KR20180021328A

KR20180021328A - 유방암 예후 예측용 바이오마커

Info

Publication number: KR20180021328A
Application number: KR1020160105401A
Authority: KR
Inventors: 박상규
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2018-03-02
Also published as: KR101943157B1

Abstract

본 발명은 유방암의 예후를 예측하기 위한 유전자 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 유방암의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 상기 유전자 바이오마커를 이용하여 유방암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템 및 상기 유전자 바이오마커를 타겟으로 하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자에서 본 발명의 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 예후 예측결과에 따라 유방암의 불량한 예후에 관여하는 해당 유전자 바이오마커의 발현을 억제할 수 있으므로, 유방암 환자를 보다 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

유방암 예후 예측용 바이오마커{Biomarkers for Predicting Breast cancer}

전사인사(Transcription factor, TF)는 다양한 세포 공정 중에 그것의 DNA 결합 인자에 결합함으로써 표적 유전자의 전사를 억제 또는 활성화시킨다. KRAB-ZFPs(Kruppel-like associated box-zinc finger proteins)은 DNA 결합 패밀리 단백질(protein family)의 일원이다. KRAB-ZFPs는 N-말단 영역에 KRAB 도메인 및 C-말단 영역에 C₂H₂-타입 아연 집게 모티브를 보존하고 있다. KRAB-ZFPs는 하나 또는 이상의 KRAB A 박스, 및/또는 KRAB B 박스, 또는 SCAN-도메인, KRAB-ZFPs의 작은 부분집합(subset)에서 발견되는 루신-풍부영역(leucine-rich region)을 가지고 있다. 최근, ZNF의 KRAB 도메인은 표적 유전자의 전사 억제의 결과로, 단백질-단백질 상호작용을 통해 보조억제자 단백질 및/또는 TF에 결합하는 것으로 알려졌다. KRAB-ZFPs는 해당 DNA 공통서열에 결합하여 유전자 발현을 침묵시키는, 염색질(chromatin) 리모델링 복합체의 매개자뿐만 아니라 보조억제자 중 하나인, KRAB-관련 단백질 1(KAP1)과 복합체를 형성한다.

ZNF224는 N-말단 영역의 KARB A 도메인, KRAB B 도메인 및 19개의 종열적으로(tendemly) 반복된 C₂H₂-타입 아연집게 모티브로 구성된 전사인자이다. ZNF224의 대안적인 스플라이스(splice) 변이체인, ZNF225는 상기 KRAB 도메인이 결여되어 있으나, 19개의 아연집게 도메인을 포함하고 있다. 그것들은 배치(localization)에 다소 차이가 있다. ZNF225가 인(nucleoli)에 관련된 subnuclear 구조로 배치되어 있는 반면, ZNF224는 핵 안 및 또한 세포질 안에서 균일하게 분포되어 있다. ZNF224와 윌름 종양 억제 유전자(Wilms' tumor suppressor gene, WT1)의 상기 핵 상호작용은 WT1 표적 유전자의 발현을 증가시키는 반면, ZNF225는 WT1과 함께 RNA 성숙 및 가공에 주로 관여한다.

ZNF224는 Aldolase A 유전자의 전자 억제를 선도하면서, KAP1 및 타입 Ⅱ 단백질 아르기닌 메틸트렌스퍼레이즈(protein arginine methyltransferase, PRMT5)와 복합체를 형성함으로써, 전자 억제제로 기능한다. 뿐만 아니라, ZNF224는 미토콘드리아 시트르산 캐리어 유전자의 전사를 억제한다. 흥미롭게, ZNF224는 Bax, Bak, 비타민 D 수용체(Vitamin D receptor, VDR), bag3, 및 A1/Bfl1을 포함한 호세포사멸(proapoptotic) 및 항세포사멸(antiapoptotic) 유전자의 조절에 있어서 WT1의 보조 활성화제로서 역할을 한다. 더욱이, DEP 도메인 포함 1(DEP domain containing 1, DEPDC1)은 ZNF224에 의해 A20 전사를 억제한다. 그러나, ZNF224/DEPDC1 복합체의 중단 시, 상기 A20 mRNA 발현은 증가된다. 이러한 결과는 ZNF224가 단백질 의존적 또는 암 유형 의존적 상호작용에서 종양단백질(oncoprotein) 또는 종양 억제제로서 기능한다는 것을 암시한다.

본 발명자들은 ZNF224가 종양단백질(oncogenic protein)로써 기능할 수 있는지 여부를 첫번째로 결정했다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 표적 유전자 및 MCF-7 세포에서 ZNF224에 의해 인지되는 DNA 공통서열을 특정하기 위해 노력했다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 ZNF224에 의해 인지되는 상기 공통서열이 miR-663a 프로모터의 -500bp 내에 존재한다는 것을 밝혀냈고 ZNF224가 miR-663a의 발현을 증가 또는 감소시키는지 여부를 조사했을 뿐만 아니라, 인간 유방암 세포를 이용하여 ZNF224 및 miR-663a의 발현을 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명자들은 유방암 예후 예측을 위한 유전자를 밝혀내고자 노력하였다. 그 결과, ZNF224가 유방암 세포에서 특이적으로 발현이 증가하고, miR-663a의 발현을 증가시키며, 상기 miR-663a의 증가된 발현 수준은 불량한 예후와 관련이 있음을 규명하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, ZNF224 유전자를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 ZNF224와 CAGC를 포함하는 염기서열의 결합을 저해하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 ZNF224 유전자를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 본 발명이 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커가 특이적으로 결합하는 결합자리(binding site)는 5'-CAGC-3'인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 정량적 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 ZNF224와 CAGC를 포함하는 염기서열의 결합을 저해하는 것을 확인하는 단계; 를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제 스크리닝 방법은 c) 대조군 시료와 비교하여 miR-663a 발현량이 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 물질은 바이오마커에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커의 단백질 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 ZNF224는 전사 활성화제로서 miR-663a를 통해 p53 및 p21의 발현을 감소시킴으로써 세포 생존 및 세포사멸 저항성을 유도한다는 점을 이용하여 ZNF224 유전자를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커를 제공하고자 한다.

따라서, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 유방암 환자의 유방암 재발 및 사망률을 감소시켜 유방암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 ZNF224의 MCF-7 세포에서의 콜로니 형성 능력 나타내는 그래프 및 RT-PCR, 웨스턴 블랏팅 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 ZNF224 과발현 세포주 및 ZNF224 넉다운 세포주의 세포 생장 및 세포사멸 저항성을 나타내는 것이다.
도 3은 ZNF224 DNA가 결합하는 모티브 특성 및 ZNF224 농도에 따른 루시퍼라아제 활성 여부를 나타낸 결과이다.
도 4는 ZNF224와 결합하는 miR-663a 프로모터 영역의 염기서열 및 ZNF224 농도에 따른 miR-663a 전사 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5는 ZNF224가 miR-663a를 통해 p21 및 p53의 프로모터 활성을 조절하는 것에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 ZNF224가 miR-663a를 통해 p21 및 p53의 발현을 조절함으로써 세포 생장을 조절하는 것에 대한 결과는 나타낸 것이다.
도 7은 유방암 환자의 조직의 암 영역과 비-암영역을 항-ZNF224 항체를 사용하여 면역조직화학 및 H&E 염색한 결과 및 암 영역과 비-암영역으로부터 분리된 ZNF224 mRNA 발현, miR-663a 발현, p53 mRNA 발현량을 비교한 그래프이다.
도 8은 Chip-seq library에서 ZNF224 enriched region의 분포에 관한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 17은 Znf224 풍부 영역 근처(1<kb)를 포함하는 유전자 정보를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, p53 및 p21은 세포 주기와 세포사멸을 조절하는 단백질로 암 발생과 깊은 관련이 있으며 유방암 세포에서 상기 p53과 p21의 발현을 조절하는 새로운 전사인자 ZNF224를 분자적 수준에서 분석함으로써 유방암 예후 예측 및 적절한 치료 방법에 대한 방향성을 제시하는 효과가 있다.

본 발명은 ZNF224 유전자를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 이를 이용해 유방암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 유방암 환자의 유방암 재발 및 사망률을 감소시켜 유방암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 유방암의 불량한 예후에 관여하는 유전자 ZNF224가 온코진(oncogene)으로서 기능하는지 여부를 결정하기 위해, ZNF224 유전자를 유방암 세포 주인 MCF-7 세포로 형질주입(transfection)시키고 콜로니 형성 분석을 실시하였다. 도 1A는 대조군과 ZNF224가 형질주입된 MCF-7의 콜로니 수를 비교한 그래프이고 도 1B는 RT-PCR 및 웨스턴 블랏팅을 통해 MCF-7에서의 ZNF224 단백질 발현 수준을 비교한 결과이다. 도 1A 및 도 1B를 통해 과발현되는 세포에서 세포 생장을 증가시키는 것을 확인하였다.

또한, oncogene의 과발현이 세포사멸에 대한 저항성을 유도하기 때문에, 본 발명자들은 ZNF224가 과발현 세포주와 ZNF224 녹다운(knock-down) 세포주에 CPT처리를 하여 CPT에 대항한 세포 생존 및 세포 사멸 여부를 시험하였다. 그 결과, ZNF224 과발현된 세포주는 대조군에 비해 CPT에 대항하여 세포 생존력이 뛰어남을 확인 할 수 있었다(도 2A).

본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하여, 본 발명의 마커는 유방암 발명 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하여, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약물 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 유방암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 유방암의 재발, 종양 성장, 약물 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 마이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제"란 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 유방암의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, ZNF224가 miR-663a의 프로모터에 결합하는 염기서열을 밝히기 위해서 ChIp-시퀀싱을 실시하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 5'-CAGC-3' 염기서열을 포함하는 헤어핀 루프(hair-pin loop) 구조를 확인하였고(도 3B), 상기 서열은 miR-663a의 -500bp 내 두 영역에 존재함을 확인하였다(도 4A). 따라서, 상기 서열에 ZNF224가 결합함으로써 농도 의존적으로 miR-663a의 전사물 수준(transcript level)이 증가함을 확인할 수 있었다(도 4D).

본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 유방암의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또한, 전술한 유방암 예후 예측용 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 유방암 예후 예측용 바이오마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 유방암의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 바이오마커 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, a) 유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 상기 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직 화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암 환자의 유방 유래의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 바람직하게는 유방 종양 조직일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예후가 알려진 유방암 환자"는 유방암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 유방암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발하여 불량한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 유방암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 이후 재발하지 않고 생존하거나 완치되어 양호한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현 수준 또는 발현 패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 다수의 유방암 환자로부터 마커 유전자의 발현 수준 또는 발현 패턴을 측정하고, 측정된 값을 이들 환자의 예후와 함께 데이터베이스화한 후, 예후를 알고자 하는 환자의 발현 수준 또는 발현 패턴을 상기 데이터베이스에 입력하여 예후를 예측할 수 있다. 이 경우, 발현 수준 또는 발현 패턴을 비교하기 위한 공지의 알고리즘, 통계분석 프로그램 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 데이터베이스는 위암 환자를 병리학적 병기, 치료받은 치료법 등으로 더욱 세분화될 수 있다.

본 발명의 유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 바이오마커 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 분석방법들을 통하여, 예후가 알려진 유방암 환자의 시료로부터 측정한 유방암 바이오마커 유전자의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 유방암 바이오마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 유방암의 예후를 예측할 수 있다. 즉, 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 예후가 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현 패턴을 나타내었다면, 이는 양호한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 반대로 불량한 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현 패턴을 나타내었다면, 이는 불량한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명에 의하면 유방암의 예후를 정확하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다. 예컨대, 양호한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 표준 치료 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정할 수 있고, 불량한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 상위 단계의 병기 위암 환자에게 사용하는 치료방법 또는 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정할 수 있다.

본 발명은 또한, a) 유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에서 선별된 바이오마커 유전자의 siRNA를 이용하여 유방암 환자의 치료가능성을 확인하기 위해 ZNF224로 형질 주입된 MCF-7 세포주에 siRNA를 처리하였으며, 사용된 예들은 다음과 같다; 5'-CUC AAG ACU UGG UGA UAA ATT-3', 5'-CGA UGU GAU ACG UGU GAU ATT-3', 5'-GGA AAG GGC UAC AAU AGU ATT-3′'(Santa Cruz Biotechnology).

상기 siRNA를 이용하여 ZNF224 유전자를 넉 다운(knock-down)시킨 후, 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비해 ZNF224로 형질주입된 세포주에서 ZNF224 유전자의 siRNA에 의한 우수한 세포사멸 효과가 관찰되었다(도 1C). 이를 통해, 본 발명에서 선별된 바이오마커 유전자를 타겟으로 한 치료가 실제로 유방암 환자에서 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 ZNF224 바이오마커 유전자가 유방암 환자를 치료하는데 유용하다는 것을 확인할 수 있다.

상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 바이오마커 유전자에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA 등이 될 수 있다.

본 발명은 또한 a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 ZNF224와 CAGC를 포함하는 염기서열의 결합을 저해하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 ZNF224가 miR-663a의 프로모터에 결합함으로써 농도 의존적으로 miR-663a의 전사물 수준(transcription level)을 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, miR-663a의 프로모터에 특이적으로 결합하는 결합자리(binding site)는 5'-CAGC-3'인 것을 miR-663a의 증가된 전사물 수준(transcription level)을 통해 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, ChIp-시퀀싱을 통하여 상기 ZNF224가 miR-663a의 프로모터에 특이적으로 결합하는 결합자리를 밝혀냈고, 대조군 또는 mutant oligo DNAs와 비교하였을 때 상기 서열을 포함하는 프로모터에 ZNF224가 더 높은 결합친화성(binding affinity)를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

항암제 스크리닝 방법은 c) 대조군 시료와 비교하여 miR-663a 발현량이 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 c) 단계는 대조군 시료와 비교하여 상기 ZNF 및 miR-663a 결합 정도는 발현되는 miR-663a의 전사물 수준(transcription level)을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 상기 전사물 수준(transcription level)의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "siRNA(small interfering RNA)"란, RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서(dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 바이오마커 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 이러한 siRNA는 공지된 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 실험실적 환경에서 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등에 의해 제조될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 상기 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도 하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 크기를 가지는 올리고머 분자를 의미하는데, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.

본 발명의 용어 "안티센스"란, 안티센스 올리고머라고도 하고, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 상기 안티센스는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있고, mRNA의 번역을 차단 또는 저해하며, mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스는 바람직하게는 본 발명의 바이오마커 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머가 될 수 있다. 상기 안티센스는 통상적인 방법으로 개체에 투여함으로써 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제시키는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법(J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182, 1998)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

아울러, 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질로는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 등이 될 수 있다. 이때, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 유효성분으로 사용되는 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 항체 이외에, 암치료 활성을 나타내는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 공지의 치료제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 방사성 핵종, 약제, 림포카인, 독서, 이중특이적 항체 등이 될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 세포배양

37℃ humidified 5% CO₂ incubator 에서 HEK293 (Human embryonic kidney cell line) 및 MCF-7 (Human adenoma breast cancer cell line) cells을 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone), 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, Utah, USA)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Hyclone, Utah, USA)에서 배양하였다. Transfection을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 plasmid DNA constructs가 polyethylenimine (PEI, Polysciences, Inc., PA, USA)에 의해 cell로 transfection되었다. 과발현된 ZNF224 안정한 클론을 얻기 위해, 본 발명자들은 MCF-7 cells을 Dr. Paola 10 Costanzo (University of Naples Federico II, Italy) 에 의해 제공된 CMV 3XFlag-ZNF224 G418-selectable plasmid로 transfection하였다. Transfected cells은 G418 (Duchefa, Haarlem, Netherlands) 80 μg/ml으로 보충된 배지에서 자라고 선택되었다. 안정하게 CMV 3xFLAG-ZNF224을 과발현하는 MCF-7 cell은 anti-FLAG M2 antibody (Sigma Aldrich, MO, USA)을 이용하여 Western blot에 의해 측정되었다. ZNF224 knock-down stable cell line을 생성하기 위해, 본 발명자들은 MCF-7 cells을 ZNF224 shRNA plasmid(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로 transfection 하였다. 상기 transfected Cells은 10 μg/ml puromycin (Sigma Aldrich, MO, USA)을 포함하는 배지에서 자라고 선택되었다. 상기 ZNF224의 stable knock-down을 Western blot 및 quantitative RT-PCR로 확인하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, E.V로 형질 주입된 MCF-7세포에 비해 ZNF224로 형질 주입된 MCF-7세포의 콜로니 수가 2배 이상 많이 존재함을 확인할 수 있었고(도 1C), ZNF224 넉다운(knock-down)의 경우 대조군에 비해 콜로니가 약 1/3배 적게 존재함을 확인할 수 있었다(도 1C).

실시예 2. RNAi study

MCF-7 cells을 20 nM ZNF224 si-RNA mixture (#1 5'-CUC AAG ACU UGG UGA UAA ATT-3', #2 5′'-CGA UGU GAU ACG UGU GAU ATT-3', #3 5′'-GGA AAG GGC UAC AAU AGU ATT-3′', Santa Cruz Biotechnology)로 48시간 또는 72시간 동안 transfection하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK)을 이용하여 47시간 또는 72시간 동안, 50 nM miR-663a antagonist (Bioneer, Korea)로 transfection하였다.

실시예 3. 웨스턴 블랏 ( Western blot )

Immunoblot을 위해, 세포를 lysis buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 0.1 mM NaVO3)로 용해하였다. 전체 cell lysates (30 μg)는 SDS-PAGE로 실시하였고 polyvinyldene fluoride membrane (PVDF, Millipore, MA, USA)으로 transfer하였다. 상기 membrane은 ZNF224 specific antibody (1:1000, Abcam, Cambridge, UK), M2 anti-FLAG (1:3,000, Sigma Aldrich, MO, USA), anti-p21 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-p53 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-PARP1 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 및 anti-alpha-tubulin antibody (1:20,000)로 incubation한 것에 이어, 5% skim milk 및 0.2% Tween-20을 포함하는 TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl)로 1시간 동안 block되었다. 두번째 항체들은 antimouse IgG HRP (1:25,000, Thermo Scientific, MA, USA) 또는 anti-rabbit IgG HRP (1:30,000, Thermo Scientific, MA, USA)이었다. 상기 membrane은 enhanced chmiluminescence (ECL) solution (Abclon, Korea)을 이용하여 전개시켰다.

실시예 4. 세포 성장 및 약물 저항성 분석

Cell growth 및 drug resistance을 분석하기 위해, 안정적인 클론 (5×104 cells) 의 각각에 8-E plate(ACEA, CA, USA)을 접종하고 humidified 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 10시간 후, 세포들은 DMSO 또는 0.1μM CPT로 처리하였고 24시간 동안 더 배양하였다. Cell culture하는 동안, cell growth는 iCelligence system(ACEA, CA, USA)을 이용하여 실시간으로 관찰하였다. 그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, ZNF224 과발현 세포주는 대조군(E.V)에 비해 CPT 에 대한 세포 생존 저항성에서 유의적 차이를 보임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 유세포 분석( Flow cytometry )

CPT에 의한 세포사멸은 flow cytometry에 의해 측정되었다. Cells (2.5×106)을 100 mm dish에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, DMSO 또는 CPT (0.1 μM)를 세포의 각 그룹에 첨가하였다. 24시간 후, cell을 수확하고 cold 70% ethanol로 16시간 동안 고정하였다. 1x cold PBS로 rehydration한 후, cell을 RNaseA (50μg/ml, Roche, Mannheim, Germany) 및 propidium iodide (100 μg/ml, Sigma Aldrich, MO, USA)로 처리하였다. 상기 DNA contents는 flow cytometry (CUBE6, PARTEC, Germany)에 의해 측정되었다.

실시예 6. 크로마틴면역침강반응 분석 및 시퀀싱( Chromatin immunoprecipitation assay and sequencing )

HEK293 cell을 CMV 3xFLAG-ZNF224 plasmid (6 μg)로 transfection 하였다. 이전에 기술된 바와 같이 Chromatin immunoprecipitation을 수행하였다. 간략하게, cell은 실온에서 10분 동안 1% formaldehyde로 crosslink되도록 하였다. 상기 cell 플레이트는 sonication buffer (50 mM HEPES, pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, 1% Triton X-100 and PIC) 200ul에서 incubation하였다. 상기 cell lysate는 70초 (10 초 정지 및 60 초 휴식)동안 sonication되었고 DNA 길이는 200 내지 1,000bp로 공유되었다. Protein A and G agarose bead mixture (Invitrogen, Paisley, UK)를 이용하여 immunoprecipitation한 것에 이어, 상기 핵산 및 단백질 혼합물을 M2 anti-FLAG antibody (Sigma Aldrich, MO, USA) 또는 normal mouse IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로 incubation 하였다. 상기 단백질-DNA complex는 elution buffer (50 mM Tris- HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM NaHCO3)에 의해 상기 beads로부터 분리되었고, 상기 formaldehyde crosslink에 전환하기 위해 65℃ 에서 5시간 동안 protease K로 가열하였다. 최종적으로, 상기 DNA는 PCR Clean-up Kit (Promega, WI, USA)로 정제하였다. ChIPed DNA는 또한 일부 modifications과 sequencing library를 준비하기 위해 처리되었다. DNA fragment는 end-repaired, dA-tailed이었고 Illumina사에서 제공하는 Genomic DNA Adapters 와 ligation하였다. Adapter-ligated DNA fragments는 정제되었고 PCR 20 사이클로 증폭시켰다. PCR 산물의 200-400bp를 isolation 하기 위해 Gel extraction이 수행되었다. Illumina Genome Analyzer IIx에 의해 Libraries가 시퀀싱되었다. Illumina's CASAVA pipeline (v1.8.2)을 사용하여 sequences reads의 Alignment를 수행하였다. 추가적인 분석을 위해 2 mismatches를 허용하는 고유 정렬 태그를 사용하였다. Raw sequencing reads는 FASTQC tool을 사용하여 품질 조사를 하였다. 상기 reads는 기본매개변수 CASAVA v1.6.0을 사용하여 인간 genome build hg18에 정렬되었다. ZNF224 총 매핑 태그 수는 4,090,000이었다. 상기 시퀀싱 데이터는 National Center for Biotechnical Information(NCBI)의 Gene Expression Omnibus (GEO)에 기탁되었다(GSE73947). FLAG-ZNF224가 풍부한 피크를 확인하기 위하여, MACS(Model-based Analysis for ChIP-Seq) ver. 1.4.0 은 하기와 같은 옵션이 사용되었다; tsize=36 --pvalue=1e-4--mfold=30 --bw=100. 또한, HOMER(Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment) ver. 4.1은 하기와 같은 옵션이 사용되었다; -frag Length 200 -gsize 2700000000 -center. Genome의 annotating peaks는 HOMER로 수행되었다. 히스토그램은 각각 50bps의 개별 transcription start site (TSS)주위의 read densities 계산에 의해 만들었다. DAVID는 그것의 TSSs에서 1kb 내의 모든 피크를 포함하여 gene이 풍부한 Gene Ontology terms을 조사하기 위해서 사용되었다. HOMER로 피크의 모티브 발견을 수행하였다. HOMER을 이용하여, HEK293에서 ZNF224의 10,185개의 피크를 확인했고, 주위 클러스터에 transcriptional start site (TSS)의 5' 유전자 경계의 1kb 이내인 ZNF224 풍부한 영역에 대한 경향이 있었다 (도 8A).

Znf224 풍부 영역 근처(1<kb)를 포함하는 유전자 정보는 도 9 내지 도 17에 나타냈다. 또한, 도 8B에서와 같이, 상기 ZNF224 signal는 상기 TSS의 1kb upstream 및 downstream을 포함하는 프로모터에서 HEK293 총 피크의 약 12%를 차지한다. ZNF224에 의해 인지되는 상기 DNA consensus sequence를 결정하기 위해, MACS 프로그램에 의해 확인된 13,561개의 피크를 HOMER을 이용해 분석하고 Structural Time series Analyser, Modeller and Predictor (STAMP)를 이용하여 추가 처리하였다. 그 결과, 본 발명자들은 도 3A에서 보여지는 바와 같이 sequence 5'-CAGC-3' 을 포함하는 putative motif를 밝혀냈다.

실시예 7. HEK293으로부터 ZNF224의 정제

HEK293 cells은 CMV 3xFLAG-ZNF224 plasmid와 함께 transfection되었다. 36시간 후, 단백질 추출물은 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 0.1 mM NaVO3)와 함께 준비되었다. 상기 단백질 추출물 (10 mg)은 anti-FLAG M2 magnetic bead (Sigma Aldrich, MO, USA)와 함께 4℃에서 incubation하였다. 침전된 bead-protein complex는 1 mM PMSF을 포함하는 1X cold PBS로 세척되었고 elution buffer (0.1 M glycin, pH 2.5)로 용출하였다. 정제 후, FLAG-ZNF224 proteins은 1x PBS에 대항하여 투석하였고, -70℃에서 저장하였다. 그 결과, 정제된 FLAG-ZNF224는 약 100kDa의 크기 인 것을 확인할 수 있었다. 도 3C에서 나타난 바와 같이, 5'-CAGC-3'을 포함하는 상기 sequence는 대조군 또는 mutant oligo DNAs에 비해 더 높은 binding affinity을 보였다.

실시예 8. 효소면역분석법( enzyme - linked immunosorbent assay , ELISA)

ZNF224에 의해 인지되는 DNA consensus sequence를 결정하기 위하여, streptavidin로 코딩된 플레이트 (Thermo Scientific, MA, USA)를 wash buffer(25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20) 200ul로 세척하였고, 그 다음 각각의 well에 5'-biotinylated oligo DNA (5 μM) 100ul을 첨가하였다. 20% 글리세롤을 포함하는 1X PBS에서 정제된 FLAG-ZNF224 proteins 50ng을 각각의 well에 첨가하였고, RT에서 2시간 동안 incubation하였으며, 플레이트를 wash buffer로 3차례 세척하였다. Wash burffer에서 희석된 Anti-FLAG antibody (1 μg/ml)를 각각의 well (100 μl/well)에 첨가하고 RT 에서 2시간동안 더 incubation하였다. 세척한 후, 25 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20에서 희석된 상기 horseradish peroxidatse (HRP)-conjugated goat antimouse IgG (1:5,000)를 각각의 well에 첨가하고 30분 동안 더 incubation 하였다. Washing buffer로 상기 플레이트를 세척한 후에, 3, 3', 5, 5′' -tetramethylbenzidine solution을 15분 동안 첨가하였다. 상기 signal은 450nm (BMG Labtech, Ortenberg,Germay)에서 측정되었다.

실시예 9. 루시페라아제 활성 분석( Luciferase activity assay )

MCF-7 cells (2.5×105)을 12-well plates에 접종하고 Renilla vector (100 ng)의 CAGCTTC sequence의 triple repeat을 포함하는 pGL3-basic luciferase reporter vectors (200 ng)와 FLAG-ZNF224 (200 ng)의 존재 또는 부재 하에서 24시간 동안 배양하면서 transfection시켰다. ZNF224 및 miR-663a의 효과를 조사하기 위하여, MCF-7 cell을 Renilla vector (200 ng)의 p21 3' UTR 또는 p53 3' UTR을 포함하는 psiCHECK™ vectors (200 ng)로 FLAG-ZNF224 (200 ng) 또는 miR-663a의 존재 하에서 24시간 동안 (20 nM)transfection 시켰다(도 5A). 그 다음 세포를 miR-663a inhibitor(50nM, Bioneer, Korea)로 48시간 동안 처리하였다. Luciferase activity는 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, WI, USA)로 측정되었고 제조사의 지시에 따라 GloMax®(Promega, WI, USA)를 이용하여 정량화하였다. 그 결과, 도 5B에서 나타난 바와 같이 miR-663a는 p53-3' UTR-wild type 및 p21-3' UTR-wild type의 luciferase activity를 감소시킴을 확인할 수 있었으나, p53-3' UTR-mutant, 및 p21-3' UTR-mutant에서는 감소시키지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, miR-663a antagonist는 miR-663a에 의해 luciferase activity의 감소를 억제함을 확인하였다. 또한, ZNF224는 용량 의존적으로 p53-3' UTR-wild type, 및 p21-3' UTR-wild type의 luciferase activity를 감소시켰으며, p53-3' UTR-mutant, 및 p21-3' UTR-mutant (도 5C)에서는 감소시키지 않음을 확인할 수 있었다. p53-3' UTR 및 p21-3' UTR의 감소된 luciferase activity 확인 여부는 ZNF224를 통해 miR-663a에 의해 매개되었다. 본 발명자들은 ZNF224 및 miR-663a antagonist의 transfection이후 luciferase activity를 시험했다. ZNF224의 과발현은 p53-3' UTR-wild type, 및 p21-3' UTR-wild type의 luciferase activity를 현저하게 감소시켰으나, p53-3' UTR-mutant, 및 p21-3' UTR-mutant에서는 감소시키지 않음을 확인할 수 있었다(도 5D). 또한, 이는 ZNF224가 miR-663a의 전사가 증가함으로써 p53 및 p21의 발현을 down-regulate시킬수 있다는 것을 시사하였고, miR-663a antagonist는 ZNF224에 의한 luciferase activity의 감소를 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 표면 플라스몬 공명 분석( Surface plasmon resonance ( SPR ) analysis )

oligo DNA와 ZNF224의 결합을 확인하기 위해, SPR 분석을 수행하였다. Surface plasmon resonance (SPR) analysis는 SR7500DC (Reichert, NY, USA)를 이용하여 수행하였다. FLAG-ZNF224 proteins (50 μg)을 제조사의 프로토콜에 따라 CMDH chips (Reichert, NY, USA)으로 고정하였다. Oligo DNA (0, 0.625 μM, 1.25μM, 2.5 μM, 5.0 μM, and 10 μM)를 1X PBS에서 분석물로 통과시시켰다. K_D값을 Scrubber2 software을 사용하여 측정하였다. mutant sequence을 포함하는 oligo DNA가 어떠한 binding affinity도 보여주지 않는 반면, 5'-CAGC- 3'을 포함하는 oligo DNA와 ZNF224의 binding affinity의 정량은 ZNF224가 CAGCTTC (KD= 1.25±0.06x10-6 M), CAGCGTC (KD=2.0±0.1x10-6 M), and GCAGCAA (KD=0.42±0.03x10-6 M)에 결합한다는 것을 보여주었다. 5'-CAGC- 3'을 포함하는 oligo DNA가 프로모터로 기능할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 대표적인 프로모터에 5'-CAGCGTC-3′' sequence를 포함하는 luciferase vector 구축하였다. 도 3D에서 나타난 바와 같이, ZNF224는 프로모터에서 ZNF224를 인지하는 DNA consensus sequence로서 기능하는 5'-CAGC-3′'을 포함하는 DNA sequence를 확인하는, dose-dependent manner에서 luciferase activity가 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 11. 정량적 중합연쇄반응 ( Quantitative RT- PCR )

유전자 발현을 분석하기 위해서, total RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol reagent (Invitrogen, Paisley, UK)를 사용하여 추출하였다. Total RNA의 500ng을 역전사에 의해 cDNA를 제조하였고, 각각의 gene transcript를 특정 프라이머와 PCR에 의해 증폭시켰으며, 사용된 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다. Quantitative RT-PCR은 Power SYBR Green PCR Master Mix® (ABI, CA, USA)및 StepOne 48 well real time PCR system (ABI, CA, USA)으로 수행하였다. 또한 ChIP sequencing결과를 확인하기 위해, Re-ChIP을 수행하였고, ChIPed DNA를 특정 프라이머와 PCR에 의해 증폭시켰으며, 사용된 프라이머를 하기 표 2에 나타냈다). 각각의 Ct value는 입력 샘플 ΔCt[Ct(IP) - Ct(Input)] 로 정규화 하였다. ChIP signals을 상기 입력 2^-[컴Ct] 배의 값으로 계산하였다. 각각의 ChIP assay를 적어도 3번 반복하였다.

프라이머	염기서열
GAPDH	F: 5‘-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3‘ R: 5‘-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’
GAPDH	F: 5‘-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’ R: 5'-GTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3‘
ZNF224	F: 5‘-CAGAGAGTCCACATGGGAGAG-3’ R: 5‘-CCCGTGTGGACCATATGATGC-3‘
ZNF224	F: 5‘-CACCAGAAGGTCCACACAGG-3’ R: 5‘-CCCAGCCAAAACTCTTCCCA-3’
P21	F: 5‘-GCAGACCAGCATGACAGATTT-3’ R: 5‘-GGATTAGGGCTTCCTCTTGGA-3’
P53	F: 5‘-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3’ R: 5‘-GGCATTCTGGGAGCTTCATCT-3’
U6	F: 5‘-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3‘ R: 5‘-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’
miR-663a	F: 5‘-AGCCGCGTCCCAACCCGCTAG-3’ R: 5‘-CTCGCTTGCAGAGGAACCCTC-3’

프라이머	염기서열
LOC284801	F: 5‘-AGATTTTCTGCCTTGGCACC-3’ R: 5‘-TGGACTCTCTCAGGTTGAACG-3’
miR-663a	F: 5‘- GCCGCGTCCCAACCCGCTAG -3’ R: 5‘- ACTCGCTTGCAGAGGAACCC -3‘
ROCK1P1	F: 5‘-GCACTGGAAAACCGATCGTC-3’ R: 5‘-TTCATCAGTGCGGCTTTCAA-3’
SCML1	F: 5‘-CCACAGAGGTAGGATGAGCC-3‘ R: 5‘-ACGGAGAACTTCCCTGTATGG-3’
PPP1R15B	F: 5‘-AGGGAGCACATTTACAGGATGG-3’ R: 5‘-CAACCGACATTGCTGTTGCT-3‘
ZDHHC14	F: 5‘-GTAAACGTCCGTGGGGAGAA-3’ R: 5‘-TCAGGGTCCCCTCCGGCCCCG-3‘
miR-3621	F: 5‘-AGCGAGAGTGCCGAGCAGC-3’ R: 5‘-CTGCTGTTGCTGCTGCTGTCG-3’
miR-663a	F: 5‘-CTTCCGGCGTCCCAGG-3’ R: 5‘-CGGGCCACCAGGAAAACA-3‘
P21	F: 5‘-CAGGCTGGTCTCAAAACTCCT-3’ R: 5‘-GATGTGAGGAAGGCTCAGTGG-3‘
P53	F: 5‘-CATCAAGCCCTAGGGCTCCTC-3’ R: 5‘-ATGGAGTTGGGGAGGAGGGTA-3‘

실시예 12. 면역 조직화학적 염색( Immunohistochemical staining )

유방암 환자로부터 서면동의서를 얻었고, 본 연구는 연세대학교 세브란스 병원(4-2015-0168)의 임상심사위원회에 의해 승인되었다. 표본은 단계 1과 2사이의 유관암(ductal carcinoma)이었다. 면역조직화학 염색은 전술한 바와 같이 수행하였다. 섹션(5um)을 항-p53및 1/50로 희석한 항-ZNF224 항체로 1시간 동안 RT에서 염색하였다. 염색은 제조업체의 지시에 따라 Ultra View universal DAB detection kit (Ventana, AZ, USA)로 detection하였다. 핵을 Mayer's haematoxylin(Dako, Glostrup, Denmark)으로 대조하였다. H&E 및 immunohistochemical staining은 ZNF224 발현 수준이 비-암 영역에 비해 암 영역(18건 중 15건)에서 증가하였음을 보여준다(도 7A 및 7B), 반면, ZNF224 mRNA 발현은 18건 중에 오직 8건 만이 증가하였다(도 7c). 또한, miR-663a transcript 수준은 14건 중에 7건이 증가하였고, p21 mRNA가 detection되지 않은 반면, p53 mRNA 수준은 16 case 중에 8 건이 감소하였다(도 7D 및 7E). 상기 테스트된 조직 중에, 3건(16.6%)은 ZNF224 transcript 수준의 증가는 증가된 miR-663a RNA (rs = -0.4862, p=0.0389) 및 감소된 p53 mRNA (rs = -0.3446, p=0.046)와 연관이 있음을 나타냈다.

실시예 13. P21 및 p53의 tanscript 및 단백질 수준 확인

본 발명자들은 ZNF224가 miR-663a를 통해 p53 및 p21의 transcript 및 단백질 수준을 감소시킬 수 있는지 여부를 시험했다. miR-663a transfection은 p21 및 p53의 transcript 수준뿐만 아니라 단백질 수준을 효과적으로 감소시켰다(도 6A 및 6B). 또한, miR-663a는 miR-663a antagonist가 p21 및 p53의 발현을 감소시키는 반면, MCF-7 cell의 콜로니 형성 가능성을 증가시켰고(도 6C) 증가된 콜로니 형성은 miR-663a에 의해 유도됨을 확인할 수 있었다(도 6A 내지 6C). p21 및 p53의 감소된 발현 수준이 세포사멸 저항을 유도하기 때문에, 세포성장 및 세포 사멸은 CPT의 처리 이후에 분석하였다. miR-663a antagonist의 transfection시와 반대로, miR-663a transfection은 MCF-7 cell의 세포성장을 증가시키고 CPT에 의한 세포사멸의 저항이 유도하였다(도 6D). 또한, ZNF224의 transfection은 p21 및 p53의 mRNA 수준뿐만 아니라 그것의 단백질 수준도 감소시킴을 확인할 수 있었다. 그리고 miR-663a의 transcript 수준은 증가했다. 반면, ZNF224에 의한 p21 및 p53의 상기 감소된 발연은 miR-663a에 의해 매개된다는 것을 시사하면서, miR-663a antagonist는 ZNF224의 효과를 억제했다 (도 6E 및 6F). 또한, ZNF224에 의해 유도된 콜로니 형성 능력 및 세포 성장의 증가는 miR-663a antagonist의 transfection에 의해 억제되었다. 뿐만 아니라 miR-663a antagonist는 세포사멸 저항의 민감성을 이끌면서, ZNF224 과발현에 의해 유도된 enhanced cell growth를 억제했다(도 6H). ZNF224 의 si-RNA transfection은 miR-663a 전사 수준이 아니라, p21 및 p53의 transcript 수준을 증가시켰다(도 6I). Western blot analysis는 si-RNA를 이용한 ZNF224 knock-down이 p21이 아닌, p53의 발현 수준을 증가시킨다는 것을 보여주었다(도 6J).

실시예 14. 통계적 분석

상기 결과는 평균±S.D 또는 평균±SEM으로 표현하였다. 상기 student's t test는 모든 수행 실험 그룹의 통계적 중요성을 결정하기 위해서 수행되었고 P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

Claims

ZNF224 유전자를 포함하는 유방암의 예후 예측용 바이오마커.
제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 염기서열을 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 바이오마커가 특이적으로 결합하는 결합자리(binding site)는 5'-CAGC-3'인 것을 특징으로 하는 유방암 예후 예측용 조성물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 키트.
제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 정량적 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 유방암 예후 예측용 키트.
a) 유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제7항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것인 유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제7항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템.
a) 유방암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및
b) 후보물질이 처리된 유방암 환자의 시료에서 ZNF224와 CAGC를 포함하는 염기서열의 결합을 저해하는 것을 확인하는 단계; 를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 항암제 스크리닝 방법은 c) 대조군 시료와 비교하여 miR-663a 발현량이 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
제1항에 따른 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 물질은 바이오마커에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 물질은 상기 바이오마커의 단백질 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.