KR20180040912A

KR20180040912A - 와송 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물

Info

Publication number: KR20180040912A
Application number: KR1020160132814A
Authority: KR
Inventors: 윤원종; 김창숙; 이용범; 함영민; 오대주; 윤선아; 송상목; 이시택; 홍인철; 현호봉
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2018-04-23

Abstract

본 발명은 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성을 농도 의존적으로 촉진하고 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등의 사이토카인 생성을 농도 의존적으로 촉진하며 또한 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 촉진하는 와송 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물을 개시한다.

Description

와송 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물{Composition for immunity stimulatory activity Using a Water Extract of Orostachys japonicus}

본 발명은 와송(Orostachys japonicus) 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.

면역은 인체가 자기 성분 이외의 물질이 생체의 항상성을 깨드리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 자기 보호 기작으로, 크게 선천적 면역(innate immunosurveillance)과 획득 면역(adaptive immunosurveillance)으로 구분된다(Korean J Oriental Physiol Pathol 23:1385-1391, 2009).

자연 면역이라고도 하는 선천적 면역은 대식세포, 자연살해세포 등을 포함하는 백혈구, TNF-α 등의 다양한 사이토카인 등으로 구성되어 있어 획득 면역이 발생하기 전에 미생물, 바이러스 침입 등의 감염성 병원체뿐만 아니라 노화된 정상세포와 암세포 등에 대해 대식작용(phagocytosis)을 일으켜 1차적인 방어 면역 역할을 담당한다(Biochem Biophys Res Commun 157: 87-94, 1998; J Clin Invest 79: 319-326, 1987; Biol. Pharm. Bull. 27:617, 2004). 획득 면역은 적응 면역이라고도 하는데, 항원 제시 세포가 포식하여 제시한 항원을 T세포가 인식하면서 이루어지며, T세포가 관여하는 세포성 면역과 B세포가 생산하는 항체에 의한 체액성 면역반응으로 이루어진다(Korean J Food Nutr 21: 275-282, 2008).

선천 면역에서 대식세포가 가장 중요한 역할을 담당하는데, 대식세포는 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 체액성 면역과 세포성 면역에 관여하며, 활성화되면 증식과 확산능력의 향상, 대식능력 증강뿐만 아니라 NO(nitric oxide), TNF-α, IL-1β, IL-6 등의 사이토카인을 분비하여 각종 미생물, 바이러스 등 감염성 병원체의 증식을 억제하고 암세포 등에 대해서도 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Food Ind Nutr 5: 21-26, 2000; Biochem Biophys Res Commun 157: 87-94, 1998; J Clin Invest 79: 319-326, 1987, Biol. Pharm. Bull. 27:617, 2004; J. Immunol. 144:1425, 1990; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 211:24, 1996; J. Exp. Med. 181:559, 1995; J. Exp. Med. 181:559, 1995).

이처럼 인체는 외부 항원과 같은 외래 물질의 침입 혹은 감염에 대하여 선천적 면역 및 획득 면역이 적절하게 대항하여 항상성을 유지하도록 설계되어 있다.

와송(Orostachys japonicus A. Berger)은 돌나물과(Crassulaceae)의 다년생 초본식물로서 한국, 중국, 일본 등지에 분포하며, 우리나라에서는 바위솔(Orostachys japonicus A. Berger), 둥근바위솔(Orostachys malacophyllus Fisch), 난쟁이바위솔(Orostachys sikokianus Ohwi), 연화바위솔(Orostachys iwarenge (Makino) H. Hara) 4종이 자생하고 있다(이창복, 『대한식물도감』, 항문사, 1993).

와송은 일반성분으로 수분(48.5%)이 가장 많고, 그 외 탄수화물(38.2%), 조유(15.8%), 조단백(13.2%), 환원당(12.%) 등을 포함되어 있고, 알루미늄(Al), 칼슘(Ca), 구리(Cu), 철(Fe), 칼륨(K), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 나트륨(Na), 인(P), 아연(Zn) 등의 무기질을 포함하고 있으며, 그 중 칼슘과 칼륨의 함량이 높다. 와송은 오래전부터 암치료제로 사용되어왔고 약리적으로는 혈관수축작용과 호흡 흥분 작용, 장의 긴장도 증강작용 등이 알려져 있다(M. H. Kim, Master's thesis, Department of Chemistry and Engineering, Konkuk University, 2010). 한방에서는 청열, 해독, 이습, 지혈, 소종 등을 치료하는데 사용되고 있으며, 오래전부터 민간요법으로서 암의 치료제로 이용되었다(이남선, 석사학위논문, 중부대학교, 한약자원학과, 2015). 또한 와송은 항산화 효과[12], 항균 효과[13], 세포자살 유도 효과[14], 항암 효과[16] 등의 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되었다(J Kor Soc Food Sci Nutr 37(5):605-611, 2008; J Kor Soc Food Sci Nutr 38(1):14-18, 2009; Kor J Medicinal Corp Sci 12(4):315-320, 2004; J Kor Soc Food Sci Nutr 43(1):67-73, 2014).

본 발명은 와송의 면역 증강 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 와송 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 와송의 물 추출물, 30% 에탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물, 70% 에탄올 추출물 및 100% 에탄올 추출물을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때, 물 추출물만이 NO(Nitric oxide) 생성을 촉진함을 확인하였고, 또 추출온도를 실온, 30℃, 60℃ 및 90℃로 하고 추출 시간을 24시간으로 하여 얻은 물 추출물을 상기보다 낮은 농도인 12.5, 25 및 50 ㎍/mL로 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 실온 추출물만이 NO 생성 억제 활성을 보임을 확인하였으며, 나아가 추출온도를 실온으로 하고, 추출시간을 6시간, 12시간, 18시간 및 24시간로 하여 얻은 물 추출물을 또한 상기보다 낮은 농도인 12.5, 25 및 50 ㎍/mL로 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때는 18시간 및 24시간 물 추출물만이 효과를 보임을 확인하였다. 그리고 상기 24시간 물 추출물은 RAW 264.7 세포에서 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등의 사이토카인 생성을 농도 의존적으로 촉진하고 또 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 촉진함을 확인하였다.

본 발명의 면역 증강용 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 와송 물 추출물을 유효성분으로 포함하되, 그 와송 물 추출물은 와송을 실온에서 18시간 이상 물로 침출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "추출물"은 추출 직후의 조추출액, 이를 여과하여 추출 잔사를 추출 여액, 조추출액이나 추출 여액을 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "실온"은 추출시의 추출 장소의 온도로 인위적으로 열을 가하거나 열을 빼앗지 않은 상태의 온도, 즉 추출 장소의 자연 상태의 온도를 말한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 면역 증강용 조성물에서 그 유효성분은 면역 증강 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 의도한 면역 증강 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 면역 증강 효과의 상승·보강을 위하여 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성이 확인된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임), 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 "건강기능식품에관한법률"임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물 등이 포함된다. 예컨대 그러한 화합물 또는 추출물로서 한국 건강기능식품공전 또는 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 개별 인정 원료로서, L-글루타민, 게르마늄 효모, 금사상황버섯, 당귀혼합추출물, 동충하초 주정추출물, 스피루리나, 클로렐라, 청국장균 배양 정제물(폴리감마글루탐산칼륨), 표고버섯균사체, 효모베타글루칸 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격")에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 와송 물 추출물을 이용한 면역 증강용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 면역 증강용 조성물은 식품 또는 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 각 추출용매별 추출물(추출온도 실온, 추출시간 24시간)의 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과이다.
도 2는 물 추출물(추출 시간 24시간)의 추출 온도별 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과이다.
도 3은 물 추출물(추출온도 실온)의 추출 시간별 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과이다.
도 4 내지 도 6은 실온 24시간 물 추출물이 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등의 사이토카인 생성 촉진 활성에 대한 결과이다.
도 7은 실온 24시간 물 추출물이 iNOS 및 COX-2 발현에 미치는 영향에 대한 측정 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 와송 물 추출물의 면역 증강 활성

1. 시료 및 실험방법

1-1. 시료 제작

와송(추출부위, 전초; 충청북도 진천군)은 2015년 7월에 구입하여 사용하였고, 확보한 시료는 증류수로 2~3회 수세한 뒤 물기를 제거한 뒤 열풍건조 한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하여 추출용 시료로 사용하였다. 와송 용매 조건별 추출물의 제조는 물 100%와 주정 에탄올(EtOH) 30%, 50%, 70% 그리고 100%를 사용하여 추출하였다. 즉 건조된 분말 시료에 용매 조건별로 1회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전히 건조시켜 와송 용매 조건별 추출물을 제작한 후 사용하였다.

1-2. 세포 배양

Murine macrophage cell line RAW 264.7 세포를 KCLB(Korean Cell Line Bank)로부터 분양받아 100 units/mL penicilin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한번 씩 계대배양을 시행하였다. Lipopolysaccharide(LPS, E, coli serotype 0111:B4)는 sigma로부터 구입하여 사용하였다.

1-3. Nitric oxide (NO) assay

RAW 264.7 세포(1.5 × 10⁵ cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 접종하고, 시험물질과 LPS(1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO양의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약[1% (w/v) sulfani-lamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite(NaNO₂)를 serial dilution(연속희석)하여 얻었다.

1-4. 면역 조절 바이오 마커인 사이토카인 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 10⁵ cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이 후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일한 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 사이토카인 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. 사이토카인 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) kit(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다.

1-5. Immuno blot analysis

RAW 264.7 세포(1.0 × 10⁶ cells/mL)를 18시간 전배양을 하고, LPS(1 ㎍/mL)로 자극을 주고 시료를 동시에 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 2~3회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 300 ㎕의 lysis buffer를 첨가, 30분~1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분리(15,000 rpm, 15 min)하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein assay kit를 사용하여 정량 하였다. 20~30 ㎍의 lysate를 8% mini gell SDS-PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane(BIORAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 memvrane의 blocking은 5% skin milk가 함유된 TTBS(TBS + 0.1% Tween 20)용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS와 COX-2의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 anti-mouse iNOS(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)와 anti-goat COX-2(BD biosciences, San Jose, CA, USA)를 TTBS용액에서 희석(1:1000)하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, TTBS로 4회 세정하여 ECL 기질(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

1-6. 통계분석

모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치 표준편차(SD)를 구하여 신뢰수준 95%(p<0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

2. 실험 결과

2-1. NO 생성 촉진 활성

각 추출용매별 추출물(추출온도 실온, 추출시간 24시간)의 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과를 도 1에 나타내었고, 물 추출물(추출 시간 24시간)의 추출 온도별 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과를 도 2에 나타내었으며, 물 추출물(추출온도 실온 )의 추출 시간별 NO 생성 촉진 활성에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 1을 참조하여 보면 30% 에탄올 등의 추출용매의 추출물은 거의 NO 생성 촉진 활성이 없지만 물 추출물은 LPS보다도 높은 NO 생성 촉진 활성을 나타내었다.

또 도 2를 참조하여 보면, 실온 물 추출물이 높은 NO 생성 촉진 활성을 보이고 있으며, LPS와 동시처리하였을 때는 특별히 NO 생성을 더 촉진하지 않았다.

또 도 3을 참조하여 보면, 물 추출물은 추출 시간이 18시간 이상 되었을 때부터 뚜렷하게 NO 생성 촉진 활성을 보였고, 도 2의 결과와 마찬가지로 LPS와 동시처리하였을 때는 특별히 NO 생성을 더 촉진하지는 않았다.

2-2. 사이토카인 생성 촉진 활성

실온 24시간 물 추출물이 TNF-α, IL-6 및 IL-10 등의 사이토카인 생성 촉진 활성에 대한 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

도 4 내지 도 6을 참조하여 보면, 실온 24시간 물 추출물이 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성 촉진 활성을 보이고, LPS와 동시처리하였을 때는 특별히 더 TNF-α, IL-6 및 IL-10의 생성을 촉진하지 않았다.

2-3. iNOS 및 COX-2 생성 촉진 활성

실온 24시간 물 추출물이 iNOS 및 COX-2 발현에 미치는 영향에 대한 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 실온 24시간 물 추출물은 COX-2의 생성에는 영향을 미치지 않았지만 iNOS의 생성을 농도 의존적으로 촉진하였다.

Claims

와송 물 추출물을 유효성분으로 포함하되, 그 와송 물 추출물은 와송을 실온에서 18시간 이상 물로 침출하여 얻어진 추출물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.