KR20180023504A

KR20180023504A - 제럼본을 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20180023504A
Application number: KR1020160108986A
Authority: KR
Inventors: 임지홍; 고현명; 곽근창; 오택인
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2018-03-07

Abstract

본 발명은 제룸본을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제럼본(Zerumbone)은 MITF의 mRNA 전사를 억제하고, MITF 및 티로시나아제의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 저해하는 효과가 있다.

Description

제럼본을 함유하는 피부 미백용 조성물 {Skin whitening composition containing zerumbone}

본 발명은 제룸본을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

생체 내 존재하는 멜라닌은 피부의 색상을 변화시키는 주요한 생물학적 색소로서 작용한다. 멜라닌은 멜라노좀이라는 세포에 의해 만들어지며, 피부 기저층에 존재하는 멜라노 사이트에서 멜라노좀과 멜라닌이 생성되게 된다. 피부의 멜라닌 생합성에는 다양한 기전들이 연관되어 있는데 그 중에서도 자외선에 의한 자극으로 p53유전자가 만들어 내는 알파-멜라노사이트-조절호르몬에 의한 조절과, 이 호르몬에 의해 증가된 마이크로프탈미아 연합 전이 요소(MITF)가 멜라노좀 안에 존재하는 타이로시네이즈의 활성화를 촉진하고, 활성화된 타이로시네이즈에 의해 DOPA의 하이드록실레이션 과성이 개시되며, 타이로시네이즈 하위 단백질들인 TRP1과 TRP2에 의해 멜라닌 생합성을 촉진 및 조절하게 된다. 최종 산물인 멜라닌은 표피 세포 안으로 들어가 자외선과 같은 피부 자극 물질로부터 피부세포를 보호하는 역할을 수행하게 된다. 그러나 멜라닌 합성의 과다 촉진은 피부 색을 과색소침착과 염증성 침착과 같은 기전을 일으키게 된다.

현재 피부 미백에 효과적으로 알려진 대표적인 물질은 알부틴(Arbutin)과 누룩산(Kojic acid)이 피부 미백에 효과적으로 알려진 물질이다. 허나 알부틴은 하이드로퀴논(Hydroquinone)기를 가지고 있어 멜라노사이트에 대한 독성이 알려져 있으며, 누룩산(Kojic acid)의 경우 2.5%의 농도에서 피부염을 유발 시키는 것으로 밝혀졌으며, 2010년 1%의 농도에서도 색소접촉피부염을 발생시킨다는 논문이 발표되었다. 이러한 문제로 인해 미백효과를 기대하는 물질에 있어서 피부에 대한 독성과 부작용의 문제로 인해 사용이 어렵다는 문제가 많다. 이에 최근 연구에서는 피부에 자극을 최소화 하면서 천연물에서 추출 혹은 정제한 피부 미백 물질 개발연구가 중심을 이루고 있다.

생강(Ginger)은 (Zingiber officinale Roscoe)라는 학명을 가지는 식물의 뿌리줄기로서 향신료, 식용, 약용으로 주로 사용되고 있다. 한방에서는 생강을 감기와, 식중독에 효과가 있다고 보고하고 있으며, 또한 소화장애와 혈액순환 촉진에 효과가 있음이 보고되고 있다. 특히나 생강의 향기성분을 많이 가지고 있는 생강의 정유에는 진지베롤(zingiberol), 휴물렌(Humulene), 제럼본(Zerumbone) 등 다양한 물질들을 가지고 있는 것으로 알려져있다. 이러한 정유 성분 중 제럼본은 활성 산소 억제와 항염증, 항암효과가 있는 것으로 알려져 있지만, 피부 미백에 연관된 치료 활성에 대해서는 아직 연구 보고된 바가 없다.

따라서 본 발명자들은 부작용이 없고 안전한 천연 물질로부터 추출한 제럼본을 이용, 피부 미백에 있어서 우수한 효과를 가지고 있다는 것을 확인하였으며, 추가적으로 알부틴과 누룩산보다 효과가 더 우수함을 입증, 제럼본이 피부 미백에 우수한 효과가 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

공개특허공보 10-2010-0072398호

본 발명의 목적은 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부 미백용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 미백용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부 미백용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 제럼본(Zerumbone)은 MITF의 mRNA 전사를 억제하고, MITF 및 티로시나아제의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 저해하는 효과가 있다.

도 1은 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 세포에 제럼본 (10μM 및 20μM)을 처리할 경우 세포 외부 및 내부 멜라닌 샘플의 색상 변화를 육안으로 관찰한 사진이다.
도 2는 대조군(알부틴 및 코지산) 및 제럼본 처리에 따른 세포 외부 및 내부의 멜라닌 함량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 MITF RNA의 변화량을 특정한 결과이다.
도 4는 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 티로시나아제 및 DCT의 변화량을 측정한 결과이다.
도 5는 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 티로시나아제 활성 변화량을 측정한 결과이다.
도 6은 제럼본의 처리량에 따른 세포 생존율 결과를 측정한 그래프이다.
도 7은 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 MITF 및 티로시나아제 발현량을 웨스턴블롯으로 측정한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

화장료 조성물

[화학식 1]

상기 제럼본은 "(2E,6E,10E)-2,6,9,9-테트라메틸사이클로운데카-2,6,10-트리엔-1-온"으로 명명될 수 있다.

미백 성분을 실제 피부에 적용시, 우수한 미백 효과를 발휘하기 위해서는 저농도에서 고활성의 피부 미백 효과를 나타내고, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 우수하고, 미백 효과를 나타내기에 충분한 시간 동안 머무를 수 있도록 휘발성이 낮고, 조성물이나 피부 상에서 활성 성분이 안정하게 유지되고, 의약이나 화장품으로의 제형화가 용이하며, 또한 피부에 안전한 것이 바람직하다. 그러나 공지의 미백 성분 중 상기 특성을 모두 만족시키는 미백 성분은 흔치 않다. 예를 들어, 몇몇 미백 성분들은 시험관 내 실험에서는 저농도에서도 미백 활성이 우수하나, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 떨어져 실제 피부에 적용하기 어렵다. 또 다른 미백 성분들은 친수성이 낮아 화장품이나 의약품으로 제형화가 어렵다. 또한 몇몇 미백 성분들은 열, 광 또는 산소에 노출되었을 때 미백 성분이 분해되거나 다른 화합물로 변형되어 피부에 적용하기 전에 이미 미백 효과가 사라지는 경우도 있다.

그러나 본 발명의 상기 화학식 1의 제럼본은 MITF의 mRNA 전사를 억제하고, MITF 및 티로시나아제의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 저해하는 효과가 우수한 것으로 나타났고, 특히 현재 미백 용도로 사용되고 있는 알부틴 및 코지산에 비해서도 미백효과가 우수한 것으로 나타났으며, 20 μM 이상의 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않아서 피부에 매우 안전한 것으로 나타났다.

본 발명에 있어서, '미백'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색 반점 또는 검버섯 등을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 제럼본을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~90 중량부의 양으로 함유할 수 있으나, 바람직한 미백 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시킬 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 화합물의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화합물을 포함해도 무방할 것이다.

본 발명의 일 구현에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

상기와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

건강식품 조성물

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

약학적 조성물

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 피부 미백용 약학 조성물은, 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물을 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. 산 부가염 이외에도, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 3차-부틸아민과 같은 염기 부가염도 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 약학 조성물의 제형에 있어서, 유효성분의 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다.

본 발명에 의한 약학 조성물은, 유효성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 첨가하여 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 경구 등으로 투여할 수 있다. 비경구 투여 루트로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소도포가 가장 바람직하다. 예를 들어, 반창고 형태로 제조하여 붙일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제형으로는, 연고, 크림, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 비롯하여 약학적 제제에 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다.

본 발명에 의한 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 0.001 내지 1000 ㎎/Kg·day일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분인 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시약 및 재료

본 실험에 사용한 cell culture plate는 SPL사의 제품을 사용하였으며, α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine), DMEM(Tryrosinase from mushroom, Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High Glucose), DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), L-DOPA, Arbutin, Kojic acid는 Sigma aldrich korea 제품을 이용하였으며, FBS는 ATCC사의 제품을 사용하였다. Antibody β-tubulin, Tyrosinase는 Santa cruz사의 제품을 사용하였으며, MITF는 cell signaling의 제품을 사용하였다.

세포배양

B16F10 cell은 한국 세포주은행에서 분양받아 연구를 진행하였다. Heat inactivated FBS 10%와 100 units/ml, 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM에 37℃ 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다.

세포 생존율 측정 (Cell viability assay)

세포 생존율 측정은 Crystal violet(Sigma aldrich) 용액을 이용하여 측정하였다. 6 well plate에 2.5 x 10⁵/ml로 각 well 당 2 ml씩 분주하여 24시간 동안 plate에 안정화 후 Vehicle군을 제외한 sample군에 α-MSH 200 nM & IBMX 100 μM를 첨가한 media로 변경해 주었으며, Arbutin 1 mM, Kojic acid 200 μM, Zerumbone 5 μM 및 10 μM, 20 μM을 처리한 후 72시간 동안 배양하였으며, 배양된 세포를 PBS세척 후 4% 파라포름알데히드 용액(Paraformaldehyde solution)에서 10분간 고정(fixation)을 진행한 후 0.5% crystal violet 용액을 이용하여 10분간 염색을 진행하였다.

외부 및 내부 멜라닌 함량 측정 (Extra & Intra melanin content assay)

세포배양은 세포 생존율 측정시와 동일하게 진행하였으나 phenol red가 없는 배지를 이용하였다. 세포 외부 멜라닌은 배지의 색상을 405 nm에서 측정하였으며, 세포 내부 멜라닌은 1N NaOH용액을 이용하여 세포 내 멜라닌을 용출시킨 후 80℃에서 1시간 동안 멜라닌을 용해 시킨 후 405 nm의 흡광도로 측정하였다.

세포 내 티로시나아제 활성 측정 (Inter cellular tyrosinase activity assay)

세포배양은 동일하게 진행하였으며, 72시간 경과 후 DPBS로 세척 후 Triton X-100 (1%)의 용액을 이용하여 4℃에서 10분간 배양한 후 12000 x g로 20분간 원심분리 후 상층액(supernatent)만을 분리시킨 후 Bradford assay를 이용하여 단백질을 정량한 후 동일한 양의 세포 단백질과 1mM의 L-DOPA(2mg/ml)와 혼합한 후 475 nm에서 티로시나아제 활성(Tyrosinase activity)을 측정하였다.

총 RAN의 분리 및 cDNA 합성 (Isolation of total RNA and cDNA synthesis)

분리에는 Trizol(ambion) 제품을 사용하였다. 6 well plate에 Trizol 1 ml씩 분주 후 분리를 진행하였으며, 클로로포름 용액 200 μL씩 넣은 후 voltexing을 10초간 진행하였다. 4℃에서 5분간 반응 후 12000 x g로 15분간 원심분리를 진행하였다. 이후 상층 액을 분리한 후 상층 액과 동일한 양의 Isoprophanol을 넣은 후 2분간 반응시킨 후 12000 x g로 20분간 원심분리를 진행하였다. 상층액 제거후 70% 에탄올 500 μL를 넣은 후 7000 x g로 10분간 세척해준 후 air dry를 한 후 DEPC-treated water(ambion)을 이용하여 RNA을 녹여주었다. RT-PCR시료에 들어갈 RNA는 최종 2 μg으로 사용하였으며, cDNA 합성 protocol은 Applied biosystem의 protocol을 이용하였다(P/N:4368814).

정량 PCR (Quantitative PCR )

Q-PCR에 사용된 primer는 Integrated DNA technologies사에 주문하여 사용하였다. MITF 서열은 Sense: 5'-CATCATCAGCCTGGAATCAA-3', antisense: 5'-TCAAGTTTCCAGAGACGGGT-3'이며, Tyrosinase 서열은 Sense: 5'-TCTTCACCATGCTTTTGTGG-3', antisens: 5'-ATAGGTGCATTGGCTTCTGG-3'이다. Final volume 0.1 μg/μL의 RNA에서 합성된 cDNA를 DEPC-treated water에 1/10로 희석시킨 후 사용하였으며, Primer는 20 nM, cDNA는 60 ng을 2x sybr green mixer(Elpis)와 섞은 후 Final volume 20 μL로 Q-PCR을 진행하였다. 95℃에서 10분 반응 후 95℃에서 0.25분 60℃ 1분, 40 cycle로 반응시켰다. Melt curve는 65℃에서 95℃까지 0.05초 마다 0.5℃씩 상승시켜 확인하였다.

< 실험예 1> 제럼본(Zerumbone)의 멜라닌 생성 억제 평가

제럼본(Zerumbone)의 멜라닌 합성 억제 효능을 알아보기 위해 B16F10 세포에서의 외부로의 멜라닌 방출량과 세포 내의 멜라닌 생성량을 측정하였다.

구체적으로, B16F10 세포에 200nM의 α-MSH용액과 100μM의 IBMX를 co-treat를 하여 멜라닌 합성을 유도하고, Zerumbone을 10 및 20μM의 농도로 처리한 후 멜라닌 생성에 따른 색상 변화를 육안으로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 현재 미백에서 사용 중인 Arbutin(1mM) 과 Kojic-acid(200μM)를 처리하였고, Zerumbone을 5,10μM로 처리하여 72시간 이후 외부방출 멜라닌과 내부의 멜라닌 생성량의 차이를 확인, 대조군과 비교하여 상대적인 멜라닌 생성량을 그래프화 하였다. 용출된 멜라닌을 405nm의 흡광도로 측정하여 GraphPad Prism program을 이용하여 그래프화 하였으며, 3회 반복 실험하여 통계치를 계산한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 1은 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 세포에 제럼본 (10μM 및 20μM)을 처리할 경우 세포 외부 및 내부 멜라닌 샘플의 색상 변화를 육안으로 관찰한 사진이다.

도 2는 대조군(알부틴 및 코지산) 및 제럼본 처리에 따른 세포 외부 및 내부의 멜라닌 함량을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 제럼본 처리 군에서 대조군보다 멜라닌 색소가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실제로 미백에서 사용되고 있는 알부틴(Arbutin)과 코지산(Kojic-acid)과의 비교를 통해 미백 소재로서의 가능성을 확인한 결과 알부틴과 코지산과 유사한 효능을 보이거나 알부틴 보다 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> 제럼본(Zerumbone)의 멜라닌 생성 mRNA의 생성 억제 평가

제럼본의 멜라닌 합성을 억제 효능의 기전을 파악하고자 B16F10 세포에 α-MSH와 IBMX를 처리한 후 멜라닌을 생성시키는 유전자인 MITF 유전자와 Tyrosinase, DCT의 변화량을 측정, 그 변화를 확인하였다.

구체적으로, B16F10 세포에 α-MSH와 IBMX를 처리와 함께 미백효과 물질을 2시간 동안 처리 후, total RNA를 추출한 후 cDNA를 합성, sybr green q-PCR을 이용하여 MITF RNA의 변화량을 측정하였다. α-MSH와 IBMX를 처리하지 않은 대조 군의 total MITF RNA의 값을 1의 값으로 정했을 경우 그 변화수치를 비교하여 다음과 같은 그래프로 수식화하였다(도 3).

또한, B16F10 세포에 α-MSH와 IBMX를 처리와 함께 미백효과 물질을 48시간 동안 처리 후, total RNA를 추출한 후 cDNA를 합성, sybr green q-PCR을 이용하여 Tyrosinase, DCT RNA의 변화량을 측정하였다. 도 3과 같은 방법으로 α-MSH와 IBMX를 처리하지 않은 대조군의 total RNA의 값을 1의 값으로 정했을 경우 그 변화수치를 비교하여 다음과 같은 그래프로 수식화하였다(도 4).

도 3 및 도 4의 결과는 GraphPad Prism program을 이용하여 그래프화하였으며, 3회 반복 실험하여 통계치를 계산하였다.

도 3은 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 MITF RNA의 변화량을 특정한 결과이다.

도 4는 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 티로시나아제 및 DCT의 변화량을 측정한 결과이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 실험결과 제럼본 10μM에서 MITF RNA level이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, 그 감소량은 현재 미백에서 사용되고 있는 알부틴, 코지산 보다 효과가 높은 것으로 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 멜라닌 합성에 또한 인자의 티로시나아제와 DCT의 변화 또한 제럼본을 사용한 실험 군에서 우수한 미백효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 제럼본(Zerumbone)의 티로시나아제( tyrosinase ) 활성 억제 평가

제럼본이 실제 세포내의 티로시나아제의 활성도를 감소시키는지 확인하기 위해 멜라닌 생성을 유도한 B16F10 세포를 미백 효능 물질을 처리 후 72시간 동안 배양한 후 세포 내 총 단백질을 용출한 후 티로시나아제와 반응하는 L-DOPA를 이용하여 티로시나아제의 활성도를 측정하였다.

구체적으로, B16F10 세포에 α-MSH와 IBMX를 처리 후 미백 소재를 처리, 72시간 동안 배양한 후 1%의 Triton X-100을 이용하여 세포 내 총 단백질을 얻었으며, 얻은 단백질을 L-DOPA와 반응한 후 475nm의 흡광도에서 그 변화량을 측정하였다. α-MSH와 IBMX를 처리하지 않은 대조군의 값을 1의 값으로 정했을 경우 그 변화수치를 비교하여 그래프로 수식화하였다(도 5). 각 실험은 3회 반복하여 실험한 통계치를 수치화 하였다.

도 5는 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 티로시나아제 활성 변화량을 측정한 결과이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 티로시나아제의 활성도를 측정한 결과 제럼본이 현재 사용되고 있는 미백소재인 코지산 보다 티로시나아제의 활성도를 감소시키는 것으로 확인하였다.

< 실험예 4> 제럼본(Zerumbone)의 세포독성 평가

이전 실험에서 제럼본이 미백소재로서의 잠재성에 대해 실험하였으며 추가적으로 제럼본의 세포독성을 확인하기 위해 세포사를 측정하는 세포 생존율을 측정하였다.

도 6은 제럼본의 처리량에 따른 세포 생존율 결과를 측정한 그래프이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 실험에서 사용농도인 5, 10 μM에서의 제럼본의 독성은 크게 나타나지 않은 것으로 확인되었으며, 50 μM의 농도에서 세포 독성이 크게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 제럼본의 미백효과는 세포독성으로 인한 유전자 저해적 작용이 아니라는 것을 확인하였다.

< 실험예 5> 제럼본(Zerumbone)의 멜라닌 생성 인자들의 단백질 발현 평가

멜라닌 생성을 유도한 B16F10 세포에서 멜라닌 생성 인자들의 단백질 발현을 확인하기 위해 웨스턴블롯 실험법을 이용하여 단백질의 변화량을 측정하였다.

구체적으로, B16F10 세포에 α-MSH와 IBMX를 처리하여 미백에 사용되고 있는 알부틴 및 코지산과 비교하여 웨스턴블롯 실험법을 이용 단백질의 변화량을 확인하였다. 튜블린(Tubulin)은 정량의 지표로 사용하였으며, 총 단백질에는 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.

도 7은 멜라닌 생성이 유도된 B16F10 세포에 대조군(알부틴 및 코지산)과 제럼본을 처리할 경우 MITF 및 티로시나아제 발현량을 웨스턴블롯으로 측정한 도면이다.

도 7에 나타난 바와 같이, 현재 미백 용도로 사용되고 있는 알부틴(1 mM)과 코지산(200 μM)는 큰 변화를 확인할 수 없었으나, 제럼본의 경우 MITF의 발현량이 감소하는 것을 확인하였으며, 티로시나아제 또한 α-MSH와 IBMX를 처리한 대조군 대비 감소하는 것을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크 로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제럼본은 MITF의 mRNA 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제럼본은 MITF 및 티로시나아제 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 건강식품 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 제럼본(Zerumbone)을 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물.
[화학식 1]