KR20180041467A

KR20180041467A - 코어-푸코실화 알파-페토프로테인에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역 분석법

Info

Publication number: KR20180041467A
Application number: KR1020160133666A
Authority: KR
Inventors: 구미영; 우소연; 백승한; 황규상
Original assignee: 에스케이텔레콤 주식회사
Priority date: 2016-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2018-04-24

Abstract

본 발명은 코어 푸코실레이션된 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 간암 조기 진단을 위한 코어푸코실레이션된 알파페토프로테인의 항체 및 항체 기반 정량방법에 관한 것이다.

Description

코어-푸코실화 알파-페토프로테인에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역 분석법{Immunoassay using antibody specifically binding to core fucosylated alpha-fetoprotein}

본 발명은 코어 푸코실화 알파-페토프로테인(core fucosylated alpha-fetoprotein)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 AFP-L3 탐지, 정량 또는 간암을 진단하는 방법과 AFP-L3 탐지, 정량 또는 간암 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

종합적인 암 관리를 통한 암 발생, 암 사망의 최소화로 암 부담의 획기적 감소를 위한 방법은 암의 조기검진이다. 암의 스크리닝(screening) 및 모니터링(monitoring)의 개념에서 다수의 사람을 빠르게 암을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 간암 진단 스크리닝 및 모니터링을 위한 알파-페토프로테인(Alpha FetoProtein, AFP) 모노클로날 항체들의 개발이 요구되고 있다.

AFP는 당단백질의 일종으로 간세포 암종(Hepatocellular carcinoma,HCC)의 종양 표지자이다. AFP은 구조상 알부민과 상동성이 높으며, 태생 간기 및 난황에서 생성되어 태령 13-14주에 최고치에 달하며 생후 감소하기 시작하여 12개월이 지나면 성인치(<10ug/L)까지 감소한다. 산부인과 질환에서 임신부의 혈중 및 양수 중 AFP 증가는 무뇌아, 척추파열, 수두증 등 선천성 이상의 지표로 활용되기도 한다.

대부분의 종양 표지자와는 달리 AFP는 선별검사에 매우 유용하며, 한국을 비롯한 중국, 일본, 알라스카 및 아프리카 등의 간세포암 유병율이 높은 지역에서 간세포암의 고위험군을 선별하는데 이용되고 있다. 종양표지자가 감소하면 성공적인 치료를 의미하고 반대로 상승하면 재발이나 전이를 의미하므로 종양 표지자는 종양의 예후 및 크기와 밀접한 관련이 있다.

AFP는 당쇄 구조 및 렉틴 중의 하나인 Lens culinaris agglutinin(LCA) 에 대한 결합 친화도에 따라, L1, L2 및 L3의 3가지 이소타입으로 구분될 수 있다. AFP-L3는 푸코실화된 AFP 또는 렉틴-반응성 AFP라고도 불리우며, 간세포암의 선별검사에 이용되는 물질이다. AFP-L1는 주로 양성 간질환에서 발현되며 푸코실화되지 않은 당을 가지고 있는 형태이며, AFP-L2가 주로 임산부에서 발현되며 AFP-L2도 코어-푸코실화된 형태의 AFP이나 당의 형태는 AFP-L3와는 다르다.

2005년, FDA는 AFP-L3를 원발성 간암의 바이오마커 하나로 정식으로 허가하였다. AFP-L3는 간암의 조기진단, 치료 효과 평가 및 예후 감시 등의 면에서 활용되어 기존의 AFP를 이용한 진단에 비해 진단의 정확성을 높이기 위해 사용되고 있다.

푸코스는 메틸화된 육탄당이며 조직 및 혈청의 몇 개의 당단백질 당쇄 존재해, 단백질 결합 푸코스(protein-bound fucose)라고 칭해진다. AFP 탄수화물 체인에 푸코스 잔기를 가지며, 이러한 변이체가 푸코스화 AFP(FucAFP) 라고 칭해져 AFP 총량에 차지하는 백분율이 푸코스화 지수(Fucosylation Index, Fuol) 라고 칭해진다. 푸코스화 지수는 중요한 이론적 의의 및 임상 응용적인 의의를 가지며, 간암 진단 및 예후 응용에 중요한 지표라고 해도 좋다.

간암 및 간 질환 진단을 위해 사용된 마커 중의 하나인 AFP의 낮은 진단 민감도 부분을 개선하기 위해, wako 사에서는 AFP의 서브타입 중의 하나인 AFP-L3 를 진단 마커로 이용하여 AFP-L3%를 계산하여 간 질환 진단을 위한 도구로 활용하고 있다.

구체적으로 Wako가 개발한 검사방법은 혈청 중에서 총 AFP의 렉틴 반응성에 의한 분획비(AFP-L3 %)를 측정하는 것이다. Wako 기술에 의하면, 간경변이나 만성 B형 바이러스 감염에서 AFP-L3% 수치가 10% 이상이면 간암 가능성이 매우 높다는 것을 의미하며, 뿐만 아니라 간암에서 AFP-L3%가 양성이라면 암의 진행속도가 빠르고 종양 크기는 상대적으로 크고 간문맥 정맥이 침범, 다른 장기로 전이와도 관련이 있다는 보고가 많아 예후를 추정하는 데 중요한 수단이 될 수 있음을 설명하고 있다.

Wako 사의 기기(u-TASWAKO i30)는 항체기반의 AFP-L3 단백질의 정량법이 아닌 렉틴이라고 하는 당 친화단백질의 성질을 이용하여 형광 신호를 측청하는 방법으로, AFP 단백질 전체를 인지하는 포획 항체(capture antibody)를 이용하여 먼저 혈액 내 AFP를 분리한 다음, 렉틴 단백질이 포함된 아가로스 겔에 전기영동을 하여 렉틴과 반응을 하는 AFP-L3 타입을 분리하여 전체 AFP 형광값 중에 렉틴과 반응하는 구간의 형광값을 %화 하여 AFP-L3 %를 측정하는 방식의 진단법을 이용한다. 그러나, 본 원리로 AFP-L3%를 측정하는 경우, 렉틴 단백질의 당친화도가 비특이 반응이 있어 AFP-L3 %를 정량하는 정확도가 감소하게 된다. 또한 Wako 사의 별도의 장비가 필요하게 되어 기존 병원에서 많이 사용되는 core-lab 장비들과의 multiple maker를 이용한 동시 진단 알고리즘 적용 및 비교가 불가능하며, 하나의 분석당 비용 및 시료의 양이 다량 필요하여 많이 활용되지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 AFP-L3을 혈청 내에서 특이적으로 인지할 수 있는 항체와 이를 이용한 AFP-L3 탐지 및 정량방법이 필요한 실정이다. 질병 진단의 유용한 표지자인 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, AFP의 코어-푸코실화의 유무를 구별하는 항체의 개발이 간암 진단의 정확도를 높이기 위한 진단법의 활용 및 보급화를 위해 필요한 실정이다.

본 발명의 일예는 항체기반의 AFP-L3 탐지 또는 정량을 위해, AFP-L3를 특이적 및 선택적으로 인지하는 항체를 개발하고, 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3 에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 선택적으로 구별하여 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3)에 선택적으로 결합할 수 있은 항체를 이용하여 간암 진단용 조성물 또는 간암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일예는 코어-푸코실화된 AFP에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 선택적으로 구별하여 코어-푸코실화된 AFP에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 간암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는, 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 선택적으로 구별하여 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 선택적으로 결합할 수 있은 항체를 이용하여 시료 내 존재하는 AFP-L3를 선택적 및 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 정량 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는, 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 선택적으로 구별하여 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 선택적으로 결합할 수 있은 항체를 이용하여 시료내 존재하는 AFP-L3를 선택적 및 특이적으로 검출하는 키트 및 이를 이용한 정량용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 코어 푸코실화 AFP(AFP-L3)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 간암을 진단하는 방법 및 항체 기반 정량방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 시료 내 AFP-L3을 검출하거나 정확한 정량을 용이하게 할 수 있으며, 이에 따라 간암의 진단 또는 예후를 정확하게 분석할 수 있다.

본 명세서에서 표현, " 간암 진단 또는 예후 분석용 키트"는 간암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "간암의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 "진단 또는 예후 분석용 조성물"서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 "간암"(liver cancer)이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다.

본 발명의 일 예에서, 항-AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, AFP-L1과 구별하여 AFP-L3에 특이적으로 결합하므로, 이러한 특성을 이용한 면역 분석 방법 또는 면역 분석 키트에 이용될 수 있으며, AFP-L3의 탐지, 검출 또는 정량하는 방법 또는 탐지, 검출 또는 정량용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 일 예에서, 항 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 AFP-L3에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 AFP-L3 종양 표지자와 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.

또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계; 및 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 AFP-L3 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 진단 방법 또는 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액, 혈장 또는 혈액 등일 수 있다. 상기 진단 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 사람이다.

본 발명에 적용 가능한 포획 항체는 코어-푸코실화되지 않은 알파-페토프테인(AFP)과 구별하여 항원으로서 코어-푸코실화된 AFP에 특이적으로 결합하는 포획 항체일 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 포획 항체는 푸코실화되지 않은 AFP인 AFP-L1에 비해 높은 친화력으로 선택적으로 AFP-L3에 결합하는 항체이다.

본 발명에 따른 항-AFP-L3 항체는 푸코스(fucose)가 없는 AFP에는 낮은 친화도 및 선택도를 보인다. 본 발명에 따른 항체가 인지하는 코어-푸코실화된 AFP의 구조는 도 1에 나타냈다. 도 1은 AFP의 당 구조 및 개발 항체 인지 성능 정도의 모식도를 나타낸다. AFP-L1에 비해 상대적으로 AFP-L3에 대한 높은 특이도 및 선택도로 인식하는 항체는 AFP 단백질의 구조가 현재 명확히 규명되지 않으며, 또한 두 단백질이 동일한 염기서열을 가지면서 당의 구조상 푸코스 존재 유무의 차이만을 가지고 있기 때문에, AFP-L1에서 푸코스 만을 추가로 가진 AFP-L3 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 개발의 난이도가 매우 높아 개발하기 어려웠다.

Wako 사의 u-TASWAKO i30 장비를 이용한 AFP-L3의 측정법에 사용하는 렉틴, 특히 LCA 단백질에 비해, 본 발명에 따른 항체는 코어-푸코실화된 AFP-L3를 특이적으로 인지하여 결합함으로 렉틴을 이용한 측정법에 대해서 측정의 정확성이 높으며, 기존 AFP-L3 진단 장비에 비해 AFP-L3을 정확히 정량할 수 있어 이에 기반한 간암의 진단 및 예후의 판단이 가능하다.

본 발명에 따른 AFP-L3 항체는 기존에 암 진단을 위한 단백질의 유무 및 정량 측정법을 위한 기기에 바로 적용이 가능하여 빠르고 간편할 뿐만 아니라, 멀티마커를 이용한 진단의 정확도를 높이기 위해 적용하는 멀티마커 알고리즘에도 AFP-L3 항체수치를 적용가능하며 이를 통해 간암의 조기 진단의 정확도를 더 높일 수 있는 진단 기준을 제시 가능하다. fucose 당의 유무에 따라 반응성의 차이를 보이며 이에 대한 성능 검증을 Sandwich ELISA를 이용하여 본원 발명에 따른 항체가 AFP-L3를 AFP-L1에 비해 더 잘 인지하며, AFP 단백질에 당을 제거하였을 경우 반응성이 낮아지는 특성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 일 예에 있어서, 항-AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 상기 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 대한 항체는, 인간 AFP (Accession #NP001125.1)중 251번째 아스파라진 아미노산을 포함하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 에피토프(항원결정부위)로서 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 에피토프를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합, 및 이와 경쟁적으로 AFP-L3 에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 샌드위치 ELISA 분석(Sandwich ELISA assay)을 기반으로 AFP-L3에 대한 분석을 수행함에 있어, 상기 항체를 포획(capture) 항체로 사용하고, 각 웰에 있는 천연 AFP-L1와 천연 AFP-L3 단백질에 모두 반응하여 AFP 전체를 인지하는 항체를 탐지(Detector)항체로 측정하게 되면, 천연 AFP-L1 및 AFP-L3의 농도가 각각 50ng/ml 이상의 구간에서 AFP-L1에 대한 AFP-L3의 O.D 값의 비율이 1.5배 이상, 예를 들면 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상 또는 2.0배 이상의 값을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 AFP-L3의 농도가 50ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 100 ng/ml이상, 200ng/ml 이상의 농도에서 AFP-L1에 대한 AFP-L3의 구별능이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 예에서, 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서, 일반식 1(서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 일반식 2(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 일반식 3(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

[일반식 1]

GX₁X₂X₃X₄X₅X₆GX₇G

상기 식에서, X₁는 F, S, Y, I, 또는 L이고, X₂는 S, P, F, 또는 Y이고, X₃는 F, S, I, 또는 L이고, X₄는 S, T, G, 또는 R이고, X₅는 D, N, G, 또는 V이고, X₆는 H, 또는 R이고, X₇는 L, M, V, 또는 I이고,

[일반식 2]

SX₈TX₉GGX₁₀X₁₁TWX₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂

상기 식에서, X8은 I 또는 T이고, X9은 S, 또는 N이고, X10은 S, G 또는 R 이고, X11은 G 또는 I이고, X12는 Y 또는 N이고, X13은 A, S 또는 T이고, X14는 P 또는 S이고, X15는 A 또는 T이고, X16은 V 또는 M이고, X17은 K, R 또는 E이고, X18은 G, 또는 V이고, X19는 R 또는 P이고, X20은 A 또는 T이고, X21은 T 또는 S이고, X22는 I 또는 F이고,

[일반식 3]

SAX₂₃GGWIX₂₄X₂₅DX₂₆X₂₇X₂₈

상기 식에서, X₂₃은 Y 또는 V이고, X₂₄는 A 또는 V이고, X₂₅는 D, G, S 또는 E이고, X₂₆은 I, V 또는 T이고, X₂₇은 D, V 또는 N이고, X₂₈은 A, V, S 또는 T이다.

더욱 자세하게는, 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서,

서열번호 7 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1),

서열번호 12 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및

서열번호 15 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)

로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

항AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서, 일반식 4(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 일반식 5(서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 일반식 6(서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

[일반식 4]

SGGX₂₉X₃₀X₃₁G

상기 식에서, X29은 S 또는 R, X30는 G, D, 또는 S, X31는 Y, C, 또는 H이고,

[일반식 5]

YX₃₂X₃₃X₃₄X₃₅RX₃₆X₃₇

상기 식에서, X32는 E 또는 D이고, X33은 S, C 또는 N이고, X34는 N, S, Y, D, T 또는 H이고, X35는 K, R 또는 H이고, X36은 P 또는 L이고, X37은 S, T, P 또는 L이고,

[일반식 6]

GGX₃₈X₃₉SX₄₀X₄₁X₄₂PGX₄₃FGA

상기 식에서, X38은 W 또는 R이고, X39는 E 또는 G이고, X40은 S, N, G, Y 또는 V이고, X41은 S 또는 N이고, X42는 I, T, 또는 V이고, X43은 A 또는 T이다.

더욱 자세하게는, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서,

서열번호 19 내지 서열번호 21으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1),

서열번호 22 내지 서열번호 27으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및

서열번호 28 내지 서열번호 32으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)

로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

구체예에서, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기한 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 AFP-L3항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 7 내지 서열번호 27 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 28 내지 서열번호 48 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 49 내지 서열번호 61 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 62 내지 서열번호 68 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 69 내지 서열번호 85 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 86 내지 서열번호 98 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 AFP-L3 항체의 중쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

CDR-H1	서열번호	CDR-H2	서열번호	CDR-H3	서열번호
GFSFSDHGMG	7	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	28	SAYGGWIADDIDA	49
GFYFSDHGMG	8	SITSGGRGTWYAPAVKGRATI	29	SAYGGWIAEDIDA	50
GFSFSVHGMG	9	SITSGGSGTWYAPAVKVRATI	30	SVYGGWIADDIDA	51
GFSFSDRGMG	10	SITNGGSGTWYAPAVKGRATI	31	SAYGGWIADDVDA	52
GSSFSDHGMG	11	SITSGGGGTWYAPAVKGRATI	32	SAYGGWIASDIDA	53
GFSFSDHGLG	12	SITSGGSGIWYAPAVKGRATI	33	SAYGGWIADDIDS	54
GFSLGDHGMG	13	SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI	34	SAYGGWIADDIDV	55
GISFSDHGMG	14	SITGGGSGTWYAPAVKGRATI	35	SAYGGWIADDTDA	56
GFSFGDHGMG	15	SITSGGSGTWYTPAVRGRATI	36	SAYGGWIADDIVA	57
GFFFSDHGMG	16	SITSGGSGTWYAPAVKGRATF	37	SAYGGWIADDIDT	58
GFPFSDHGMG	17	SITSGGSGTWYAPAMKGRATI	38	SAYGGWIADDINA	59
GYSFSDHGMG	18	SITSGGSGTWYSPAVKGRATI	39	SAYGGWIVDDIDA	60
GFSFSDHGIG	19	STTSGGSGTWYAPAVKGRATI	40	SAYGGWIAGDINA	61
GFSFSNHGMG	20	SITSGGGGIWYAPAVKGRATI	41
GLSFSVHGMG	21	SITSGGSGTWYAPAVKGRVTI	42
GFSFSDHGVG	22	SITSGGSGTWYAPAVEGRATI	43
GFSFSGHGMG	23	SITSGGSGTWNAPAVKGRATI	44
GFSFTDHGMG	24	SITSGGSGTWYAPAVKGRASI	45
GFSISDHGMG	25	SITSGGSGTWYAPTVKGRATI	46
GFPFRDHGMG	26	SITSGGSGTWYASTVKGRATI	47
GFSSSVHGMG	27	SITSGGSGTWYAPAVKGRAII	48

구체적으로, 항 AFP-L3 항체의 경쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

CDR-L1	서열번호	CDR-L2	서열번호	CDR-L3	서열번호
SGGSGYG	62	YESNKRPS	69	GGWESSSNPGIFGA	86
SGGSDYG	63	YESDKRPS	70	GGRESSSNPGIFGA	87
SGGSSYG	64	YESTKRPS	71	GGWESNSNPGIFGA	88
SGGSGCG	65	YESSKRPS	72	GGWGSSSNPGIFGA	89
SGGRSYG	66	YESNMRPS	73	GGWESNSNPGTFGA	90
SGGSGHG	67	YESNRRPS	74	GGWESSSNPGVFGA	91
SGGRGYG	68	YESTKRPP	75	GGWESGSNPGIFGA	92
		YENNKRPS	76	GGWESSSNPGIFGT	93
		YESHKRPS	77	GGWESYSNPGIFGA	94
		YESNKRPP	78	GGWESVSNPGIFGA	95
		YESNKRPT	79	GGWESSSSPGIFGA	96
		YESNKRLS	80	GGWESSNNPGIFGA	97
		YESNKRPL	81	GGWESSSKPGIFGA	98
		YDSNKRPS	82
		YDSDKRPS	83
		YECNKRPS	84
		YESYKRPS	85

본 발명에 따른 항체의 일예는, 하기 표 11에 나타낸 상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합을 갖는 항체일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

항 AFP-L3　항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 AFP-L3 항체는 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다. 최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에 적용 가능한 탐지 항체는, 포획 항체에 의해 포획된 목적 항원인 코어-글루코실화 알파페토프로테인 L3(AFP-L3)에 결합가능하며, 포획 항체와 목적 항원의 결합을 방해하지 아니하여야 한다. 구체적으로 포획 항체와 에피토프가 상이하며 탐지 항체의 항원에 결합이 포획 항체와 항원의 결합을 방해하지 않아야 하며, 포획 항체와 비경쟁적으로 목적 항체에 결합 가능한 항체일 수 있다. 포획 항체는 AFP-L1과는 구별하여 목적 항원인 코어-글루코실화 알파페토프로테인 L3(AFP-L3)에 특이적으로 결합하는 항체이므로, 이미 포획된 항체는 AFP-L3이므로, 탐지항체와 경쟁적인 결합을 통해 AFP-L3의 결합 특이성을 제공하기 위한 렉틴이 필요하지 않으며, 또한 AFP에 결합 가능한 항체라면 반드시 AFP-L3에 특이성을 갖는 항체이지 않아도 무방하다.

본 발명의 일예에서, 상기 포획 항체는 기재에 고정되어 사용되는 것이 바람직하며, 따라서 렉틴을 기재에 고정화하여 사용하는 탐지기술 또는 포획항체에 포획된 AFP에 대해 탐지 항체와 경쟁적인 결합을 제공하는 위한 렉틴을 사용하는 기술과는 전혀 상이하다. 또한, 발명에 따른 AFP-L1과는 구별하여 목적 항원인 코어-글루코실화 알파페토프로테인 L3(AFP-L3)에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 면역 분석 방법, 키트 또는 조성물은 렉틴을 필요하지 않는 다는 점에서 장점이 있으며, 면역 분석 정확성 또한 매우 높은 기술이다.

본 발명의 일예에서, 상기 포획 항체를 고정 가능한 기재는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 금, 유리, 변형된 실리콘, 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리프로필렌(polyprophylene) 등 흔히 사용되는 중합체나 겔 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 기재의 표면은 중합체, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 막 등으로 표면 처리될 수 있다.

상기 기재는 지지체로서의 역할뿐 아니라, 고정된 항체와 항원 간의 결합 반응이 일어나는 장소를 제공한다. 상기 기재의 규격 및 기판상에 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기계(spotting machine) 및 스캐너 등의 장치에 따라 변화될 수 있다. 상기 기재의 형태는 편평한 형태, 비드 등 다양한 형태로 선택될 수 있다.

상기 포획 항체를 기재에 고정하는 단계에서 다양한 가교제를 사용할 수 있으며, 기재의 표면에 존재하는 화합물에 따라 달리 선택할 수 있다. 가교제는 아민기, 티올기, 카르복실기, 알데하이드기 등의 작용기들을 연결시켜 결합시키는 것들을 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 일예는, 항AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 시료 내 AFP-L3을 검출 또는 정량하는 방법은, 효소반응을 이용한 면역측정법를 이용할 경우 하기와 같은 구체적인 방법으로 수행될 수 있다.

ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 탐지 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 AFP-L3을 검출방법은 샌드위치 ELISA를 이용한 면역 분석법일 수 있으며, 구체적으로, 기재에 AFP-L3에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 고정하고, 상기 포획 항체가 고정된 기재에 분석 시료를 처리하여 상기 포획항체를 이용하여 AFP-L3를 포획하며, 표지자가 결합된 탐지 항체를 처리하여 상기 포획된 AFP-L3와 탐지 항체의 결합체를 얻고, 상기 결합된 탐지 항체에 있는 표지자를 이용하여 포획된 AFP-L3을 검출하는 단계를 포함한다.

상기 방법에 있어서, 농도를 알고 있는 AFP-L3 표준물질을 이용하여 각 농도별 표지자의 측정치를 이용하여 표준곡선을 얻는 단계를 추가로 포함하며, 시료를 이용한 표지자의 측정치를 상기 표준곡선에 대입하여 시료 내 존재하는 AFP-L3를 정량하는 방법을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 예에서, 샌드위치 ELISA 분석법으로 AFP-L3를 정량하는 방법이 제공된다.

AFP-L3를 검출 또는 정량하기 위해 적용하는 항체는 AFP-L3를 특이적으로 인지하고 AFP-L1에 대해서는 선택적으로 결합하지 않은 항체(포획 항체)와 core-fucosylation AFP의 영역과 반응하지 않고 AFP의 L1 및 L3의 공통적인 영역을 인지하면서 AFP-L3 항체와 짝을 이룰 수 있는 AFP 항체(탐지 항체)를 적용한다

본 발명에 따라 형광물질을 사용한 구체적 ELISA 분석 방법을 예를 들면, AFP-L3를 특이적으로 인지하는 포획항체를 ELISA plate에 고정화하고, 고정화 후 남은 AFP-L3 항체 시약 제거하고, BSA solution으로 AFP-L3 항체가 고정화 되지 않은 부분을 코팅하여 블라킹 진행하고,

블라킹 시약 제거 후, AFP-L1, AFP-L3 표준 단백질 혹은 임상 샘플을 각 well에 반응하고, 반응이 끝난 표준단백질 혹은 임상샘플을 제거 후 PBST 용액으로 3회 washing 진행하고,

형광 효소가 접합된 (ex.Biotinylation)된 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하지 않고 AFP-L3의 당화 부분을 인지하지 않는 AFP를 인지하는 항체를 각 well에 반응하고, 반응이 끝난 AFP 항체를 제거한 후, PBST 용액으로 3회 washing 진행하고,

형광을 발색할 수 있는 Substrate를 넣고 발색 반응 유도 후 O.D값을 측정하여 AFP-L3을 검출하고 정량할 수 있다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 AFP-L3 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 간암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체복합체의 형성량은 검출 표지자(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 표지자은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

검출 표지자로 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase,RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 예를 들면, HRP substrate를 이용하여 발색하는 경우에는 ABTS, TMB, OPD등의 시약을 이용할 수 있다. 또한 AP(alkaline phosphatase)를 substrate로 사용하는 경우에는 pNPP를 적용하여 발색 O.D 값을 얻을 수 있다.

효소 반응을 이용하는 경우 효소는 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소짐, 당류 옥시다제(예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제(예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 이용할 수 있으며, 효소를 탐지항체에 직접 또는 링커를 이용하여 연결할 수 있다.

상기 링커의 예로 아비딘(Avidin)을 사용하는 경우 탐지 항체에 비오틴을 결합하여 사용할 수 있다. 상기 효소의 기질을 반응에 첨가하여 기질-효소 반응을 일으키고 반응 결과를 측정하여 항원-항체 반응을 검출 또는 측정할 수 있다. 상기 기질-효소 반응의 결과가 색상의 변화를 가져오는 경우 특정 파장에서 spectrophotometer를 이용하여 광학밀도(optical density, OD)을 측정할 수 있다. 농도를 알고 있는 AFP-L3 표준품을 이용하여 각 농도별 표지자의 OD를 이용하여 표준곡선을 얻는 경우, 시료의 OD 값을 상기 표준곡선에 대입하여 시료 내 AFP-L3의 농도를 정량할 수 있다.

형광물질에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물질에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.

항원과 항체의 결합을 화학발광반응(chemiluminescence)를 이용하여 측정하는 원리를 활용한 화학발광 면역측정법(chemiluminescence immunoassay)를 사용한다. 화학발광 반응이란 화학발광 물질이 저에너지 상태에서 고에너지 상태로 여기되었다가 기저 상태로 돌아오면서 빛을 내는 현상으로 분자를 여기시키는 에너지가 빛이 아닌 화학반응이라는 점에서 형광과 다르며, 효소를 이용한 면역분석법에 비해 높은 민감도를 보인다.

본 발명의 일예는, 항AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 시료내 AFP-L3을 탐지 또는 정량하는 방법은, 화학발광 면역측정법를 이용할 경우 하기와 같은 구체적인 방법으로 수행될 수 있다. 화학발광 반응이란 화학발광 물질이 저에너지 상태에서 고에너지 상태로 여기되었다가 기저 상태로 돌아오면서 빛을 내는 현상으로 분자를 여기시키는 에너지가 빛이 아닌 화학반응이라는 점에서 형광과는 다르다. 상기 탐지항체에 결합된 chemiluminescence 표지자를 이용하여 결합된 chemiluminescence를 에너지를 발광할 수 있게 높은 에너지 준위로 만든 후 에너지가 감소될 때 나오는 빛의 양을 측정하여 항원-항원 반응을 탐지하는 것이다.

예를 들면, 화학 발광 단백질 칩을 사용하는 푸코스화 단백질의 정량 측정 방법은 (1) 시료 내 AFP-L3 단백질을 측정하는 단계, (2) AFP-L3의 표준 곡선 방정식을 얻는 단계, 및 (3) 시료 내 AFP-L3 농도를 산출하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 단계 (1)은 시료를 측정하는 단계로서, 측정 대기 혈청 시료를 희석한 후 상기 화학 발광 단백질 칩의 측정 서브 영역 상에 적가하고, 탐지 항체로서 비오틴 표지 항AFP 항체를 넣고, 아비딘 HRP을 처리하고 HRP 기질 발광액을 넣어 화학 발광 스캐너로 AFP-L3의 발광값을 얻는 단계를 포함한다. 단계 (2)은 AFP-L3의 표준 곡선 방정식을 얻는 단계로서, AFP-L3 표준품의 농도를 가로축으로 하고, 단계 (1)에 따라 측정된 AFP-L3의 발광값을 y축으로 하여 AFP-L3 표준 곡선 방정식을 얻는 단계를 포함한다. 단계(3)은 단계(1)에서의 측정된 시료 내 AFP-L3의 발광값을 상기 AFP-L3 표준 곡선 방정식에 대입하여 시료 내 AFP-L3 농도를 산출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 예에 따라 화학발광면역측정법(chemiluminescence immunoassay)을 이용한 AFP-L3 검출 또는 정량 방법에서, 마그네틱 비드에 포획 항체를 코팅한 후 탐지 항체에 화학적 발광을 적용하는 경우에는, 탐지 항체에 dioxatane, acridinium ester, 또는 isoluminol 계열의 발색반응을 제공하는 표시자를 결합할 수 있다.

임상샘플에 존재하는 AFP-L3 단백질의 정량법은 이미 양을 알고 있는 control AFP-L3 단백질을 넣어 발색반응으로 나온 시그널로 표준 정량 그래프를 확보하고 이를 이용하여 정량 그래프가 직선으로 나오는 농도 구간에 기반하여 임상 검체를 넣은 웰에서 나오는 발색반응 값을 정량그래프의 수식에 대입하여 임상 검체에서 나온 발색 O.D 값에 의한 AFP-L3의 정량 값을 구한다.

본 발명에 따라 구체적 화학발광면역측정법을 예로 들어 설명하면,

AFP-L3를 특이적으로 인지하는 포획항체를 Magnetic bead 에 고정화하고, 고정화 후 남은 AFP-L3 항체 시약 제거하고, BSA solution으로 AFP-L3 항체가 고정화 되지 않은 bead 표면을 코팅하여 블라킹 진행하고,

블라킹 시약 제거 후, 테스트할 반응의 수량만큼, 일정량의 항체가 고정화된 bead를 용기에 각각 담고, 각 용기마다 각각의 AFP-L1, AFP-L3 표준 단백질 혹은 임상 샘플을 넣어 각각 bead에 반응하고, 반응이 끝난 표준단백질 혹은 임상샘플을 제거 후 PBST 용액으로 3회 bead washing 진행하고,

상기 화학 발광물질(Chemiluminescence)이 접합된 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하지 않고 AFP-L3의 당화 부분을 인지하지 않는 AFP를 인지하는 항체를 각각의 bead가 들어 있는 용기에 반응하고,

반응이 끝난 AFP 항체를 제거한 후, PBST 용액으로 3회 bead washing 진행하고, 화학 발광할 수 있는 Substrate를 넣고 발색 반응 유도 후 발광된 빛의 양을 측정하여 목적 항원을 검출 또는 정량할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 코어-푸코실화된 AFP (AFP-L3)에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, core fucosylation 되지 않은 AFP와 선별하여 AFP-L3에 선택적으로 결합할 수 있어, 상기 항체를 이용한 간암 등의 질병을 진단 또는 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 AFP의 이소타입(isotype)에 따른 AFP의 당 구조 및 코어-푸코실화된 AFP의 당 구조와 이에 따른 개발 항체 인지 성능 정도의 모식도이다.
도 2는 Lectin(LCA)을 이용한 기존 AFP-L3에 대한 측정원리 및 방법 AFP-L3에 관한 설명하는 도면이다.
도 3은 WAKO 사의 경쟁적 면역 분석 (TAS WAKO i30) Schematic diagram of i30 operation principle을 나타낸다.
도 4는 실시예 1-2에 따라, 표준 물질인 단백질의 Lectin Electrophoresis 를 이용하여 fucosylation된 정도를 WAKO의 표준물질(calibrator)와 비교하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5은 실시예 1-3 에 따라, 표준 AFP 단백질의 당분석 결과를 나타내는 것으로서, MALDI-TOF MS 분석결과이다.
도 6은 실시예 4-1에 따라 본 발명에 따른 항체의 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 분석한 분자량 및 순도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 4-2에 따라 샌드위치 ELISA 분석법을 이용하여, 본 발명에 따른 항체의 표준 물질에 대한 구별 성능 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공될 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다

실시예 1: 천연 AFP- L1 및 AFP- L3 단백질 준비

1-1: 천연 AFP- L1 및 AFP- L3 단백질 준비

천연 AFP-L1은 cord blood originated AFP protein 구매하고, 천연 AFP-L3는 liver cancer cell originated AFP protein 정제하여 얻었다. 천연 AFP-L3 단백질 정제 방법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

간세포암(Hepatocellular carcinoma cell)유래의 세포주인Huh7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum, 우태아 혈청)(Welgene,한국)가 들어있는 DMEM media(Welgene,한국)에 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 배양 세포가 전체 150π dish에 2.5x10⁶ 개 이상으로 세포가 자랐을 때, dish에 남은 DMEM media를 세포에 닫지 않게 흡입하여 media를 완전히 제거한다. Media가 제거된 dish에 1X PBS buffer(인산 완충 용액)로 25ml씩 2번 세포가 자란 dish를 세척한 후, FBS가 없는 DMEM media로 72 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 이렇게 배양이 완료된 media를 모아 1000rpm, 3분동안 원심 분리하여 가라앉은 세포의 부스러기(cell debris)를 제거하고 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 천연 AFP-L3 정제 용액으로 사용하였다.

상기 용액을 AFP 마우스 유래 항체(Boditechmed, 한국)가 컨쥬케이션 되어 있는 protein G bead(GE Healthcare Life Science,미국)에 20X PBS stock(바이오세상,한국)을 위의 얻어진 천연 AFP-L3 정제용액의 전체 양의 1/20을 넣어 1X PBS 조성이 되게 만든다. 이를 protein G bead가 들어있는 컬럼에 천천히 흘려주었다. 모든 천연 AFP-L3 정제용액이 컬럼을 다 통과하여 흘러내린 후, 1X PBS로 bead 양에 10배 이상의 1X PBS를 흘려 내려, 비드에 붙지 않은 단백질을 제거하기 위해 비드의 세척단계를 진행하였다. 이후 protein IgG elution buffer (Thermo, 미국)를 이용하여 AFP 항체에 붙은 천연 AFP-L3 단백질을 elution 한 후, 1M Tris-HCl(PH 9.5)용액을 넣어 정제하여 얻어진 천연 AFP-L3가 포함되어 있는 용액의 산도를 중화시켰다. 모아진 단백질을 1X PBS solution을 투석카세트 밖에 다량 담아, 투석카세트에 있는 버퍼를 1X PBS 버퍼로 교체하기 위한 투석 단계를 진행하였다. 투석이 완료되면 단백질을 BCA 단백질 정량 키트(Thermo, 미국)를 이용하여 단백질을 정량하여 냉동 보관하였다.

실시예 1-2: 렉틴 면역블랏법에 대한 렉틴 전기영동

실시예 1-1에서 확보한 표준물질 AFP-L1 및 AFP-L3가 고순도이며, 렉틴 면역블랏법 시험결과를 통해, Wako 표준물질의 AFP-L1 및 AFP-L3 밴드 위치와 자체 확보 표준물질의 밴드의 위치가 유사하게 나타나는 것을 확인하였다. 렉틴 면역블랏 시험 결과를 통해, Wako 표준물질의 AFP-L1 및 AFP-L3 밴드 위치와 자체 확보 표준물질의 당분석을 통해 Wako 표준물질 AFP-L3이 AFP-L1에 비해 다량의 AFP-L3 특이적인 당을 보유하고 있음을 확인하였다.

구체적인 렉틴 면역블랏 시험방법은 LCA(vectorlab,미국)를 0.2mg/ml의 농도로 섞어 1% agarose gel을 만들고 단백질 sample을 gel에 loading 하였다. Loading 하는 샘플은 실시예 1-1에서 정제하여 확보한 AFP-L3 단백질을 농도별로, Wako사에서 판매하는 AFP-L3 표준물질을 종류별로 loading 하여 겔을 120volt에서 1시간 전기영동을 수행하였다. 내린 gel을 NC membrane에 transfer 하기 위해 TE77 ECL SemiDry Transfer Unit(Amersham Biosciences, 영국)를 이용하여 40 mA에서 1시간 작동시켰다. 전이가 완료된 NC 멤브레인을 1시간 동안 블라킹한 후, AFP에 대한 단클론 항체 (1G7)항체(Merck Millipore, 미국)룰 4 ℃ 보관상태에서 O/N으로 반응시킨 후 PBST 용액으로 3번 세척하였다. Anti-mouse Fc HRP antibody(Thermo, 미국)가 섞인 용액을 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 이 후 PBST 용액으로 3번 세척 한 후, Substrate를 넣어 ChemiDoc(Bio-Rad, 미국)로 이미지를 얻었다.

도 4는 실시예 1-2에 따라, control 단백질의 Lectin Electrophoresis 를 이용하여 푸코실화된 정도를 WAKO의 표준물질과 비교하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

실시예 1-3: 정제 AFP 단백질의 당 분석

실시예 1-1에서 정제된 천연 AFP-L1, 천연 AFP-L3 단백질에서 당쇄를 분리하기 위해 N-glycosidase(PNGase F) 효소를 인산화 버퍼와 반응하였다. 잘려진 당쇄를 Girarads reagent P(GP)룰 레이블링하기 위해 GP solution을 실온에서 4시간 반응시켰다. GP 레이블된 당쇄를 dihydroxybenzoic acid(DHB)와 섞고, 이를 이용하여 MALDI-TOF MS를 이용하여 GP-라벨링 된 당쇄를 정량한다. MALDI spectra는 Bruker Daltonics Microflex LRF MALDI-TOF MS(Bruker, 독일)을 이용하여 확보하였다. 관련 세부 방법은 참고논문(Biotechnology Letters,October 2015, Volume 37, Issue 10, pp 2019-2025) 과 동일하게 수행하였다.

상기 실험결과를 도 5에 나타냈으며, MALDI-TOF MS analysis--표준물질의 당분석을 통해 표준물질 정제 AFP-L3이 정제 AFP-L1에 비해 다량의 AFP-L3 특이적인 당을 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 2: 천연 AFP- L3 항체 후보 선정 및 성능 확인

실시예 2-1: 항체 제조

항체 제조를 위하여, 실시예 1-1에서 본 발명에서 control 물질로 사용하기 위해 정제한 AFP-L3 단백질과 구매한 control물질인 AFP-L1을 구별하는 항체를 선별하기 위해 phage display 기술을 이용하여 항체 라이브러리를 제작하였다.

제작한 항체 라이브러리는 ScFv form의 항체를 발현하는 형태로 제작되었으며, 1x10¹⁰의 complexity를 지닌다. 전체 라이브러리 중에서 control물질인 AFP-L3는 선택적으로 인지하고 AFP-L1은 인지하지 않는 항체를 선별하기 위하여, 항체 pool을 panning 방법을 통해 선별하였다. Panning방법은 AFP-L3 단백질을 마그네틱 비드에 컨쥬게이션한 것을 사용하였으며, AFP-L3 단백질에 붙는 항체를 선별하기 위해 비드에 binding 시 AFP-L1 control 단백질을 다량 함께 넣어, AFP-L3 control단백질에 더 잘 붙는 항체 pool을 선별하였다. 선별된 항체 Pool 에서 항체를 발현하는 phage clone 각각을 phage displayed 항체의 형태로 발현하였으며, 이의 스크리닝은 ELISA test를 기반으로 진행하였다.

실시예 2-2: 면역 및 cDNA 라이브러리 제작

AFP-L3(Ag)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 동물에 항원을 면역한 면역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이를 위한 벡터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.

구체적으로, 화이트 레그혼종의 닭에 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3)(Ag)를 완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제(Sigma, 미국)와 혼합하여 3주 간격으로 5회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB(3% 태아혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산완충용액)를 이용하여 1:100, 1:500, 1:2500 및 1:12500의 농도로 희석하여 보관한 후, 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다.

구체적인 효소면역측정법은, ELISA 플레이트에 Ag 1ug/ml을 4 ℃에서 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. PBST(0.1% tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로블린-HRP(horse radish peroxidase)(1:3000)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS(Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 Ag과 결합하지 않았으며, Ag에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.

마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 상기 채취된 조직을 10ml TRI 시약(Molecular research center, 미국)과 혼합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 헥사머(random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템(Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응(65?에서 5분; 4℃에서 5분; 50?에서 50분; 85?에서 5분; 및 4℃)을 수행하였다. 역전사 반응의 결과물인 cDNA를 포함하는 반응액 5μl를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동 후 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다. 상기 랜덤 헥사머 프라이머는 일반식 [d(N)₆]로 표현되며, N은 뉴클레오타이드 서열 4종인 A(아데닌),T(티아민),G(구아닌),C(싸이토신)이 모두 포함된 것이다.

실시예 2-3: 항체 라이브러리 제작

(1)면역 항체 유전자 증폭

닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 V_H와 V_L 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응은 실시예 2-1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFV(single chain Fv) 영역에 맞게 고안된 하기 표 3의 프라이머 조합을 이용하였다. V_H 및 V_L 각각의 cDNA 라이브러리 0.5 마이크로리터, 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시킨 후, 94 ℃에서 15초, 56 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 90초간 반응시키는 과정을 30 사이클 반복하였다.

구분	프라이머	서열 (5'-->3')	서열번호
V_H	정방향	GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG	99
V_H	역방향	CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC	100
V_L	정방향	GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC	101
V_L	역방향	GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG	102
scFV	정방향	GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG	103
scFV	역방향	GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGG	104

PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

scFv DNA를 얻기 위해, 정제된 V_H 50ng, V_L 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 2분간 반응시키는 과정을 20 사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

(2)항체 DNA의 제한효소 절단

상기에서 제조된 scFv와 파지미드 벡터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)로 절단하였다.

scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units SfiI (Roche, 미국), 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50 ℃에서 밤샘 반응시켰다.

또한, pComb3X 벡터 20ug, 120 units SfiI 및 20ul 10x buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤샘 반응시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

(3)항체 DNA의 라이게이션 및 라이브러리의 제조

scFv 절편을 pComb3X 벡터에 삽입하기 위하여, 제한효소 SfiI를 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR 절편 700ng 및 pComb3X 1.4ug을 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738(New England Biolab, 미국)에 전기 천공법(electroporation)으로 형질전환시켜 46ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1X10¹⁰ complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다.

실시예 2-4: 항- Ag scFV 를 포함하는 파지 클론의 선별

수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 Ag에 결합하는 항체를 고체에 지지된 Ag을 이용하여 선별하였다.

결합하는 항체 선별하고자, 먼저 마그네틱 비드에 Ag 10마이크로그램을 각각 컨쥬게이션시켰다. 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37℃에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene, 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 70ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지(30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.

상기 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.

마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 Ag와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 Ag 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신(pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝(panning)을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다.

4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다.

상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 이용해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻고 Ag이 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 준비한 파아지를 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로 이용하여 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.

실시예 2-5: 선별된 항체의 서열분석

상기 실시예 2-4에서 선별조건에서 양성 반응을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻었다. DNA 미니 프렙 키트(진올, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정을 위해 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머 서열번호 (정방향) 및 (역방향)의 프라이머를 이용하여 분석하였다.

정방향(서열번호 105)	ACACTTTATGCTTCCGGCTC
역방향(서열번호 106)	CAAAATCACCGGAACCAGAG

실시예 2-6: 항체 선별을 위한 ELISA test

ELISA plate에 HA tag을 인지하는 monoclonal HA antibody(Abcam, 영국)를 코팅하고 각 well을 BSA solution으로 블라킹을 37℃ 1시간 반응하였다. 이 후, 앞선 panning 작업으로 선택된 pool 중 각 clone을 phage displayed scFv 로 발현된 E.coli culture media를 37℃ 2시간 추가 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, 정제된 Control AFP-L3, Control AFP-L1 단백질(10ug/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃ 2시간 반응시켰다. 이후 3번의 PBST용액으로 세척한 후, AFP를 인지하는 탐지항체를 Biotinylation시켜 둔 항체를 37℃에서 2시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, avidin-HRP항체를 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 3번의 PBST 용액으로 재 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응 시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.

위의 테스트에 사용한 후보 E.coli 발현 항체는 총 5종으로 항체의 이름은 L3-1 A4, L3P2-D5, 1-1 H1, L3-2 C10, 2-1 B8 총 5종 중 2종(L3-2 C10, 2-1 B8)이 선별되었다. 3회 반복의 실험의 평균값이다. Screening 시 후보항체를 capture 항체로 적용하여 실험 진행하였다.

구분	BSA	AFP-L1	AFP-L3
L3-1 A4	0.14	0.13	0.13
L3P2-D5	0.15	0.23	0.31
1-1 H1	0.14	0.23	0.25
L3-2 C10	0.13	1.16	3.46
2-1 B8	0.16	0.18	0.63

E.coli 발현된 항체를 sandwich ELISA 기법으로 screening 하여, 표준물질AFP-L3를 친화적으로 인지하는 최종 2개의후보 항체(L3-2 C10, 2-1 B8)을 선별하였다.

실시예 3: 샌드위치 ELISA 를 이용한 항체의 AFP- L3 구별성능 확인 및 선별

Sandwich ELISA를 이용한 AFP-L3의 당의 존재 유무에 따른 항체의 결합 영향 평가하고자 하였다.

실시예 2에서와 유사하게 항체의 선별은 monoclonal HA항체를 플레이트에 코팅 시키고, BSA 용액을 37℃에서 1시간 반응하여 블라킹을 진행하였다. 이후 phage displayed scFv(C10, B8) 항체를 해당 well에서 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후 control AFP-L1, control AFP-L3와 함께 N-glycosidase PNGase 효소(NEB,미국)를 처리하여 단백질의 당이 제거된 형태의 AFP-L1, AFP-L3를 10ug/ml 농도로 37℃에서 2시간 반응을 시행하였고, 이후의 과정은 앞의 실시예 2-6의 방법과 동일하게 수행하였으며 3회 반복 실험의 평균값을 나타냈다.

선별 항체가 당을 제거하지 않은 단백질보다 AFP-L3의 당을 제거한 표준물질에 더 약하게 결합하는 것을 확인하였다. 선별항체가 당을 인지하고(epitope이 AFP-L3 당 부분 포함) AFP-L3 표준 물질에 친화적으로 결합함을 확인하였다. 상기 항체 IgG O.D 값을 하기 표 6에 나타냈다.

항원	L3-2 C10항체	L2-1 B8항체
AFP-L1	0.61	0.23
AFP-L1(당제거)	0.30	0.18
AFP-L3	2.08	1.23
AFP-L3(당제거)	1.66	0.61

선별 항체 C10 및 B8 은 AFP-L3 의 당을 제거한 표준물질에는 당을 제거하지 않은 단백질보다 약하게 binding하는 것을 확인하였다. 이를 통해 선별항체가 당을 인지하고(epitope이 AFP-L3 당 부분 포함) AFP-L3 표준 물질에 친화적으로 binding 함을 확인하였다.

실시예 4: 천연 AFP- L3 항체 후보 선정 및 성능 확인(정제된 동물세포 이용 발현항체 적용( IgG ))

실시예 4-1: 정제된 동물세포 이용 발현 항체 적용

실시예 2에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여 면역글로불린( IgG ) 단백질을 생산하였다. 구체적으로, scFv 를 포함하는 pComb3x 로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 7의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR 을 통해 수득하였다.

즉, 각 가변영역과 불변영역(CH 및 Ck)을 하기 표 7의 HC 및 LC 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNATM3.3-TOPO® 클로닝 키트 및 pOptiTMVEC-TOPO®A 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 벡터(pcDNATM3.3-TOPO®벡터와 pOptiTM VEC-TOPO®벡터) 1ul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl₂이 포함된 완충액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열충격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.

구분	프라이머	서열(5'->3')	서열번호
V_H	정방향	GCTAGCCGCCACCATGGGC	107
V_H	역방향	AGGGGCCCTTGGTGGAGGCCTGGCCGGCCTGGCCACT	108
C_H	정방향	GCCTCCACCAAGGGCCCCTC	109
C_H	역방향	CGGGATCCCTTGCCGGCCGT	110
HC	정방향	GCTAGCCGCCACCATGGGC	111
HC	역방향	CGGGATCCCTTGCCGGCCGT	112
V_L	정방향	AAGCTTGCCGCCACCATG	113
V_L	역방향	AGGGGGCGGCCACGGTCCGGGAAGATCTAGAGGACTG	114
C_k	정방향	CGGACCGTGGCCGCCCCCTC	115
C_k	역방향	GCTCTAGACTAGCACTCGC	116
LC	정방향	AAGCTTGCCGCCACCATG	117
LC	역방향	GCTCTAGACTAGCACTCGC	118

상기 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄(25kDa)와 중쇄(50kDa)의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.

실시예 4-2: control 기준 물질에 대한 항체의 구별 성능 확인

선별용 Sandwich ELISA 방법은, AFP-L3 단백질을 선택적으로 인지하는 후보 항체를 IgG 형태로 발현하여 정제 후 이를 5ug/ml의 농도로 ELISA plate에 coating하였다. 각 well을 BSA solution으로 블라킹하고, 실시예 1에서 정제된 Control AFP-L3 및 Control AFP-L1 단백질(10ug/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이 후 3번의 PBST용액으로 세척 후, 탐지항체를 37℃에서 2시간 반응 후, 이후 3번의 PBST용액으로 재 세척 후, Biotin과 반응하는 avidin에 HRP 효소가 표지되어 있는 2차 항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST용액으로 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 3반복 실험의 평균값이다. 시험결과를 하기 표 8 및 도 7에 나타냈다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.

항원	L3 -2 C10 항체	L2 -1 B8항체
AFP- L1 50 ng/ml	0.23	No data
AFP- L1 100 ng/ml	0.16	0.41
AFP- L1 1000 ng/ml	0.63	0.13
AFP- L3 50 ng/ml	0.37	No data
AFP- L3 100 ng/ml	0.34	0.33
AFP- L3 1000 ng/ml	1.97	0.89

표 8 및 도 6의 실험 결과에 나타낸 바와 같이, IgG 형태 선별 항체 중 하나인 L3-2 C10 항체가 표준물질 AFP-L3에 대해 AFP-L1 보다 높은 친화도를 가지고 구별함을 확인하였고, L3-2 C10 항체가 50ng/ml 라는 상대적으로 낮은 농도에서 구별 성능을 보였다.

실시예 5: 다양한 항체 제조 및 활성 확인

5-1: 항체 제조

항체 선별을 위한 선별항체의 random mutagenesis를 통한 선별 항체 라이브러리 제작 및 후보항체 선별하였다.

상기 선별된 C10 항체의 scFv 서열을 주형으로 항체의 유전자를 서열번호 103,104 에 제시된 프라이머를 이용하여 항체를 PCR 반응을 시켰다. 항체를 증폭 시 항체의 염기서열에 random mutagenesis를 도입하기 위하여 random mutagenesis kit(Jenabioscience, 독일)을 이용하여 키트에 작성된 방법대로 항체 유전자에 random mutagesis를 도입하였다. 위의 키트를 통해 증폭된 항체의 유전자를 항체 DNA의 제한효소 절단부터의 실험과정은 실시예 2-3: 항체 라이브러리 제작에서 작성된 것과 동일하게 진행하여 C10 random mutagenesis된 항체 라이브러리를 제작하여 5*10⁹ complexity를 갖는 항체를 확보하였다.

5-2: 결합하는 항체 선별

먼저, 마그네틱 비드에 Ag 10 마이크로그램을 각각 컨쥬게이션시켰다.

수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37℃에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene, 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 70ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지(30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.

상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.

5-3: 활성 확인시험

항체의 활성 확인 및 선별은 실시예 2-6에서와 유사하게 monoclonal HA항체를 플레이트에 코팅시키고, BSA 용액을 37℃에서 1시간 반응하여 블라킹을 진행하였다. 실시예 1에서 얻은 control AFP-L1, control AFP-L3를 1ug/ml농도로 처리하여 37 ℃에서 2시간 반응을 수행하였고, PBST 용액으로 3번 세척을 진행하였다.

상기 수득한 파아지 항체 배양액 각각을 처리하여 37 ℃에서 2시간 반응을 시행하고 난 후, PBST 용액으로 3번 세척을 진행한 후, 탐지항체를 Biotinylation시켜 둔 항체를 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, avidin-HRP항체를 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 재세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정하였다. 이후 항체의 유전자 분석은 실시예 2-5와 동일한 방법으로 진행하여, C10과 유사한 성능을 보이면서 C10과 CDR의 서열이 다른 항체를 선별하였다.

표 9에 기재된 항체는 AFP-L3 O.D값을 AFP-L1 O.D 값을 나눈 O.D값의 비율(ratio)가 1.5 이상이면서 각각의 CDR의 서열이 다른 항체를 선별하여 기재하였다.

NO	CDR-L1	CDR-L3	CDR-L3	CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3	O.D.(Ratio)
1	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	3.39
2	SGGSGYG	YESNKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFYFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIAEDIDA	2.57
3	SGGSGYG	YESDKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.35
4	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESNSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGRGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.19
5	SGGSGYG	YESTKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.21
6	SGGSGYG	YESSKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.04
7	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKVRATI	SAYGGWIADDIDA	2.89
8	SGGSGYG	YESNMRPS	GGWGSSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITNGGSGTWYAPAVKGRATI	SVYGGWIADDIDA	2.68
9	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSVHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.68
10	SGGSGYG	YESNRRPS	GGWESNSNPGTFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDVDA	2.69
11	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESNSNPGIFGA	GFSFSDRGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.57
12	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GSSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIASDIDA	2.90
13	SGGSGYG	YESSKRPS	GGWESSSNPGVFGA	GFSFSDHGLG	SITSGGGGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.23
14	SGGSGYG	YESNKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFSLGDHGMG	SITSGGSGIWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.89
15	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GISFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDS	2.89
16	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDV	2.11
17	SGGSGYG	YESTKRPP	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI	SAYGGWIADDIDA	2.22
18	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDTDA	3.58
19	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIVA	2.06
20	SGGSGYG	YENNKRPS	GGWESGSNPGIFGA	GFSFGDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.15
21	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGGGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.18
22	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESNSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.19
23	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITGGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDS	2.16
24	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDRGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.82
25	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFFFSDHGMG	SITSGGSGTWYTPAVRGRATI	SAYGGWIADDIDA	3.16
26	SGGSGYG	YESHKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.17
27	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFPFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATF	SAYGGWIADDIDA	3.07
28	SGGSGYG	YESNKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GYSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDVDA	2.73
29	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGIG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.02
30	SGGSGYG	YESNKRPP	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAMKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.01
31	SGGSGYG	YESNKRPT	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.30
32	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSNHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDT	2.39
33	SGGSGYG	YENNKRPS	GGWESNSNPGIFGA	GFSFSVHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIVA	2.45
34	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIAEDIDA	2.04
35	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GLSFSVHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.22
36	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESGSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI	SAYGGWIADDINA	2.29
37	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGT	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYSPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.36
38	SGGSGYG	YESSKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	STTSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDT	2.12
39	SGGSGYG	YESNKRLS	GGWGSSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGGGIWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.12
40	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGVG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.15
41	SGGSDYG	YESNKRPL	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDINA	3.04
42	SGGSGYG	YESNKRPT	GGRESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.64
43	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGVFGA	GFSFSGHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI	SAYGGWIADDIDA	2.24
44	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRVTI	SAYGGWIADDIDA	2.65
45	SGGSGYG	YESNKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.24
46	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESYSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRASI	SAYGGWIADDIDA	1.67
47	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESYSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVEGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.70
48	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGVG	SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI	SAYGGWIADDIDA	1.66
49	SGGSGYG	YDSNKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFSFSDRGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.81
50	SGGSGYG	YESNKRPT	GGRESSSNPGIFGA	GFSFTDHGMG	SITSGGSGTWNAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.28
51	SGGSGYG	YESNRRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.09
52	SGGSGYG	YDSDKRPS	GGRESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.93
53	SGGSSYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIVDDIDA	2.62
54	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESVSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.67
55	SGGSGCG	YECNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSISDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIVA	2.12
56	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESNSNPGIFGA	GFPFRDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDT	2.31
57	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGVFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.80
58	SGGSGYG	YENNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPTVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.76
59	SGGSGYG	YESYKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYASTVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.66
60	SGGSGYG	YESNKRPL	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.71
61	SGGRSYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	1.67
62	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRAII	SAYGGWIADDIDA	2.05
63	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSSPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.00
64	SGGSGYG	YENNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDVDA	2.31
65	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSSSVHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.00
66	SGGSGYG	YESYKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.15
67	SGGSGHG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGLG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIAGDINA	2.03
68	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSLGDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.86
69	SGGSGYG	YESNKRPS	GGWESSNNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.09
70	SGGSGYG	YESNKRPT	GGWESSSKPGIFGA	GFSFSDHGLG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDVDA	2.96
71	SGGSGYG	YESNKRPP	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDRGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.44
72	SGGRGYG	YESNKRPS	GGWESSSNPGIFGA	GFSFSDHGMG	SITSGGSGTWYAPAVKGRATI	SAYGGWIADDIDA	2.36

표 10 는 표 9에 기재된 항체 중 대표적인 항체 5종의 실제 ELISA 분석법을 이용한 O.D 측정치를 표시하여 나타내었으며 실험방법은 실시예 2-6과 동일하게 수행하였다.

NO	AFP-L1(O.D)	AFP-L3 (O.D)
10	1.5036	3.0411
35	1.065	2.3648
37	0.9962	2.3472
55	1.0814	2.2879
61	1.4043	2.3391

실시예 6: 와코 표준물질(Wako calibrator) 에 대한 면역 분석

실시예 4-1에서 정제된 동물세포 이용 발현 항체 적용하여 대상 항원을 와코 표준물질(Wako calibrator)에 대해 ELISA 분석법을 수행하였다.

구체적으로 실시예 4-1에서 얻어진 AFP-L3을 선택적으로 인지하는 항체를 IgG 형태로 발현하여 정제 후 이를 5ug/ml의 농도로 ELISA plate에 coating하였다. 각 well을 BSA solution으로 블라킹하고, Wako calibrator AFP-L3(100ng/ml), Wako Calibrator AFP-L1 단백질(100ng/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃ 2시간 반응시켰다. 이 후 3번의 PBST용액으로 세척 후, 탐지항체를 37 ℃에서 2시간 반응 후, 이후 3번의 PBST용액으로 세척 후, Biotin과 반응하는 avidin에 HRP 효소가 label되어 있는 2차 항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응 시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 3반복 실험의 평균값이다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.

항원	L3-2 C10항체
Wako AFP-L1(100 ng/ml)	0.21
Wako AFP-L3(100 ng/ml)	0.32

선별 항체 L3-2 C10의 경우, Wako 사 판매 AFP-L1 및 AFP-L3에 대해 100ng/ml의 농도 구간에서 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하는 성능을 보임을 확인하였다.

즉, 본 발명에 따른 선별 항체 L3-2 C10를 이용한 면역 분석법을 사용하여, 대상 탐지 항원을 두 가지로 구분하여 실험을 수행한 결과, 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1 및 AFP-L3단백질을 대상으로 측정한 결과(실시예 4)와, 실시예 5에서 얻는 Wako 사 판매표준 물질인 AFP-L1 및 AFP-L3 단백질을 대상으로 측정한 결과 모두 유의하게 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하는 성능을 확인하였다.

실시예 7: 본 발명의 면역 분석법과 Wako system의 분석법과 비교 확인

7-1: 시료 제조

Sandwich ELISA 측정 방법으로서, 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 전체 단백질 농도가 200ng/ml이 되도록 혼합하며, 이 때 혼합의 기본 버퍼 조건은 구매한 AFP depleted serum을 이용하여 혼합된 AFP 단백질 용액을 제조하였다.

7-2: ELSIA 방법으로 분석

실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 본 발명에 따른 항체를 이용한 ELISA 분석방법으로 분석하였다.

구체적으로, 상기 7-1에서 제조한 시료에 대해서, 상기 실시예 2-6의 방법에 따라 ELISA 분석을 수행하였고, 이러한 분석결과를 하기 표 10에 나타내었다.

7-3: WAKO 분석기계로 분석

실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 Wako사의 uTas i30기기를 이용한 ELISA 분석방법으로 분석하였다.

이를 Wako사의 uTas i30기기로 측정하여 AFP-L3(%) 값을 구하고, 또한 본 개발에서 확보한 L3-2 C10 항체의 IgG 를 코팅하여 각 샘플을 Sandwich ELISA를 통해 각 샘플을 AFP 인지할 수 있는 항체 pair 및 L3-2 C10를 이용한 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3)인지를 위한 항체 pair를 적용하여 Sandwich ELISA test를 수행하였다.

이 때 그려지는 Standard curve를 적용하여 계산되는 전체 AFP 단백질의 양 및 L3-2 C10을 이용하여 측정된 코어-푸코실화된 AFP의 양을 구한 후, 이를 % 수치화 하여 Wako에서 측정된 수치와의 연관관계 확인을 위해 피어슨 상관계수 값을 계산하였다.

구분	전체 AFP 단백질 농도(ng/mL)	AFP-L1 단백질 (ng/mL)	AFP-L3 단백질 (ng/mL)	AFP-L3(%)-wako uTas 측정치	AFP-L3(%)-개발항체 ELISA 측정치
시료1	200	20	180	33.6	11,6
시료2	200	100	100	55.4	16.2
시료3	200	180	20	81.4	33.2

uTas 측정수치와 개발 항체 측정 수치간의 Correlation score는 0.96이었다.동일 분석 시료인 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1 및 AFP-L3단백질을 대상으로 측정한 AFP-L3%의 측정치 면에서, 본 발명에 따른 개발항체를 이용한 면역 분석법과 WAKO사의 uTas 기기를 이용한 분석법 사이에 높은 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 항 AFP- L3 항체를 이용한 화학발광 면역분석법

상기 실시예 4-1의 항체를 이용하여, 실시예 4-2와 동일하게 실시예 1에서 정제된 Control AFP-L3 및 Control AFP-L1 단백질(10ug/ml)을 사용하였다.

화학발광에 사용할 magnetic bead를 사전에 필요한 만큼 어세이용 용기에AFP-L3를 덜어둔 후, magnetic bead 보관 용액을 제거한 후, PBST 용액으로 bead를 washing 한다. 이 후 사용하는 magnetic bead의 컨쥬게이션 프로토콜에 적합한 컨쥬게이션 실험 방법을 이용하여 특이적으로 인지하는 포획항체를 Magnetic bead 에 고정화하기 위하여 항체와 magnetic bead를 인큐베이션한다. 인큐베이션이 완료된 후, bead에 고정화 후 고정화에 사용되지 않은 AFP-L3 항체 시약을 제거한다. 항체를 고정화한 bead를 PBST용액으로 3회 bead washing을 진행한다. washing된 bead는 BSA solution으로 AFP-L3 항체가 고정화 되지 않은 bead 표면을 코팅하여 블라킹 반응을 진행한다. 블라킹 시약 제거 후, 테스트할 반응의 수량만큼, 일정량의 항체가 고정화된 bead를 용기에 각각 담고, 각 용기마다 각각의 AFP-L1, AFP-L3 표준 단백질 혹은 임상 샘플을 넣어 각각 bead에 인큐베이션 하여 항체와 임상검체 및 표준 단백질의 결합을 진행한다. 반응이 끝난 표준단백질 혹은 임상샘플을 magnetic bead에서 제거 후, bead에 비특이적으로 결합된 단백질 제거를 위해 PBST 용액으로 3회 bead washing 진행한다.

Magnetic bead에 결합된 AFP-L3 포획 항체에 의해 인지된 AFP-L3를 화학발광하기 위해 사전 화학발광 물질이 컨쥬게이션 된 탐지항체를 각 샘플 용기에 분주하여 포획된 AFP-L3단백질과 화학발광물질이 컨쥬케이션된 포획항체의 반응을 유도한다. 반응 이후, 본 결합에 비특이적으로 결합된 단백질 제거를 위하여 PBST 용액을 이용하여 washing을 진행한다. Washing이 완료된 각 샘플 tube에 화학발광을 일으키는 substrate를 넣고 반응 시킨 후, 정해진 반응시간 이후 측정되는 화학 발광량 수치 시그널을 확보하였다.

시료에 존재하는 AFP-L3 단백질의 정량법은 이미 양을 알고 있는 control AFP-L3 단백질을 넣어 발색반응으로 나온 시그널로 정량 그래프를 확보하고 이를 이용하여 정량 그래프가 linear 하게 나오는 농도 구간에 기반하여 임상 검체를 넣은 well에서 나오는 발색반응 값을 정량그래프의 수식에 대입하여 임상 검체에서 나온 발색 O.D 값에 의한 AFP-L3의 정량 값을 구하였다.

<110> SK TELECOM CO., LTD. <120> Immunoassay using antibody specifically binding to core fucosylated alpha-fetoprotein <130> DPP20162432KR <160> 118 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H1) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is F, S, Y, I or L <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is S, P, F or Y <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is F, S, I or L <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is S, T, G, or R <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is D, N, G, or V <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is H or R <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X is L, M, V, or I <400> 1 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H2) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is I or T <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is S, or N <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is S, G or R <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is G or I <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is Y or N <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> X is A, S or T <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X is P or S <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> X is A or T <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X is V or M <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> X is K, R or E <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> X is G, or V <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> X is R or P <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> X is A or T <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> X is T or S <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> X is I or F <400> 2 Ser Xaa Thr Xaa Gly Gly Xaa Xaa Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H3) <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is Y or V <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is A or V <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X is D, G, S or E <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is I, V or T <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> X is D, V or N <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X is A, V, S or T <400> 3 Ser Ala Xaa Gly Gly Trp Ile Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L1) <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is S or R <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is G, D, or S <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is Y, C, or H <400> 4 Ser Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L2) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is E or D <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is S, C or N <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is N, S, Y, D, T or H <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is K, R or H <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is P or L <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is S, T, P or L <400> 5 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L3) <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is W or R <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is E or G <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is S, N, G, Y or V <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is S or N <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is I, T, or V <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is A or T <400> 6 Gly Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 7 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 8 Gly Phe Tyr Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 9 Gly Phe Ser Phe Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 10 Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg Gly Met Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 11 Gly Ser Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 12 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 13 Gly Phe Ser Leu Gly Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 14 Gly Ile Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 15 Gly Phe Ser Phe Gly Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 16 Gly Phe Phe Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 17 Gly Phe Pro Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 18 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 19 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 20 Gly Phe Ser Phe Ser Asn His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 21 Gly Leu Ser Phe Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 22 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Val Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 23 Gly Phe Ser Phe Ser Gly His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 24 Gly Phe Ser Phe Thr Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 25 Gly Phe Ser Ile Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 26 Gly Phe Pro Phe Arg Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 27 Gly Phe Ser Ser Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 28 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 29 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Arg Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 30 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Val Arg Ala Thr Ile 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 31 Ser Ile Thr Asn Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 32 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 33 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Ile Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 34 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Thr Thr Ile 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 35 Ser Ile Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 36 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Thr Pro Ala Val Arg 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 37 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Phe 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 38 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Met Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 39 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ser Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 40 Ser Thr Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 41 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ile Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 42 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 43 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 44 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Asn Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 45 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ser Ile 20 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 46 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 47 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Ser Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 48 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ile Ile 20 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 49 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 50 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Glu Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 51 Ser Val Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 52 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Val Asp Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 53 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Ser Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 54 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 55 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Val 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 56 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Thr Asp Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 57 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Val Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 58 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 59 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 60 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Val Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 61 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Gly Asp Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 62 Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Gly 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 63 Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Gly 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 64 Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 65 Ser Gly Gly Ser Gly Cys Gly 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 66 Ser Gly Gly Arg Ser Tyr Gly 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 67 Ser Gly Gly Ser Gly His Gly 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 68 Ser Gly Gly Arg Gly Tyr Gly 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 69 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 70 Tyr Glu Ser Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 71 Tyr Glu Ser Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 72 Tyr Glu Ser Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 73 Tyr Glu Ser Asn Met Arg Pro Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 74 Tyr Glu Ser Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 75 Tyr Glu Ser Thr Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 76 Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 77 Tyr Glu Ser His Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 78 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 79 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Thr 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 80 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Leu Ser 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 81 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Leu 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 82 Tyr Asp Ser Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 83 Tyr Asp Ser Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 84 Tyr Glu Cys Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 85 Tyr Glu Ser Tyr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 86 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 87 Gly Gly Arg Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 88 Gly Gly Trp Glu Ser Asn Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 89 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 89 Gly Gly Trp Gly Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 90 Gly Gly Trp Glu Ser Asn Ser Asn Pro Gly Thr Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 91 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Val Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 92 Gly Gly Trp Glu Ser Gly Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 93 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Thr 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 94 Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 95 Gly Gly Trp Glu Ser Val Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 96 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 97 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Asn Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 98 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Lys Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 72 <212> DNA <213> VH forward primer <400> 99 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 100 <211> 44 <212> DNA <213> VH reverse primer <400> 100 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 101 <211> 38 <212> DNA <213> VL forward primer <400> 101 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 102 <211> 34 <212> DNA <213> VL reverse primer <400> 102 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 103 <211> 42 <212> DNA <213> scFV forward primer <400> 103 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 104 <211> 47 <212> DNA <213> scFV reverse primer <400> 104 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Seqeuncing primer(forward) <400> 105 acactttatg cttccggctc 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Seqeuncing primer(reverse) <400> 106 caaaatcacc ggaaccagag 20 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> VH primer (forward) <400> 107 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 108 <211> 37 <212> DNA <213> VH primer (reverse) <400> 108 aggggccctt ggtggaggcc tggccggcct ggccact 37 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> CH primer (forward) <400> 109 gcctccacca agggcccctc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> CH primer (reverse) <400> 110 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> HC primer(forward) <400> 111 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> HC primer (reverse) <400> 112 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> VL primer (forward) <400> 113 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 114 <211> 37 <212> PRT <213> VL primer (reverse) <400> 114 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 1 5 10 15 Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Cys Thr Gly 35 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Ck primer (forward) <400> 115 cggaccgtgg ccgccccctc 20 <210> 116 <211> 19 <212> DNA <213> Ck primer (reverse) <400> 116 gctctagact agcactcgc 19 <210> 117 <211> 18 <212> DNA <213> LC primer (forward) <400> 117 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> LC primer (reverse) <400> 118 gctctagact agcactcgc 19

Claims

코어-푸코실화되지 않은 알파-페토프테인(AFP)과 구별하여 항원으로서 코어-푸코실화된 AFP에 특이적으로 결합하는 포획 항체에, 시료를 접촉하여 코어-푸코실화된 AFP 항원을 포획하고,
상기 포획항체와 비경쟁적으로 항원에 결합하는 탐지 항체를 처리하여 기재에 포획된 코어-푸코실화된 AFP와 탐지 항체 간의 항원-항체 결합을 형성하고,
상기 항원-항체 반응을 탐지하는 단계를 포함하는, 코어 푸코실화 알파-페토프로테인을 검출하는 면역 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포획 항체를 기재에 고정하여 사용하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 렉틴의 사용을 포함하지 않는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 탐지 항체는, 상기 포획항체와 항원의 결합을 방해하지 않으며 탐지 항체에 포획된 AFP에 결합 가능한 항체인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 항원-항체 반응을 탐지하는 단계는, 상기 상기 탐지 항체에 직접 또는 링커를 통해 결합된 표지자를 이용하여 수행하는 것인 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 표지자는 효소, 형광물질, 발광물질, 미소입자, 렉독스 분자 또는 방사선 동위원소인 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 항원-항체 반응을 탐지하는 단계는, 상기 표지자를 이용한 발색반응을 탐지하는 것인 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 또는 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA))인 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 표지자는 바이오틴이 결합된 효소이고, 상기 효소의의 기질은 아비딘이 결합된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 항원-항체 반응을 탐지하는 단계에서 항원-항체 반응의 결과 측정치를 얻고,
기지의 농도를 갖는 목적 항원을 이용하여 표준 곡선을 작성하고,
상기 얻어진 측정치를 표준곡선에 대입하여 검출 값을 변환하여 시료 내 존재하는 목적 항원을 정량하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, AFP-L1에 대한 AFP-L3의 O.D 값이 1.5배 이상의 값을 갖는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 AFP-L3의 농도가 50ng/ml 이상으로 포함하는 시료인것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포획 항체는, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)와 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)를 포함하는, 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 7 내지 27의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H1, 서열번호 28 내지 48의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H2, 및 서열번호 49 내지 61의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 62 내지 68의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L1, 서열번호 69 내지 85의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L2, 및 서열번호 86 내지 98의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 세포, 조직, 체액, 혈장 또는 혈액인 방법.
코어-푸코실화되지 않은 알파-페토프테인(AFP)과 구별하여 목적 항원으로서 코어-푸코실화된 AFP에 특이적으로 결합하는 포획 항체;
상기 포획항체와 비경쟁적으로 항원에 결합하는 탐지 항체; 및
상기 포획된 코어-푸코실화된 AFP와 탐지 항체 간의 항원-항체 반응을 탐지하는 표지자를 포함하며, 코어-푸코실화된 AFP를 검출하는 면역 분석용 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 목적 항원은 기재에 고정되어 제공되는 것인 면역 분석용 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 표지자는 항원에 직접 또는 링커를 통해 결합된 것인 면역 분석용 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 방법은 렉틴의 사용을 포함하지 않는 것인 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 탐지 항체는, 상기 포획항체와 항원의 결합을 방해하지 않으며 탐지 항체에 포획된 AFP에 결합 가능한 항체인 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 표지자는 효소, 형광물질, 발광물질, 미소입자, 렉독스 분자 또는 방사선 동위원소인 키트.
제 22항에 있어서, 상기 표지자는 바이오틴이 결합된 효소이고, 상기 효소의의 기질은 아비딘이 결합된 것인 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 키트는 항원-항체 반응을 검출하는 검출수단을 추가로 포함하는 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 키트는 항원-항체 반응을 검출하는 검출수단으로 측정한 결과 측정치를, 기지의 농도를 갖는 목적 항원을 이용하여 얻어진 표준 곡선을 이용하여 변환하여, 시료 내 존재하는 목적 항원을 정량하는 것인 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, AFP-L1에 대한 AFP-L3의 O.D 값이 1.5배 이상의 값을 갖는 것인, 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 AFP-L3의 농도가 50ng/ml 이상으로 포함하는 시료인 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 포획 항체는, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)와 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)를 포함하는, 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 키트.
제 28 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 7 내지 27의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H1, 서열번호 28 내지 48의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H2, 및 서열번호 49 내지 61의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 키트.
제 29 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 62 내지 68의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L1, 서열번호 69 내지 85의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L2, 및 서열번호 86 내지 98의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 키트.