KR20180028503A - 장벽 기능 측정 - Google Patents

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미메타스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 상피 세포 장벽 기능(epithelial cell barrier function)에서 화합물의 조절 효과(modulating effects)를 측정하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 시험 화합물을 개별적으로 또는 조합하여 고효율 스크리닝(high throughput screening)을 가능하게 한다. 상피 장벽 기능을 개선시키는 화합물 또는 상피 장벽 기능에 부정적 영향을 미치는 화합물은 본 명세서에 기재된 방법으로 분석될 수 있다.

Description

장벽 기능 측정{BARRIER FUNCTION MEASUREMENTS}
선행 기술
상피 조직은 4가지 기본 조직 유형(상피 조직, 결합 조직, 근육 조직 및 신경 조직) 중 하나를 포함한다. 상피 세포는 식물뿐만 아니라 동물(척추동물과 무척추동물 모두)에서 발견되며 유기체의 생리학에서 중요한 역할을 한다.
상피 세포는 신체(body)의 공극(cavities)과 내강(lumen)의 바깥 및 안쪽 모두를 막처럼 싼다(line). 내피(endothelium)(혈관, 심장 및 림프관의 내막) 및 중막(mesothelium)(심낭, 흉막 및 복막의 벽을 형성)은 특화된 상피 형태이다.
상피 세포는 내부 신체(internal body)에 대한 방어 역할을 하는 상피 장벽(epithelial barriers)을 형성한다. 그들이 형성하는 세포 및 장벽은 신체의 내부 및 외부 공극을 격리하고 신체가 선택적으로 특정 물질을 흡수하고 배설할 수 있는 수단을 제공한다. 상피 장벽 및 상피 세포는 화학적 흡수 및 영양소 흡수, 세포간 수송(transcellular transport), 감각(sensation) 감지, 배설물 배출(waste excretion) 및 미생물 감염 방지와 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요하다. 모든 상피 세포는 대개 세포외 섬유질 기저막(extra cellular fibrous basement membrane)에 의해 하부 조직으로부터 분리된다.
예를 들어, 상피 세포는 폐포(alveoli) 또는 공기 주머니(air sacs)를 포함하여 폐의 구조를 형성하고, 위장(stomach), 소장(small intestine), 신장(kidney) 및 췌장(pancreas)과 같은 대부분의 장기를 막처럼 싼다. 그들은 또한 식도(esophagus)를 싸고 담관(bile duct) 및 침샘(salivary glands)과 같은 도관 및 분비샘에서 발견된다. 그들은 미뢰(taste buds)를 형성하고, 코, 귀 및 눈 및 피부를 막처럼 싼다.
내피는 혈관과 림프관의 내부 표면을 싸는 내피세포의 얇은 층으로, 내강의 순환 혈액(circulating blood) 또는 림프(lymph), 및 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)과 같은 혈관 벽의 나머지 부분 간의 경계면을 형성한다.
중피 세포(mesothelial cell)는 신체 장액(serous)의 공극 및 내부 기관을 싸는 전문화된 포장-성 세포(specialized pavement-like cell)의 단층을 형성한다. 중막이라고 지칭되는 상기 층(layer)의 일차 기능은 미끌거리고, 비-접착성이며 보호하기 위한 표면을 제공하는 것이다. 그러나, 중피 세포는 장액 공극을 통과하는 유체 및 세포의 이동, 항원 제시(antigen presentation), 염증 및 조직 복구(tissue repair), 응고(coagulation) 및 섬유소 분해(fibrinolysis) 및 종양 세포 부착을 포함하는 다른 중추적 역할을 한다.
상피 세포는 다수의 구별 가능한 특징에 의해 특정된다. 상피 세포는 상피(epithelia)라고 불리는 조직의 시트(sheet)에 함께 결합된다. 이들 시트는 치밀 접합(tight junction), 부착(adherens), 데스모솜(desmosome) 및 간극 연접(gap junction)을 포함하는 몇몇 형태의 상호작용을 통해 서로 고정된다. 치밀 접합은 두 영역 사이의 극성과 함께 상피세포의 꼭대기(상부) 및 기저(하부) 영역 사이의 도형으로서 작용한다. 상피(epithelium)는 기저 라미나(lamina)로 불리는 기저막에 의해 기저 측면에서 지지된다.
상기 언급한 바와 같이, 하나의 구분가능한 특징은 꼭대기 및 기저 부분(portion) 내로 극성화된 상피 세포의 플라즈마 막을 분리하는 치밀 접합의 형성이다. 세포의 부분이 시험관 내에서, 예를 들면 조직 배양 플레이트에서, 세포 단층 성장을 지향할 때, 상기 세포의 꼭대기 부분 또는 윗부분이 노출된다. 신체 내에서 상피 세포 시트의 맥락에서, 상기 꼭대기 표면은 상피에 의해 싸인 내강에 노출될 것이다. 상기 세포의 기저 표면은 가장 아래(bottom), 또는 기초(basal) 부분 및 측면(side), 또는 옆(lateral) 부분으로 구성된다. 조직 배양 플레이트 상의 세포 성장의 면에서, 세포의 기저막은 조직 배양 플레이트와 접촉하는 세포의 부분이고, 치밀 접합 아래에 위치한 세포의 옆 부분이다. 신체 내에서 상피 세포 시트의 맥락에서, 세포의 기저 표면은 상피에 의해 싸인 신체의 내부 부분에 노출될 것이다. 다양한 단백질은 꼭대기막 또는 기저막에 특이적으로 위치한다.
상피 세포(내피 세포 및 중피 세포 포함)가 생물학적 과정의 다양한 연구에서 널리 사용된다는 것은 그 중요성을 고려할때 놀랍지 않다. 상기 세포는 분자세포 생물학, (미생물의) 발병기전, 약리학, 및 독성학과 같은 분야의 연구에 매우 적합하다.
많은 모델 시스템이 상피 세포 및 장벽 기능을 연구하기 위해 발달하였다. 상피 세포의 연구는 일반적으로 상피 세포의 꼭대기 또는 기저 표면과 접촉하는 배양 배지를 이용 또는 변형하는 능력이 요구된다. 표준화된 조직 배양 장치(device)가 이와 같은 조작(manipulation)을 허용하지 않은 이후로, 전문화된 세포 배양 장치가 발달하였다. 대부분의 시험관 내 모델 시스템에서 사용되는 일차 장치는 트랜스웰®(Corning, Inc., Lowell, Mass)과 같은 투과성의 조직 배양 플레이트 인서트(insert)이다. 이들 장치는 조직 배양 플레이트의 웰에 삽입될 수 있는 인공적인 투과성의 성장 지지체(permeable growth support)를 제공한다. 투과성의 성장 지지체의 표면을 통과하는 극성화된 세포 단층의 배양에 의해, 이는 조직 배양 웰의 꼭대기 및 기저 챔버(chamber)를 분리하는 선택적인 장벽으로서 기능할 것이다.
이와 같은 모델 시스템은 신약의 개발, 다양한 질병의 이해 및 제제의 독작용(toxic effect)의 이해에서 중요한 역할을 한다.
예를 들면, 약물 개발 과정동안, 잠재적으로 치료 제제 또는 약물 후보물질은 승인 및 후속적인 상업화 이전에 그들이 원하는 용도를 위한 안전성 및 효과 모두를 반드시 입증해야 한다. 다양한 약물이 상피 장벽 기능을 음성적으로(negatively) 조절하는 것이 알려져 있다(예를 들어, Youmba et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012;54:463-70 참조). 반면에, 상피 세포의 장벽 기능을 조절하는, 예를 들면 장벽을 일시적으로 여는 화합물이 체순환(systemic circulation) 및 조직으로의 약물 전달을 개선하는데 유용할 것이다(Deli, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 1788 (4) 2009, 892-910). 유사하게, 혈액-뇌 장벽을 일시적으로 여는 것은 약물을 뇌로 전달하는데 유용할 것이다. 게다가, 이와 같은 시스템은 식품, 화장품, 및 음료 및 미생물에서 발견되는 것들을 포함하는 모든 종류의 화합물의 장벽 기능상의 효과를 이해하는데 중요하다. 예를 들면, 클로스트리듐 다이피셀(clostridium difficile) 독소는 치밀 접합 단백질의 막 미세영역(microdomain) 위치를 변화시킴으로써 상피 장벽 기능을 방해하나(Nusrat et al. Infect Immun. 2001 Mar;69(3):1329-36), 다른 성분들은 상피 장벽 기능을 증가시키거나 보조할 것이다.
현재의 상피 세포 모델 시스템이 약물 발견에 유용하게 사용되는 동안, 이들 시스템에서 세포를 이용한 작업은 상기 작업에 필요한 매우 균일한 세포 단층 때문에 어렵다는 것이 드러났다. 이와 같은 실험은 정확한 세포 타입의 선택, 다수의 균일한 세포 단층 생성, 및 세포 단층의 무결성(integrity)이 실험을 수행하기 충분하다는 보장이 요구된다. 게다가, 이들 모두는 실험적으로 허용가능한 결과의 반복적인 생산을 허용하기 위해 잘 수립되어야 한다. 이들 어려움에 의해 이상적인 상피 세포 모델 시스템의 발굴에는 수개월 또는 수년의 작업이 요구된다.
따라서, 다수의 다른 화합물에 대한 상피 장벽 기능에서의 신속한 데이터를 제공할 수 있는 고효율 스크리닝 분석법(high throughput screening assay)의 개발에 큰 관심이 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 상피 장벽 기능에서 화합물의 효과를 더 잘 이해할 수 있는 결과를 보이는 개선된 분석법을 제공하는 것이다.
정의
본 발명의 방법, 조성물, 용도 및 다른 측면에 관한 다양한 용어가 명세서 및 청구 범위를 통해 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 통상적인 의미를 부여 받는다. 특별히 정의된 다른 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다. 본 명세서에 기술 된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 실시하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법은 본 명세서에 기재되어 있다.
"A", "an" 및 "the": 이러한 단수 형태 용어는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "a cell(세포)"에 대한 언급은 2개 이상의 세포들의 조합 등을 포함한다.
"약(About)" 및 "대략(approximately)": 이러한 용어는, 양(amount), 일시적 기간(temporal duration) 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 특정 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게 ±5%, 더욱 바람직하게 ±1%, 그리고 보다 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 변화는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 적절하다.
"포함(Comprising)": 이 용어는 포괄적이고(inclusive) 개방적인(open ended) 것으로 해석되며, 독점적인(exclusive) 것으로 해석되지 않는다. 특히, 용어 및 그 변형은 명시된 특징, 단계 또는 구성 요소가 포함됨을 의미한다. 이러한 용어는 다른 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.
"예시적인(Exemplary)": 이 용어는 "예(example), 실례(instance) 또는 예증(illustration)의 역할을 함"을 의미하며 본 명세서에 설명된 다른 구성(configuration)을 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.
"미세유체 시스템(Microfluidic system)": 이 용어는 서브 피콜리터(sub-picoliter)에서 서브 밀리리터(sub- milliliter) 또는 밀리리터 범위와 같은 소량의 액체를 수용(containing), 유동(flowing), 처리(processing) 또는 그 외의 조작(manipulating)을 하도록 구성된, 장치 또는 장치의 유체 구성 요소(fluidic component)를 지칭한다. 일 실시양태에서, 미세유체 채널과 같은 미세유체 형상(microfluidic feature)의 최대 단면 치수(cross- sectional dimension)는 1 mm 미만, 500 미크론(micron) 미만, 100 미크론 미만, 50 미크론 미만, 또는 25 미크론 미만일 수 있다.
"발광 프로브(Luminescent probe)": 이 용어는 빛을 방출하는 모든 프로브 또는 분자를 의미한다. 발광의 유형에는 생물 발광(bioluminescence), 화학 발광(chemiluminescence), 전기 화학 발광(electrochemiluminescence), 전압 발광(electroluminescence) 및 광 발광(photoluminescence)이 포함된다. 프로브는 자체적으로 발광할 수 있고, 발광은 발광성 프로브를 포함하는 화학적 또는 효소적 반응의 결과일 수 있거나 또는 다른 파장에서 프로브에 의한 광 방출이 뒤따르는 광에 의한 프로브의 여기(excitation)의 결과 일 수 있다. 후자는 또한 형광(fluorescence)으로 알려져 있다. 형광은 일종의 발광이며 광자의 흡수 결과이므로 광 발광의 한 유형이다. 본 발명의 범주 내에서, 또한 "발광성 프로브"라는 용어에 포함되는 것은 비색계 프로브(colorimetric probes)이다.
프로브(Probe): 이 용어는, 예를 들어 검출 가능한 분자(molecule), 마커(marker) 또는 물질(substance)과 같이 존재 또는 부재가 (질적 및/또는 양적으로) 검출될 수 있는 시스템, 조성물 또는 분자를 의미한다. 본 발명의 문맥 내에서, 프로브는 상피 장벽 기능을 측정하는데 사용된다. 프로브를 제공하고 꼭대기(apical) 측면, 기저(basolateral) 측면 또는 양측 모두에서 프로브에 의해 생성된 신호를 측정함으로써, 상피 장벽 기능의 척도(measure)가 얻어진다. 예를 들어, 세포층의 한쪽 측면에 프로브가 제공되었을 때, 다른 측면에서 프로브의 출현(appearance)은 프로브가 세포층을 통과했음을 나타낸다. 증가된 출현율은 세포층에 증가된 "누출(leakage)"을 나타낸다. 다시 말해서, 본 발명의 문맥 내에서 프로브는, 예를 들어 신호를 제공하거나 신호를 제공하도록 유도될 수 있는, 검출 가능한 것을 말한다. 본 발명의 범주 내에서, 당업자라면, 예를 들어, 상피층 세포의 꼭대기, 기저 측면에서, 또는 이 세포들에서, 이의 검출을 허용하는 물질, 분자 또는 시스템의 임의의 어떠한 유형이 될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 프로브의 분포, 또는 검출 가능한 프로브의 재분배 속도의 모니터링을 기초로, 상피 장벽 기능이 결정될 수 있다. 예를 들어, 선행기술로부터 볼 수 있는 바와 같이, 프로브는 (검출 가능한) 마커, 물질, 마커 물질, 시약, 라벨 또는 분자로 지칭될 수도 있다. 쉽게 검출 및 측정될 수 있는 프로브의 예는, 발광 물질 및 화합물, 염료, 형광 물질(fluorophores), 방사성 화합물, 센서 분자(sensor molecules) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 그러나 그 존재가 꼭대기 및/또는 기저 측면 (또는 세포 내)에서 검출될 수 있는 다른 분자도 또한 예상된다. 당업자는 프로브에 의해 제공된 신호의 검출이 사용된 프로브 또는 마커 물질(marker substance)의 유형에 의존할 것이라는 것을 이해한다. 예를 들어, 프로브가 형광 프로브인 경우, 형광이 측정될 수 있다. 예를 들어, 프로브가 방사성 프로브인 경우, 방사능이 측정될 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소 물질인 경우, 프로브는 샘플에 대해 효소 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 프로브에 의해 제공된 신호가 사용된 프로브의 유형에 의존할 것이라는 것을 이해한다. 당업자는 본 명세서의 개시가 본 발명의 문맥 내에서 적합하게 사용될 수 있는 한 사용된 프로브의 유형에 특히 제한되지 않는다는 것을 이해한다.
바람직하게는, 프로브는 광학 프로브(optical probe), 즉 프로브에 의해 생성되거나 제공되는 신호는 광학적 수단(예를 들어, 흡수, 형광 또는 화학 발광 측정)을 사용하여 검출될 수 있다. 광학 모니터링을 허용하는 것으로 잘 알려진 프로브에는 발광 프로브(형광 프로브 포함), 염료(dyes) 및 비색 프로브(colorimetric probes)가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 프로브는 또한, 세포의 한쪽 측면(꼭대기 측면 또는 기저 측면)에 제공된 센서 분자 또는 조성물 및 세포의 다른 측면에 제공된 추가적인 분자 또는 조성물로 구성될 수 있으며, 상기 센서 분자 및 조성물은 그것이 추가적인 분자 또는 조성물과 접촉하게 될 때, 바람직하게는 광학적으로, 검출 가능하다. 검출된 신호는 추가적인 분자 또는 조성물이 세포를 통과한 것을 보여주는 것으로, 상피 장벽 기능을 나타내는 것이다.
상피 장벽 기능(epithelial barrier function)에 대한 시험 화합물의 조절 효과(modulating effect)를 결정하기 위한 시험관 내(in-vitro) 방법이 개시되어 있다. 상피 장벽은 정지상태의 구조(static structures)가 아니다. 다양한 상이한 자극에 반응하여 더 누출이 되거나 누출이 줄어들 수 있다. 질병의 과정과 제제(agents)는 장벽 내벽(barrier linings)을 더 누출시킬 수 있으며, 이러한 누출 부위는 종종, 예를 들어 치밀 접합(tight junctions)이다(Mullin et al. (2005) Drug Discov. Today, 10:395-408).
침투성(permeability)은 하나의 자극으로 증가 및/또는 다른 자극으로 감소하는 역동적인 현상이기 때문에, 임의의 주어진 상피 조직에서 상피 장벽의 기저 상태(basal state)는 일반적으로 더 단단해지도록 조절되거나 더 누출되도록 조절될 수 있다.
일반적으로 증가된 누출은 해롭지만, 감소된 누출은 생리학적 또는 면역학적으로 유기체의 이익에 작용한다.
본 발명의 방법은 이제 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 부정적 또는 긍정적 효과를 결정, 측정, 분석, 예측 또는 확립하는 것을 가능하게 한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과에 대한 상세한 통찰력(detailed insight)을 얻는 것을 가능하게 한다. 상기 방법은 상피 장벽 기능 효과에 있어서 상이한 화합물, 화합물 농도 또는 상이한 조건을 비교하는 것을 가능하게 한다. 특히, 상기 방법은 시간의 함수로서 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과를 연구하거나 확립하는 것을 허용한다. 본 발명의 방법은 세포층(또는 단층)에서 발생하는 다양한 누출 현상을 구분하는 것을 가능하게 한다: 예를 들어 치밀 접합의 파손, 세포층/막 내 핀홀(pin-holes)의 출현, 불완전한 단층 부착으로 인한 측면의 누출; 이들 모두는 트랜스웰 시스템(Transwell systems)과 같은 당업계의 방법으로는 불가능하다. 중요하게는, 본 발명의 방법은 상피 장벽 기능에 대한 조절 효과의 실시간 모니터링(real-time monitoring)을 가능하게 한다; 실시간 모니터링을 통해 누출 시간을 결정할 수 있다; 이것은 형광 강도보다 세포층의 상피 장벽 기능에 미치는 화합물의 효과에 대한 더 나은 값인데, 왜냐하면 전자(형광강도)는 액체 레벨로 인해 가해지는 압력과 같은 양상을 포함하기 때문이다.
트랜스웰 시스템을 사용하면 시간이 지남에 따라 웰로부터 표본(aliquot)을 분취해야하고 트랜스웰 시스템과 별도로 측정되어야 하는 반면, 본 발명의 방법은 실험이 실시간 이미징(real-time imaging)이 뒤따를 수 있기 때문에 사용하기가 더 쉽다. 더욱이, 본 발명의 방법은 미세유체 채널에서 작은 볼륨을 다루기 때문에, 심지어 형광의 미세한 변화가 관찰될 수 있다; 이는 많은 양의 유체에서 적은 양의 형광이 사라지는 트렌스웰 시스템과는 대조적이다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 방법으로 수득된 결과는 화합물의 독성 효과를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 방법으로 수득된 결과는 일시적으로 상피 장벽을 개방(open up)(즉, 장벽 기능을 일시적으로 감소)시키는 시험 화합물의 유용성(usefulness)을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 방법으로 수득 된 결과는 어떤 화합물이 그의 독성 효과를 발휘할 수 있는지 메커니즘(어떻게 및 얼마나 빨리)을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 방법으로 수득된 결과는 시험 화합물의 장벽 기능 개선 효과를 나타낸다.
이 방법은 신뢰성 있고 간단하며 재현성이 높기 때문에, 스크리닝 목적에 특히 적합하다. 또한, 본 발명의 방법은 수득된 결과가 장벽 기능에 대한 화합물의 효과를 대표하는지 또는 실험상의 결함으로 인해 결과가 거짓으로 거절되어야 하는지를 신속하게 식별할 수 있게 한다. 본 발명의 방법은 실시간 측정을 가능하게 한다.
이 방법은 미세유체 시스템에서 배양된 세포의 상피층의 한쪽 측면(꼭대기 측면 또는 기저 측면)으로부터 상피층의 다른 측면으로 프로브(또는, 본 명세서에 기술된 바와 같이 프로브가 센서 및 추가의 분자 또는 조성물을 포함하는 경우, 추가의 분자 또는 조성물의 이동)의 이동(수동적 또는 능동적; 예를 들어 실제적으로 과압은 다른 측면에 대한 상피 장벽을 통한 화합물의 유입을 증가시키기 위해 적용될 수 있으며, 겔은 겔을 통한 간질성 흐름(interstitial flow)을 허용한다.)을 측정하는 것에 의존한다. 상기 측정은 시험 화합물이 없거나 존재할 때 시간이 지남에 따라 수행된다. 수송 속도 또는 시간에 따른 수송량, 또는 특히 수송의 특정 수준(상대적 또는 절대적)이 완성되는 동안의 시간은 본 발명에서 사용된 상피 세포에 대한 시험 화합물의 효과에 새로운 통찰력을 제공한다.
하기 단계를 포함하는, 상피 장벽 기능(epithelial barrier function)에 대한 시험 화합물의 조절 효과(modulating effect)를 결정하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법:
a) 다중 중공 미세유체 채널들(multiple hollow microfluidic channels)을 포함하는 미세유체 시스템(microfluidic system)을 제공하는 단계로, 여기서 상기 채널은 적어도 부분적으로 겔(gel)로 채워짐;
b) 상피 세포를 미세유체 채널(microfluidic channel)에 도입하고 상피 세포를 겔과 접촉하게 하는 단계;
c) 미세유체 채널에 도입된 상피 세포를 배양하는 단계로, 이로써 상기 세포가 꼭대기 측면(apical side) 및 기저 측면(basolateral side)을 갖는 세포층을 겔 상에 형성하도록 허용하고, 바람직하게는 미세유체 채널에서 세포가 꼭대기 측면 및 기저 측면을 갖는 관형 구조(tubular structure)를 형성하게 하는 단계;
d) 미세유체 채널 상의 상피 세포에 프로브 및 시험 화합물을 제공하는 단계로, 여기서 상기 프로브 및 시험 화합물은 독립적으로 꼭대기 측면, 기저 측면, 또는 꼭대기 및 기저 측면 양쪽에 제공되는 단계;
e) 미세유체 채널 또는 겔에서, 또는 미세유체 채널 및 겔 모두에서 프로브에 의해 제공된 신호를 다양한 시점(time point)에서 결정하는 단계.
특히 다양한 시점에 걸쳐, 단계 e)에서 결정된 신호의 절대값(absolute values), 값의 변화 또는 값의 비율은 놀랍게도, 상피 세포의 장벽 기능에 있어서 화합물의 효과에 대해 재현 가능성이 높은 징후임이 밝혀졌다. 예를 들어, 상기 값은 상피 세포 또는 상피 장벽에 있어서 화합물의 독성 효과를 나타내는 것으로 사룔될 수 있다.
첫 번째 단계에서, 다수의 중공 미세유체 채널을 포함하는 미세유체 시스템이 제공된다. 분명히, 미세유체 시스템은 상피 세포 재배에 적합해야 한다. 또한, 미세유체 시스템은 일단 미세유체 시스템에서 배양된 상피 세포의 꼭대기 또는 기저 측면에 대한 접근을 제공해야 하지만, 바람직한 실시양태에서는, 꼭대기 및 기저 측면 모두에 대한 접근을 제공해야 한다.
세포 배양에 적합한 미세유체 시스템은 당업자에게 공지되어 있으며, 장치 또는 장치의 유체 구성 요소를 지칭하며, 이는 서브 피콜리터(sub-picoliter)에서 서브 밀리리(sub-milliliter)터 또는 밀리리터(milliliter) 범위와 같은, 소량의 액체를 수용(containing), 유동(flowing), 처리(processing) 또는 그 외의 조작을 하도록 구성된다.
본 발명의 방법에 사용되는 미세유체 시스템은 시험관 내 세포 배양 지지체(cell culture support)에 적합하며, 예를 들어 수동적인 수평 조절(passive leveling)과 같은 수동적 수단에 의해 또는 예를 들어 주사기 펌프 등과 같은 능동 펌프(active pumps)를 사용함으로써 유동(flow)을 제공하는 미세유체 채널 시스템에 의해, 살아있는 세포에 능동 지지체를 제공할 수 있다. 유체가 예를 들어 압력 펌프(pressure pump), 가압 탱크(pressurized tank), 진공 펌프(vacuum pump) 또는 이와 유사한 것과 같은 외부의 포지티브 또는 네거티브 압력 소스(external positive or negative pressure source)를 사용하여 일부 또는 모든 채널로 전달되거나 일부 또는 모든 채널로부터 추출되는 유동은, 살아있는 세포에 대한 지지체 시스템(support system)과 관련된다. 능동 지지체(Active support)는 일부 또는 모든 채널이 능동적인 미세유체 유동을 받는 살아있는 세포를 위한 지지체 시스템과 관련이 있다. 능동적 미세유체 시스템은 수동적 미세유체 유동을 사용하는 시스템과 대조될 수 있는데, 여기서 유체 순환은 중력, 모세관 작용, 표면 장력 또는 이와 유사한 작용 등과 같은 자연 발생 메커니즘에 의해 유동을 유도하도록 추진된다. 본 발명의 방법에서 미세유체 시스템은 유동을 제공하거나 유동 없이 작동할 수 있다.
사용된 미세유체 시스템은 미세유체 채널에서 배양된 세포에 유동을 제공할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 미세유체 채널 시스템을 통해 존재하여 세포에 적합한 유체 환경을 제공한다.
미세유체 시스템은 실질적으로 균일한 캘리버(substantially even caliber)의 채널을 포함할 수 있거나, 유체 유동 동력학(fluid flow dynamics)에 의해 요구되는 수축(constrictions) 및 팽창(dilatations)을 포함하는 다양한 캘리버(caliber)을 갖는 채널을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 미세유체 시스템은 특정 미세유체 시스템에 특별히 제한되지 않는다. 예시적인 미세유체 장치는, S.J. Trietsch, G.D. Israels, J. Joore, T. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab Chip 2013, vol. 13, no. 18, pp. 3548-3554, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M. T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab Chip, Vol. 15, No. 11, pp. 2419-2428, WO2012120102, WO2014038943, Mu et al, Lab on a Chip, 2013, 13, 1612-1618, 또는 Jang et al, integr biol, 2013, 5, 1119에 개시되어 있다. 그러나, 마지막의 두 개는 고효율 스크리닝(high throughput screening)을 허용하지 않으며 덜 바람직하다.
예를 들면, WO2012120102에 기재된 장치는, (a) 볼륨 내부에 형성된 적어도 2개의 위상가이드(phaseguides)에 의해 적어도 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 서브-볼륨(sub-volumes)로 내부 분할되고 (b) 볼륨에서 메니스커스(meniscus) 또는 벌크 액체(bulk liquid)의 이동을 기준으로 판단할 때, 상대적으로 상류(upstream) 또는 상대적으로 하류(downstream)인 부분을 포함하는 텅빈 볼륨(hollow volume)을 포함한다. 상기 장치는 상기 볼륨의 상류 외부 및 상기 각각의 서브-볼륨 사이의 유체 연통(fluid communication)을 허용하도록 연결된, 적어도 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 유체 도관을 포함하며; 상기 볼륨의 하류 외부 및 상기 각각의 서브-볼륨 사이의 유체 연통을 허용하도록 연결된 적어도 하나의 추가적인 도관을 포함한다. 상기 첫 번째 서브-볼륨은 겔 또는 겔형 물질 내에서 또는 이에 의해 지지된 세포를 포함할 수 있고; 첫 번째 및 두 번째 서브-볼륨 간 물질의 운반을 허용하도록 그리고 적어도 하나의 겔 또는 겔형 물질을 함유하도록 두 번째 서브-볼륨은 첫 번째 서브-볼륨과 연통한다. 본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서 세 번째 서브-볼륨은 적어도 첫 번째 서브-볼륨과 연통하여 첫 번째 및 세 번째 서브-볼륨 간 물질의 이송을 허용하고, 여기서 세 번째 서브-볼륨은 관류액(perfusate)을 포함한다.
바람직한 미세유체 플레이트 또는 시스템은 미세유체 네트워크에 대한 접근을 제공하는, 다수의 미세유체 네트워크들 및 주입구들(inlets)을 포함한다. 각각의 미세유체 네트워크는 모세관 압력 장벽(capillary pressure barrier)을 포함한다. 각각의 주입구는 바닥면을 가지는 입구 챔버(chamber)에 의해 형성된다.
실제로, 유체를 분배하기 위한 말단(end)을 포함하는 분배부(dispensing part)를 가지는 유체 분배기(fluid dispenser)는 유체 및/또는 겔 및/또는 겔 전구체를 미세유체 네트워크에 삽입하기 위해 사용되며, 그에 의해 모세관 압력 장벽의 수단에 의해 액체/겔/겔 전구체 중 적어도 하나를 정지(stopping) 또는 패턴화(patterning)한다. 미세유체 플레이트는 유체 또는 그 내용물을 연구하거나, 유체 또는 그 내용물 간의 상호 작용을 평가하는데 사용될 수 있다.
모세관 압력 장벽은 예를 들어 미세유체 네트워크의 미세유체 챔버를 제1 챔버부 및 제2 챔버부로 분할할 수 있다. 세포와 같이 수명에 기초한 입자를 가지는 액체, 겔 또는 겔 전구체는 주입구 내의 유체 분배기의 분배부에 의해 배출될 수 있다. 상기 액체 또는 겔(전구체)은 주입구로부터 미세유체 챔버의 제1 챔버부로 유동되고, 모세관 압력 장벽의 존재로 인해 제어되거나 패턴화되는 이의 전진(advancement)은 정지된다. 액체 또는 겔(전구체)은 중력 또는 다른 작동 힘에 의하여, 모세관 힘(capillary forces)에 의한 미세유체 네트워크를 통해 이송될 수 있다.
이러한 모세관 압력 장벽의 사용의 예로는, 미세유체 네트워크를 예컨데 겔과 같은 제1 유체를 선택적으로 채우는 것이다. 미세유체 네트워크가 상기 제1 유체로 채워지는 정도는 네트워크 내의 유체의 전진을 정지시키는 모세관 압력 장벽에 의해 결정된다. 겔화(gelation)시, 미세유체 네트워크의 나머지 부분은 두 유체 사이의 교환이 일어나거나 유체 또는 그 구성 요소 사이의 반응이 발생하도록 제2 유체로 채워질 수 있다. 그 예로는 중간 관류 흐름(medium perfusion flow)이 측면에 위치하는 세포외기질 겔에서 세포의 3D 배양을 나타낸 것이다. 이것은 S.J. Trietsch, G.D. Israels, J. Joore, T. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab Chip 2013, vol. 13, no. 18, pp. 3548-3554에 광범위하게 기술되어 있다.
모세관 압력 장벽을 사용하는 다른 예는 다음에 나와 있다: C. Phurimsak, E. Yildirim, M.D. Tarn, S.J. Trietsch, T. Hankemeier, N. Pamme, P. Vulto, Phaseguide assisted liquid lamination for magnetic particle-based assays, Lab Chip, 2014, vol. 14, no. 13, pp. 2334-2343, P. Vulto, G. Dame, U. Maier, S. Makohliso, S. Podszun, P. Zahn, G.A. Urban, A microfluidic approach for high efficiency extraction of low molecular weight RNA, Lab Chip, 2010, vol. 10, no. 5, pp. 610-6, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M. T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab Chip, Vol. 15, No. 11, pp. 2419-2428, US020070280856A1, US020040241051A1, US000004761381A, US000006271040B1, WO2006074665, US6601613B2, US6637463B1. 모세관 압력 장벽은 소수성 패치 또는 스트라이프(patch or stripe), 이면의 네트워크 물질(ulterior network material)에 대한 친수성이 적은 패치 또는 스트라이프, 채널 확장(channel widening), 채널 또는 챔버 내 줄지은 하나 이상의 기둥들(pillars or posts), 채널 또는 챔버 기판(substrate) 내 홈(groove), 챔버 볼륨 내 물질의 돌출(protrusion) 및 이와 비슷한 것들 중 어느 하나일 수 있다.
Mimetas' OrganoPlates (http://mimetas.com/products.php)가 특히 바람직하다.
생리학적으로 관련된 장기 및 조직 모델의 광범위한 배양 및 스크리닝을 가능하게 하는 미세유체 기반 배양 플레이트가 있다.
이러한 미세유체 시스템의 미세유체 네트워크는 일반적으로 채널, 챔버, 다중(multiple) 채널 또는 챔버 또는 이들의 조합을 포함하며, 적어도 하나의 채널 또는 챔버의 적어도 하나의 치수(dimension)는 1 mm 미만인 것이 종종 바람직하다.
미세유체 네트워크는 전형적으로 하부 기판, 미세유체 네트워크를 포함하는 층 및 상부 기판을 포함하는 수평으로 적층된 장치로서 구성된다. 미세유체 층은 또한 상부 기판 및 하부 기판 중 하나 또는 양 기판 내로(into) 또는 그 위에(onto) 패턴화될 수 있다. 미세유체 네트워크는 폴리머 또는 유리의 상부 및 하부 기판을 포함한다. 미세유체 네트워크는 어느 기판으로 네트워크를 에칭하거나, 어느 기판 상부에 폴리머 층으로 패턴화함으로써 구성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상부 또는 하부 기판 중 적어도 하나는 유리 또는 친수성 폴리머로 구성되어, 유체 전달이 모세관 힘에 의해서만 달성될 수 있다. 미세유체 플레이트(시스템)는 사진 석판술(photolithography techniques), 고온 엠보싱 기술(hot-embossing techniques), 부드러운 엠보싱 기술(soft embossing techniques), 에칭 기술(etching techniques), 복제 성형(replication moulding) 또는 사출 성형(injection moulding) 기술을 사용하여 구성될 수 있다.
채널의 벽은 이에 한정되지 않으나, 유리, 폴리스티렌(polysterene), PMMA, COC와 같은 중합체, 실리콘 고무와 같은 엘라스토머(elastomers), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 세라믹, 금속을 포함하는 임의의 유형의 재료일 수 있다.
채널은 적어도 부분적으로 겔, 바람직하게는 하이드로겔(hydrogel)로 채워진다. 당업자는 본 발명의 문맥 내에서 겔이 상피 세포의 배양을 허용하는 한, 및 세포 배양 기술에 일상적으로 사용되는 것들을 포함하여, 상이한 타입의 겔이 적합하며 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있음을 이해한다. 실제로, 실험에서 본 명세서에서 구체적으로 언급된 것과 같이 상이한 겔이 사용될 수 있음을 보여준다. 실제로 당업자는 적합한 겔을 선택하는데 어려움이 없을 것이다. 겔은 전술한 바와 같이 채널에 제공될 수 있다. 겔을 제공한 후, 추가적인 유체를 도입하기 전에 겔화시킨다. 이 유체는 일반적으로 영양소 및 산소를 제공하는 성장 배지이다. 이 액체를 통해, 세포가 도입될 수 있어 이들을 겔에 부착시켜 세포가 세포층을 형성하게 할 수 있다. 이러한 세포를 배양할 때, 이들은 전형적으로 튜브의 내강(lumen)을 통한 유동으로 관류될 수 있는 튜브를 형성한다. 따라서, 겔은 채널에 제공되고 겔화(gelation) 후에, 상피 세포는 예를 들어 배양 배지와 같은 배양 수단에 의해 채널 내에서 도입되어, 세포를 세포에 접촉시키고 세포층(예를 들어, 세관/관(tubules/vessel))을 겔 상에 형성시켜, 꼭대기 측면 및 기저 측면을 형성할 수 있다.
예를 들어, 겔 전구체(전형적으로 콜라겐, 피브리노겐(fibrinogen), 피브로넥틴(fibronectin), 마트리겔(Matrigel) 또는 합성겔과 같은 기저막 추출물과 같은 세포 외 매트릭스(ECM) 겔로부터 유래됨)는 피펫으로 미세유체 플레이트의 주입구로 도입될 수 있다(typically a repeating pipette such as the Eppendorf Multipette® M4 (Eppendorf AG, Germany, catalogue number 4982 000.012) in combination with Eppendorf Combitips advanced ® (Eppendorf AG, Germany, catalogue number 0030 089.405). 겔 전구체는 세포 현탁액을 생성하는 세포를 추가로 함유할 수 있지만, 세포는 또한 이후에 제공될 수 있다. 겔 전구체는 미세유체 플레이트의 주입구로 방출된다. 겔 전구체는 잠재적으로 중력에 의해 도움을 받는 모세관 힘에 의해 미세유체 네트워크로 운반된다. 겔은 미세유체 챔버의 전체 너비(complete width)에 걸치는 본질적인 모세관 압력 장벽인 위상가이드에 의해 정지된다. 겔 전구체는 제2 유체가 도입되기 전에 겔화된다. 상기 제2의 유체는 일반적으로 영양소 및 산소를 제공하는 성장 배지이다. 유동의 경우, 성장 배지는 또한 세포에 의해 생성되는 폐기 대사산물(waste metabolites)을 제거하거나 희석할 수 있다.
위의 예와 유사한 방식으로, 세포가 제2 유체에 도입되어 겔에 부착될 수 있다. 이러한 세포를 배양할 때, 이들은 전형적으로 튜브의 내강을 통한 유동으로 관류될 수 있는 튜브를 형성한다.
또 다른 예에서, 다중 겔은 다른 하나와 서로 인접하여 패턴화될 수 있다. 다중 겔은 겔 전구체 주입, 모세관 압력 장벽에 의한 전구체의 전진 중지(halting advancement), 및 연속적으로 네트워크의 다른 부분에서 전구체를 겔화되게 함으로써 패턴화될 수 있다. 제1 겔 전구체에서 제1 세포형, 이어서 제2 겔 전구체에서 제2 세포형의 현탁은 세포형이 서로 인접하여 배양된 이른바 층화된 공동 배양을 초래한다.
겔은 바람직하게는 채널 벽에 접촉(contact with)/증착(deposited) 된다.
겔은 실질적으로 묽은 가교 결합 시스템(dilute cross-linked system)으로 정의되며, 정상 상태(steady-state)에서 유동을 나타내지 않는다. 겔은 비 유체 콜로이드 네트워크(non-fluid colloidal network) 또는 종종 유체에 의해 전체 볼륨(whole volume)으로 확장되는 폴리머 네트워크이다. 하이드로겔 또는 아쿠아겔은 팽창제(swelling agent)가 물인 겔이다. 본 발명의 방법의 맥락에서, 겔 물질은 바람직하게는 물에 불용성이지만 2차원 또는 3차원 지지체 구조를 갖도록 물을 포함하는 물-함유 겔(water-containing gel)일 수 있다. 본 발명에서, 사용된 겔은 물질, 특히 프로브(또는 본 명세서에서 정의된 추가 화합물) 및/또는 시험 화합물(하기 참조)의 상기 겔 내에서의 확산을 허용한다. 예로, 마트리겔 및 콜라겐 기반 겔이 있다.
본 발명에서 사용된 겔은, 상기 성질을 가지고, 겔상에 상피 세포층을 형성 할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로 사용되는 겔은 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 피브리노겐, 마트리겔 및/또는 아가로스를 포함하는 생물학적 기원의 겔, 및 PEG(polyethylene glycols), 펩타이드, PLLA(poly-L-lactide), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)와 같은 여러 스캐폴드 기반의 합성 겔을 포함한다.
겔을 패턴화하기 위해, 즉 겔로 미세유체 채널의 부분을 채우기 위해, 이에 한정되는 것은 아니나, 광경화성(photocurable) 겔의 석판술의 패터닝(lithographic patterning), 예를 들어 기둥(pillars)을 이용한 모세혈관 힘 기반의 패터닝, 소수성 패치 또는 위상가이드, 및 선택적 증착(selective deposition)과 같은 다양한 기술들이 사용될 수 있다.
중공 미세유체 채널을 포함하고 상기 채널에서 적어도 부분적으로 겔로 채워지는 미세유체 시스템에 상피 세포가 제공된다. 세포가 미세유체 채널에서 겔과 접촉할 수 있는 한 임의의 적합한 수단에 의해 세포가 채널에 도입될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 상피 세포라는 용어는 상피 세포(epithelial cells), 내피 세포(endothelial cells) 또는 중피 세포(mesothelial cells)를 지칭하며, 후자 두 개는 특별한 형태의 상피 세포이다. 채널에 도입된 세포의 수는 세포가 적합한 배지에서 배양 후 겔 상에 세포층을 형성하도록 허용해야 하며, 사용된 세포의 유형, 사용된 겔의 유형 및 사용된 배지의 유형에 의존한다. 당업자는 이러한 요구 사항을 충족시키기 위해 어떤 조건이 필요한지 또는 이를 확립하는 방법을 잘 알고 있다.
일단 세포가 미세유체 채널에 도입되면, 세포가 겔 꼭대기 측면 및 기저 측면을 갖는 세포의 층을 형성할 수 있도록, 세포는 성장, 확장 또는 나누어질 수 있다. 본 발명과 문맥에서, 세포의 꼭대기 측면은 미세유체 채널의 내부를 향하는 측면인 반면, 기저 측면은 겔을 향하는 (또는 겔과 접촉하는) 세포의 측면이다. 본 발명의 문맥 내에서 또한 세포의 기저 측면에 접하는 측면은 기저(basolateral)로 표시되는 반면에, 세포의 꼭대기 측면에 접하는 측면은 꼭대기(apical)로 표시된다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 미세유체 채널에서 관형 구조를 형성하기에 충분한 기간 동안 배양되고, 다시 말해 본 명세서에서 정의된 바와 같이 꼭대기 및 기저 측면을 특징짓는다.
세포는 선택된 특정 세포에 적합한 조건 및 배지에서, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 배양된다.
꼭대기 및 기저 측면을 갖는 세포층의 형성과 관련하여, 바람직한 실시양태에서 상기 층은 융합한다(confluent). 본 발명의 문맥에서, 융합(Confluence)은 미세유체 채널 내의 겔 물질의 표면과 관련하여 표현된다. 융합은 미세유체 장치 내 부착 세포 수의 추정치로써 일반적으로 사용되는 용어로, 세포가 덮는 표면의 비율을 나타낸다. 예를 들어, 50% 융합은 겔의 표면의 약 절반이 덮여 있음을 의미한다. 층이 융합한다고 말할 때는, 겔 표면의 약 100%가 세포에 의해 덮여 있고, 세포가 단일층으로서 성장할 여지는 더 이상 남지 않는 것이다.
세포층, 예를 들어 단일층이 겔과 접촉하는 부분에 융합할 때, 단일층은 누출 방지(leak tight)된 것으로 밝혀졌다. 실제로, 본 명세서에 개시된 방법의 맥락에서 상피 장벽 기능은 프로브 (또는 프로브 시스템의 일부)가 상피 세포층의 한 측면(꼭대기 또는 기저)으로부터 상피 세포층의 다른 곳(기저, 각각의 꼭대기)으로 확산 또는 표류하는 속도에 기초하여 정의될 수 있다. 완전히 기능적인 상피 장벽 기능으로는 이 속도는 0에 가까울 것인 반면에, 상피 장벽 기능이 없으면 어떤 세포도 없는 경우 주어진 시스템의 속도에 가까워질 수 있다. 주어진 환경 하에서 꼭대기 및 기저 압력의 차이로 인한 간질성 유동은 수송에 영향을 미치고, 따라서 실험을 수행할 때 고려될 수 있음을 당업자는 알고 있다. 이 두 극단적인(extremes) 사이의 임의의 값은 상피 장벽 기능의 수준이 다양함을 나타내며, 0에 가까운 값은 보다 기능적인 상피 장벽 기능을 나타낸다.
바꾸어 말하면, 이러한 조건하에서 프로브(또는 프로브 시스템의 일부분)는, 예를 들어 꼭대기 측면에 부가될 때 세포의 꼭대기 측면에서 기저 측면으로, 매우 제한적으로 이동 또는 확산 또는 표류하거나 하지 않을 것이며, 이는 완전히 기능하는 상피 장벽을 나타낸다. 프로브는 꼭대기에 전달될때 겔에 축적되지 않는다.
본 발명의 문맥에서, 상피 세포층은 부가 후 5, 10, 20 또는 30분 안에 프로브(또는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 센서를 사용하는 경우 추가 화합물)가 제공된 측면(예를 들어, 기저)에 대하여 반대 측면(예를 들어, 꼭대기)에 신호의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 더욱 바람직하게는 약 1% 미만이 나타날 때 누출 방지된 것으로 여겨진다. 바람직한 실시양태에서, 상피층은 5분 동안 신호의 1% 미만이 나타나는 경우 누출 방지된 것으로 여겨진다. 이 수치는 사용된 프로브의 종류 뿐만 아니라 사용된 세포의 종류에 따라 부분적으로 달라진다.
그러나 놀랍게도, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 층은 적어도 겔과 접촉하고 있는 부분에 있어서 프로브에 대해 크게 누출 방지(leak-tight)될 필요가 없다는 것을 발견하였다. 실제로 실험의 시작부터 어느 정도의 누출(leakiness)이 허용될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 방법으로 실험의 시작시, 그리고 시험 화합물의 부재시, 누출 방지가 없는(non-leak-tight) 상피층의 결과로서 예를 들어 겔에 대한 층 내 세포의 융합이 감소된 결과로서, 프로브는 한 측면에서 다른 측면으로 어느 정도까지 움직인다.
실제로, 일부 실시 양태에서, 이러한 누출 방지가 없는 상피 세포가 바람직한데, 이는 예를 들어 시간의 경과에 따라 한 측면에서 다른 측면으로의 프로브의 확산/이동 속도의 감소를 측정함으로 이들의 상피 장벽 강화 특성과 관련하여 화합물을 연구하거나 스크리닝할 수 있게 하기 때문이다.
실험의 시작에서 상피 장벽 기능이 방해받을 수 있는 정도는 실험의 목표에 크게 좌우된다. 프로브(본 발명의 문맥에서, 그리고 센서 시스템의 경우에 추가의 분자 또는 조성물의 이동을 또한 포함하는 본 명세서의 모든 실시양태에서, 사용되는 프로브; 본 명세서에 개시됨)의 한 측면에서 다른 측면으로의 확산은 주어진 시스템에서 어느 세포도 없을 때의 속도와 같아서는 안된다. 일부 실시양태에서, 바람직하게는 실험의 시작시, 및 임의의 시험 화합물이 세포에 제공되기 전, 이동 또는 확산은 임의의 세포의 부재시 동일 시스템 내에서 관찰되는 이동/확산 속도의 최대 50%, 40%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 그 이하이다.
일부 실시양태에서 얻어질 수 있는 관형 구조물과 관련하여, 바람직하게는 관형 구조물은, 겔에 대해 국부적으로 존재하거나 겔과 접촉하는 관형 구조물의 적어도 일부에 융합한다.
본 명세서의 개시에 기초하여, 당업자는 겔 상에 형성된 세포층의 비 누출 방지(non-leak-tightness)에 관해 여전히 받아들여질 수 있는 것을 이해할 것이다. 동시에, 상기 방법은 상피 장벽 기능이 감소하거나 심지어 없기 때문에 세포층이 적절하게 사용될 수 있는지 또는 배척해야 하는지를 신속하게 결정하거나 확립할 수 있게 한다.
세포가 세포층을 형성하고 더불어 꼭대기 측면 및 기저 측면을 갖는 세포층을 형성한 후에, 미세유체 채널 내 세포에 프로브가 제공된다. 프로브는 꼭대기 배지 또는 기저 배지, 꼭대기 및 기저 배지 모두에 제공될 수 있다. 후자는 예를 들어 서로 다르고 구별 가능한 두 개의 프로브의 추가를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로브는 광 프로브(optical probe)이다: 즉, 광학 수단으로 모니터링 될 수 있다. 바람직하게는 광학 프로브는 발광 프로브(luminescent probe)이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 발광 프로브는 자체적으로 빛을 방출하거나, 발광 프로브를 포함하는 효소 반응의 화학 물질의 결과로서 빛을 방출 또는 생성하거나, 여기(형광)에 따라 빛을 방출한다. 예를 들어, 발광 프로브가 빛을 방출하기 위해 보조 인자(co-factors) 또는 기질(substrates)을 필요로 하는 경우, 상기 보조 인자 또는 기질은 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 모든 측면에서 상기 배지에 첨가될 수 있다. 보조 인자 또는 기질을 사용할 때, 프로브는 실제로 빛 자체를 방출할 필요는 없지만 발광 생성 과정의 중요한 부분이어야 하는데, 예를 들면 보조 인자의 형광 부분은 발광성 프로브의 존재하에서 꺼지지 않을 수 있다(unquenched).
보조 인자 또는 기질이 프로브에 대한 세포층의 반대쪽에 선택적으로 제공되면, 보조 인자 또는 기질이 없는 측면에서 빛이 생성되지 않기 때문에, 확산되거나 표류된 프로브의 측정은 꼭대기 및 기저 빛 사이의 비율과 반대로 생성되는 빛의 절대량일 것이다.
세포에는 또한 시험할 화합물이 제공된다. 상기 화합물은 프로브와는 독립적으로, 세포의 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 꼭대기 및 기저 측면 모두에 제공된다. 화합물(시험 물질)은 프로브와 동시에, 또는 프로브가 세포에 제공되기 전 또는 후 첨가될 수 있다. 상기 화합물은 상피 장벽 기능을 조절하는 능력을 시험하는 제제 일 수 있다. 상피 장벽 기능의 조절은 증가된 상피 장벽 기능, 감소된 장벽 기능 또는 보충된 상피 장벽 기능을 포함할 수 있다(여기서 화합물은 상피 장벽 기능 자체를 증가시키지 않지만, 예를 들어 상피 세포층을 위한 코팅제로서 작용하여 상피 장벽 기능을 보완한다). 상피 장벽 기능에 대한 상기 화합물의 활성은 이미 공지되었거나 알려지지 않았을 수 있다. 시험할 화합물은 항체, 소분자 억제제(small molecule inhibitors), 약물, 천연 또는 합성 점막 보호제(mucosal protective agents), 사이토카인, 성장 인자, 항산화제, 항프로테아제, 천연 또는 합성 상피 분비물(epithelial secretions), 및 계면 활성제 또는 임의의 다른 개입(intervention)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
상기한 바와 같이, 상피 장벽 기능을 증가, 보충 또는 감소시키거나 시킬 것으로 의심되는 화합물이 특히 중요하다.
본 발명의 방법의 다음 단계 동안, 프로브 또는 프로브 시스템에 의해 생성되거나 제공되는 신호는 다양한 시점에서 결정된다. 신호는 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 꼭대기 측면 및 기저 측면에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 프로브가 기저 측면에 제공되는 경우, 프로브의 꼭대기 측면으로의 이동은, 신호의 증가가 꼭대기 측면으로의 확산을 나타내는 꼭대기 측면에서 신호를 측정함으로써 측정될 수 있다. 그러나, 하나의 실시양태에서, 예를 들어, 꼭대기 측면으로의 확산 또는 표류는 기저 측면에서 신호를 측정함으로써 결정될 수도 있으며, 여기서 신호의 감소는 꼭대기 측면으로의 확산을 나타낸다. 신호는 또한 양 구획, 즉 꼭대기 또는 기저 측 배지 또는 겔 모두에서 측정될 수 있다. 하기에서 상세히 설명하는 바와 같이, 기저 측면에서 신호를 측정하는 단계는 겔에서 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있지만, 기저 측 겔에 접근 가능한 배지에서 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 프로브는 겔로부터 축적될 수 있다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 겔의 기저 측 신호를 측정하는 단계는 상기 겔 또는 상기 배지, 또는 이 둘 모두에서 측정하는 단계를 포함한다.
신호를 측정하기 위해 사용된 방법은 본 발명의 방법에서 사용된 특정 프로브에 의존한다. 사용된 프로브에 따라, 당업자는 어떤 방법을 사용해야 하는지 알고 있다. 예를 들어, 형광 프로브의 경우, 프로브의 형광은 임의의 적합한 수단을 사용하여 결정된다.
바람직하게는, 프로브는 광학 프로브, 바람직하게는 발광 프로브, 바람직하게는 형광 프로브이다. 프로브, 광학 프로브, 발광 프로브, 형광 프로브는 또한 추가적인 분자 또는 조성물에 의해 일단 접촉된 신호를 제공하는 센서 분자 또는 조성물을 포함할 수 있다. 한쪽 측면에 센서를 제공하고 다른 쪽 측면에 추가적인 분자 또는 조성물을 제공함으로써, 추가적인 분자 또는 조성물에 의해 접촉될 때 누출(leakage)은 센서에 의해 생성/제공되는 신호를 측정함으로써 검출될 수 있다.
상기 신호는 바람직하게는 하나보다 많은 시점(time point)에서 결정된다. 실제로, 제1 시점에서 시험 화합물의 부재시의 신호는 제1 대조 값(control value)을 얻기 위해 결정될 수 있다. 본 발명의 실시에서, 그리고 하나 이상의 채널에서 상피 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 효과를 시험하는 것과 동시에, 세포층을 포함하는 하나 이상의 채널이 대조로서 사용되며, 즉 여기서 프로브에 의해 제공된 신호는 시간이 지남에 따라 그리고 동일한 조건하에서 그러나 시험 화합물의 부재하에 결정되거나 측정될 것이다. 실제로, 본 발명의 모든 실시양태에 적용 가능하며, 배양물을 물질에 노출시키는 기간을 변경하기 위한 처리 후 배지를 변경할 수 있다. 또한 일반적으로 그러나 필수적이지는 않게, 배양 조건에 문제가 있는지 여부를 결정하기 위해 시험 배양물과 함께 대조군(controls) 또는 표준(standards)을 실행해야 한다. 대조군은 파쇄되지 않고 시험되는 물질로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험에 사용된 세포 배양과 동일하다.
얻은 결과는 다른 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과는 시간에 따라 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 두 측면 모두에서 신호에 있어서 절대적 또는 상대적 변화로 표현될 수 있다. 그렇지 않으면, 결과는 동일한 조건하에 그러나 시험 화합물의 부재하에 수행된 대조군 실험과 비교될 수 있다. 또한, 다양한 농도의 시험 화합물을 비교할 수 있다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 ... 10 가지 상이한 농도). 기저 측면에 관하여 꼭대기 측면에서 신호를 표현할 수 있으며 다른 방법으로 신호를 표현할 수도 있다(상대값 뿐만 아니라 절대값). 데이터는 시간 단위당 신호의 변화(절대적, 상대적)로 표현될 수도 있다.
프로브가 상피 세포층을 통해 확산되거나 표류하는 속도는 특정 프로브에 대한 세포층의 겉보기 투과성(apparent permeability; Papp)을 산출하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 이 값은 일반적으로 허용되는 상피 세포층의 장벽 기능에 대한 서술(descriptor)이다. 이 값을 계산하려면, 예를 들어, 지지하는 겔을 향한 세포층을 통한 프로브의 확산 또는 표류를 모니터하고, 세포 없이 겔을 갖는 제어 장치(control devices)에서 관찰되는 확산 또는 표류에 대해 이를 보정할 수 있다. 이러한 계산에 사용할 수 있는 수식은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00001
여기서 t는 시간, A는 프로브가 교차할 수 있는 세포층의 영역, V receiver 는 프로브가 확산하거나 표류하는 장치 부분의 부피, C receiver 는 프로브가 확산하거나 표류하는 장치 부분의 프로브 농도 및 C donor , initial 는 프로브가 밖으로 확산되는 구획에서 프로브의 초기 농도이다.
겔의 세포층 형태의 투과성(permeability)을 구분하기 위해서 다음과 같은 공식을 사용할 수 있다:
Figure pct00002
P app determined 는 겔의 상위에 있는 세포의 P app 이며, P monolayer 는 세포의 P app 층이며, P cell free 는 세포 없이 겔을 가진 제어 장치의 P app 이다. 이 수식은 다음과 같이 재정렬될 수 있다:
Figure pct00003
이 방법을 사용하려면, 프로브의 표류 또는 확산을 신호의 증가가 계속 거의 선형(linear)인 시간 동안 모니터되야 한다. 예를 들어, 실험은 상이한 시간 동안 상이한 화합물 또는 화합물의 농도에 상이한 단일층을 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 노출 후, 프로브는 단일층 및 제어 장치에 추가될 수 있으며, 프로브의 표류는 5 및 60 분 사이 동안 모니터링된다. 상기의 공식을 적용하면 상이한 처리 후 세포 단일층의 겉보기 투과성을 얻을 수 있다.
일 실시양태에서, 상이한 화합물은 동일한 채널에서 순서대로 시험된다. 이러한 실시양태에서, 특정 채널 내 세포를 먼저 제1 화합물과 접촉시키고 얼마 후에 시험할 추가 화합물을 첨가하거나, 또는, 세포를 먼저 제1 화합물과 접촉시키고 제1 화합물을 제거한 후 시험할 제2 화합물을 채널 내 동일한 세포에 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 화합물의 혼합물을 시험할 수 있게 한다. 이러한 실시양태에서, 화합물의 혼합물은 세포를 포함하는 미세유체 채널에 제공된다.
일부 실시양태에서, 배지의 연속적인 유동(continuous flow)은 세포 단일층과 반대편의 겔과 나란히 그리고 단일층과 나란히 제공될 수 있다. 이러한 유동(flow)은 겔을 통해 완전히 확산되거나 표류하는 임의의 프로브를 제거할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 겔 뒤의 유동 및 볼륨은 그 안에 용해된 프로브의 농도가 결코 현저한 수준에 이르지 않아 일정한 싱크(constant sink) 상황을 효과적으로 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 세포층의 반대측에도 연속적인 유동이 제공된다. 바람직하게는 프로브를 함유하는 유체의 유동 및 볼륨은 세포층을 통한 확산 또는 표류로 인해 프로브의 농도가 현저하게 감소하지 않아서 일정한 공급(constant source)을 효과적으로 생성한다. 일정한 싱크 및 일정한 공급이 모두 존재할 경우, 겔을 통한 확산 또는 표류가 일정하다는 사실, 겔 내부의 프로브 농도에 영향을 미치는 유일한 요인은 세포층을 통한 확산 또는 표류이다. 이것은 겔 영역에서 프로브의 농도를 단지 측정함으로써, 프로브의 유량(flux) 및 세포층의 장벽 기능을 직접 평가할 수 있다. 시간 경과에 따른 프로브 농도의 증가가 측정되는 몇몇 다른 실시양태와 달리, 일정한 공급 및 싱크를 달성하기 위해 일정한 유동을 이용하는 이 실시양태는 임의의 시점에서 장벽 기능의 직접적이고 역동적인 측정을 허용한다.
바람직한 실시양태에서, 다양한 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합물, 예를 들어 2, 3, 4, 5, ... 10개의 상이한 시험 화합물의 혼합물을, 바람직하게는 상이한 농도에서 비교할 수 있다. 특히, 후자는 약리학(pharmacology), 영양(nutritional) 및/또는 화장품(cosmetics) 분야에서의 응용에 중요할 수 있다. 예를 들어, 요즘 환자들은 동시에 또는 하루 동안 상이한 약을 자주 복용한다. 이러한 조합이 상피 장벽 기능에 미치는 영향을 이해하는 것이 중요할 수 있다. 예를 들어, 천식(asthma)에서, 폐의 상피 장벽 기능을 향상시키거나 보충하기 위해 약물을 투여할 수 있지만, 반면에 이러한 환자는 의도하지 않게 그러한 개선을 무효시키거나 반대되는 약물을 복용할 수 있다.
일반적으로, 프로브가 첨가된 측면의 반대 측면에 주어진 프로브에 의해 제공되거나 생성된 신호의 증가는 완전히 누출 방지되지 않은 상피 장벽을 나타낸다. 증가가 클수록 상피 장벽 기능이 감소한다.
본 발명의 방법으로, 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 효과에 관해 보다 상세한 정보를 얻을 수 있게 되었다. 첫 번째 이유는 트랜스웰(Transwell®, Corning, Inc., Lowell, Mass.; 이러한 삽입물은 조직 배양 플레이트의 웰에 삽입될 수 있는 인공 투과성 성장 지지체를 제공함)과 같은 투과성 조직 배양 플레이트 삽입물의 사용에 주로 의존하는 당업계의 방법과 비교하여, 본 발명의 방법에 사용된 상피 세포가 생체 내 상태에 대한 보다 대표적인 모델이라는 것이다. 두 번째 이유는 실시간으로, 많은 시점에서, 그리고 한 실험에서 세포층에 대해 신호를 모니터할 수 있다는 것다. 세 번째 이유는 본 발명의 방법으로 화합물이 상피 장벽 기능을 조절하는 메카니즘의 특징을 확인하는 것이 가능해진다는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 화합물을 세포에 제공한 후에 시험 화합물의 효과를 즉각적으로 관찰 가능하게 해주거나, 또는 화합물이 첨가되는 순간과 장벽 기능 조절이 일어나는 순간 사이에 지연 시간(lag time)이 있는지를 확립하는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 라이브/데드(live/dead) 효과보다 세포에 대한 화합물의 미묘한 효과를 확립하는데 사용될 수 있다. 화합물 첨가시 상피 장벽 기능의 측정, 즉 경계 무결성(boundary integrity)을 측정하면, 라이브/데드 평가보다 훨씬 더 미약한 독성의 값을 부여한다. 시험 화합물은, 예를 들어 세포층의 치밀 접합를 방해하거나, 세포를 죽일 수 있을 뿐만 아니라 세포층 또는 관형 구조물의 자체 재생 능력을 저해하거나 감소시킬 수 있다(그러나 전부는 아님).
유동 시스템(flow systems) 즉 본 발명의 방법에서 사용되는 미세유체 시스템을 취급할 때 정량화하는 것이 가능하다면, 라이브/데드 분석이 어렵다는 문제점은 본 발명의 방법으로 해결된다. 유동의 존재시에 죽은 세포가 흘러나오는 반면, 동시에 상피 장벽은 세포의 살생을 보충하는 확실한 재생 능력을 가지고 있다. 따라서 장벽 무결성(barrier integrity)의 측정은, 본 발명의 방법을 사용하여 간단히 측정할 수 있는 기능 손실(loss of function), 재생 능력(regenerative capacity) 또는 세포 사멸(cell death)을 명확하게 나타낸다.
실제적으로, 경계 무결성에 영향을 미치는 독성 효과는 즉각적인 사건이 아니지만 특정 시점에서 발생할 수 있음이 또한 발견되었다. 경계 무결성이 손상된 시점은 첨가된 화합물의 농도와 관련이 있음을 발견했다. 실제로, 본 발명자들은 화합물의 농도는 시간의 함수로써 재생 능력 대비 세포 사멸 비율, 또는 치밀 접합에 영향을 미치는 것으로 믿는다. 화합물 투여 및 장벽 완전성 손실(barrier integrity loss)의 부작용을 측정할 수 있는 시점 사이 시간은 특정 농도에서 화합물의 독성 효과에 대한 중요한 척도이다. 본 발명의 방법의 매우 바람직한 실시양태에서, 하기의 단계를 추가적으로 포함한다:
f) 시험 화합물 및/또는 프로브를 상피 세포로 제공한 시점(time point)에서, 미세유체 채널 및/또는 겔 상에서 미리 결정된 형광 값 또는 미리 결정된 형광 값의 변화에 도달한 시점(time point), 또는 미세유체 채널(꼭대기 측면) 및/또는 겔(기저 측면) 상에서 미리 결정된 형광 비율 값 또는 미리 결정된 형광 비율 값의 변화에 도달한 시점(time point)으로 경과한 시간을 단계 e)에서 수득된 신호로부터 결정하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 시험 화합물 및/또는 프로브를 상피 세포에 제공하는 시간 및 어떤 미리 결정된 신호 값 또는 신호 값의 변화가 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 양측 모두에 도달하는 순간 사이의 시간은 시험된 농도에서 시험 화합물에 대하여 계산된다.
이렇게 수득된 값은 "누출까지의 시간(time-to-leak)"의 척도이며, 예를 들어 시험 화합물 및/또는 프로브의 첨가로부터의 시간을 시험 화합물의 상이한 시험 농도의 미리 결정된 값으로 비교함으로써, 상이한 시험 조건 간에 비교될 수 있다. 설명된 바와 같이, 이러한 데이터는 특정 농도에서 화합물의 독성 효과에 대한 중요한 척도이며, 본 발명의 방법을 이용하여 처음으로 가능해졌다. 미리 결정된 값은 사용된 세포의 유형에 따라 달라질 것이며 경험에 기인하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 값은 기준(reference) 화합물을 사용하여 얻은 결과에 기초하거나, 대조군(controls)에 의해 얻어진 결과에 기초할 수 있다. 예를 들어, 기준 화합물 A에 대해, 주어진 농도에서, 꼭대기 측면 및 기저 측면에서의 신호 사이의 특정 비율(예를 들어, 채널 내 배지에서의 신호 및 겔 내에서의 신호의 비율)이 예를 들어 20분 후에 도달한다고 알려진 경우에, 이러한 비율은 다른 화합물의 조절 효과를 시험하기 위한 벤치 마크(benchmark)로서 사용될 수 있다. 또한, 상이한 농도의 시험 화합물에 대한 누출시간(time-to-leak)이 본 발명의 방법과 비교될 수 있다.
실제로, 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 농도의 시험 화합물에 대해 수행되며, 바람직하게는 상기 단계 f)는 하나 이상의 농도의 시험 화합물에 대해 결정된다. 이들의 실시양태에서, 다양한 농도의 시험 화합물(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 ... 10개의 상이한 농도)이 비교될 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 다양한 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합물, 예를 들어 2, 3, 4, 5, ... 10개의 상이한 시험 화합물의 혼합물을, 바람직하게는 상이한 농도로 비교할 수 있다.
또한, 상피 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 효과가 결정되고, 바람직하게는 동시에, 즉 동일한 실험 내에서, 배양된 상피 세포를 포함하는 하나 이상의 미세유체 채널 내에서, 바람직하게는 여기서 상피 장벽 기능에 대한 하나 이상의 농도의 시험 화합물의 효과가 동시에, 즉 하나의 동일한 실험 내에서 결정되는, 본 발명의 방법이 제공된다. 실제로, 상이한 채널에서 제공된 신호는 상피 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 효과가 바람직하게는 동시에 결정되는, 그러한 실시양태에서 순차적으로 측정된다.
본 발명의 방법을 사용하면 시간에 따른 동일한 실험 및 상이한 조건 하에서 시험 화합물의 조절 효과를 결정할 수 있게 된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 동일한 실험에서 하나 이상의 미세유체 채널(또는 채널 네트워크)에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상이한 채널에 제공된 시험 화합물의 농도는 동일하고, 다른 실시양태에서 상이한 채널에 제공되는 시험 화합물의 농도는 채널마다 다르다. 본 발명의 방법은 하나의 실험에서, 동일한 조건하에서 모두 수득된 상피 세포층을 이용하여, 세포층을 포함하는 하나 이상의 채널로부터 얻어진, 시간에 따른 농도에서의 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 효과, 시간에 따른 상이한 농도의 효과를 결정할 수 있다. 이를 통해 우수한 품질과 대표 데이터를 제공할 수 있다.
당업자는 사용자의 희망에 따라, 본 발명의 방법이 동일한 실험에서(즉, 동시에) 시간 경과에 따라 상이한 화합물을 하나 이상의 상이한 농도로 시험하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 독립적으로 상피 장벽 기능에 대한 하나 이상의 시험 화합물의 효과가 동시에 존재하는 본 발명의 방법이 제공되며, 다시 말하면, 동일한 실험에서, 적어도 배양된 상피 세포를 포함하는 다중 미세유체 채널(또는 채널 네트워크)의 일부에서 결정된다.
그러한 실시양태에서, 동일한 조건하에 있지만 상이한 채널에서, 바람직하게는 동일한 미세유체 시스템에서 성장된 세포는 상이한 시험 화합물(또는 일부의 경우, 시험 화합물의 혼합물, 또는 상이한 화합물에 순차적으로 노출된 하나의 채널에서의 세포)로 처리되고, 효과는 시간 경과에 따라, 바람직한 실시양태에서는 상이한 농도에서 결정된다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 겔과 접촉하는 세포층은 누출방지이지만, 즉 프로브가 제한된 정도로만 한쪽 측면에서 다른 측면으로(예를 들어 꼭대기 측면에서 기저 측면으로) 확산되거나 이동하는 경우, 또는 그렇지 않은 경우, 이는 본 발명의 방법에 필수적이지 않다. 사실 몇몇 실시양태에서는 화합물이 상피 장벽 기능을 복원함으로써 조절할 수 있는지 여부를 연구할 수 있기 때문에 특정(제한된) 수준의 확산이 바람직하다(프로브의 확산 감소로 측정). 선택적으로, 단계 d)에 앞서 또는 동시에 장벽 기능이 중단되는 본 발명의 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, (바람직하게는 융합하는) 세포층에서 (바람직하게는 반복적인) 파괴가 생성될 수 있다. 파괴를 형성시키는 하나의 방법은 세포층에서 세포의 일부를 동결시키는 것이며, 그렇지 않으면, 예를 들어 레이저 빛, 특정 화합물, 초음파 또는 음향 신호, 내부에 기포 발생 또는 폭발, 연마 비드를 사용하거나, 또는 자신의 실험이나 문헌에 기초하여 재현성 있게 세포층을 파괴시키는 것으로 보이는 화합물을 첨가함으로써 수행될 수 있다.
다음으로, 시험 화합물을 첨가하여 시험을 개시한다. 일반적으로 처리는 배양이 중단된 직후이지만 때로는 배양 중단 전 시험 물질로 처리하여 특정 유형의 효과를 결정하기도 한다. 이 절차의 목적을 위해, 처리는 시험 화합물에 배양물을 노출시키는 임의의 수단일 수 있다. 구체적인 처리 방법은 물질의 성질에 따라 다르다.
예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 연속 희석법을 사용하여 물질의 상이한 양의 효과를 비교함으로써, 물질이 방해의 종료를 억제하거나, 자극하거나, 그렇지 않으면 영향을 미치는 수준의 결정이 달성된다.
일부 실시양태에서, 시험 화합물은 프로브가 세포층에 제공되기 전에 세포에 제공된다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 프로브가 세포층에 제공된 후에 세포에 제공된다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 프로브가 세포층에 제공되는 것과 동시에 제공된다. 전술한 바와 같이, 세포는 세관(tubules) 또는 관(vessel)의 형태인 것이 바람직하다. 이러한 세관 또는 관은 혈관(blood vessels) 또는 림프관(lymph vessels), 또는 근위 세뇨관(proximal tubule)과 같은 세관을 취급할 때,보다 생리학상으로 적절한 상태를 나타낸다. 그 이유는 세포가 경험하는 기계적 신호가 생체 내 신호와 유사하고, 유동을 경험할 수 있는 명확한 내강 측면을 가지고 있기 때문이다(그러나 꼭 필요한 것은 아님). 시험 화합물 및 프로브는 동일한 측면(즉, 꼭대기 측면, 기저 측면 또는 양 측면 모두)에 제공 될 수 있지만, 이들은 또한 상이한 측면에 제공될 수 있다(예를 들어, 시험 화합물은 기저 측면에 제공되는 반면, 시험되는 화합물은 꼭대기 측면에 제공되거나, 꼭대기 및 기저 측면에서 요구된다). 따라서, 시험 화합물은 프로브 전, 프로브 후 또는 프로브와 동시에 세포에 제공되는 본 발명의 방법이 제공된다. 시험 화합물 및 프로브를 제공하는 사이의 시간은 실험 설정(experimental set-up)에 따라 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 시간주기는 1분, 5분, 10분 또는 30분 미만이다. 다른 실시양태에서, 시간주기는 약 10, 30, 60초, 또는 약 5, 10, 30, 60분 또는 약 1, 2, 6, 12, 24 또는 48시간이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유형의 프로브가 세포에 제공된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 시험 화합물이 제공된 후에 제공된다. 일부 실시양태에서 추가적인 프로브가 제1 프로브 및 시험 화합물이 제공된 다음에 제공되고, 예를 들어 시험 화합물 및 제1 프로브가 세포에 제공된 후 얼마 후에 제공된다. 이러한 실시양태는 예를 들어, 제1 프로브로 상피 세포층(세관 포함)의 파괴 또는 수리를 먼저 검출하고 이어서 제2 프로브에 의한 파괴 수리를 결정하는 것을 목적으로 한 실험에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 제1 시험 화합물의 제거 후, 또는 시험 화합물에의 노출 기간 후에 수행될 수 있다(예를 들어, 세포에 의한 측정 적응(measure adaptation) 등).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 시험 화합물이 세포에 제공된다. 예를 들어, 시험 혼합물 중의 한 화합물이 혼합물 중 다른 화합물과 상호 작용하여 상피 장벽 기능에 미치는 영향을 조절하는지를 결정하기 위해, 화합물의 혼합물을 시험할 수 있다. 혼합물 중의 시험 화합물은 또한 장벽 기능에 대해 시너지적으로 작용하거나 또는 서로 반대되는 작용을 할 수 있다.
실제로, 세포층이 반드시 누출 방지이어야 할 필요는 없고, 실험의 개시시(즉, 시험 화합물이 첨가될 때) 프로브의 일부 확산이 허용될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서, 세포층은 누출 방지이며, 시험 화합물의 부재하에 세포에 제공될 때 관찰되는 경우, 사실상 또는 실질적으로 프로브가 확산되지 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 단계 c)에서 배양된 세포가 단일층을 형성하는 본 발명의 방법을 제공하며, 바람직하게는 단일층이 프로브가 꼭대기 측면에서 기저 측면으로 그리고/또는 꼭대기 측면에서 기저 측면으로 확산하는 것을 실질적으로 허용하지 않는다. 본 발명과 관련하여, 상피 세포층은 신호의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만이 첨가 후 5분, 10분, 20분 또는 30분 이내에 한쪽(예를 들어, 꼭대기 측면)에서 다른 한쪽(예를 들어, 기저 측면)으로 확산된다. 이 수치는 사용된 프로브의 종류와 사용된 세포의 종류에 따라 부분적으로 달라진다. 일부 실시양태에서, 바람직하게는 실험 초기 및 임의의 시험 화합물이 세포에 제공되기 전, 확산 또는 표류가 어떠한 세포도 없을 때 동일한 시스템에서 관찰된 확산 속도의 50%, 40%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0% 또는 그 이하이다. 실제로, "화합물 누출(compound leakage)"의 속도를 높이기 위해, 프로브 측면 상에 유체의 (약간의) 과압이 자주 가해지므로 신호가 더 명확해진다. 이것은 겔에 존재하는 간질성 유동(interstitial flow)이 있기 때문에 가능하다. 예를 들어, 시험 화합물 및 프로브를 포함하는 100 마이크로 리터의 배지를 세포층/세관의 내강 측면과 연통하는 저장기(reservoirs)에 첨가할 수 있으며, 단지 20 마이크로 리터의 배지를 세관의 다른 측면과 연통하는 저장기에 첨가할 수 있다. 따라서 내강 측면(luminal side)에 약간의 과압이 발생하여, 장벽의 파열이 발생할 때 명확한 신호를 제공한다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 단계 e)에서 미세유체 채널 또는 겔, 또는 미세유체 채널 및 겔 모두에서 프로브에 의해 제공된 신호를 다양한 시점에서 결정하는 것을 포함한다. 당업자는 상기 다양한 시점에서의 결정이 적어도 2개의 시점(실험/방법 동안)에서 프로브(마커 물질로도 지칭됨)가 예를 들어 세포의 꼭대기 측면 및/또는 기저 측면에서 (또는 세포와 함께) 결정된다는 것을 이해한다. 즉, 프로브(프로브에 의해 제공되는 신호)는 시간이 지남에 따라 그리고 적어도 두 개의 서로 다른 순간에 결정된다. 당업자는, 예를 들어 실험 또는 분석의 목적에 따라, 첫 번째 측정/결정 순간, 두 측정 간의 시간, 총 측정 횟수, 한 측정 기간, 측정의 총 길이 등에 따라 변할 수 있다는 것을 이해한다. 예를 들어, 당업자는 시험 화합물의 첨가 전, 시험 화합물 제공 후 1초, 1시간, 12시간, 1일, 3일 등에서 첫 번째 측정을 수행할 수 있다. 예를 들어 당업자는, 1초마다, 1분마다, 1시간마다, 6시간마다, 매일, 매주 또는 매달, 그리고 원한다면 상기 언급된 어느 기간 사이 및 이상에서 측정할 수 있다. 예를 들어 당업자는, 1초 미만 또는 1초 이상, 1분 미만 또는 1분 이상, 1시간 미만 또는 1시간 이상, 6시간 미만 또는 6시간 이상, 1일 미만 또는 1일 이상, 1주일 또는 1개월 동안 측정할 수 있다. 예를 들어, 두 측정 간의 시간 간격은 1초 미만 또는 1초 이상, 또는 1분 미만 또는 1분 이상, 1시간 미만 또는 1시간 이상, 6시간 미만 또는 6시간 이상, 하루 미만 또는 하루 이상, 1주일 또는 한달 등일 수 있다.
또한, 단계 e)에서 두 개의 연속적인 시점이 서로 1초 내지 24시간 내에 있는 본 발명의 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에서 프로브에 의해 제공된 신호는 다양한 시점에서 측정된다. 두 시점 사이의 기간이 다를 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 시점 사이의 기간은 5초일 수 있는 반면, 제2 및 제3 시점 사이의 기간은 10분일 수 있다. 원칙적으로 두 시점 사이의 기간은 임의의 적절한 기간이 될 수 있다. 그러나 실제적으로 시점 사이의 시간은 각 시점에서 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 수 있는 것으로 선택해야한다. 예를 들어, 후자의 시점(later time points) 사이의 기간은 상대적으로 길 수 있는 반면에, 제1 시점 간의 기간은 상대적으로 짧다. 그러나, 얻어진 실험 데이터로부터, 상피 장벽 기능의 변화가 일정한 간격으로 발생하는 것으로 나타난다면, 두 시점 사이의 기간은 비교적 길고, 상기 실험은 상피 장벽 기능의 변화를 보다 정확하게 결정하기 위해 상기 일정한 간격에서보다 짧은 시간 주기로 반복될 수 있다. 일반적으로 두 시점 사이의 기간은 1초에서 24시간, 예를 들어 각각 1초 및 20분일 수 있다. 두 시점 사이의 각 기간이 동일하거나 주어진 범위 내에 있어야 하는 것은 아니다.
또한, 단계 e)의 다양한 시점이 10분 및 4주(예를 들어, 28일) 사이 및 포함하는 기간의 기간 내에 있는 본 발명의 방법이 제공된다. 실험이 계속될 수 있고 많은 다른 시점에서 측정이 이루어질 수 있지만, 일반적으로 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과, 특히 독성 효과는 시험 화합물의 첨가 후 오히려 신속하게 발생한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 신호가 결정되는 상이한 시점에서의 총 기간은 10분 내지 4주(예를 들어, 28일) 사이 및 이를 포함할 수 있다.
그 점에서, 제1 측정은 화학적 화합물 및/또는 프로브가 세포에 제공된 직후에 수행될 필요는 없다는 것을 주목해야 한다. 언급한 바와 같이, 시험 화합물은 예를 들어, 시험 화합물이 상피 장벽 기능과 관련하여 그의 작용을 발휘할 수 있게 하기 위해, 예를 들어, 프로브가 제공되기 수 분 또는 수 시간 전에 세포에 제공될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 제1 측정은 시험 화합물의 첨가 후 수 시간 후에 수행될 수 있으며, 예를 들어 10분 내지 4주(예를 들어, 28일) 동안 계속될 수 있다.
또한, 겔에 인접하여 겔과 접촉하는 추가의 채널이 존재하고, 상기 채널은 배양된 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널과 직접 접촉하지 않는, 본 발명의 방법이 제공된다.
상기 추가 채널은 겔과 직접 접촉하지만, 상기 겔(및 상기 겔 상에 단일층을 형성하는 세포)에 의해 배양된 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널로 분리된다. 따라서, 추가 채널은 기저 측면의 일부이며, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 프로브에 의해 제공된 신호를 측정하거나 시험 화합물 또는 다른 화합물을 세포의 기저 측면에 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 시험 화합물과 프로브는 세포의 기저 측면에 도달하기 위해 겔을 통해 확산할 수 있거나, 추가 채널 내에서 액체에 도달하기 위해 겔을 통해 확산될 수 있다.
또한, 상기 추가의 채널에서 프로브가 겔로부터 제거되는 유동이 존재하고, 바람직하게는 겔 내에서 단계 e)에서 프로브에 의해 제공된 신호를 측정하는 단계는 상기 추가 채널 및/또는 겔에 존재하는 유동에서의 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 방법이 제공된다.
일반적으로, 그리고 본 명세서에 기재된 다양한 실시양태에 있어서, 측정은 여러 가지 방식으로 미세유체 장치에서 수행될 수 있다. 예를 들어,
1) 채널, 즉 프로브가 제공되는 측면(공여자 측면(donor side))에서 일정한 유동. 이러한 실시양태에서, 이는 예를 들어, 기저 측면 또는 꼭대기 측면에서 프로브의 일정한 공급(constant source)을 야기한다. 이러한 실시양태에서의 측정은 바람직하게는 다른 측면에서 얻어진 신호에 기초하여 행해진다.
2) 선택적으로, 공여자 측면에서의 유동의 사용이 없으며, 즉 프로브의 일정한 공급이 없다. 이러한 정적인 실시양태에서, 프로브의 다른 측면(즉, 미세유체 채널의 기저 측면/겔/추가채널 또는 꼭대기 측면/배지)으로의 확산은, 프로브가 제공되는 채널에서 프로브의 레벨을 감소시키며, 이는 획득된 데이터를 해석할 때 고려되어야 한다.
3) 수용자 측면(acceptor side)(즉, 반대 측면(꼭대기에 대한 기저; 기저에 대한 꼭대기)에 추가될 때 프로브가 확산할 수 있는 꼭대기 또는 기저 측면)에 유동이 없을 수도 있다. 이는 시간이 지남에 따라 이러한 측면에서 프로브가 축적될 것이고, 따라서 이는 측정된 시간 간격에 걸친 누출의 적분(integral)이다. 이 실시양태는 특히 기저 측면(즉, 겔)이 수용체 측으로서 사용되는 경우에 사용될 수 있다.
4) 수용체 측에서 일정한 유동(constant flow)이 가해질 수 있다. 이것은 수용자 측에서 축적을 일으키지 않는다(그리고 공여자 측면으로 프로브가 재분포될 수 있음). 이 경우, 시점 당 누출 또는 시점 당 누출 시간(time leakage)은 수용자 측면에서 결정될 수 있다(예를 들어, 겔에서, 하기 논의된 바와 같은 추가 채널과 조합하여).
바람직한 실시양태에서, 유동은 공여자 측면 또는 수용자 측면 중 어느 하나, 또는 양쪽 모두에 적용된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유동은 한 측면에만 적용되고 다른 측면에는 적용되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 기저 측면에 유동이 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 유동은 꼭대기 측면에 적용된다. 일 실시양태에서, 유동은 공여자 측면에만 적용된다. 추가의 실시양태에서, 시험 화합물은 유동이 가해지지 않은 측면에 첨가된다. 추가의 실시양태에서, 시험 화합물은 유동이 적용되는 측면에 첨가된다. 추가의 실시양태에서, 시험 화합물이 유동이 적용되는 측면에 첨가될 때, 유동은 화합물이 제공되는 측면에서 일정한 농도를 위해 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 시험 화합물의 초기 제공 후, 시험 화합물이 유동이 적용되는 측면에 첨가될 때, 유동은 시험 화합물을 포함하지 않거나, 보다 낮은 농도로 포함하며; 화합물이 제공되는 측면에서 시험 화합물의 농도를 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 시험 화합물의 초기 제공 후, 유동은 화합물의 농도를 변화시키거나 증가시키는 것을 포함하고, 따라서 시험 화합물이 제공되는 측면에서 시험 화합물의 농도를 증가시키거나 변화시킨다.
본 발명의 방법은 시간에 따른 시험 화합물 또는 상이한 시험 화합물의 시간에 따른 및/또는 상이한 농도에서의 조절 효과를 결정할 뿐만 아니라, 상이한 상피 세포 또는 상이한 상피 세포층의 조성물에 대해, 하나 이상의 농도에서, 시간 경과에 따른 시험 화합물 또는 상이한 시험 화합물의 조절 효과를 반복적으로 시험하는 것을 허용한다. 따라서, 단계 b)에서 상이한 유형의 상피 세포가 동일한 미세유체 채널에 도입 및/또는 단계 b)에서 상이한 미세유체 채널이 상이한 유형의 상피 세포로 제공되는 본 발명의 방법이 제공된다. 당업자는 상피 세포의 하나 이상의 유형을 포함하는 미세유체 장치를 제조하는 방법을 잘 알고 있다. 이 실시양태는, 예를 들어 시험 화합물의 상피 세포 유형 특이적 효과를 검출할 수 있게 한다.
본 발명의 방법에 사용된 겔은 제공된 상피 세포 유형이 꼭대기 측면 및 기저 측면을 갖는 세포층을 겔 상에 형성할 수 있는 한 임의의 적합한 겔일 수 있다. 예를 들어, 겔은 아가로오스(agarose), 젤라틴(gelatin), 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 실리카겔(silica gel) 등을 포함하는 합성 중합체, 천연 중합체 또는 생체 고분자를 포함할 수 있다.
그러나, 바람직한 실시양태에서, 겔은 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로닌(vitronectin), D-라이신(D-lysine), 엔탁틴(entactin), 헤파란 설파이드 프로테오글리칸(heparan sulfide proteoglycans), 유사 조직 배양 기질, 및 이들의 조합물과 같은 하나 이상의 성장 및/또는 분화 물질을 포함한다.
다른 실시양태에서, 겔은 기저막 추출물(basement membrane extract), 인간 또는 동물 조직 또는 세포 배양 유래 세포외기질, 동물 조직 유래 세포외기질, 합성 세포외기질, 하이드로겔, 콜라겐, 연질 아가(soft agar), 달걀 흰자(egg white) 및 마트리겔(Matrigel)과 같은 상업적으로 이용 가능한 제품을 포함한다. 기저막은 생체 내에서 상피 세포의 근간이 되는(underlie) 얇은 세포외기질이며, 단백질 및 프로테오글리칸(proteoglycans)과 같은 세포외기질로 구성된다. 상피 세포층, 다층 또는 단층이 장벽으로써 외계(external world)로부터의 외인성 물질의 침입을 막지만, 기저막 자체는 물리적 장벽으로 작용한다. 따라서, 상피 조직을 포함하는 상피 세포는 기저막과 협력하여 고체 장벽을 형성하고 내부 생체 활성을 보호한다.
이들은 콜라겐 IV, 라미닌, 엔탁틴, 헤파란 설파이드 프로테오글리칸 및 기타 여러 가지 작은 구성 요소로 구성되어 있다(Quaranta et al, Curr. Opin. Cell Biol.6, 674-681, 1994). 손상되지 않은 기저막 뿐 아니라 이러한 구성 요소들 단독은 생물학적으로 활성을 나타내며 세포 부착, 이동 및, 많은 경우 성장 및 분화를 촉진한다. 기저막을 기본으로 한 겔의 예는 마트리겔이다(US 4829000). 이 물질은 상피 세포의 기질(substratum)로서 생체 외에서 생물학적으로 매우 활성을 나타낸다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 많은 다양하고 적합한 겔은 상업적으로 입수 가능하며, 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 마트리겔 rgf, BME1, BME1rgf, BME2, BME2rgf, BME3(모든 마트리겔 변형체), 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 I 및 IV의 혼합물, 또는 콜라겐 I 및 IV, 및 콜라겐 II 및 III의 혼합물), 퓨라메트릭스(puramatrix), 하이드로겔, Cell-Tak™, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, Matrigel® Matrix, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 오스테오폰틴(Osteopontin), 폴리-리신(PDL, PLL), PDL/LM 및 PLO/LM, PuraMatrix® 또는 비트로넥틴.
하나의 바람직한 실시양태에서, 매트릭스 구성 성분은 상업적으로 이용 가능한 Corning® MATRIGEL® Matrix (Corning, NY 14831, USA)으로써 얻을 수 있다.
MATRIGEL® Matrix는 Engelbreth-Holm-Swarm("EHS") 마우스 종양에서 추출된 것으로, 기저막에서 종양이 풍부하다. 주요 매트릭스 성분은 라미닌, 콜라겐 IV, 엔탁틴 및 헤파란 설파이드 프로테오글리칸("HSPG")이다. 매트릭스는 또한 아직 정의되지 않은 세포외기질 성분 뿐만 아니라 성장인자, 매트릭스 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinases)(콜라게나아제(collegenases)) 및 기타 단백질 분해 효소(플라스미노겐 활성제(plasminogen activators))를 포함한다. 상온에서 MATRIGEL® Matrix 겔은 재구성된 기저막을 형성한다.
따라서, 겔이 기저막 추출물, 세포외기질 성분, 콜라겐, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로닌, D-라이신, 엔탁틴, 헤파란 설파이드 프로테오글리칸 또는 이들의 조합물을 포함하며, 바람직하게는 둘로 분리시키는 물리적인 막 없이 겔이 세포층과 직접 접촉하는, 본 발명의 방법이 바람직한 실시양태에서 제공된다.
당해 분야의 방법과는 대조적으로, 본 발명은 투과성 지지체(예를 들어, 본 명세서에 이미 기재된 Transwell® 삽입체)를 갖는 조직 배양 삽입체의 이용에 의존하지 않는다. 이러한 삽입체(inserts)는 일반적으로 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에스테르(polyester), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate)뿐만 아니라 다른 유사한 물질로 만들어진다. 이러한 삽입체가 제조되는 물질로서, 확산 장애물(diffusion barriers) 형성과 함께 이러한 지지체는, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 프로브에 대해서는, 접근할 수 없다. 놀랍게도, 겔을 세포층과 직접 접촉시키고, 세포층 및 겔 사이에 물리적 및 불투과성(impermeable) 막을 형성시키지 않는 본 발명의 방법에서 겔을 사용함으로써, 그러한 불침투성 및 비-자연적 층(non-natural layer) 존재의 부정적인 효과는 회피된다는 것을 알아냈다. 이는 특히, 지지체를 제공 및 세포의 적어도 일부에 물리적 장벽을 생성시키기 위해 불침투성 재료를 포함하는 이러한 지지체 또는 삽입체의 사용에 의존하는 분석법과 비교할 때, 상피 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과를 더욱 민감하게 측정할 수 있다는 것을 발견하였다
본 발명의 방법은, 다양한 유형 및 종류의 상피 세포를 나타내는, 본 명세서의 실시예에서 볼 수 있는 바와 같은, 상피 세포의 임의의 유형(내피 세포 및 중피 세포를 포함)에 사용될 수 있고, 미세유체 시스템의 채널에서 배양될 수 있다. 상기 세포는 동물 상피 세포, 동물 상피 세포주 세포(cell line cells), 동물 상피 일차 세포(primary cells), 포유류 상피 세포, 포유류 상피 세포주 세포, 포유류 상피 일차 세포, 인간 상피 세포, 인간 상피 세포주 세포 또는 인간 상피 일차 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어에 의해 포함되는 상피 세포의 예로는 전립선 세포(prostate cells), 유방 세포(mammary cells), 간세포(hepatocytes), 베타 세포를 포함하는 췌장섬 세포(pancreatic islet cells), 폐 상피 세포(pulmonary epithelial cells), 신장 세포(kidney cells), 방광 세포(bladder cells), 위 상피 세포(stomach epithelial cells), 대장 및 소장 상피 세포(large and small intestinal epithelial cells), 요도 상피 세포(urethral epithelial cells), 고환 상피 세포(testicular epithelial cells), 난소 상피 세포(ovarian epithelial cells), 자궁 경부 상피 세포(cervical epithelial cells), 갑상선 상피 세포(thyroid cells), 부갑상선 상피 세포(parathyroid cells), 부신 세포(adrenal cells), 흉선 세포(thymus cells), 담낭 세포(gall bladder cells), 뇌하수체 세포(pituitary cells)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포는 마우스, 래트, 개(canine), 고양이(feline), 소(bovine), 말(equine), 돼지(porcine), 비인간(non-human) 및 인간 영장류와 같은 임의의 포유류를 포함 하나 이에 한정되지 않는 임의의 동물로부터의 세포일 수 있다. 본 발명 배지에서 특히 적합한 포유동물 세포는 인간 유래의 상피 세포를 포함하며, 이는 유방 땀샘(mammary glands), 전립샘(prostate glands), 간(liver), 췌장(pancreas), 신장(kidney), 기관지(bronchi) 및 기도(trachea)와 같은 조직에서 유래된 일차 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 형질전환된 세포 또는 확립된 세포주를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 사용되는 세포는 질환이 없거나 유전적으로 변형되지 않은 정상적이고 건강한 세포일 수 있으며, 또는 질환이 있거나 유전적으로 변형될 수 있는 세포일 수 있다.
본 발명의 문맥 내에서, 세포주는 연속적으로 성장하는 또는 불멸화된 세포를 지칭한다. 때때로 "불멸화된 세포주(immortalized cell line)"라고도 불리는 세포주는 다세포 생물의 세포 집단으로 보통 무한정 증식하지는 않지만 돌연변이로 인해 정상적인 세포 노화(senescence)를 피하고 분열을 계속할 수 있다. 이 용어는 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 세포주 세포는 그러한 세포주에 속하는 세포를 나타낸다. 본 발명의 방법에 적합한 상피 세포주의 예로는, LLC-PK1(돼지 신장 세포) 세포, MDCKI 세포, MDCKII 세포, A549, HMEC-1, ECV304, EaHy926, Caco-2 세포, CEBBe1 세포, HT-29 세포, T84 세포 및 SK-CO15 세포와 같은 Madin-Darby Canine 신장 세포, 또는 유전적으로 조작된 이러한 상피 세포의 유도체 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 1차 세포는 생체 조직(예를 들어, 생검 물질)으로부터 직접 취하여 인비트로(in vitro)에서의 성장을 위해 확립된 세포이다. 이들 세포는 거의 모집단 배양을 거치지 않아, 연속적인(종양 또는 인공적으로 불멸화된) 세포주와 비교하여 유래된 조직의 주 기능적 성분을 보다 잘 대표하므로, 인비보(in vivo) 상태에 대해 보다 대표적인 모델임을 나타낸다.
1차 상피 세포 및 상피 세포주 세포 모두는 American Type Culture Collection (ATTC)을 비롯한 다양한 상업적 원천으로부터 얻을 수 있다.
또한, 상기 단계 e)에서 상기 프로브에 의해 제공된 신호를 결정하는 단계는 이미징 장치(imaging device), 현미경(microscope), 자동화된 현미경, 고해상도 이미저(high content imager), 플레이트 판독기(plate reader) 또는 다중 모드 판독기(multimode reader)를 사용하여 측정하는 것을 포함하는 것인 상기 청구범위 중 어느 한 항의 방법이 제공된다.
신호를 측정하기 위한 적절한 방법 및 장치는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 적절한 방법을 선택하는데 문제가 없다. 고해상도 영상 장치는 예를 들어 Molecular Devices(Sunnyvale, USA) 또는 다른 곳에서 입수할 수 있다.
또한, 미세유체 장치가 미세유체 채널 및/또는 겔 및/또는 추가 채널에 중단되지 않는 광 경로(optical path)를 제공하는 본 발명의 방법이 제공된다. 이렇게 하면 꼭대기, 기저 측면 또는 양 측면에서 신호를 중단 없이 측정할 수 있다.
조절 효과는 본 발명에 따른 미세 유체 시스템에서 세포층의 상피 장벽 기능을 증가시키는 효과이거나 세포층의 상피 장벽 기능을 감소시키는 효과일 수 있다. 조절 효과는 상피 장벽 기능을 파괴하거나 회복시키는 것인 본 발명의 방법이 제공된다. 그 점에서 주목할 점은, 수행된 실험이 초기에는 화합물이 상피 장벽 기능을 감소시키는 것으로 나타난 반면에(수용체 측면(이 경우에는 겔/기저 측면에서)에서 신호의 변화에 의한 목격), 상기 화합물의 존재하에서도 후기 시점에서의 상피 장벽 기능이 다시 개선되었다는 것을 보여준다는 점이다. 이것은 본 발명의 방법이 당업계의 방법과 비교하여, 장벽 기능에 대한 화합물의 조절 효과를 보다 정확하게 검출할 수 있음을 보여준다.
또한, 단계 d)에서, 시험 화합물이 제공되기 전에 프로브가 상피 세포에 제공되고, 바람직하게는 프로브가 제공된 후에, 미세유체 채널 또는 겔, 또는 미세유체 채널 및 겔 모두에서 프로브에 의해 제공된 신호는 다양한 시점에서 그리고 시험 화합물이 제공되기 전에 결정되는 것인 본 발명의 방법이 제공된다.
이러한 실시양태는 세포층이 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 효과를 결정하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 대조군으로써 비교를 위한 데이터를 제공하는데 유용하다. 예를 들어, 시험 화합물이 없는 측정이 이미 프로브의 높은 수송이 있다는 것을 드러낸다면, 세포층은 본 발명의 방법에서 추가적인 사용을 위해 배제될 수 있다. 동시에, 본 실시양태는 "배경(background)" 활동을 결정할 수 있게 한다.
본 발명의 방법으로, 다수의 상이한 시험 조건을 일제히/동시에(즉, 하나의 동일한 실험 내에서) 측정하여 스크리닝 방법을 고려할 수 있게 되었다. 당업자는 "일제히(simultaneously)" 또는 "동시에(concurrently)"라는 단어가 동일한 실험 내에서 표시된다는 것을 이해한다. 동일한 실험 내에서 신호의 측정은 원하는 경우 순차적으로 또는 병렬로 수행될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 방법은 상피 세포를 포함하는 다중 미세유체 채널을 사용하여 동시에 수행될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 상기 미세유체 시스템은 적어도 3개, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 약 40, 96, 252, 384개의 미세유체 채널을 포함하고, 바람직하게는 상피 세포층 또는 관을 포함하는, 적어도 3개, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 약 40, 96, 252, 384개의 미세유체 채널이 동시에, 순차적으로 또는 병렬로 측정되는 것인 방법이다.
본 발명의 방법에 사용되는 프로브는 본 명세서에서 정의된 상피 장벽 기능을 결정하는데 적합할 수 있는 임의의 프로브일 수 있다. 상피 세포층을 가로 질러 확산을 검사하는데 사용되는 이러한 프로브는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 프로브의 잘 알려진 예로는, 루시퍼 옐로우(Lucifer yellow), 형광 표지된 덱스트란(dextran) 또는 이눌린(inulin), 예를 들어 플루오레세인(fluorescein) 또는 로다민(rhodamine) 접합된 덱스트란 또는 이눌린, FITC-접합된 덱스트란, TRITC- 접합된 덱스트란 및 FITC-접합된 이눌린을 다양한 분자량으로 포함한다. 사용되는 전형적인 분자량은 FITC 덱스트란의 경우 6kDA, 75kDA, 150kDa 또는 400kDA 이지만, 다른 분자량도 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 프로브가 사용되고, 예를 들어 각각의 프로브는 상이한 크기에 의해 및/또는 상이한 검출 가능한 라벨에 의해 특징지어진다. 예를 들어 FITC (Fluorescein isothiocyanate), 나노도트(nanodots), 로다민(tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC) 등과 같은 상이한 형광 그룹에 접합된 상이한 크기의 덱스트란 또는 이눌린이 사용될 수 있다.
명백히, 리포터 분자의 임의의 유형이 본 발명의 방법의 맥락에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 다음과 같다: 임의의 형광 물질로 형광 표지된 프로브(예를 들어, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 647, Oregon Green®, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 680, Fluorescein(FITC), Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 750, Cy®3, Alexa Fluor® 532, Pacific Blue™, Pacific Orange™, Alexa Fluor® 546, 쿠마린(Coumarin), Tetramethylrhodamine(TRITC), Alexa Fluor® 555, BODIPY® FL, Texas Red®, Alexa Fluor® 568, Pacific Green™, Cy®5, Alexa Fluor® 594, DNA stains, DAPI, SYTOX® Green, SYTO® 9, TO-PRO®-3, 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide), Qdot® probes, Qdot® 525, Qdot® 565, Qdot® 605, Qdot®655, Qdot® 705, Qdot® 800, 형광 단백질 라벨, R-Phycoerythrin(R-PE), Allophycocyanin(APC) 발현된 형광 단백질(Expressed fluorescent proteins), CFP, GFP(emGFP), RFP(tagRFP)) 등.
적절한 비-형광 발광 프로브는 GSH-Glo, MAO-Glo, Pgp-Glo, BacTiter-Glo, Viral Tox, GloNAD, (P)H-Glo, GSH-Glo 등을 포함한다.
비색(Colorimetric) 프로브는 AEC, AEC+, BCIP/NBT, DAB+, Fuchsin+, Permanent Red, Alamar Blue, MTT, Griess 등이 있다.
당업자는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 프로브를 선택하는 방법을 잘 알고 있다.
상기와 관련하여, 바람직한 실시양태에서 상이한 크기의 프로브가 단계 d)에서 제공되며, 바람직하게는 각각의 상이한 크기의 프로브는 상이한 형광 라벨로 표지된다.
또한, 여기서 과압(overpressure)은 프로브가 제공되는 측면(기저 또는 꼭대기)에 적용되며, 바람직하게 상기 과압은 상기 프로브가 제공되는 측면 또는 상기 프로브가 제공되는 측면에 대응하는 저장기(reservoirs)에, 다른 측면의 또는 다른 측면에 대응하는 저장기의 유체량과 비교하여, 더 많은 유체량을 첨가함으로써 실현되는 것인, 본 발명의 방법이 제공된다.
또한, 상기 겔은 우세하게 더 친수성인 채널에서 필라(pillars), 리지(ridges), 그루브(groves), 소수성 패치(hydrophobic patches) 또는 친수성이 적은 패치와 같은 모세관 압력 기술(capillary pressure techniques)의 수단에 의해 미세유체 채널에서 구조화되는 것인, 본 발명의 방법이 제공된다.
또한, 바람직하게는 청구범위 제19항의 방법에 있어서, 하나 이상의 프로브가 시험 화합물과 함께 또는 상기 시험 화합물의 첨가 후 시점에서 상피 세포에 제공되고, 여기서 상기 하나 이상의 프로브는 바람직하게는 광학 수단(optical means)에 의해 첫 번째 프로브와 구별될 수 있는 것인, 본 발명의 방법이 제공된다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였으므로, 하기의 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이며, 이는 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예
도 1은 미세유체 플랫폼에서 세포외기질에 대한 장벽의 분주를 나타낸다: A) 세포외기질(ECM)에 대해 세포 분주의 모식도. 2-레인(2-lane) 미세유체 플랫폼에서, ECM은 겔 채널에 분주된다. ECM의 경화 후, 세포는 배양 채널의 배양 배지에 분주된다. 플레이트는 중력에 의해 ECM이 세포가 위에 정착하는 것을 허용하도록 이의 측면으로 배양된다. 세포가 부착된 뒤, 관류(perfusion) 유동이 시작된다. 세포-형태 의존적으로, 세포의 장벽이 ECM에 대하여 형성되거나, 관형 구조를 형성하는 전체 배지 관류 채널을 코팅한다. B) 배지 관류 채널에서 관형 구조 형성의 예. 돼지 근위 세뇨관(proximal tubule) 세포인 LLC-PK1가 ECM에 대해 배지 관류 채널에 분주된다. 분주 1일 후, 세포층은 ECM에 대해 눕혀서 위상차 현미경(phase contrast microscopy)으로 관찰된다. 4일째 날, 세포는 배지 관류 채널의 모든 4면에 대해서 성장한다. 6일째 날, 융합성(confluent) 단층이 모든 방향에 형성된다.
도 2는 2-레인 미세유체 칩에서 장벽의 3D 공초점 이미지를 나타낸다: 개 근위 세뇨관 세포인 MDCK를 도 1에 서술한 바와 같이 2-레인 미세유체 장치에서 ECM에 대해 분주되었다. 장벽 형성을 위상차 현미경으로 관찰한 뒤, 세포를 생존 염료(viability dye) 칼세인-AM(Life Technologies, C1430)으로 염색하고, 생존 세포(viable cell) 형광 녹색(fluorescently green)으로 표지하였다. 고정한 뒤, 세포를 액틴레드(ActinRed, Life Technologies, R37112)로 염색하고, 공초점 현미경(Leica, TCS SP5 STED)으로 이미지를 얻었다. 3D 투영(projection)은 3D 뷰어 피지 플러그인(3D viewer Fiji plug in)(Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772)을 사용하여 생성하였다. 슬라이스(slice)는 ECM에 대한 세포의 융합성(confluent) 장벽의 형성을 보여준다. 장벽의 꼭대기 측면은 배지 관류 채널을 통해 접근할 수 있고, 이때, 기저 측면은 겔 채널로부터 자유롭게 접근된다.
도 3은 장벽 무결성 분석: 예를 들면, 도 1 및 2에서 서술한 바와 같이 재배된 세포 장벽의 무결성은 500 ㎍/㎖ FITC-덱스트란 150 kDa(Sigma, 46946)을 포함하는 배지에 의해 관류 채널에서 배지의 교체에 의해 조사될 수 있다. 만약 세포 장벽에 누출이 없으면 형광 신호는 관류 채널에 포함될 것이나, 세포가 없는 미세유체 칩에서, 단지 겔 채널 내의 ECM에서는 형광 신호가 ECM으로 들어갈 것이고, 이는 몇 분내로 포화될 것이다. 관류 및 겔 채널 내의 형광 신호는 저속 형광 현미경(time-lapse fluorescent microscopy), 예를 들면, 이미지X프레스 마이크로(ImageXpress Micro, Molecular Devices)를 사용하여 실시간으로 관찰될 수 있다. B) FITC-덱스트란 150 kDa의 형광 신호 무결성은 FIJI 분석 소프트웨어(Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772)를 사용하여 위쪽 관류 채널 내 및 겔 채널 내에서 정량화되었다. C) 겔 채널의 무결성은 위쪽 관류 채널의 무결성에 의해 나뉘고, 속도(rate)는 형광 리포터의 추가 시작 후 시간에 대해 표시되었다. 세포 장벽 없이, 상기 ECM은 염료의 추가 후 몇 분내에 포화되었으나, O에 가까운 그 속도는 세포 장벽이 보존되는 한 유지된다.
도 4는 스타우로스포린(staurosporin)에 노출된 LLC-PK1의 장벽 무결성 분석을 나타낸다: 돼지 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK1(ATCC, CL-101, 210 계대)을 콜라겐 I ECM(Cultrex, Amsbio, 3447-020-01, 4 ㎎/㎖)에 대해 200 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™(OrganoPlate™)의 위쪽 관류 채널에 10x106 cells/㎖로 분주하였다. 60 ㎕의 배지를 바닥 관류 채널의 입구 및 출구 배지에 첨가하였다. 세포가 ECM의 위에 정착하는 것을 허용하도록 플레이트는 밤새 이의 측면으로 배양되었다. 분주 1일째에 60 ㎕의 배지를 바닥 관류 채널의 입구(inlet) 및 출구(outlet) 배지에 첨가하고, 플레이트는 인큐베이터에 평평하게 두었다. 분주 4일 후, 플레이트를 지속적인 배지 관류를 위해 교반 플랫폼(rocker platform)에 두었다(7°, 매 8분마다 기울임). 분주 6일 후, LLC-PK1 세뇨관의 누출 방지를 500 ㎍/㎖ FITC-덱스트란 150 kDa(Sigma, 46946)를 포함하는 배지로 위쪽 관류 채널 내 배지를 교체함으로써 시험하였다. 부피는 위쪽 관류 채널에서 60 ㎕/40 ㎕, 중간 ECM 채널에서 0 ㎕/0 ㎕, 바닥 관류 채널에서 40 ㎕/40 ㎕ 표준 배양 배지였다. 추가 15분 뒤에 ECM 내에서 FITC-덱스트란 신호가 보이지 않는 세뇨관은 누출이 없는 것으로 고려되고, 스타우로스포린 노출을 위해 선택되었다. 위쪽 관류 채널 내 배지는 0, 1, 5 또는 10 μM의 팬-키아나제 억제제(pan-kinase inhibitor)인 스타우로스포린(Sigma, S4400) 및 500 ㎍/㎖ FITC-덱스트란 150 kDa을 포함하는 배지로 교체되었다. 부피는 위쪽 관류 채널에서 60 ㎕/40 ㎕, 중간 ECM 채널에서 0 ㎕/0 ㎕, 바닥 관류 채널에서 40 ㎕/40 ㎕ 표준 배양 배지였다. 플레이트는 5% CO2, 37℃, 가습된 인큐베이터 상태하에서 EVOS FL 오토(EVOS FL auto, Live Technologies)에 두었다. 미세유체 칩은 16시간 동안 매 15분마다 4x 배율로 위상차 및 형광(FITC) 이미지를 얻었다. 각각의 시점을 나타낸다. 스타우로스포린에 노출되지 않은 LLC-PK1 튜브는 실험 기간동안 누출되지 않았다. 스타우로스포린의 농도 증가와 함께 LLC-PK1 장벽의 무결성은 초기에 깨졌다.
도 5는 스타우로스포린에 노출된 LLC-PK1의 장벽 무결성 분석의 정량화를 나타낸다: FITC-덱스트란 150 kDa의 형광 신호 강도는 FIJI 분석 소프트웨어(Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772)를 사용하여 도 4의 위쪽 관류 채널 내 및 겔 채널 내에서 정량화되었다. 겔 채널의 강도는 위쪽 관류 채널의 강도에 의해 나뉘었고, 속도(rate)는 스타우로스포린 노출 시작 후의 시간에 대해 표시되었다. 속도의 증가는 LLC-PK1 장벽 무결성에서 구멍이 나타난 겔 채널 내에서 형광 신호의 증가를 의미한다.
도 6은 다른 기원의 신장 세뇨관 세포주를 이용하여 도 4에 서술된 바와 유사한 실험을 나타낸다. MDCK(개) 세포주를 콜라겐 I ECM(Cultrex, Amsbio, 3447-020-01, 4 ㎎/㎖)에 대해 400 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™(OrganoPlate™)의 위쪽 관류 채널에 10x106 cells/㎖로 분주하였다. 60 ㎕의 배지를 바닥 관류 채널의 입구 및 출구 배지에 첨가하였다. 플레이트는 세포가 ECM의 위에 정착하는 것을 허용하도록 3시간 동안 이의 측면으로 배양되었다. 분주 3시간 후, 60 ㎕의 배지를 바닥 관류 채널의 입구 및 출구 배지에 첨가하고, 플레이트를 지속적인 배지 관류를 위해 교반 플랫폼에 두었다(7°앵글, 매 8분마다 기울임). 분주 5일 후, MDCK 세뇨관의 누출 방지를 500 ㎍/㎖ FITC-덱스트란 150 kDa(Sigma, 46946)를 포함하는 배지로 위쪽 관류 채널 내 배지를 교체함으로써 시험하였다. 부피는 위쪽 관류 채널에서 40 ㎕ 입구/30 ㎕ 출구, 중간 ECM 채널에서 0 ㎕ 입구/0 ㎕ 출구, 바닥 관류 채널에서20 ㎕ 입구/20 ㎕ 출구 표준 배양 배지였다. 추가 15분 뒤에 ECM 내에서 FITC-덱스트란 신호가 보이지 않는 세뇨관은 누출이 없는 것으로 고려되고, 스타우로스포린 노출을 위해 선택되었다. 위쪽 관류 채널 내 배지는 0, 1, 4, 7 또는 10 μM의 팬-키아나제 억제제인 스타우로스포린(Sigma, S4400) 및 500 ㎍/㎖ FITC-덱스트란 150 kDa을 포함하는 배지로 교체되었다. 부피는 위쪽 관류 채널에서 40 ㎕ 입구/30 ㎕ 출구, 중간 ECM 채널에서 0 ㎕ 입구/0 ㎕ 출구, 바닥 관류 채널에서 20 ㎕ 입구/20 ㎕ 출구 표준 배양 배지였다.
플레이트는 5% CO2, 37℃, 가습된 인큐베이터 상태하에서 고화질 스크린 이미지X프레스 마이크로(분자 장치)[ImageXpress Micro XLS (Molecular Devices)]에 두었다. 미세유체 칩은 16시간 동안 매 15분마다 4x 배율로 위상차 및 형광(FITC) 이미지를 얻었다. 각각의 시점을 나타낸다. 스타우로스포린에 노출되지 않은 MDCK 튜브는 실험 기간동안 누출되지 않았다. 스타우로스포린의 농도 증가와 함께 MDCK 장벽의 무결성은 초기에 깨졌다.
도 7은 도 6으로부터 스타우로스포린에 노출된 LLC-PK1의 장벽 무결성 분석의 정량화를 나타낸다. FITC-덱스트란 150 kDa의 형광 신호 강도는 FIJI 분석 소프트웨어(Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772)를 사용하여 도 4의 위쪽 관류 채널 내 및 겔 채널 내에서 정량화되었다. 겔 채널의 강도는 위쪽 관류 채널의 강도에 의해 나뉘었고, 속도는 스타우로스포린 노출 시작 후의 시간에 대해 표시되었다. 속도의 증가는 MDCK 장벽 무결성에서 구멍이 나타난 겔 채널 내에서 형광 신호의 증가를 의미한다. 누출 시간에 따른 농도결정: 역치는 강도 속도(rate), 예를 들어, 0.4를 위해 설정될 수 있다. 각각의 노출된 화합물 농도를 위한 상기 속도에 상응하는 시점은 농도에 대해 표시된다. 누출 시간에 의존적이고, IC50 값과 비교 가능한 화합물의 특징적인 농도가 결정될 수 있다. 누출 시간 값(예를 들어, 화합물 추가 2시간 후)은 최대 생체 내 타당성을 보장하기 위해 검증 실험에 기초하여 결정될 수 있다. 상기 누출 시간 시점은 모든 화합물을 위한 동일한 값으로 설정되거나(IC50 값 그대로), 예를 들어, 화합물의 반감기에 의존적으로 만들어질 수 있다.
도 8은 도 7 그래프의 추가 데이터 해석을 나타낸다. 튜브가 형광 역치 속도(여기서 0.4로 설정)을 지나는 시점에서, 튜브는 구멍난 것이 고려된다. 장벽 무결성의 손실은 여기서 묘사된 바와 같이 생존플롯(survival plot)[카플란 메이어 플롯(Kaplan Meier plot)]으로 불리는 형태로 표시될 수 있다. 이런 접근은 정확한 EC50의 결정을 위해 충분한 데이터 포인트를 이용할 수 있을 때 특히 유용하다. 이의 예는 도 11에 나타냈다.
도 9는 스타우로스포린에 노출된 인간 소화관 세뇨관에서 누출 시간 장벽 무결성 분석을 위해 매시간 추출된 투여량 반응 곡선(dose response curve)을 나타낸다. Caco-2 세포주(Sigma, 인간 결장암 세포)는 400 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™(OrganoPlate™)에 106 cells/㎖로 분주되고, 2시간 동안 세포 및 ECM이 부착되도록 측면으로 둔 뒤, 지속적인 배지 관류를 위해 변형된 교반 플랫폼에 두었다. 분주 3일 후, Caco-2 세뇨관의 누출 방지를 0.25 ㎎/㎖ TRITC 덱스트란 150 kDa을 포함하는 배지로 위쪽 관류 채널 내 배지를 교체함으로써 시험하였다. 30분 동안 ECM 구획(compartment)으로 형광 염료 누출이 보이지 않은 세뇨관은 누출이 없는 것으로 고려되고, 화합물 노출에 사용되었다. 위쪽 배지 채널 내 배지는 TRITC-덱스트란 아스피린의 농도 증가를 포함하는 배지로 교체되었다. 플레이트는 온도 및 CO2가 조절된 조건하에서 이미지X프레스 마이크로 XLS에 두었고, 13시간 동안 매 시간마다 형광(TRITC) 신호 이미지를 얻었다. 투여량 반응 곡선은 Caco-2 튜브에 노출된 저속 촬영(time-lapse)으로부터 모든 시점에서 추출될 수 있다. 그래프패드 프리즘 6(GraphPad Prism 6)(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)이 0 및 100% 형광에서 위쪽 및 바닥 안정기(plateau)를 가정하여 화합물의 농도 대 표준화된 형광 로그의 비선형 회귀(nonlinear regression)에 기초하여 투여량 반응 곡선에 맞추기 위해 사용되었다. 노출 시간이 증가함에 따라 낮은 화합물 농도로의 이동이 관찰된다.
도 10은 시간 경과에 따라 도 9로부터 Caco-2 튜브의 투여량 반응의 EC50 값의 지수감소(exponential decrease)를 나타낸다. 이는 추출된 EC50 값을 시간에 대해 표시할 때 관찰된다. 추출된 ED50 값의 95% 신뢰구간은 노출의 3 및 13시간 사이의 강력한 데이터를 나타낸다.
도 11은 아스피린에 노출된 소화관 세뇨관의 장벽 기능 손실을 묘사한다. Caco-2 세포주(Sigma, 인간 결장암 세포)는 400 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™에 106 cells/㎖로 분주되고, 2시간 동안 세포 및 ECM이 부착되도록 측면으로 둔 뒤, 지속적인 배지 관류를 위해 변형된 교반 플랫폼에 두었다. 분주 3일 후, Caco-2 세뇨관의 누출 방지를 0.25 ㎎/㎖ TRITC 덱스트란 150 kDa을 포함하는 배지로 위쪽 관류 채널 내 배지를 교체함으로써 시험하였다. 30분 동안 ECM 구획으로 형광 염료 누출이 보이지 않은 세뇨관은 누출이 없는 것으로 고려되고, 화합물 노출에 사용되었다. 위쪽 배지 채널 내 배지는 TRITC-덱스트란 및 아스피린의 농도 증가를 포함하는 배지로 교체되었다. 플레이트는 온도 및 CO2가 조절된 조건하에서 이미지X프레스 마이크로 XLS에 두었고, 24시간 동안 매시간마다 형광(TRITC) 신호 이미지를 얻었다. 비록 아스피린이 소화관에서 덜 유독한 독성물질이었으나, 형광 데이터는 40 mM 및 12.12 mM의 농도에서 장벽 기능의 손실을 나타낸다. 그러나, 최대 반응을 보이는 농도에 대한 데이터가 부족하여 정확한 EC50의 추정이 어렵다. 카플란-메이어 커브가 여기서 묘사되었으나, 더 높은 농도에서 장벽 기능 손실의 매우 유의적인 경향을 나타낸다(곡선 차이 및 추세의 중요성 모두에서 P<0.0001). 오가노플레이트™-기초한 분석에서, 40 및 12 mM의 농도뿐만 아니라, 3.7 mM의 농도에서도 장벽 무결성의 명확한 손실이 관찰되었다. 비록 투여량 반응 곡선이 정확하게 맞춰질 수는 없지만, 50%의 영향이 40 mM로 10시간의 노출 및 12 mM로 20시간의 노출에서 관찰되었다.
도 12는 암포테세린 B(amphotecerin B)에 노출된 약물에 의해 유도된 인간 신장 근위 세뇨관의 장벽 무결성 손실을 카플란-메이어 플롯으로 나타낸다. 인간 근위 세뇨관 세포(RPTEC, Sigma)는 400 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™에 206 cells/㎖로 분주되고, 하룻밤 동안 세포 및 ECM이 부착되도록 측면으로 둔 뒤, 지속적인 배지 관류를 위해 변형된 교반 플랫폼에 두었다. 배양 8일 후, 분주된 세뇨관의 >95%가 루미날(luminal) 구획 내 배지에 FITC-덱스트란 150 kDa을 추가하여도 누출되지 않음을 보였다. 튜브 내의 배지는 신장 독성 물질인 암포테세린 B의 농도 증가 및 형광 FITC-덱스트란을 포함하는 배지로 교체되었다. 플레이트는 온도 및 CO2가 조절된 조건하에서 이미지X프레스 마이크로 XLS에 두었고, 60시간 동안 매시간마다 형광(FITC) 신호 이미지를 얻었다. 여기서 묘사된 튜브 무결성의 생존은 비노출된(배지, 비히클 대조군 1 및 비히클 대조군 2) 및 노출된 튜브 사이의 유의적인 차이를 나타낸다. IC는 3 유출 운송 억제제(efflux transporter inhibitor)의 억제제 칵테일을 나타낸다.
도 13은 세뇨관이 꼭대기(루미날) 또는 기저 측면으로부터 오직 독성 화합물에 노출되었을 때, 누출 시간 차이를 나타낸다. 3-레인 오가노플레이트™는 관형 구조의 꼭대기 또는 기저 측면으로부터만 화합물을 추가할 수 있는 특별한 가능성을 제공한다. 확산을 통해 수동적으로 세포 내로 들어갈 수 있는 화합물(예를 들어, 스타우로스포린)은 세포 흡수(uptake)의 방향성을 갖지 않는다. 능동적으로 운송된 화합물은 세포간 운송에서 방향성을 가질 수 있고, 이는 예를 들어, 신장 근위 세뇨관에서의 상황, 튜브의 꼭대기 측면으로부터 기저 측면으로, 또는 다른 방향으로 화합물이 특이적으로 움직이는 것은 신장 여과 기능의 부분이다. 이는, 근위 세뇨관 세포에 의해 능동적으로 운송된 독성 화합물이 노출 위치에 의존적으로 다른 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 항암제 시스플라틴(cisplatin)은 상피 단층의 기저 측면에 나타낸 OCT-2 수송체에 의해 흡수된다.
MDCK 세포는 콜라겐 I ECM에 대해 200 ㎛ 3-레인 오가노플레이트™의 위쪽 채널에 106 cells/㎖로 분주되었다. 분주 3일 후, MDCK 세뇨관은 위쪽 배지 채널 내 또는 바닥 배지 채널 내 중의 하나로부터 배지를 시스플라틴이 포함된 배지로 교체함으로써 꼭대기 또는 기처 측면 중 하나를 시스플라틴의 증가하는 농도에 노출시켰다. 노출 시작 시점에서, 위쪽 채널 내의 배지는 형광 누출 마커인 FITC-덱스트란 150 kDa과 함께 공급되었다. 플레이트는 온도 및 CO2가 조절된 조건하에서 이미지X프레스 마이크로 XLS에 두었고, 16시간 동안 30분마다 형광(FITC) 신호 이미지를 얻었다. 기저 측면으로부터 노출된 튜브에서의 노출 시간은 꼭대기가 노출된 튜브에 비해 유의적으로 빨랐다.
도 14a는 테노포비르(tenofovir)의 증가한 농도에 6일 동안 노출된 신장 근위 세뇨관의 장벽 무결성을 나타낸다. 노출 및 튜브 무결성의 형광이 판독된 뒤, 튜브 내의 배지를 신선한 독성 화합물이 포함된 배지로 교체하였고, 72시간 노출 후 결정된 도 14a와 동일한 튜브, 및 이전의 노출되지 않은 튜브의 무결성은 도 14b에 나타냈다.
도 15는 위쪽 배지 채널 내에 배양된 신장 근위 세뇨관과 함께 하나의 3-레인 오가노플레이트™에서 두 관형 구조의 공배양(co-culture)을 나타내었고, 이는 분주 9일 후에 튜브의 내강 내의 배지를 교체함으로써 형광 FITC-덱스트란 150 kDa으로 탐지되었다. 바닥 채널 내의 튜브는 내피 세포(HUVEC)를 포함하고, 9일째에 무결성은 TRITC-덱스트란 150 kDa으로 탐지된다. 중간 채널 내에서 ECM으로의 형광 프로브 누출은 도 15에 표시되었다.
도 16은 25일 이상 동일한 세뇨관에서 누출이 없음을 보이는 분주 후, 다른 날에 콜라겐 I ECM에 대해 400 ㎛ 2-레인 오가노플레이트™에 배양된 내피 튜브의 누출 방지를 나타낸다. 누출 없음은 다른 크기의 화합물을 위한 장벽 기능의 차이를 보이는 두 다른 크기의(FITE-덱스트란 150 kDa 및 TRITC-덱스트란 20 kDa)의 형광 표지된 덱스트란에 의해 추적된다.
이상으로 본 발명은 완전히 서술하였으므로, 통상의 기술자가 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 동일한 매개변수, 농도 및 조건의 넓은 범위 내에서 이를 동일하게 수행할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 이의 특정 실시예와 관련하여 설명되었으나, 추가 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적용을 포함하며, 이는 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술 내에서 공지된 또는 통상적인 관례에 있으며, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 다음과 같이 설명된 본질적인 특징에 적용될 수 있는 본 공개의 이탈을 포함한다.
저널 기사 또는 초록, 출판된 또는 이에 상응하는 특허 출원, 특허, 또는 기타 참고 문헌을 포함하는 본 공개에 인용된 모든 참고 문헌은 인용된 참고 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면 및 텍스트를 포함하여 본 명세서에 참고로 전체적으로 합체되며, 추가로, 본 명세서에 인용된 참고 문헌 내에서 인용된 전체 내용은 참고로 전체적으로 삽입된다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지되거나 통상적인 방법에 대한 언급은 어떤 방법으로도 허용되지 않으며, 이는 본 발명의 어떤 측면, 설명 또는 실시예에 의해 관련 기술분야에서 공개, 교시 또는 제안된다.
특정 실시예에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 나타낼 것이고, 다른 것들은 통상의 기술자의 지식을 적용함으로써(본 명세서에 인용된 참고 문헌의 내용을 포함하여) 과도한 실험 없이 본 발명의 개념을 벗어나지 않으면서 특정 실시예와 같은 다양한 적용을 변형 및/또는 적용할 수 있다. 따라서, 이와 같은 적용 및 변형은 본 명세서에 나타난 가르침 및 지침에 기초하여 공개된 실시예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 전문용어는 제한이 아닌 설명의 목적을 위한 것이며, 이와 같은 본 명세서의 전문용어 또는 어구는 본 명세서에 나타난 가르침 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되어야 하며 통상의 기술분야의 기술자의 지식이 조합으로 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (24)

  1. 하기 단계를 포함하는, 상피 장벽 기능(epithelial barrier function)에 대한 시험 화합물의 조절 효과(modulating effect)를 측정하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법:
    a) 다중 중공 미세유체 채널들(multiple hollow microfluidic channels)을 포함하는 미세유체 시스템(microfluidic system)을 제공하는 단계로, 여기서 상기 채널은 적어도 부분적으로 겔(gel)로 채워짐;
    b) 상피 세포를 미세유체 채널(microfluidic channel)에 도입하고 상피 세포를 겔과 접촉하게 하는 단계;
    c) 미세유체 채널에 도입된 상피 세포를 배양하는 단계로, 이로써 상기 세포가 꼭대기 측면(apical side) 및 기저 측면(basolateral side)을 갖는 세포층을 겔 상에 형성하도록 허용하고, 바람직하게는 미세유체 채널에서 세포가 꼭대기 측면 및 기저 측면을 갖는 관형 구조(tubular structure)를 형성하게 하는 단계;
    d) 미세유체 채널 상의 상피 세포에 프로브(probe) 및 시험 화합물을 제공하는 단계로, 여기서 상기 프로브 및 시험 화합물은 독립적으로 꼭대기 측면, 기저 측면, 또는 꼭대기 및 기저 측면 양쪽에 제공되는 단계;
    e) 미세유체 채널 또는 겔에서, 또는 미세유체 채널 및 겔 모두에서 프로브에 의해 제공된 신호를 다양한 시점(time point)에서 결정하는 단계.
  2. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 더 포함하는 방법:
    f) 시험 화합물 및/또는 프로브를 상피 세포로 제공한 시점(time point)에서, 미세유체 채널 및/또는 겔 상에서 미리 결정된 형광 값 또는 미리 결정된 형광 값의 변화에 도달한 시점(time point), 또는 미세유체 채널 및/또는 겔 상에서 미리 결정된 형광 비율 값 또는 미리 결정된 형광 비율 값의 변화에 도달한 시점(time point)으로 경과한 시간을 단계 e)에서 수득된 신호로부터 결정하는 단계.
  3. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험 화합물의 하나 이상의 농도에 대해 수행되고, 바람직하게는 상기 단계 f)가 시험 화합물의 하나 이상의 농도에 대해 결정되는 방법.
  4. 상기 어느 한 항에 있어서, 상피 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 효과는 배양된 상피 세포를 포함하는 하나 이상의 미세유체 채널에서 동시에 결정되며, 바람직하게는 상피 장벽 기능에 대한 시험 화합물의 하나 이상의 농도의 효과가 동시에(concurrently) 결정되는 것인 방법.
  5. 상기 어느 한 항에 있어서, 상피 장벽 기능에 대한 하나 이상의 시험 화합물의 효과가 배양된 상피 세포를 포함하는 다중 미세유체 채널의 적어도 일부에서 동시에, 독립적으로, 결정되는 방법.
  6. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에 앞서 또는 동시에 장벽 기능(barrier function)이 중단되는 방법.
  7. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 화합물은 상기 프로브의 처리 전, 후 또는 동시에 상기 세포에 제공되는 방법.
  8. 상기 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 배양된 세포가 단층(monolayer)을 형성하고, 바람직하게는 단층은 프로브가 꼭대기 측면에서 기저 측면으로 및/또는 기저 측면에서 꼭대기 측면으로 확산하는 것을 실질적으로 허용하지 않는 방법.
  9. 상기 어느 한 항에 있어서, 단계 e)에서 두 개의 연속적인 시점은 각각 1초 내지 24시간 내에 있는 방법.
  10. 상기 어느 한 항에 있어서, 단계 e)의 다양한 시점은 10분 내지 4주 사이에, 그리고 포함되는 기간 내에 있는 방법.
  11. 상기 어느 한 항에 있어서, 겔에 접하여 겔과 접촉하는 추가의 채널이 존재하고, 상기 채널은 배양된 상피 세포를 포함하는 미세유체 채널과 직접 접촉하지 않는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 추가 채널에, 겔로부터 프로브를 제거하는 유동(flow)이 존재하고, 바람직하게는 겔에서 단계 e)의 프로브에 의해 제공된 신호를 결정하는 단계는 상기 추가 채널 내에 존재하는 유동에서 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 상이한 유형의 상피 세포가 동일한 미세유체 채널에 도입되고, 및/또는 상기 단계 b)에서 상이한 미세유체 채널이 상이한 유형의 상피 세포로 제공되는 방법.
  14. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 겔은 기저막(basement membrane) 추출물, 세포외물질(extracellular matrix) 성분, 콜라겐(collagen), 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 바이트로넥틴(vitronectin), D-라이신(D-lysine), 엔탁틴(entactin), 헤파란 설파이드 프로테오글리칸(heparan sulfide proteoglycans) 또는 이들의 조합이고, 바람직하게는 상기 겔은 인공막(artificial membrane) 또는 확산 장벽(diffusion barrier)을 포함하지 않고/않거나 상기 겔은 둘로 분리하는 물리적 막 없이 세포층과 직접 접촉하는 것인 방법.
  15. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 상피 세포는 동물 상피 세포, 동물 상피 세포주 세포(epithelial cell line cells), 동물 상피 일차 세포(epithelial primary cells), 포유류 상피 세포, 포유류 상피 세포주 세포, 포유류 상피 일차 세포, 인간 상피 세포, 인간 상피 세포주 세포 또는 인간 상피 일차 세포인 방법.
  16. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 e)에서 프로브에 의해 제공된 신호를 결정하는 단계는 이미징 장치(imaging device), 현미경(microscope), 자동화된 현미경(automated microscope), 고해상도 이미저(high content imager), 플레이트 판독기(plate reader) 또는 다중모드 판독기(multimode reader)를 사용하여 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 장치는 미세유체 채널 및/또는 겔 및/또는 추가 채널에 연속적인 광학 경로(uninterrupted optical path)를 제공하는 방법.
  18. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 효과는 상피 장벽 기능을 파괴하거나 복구하는 것인 방법.
  19. 상기 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 시험 화합물이 제공되기 전에 프로브가 상피 세포에 제공되고, 바람직하게는 상기 프로브가 제공된 후에 미세유체 채널 또는 겔에서, 또는 미세유체 채널 및 겔 모두에서 제공된 신호가 다양한 시점에서 그리고 시험 화합물이 제공되기 전에 결정되는 것인 방법.
  20. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 시스템은 적어도 3개, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 약 40, 96, 252, 384개의 미세유체 채널을 포함하고, 바람직하게는 상피 세포를 포함하는, 적어도 3개, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 약 40, 96, 252, 384개의 미세유체 채널이 동시에, 순차적으로 또는 병렬로 측정되는 것인 방법.
  21. 상기 어느 한 항에 있어서, 상이한 크기의 프로브가 단계 d)에서 제공되고, 바람직하게는 상기 각각의 상이한 사이즈의 프로브는 상이한 형광 라벨로 표지되는 방법.
  22. 상기 어느 한 항에 있어서, 과압(overpressure)은 프로브가 제공되는 측면(기저 또는 꼭대기)에 적용되며, 바람직하게 상기 과압은 상기 프로브가 제공되는 측면 또는 상기 프로브가 제공되는 측면에 대응하는 저장기(reservoirs)에, 다른 측면 또는 다른 측면에 대응하는 저장기의 유체량과 비교하여, 더 많은 유체량을 첨가함으로써 실현되는 방법.
  23. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 겔은 우세하게 더 친수성인 채널에서 필라(pillars), 리지(ridges), 그루브(groves), 소수성 패치(hydrophobic patches) 또는 친수성이 적은 패치와 같은 모세관 압력 기술(capillary pressure techniques)의 수단에 의해 미세유체 채널에서 구조화되는 것인 방법.
  24. 제 19항에 있어서, 하나 이상의 프로브가 시험 화합물과 함께 또는 상기 시험 화합물의 첨가 후 시점에서 상피 세포에 제공되고, 여기서 상기 하나 이상의 프로브는 바람직하게는 광학 수단(optical means)에 의해 와 구별될 수 있는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL2020518B1 (en) 2018-03-02 2019-09-12 Mimetas B V Device and method for performing electrical measurements
WO2020195458A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 富士フイルム株式会社 測定装置、測定装置の作動プログラム及び測定方法
CN110793735B (zh) * 2019-11-08 2021-02-26 湖南科技大学 一种液态危险化学品泄漏模拟试验装置
NL2024202B1 (en) 2019-11-08 2021-07-20 Mimetas B V Microfluidic cell culture system
JP2022061818A (ja) 2020-10-07 2022-04-19 ウシオ電機株式会社 マイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイスの使用方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028033A2 (en) * 1998-11-10 2000-05-18 Digital Gene Technologies, Inc. Nucleic acids and polypeptides having altered expression in the t84 gut barrier model

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4829000A (en) 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
US4761381A (en) 1985-09-18 1988-08-02 Miles Inc. Volume metering capillary gap device for applying a liquid sample onto a reactive surface
US6156270A (en) 1992-05-21 2000-12-05 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membranes
EP0907412B1 (en) * 1996-06-28 2008-08-27 Caliper Life Sciences, Inc. High-throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US6637463B1 (en) 1998-10-13 2003-10-28 Biomicro Systems, Inc. Multi-channel microfluidic system design with balanced fluid flow distribution
US6601613B2 (en) 1998-10-13 2003-08-05 Biomicro Systems, Inc. Fluid circuit components based upon passive fluid dynamics
US8231845B2 (en) 2000-10-25 2012-07-31 Steag Microparts Structures for uniform capillary flow
EP1843849A2 (en) 2005-01-12 2007-10-17 Inverness Medical Switzerland GmbH A method of producing a microfluidic device and microfluidic devices
CA2607965A1 (en) * 2005-05-18 2007-02-22 Cornell Research Foundation, Inc. Pharmacokinetic-based culture system with biological barriers
US7312047B2 (en) * 2005-05-24 2007-12-25 University Of Southampton Screening assay for improvement of epithelial barrier function
US20070280856A1 (en) 2006-06-02 2007-12-06 Applera Corporation Devices and Methods for Controlling Bubble Formation in Microfluidic Devices
RU2012157399A (ru) * 2010-06-18 2014-07-27 КсайберСайенс ГмбХ Пептиды в качестве активных агентов для стабилизации биологических барьеров
SG10201601434RA (en) * 2011-02-28 2016-03-30 Harvard College Cell Culture System
GB201103917D0 (en) * 2011-03-08 2011-04-20 Univ Leiden Apparatus for and methods of processing liquids or liquid based substances
WO2013086329A1 (en) * 2011-12-08 2013-06-13 Research Triangle Institute Human emulated response with microfluidic enhanced systems
JP2015509382A (ja) * 2012-03-07 2015-03-30 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 組織構築体およびその使用
US9513280B2 (en) * 2012-08-28 2016-12-06 University Of Utah Research Foundation Microfluidic biological barrier model and associated method
US9588106B2 (en) * 2012-09-05 2017-03-07 The University Of Chicago Methods and compositions for measuring cell permeability
GB2505706A (en) 2012-09-10 2014-03-12 Univ Leiden Apparatus comprising meniscus alignment barriers
US20140363883A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-11 BellBrook Labs Device for cell culture and direct imaging
CN104031878A (zh) * 2014-05-16 2014-09-10 浙江大学 通过lps刺激建立的大鼠及猪肠道上皮细胞的综合模型

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000028033A2 (en) * 1998-11-10 2000-05-18 Digital Gene Technologies, Inc. Nucleic acids and polypeptides having altered expression in the t84 gut barrier model

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Duinen et al., Current Opinion in Biotechnology, Vol. 35, 2015, pp. 118-126. *
Thuenauer et al., Analyst, Vol. 139, 2014, pp. 3206-3218.* *
Trietsch et al., Lab on a Chip, Vol. 13, No. 18, 2013, pp. 3548-3554. *

Also Published As

Publication number Publication date
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