벡터(Invitrogen)의 유도체에서 뮤린/인간 키메라 Ang-2(F)의 N-말단에 FLAG 태그(아미노산 DYKDDDDK)를 연결시키고, 293F 세포에서 발현시키고, 항-FLAG 컬럼을 이용하여 정제하여 Flag-m/hAng-2(F)를 생성시켰다. 또 다른 단백질 펩티드-KLH를 KLH에 hAng-2로부터의 펩티드(아미노산 464-483)를 화학적으로 컨쥬게이션시켜 제조하였다. 차단 검정에 대해, 인간 Tie-2 수용체의 세포외 도메인(아미노산 1 내지 760)을 인간 Ig 감마-1 Fc 불변 영역(힌지-cH2-cH3)에 연결시켜 인간 Tie-2-Fc를 생성시켰고, 이는 포유동물 세포에서 생성되고, 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제되었다.
Balb/c 암컷 마우스를 Ribi 애쥬번트 중 항원(첫번째 주사에 대해 10 ㎍ 및 이후 주사에 대해 5 ㎍ 또는 표시된 바와 같음)으로 매주 2회 각각의 뒷 발바닥에서 면역화시켰다. 한 그룹의 마우스를 hAng-2(F)-Fc 및 Fc-hAng-2(F)를 이용한 최종 부스트로 12회 면역화시켰다. 두번째 그룹의 마우스를 mAng-2(F)-Fc와 교대로 hAng-2(F)-Fc로 6회, 이후 Flag-m/hAng-2(F)로 3회, 이후 mAng-2(F)-Fc와 교대로 hAng-2(F)-Fc로 3회, 이후 Peptide-KLH(6 ㎍)로 2회, 및 m/hAng-2(F)-Fc를 이용한 최종 부스트로 면역화시켰다. 이러한 최종 부스트 3일 후, 오금 림프절 세포를 뮤린 골수종 세포 P3X63AgU.1과 융합시키고, 상기 기재된 바와 같이 HAT 배지에서 하이브리도마를 선택하였다. 하이브리도마 배양 상층액을 먼저 hAng2(F)-KF 포획 ELISA에서 스크리닝한 후, 하기 기재되는 바와 같이 Ang-2Tie2 차단 ELISA를 수행하였다. 선택된 하이브리도마를 Ang2(F)-KF 결합 및 Ang-2/Tie2 차단 활성에 대해 스크리닝하여 2회 클로닝하였다. 26개의 융합체로부터 약 26,000개의 하이브리도마를 스크리닝한 후, 높은 결합 및 차단 활성을 기초로 하여 mAb A2B14.6(본원에서 A2B로 명명됨)을 첫번째 그룹의 마우스 중 하나의 융합체로부터 선택하고, mAb A2T.10.2(본원에서 A2T로 명명됨)를 두번째 그룹의 마우스 중 하나의 융합체로부터 선택하였다. A2B 및 A2T는 아이소타이핑(isotyping) 키트를 이용하여 각각 IgG2b 및 IgG2a 아이소형인 것으로 결정되었다.
A2B 및 A2T를 이전에 강력한 항-혈관신생 효과를 갖는 것으로 밝혀진 다른 항-Ang-2 mAb와 비교하기 위해, 본 발명자는 공개된 서열을 기초로 하여 여러 상기 mAb의 가변 도메인 유전자를 합성하였다: Ab356(J. Oliner et al., op. cit; WO 03/030833호의 SEQ ID NO. 11 및 SEQ ID NO. 12); REGN910(C. Daly et al., op. cit., http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=693224의 NCI Drug Dictionary에서 네스바쿠맙(nesvacumab)으로 확인된 REGN910, 및 이후 네스바쿠맙에 대한 검색에 의해 http://www.genome.jp/dbget에서 획득된 서열); MEDI-3167(A. Buchanan et al., op. cit., 도 1a 및 초록 및 본문), 및 LC06(M. Thomas et al., op. cit., 및 S. Fenn et al., Plos One 8: e61953-e61953, 2013; Protein Data Bank에서 4IMK). 본 발명자는 또한 작제 및 발현을 위한 표준 방법을 이용하여 각각의 mAb의 인간 V 영역을 마우스 C 영역에 연결시킨 인간-마우스 키메라 항체 muAb356, muMEDI-3167 및 muREGN910을 생성시켰고, 따라서 이들 mAb는 동일 검정에서 마우스 항체 A2B 및 A2T와 비교될 수 있으며; 물론 키메라 mAb는 각각의 인간 mAb와 동일한 결합 및 차단 활성을 가질 것으로 예상된다.
실시예 8: 항- Ang -2 mAb의 특성규명
Ang-2에 결합하는 항-Ang-2 mAb의 능력을 측정하기 위해, 염소 항-마우스 IgG-Fc(2 ㎍/㎖)로 코팅된 플레이트를 하이브리도마 상층액 또는 시험되는 정제된 mAb(2 ㎍/㎖) 및 이어서 hAng-2(F)-KF(1 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 hAng2(F)-KF를 HRP-염소-항-IgG-카파(Sigma) 및 이후 TMB 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 뮤린 Ang-2 및 시노몰구스 원숭이 Ang-2에 대한 mAb의 결합을 또한 적절한 Ang-2(F)-KF 작제물을 이용하여 상기 방식으로 측정하였다. 둘 모두의 mAb A2B 및 A2T는 인간 및 시노몰구스 Ang-2에 결합하나, 이전에 공개된 항체 Ab536, MEDI-3167 및 REGN910과는 달리 뮤린 Ang-2에는 검출 가능하게 결합하지 않았다(도 10a). 이 때문에, A2B 및 A2T는 이들 이전 mAb와 상이한 에피토프를 가져야 한다. 유사한 검정에서, 이들 mAb 중 어느 것도 Ang-1에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.
항-Ang-2 mAb의 에피토프를 결정하기 위해, 본 발명자는 또한 상기 기재된 키메라 m/hAng2(F)-KF 및 h/mAng2(F)-KF 단백질에 대한 이들 mAb의 결합 능력을 측정하기 위해 ELISA 검정을 이용하였다. A2B mAb는 h/mAng-2-KF에 결합하였으나, m/hAng-2-KF에는 결합하지 않은 반면, A2T mAb는 m/hAng-2-KF에 결합하였으나, h/mAng-2-KF에는 결합하지 않았으며(도 10b), 이는 A2B 및 A2T가 상이한 에피토프를 갖고, A2T의 에피토프가 아미노산 411-496 영역 내에 함유된 것을 나타낸다.
수용체 (인간) Tie-2에 대한 (인간) Ang-2의 결합을 차단하는 A2B 및 A2T의 능력을 측정하기 위해, ELISA 플레이트를 먼저 염소 항-hIgG-Fc(2 ㎍/㎖) 및 이어서 Tie-2-Fc(0.3 ㎍/㎖)로 코팅한 후, 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-Ang-2 mAb와 혼합된 50 또는 100 ng/㎖의 Ang-2로 코팅하였다. 결합된 Ang-2를 0.5 ㎍/㎖의 비오티닐화된 항-Ang-2 항체(R&D Systems)를 이용하여 검출한 후, HRP-스트렙타비딘 및 TMB 기질을 첨가하였다. 이러한 검정에서, A2B 및 A2T 둘 모두는 Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 완전히 억제하였으며, 이는 MEDI-3167 및 REGN910보다 약간 더 강력하였고, Ab536보다 유의하게 더 강력하였다(도 11).
실시예 9: 인간화 A2T 항체의 작제 및 특성규명
A2B 및 A2T mAb의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 클로닝하고, VE1에 대해 상기 기재된 바와 같이 서열분석하였고 - A2B에 대한 서열은 도 12에 제시된다. 키메라 A2T mAb의 작제 및 발현, 및 인간화 A2T mAb의 설계, 작제, 발현 및 정제를 또한 모두 VE1 mAb에 대해 상기 기재된 바와 같은 분자생물학의 표준 방법을 이용하여 수행하였다. A2T의 (성숙) 경쇄 및 중쇄 가변(V) 영역의 아미노산 서열은 각각 도 13a 및 13b에서 A2T로 표지된 상단 라인으로 제시된다. 도 13a 및 13b, 하부 라인에 각각 제시된 인간 VK 서열 AIT39024 및 VH 서열 AIT38751을 각각 A2T VL 및 VH 서열에 대한 수용체 서열로 제공하기 위해 선택하였는데, 이는 이들의 이들에 대한 높은 프레임워크 상동성 때문이다. 경쇄에 대해, 마우스 서열로부터의 치환을 잔기 49(HuA2T-L1), 또는 잔기 43 및 49(HuA2T-L2)에서 수행하였고; 중쇄에 대해, 중쇄의 잔기 28, 48 및 49를 치환하거나(HuA2T-H1), 이들 잔기 및 추가 잔기 37 및 66을 치환하였고(HuA2T-H2), 모두 케이뱃 넘버링을 참조하였다. 또한, 패턴 N-X-S/T로부터 예측된 위치 58에서의 잠재적 N-연결 당화 부위를 제거하기 위해 마우스 서열로부터의 위치 60(중쇄 CDR2에서)에 T, 또는 인간 수용체 서열로부터의 위치 60에 A를 갖는 각각의 중쇄의 2개의 형태를 작제하였다. 이들 인간화 경쇄 및 중쇄 V 영역 서열은 도 13a 및 13b에서 각각 중간선으로 표시된 바와 같이 제시되고(중쇄의 위치 60에 A를 가짐), 여기서 이들은 각각의 VE1 공여체 및 인간 수용체 V 영역에 대해 정렬되고 - CDR(케이뱃에 의해 정의됨)은 밑줄로 표시되고, 상기 나열된 치환된 아미노산은 이중 밑줄로 표시된다. V 영역 서열을 인간 카파 및 감마-1 C 영역과 연결시켰다. 인간화 경쇄 각각을 인간화 중쇄 각각과 조합시킴으로써, 하기 표에 제시된 바와 같이 위치 60에 T를 갖는 HuA2T #1, #2, #3 및 #4, 및 위치 60에 A를 갖는 HuA2T #1(d), #2(d), #3(d) 및 #4(d)로 각각 명명된 4개의 상이한 인간화 A2T 항체의 2개 세트를 제조하였고, 각각의 사슬에서의 치환의 수는 괄호 내에 제공된다. 또한, (마우스) VE1의 V 영역과 인간 카파 및 감마-1 C 영역을 조합함으로써 ChA2T로 명명된 키메라 A2T mAb를 작제하였다.
표: HuA2T 변이체
Figure pct00002
결합 및 차단 검정에서 위치 60에 T를 갖는 HuA2T 형태를 위치 60에 A를 갖는 각각의 형태와 비교하였고, 예를 들어, 결합에 대해 도 14a 및 차단에 대해 도 14b에서 관찰되는 바와 같이 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, HuA2T 형태는 Ang-2뿐만 아니라 ChA2T에 결합하였고(도 14a), 검정에서 Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 ChA2T보다 약간 더 낫게 실제로 차단하였으며(도 14b), 이는 인간화 동안 활성이 손실되지 않았음을 나타낸다. 가능한 단백질 비균질성 및 다른 문제로 인해 항체 V 영역에서 당화를 갖지 않는 것이 바람직하므로, HuA2T의 탈당화된(d) 형태로 추가 연구를 수행하였다. 4개 모두의 mAb HuA2T #1(d), #2(d), #3(d) 및 #4(d)는 매우 유사하게 결합하고(도 15a), 차단하였으며(도 15b), HuA2T #4(d)는 아마 다른 것들보다 단지 약간 더 우수할 수 있다. 따라서, 이하 모두에서, HuA2T #4(d)는 단순히 HuA2T로 명명될 것이다. 본 발명자는 또한 Tie-2에 대한 Ang-2의 결합 차단에서 HuA2T의 활성이 이전에 기재된 인간 항-Ang-2 mAb REGN910 및 LC06과 유사한 것을 제시하였다(도 16a).
최종적으로, 본 발명자는 더욱 생물학적인 검정에서 HuA2T, REGN910 및 LC06의 활성을 비교하였고: Ang-2의 억제는 Tie-2 인산화를 유도하였다. HEK293 인간 배아 신장 세포(ATCC CRL 1573)를 먼저 발현 벡터에서 Tie-2 유전자로 형질감염시켰고, 따라서 이들 HEK293-Tie-2 세포는 전장 인간 Tie-2 수용체를 발현하였다. 세포를 24-웰 플레이트에서 10% 우 태아 혈청을 갖는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 배지를 혈청이 없는 DMEM-0.1% BSA로 대체하고, 세포를 18시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다양한 농도의 mAb의 존재하에서 인간 재조합 Ang-2(R&D Systems; 1 ㎍/㎖)로 20분(37℃, 5% CO2) 동안 자극하였다. 제조업체의 설명서에 따라 ELISA 키트(R&D Systems #DYC2720)로 인산화된 Tie-2의 수준을 결정하였다. 3개의 mAb는 인산화를 유사하게 억제하였고, HuA2T는 LC06보다 약간 더 나았다(도 16b).
실시예 10: 이특이적 HuVE1 / HuA2T 항체
도 1에 개략적으로 예시된 Bs(scFv)4-IgG 포맷을 이용하여 HuVE1 항-VEGF mAb 및 HuA2T 항-Ang-2 mAb로부터의 결합 도메인을 포함하는 B-HuA2T/HuVE1으로 명명된 이특이적 항체를 작제하였다. 도 1a의 표지화와 관련하여, VL1 및 VH1은 각각 HuVE1-L1 및 HuVE1-H2(도 3)인 반면, VL2 및 VH2는 각각 HuA2T-L1 및 HuA2T-H2(도 13)이고, 각각의 중쇄와 경쇄 도메인 사이의 링커는 (G4S)3GS이고, 불변 영역은 인간 IgG1, 카파 아이소형의 불변 영역이다. 이특이적 B-HuA2T/HuVE1 mAb가 VEGF 및 Ang-2에 동시에 결합할 수 있음을 제시하기 위해, ELISA 플레이트를 GST-VEGF(글루타민 신세타제 및 VEGF의 융합 단백질)로 코팅한 후, 증가하는 농도의 이특이적 mAb 또는 대조군 mAb HuVE1 및 이어서 hAng-2(F)-KF와 함께 인큐베이션한 후, HRP-항-Flag M2 및 TMB 기질로 검출하였다. 플레이트 상의 GST-VEGF 및 용해 상태의 Ang-2 둘 모두에 결합할 수 있는 분자만이 상기 검정에서 양성 신호를 발생시킬 것이다. 상기는 B-HuA2T/HuVE1의 경우이나, VEGF에만 결합할 수 있는 HuVE1의 경우는 아니다(도 17a).
B-HuA2T/HuVE1의 일부로서 활성을 갖는 개별적 mAb로서의 HuVE1 및 HuA2T의 활성을 비교하기 위해, 본 발명자는 먼저 실시예 2에 기재된 VEGF 포획 검정을 이용하여 HuVE1 및 B-HuA2T/HuVE1의 결합 활성을 비교하였다. B-HuA2T/HuVE1의 결합 활성은 EC50에 의해 측정시 HuVE1의 결합 활성보다 단지 약 2배 감소되었고, 중요하게는 인간에서 암에 대해 물론 효과적인 것으로 공지된 베바시주맙보다 여전히 현저하게 더 나았다(도 17b). 유사하게, 실시예 8에 기재된 결합 검정을 이용하여, Ang-2에 대한 B-HuA2T/HuVE1의 결합 활성은 HuA2T의 결합 활성보다 약 3배 감소되었다. 최종적으로, 실시예 8에 기재된 차단 검정을 이용하여, VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 억제하고(도 18a), Tie-2에 대한 Ang-2의 결합을 억제하는(도 18b) B-HuA2T/HuVE1의 능력을 측정하였고: B-HuA2T/HuVE1은 HuVE1 및 HuA2T보다 각각 약 2배 더 활성이 낮았으나, VEGF 및 Ang-2 둘 모두의 이들의 수용체로의 결합을 본질적으로 완전히 차단할 수 있었다. HuVE1 및 HuA2T의 결합 도메인은 B-HuA2T/HuVE1에서 단일쇄 형태이므로, 활성의 일부 상실이 예상치 못한 것이 아니다.
실시예 11: 종양 이종이식편의 성장을 억제하는 VE1 및 HuVE1의 능력
이종이식편 실험을 다양한 투여 요법으로 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Kim et al., Nature 362:841, 1993). 완전 DMEM 배지에서 통상적으로 성장한 인간 종양 세포는 HBSS에서 수거된다. 암컷 무흉선 누드 마우스(5-6주령)의 등 부위에 0.1 ㎖의 HBSS 중 2-10 x 106개의 세포를 피하 주사하였다. 종양 크기가 통상적으로 100 ㎣에 도달하는 경우, 마우스를 무작위로 그룹화시키고, 5 ㎎/㎏(전체 100 ㎍)의 mAb를 0.1 ㎖의 부피로 주 당 2회 i.p. 투여하거나, 기재된 다른 투여 요법을 이용하여 투여하였다. 종양 크기를 2개의 치수[길이 (a) 및 폭 (b)]를 측정함으로써 주 당 2회 결정하였다. 종양 부피를 V = ab2/2에 따라 계산하고, 평균 종양 부피 ± SEM으로 표현하였다. 각 처리 그룹의 마우스의 수는 통상적으로 5-7마리의 마우스이다. 예를 들어, 최종 데이터 포인트에 대해 스튜던츠 t 검정(Student's t test)을 이용하여 통계 분석을 수행할 수 있다.
도 19a는 VE1(5 ㎎/㎏, 주 당 2회)을 이용한 처리가 COLO 205 결장 종양(ATCC CCL-222) 이종이식편의 성장을 억제한 것을 제시한다. 유사하게, 도 19b는 동일 투여 요법에서 HuVE1 #3를 이용한 처리가 COLO 205 이종이식편의 성장을 대략 VE1만큼 잘 억제한 것을 제시한다. 일부 모델에서 HuVE1이 종양 이종이식편의 억제에서 베바시주맙보다 우수한 것을 제시하기 위해, 낮은 용량의 2개의 mAb를 사용하였는데, 이는 높은 용량에서 베바시주맙 자체가 매우 효과적이기 때문이다. 인간 종양이 마우스에서 계대배양되고, 세포주로 전환되지 않은 원발성 간 종양 모델에서, mAb를 주 당 2회 2.5 ㎎/㎏으로 투여한 경우 베바시주맙에 비해 HuVE1의 효능이 더 큰 경향이 있었다(도 20a, p = 0.1). 6일 및 9일에서 1 ㎎/㎏으로 제공되는 경우 베바시주맙은 RPMI 4788 결장 종양 세포의 이종이식편에 대해 효과적이지 않은 반면(Roswell Park Institute, referenced in M. Aonuma et al., Anticancer Res 19:4039-4044, 1999), HuVE1은 부분적으로 효과적이었다(도 20b, HuVE1 대 베바시주맙에 대해 p = 0.01).
유사하게, 원발성 유방 종양 이종이식편 모델에서, mAb가 주 당 1회 5 ㎎/㎏으로 투여되는 경우, 베바시주맙에 비해 HuVE1의 더 큰 효능의 경향이 있었다(도 21).
***
본 발명은 본원의 바람직한 구현예를 참조하여 기재되었으나, 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않은 한, 본 발명의 임의의 단계, 요소, 구현예, 특징 또는 양태는 임의의 순서로 이용될 수 있다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원, 예를 들어, 등록 번호 등은 각각의 개별적 간행물, 특허 및 특허 출원이 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 용어 "본원에"는 단순히 용어 "본원에"가 나오는 섹션 내가 아니라 본 특허 출원의 어느 곳을 나타낸다. 하나 초과의 서열이 상이한 시간의 등록 번호와 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일로서 등록 번호와 관련된 서열이 의도되며, 유효 출원일은 실제 출원일 또는 해당 등록 번호를 개시하는 우선권 출원의 더 이른 출원일을 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> Galaxy Biotech, LLC <120> HIGHLY POTENT MONOCLONAL ANTIBODIES TO ANGIOGENIC FACTORS <130> 1021911 <140> PCT/US2016/051486 <141> 2016-09-13 <150> US 62/218,226 <151> 2015-09-14 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature region of mouse VE1 light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Lys Gly Asn Thr Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequences of the mature variable 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Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Gly Asn Thr Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature human acceptor V region AAS01771 <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature region of mouse VE1 heavy chain <400> 5 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Thr Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Ser Asn Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequences of the mature variable regions of the HuVE1-H1 heavy chain <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Ser Asn Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature variable region of the HuVE1-H2 heavy chain <400> 7 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Ser Asn Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature human acceptor V region AAC18292 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Phe Gly Glu Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the (mature) light chain variable region of the A2B mAb <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the heavy chain variable region of the A2B mAb <400> 10 Glu Ala Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Ala 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Tyr Gly Tyr Asp Gly Tyr His Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature region of mouse A2T light chain <400> 11 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Arg Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly His Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequences of the mature variable regions of the HuA2T-L1 light chain <400> 12 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Arg Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly His Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature variable region of the HuA2T-L2 light chain <400> 13 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Arg Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly His Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature human acceptor V region AIT39024 <400> 14 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature region of mouse A2T heavy chain <400> 15 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg His 20 25 30 Trp Met Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Glu Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Asn Phe Phe Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Met Asn Lys Val Gly Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Asp Asp Phe Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequences of the mature variable regions of the HuA2T-H1 heavy chain <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg His 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Glu Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Asp Asp Phe Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature variable region of the HuA2T-H2 heavy chain <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg His 20 25 30 Trp Met Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Glu Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Asn Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Asp Asp Phe Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence of the mature human acceptor V region AIT38751 <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Arg Arg Leu Gly Glu Leu Ser Ala Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 20 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ile Phe Ile Pro Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid FLAG tag <400> 22 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (20)

  1. VEGF에 결합하여 이를 중화시키고, VE1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 모노클로날 항체(mAb).
  2. 제1항에 있어서, 도 3a의 VE1의 경쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역 및 도 3b의 VE1의 중쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb.
  3. 제2항에 있어서, 인간화 항체인 mAb.
  4. 제2항에 있어서, 도 3a의 HuVE1-L1 또는 HuVE1-L2의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 도 3b의 HuVE1-H1 또는 HuVE1-H2의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb.
  5. 제2항에 있어서, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편 또는 단일쇄 항체인 mAb.
  6. 제2항에 있어서, 마우스에서 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제하는 mAb.
  7. 제2항에 있어서, 이특이적 항체인 mAb.
  8. 제7항에 있어서, VEGF에 결합하는 제1 결합 도메인 및 HGF 또는 FGF2 또는 Ang-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 mAb.
  9. 제7항에 있어서, 단량체 각각이 VEGF에 결합하는 제1 결합 도메인 및 HGF 또는 FGF2 또는 Ang-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 단량체의 동종이량체인 mAb.
  10. 제2항의 mAb를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제10항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질병을 가진 환자를 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 질병이 암인 방법.
  13. Ang-2에 결합하여 이를 중화시키고, A2T 항체와 동일한 에피토프를 갖는 모노클로날 항체(mAb).
  14. 제13항에 있어서, 도 13a의 A2T의 경쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역 및 도 13b의 A2T의 중쇄 가변 영역 서열로부터의 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb.
  15. 제14항에 있어서, 인간화 항체인 mAb.
  16. 제15항에 있어서, 도 13a의 HuA2T-L1 또는 HuA2T-L2의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 도 13b의 HuA2T-H1 또는 HuA2T-H2의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 mAb.
  17. 제14항에 있어서, 이특이적 항체인 mAb.
  18. 제14항의 mAb를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 제18항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병을 가진 환자를 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 질병이 암인 방법.
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