KR20180041466A - 코어-푸코실화된 알파-페토프로테인에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코어-푸코실화된 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 간암 조기 진단을 위한 코어-푸코실화된 알파페토프로테인의 항체 및 항체 기반 정량방법에 관한 것이다.

Description

코어-푸코실화된 알파-페토프로테인에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{Antibody specifically binding to core fucosylated alpha-fetoprotein and use thereof}
본 발명은 코어-푸코실화된 알파-페토프로테인(core fucosylated alpha-fetoprotein, AFP)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 간암 조기 진단을 위한 코어-푸코실화된 AFP의 항체 및 항체 기반 정량방법에 관한 것이다.
종합적인 암 관리를 통한 암 발생, 암 사망의 최소화로 암 부담의 획기적 감소를 위한 방법은 암의 조기검진이다. 암의 스크리닝(screening) 및 모니터링(monitoring)의 개념에서 다수 의 사람을 빠르게 암을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 간암 진단 스크리닝 및 모니터링을 위한 알파-페토프로테인(Alpha FetoProtein, AFP) 모노클로날 항체들의 개발이 요구되고 있다.
AFP는 당단백질의 일종으로 간세포 암종(Hepatocellular carcinoma,HCC)의 종양 표지자이다. AFP은 구조상 알부민과 상동성이 높으며, 태생 간기 및 난황에서 생성되어 태령 13-14주에 최고치에 달하며 생후 감소하기 시작하여 12개월이 지나면 성인치(<10ug/L)까지 감소한다. 산부인과 질환에서 임신부의 혈중 및 양수 중 AFP 증가는 무뇌아, 척추파열, 수두증 등 선천성 이상의 지표로 활용되기도 한다.
대부분의 종양 표지자와는 달리 AFP는 선별검사에 매우 유용하며, 한국을 비롯한 중국, 일본, 알라스카 및 아프리카 등의 간세포암 유병율이 높은 지역에서 간세포암의 고위험군을 선별하는데 이용되고 있다. 종양표지자가 감소하면 성공적인 치료를 의미하고 반대로 상승하면 재발이나 전이를 의미하므로 종양 표지자는 종양의 예후 및 크기와 밀접한 관련이 있다.
AFP는 당쇄 구조 및 렉틴 중의 하나인 Lens culinaris agglutinin(LCA) 에 대한 결합 친화도에 따라, L1, L2 및 L3의 3가지 이소타입으로 구분될 수 있다. AFP-L3는 푸코실화된 AFP 또는 렉틴-반응성 AFP라고도 불리우며, 간세포암의 선별검사에 이용되는 물질이다. AFP-L1는 주로 양성 간질환에서 발현되며 푸코실화되지 않은 당을 가지고 있는 형태이며, AFP-L2가 주로 임산부에서 발현되며 AFP-L2도 코어-푸코실화된 형태의 AFP이나 당의 형태는 AFP-L3와는 다르다.
2005년, FDA는 AFP-L3를 원발성 간암의 바이오마커 하나로 정식으로 허가하였다. AFP-L3는 간암의 조기진단, 치료 효과 평가 및 예후 감시 등의 면에서 활용되어 기존의 AFP를 이용한 진단에 비해 진단의 정확성을 높이기 위해 사용되고 있다.
푸코스는 메틸화된 육탄당이며 조직 및 혈청의 몇 개의 당단백질 당쇄 존재해, 단백질 결합 푸코스(protein-bound fucose)라고 칭해진다. AFP 탄수화물 체인에 푸코스 잔기를 가지며, 이러한 변이체가 푸코스화 AFP(FucAFP) 라고 칭해져 AFP 총량에 차지하는 백분율이 푸코스화 지수(Fucosylation Index, Fuol) 라고 칭해진다. 푸코스화 지수는 중요한 이론적 의의 및 임상 응용적인 의의를 가지며, 간암 진단 및 예후 응용에 중요한 지표라고 해도 좋다.
간암 및 간 질환 진단을 위해 사용된 마커 중의 하나인 AFP의 낮은 진단 민감도 부분을 개선하기 위해, wako 사에서는 AFP의 서브타입 중의 하나인 AFP-L3 를 진단 마커로 이용하여 AFP-L3%를 계산하여 간 질환 진단을 위한 도구로 활용하고 있다.
구체적으로 Wako가 개발한 검사방법은 혈청 중에서 총 AFP의 렉틴 반응성에 의한 분획비(AFP-L3 %)를 측정하는 것이다. Wako 기술에 의하면, 간경변이나 만성 B형 바이러스 감염에서 AFP-L3% 수치가 10% 이상이면 간암 가능성이 매우 높다는 것을 의미하며, 뿐만 아니라 간암에서 AFP-L3%가 양성이라면 암의 진행속도가 빠르고 종양 크기는 상대적으로 크고 간문맥 정맥이 침범, 다른 장기로 전이와도 관련이 있다는 보고가 많아 예후를 추정하는 데 중요한 수단이 될 수 있음을 설명하고 있다.
Wako 사의 기기(u-TASWAKO i30)는 항체기반의 AFP-L3 단백질의 정량법이 아닌 렉틴이라고 하는 당 친화단백질의 성질을 이용하여 형광 신호를 측청하는 방법으로, AFP 단백질 전체를 인지하는 포획 항체(capture antibody)를 이용하여 먼저 혈액 내 AFP를 분리한 다음, 렉틴 단백질이 포함된 아가로스 겔에 전기영동을 하여 렉틴과 반응을 하는 AFP-L3 타입을 분리하여 전체 AFP 형광값 중에 렉틴과 반응하는 구간의 형광값을 %화 하여 AFP-L3 %를 측정하는 방식의 진단법을 이용한다. 그러나, 본 원리로 AFP-L3%를 측정하는 경우, 렉틴 단백질의 당친화도가 비특이 반응이 있어 AFP-L3 %를 정량하는 정확도가 감소하게 된다. 또한 Wako 사의 별도의 장비가 필요하게 되어 기존 병원에서 많이 사용되는 core-lab 장비들과의 multiple maker를 이용한 동시 진단 알고리즘 적용 및 비교가 불가능하며, 하나의 분석당 비용 및 시료의 양이 다량 필요하여 많이 활용되지 못하였다.
이에, 본 발명자들은 AFP-L3을 혈청 내에서 특이적으로 인지할 수 있는 항체와 이를 이용한 AFP-L3 탐지 및 정량방법이 필요한 실정이다. 질병 진단의 유용한 표지자인 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, AFP의 코어-푸코실화의 유무를 구별하는 항체의 개발이 간암 진단의 정확도를 높이기 위한 진단법의 활용 및 보급화를 위해 필요한 실정이다.
본 발명은 간암 진단의 유용한 표지자인 코어-푸코실화된 알파-페토프로테인(core fucosylated alpha-fetoprotein, AFP), 예컨대 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP인 AFP-1과 구별하여 AFP-L3에만 선택적으로 결합할 수 은 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, AFP-L1와 구별하여 AFP-L3 만을 특이적으로 인지하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, AFP-L3에 대한 선택적 인지 성능으로 간암의 조기 진단 및 예후, 모니터링을 상기 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 이용한 질병 진단 또는 질병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 AFP-L3에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 구별하여 AFP-L3에 선택적으로 결합할 수 있은 항체, 상기 항체를 이용한 AFP-L3 탐지 또는 정량방법, 및 상기 항체를 이용한 간암 등의 질병을 진단 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 명세서에서 용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 예는, AFP-L3를 특이적으로 인지하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에서, 상기 항체는 푸코실화되지 않은 AFP인 AFP-L1에 비해 높은 친화력으로 선택적으로 AFP-L3에 결합하는 항체이다. 본 발명에 따른 항-AFP-L3 항체는 푸코스(fucose)가 없는 AFP에는 낮은 친화도 및 선택도를 보인다. 본 발명에 따른 항체가 인지하는 코어-푸코실화된 AFP의 구조는 도 1에 나타냈다. 도 1은 AFP의 당 구조 및 개발 항체 인지 성능 정도의 모식도를 나타낸다. AFP-L1에 비해 상대적으로 AFP-L3에 대한 높은 특이도 및 선택도로 인식하는 항체는 AFP 단백질의 구조가 현재 명확히 규명되지 않으며, 또한 두 단백질이 동일한 염기서열을 가지면서 당의 구조상 푸코스 존재 유무의 차이만을 가지고 있기 때문에, AFP-L1에서 푸코스 만을 추가로 가진 AFP-L3 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 개발의 난이도가 매우 높아 개발하기 어려웠다.
Wako 사의 u-TASWAKO i30 장비를 이용한 AFP-L3의 측정법에 사용하는 렉틴, 특히 LCA 단백질에 비해, 본 발명에 따른 항체는 코어-푸코실화된 AFP-L3를 특이적으로 인지하여 결합함으로 렉틴을 이용한 측정법에 대해서 측정의 정확성이 높으며, 기존 AFP-L3 진단 장비에 비해 AFP-L3을 정확히 정량할 수 있어 이에 기반한 간암의 진단 및 예후의 판단이 가능하다.
본 발명에 따른 AFP-L3 항체는 기존에 암 진단을 위한 단백질의 유무 및 정량 측정법을 위한 기기에 바로 적용이 가능하여 빠르고 간편할 뿐만 아니라, 멀티마커를 이용한 진단의 정확도를 높이기 위해 적용하는 멀티마커 알고리즘에도 AFP-L3 항체수치를 적용가능하며 이를 통해 간암의 조기 진단의 정확도를 더 높일 수 있는 진단 기준을 제시 가능하다.
본 발명의 일 예에 있어서, 항-AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 상기 코어-푸코실화된 AFP, 예컨대 AFP-L3에 대한 항체는, 인간 AFP (Accession #NP001125.1)중 251번째 아스파라진 아미노산을 포함하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 에피토프(항원결정부위)로서 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 에피토프를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합, 및 이와 경쟁적으로 AFP-L3 에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 샌드위치 ELISA 분석(Sandwich ELISA assay)을 기반으로 AFP-L3에 대한 분석을 수행함에 있어, 상기 항체를 포획(capture) 항체로 사용하고, 각 웰에 있는 천연 AFP-L1와 천연 AFP-L3 단백질에 모두 반응하여 AFP 전체를 인지하는 항체를 탐지(Detector)항체로 측정하게 되면, 천연 AFP-L1 및 AFP-L3의 농도가 각각 50ng/ml 이상의 구간에서 AFP-L1에 대한 AFP-L3의 O.D 값의 비율이 1.5배 이상, 예를 들면 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상 또는 2.0배 이상의 값을 가지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 AFP-L3의 농도가 50ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 100 ng/ml이상, 200ng/ml 이상의 농도에서 AFP-L1에 대한 AFP-L3의 구별능이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 예에서, 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서, 일반식 1(서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 일반식 2(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 일반식 3(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
[일반식 1]
GX1X2X3X4X5X6GX7G
상기 식에서, X1는 F, S, Y, I, 또는 L이고, X2는 S, P, F, 또는 Y이고, X3는 F, S, I, 또는 L이고, X4는 S, T, G, 또는 R이고, X5는 D, N, G, 또는 V이고, X6는 H, 또는 R이고, X7는 L, M, V, 또는 I이고,
[일반식 2]
SX8TX9GGX10X11TWX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22
상기 식에서, X8은 I 또는 T이고, X9은 S, 또는 N이고, X10은 S, G 또는 R 이고, X11은 G 또는 I이고, X12는 Y 또는 N이고, X13은 A, S 또는 T이고, X14는 P 또는 S이고, X15는 A 또는 T이고, X16은 V 또는 M이고, X17은 K, R 또는 E이고, X18은 G, 또는 V이고, X19는 R 또는 P이고, X20은 A 또는 T이고, X21은 T 또는 S이고, X22는 I 또는 F이고,
[일반식 3]
SAX23GGWIX24X25DX26X27X28
상기 식에서, X23은 Y 또는 V이고, X24는 A 또는 V이고, X25는 D, G, S 또는 E이고, X26은 I, V 또는 T이고, X27은 D, V 또는 N이고, X28은 A, V, S 또는 T이다.
더욱 자세하게는, 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서,
서열번호 7 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1),
서열번호 12 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및
서열번호 15 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
항AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서, 일반식 4(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 일반식 5(서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 일반식 6(서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
[일반식 4]
SGGX29X30X31G
상기 식에서, X29은 S 또는 R, X30는 G, D, 또는 S, X31는 Y, C, 또는 H이고,
[일반식 5]
YX32X33X34X35RX36X37
상기 식에서, X32는 E 또는 D이고, X33은 S, C 또는 N이고, X34는 N, S, Y, D, T 또는 H이고, X35는 K, R 또는 H이고, X36은 P 또는 L이고, X37은 S, T, P 또는 L이고,
[일반식 6]
GGX38X39SX40X41X42PGX43FGA
상기 식에서, X38은 W 또는 R이고, X39는 E 또는 G이고, X40은 S, N, G, Y 또는 V이고, X41은 S 또는 N이고, X42는 I, T, 또는 V이고, X43은 A 또는 T이다.
더욱 자세하게는, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서,
서열번호 19 내지 서열번호 21으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1),
서열번호 22 내지 서열번호 27으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및
서열번호 28 내지 서열번호 32으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
구체예에서, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기한 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 항 AFP-L3항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 7 내지 서열번호 27 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 28 내지 서열번호 48 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 49 내지 서열번호 61 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 62 내지 서열번호 68 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 69 내지 서열번호 85 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 86 내지 서열번호 98 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 항 AFP-L3 항체의 중쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
CDR-H1 서열번호 CDR-H2 서열번호 CDR-H3 서열번호
GFSFSDHGMG 7 SITSGGSGTWYAPAVKGRATI 28 SAYGGWIADDIDA 49
GFYFSDHGMG 8 SITSGGRGTWYAPAVKGRATI 29 SAYGGWIAEDIDA 50
GFSFSVHGMG 9 SITSGGSGTWYAPAVKVRATI 30 SVYGGWIADDIDA 51
GFSFSDRGMG 10 SITNGGSGTWYAPAVKGRATI 31 SAYGGWIADDVDA 52
GSSFSDHGMG 11 SITSGGGGTWYAPAVKGRATI 32 SAYGGWIASDIDA 53
GFSFSDHGLG 12 SITSGGSGIWYAPAVKGRATI 33 SAYGGWIADDIDS 54
GFSLGDHGMG 13 SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI 34 SAYGGWIADDIDV 55
GISFSDHGMG 14 SITGGGSGTWYAPAVKGRATI 35 SAYGGWIADDTDA 56
GFSFGDHGMG 15 SITSGGSGTWYTPAVRGRATI 36 SAYGGWIADDIVA 57
GFFFSDHGMG 16 SITSGGSGTWYAPAVKGRATF 37 SAYGGWIADDIDT 58
GFPFSDHGMG 17 SITSGGSGTWYAPAMKGRATI 38 SAYGGWIADDINA 59
GYSFSDHGMG 18 SITSGGSGTWYSPAVKGRATI 39 SAYGGWIVDDIDA 60
GFSFSDHGIG 19 STTSGGSGTWYAPAVKGRATI 40 SAYGGWIAGDINA 61
GFSFSNHGMG 20 SITSGGGGIWYAPAVKGRATI 41
GLSFSVHGMG 21 SITSGGSGTWYAPAVKGRVTI 42
GFSFSDHGVG 22 SITSGGSGTWYAPAVEGRATI 43
GFSFSGHGMG 23 SITSGGSGTWNAPAVKGRATI 44
GFSFTDHGMG 24 SITSGGSGTWYAPAVKGRASI 45
GFSISDHGMG 25 SITSGGSGTWYAPTVKGRATI 46
GFPFRDHGMG 26 SITSGGSGTWYASTVKGRATI 47
GFSSSVHGMG 27 SITSGGSGTWYAPAVKGRAII 48
구체적으로, 항 AFP-L3 항체의 경쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
CDR-L1 서열번호 CDR-L2 서열번호 CDR-L3 서열번호
SGGSGYG 62 YESNKRPS 69 GGWESSSNPGIFGA 86
SGGSDYG 63 YESDKRPS 70 GGRESSSNPGIFGA 87
SGGSSYG 64 YESTKRPS 71 GGWESNSNPGIFGA 88
SGGSGCG 65 YESSKRPS 72 GGWGSSSNPGIFGA 89
SGGRSYG 66 YESNMRPS 73 GGWESNSNPGTFGA 90
SGGSGHG 67 YESNRRPS 74 GGWESSSNPGVFGA 91
SGGRGYG 68 YESTKRPP 75 GGWESGSNPGIFGA 92
YENNKRPS 76 GGWESSSNPGIFGT 93
YESHKRPS 77 GGWESYSNPGIFGA 94
YESNKRPP 78 GGWESVSNPGIFGA 95
YESNKRPT 79 GGWESSSSPGIFGA 96
YESNKRLS 80 GGWESSNNPGIFGA 97
YESNKRPL 81 GGWESSSKPGIFGA 98
YDSNKRPS 82
YDSDKRPS 83
YECNKRPS 84
YESYKRPS 85
본 발명에 따른 항체의 일예는, 하기 표 11에 나타낸 상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합을 갖는 항체일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
항 AFP-L3　항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 AFP-L3 항체는 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다. 최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
다른 예는 상기 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
한편, 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 AFP-L3에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 AFP-L3와 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다. 상기 AFP-L3 종양 표지자와 관련된 질병이 간암 또는 간 관련 질병인 것일 수 있다.
또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계; 및 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 AFP-L3 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 진단 방법 또는 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액, 혈장 또는 혈액 등일 수 있다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항 AFP-L3 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공된다.
항원과 항체의 결합을 화학발광반응(chemiluminescence)를 이용하여 측정하는 원리를 활용한 화학발광 면역측정법(chemiluminescence immunoassay)를 최근 사용한다. 화학발광 반응이란 화학발광 물질이 저에너지 상태에서 고에너지 상태로 여기되었다가 기저 상태로 돌아오면서 빛을 내는 현상으로 분자를 여기시키는 에너지가 빛이 아닌 화학반응이라는 점에서 형광과 다르며, 효소를 이용한 면역분석법에 비해 높은 민감도를 보인다.
본 발명에 따른 항체는 코어-푸코실화된 AFP (AFP-L3)에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 코어-푸코실화되지 않은 AFP와 선별하여 AFP-L3에 선택적으로 결합할 수 있어, 상기 항체를 이용한 간암 등의 질병을 진단 또는 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 AFP의 이소타입(isotype)에 따른 AFP의 당 구조 및 코어-푸코실화된 AFP의 당 구조와 이에 따른 개발 항체 인지 성능 정도의 모식도이다.
도 2는 Lectin(LCA)을 이용한 기존 AFP-L3에 대한 측정원리 및 방법 AFP-L3에 관한 설명하는 도면이다.
도 3은 WAKO 사의 경쟁적 면역 분석 (WAKO i30) Schematic diagram of i30 operation principle을 나타낸다.
도 4는 실시예 1-2에 따라, 표준 물질인 단백질의 Lectin Electrophoresis 를 이용하여 fucosylation된 정도를 WAKO의 표준물질(calibrator)와 비교하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5은 실시예 1-3 에 따라, 표준 AFP 단백질의 당분석 결과를 나타내는 것으로서, MALDI-TOF MS 분석결과이다.
도 6은 실시예 4-2에 따라, 샌드위치 ELISA 분석법을 이용하여, 본 발명에 따른 항체의 표준 물질에 대한 구별 성능 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공될 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 천연 AFP- L1 및 AFP- L3 단백질 준비
1-1: 천연 AFP- L1 및 AFP- L3 단백질 준비
천연 AFP-L1은 cord blood originated AFP protein 구매하고, 천연 AFP-L3는 liver cancer cell originated AFP protein 정제하여 얻었다. 천연 AFP-L3 단백질 정제 방법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
간세포암(Hepatocellular carcinoma cell)유래의 세포주인Huh7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum, 우태아 혈청)(Welgene,한국)가 들어있는 DMEM media(Welgene,한국)에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 배양 세포가 전체 150π dish에 2.5x106 개 이상으로 세포가 자랐을 때, dish에 남은 DMEM media를 세포에 닫지 않게 흡입하여 media를 완전히 제거한다. Media가 제거된 dish에 1X PBS buffer(인산 완충 용액)로 25ml씩 2번 세포가 자란 dish를 세척한 후, FBS가 없는 DMEM media로 72 시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 이렇게 배양이 완료된 media를 모아 1000rpm, 3분동안 원심 분리하여 가라앉은 세포의 부스러기(cell debris)를 제거하고 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 천연 AFP-L3 정제 용액으로 사용하였다.
상기 용액을 AFP 마우스 유래 항체(Boditechmed, 한국)가 컨쥬케이션 되어 있는 protein G bead(GE Healthcare Life Science,미국)에 20X PBS stock(바이오세상,한국)을 위의 얻어진 천연 AFP-L3 정제용액의 전체 양의 1/20을 넣어 1X PBS 조성이 되게 만든다. 이를 protein G bead가 들어있는 컬럼에 천천히 흘려주었다. 모든 천연 AFP-L3 정제용액이 컬럼을 다 통과하여 흘러내린 후, 1X PBS로 bead 양에 10배 이상의 1X PBS를 흘려 내려, 비드에 붙지 않은 단백질을 제거하기 위해 비드의 세척단계를 진행하였다. 이후 protein IgG elution buffer (Thermo, 미국)를 이용하여 AFP 항체에 붙은 천연 AFP-L3 단백질을 elution 한 후, 1M Tris-HCl(PH 9.5)용액을 넣어 정제하여 얻어진 천연 AFP-L3가 포함되어 있는 용액의 산도를 중화시켰다. 모아진 단백질을 1X PBS solution을 투석카세트 밖에 다량 담아, 투석카세트에 있는 버퍼를 1X PBS 버퍼로 교체하기 위한 투석 단계를 진행하였다. 투석이 완료되면 단백질을 BCA 단백질 정량 키트(Thermo, 미국)를 이용하여 단백질을 정량하여 냉동 보관하였다.
실시예 1-2: 렉틴 면역블랏법에 대한 렉틴 전기영동
실시예 1-1에서 확보한 표준물질 AFP-L1 및 AFP-L3가 고순도이며, 렉틴 면역블랏법 시험결과를 통해, Wako 표준물질의 AFP-L1 및 AFP-L3 밴드 위치와 자체 확보 표준물질의 밴드의 위치가 유사하게 나타나는 것을 확인하였다. 렉틴 면역블랏 시험 결과를 통해, Wako 표준물질의 AFP-L1 및 AFP-L3 밴드 위치와 자체 확보 표준물질의 당분석을 통해 Wako 표준물질 AFP-L3이 AFP-L1에 비해 다량의 AFP-L3 특이적인 당을 보유하고 있음을 확인하였다.
구체적인 렉틴 면역블랏 시험방법은 LCA(vectorlab,미국)를 0.2mg/ml의 농도로 섞어 1% agarose gel을 만들고 단백질 sample을 gel에 loading 하였다. Loading 하는 샘플은 실시예 1-1에서 정제하여 확보한 AFP-L3 단백질을 농도별로, Wako사에서 판매하는 AFP-L3 표준물질을 종류별로 loading 하여 겔을 120volt에서 1시간 전기영동을 수행하였다. 내린 gel을 NC membrane에 transfer 하기 위해 TE77 ECL SemiDry Transfer Unit(Amersham Biosciences, 영국)를 이용하여 40 mA에서 1시간 작동시켰다. 전이가 완료된 NC 멤브레인을 1시간 동안 블라킹한 후, AFP에 대한 단클론 항체 (1G7)항체(Merck Millipore, 미국)룰 4 ℃ 보관상태에서 O/N으로 반응시킨 후 PBST 용액으로 3번 세척하였다. Anti-mouse Fc HRP antibody(Thermo, 미국)가 섞인 용액을 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 이 후 PBST 용액으로 3번 세척 한 후, Substrate를 넣어 ChemiDoc(Bio-Rad, 미국)로 이미지를 얻었다.
도 4는 실시예 1-2에 따라, control 단백질의 Lectin Electrophoresis 를 이용하여 푸코실화된 정도를 WAKO의 표준물질과 비교하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
실시예 1-3: 정제 AFP 단백질의 당 분석
실시예 1-1에서 정제된 천연 AFP-L1, 천연 AFP-L3 단백질에서 당쇄를 분리하기 위해 N-glycosidase(PNGase F) 효소를 인산화 버퍼와 반응하였다. 잘려진 당쇄를 Girarad’s reagent P(GP)룰 레이블링하기 위해 GP solution을 실온에서 4시간 반응시켰다. GP 레이블된 당쇄를 dihydroxybenzoic acid(DHB)와 섞고, 이를 이용하여 MALDI-TOF MS를 이용하여 GP-라벨링 된 당쇄를 정량한다. MALDI spectra는 Bruker Daltonics Microflex LRF MALDI-TOF MS(Bruker, 독일)을 이용하여 확보하였다. 관련 세부 방법은 참고논문(Biotechnology Letters,October 2015, Volume 37, Issue 10, pp 2019-2025) 과 동일하게 수행하였다.
상기 실험결과를 도 5에 나타냈으며, MALDI-TOF MS analysis--표준물질의 당분석을 통해 표준물질 정제 AFP-L3이 정제 AFP-L1에 비해 다량의 AFP-L3 특이적인 당을 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 2: 천연 AFP- L3 항체 후보 선정 및 성능 확인
실시예 2-1: 항체 제조
항체 제조를 위하여, 실시예 1-1에서 본 발명에서 control 물질로 사용하기 위해 정제한 AFP-L3 단백질과 구매한 control물질인 AFP-L1을 구별하는 항체를 선별하기 위해 phage display 기술을 이용하여 항체 라이브러리를 제작하였다.
제작한 항체 라이브러리는 ScFv form의 항체를 발현하는 형태로 제작되었으며, 1x1010의 complexity를 지닌다. 전체 라이브러리 중에서 control물질인 AFP-L3는 선택적으로 인지하고 AFP-L1은 인지하지 않는 항체를 선별하기 위하여, 항체 pool을 panning 방법을 통해 선별하였다. Panning방법은 AFP-L3 단백질을 마그네틱 비드에 컨쥬게이션한 것을 사용하였으며, AFP-L3 단백질에 붙는 항체를 선별하기 위해 비드에 binding 시 AFP-L1 control 단백질을 다량 함께 넣어, AFP-L3 control단백질에 더 잘 붙는 항체 pool을 선별하였다. 선별된 항체 Pool 에서 항체를 발현하는 phage clone 각각을 phage displayed 항체의 형태로 발현하였으며, 이의 스크리닝은 ELISA test를 기반으로 진행하였다.
실시예 2-2: 면역 및 cDNA 라이브러리 제작
AFP-L3(Ag)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 동물에 항원을 면역한 면역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이를 위한 벡터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.
구체적으로, 화이트 레그혼종의 닭에 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3)(Ag)를 완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제(Sigma, 미국)와 혼합하여 3주 간격으로 5회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB(3% 태아혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산완충용액)를 이용하여 1:100, 1:500, 1:2500 및 1:12500의 농도로 희석하여 보관한 후, 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다.
구체적인 효소면역측정법은, ELISA 플레이트에 Ag 1ug/ml을 4 ℃에서 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. PBST(0.1% tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로블린-HRP(horse radish peroxidase)(1:3000)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS(Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 Ag과 결합하지 않았으며, Ag에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 상기 채취된 조직을 10ml TRI 시약(Molecular research center, 미국)과 혼합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 헥사머(random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템(Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응(65?에서 5분; 4℃에서 5분; 50?에서 50분; 85?에서 5분; 및 4℃)을 수행하였다. 역전사 반응의 결과물인 cDNA를 포함하는 반응액 5μl를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동 후 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다. 상기 랜덤 헥사머 프라이머는 일반식 [d(N)6]로 표현되며, N은 뉴클레오타이드 서열 4종인 A(아데닌),T(티아민),G(구아닌),C(싸이토신)이 모두 포함된 것이다.
실시예 2-3: 항체 라이브러리 제작
(1)면역 항체 유전자 증폭
닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH와 VL 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응은 실시예 2-1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFV(single chain Fv) 영역에 맞게 고안된 하기 표 3의 프라이머 조합을 이용하였다. VH 및 VL 각각의 cDNA 라이브러리 0.5 마이크로리터, 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시킨 후, 94 ℃에서 15초, 56 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 90초간 반응시키는 과정을 30 사이클 반복하였다.
구분 프라이머 서열 (5'-->3') 서열번호
VH 정방향 GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG 99
역방향 CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC 100
VL 정방향 GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC 101
역방향 GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG 102
scFV 정방향 GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG 103
역방향 GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGG 104
PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
scFv DNA를 얻기 위해, 정제된 VH 50ng, VL 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 2분간 반응시키는 과정을 20 사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(2)항체 DNA의 제한효소 절단
상기에서 제조된 scFv와 파지미드 벡터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)로 절단하였다.
scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units SfiI (Roche, 미국), 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50 ℃에서 밤샘 반응시켰다.
또한, pComb3X 벡터 20ug, 120 units SfiI 및 20ul 10x buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤샘 반응시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(3)항체 DNA의 라이게이션 및 라이브러리의 제조
scFv 절편을 pComb3X 벡터에 삽입하기 위하여, 제한효소 SfiI를 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR 절편 700ng 및 pComb3X 1.4ug을 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738(New England Biolab, 미국)에 전기 천공법(electroporation)으로 형질전환시켜 46ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1X1010 complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다.
실시예 2-4: 항- Ag scFV 를 포함하는 파지 클론의 선별
수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 Ag에 결합하는 항체를 고체에 지지된 Ag을 이용하여 선별하였다.
결합하는 항체 선별하고자, 먼저 마그네틱 비드에 Ag 10마이크로그램을 각각 컨쥬게이션시켰다. 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37℃에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene, 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 70ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지(30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.
상기 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.
마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 Ag와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 Ag 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신(pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝(panning)을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다.
4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다.
상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 이용해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻고 Ag이 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 준비한 파아지를 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로 이용하여 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.
실시예 2-5: 선별된 항체의 서열분석
상기 실시예 2-4에서 선별조건에서 양성 반응을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻었다. DNA 미니 프렙 키트(진올, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정을 위해 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머 서열번호 (정방향) 및 (역방향)의 프라이머를 이용하여 분석하였다.
정방향(서열번호 105) ACACTTTATGCTTCCGGCTC
역방향(서열번호 106) CAAAATCACCGGAACCAGAG
실시예 2-6: 항체 선별을 위한 ELISA test
ELISA plate에 HA tag을 인지하는 monoclonal HA antibody(Abcam, 영국)를 코팅하고 각 well을 BSA solution으로 블라킹을 37℃ 1시간 반응하였다. 이 후, 앞선 panning 작업으로 선택된 pool 중 각 clone을 phage displayed scFv 로 발현된 E.coli culture media를 37℃ 2시간 추가 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, 정제된 Control AFP-L3, Control AFP-L1 단백질(10ug/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃ 2시간 반응시켰다. 이후 3번의 PBST용액으로 세척한 후, AFP를 인지하는 탐지항체를 Biotinylation시켜 둔 항체를 37℃에서 2시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, avidin-HRP항체를 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 3번의 PBST 용액으로 재 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응 시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.
위의 테스트에 사용한 후보 E.coli 발현 항체는 총 5종으로 항체의 이름은 L3-1 A4, L3P2-D5, 1-1 H1, L3-2 C10, 2-1 B8 총 5종 중 2종(L3-2 C10, 2-1 B8)이 선별되었다. 3회 반복의 실험의 평균값이다. Screening 시 후보항체를 capture 항체로 적용하여 실험 진행하였다.
구분 BSA AFP-L1 AFP-L3
L3-1 A4 0.14 0.13 0.13
L3P2-D5 0.15 0.23 0.31
1-1 H1 0.14 0.23 0.25
L3-2 C10 0.13 1.16 3.46
2-1 B8 0.16 0.18 0.63
E.coli 발현된 항체를 sandwich ELISA 기법으로 screening 하여, 표준물질AFP-L3를 친화적으로 인지하는 최종 2개의후보 항체(L3-2 C10, 2-1 B8)을 선별하였다.
실시예 3: 샌드위치 ELISA 를 이용한 항체의 AFP- L3 구별성능 확인 및 선별
Sandwich ELISA를 이용한 AFP-L3의 당의 존재 유무에 따른 항체의 결합 영향 평가하고자 하였다.
실시예 2에서와 유사하게 항체의 선별은 monoclonal HA항체를 플레이트에 코팅 시키고, BSA 용액을 37℃에서 1시간 반응하여 블라킹을 진행하였다. 이후 phage displayed scFv(C10, B8) 항체를 해당 well에서 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후 control AFP-L1, control AFP-L3와 함께 N-glycosidase PNGase 효소(NEB,미국)를 처리하여 단백질의 당이 제거된 형태의 AFP-L1, AFP-L3를 10ug/ml 농도로 37℃에서 2시간 반응을 시행하였고, 이후의 과정은 앞의 실시예 2-6의 방법과 동일하게 수행하였으며 3회 반복 실험의 평균값을 나타냈다.
선별 항체가 당을 제거하지 않은 단백질보다 AFP-L3의 당을 제거한 표준물질에 더 약하게 결합하는 것을 확인하였다. 선별항체가 당을 인지하고(epitope이 AFP-L3 당 부분 포함) AFP-L3 표준 물질에 친화적으로 결합함을 확인하였다. 상기 항체 IgG O.D 값을 하기 표 6에 나타냈다.
항원 L3-2 C10항체 L2-1 B8항체
AFP-L1 0.61 0.23
AFP-L1(당제거) 0.30 0.18
AFP-L3 2.08 1.23
AFP-L3(당제거) 1.66 0.61
선별 항체 C10 및 B8 은 AFP-L3 의 당을 제거한 표준물질에는 당을 제거하지 않은 단백질보다 약하게 binding하는 것을 확인하였다. 이를 통해 선별항체가 당을 인지하고(epitope이 AFP-L3 당 부분 포함) AFP-L3 표준 물질에 친화적으로 binding 함을 확인하였다.
실시예 4: 천연 AFP- L3 항체 후보 선정 및 성능 확인(정제된 동물세포 이용 발현항체 적용( IgG ))
실시예 4-1: 정제된 동물세포 이용 발현 항체 적용
실시예 2에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여 면역글로불린(IgG) 단백질을 생산하였다. 구체적으로, scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 7의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.
즉, 각 가변영역과 불변영역(CH 및 Ck)을 하기 표 7의 HC 및 LC 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNATM3.3-TOPO® 클로닝 키트 및 pOptiTMVEC-TOPO®A 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 벡터(pcDNATM3.3-TOPO®벡터와 pOptiTM VEC-TOPO®벡터) 1ul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 포함된 완충액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열충격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
구분 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
VH 정방향 GCTAGCCGCCACCATGGGC 107
역방향 AGGGGCCCTTGGTGGAGGCCTGGCCGGCCTGGCCACT 108
CH 정방향 GCCTCCACCAAGGGCCCCTC 109
역방향 CGGGATCCCTTGCCGGCCGT 110
HC 정방향 GCTAGCCGCCACCATGGGC 111
역방향 CGGGATCCCTTGCCGGCCGT 112
VL 정방향 AAGCTTGCCGCCACCATG 113
역방향 AGGGGGCGGCCACGGTCCGGGAAGATCTAGAGGACTG 114
Ck 정방향 CGGACCGTGGCCGCCCCCTC 115
역방향 GCTCTAGACTAGCACTCGC 116
LC 정방향 AAGCTTGCCGCCACCATG 117
역방향 GCTCTAGACTAGCACTCGC 118
상기 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄(25kDa)와 중쇄(50kDa)의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.
실시예 4-2: control 기준 물질에 대한 항체의 구별 성능 확인
선별용 Sandwich ELISA 방법은, AFP-L3 단백질을 선택적으로 인지하는 후보 항체를 IgG 형태로 발현하여 정제 후 이를 5ug/ml의 농도로 ELISA plate에 coating하였다. 각 well을 BSA solution으로 블라킹하고, 실시예 1에서 정제된 Control AFP-L3 및 Control AFP-L1 단백질(10ug/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이 후 3번의 PBST용액으로 세척 후, 탐지항체를 37℃에서 2시간 반응 후, 이후 3번의 PBST용액으로 재 세척 후, Biotin과 반응하는 avidin에 HRP 효소가 표지되어 있는 2차 항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST용액으로 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 3반복 실험의 평균값이다. 시험결과를 하기 표 8 및 도 7에 나타냈다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.
항원 L3-2 C10항체 L2-1 B8항체
AFP-L1 50 ng/ml 0.23 No data
AFP-L1 100 ng/ml 0.16 0.41
AFP-L1 1000 ng/ml 0.63 0.13
AFP-L3 50 ng/ml 0.37 No data
AFP-L3 100 ng/ml 0.34 0.33
AFP-L3 1000 ng/ml 1.97 0.89
표 8 및 도 6의 실험 결과에 나타낸 바와 같이, IgG 형태 선별 항체 중 하나인 L3-2 C10 항체가 표준물질 AFP-L3에 대해 AFP-L1 보다 높은 친화도를 가지고 구별함을 확인하였고, L3-2 C10 항체가 50ng/ml 라는 상대적으로 낮은 농도에서 구별 성능을 보였다.
실시예 4-3: Wako calibrator 에 대한 항체의 구별 성능 확인
실시예 2에서 얻은 AFP-L3을 선택적으로 인지하는 항체를 IgG 형태로 발현하여 정제 후 이를 5ug/ml의 농도로 ELISA plate에 coating하였다. 각 well을 BSA solution으로 블라킹하고, Wako calibrator AFP-L3(100ng/ml), Wako Calibrator AFP-L1 단백질(100ng/ml)을 항체가 코팅된 플레이트에 37℃ 2시간 반응시켰다. 이 후 3번의 PBST용액으로 세척 후, 탐지항체를 37 ℃에서 2시간 반응 후, 이후 3번의 PBST용액으로 세척 후, Biotin과 반응하는 avidin에 HRP 효소가 label되어 있는 2차 항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정한다. 3회 반복 실험의 평균값이다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다.
항원 L3-2 C10항체
Wako AFP-L1(100 ng/ml) 0.21
Wako AFP-L3(100 ng/ml) 0.32
선별 항체 L3-2 C10의 경우, Wako 사 판매 AFP-L1 및 AFP-L3에 대해 100ng/ml의 농도 구간에서 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하는 성능을 보임을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 선별 항체 L3-2 C10를 이용한 면역 분석법을 사용하여, 대상 탐지 항원을 두 가지로 구분하여 실험을 수행한 결과, 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1 및 AFP-L3단백질을 대상으로 측정한 결과와, Wako 사 판매표준 물질인 AFP-L1 및 AFP-L3 단백질을 대상으로 측정한 결과 모두 유의하게 AFP-L1과 AFP-L3를 구별하는 성능을 확인하였다.
실시예 5: ELISA를 이용한 Wako system과 비교 분석
5-1: 시료 제조
Sandwich ELISA 측정 방법으로서, 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 전체 단백질 농도가 200ng/ml이 되도록 혼합하며, 이 때 혼합의 기본 버퍼 조건은 구매한 AFP depleted serum을 이용하여 혼합된 AFP 단백질 용액을 제조하였다.
5-2: ELSIA 방법으로 분석
실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 본 발명에 따른 항체를 이용한 ELISA 분석방법으로 분석하였다.
구체적으로, 상기 5-1에서 제조한 시료에 대해서, 상기 실시예 2-6의 방법에 따라 ELISA 분석을 수행하였고, 이러한 분석결과를 하기 표 10에 나타내었다.
5-3: WAKO 분석기계로 분석
실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1, AFP-L3단백질을 이용하여 Wako사의 uTas i30기기를 이용한 ELISA 분석방법으로 분석하였다.
이를 Wako사의 uTas i30기기로 측정하여 AFP-L3(%) 값을 구하고, 또한 본 개발에서 확보한 L3-2 C10 항체의 IgG 를 코팅하여 각 샘플을 Sandwich ELISA를 통해 각 샘플을 AFP 인지할 수 있는 항체 pair 및 L3-2 C10를 이용한 코어-푸코실화된 AFP(AFP-L3)인지를 위한 항체 pair를 적용하여 Sandwich ELISA test 를 수행하였다.
이 때 그려지는 Standard curve를 적용하여 계산되는 전체 AFP 단백질의 양 및 L3-2 C10을 이용하여 측정된 코어-푸코실화된 AFP의 양을 구한 후, 이를 % 수치화 하여 Wako에서 측정된 수치와의 연관관계 확인을 위해 피어슨 상관계수 값을 계산하였다.
구분 전체 AFP 단백질 농도(ng/mL) AFP-L1 단백질 (ng/mL) AFP-L3 단백질 (ng/mL) AFP-L3(%)-wako uTas 측정치 AFP-L3(%)-개발항체 ELISA 측정치
시료1 200 20 180 33.6 11,6
시료2 200 100 100 55.4 16.2
시료3 200 180 20 81.4 33.2
uTas 측정수치와 개발 항체 측정 수치간의 Correlation score는 0.96이었다.동일 분석 시료인 실시예 1에서 정제하여 확보한 control AFP-L1 및 AFP-L3단백질을 대상으로 측정한 AFP-L3%의 측정치 면에서, 본 발명에 따른 개발항체를 이용한 면역 분석법과 WAKO사의 uTas 기기를 이용한 분석법 사이에 높은 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 다양한 항체 제조 및 활성 확인
6-1: 항체 제조
항체 선별을 위한 선별항체의 random mutagenesis를 통한 선별 항체 라이브러리 제작 및 후보항체 선별하였다.
상기 선별된 C10 항체의 scFv 서열을 주형으로 항체의 유전자를 서열번호 103,104에 제시된 프라이머를 이용하여 항체를 PCR 반응을 시켰다. 항체를 증폭 시 항체의 염기서열에 random mutagenesis를 도입하기 위하여 random mutagenesis kit(Jenabioscience, 독일)을 이용하여 키트에 작성된 방법대로 항체 유전자에 random mutagesis를 도입하였다. 위의 키트를 통해 증폭된 항체의 유전자를 항체 DNA의 제한효소 절단부터의 실험과정은 실시예 2-3: 항체 라이브러리 제작에서 작성된 것과 동일하게 진행하여 C10 random mutagenesis된 항체 라이브러리를 제작하여 5*109 complexity를 갖는 항체를 확보하였다.
수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 Ag에 결합하는 항체를 고체에 지지된 Ag을 이용하여 선별하였다.
6-2: 결합하는 항체 선별
먼저, 마그네틱 비드에 Ag 10마이크로그램을 각각 컨쥬게이션시켰다.
수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37℃에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene, 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 70ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지(30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.
상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.
마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 Ag와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 Ag 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신(pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝(panning)을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다.
4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다.
6-3: 활성 확인시험
항체의 활성 확인 및 선별은 실시예 2-6에서와 유사하게 monoclonal HA항체를 플레이트에 코팅시키고, BSA 용액을 37℃에서 1시간 반응하여 블라킹을 진행하였다. 실시예 1에서 얻은 control AFP-L1, control AFP-L3를 1ug/ml농도로 처리하여 37 ℃에서 2시간 반응을 수행하였고, PBST 용액으로 3번 세척을 진행하였다.
상기 수득한 파아지 항체 배양액 각각을 처리하여 37 ℃에서 2시간 반응을 시행하고 난 후, PBST 용액으로 3번 세척을 진행한 후, 탐지항체를 Biotinylation시켜 둔 항체를 37℃에서 2시간 반응시켰다. 상기 탐지항체는 AFP-L1, AFP-L3를 구별하지 않고 AFP를 모두 인식하는 항체로서 Milipore사, ST1673, Anti-AFP Mouse mAb(1G7)를 탐지항체로 선택하여 사용하였다. 3번의 PBST 용액으로 세척 후, avidin-HRP항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 3번의 PBST 용액으로 재세척 후, ABTS solution 으로 발색하여 실온에서 30분 반응시킨 후, OD=450nM 에서 각 well의 OD 값을 측정하였다. 이후 항체의 유전자 분석은 실시예 2-5와 동일한 방법으로 진행하여, C10과 유사한 성능을 보이면서 C10과 CDR의 서열이 다른 항체를 선별하였다.
표 11에 기재된 항체는 AFP-L3 O.D값을 AFP-L1 O.D 값을 나눈 O.D값의 비율(ratio)가 1.5 이상이면서 각각의 CDR의 서열이 다른 항체를 선별하여 기재하였다.
NO CDR-L1 CDR-L3 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 O.D.(Ratio)
1 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　3.39
2 SGGSGYG YESNKRPS GGRESSSNPGIFGA GFYFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIAEDIDA 　2.57
3 SGGSGYG YESDKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 2.35
4 SGGSGYG YESNKRPS GGWESNSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGRGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.19
5 SGGSGYG YESTKRPS GGRESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.21
6 SGGSGYG YESSKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.04
7 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKVRATI SAYGGWIADDIDA 　2.89
8 SGGSGYG YESNMRPS GGWGSSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITNGGSGTWYAPAVKGRATI SVYGGWIADDIDA 　2.68
9 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSVHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.68
10 SGGSGYG YESNRRPS GGWESNSNPGTFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDVDA 　2.69
11 SGGSGYG YESNKRPS GGWESNSNPGIFGA GFSFSDRGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.57
12 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GSSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIASDIDA 　2.90
13 SGGSGYG YESSKRPS GGWESSSNPGVFGA GFSFSDHGLG SITSGGGGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.23
14 SGGSGYG YESNKRPS GGRESSSNPGIFGA GFSLGDHGMG SITSGGSGIWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.89
15 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GISFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDS 　2.89
16 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDV 　2.11
17 SGGSGYG YESTKRPP GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI SAYGGWIADDIDA 　2.22
18 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDTDA 　3.58
19 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIVA 　2.06
20 SGGSGYG YENNKRPS GGWESGSNPGIFGA GFSFGDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.15
21 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGGGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.18
22 SGGSGYG YESNKRPS GGWESNSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.19
23 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITGGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDS 　2.16
24 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDRGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.82
25 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFFFSDHGMG SITSGGSGTWYTPAVRGRATI SAYGGWIADDIDA 　3.16
26 SGGSGYG YESHKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.17
27 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFPFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATF SAYGGWIADDIDA 　3.07
28 SGGSGYG YESNKRPS GGRESSSNPGIFGA GYSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDVDA 　2.73
29 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGIG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.02
30 SGGSGYG YESNKRPP GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAMKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.01
31 SGGSGYG YESNKRPT GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.30
32 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSNHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDT 　2.39
33 SGGSGYG YENNKRPS GGWESNSNPGIFGA GFSFSVHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIVA 　2.45
34 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIAEDIDA 　2.04
35 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GLSFSVHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.22
36 SGGSGYG YESNKRPS GGWESGSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI SAYGGWIADDINA 　2.29
37 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGT GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYSPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.36
38 SGGSGYG YESSKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG STTSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDT 　2.12
39 SGGSGYG YESNKRLS GGWGSSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGGGIWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.12
40 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGVG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.15
41 SGGSDYG YESNKRPL GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDINA 　3.04
42 SGGSGYG YESNKRPT GGRESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.64
43 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGVFGA GFSFSGHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI SAYGGWIADDIDA 　2.24
44 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRVTI SAYGGWIADDIDA 　2.65
45 SGGSGYG YESNKRPS GGRESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.24
46 SGGSGYG YESNKRPS GGWESYSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRASI SAYGGWIADDIDA 　1.67
47 SGGSGYG YESNKRPS GGWESYSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVEGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.70
48 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGVG SITSGGSGTWYAPAVKGRTTI SAYGGWIADDIDA 　1.66
49 SGGSGYG YDSNKRPS GGRESSSNPGIFGA GFSFSDRGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.81
50 SGGSGYG YESNKRPT GGRESSSNPGIFGA GFSFTDHGMG SITSGGSGTWNAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.28
51 SGGSGYG YESNRRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.09
52 SGGSGYG YDSDKRPS GGRESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.93
53 SGGSSYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIVDDIDA 　2.62
54 SGGSGYG YESNKRPS GGWESVSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.67
55 SGGSGCG YECNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSISDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIVA 　2.12
56 SGGSGYG YESNKRPS GGWESNSNPGIFGA GFPFRDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDT 　2.31
57 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGVFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.80
58 SGGSGYG YENNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPTVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.76
59 SGGSGYG YESYKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYASTVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.66
60 SGGSGYG YESNKRPL GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.71
61 SGGRSYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　1.67
62 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRAII SAYGGWIADDIDA 　2.05
63 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSSPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.00
64 SGGSGYG YENNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDVDA 　2.31
65 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSSSVHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.00
66 SGGSGYG YESYKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.15
67 SGGSGHG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGLG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIAGDINA 　2.03
68 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSLGDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.86
69 SGGSGYG YESNKRPS GGWESSNNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.09
70 SGGSGYG YESNKRPT GGWESSSKPGIFGA GFSFSDHGLG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDVDA 　2.96
71 SGGSGYG YESNKRPP GGWESSSNPGIFGA GFSFSDRGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.44
72 SGGRGYG YESNKRPS GGWESSSNPGIFGA GFSFSDHGMG SITSGGSGTWYAPAVKGRATI SAYGGWIADDIDA 　2.36
표 12는 표 11에 기재된 항체 중 대표적인 항체 5종의 실제 ELISA 분석법을 이용한 O.D 측정치를 표시하여 나타내었으며 실험방법은 실시예 2-6과 동일하게 수행하였다.
NO AFP-L1(O.D) AFP-L3 (O.D)
10 1.5036 3.0411
35 1.065 2.3648
37 0.9962 2.3472
55 1.0814 2.2879
61 1.4043 2.3391
<110> SK TELECOM CO., LTD. <120> Antibody specifically binding to core fucosylated alpha-fetoprotein and use thereof <130> DPP20161737KR <160> 118 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H1) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is F, S, Y, I or L <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is S, P, F or Y <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is F, S, I or L <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is S, T, G, or R <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is D, N, G, or V <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is H or R <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X is L, M, V, or I <400> 1 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H2) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is I or T <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is S, or N <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is S, G or R <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is G or I <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is Y or N <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> X is A, S or T <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X is P or S <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> X is A or T <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X is V or M <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> X is K, R or E <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> X is G, or V <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> X is R or P <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> X is A or T <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> X is T or S <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> X is I or F <400> 2 Ser Xaa Thr Xaa Gly Gly Xaa Xaa Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-H3) <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is Y or V <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is A or V <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X is D, G, S or E <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is I, V or T <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> X is D, V or N <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X is A, V, S or T <400> 3 Ser Ala Xaa Gly Gly Trp Ile Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L1) <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is S or R <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is G, D, or S <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is Y, C, or H <400> 4 Ser Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L2) <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is E or D <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is S, C or N <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is N, S, Y, D, T or H <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X is K, R or H <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is P or L <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is S, T, P or L <400> 5 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> polypeptide(CDR-L3) <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is W or R <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X is E or G <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X is S, N, G, Y or V <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X is S or N <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> X is I, T, or V <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X is A or T <400> 6 Gly Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 7 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 8 Gly Phe Tyr Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 9 Gly Phe Ser Phe Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 10 Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg Gly Met Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 11 Gly Ser Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 12 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 13 Gly Phe Ser Leu Gly Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 14 Gly Ile Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 15 Gly Phe Ser Phe Gly Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 16 Gly Phe Phe Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 17 Gly Phe Pro Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 18 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 19 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 20 Gly Phe Ser Phe Ser Asn His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 21 Gly Leu Ser Phe Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 22 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Gly Val Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 23 Gly Phe Ser Phe Ser Gly His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 24 Gly Phe Ser Phe Thr Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 25 Gly Phe Ser Ile Ser Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 26 Gly Phe Pro Phe Arg Asp His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H1 <400> 27 Gly Phe Ser Ser Ser Val His Gly Met Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 28 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 29 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Arg Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 30 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Val Arg Ala Thr Ile 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 31 Ser Ile Thr Asn Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 32 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 33 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Ile Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 34 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Thr Thr Ile 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 35 Ser Ile Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 36 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Thr Pro Ala Val Arg 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 37 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Phe 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 38 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Met Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 39 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ser Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 40 Ser Thr Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 41 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ile Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 42 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 43 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 44 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Asn Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 45 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ser Ile 20 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 46 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 47 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Ser Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ile 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H2 <400> 48 Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ile Ile 20 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 49 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 50 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Glu Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 51 Ser Val Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 52 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Val Asp Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 53 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Ser Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 54 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 55 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Val 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 56 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Thr Asp Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 57 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Val Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 58 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asp Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 59 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Asp Asp Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 60 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Val Asp Asp Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody heavy chain CDR-H3 <400> 61 Ser Ala Tyr Gly Gly Trp Ile Ala Gly Asp Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 62 Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Gly 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 63 Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Gly 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 64 Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 65 Ser Gly Gly Ser Gly Cys Gly 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 66 Ser Gly Gly Arg Ser Tyr Gly 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 67 Ser Gly Gly Ser Gly His Gly 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L1 <400> 68 Ser Gly Gly Arg Gly Tyr Gly 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 69 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 70 Tyr Glu Ser Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 71 Tyr Glu Ser Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 72 Tyr Glu Ser Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 73 Tyr Glu Ser Asn Met Arg Pro Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 74 Tyr Glu Ser Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 75 Tyr Glu Ser Thr Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 76 Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 77 Tyr Glu Ser His Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 78 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 79 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Thr 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 80 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Leu Ser 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 81 Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Leu 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 82 Tyr Asp Ser Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 83 Tyr Asp Ser Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 84 Tyr Glu Cys Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L2 <400> 85 Tyr Glu Ser Tyr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 86 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 87 Gly Gly Arg Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 88 Gly Gly Trp Glu Ser Asn Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 89 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 89 Gly Gly Trp Gly Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 90 Gly Gly Trp Glu Ser Asn Ser Asn Pro Gly Thr Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 91 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Val Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 92 Gly Gly Trp Glu Ser Gly Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 93 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Thr 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 94 Gly Gly Trp Glu Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 95 Gly Gly Trp Glu Ser Val Ser Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 96 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Ser Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 97 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Asn Asn Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Anti-AFP-L3 antibody light chain CDR-L3 <400> 98 Gly Gly Trp Glu Ser Ser Ser Lys Pro Gly Ile Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 72 <212> DNA <213> VH forward primer <400> 99 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 100 <211> 44 <212> DNA <213> VH reverse primer <400> 100 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 101 <211> 38 <212> DNA <213> VL forward primer <400> 101 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 102 <211> 34 <212> DNA <213> VL reverse primer <400> 102 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 103 <211> 42 <212> DNA <213> scFV forward primer <400> 103 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 104 <211> 47 <212> DNA <213> scFV reverse primer <400> 104 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Seqeuncing primer(forward) <400> 105 acactttatg cttccggctc 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Seqeuncing primer(reverse) <400> 106 caaaatcacc ggaaccagag 20 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> VH primer (forward) <400> 107 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 108 <211> 37 <212> DNA <213> VH primer (reverse) <400> 108 aggggccctt ggtggaggcc tggccggcct ggccact 37 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> CH primer (forward) <400> 109 gcctccacca agggcccctc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> CH primer (reverse) <400> 110 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> HC primer(forward) <400> 111 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> HC primer (reverse) <400> 112 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> VL primer (forward) <400> 113 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 114 <211> 37 <212> PRT <213> VL primer (reverse) <400> 114 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr 1 5 10 15 Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Cys Thr Gly 35 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Ck primer (forward) <400> 115 cggaccgtgg ccgccccctc 20 <210> 116 <211> 19 <212> DNA <213> Ck primer (reverse) <400> 116 gctctagact agcactcgc 19 <210> 117 <211> 18 <212> DNA <213> LC primer (forward) <400> 117 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> LC primer (reverse) <400> 118 gctctagact agcactcgc 19

Claims (17)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위와, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위를 포함하며, 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)와 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 이루어지는 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위(CDR)를 포함하는, 알파-페토프로테인 L3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, AFP-L1와 구별하여 AFP-L3에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, AFP-L1에 대한 AFP-L3의 O.D 값의 비율이 1.5이상의 값을 갖는 것인, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 AFP-L3의 농도가 50ng/ml 이상으로 포함하는 시료인것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 7 내지 27의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H1, 서열번호 28 내지 48의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H2, 및 서열번호 49 내지 61의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-H3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 상보적 결합 부위는 서열번호 62 내지 68의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L1, 서열번호 69 내지 85의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L2, 및 서열번호 86 내지 98의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 CDR-L3을 포함하는 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 항 AFP-L3 항체는 단클론 항체인, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 항 AFP-L3 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 AFP-L3 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, AFP-L3 관련 질병의 진단용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 코어-푸코실화된 AFP에 대한 항체와 항체 결합자리가 상이한 항-AFP항체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항-AFP 항체에 직접 또는 링커를 통해 결합된 표지자를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 질병은 간암인, 진단용 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 시료와 접촉시키는 단계, 및 상기 항 AFP-L3 항체와 항원의 결합반응을 탐지하는 단계를 포함하는, AFP-L3를 검출하는 면역분석 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 방법은 ELISA, 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA) 또는 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA))인 방법.
  17. 포획 항체(capture antibody)로서 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 항 AFP-L3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 탐지 항체(detector antibody)로서 항 코어-푸코실화된 AFP항체와 결합자리가 상이한 항-AFP 항체, 및 상기 탐지 항체에 직접 또는 링커를 통해 결합된 표지자를 포함하는 면역 분석용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220142621A (ko) * 2021-04-15 2022-10-24 한국과학기술원 단백질 당화를 기반으로 한 암세포의 약물 내성 예측 방법

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