KR101966493B1

KR101966493B1 - 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커

Info

Publication number: KR101966493B1
Application number: KR1020160080440A
Authority: KR
Inventors: 남승윤; 김연희; 박성진; 이은숙; 장혜령
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2019-04-05
Also published as: KR20180001380A

Abstract

본 발명은 삼중음성유방암(triple negative breast cancer, TNBC)의 예후를 예측하기 위한 유전자 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 삼중음성유방암의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 상기 유전자 바이오마커를 이용하여 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템 및 상기 유전자 바이오마커를 타겟으로 하는 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 삼중음성유방암 환자에서 본 발명의 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하여 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 예후 예측결과에 따라 삼중음성유방암의 불량한 예후에 관여하는 해당 유전자 바이오마커의 발현을 억제할 수 있으므로, 삼중음성유방암 환자를 보다 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커{Biomarkers for Predicting Triple Negative Breast Cancer Prognostication}

삼중음성유방암(triple negative breast cancer, TNBC)은 면역조직화학염색에서 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로, 유방암 분류 중 약 10-20%를 차지하는데, 흑인종의 경우에는 24.6%로 좀 더 비율이 높고, 한국인의 경우는 9.2-15.9%의 분포를 보인다. 이들은 좀 더 젊은 연령층에서 발생하고, 폐경 전 연령에 많으며, 국소 및 원격 재발률이 높고, 림프절 전이보다는 혈행성 전이를 잘하며, 다른 유형에 비해 핵등급과 조직등급이 높고, 종양의 크기가 크다는 특성을 보이는데 이런 것들은 모두 좋지 않은 예후와 관련이 있다. 그러나, TNBC는 현재까지도 다른 유방암에 비해 효과적인 분자 표적치료제나 항암제가 없어 다각적인 종양생물학적 규명이 필요한 상태이다.

이에 본 발명자들은 불량한 예후(poor prognosis)의 TNBC와 연관된 시그널링 네트워크 하에서, TCGA와 UNC datasets으로부터 예후가 좋지 않은 TNBC 환자에서 공통적으로 과다발현된 40개의 유전자를 선별하였고, 이러한 유전자가 임상적으로 예후가 불량한 것으로 분류된 TNBC 환자에서 과다발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, ADAM9, ALCAM, ANXA3, AR, AREG, BMP7, CCND1, CDKN2B, CYP19A1, DKK1, DLC1, EGR1, EREG, FABP4, FOLR1, FOS, FOXA1, GPC3, GSTM1, GSTM2, GSTM3, HSD17B1, ITGB4, ITGB5, KLK10, KLK11, KLK5, KLK7, KLK8, LAMC2, PTK6, RARRES1, S100P, SCGB2A2, SERPINE1, SFRP1, TIMP3, TIMP4, TRIM29 및 WISP2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer, TNBC)의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 삼중음성유방암의 예후 예측용 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 상기 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 삼중음성유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 삼중음성유방암 환자의 시료에서 상기 삼중음성유방 예후 예측용 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, ADAM9, ALCAM, ANXA3, AR, AREG, BMP7, CCND1, CDKN2B, CYP19A1, DKK1, DLC1, EGR1, EREG, FABP4, FOLR1, FOS, FOXA1, GPC3, GSTM1, GSTM2, GSTM3, HSD17B1, ITGB4, ITGB5, KLK10, KLK11, KLK5, KLK7, KLK8, LAMC2, PTK6, RARRES1, S100P, SCGB2A2, SERPINE1, SFRP1, TIMP3, TIMP4, TRIM29 및 WISP2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer, TNBC)의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바이오마커는 CDKN2B, CYP19A1, DKK1, EGR1, FABP4, FOS, GSTM2, KLK10, KLK8, RARRES1 및 SFRP1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

본 발명은 또한, a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 상기 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 삼중음성유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)일 수 있다.

본 발명은 또한, a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 삼중음성유방암 환자의 시료에서 본 발명의 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 물질은 상기 바이오마커에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 물질은 상기 바이오마커의 단백질 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

본 발명의 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커를 이용하여 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 삼중음성유방암 환자의 유방암 재발 및 사망률을 감소시켜 삼중음성유방암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 TCGA와 UNC 데이터세트부터 불량한 예후를 나타내는 TNBC에서 상향조절된 유전자를 각각 선별하고, IPA(Ingenuity Pathway Analysis)를 통해 필터링한 후 TCGA와 UNC 데이터세트에서 공통적으로 상향조절된 40개의 유전자를 최종 바이오마커 후보로 선발하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 도 1의 과정을 통해 선발된 40개의 바이오마커 후보를 리스트로 나타낸 것이다.
도 3 내지 7은 TCGA 데이터세트에서 좋은 예후의 TNBC 환자와 불량한 예후의 TNBC 환자에 대하여, 선발된 40개의 바이오마커 후보의 유전자 발현 수준을 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 임상평가에 사용된 불량한 예후의 TNBC 환자에 대한 임상적 정보를 나타내는 모식도이다.
도 9 및 10은 선발된 40개의 바이오마커 후보에 대하여 임상적으로 불량한 예후의 TNBC 환자(도 8)와 다른 종류의 유방암 환자에서의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 39개의 유전자를 대상으로, 다른 종류의 유방암세포인 SKBR3 및 JIMT1과 불량한 예후의 TNBC 환자로부터 분리한 HCC38, HCC1143, HCC1806 및 HCC1937 세포에서 siRNA 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 불량한 예후의 TNBC와 관련된 23개의 시그널링 네트워크를 나타낸 것이다.
도 13은 임상적으로 불량한 예후를 나타내는 것으로 분류된 TNBC 환자에서 상향조절된 유전자와 해당 유전자가 관계된 시그널링 경로를 짝지어 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, TNBC는 좀 더 젊은 연령층에서 발생하고, 폐경 전 연령에 많으며, 국소 및 원격 재발률이 높고, 림프절 전이보다는 혈행성 전이를 잘 하며, 다른 유형에 비해 핵등급과 조직등급이 높고, 종양의 크기가 크다는 특성을 보이는데 이런 것들은 모두 좋지않은 예후와 관련이 있다. 그러나, TNBC는 현재까지도 다른 유방암에 비해 효과적인 분자 표적치료제나 항암제가 없어 다각적인 종양생물학적 규명이 필요한 상태이다.

이에 본 발명에서는 TNBC의 불량한 예후에 관여하는 선별된 유전자, 즉, ADAM9, ALCAM, ANXA3, AR, AREG, BMP7, CCND1, CDKN2B, CYP19A1, DKK1, DLC1, EGR1, EREG, FABP4, FOLR1, FOS, FOXA1, GPC3, GSTM1, GSTM2, GSTM3, HSD17B1, ITGB4, ITGB5, KLK10, KLK11, KLK5, KLK7, KLK8, LAMC2, PTK6, RARRES1, S100P, SCGB2A2, SERPINE1, SFRP1, TIMP3, TIMP4, TRIM29 및 WISP2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer, TNBC)의 예후 예측용 바이오마커를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 이를 이용해 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 삼중음성유방암 환자의 유방암 재발 및 사망률을 감소시켜 삼중음성유방암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 TNBC의 불량한 예후에 관여하는 유전자의 선별과정은 다음과 같다. 먼저, 도 1에 나타낸 바와 같이 TCGA 데이터세트로부터 수득한 124개의 예후 관련 유전자와 UNC 데이터세트로부터 수득한 174개의 예후 관련 유전자의 교집합(fold-change 1.2 이상)을 구하여 최종 40개의 예후 관련 바이오마커를 도출하였다. 도 2는 선별된 40개의 유전자에 대해서 TCGA 데이터세트로부터 얻은 예후가 나쁜 환자 그룹의 p-value 및 fold-change를 예후가 좋은 환자 그룹에 대하여 나타낸 것이고, 도 3 내지 7은 TCGA 데이터세트에서 좋은 예후의 TNBC 환자와 불량한 예후의 TNBC 환자에 대하여, 선발된 40개의 바이오마커 후보의 유전자 발현 수준을 비교한 그래프이다. 도 3 내지 7을 통해 선별된 40개의 유전자 대부분이 예후가 좋은 TNBC 보다 예후가 나쁜 TNBC에서 높은 발현 수준을 나타냄을 확인하였다.

본 발명자들은 TNBC의 나쁜 예후와 관련된 시그널링 네트워크(도 12) 및 임상적으로 나쁜 예후를 나타내는 것으로 분류된 TNBC 환자에서 상향조절된 유전자와 해당 유전자가 관계된 시그널링 경로를 짝지어 나타냄으로써 선별된 유전자와 해당 유전자가 관여하는 시그널링 경로를 함께 분석할 수 있도록 하였다.

구체적으로 도 12는 TNBC 중에서 예후가 나쁜 환자 그룹에서 중요하게 나타나는 시그널링 네트워크를 표시한 것으로, TNBC에 나쁜 예후는 한 두개의 유전자에 의한(monogenic) 질병이 아니라, 다양한 유전자가 관련된(multigenic) 질병이면서, 복잡한 시그널링의 상호작용의 결과임을 알 수 있다. 따라서, 불량한 예후를 가지는 TNBC에서 과발현된 40개의 바이오마커의 기능적 탐색을 도 12의 시그널링 네트워크에서 우선적으로 확인할 수 있다. 도 13은 나쁜 예후를 가지는 TNBC에서 과발현된 40개 바이오마커 중의 일부가 도 12의 시그널링 네트워크와 연관성을 가지는 것을 추출한 것이다. 따라서, 도 13에 표시된 11개의 바이오마커를 타겟하는 화합물이 나타나면, 해당 화합물이 기능적 변화를 검증하기 위한 read-out으로 연관 시그널링을 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 삼중음성유방암 발병 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 삼중음성유방암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 삼중음성유방암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제" 란 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 삼중음성유방암의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 삼중음성유방암의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 키트는 상기 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 삼중음성유방암의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 TNBC 환자와 TNBC가 아닌 환자의 유방암 조직에서 선별된 40개의 유전자에 대한 발현량을 측정하였다. 그 결과, GSTM2, KLK10, RARRES1, KLK8, SFRP1, CDKN28, CYP19A1, DKK1, EGR1, FAPB4 및 FOS 유전자의 발현량이 TNBC가 아닌 환자에 비해 TNBC 환자에서 증가된 것을 확인하였다(도 9 및 10). 따라서, 본 발명에서 TNBC 예후와 연관된 것으로 선별된 40개의 유전자는 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측하고 그에 따른 치료방법을 제공하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 삼중음성유방암의 예후 예측용 바이오마커를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 바이오마커 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 삼중음성유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 삼중음성유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "삼중음성유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 삼중음성유방암 환자의 유방 유래의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 바람직하게는 유방 종양 조직일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예후가 알려진 삼중음성유방암 환자"는 삼중음성유방암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 삼중음성유방암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발하여 불량한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 삼중음성유방암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 이후 재발하지 않고 생존하거나 완치되어 양호한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 다수의 삼중음성유방암 환자로부터 마커 유전자의 발현수준 또는 발현패턴을 측정하고, 측정된 값을 이들 환자의 예후와 함께 데이터베이스화한 후, 예후를 알고자하는 환자의 발현수준 또는 발현패턴을상기 데이터베이스에 입력하여 예후를 예측할 수 있다. 이 경우, 발현수준 또는 발현패턴을 비교하기 위한 공지의 알고리즘, 통계분석 프로그램 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 데이터베이스는 위암 환자를 병리학적 병기, 치료받은 치료법 등으로 더욱 세분화될 수 있다.

본 발명의 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 바이오마커 유전자의 발현수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 분석방법들을 통하여, 예후가 알려진 삼중음성유방암 환자의 시료로부터 측정한 삼중음성유방암 바이오마커 유전자의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 삼중음성유방암 바이오마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 삼중음성유방암의 예후를 예측할 수 있다. 즉, 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 예후가 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 양호한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 반대로 불량한 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 불량한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명에 의하면 삼중음성유방암의 예후를 정확하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다. 예컨대, 양호한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 표준 치료 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정할 수 있고, 불량한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 상위 단계의 병기 위암 환자에게 사용하는 치료방법 또는 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정할 수 있다.

본 발명은 또한, a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 삼중음성유방암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 삼중음성유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에서 선별된 바이오마커 유전자의 siRNA를 이용하여 TNBC 환자의 치료 가능성을 확인하기 위해 TNBC 세포주에 siRNA를 처리하여 유전자를 넉다운(knock-down)시킨 후, 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, HCC1937 세포에서 대부분의 유전자의 siRNA에 의한 우수한 세포사멸 효과가 관찰되었으며, HCC38, HCC1143 및 HCC1806 세포에서도 일부 유전자의 siRNA에 의한 세포사멸 효과가 관찰되었다(도 11). 이를 통해, 본 발명에서 선별된 바이오마커 유전자를 타겟으로 한 치료가 실제 TNBC 환자에서 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 선별된 바이오마커 유전자가 TNBC 환자를 치료하는데 유용하다는 것을 확인할 수 있다.

상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 바이오마커 유전자에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "siRNA(small interfering RNA)"란, RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서(dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 바이오마커 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 이러한 siRNA는 공지된 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 실험실적 환경에서 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등에 의해 제조될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 상기 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도 하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 크기를 가지는 올리고머 분자를 의미하는데, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.

본 발명의 용어 "안티센스"란, 안티센스 올리고머라고도 하고, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 상기 안티센스는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있고, mRNA의 번역을 차단 또는 저해하며, mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스는 바람직하게는 본 발명의 바이오마커유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머가 될 수 있다. 상기 안티센스는 통상적인 방법으로 개체에 투여함으로써 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제시키는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법(J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182, 1998)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

아울러, 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질로는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 등이 될 수 있다. 이때, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 유효성분으로 사용되는 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 항체 이외에, 암치료 활성을 나타내는 공지의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 공지의 치료제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 방사성 핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 질소 머스타드 등이 될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다.투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

TCGA와 UNC 데이터세트로부터 삼중음성유방암의 악성예후와 연관된 유전자의 선별

TCGA 유방암 RNA-SEQ 데이터세트에서 예후가 나쁜 환자와 좋은 환자를 대상으로 Rank Product Test를 이용하여 p-value cutoff 0.05를 이용하여 1715개의 유전자(예후가 나쁜 환자에서 올라감)를 얻었다. 이를 바탕으로 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)를 통한 분석을 통하여 124개의 유전자로 좁혀졌다. 독립적인 데이터세트로서 UNC 유방암 데이터세트를 이용하여, Rank Product Test (p-value 0.05)를 통하여 1558개의 유전자(예후가 나쁜 환자에서 발현 증가)를 얻었고, IPA를 통하여 174개의 예후 관련 유전자로 좁혀졌다.

앞서 TCGA에서 구한 124개의 예후 관련 유전자와 교집합(fold-change 1.2 이상)을 구하여 최종 40개의 예후 관련 바이오마커가 하기와 같이 도출되었다: ADAM9(Entrez, 8754), ALCAM(Entrez, 214), ANXA3(Entrez, 306), AR(Entrez, 367), AREG(Entrez, 374), BMP7(Entrez, 655), CCND1(Entrez, 595), CDKN2B(Entrez, 1030), CYP19A1(Entrez, 1588), DKK1(Entrez, 22943), DLC1(Entrez, 10395), EGR1(Entrez, 1958), EREG(Entrez, 2069), FABP4(Entrez, 2167), FOLR1(Entrez, 2348), FOS(Entrez, 2353), FOXA1(Entrez, 3169), GPC3(Entrez, 2719), GSTM1(Entrez, 2944), GSTM2(Entrez, 2946), GSTM3(Entrez, 2947), HSD17B1(Entrez, 3292), ITGB4(Entrez, 3691), ITGB5(Entrez, 3693), KLK10(Entrez, 5655), KLK11(Entrez, 11012), KLK5(Entrez, 25818), KLK7(Entrez, 5650), KLK8(Entrez, 11202), LAMC2(Entrez, 3918), PTK6(Entrez, 5753), RARRES1(Entrez, 5918), S100P(Entrez, 6286), SCGB2A2(Entrez, 4250), SERPINE1(Entrez, 5054), SFRP1(Entrez, 6422), TIMP3(Entrez, 7078), TIMP4(Entrez, 7079), TRIM29(Entrez, 23650) 및 WISP2(Entrez, 8839).

도 2는 상기 40개의 유전자에 대해서 도 1의 TCGA 데이터세트로부터 얻은 예후가 나쁜 환자 그룹의 예후가 좋은 환자 그룹에 대한 p-value 및 fold-change를 나타낸 것이다(예후가 나쁜 환자 그룹(poor): 36개월 안에 재발; 예후가 좋은 환자(good): 36개월 이후에도 재발없는 환자).

또한, 상기 선별된 40개의 유전자에 대한 TCGA의 유방암 데이터에서 예후가 나쁜 환자 그룹과 예후가 좋은 환자 그룹의 발현량을 도 3 내지 7과 같이 boxplot으로 나타냈다. 40개의 유전자는 도 2의 Rank Product Test에 의한 p-value < 0.05 이며, 예후가 좋은 환자 그룹에 대해 예후가 나쁜 환자의 fold-change 가 ≥ 1.2 인 것을 선택한 것이다.

선별된 40개의 후보 유전자의 발현 수준 임상평가

상기 실시예 1에서 선별된 40개의 예후 관련 유전자 발현 수준의 임상 평가를 위한 표본으로서, 총 3개의 삼중음성유방암환자의 샘플을 사용하였다. 대조군으로는 삼중음성유방암이 아닌 환자로 HER2⁺ 환자(BC17), Luminal B type 환자(BC7) 및 Luminal A type 환자(BC9)의 샘플을 사용하였다. 상기 유방암 샘플을 채취한 대상환자는 본 발명에 따른 연구의 목적으로 임상표본 조직의 사용을 동의하였고, 대한민국 국립 암센터의 IRB(Institutional Review Board) 역시 이에 대해 승인하였다. 상기 삼중음성유방암 샘플을 채취한 대상환자들의 조직학 분류(Histologic classification) 및 종양기(tumor stage)는 국립암센터의 병리학자에 의해 검토되었으며, 검토된 환자별 임상정보는 도 8과 같다.

상기 6개의 유방암 환자 조직에서 RNA를 추출한 후, 선별된 40개의 유전자에 대하여 RT-PCR로 그 발현량을 측정하였으며, RT-PCR에 사용된 모든 프라이머 서열은 하기 표 1 및 2에 기재된 바와 같다.

Oligo name	sequence (5' --> 3')
ADAM9-F	ACAAAATGTGGTGCTGGAAAG
ADAM9-R	GCAGTATTCATTTCCCATGTCC
ALCAM-F	AGAACACGATGAGGCAGACG
ALCAM-R	CCAGTAGACGACACCAGCAA
ANXA3-F	AAGCTTAGAGACCGGTGAGG
ANXA3-R	CTCTCGACTCCACCTGATTG
AR-2-F	ATGGTGAGCAGAGTGCCCTATC
AR-2-R	ATGGTCCCTGGCAGTCTCCAAA
AREG-F	GGTGCTGTCGCTCTTGATAC
AREG-R	AAATGGTTCACGCTTCCCAG
BMP7-2-F	ACTTCATCAACCCGGAAACG
BMP7-2-R	AAGTAGAGGACGGAGATGGC
CCND1-F	GATGCTGGAGGTCTGCGA
CCND1-R	AGCTGCAGGCGGCTCTT
CDKN2B-F	ACTAGTGGAGAAGGTGCGAC
CDKN2B-R	CATCATCATGACCTGGATCGC
CYP19A1-2-F	GACGCAGGATTTCCACAGAAGAG
CYP19A1-2-R	ATGGTGTCAGGAGCTGCGATCA
DKK1-F	GGTTCTGTTTGTCTCCGGTC
DKK1-R	GCTTGGTACACACTTGACCT
DLC1-2-F	GGACAGAGATGCCATTGAGGCT
DLC1-2-R	CACAAGGCTCATCCTCGTCTGA
EGR1-F	CTTCGCTAACCCCTCTGTCT
EGR1-R	TTTGATGAGCTGGGACTGGT
ERBB2-2-F	GGAAGTACACGATGCGGAGACT
ERBB2-2-R	ACCTTCCTCAGCTCCGTCTCTT
EREG-F	CCATCTTCTACAGGCAGTCC
EREG-R	CACACGTGGATTGTCTTCTG
ESR1-2-F	GCTTACTGACCAACCTGGCAGA
ESR1-2-R	GGATCTCTAGCCAGGCACATTC
FAPB4-F	AACCTTAGATGGGGGTGTCC
FAPB4-R	GTGGAAGTGACGCCTTTCAT
FOLR1-2-F	AAGGCAAGGGGGAGTGTAGA
FOLR1-2-R	ACCAGGTGATCCTTTGGGTTC
FOS-F	TTACTACCACTCACCCGCAG
FOS-R	AGTGACCGTGGGAATGAAGT
FOXA1-2-F	GCAATACTCGCCTTACGGCTCT
FOXA1-2-R	GGGTCTGGAATACACACCTTGG
GPC3-2-F	CATTGGAGGCTCTGGTGATGGA
GPC3-2-R	TTGTCCTTCGGAGTTGCCTGCT
GSTM1-2-F	TGATGTCCTTGACCTCCACCGT
GSTM1-2-R	GCTGGACTTCATGTAGGCAGAG

Oligo name	sequence (5' --> 3')
GSTM2-2-F	TGTGCGGGGAATCAGAAAAG
GSTM2-2-R	CTGCATACGGCTGTCCATAA
GSTM3-F	TGTCGGGTATAAAGCCCCTC
GSTM3-R	GAACCATAGACGACTCGCAC
HSD17B1-F	GGCTGCCTTTCAATGACGTT
HSD17B1-R	ACTCGATCAGGCTCAAGTGG
ITGB4-F	AGGATGACGACGAGAAGCAGCT
ITGB4-R	ACCGAGAACTCAGGCTGCTCAA
ITGB5-F	GCCCTGATACCTGGAACAAC
ITGB5-R	TCCCAGACTGACAACTCCAC
KLK10-2-F	GAGTGTGAGGTCTTCTACCCTG
KLK10-2-R	ATGCCTTGGAGGGTCTCGTCAC
KLK11-F	CGGCAACATCACAGACACCATG
KLK11-R	CCAGGAGATAATGCCTTGAAGAG
KLK5-F	GGCTGCTAGACTCCTATCTTCT
KLK5-R	CCGCTGCACCTTATTTCCC
KLK7-2-F	CAGGCTGTCATCCATGGTGAAG
KLK7-2-R	ATCCACGCACATGAGGTCAGAG
KLK8-F	GGGCAGGAAATACACAGTACG
KLK8-R	TGGGATGGACTGAACCACAG
LAMC2-F	CAGATCAACAGCCAACTGCG
LAMC2-R	CTTCACATCAGCCAGAATCCC
PGR-2-F	CCGCACTACTGGGATCTGA
PGR-2-R	TCACTAAAACCCTGGGGCTA
PTK6-F	GACTTCGGGTTAGCCAGGCTTA
PTK6-R	GTCGGATTTGGTGGAGTAATGGC
RARRES1-F	AGCTCTTACGTGATGTGGGA
RARRES1-R	AGGTTTTTCTTACCCACTGCC
S100P-F	CAGTGGGACATTTTCTCGGC
S100P-R	GGCTGTCTCTAGTTCCGTCA
SCGB2A2-2-F	GACCTTTGGCTCACAGAACT
SCGB2A2-2-R	AAGAGAAGGTGTGGTTTGCAG
SERPINE1-F	CTGGTTCTGCCCAAGTTCTC
SERPINE1-R	AAGACTCGTGAAGTCAGCCT
SFRP1-F	TCCCTGGTAGTGTAGCTGTG
SFRP1-R	GTGAGTTTTGCTAGGGGGTG
TIMP3-F	TCCCTGCGGAGTCGATAAAT
TIMP3-R	TAGAAAGCTCAAAACCGCCC
TIMP4-2-F	CACTACCATCTGAACTGTGGCTG
TIMP4-2-R	GCTTTCGTTCCAACAGCCAGTC
TRIM29-F	TCTCTAGTCCTCGTGGTTGC
TRIM29-R	CTTGGCTGAGCTGTTTCAGG
WISP1-2-F	GCACGCAGGGAAGAAGTGT
WISP1-2-R	GGGATGCAGCACCTATTGTC
ERBB2-2-F	GGAAGTACACGATGCGGAGACT
ERBB2-2-R	ACCTTCCTCAGCTCCGTCTCTT
ESR1-2-F	GCTTACTGACCAACCTGGCAGA
ESR1-2-R	GGATCTCTAGCCAGGCACATTC
PGR-2-F	CCGCACTACTGGGATCTGA
PGR-2-R	TCACTAAAACCCTGGGGCTA

40개의 유전자 중 유전자 시그널이 탐지가능한 영역(detectable range)에 들어가지 않은 8개의 유전자를 제외한 32개의 유전자에 대한 RT-PCR 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 그 결과, 붉은색으로 표시한 GSTM2, KLK10, RARRES1, KLK8, SFRP1, CDKN28, CYP19A1, DKK1, EGR1, FAPB4 및 FOS 유전자의 발현량이 대조군에 비해 삼중음성유방암 환자에서 증가된 발현을 나타낸다는 것을 확인하였다.

siRNA 스크리닝

유방암 세포주에 선별된 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 세포 생존율을 분석하였다. SKBR3 (HER2⁺, Herceptin sensitive, ATCC^®HTB-30^TM)와 JIMT-1 (HER2⁺, Herceptin resistant, DSMZ no. ACC 589) 세포주는 대조군으로 사용하였고, HCC38 (ATCC^® CRL-2314^™), HCC1143 (ATCC^® CRL-2321^™), HCC1806 (ATCC^® CRL-2335^™) 및 HCC1937 (ATCC^® CRL-2336^™)의 삼중음성유방암 세포주를 실험군으로 사용하였으며, 넉다운(knock-down)시켰을 때 대부분의 세포를 사멸시키는 것으로 공지된 PLK1을 양성대조군, 비-표적 서열(non-targeting sequence)을 음성대조군으로 사용하였다.

본 실시예에 사용된 siRNA는 Dharmacon사에서 입수하였으며, 선별된 40개의 유전자 중 DLC1 유전자의 siRNA는 판매되지 않아 siRNA 스크리닝에서 제외되었다. 사용된 siRNA 서열은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.

Gene Symbol	GENE ID	Gene Accession	GI Number	Sequence
ADAM9	8754	NM_001005845	54292120	GAGAUUAACUAGAGAAAGA
ADAM9	8754	NM_001005845	54292120	GGAGGGAGUUCAUAAUUCA
ADAM9	8754	NM_001005845	54292120	GUGCACAGCUAGUUCUAAA
ADAM9	8754	NM_001005845	54292120	GGUGACAGAUUUGGCAAUU
ALCAM	214	NM_001627	68163410	CUACAAGUGUUCCCUGAUA
ALCAM	214	NM_001627	68163410	CAUCUAAACCUGAAAUUGU
ALCAM	214	NM_001627	68163410	GAUGGUAUACUGUAAAUUC
ALCAM	214	NM_001627	68163410	CCUGCUCGGUGACAUAUUA
ANXA3	306	NM_005139	4826642	GGAUAUCUCUCAAGCCUAU
ANXA3	306	NM_005139	4826642	CAAGAAGCAUUAUGGCUAU
ANXA3	306	NM_005139	4826642	AGGAAUAUCAAGCAGCAUA
ANXA3	306	NM_005139	4826642	GAACAAACGAAGAUGCCUU
AR	367	NM_001011645	58535454	GAGCGUGGACUUUCCGGAA
AR	367	NM_001011645	58535454	UCAAGGAACUCGAUCGUAU
AR	367	NM_001011645	58535454	CGAGAGAGCUGCAUCAGUU
AR	367	NM_001011645	58535454	CAGAAAUGAUUGCACUAUU
AREG	374	NM_001657	22035683	UGAUAACGAACCACAAAUA
AREG	374	NM_001657	22035683	UGAGUGAAAUGCCUUCUAG
AREG	374	NM_001657	22035683	GUUAUUACAGUCCAGCUUA
AREG	374	NM_001657	22035683	GAAAGAAACUUCGACAAGA
BMP7	655	NM_001719	4502426	GAGGUGCACUCGAGCUUCA
BMP7	655	NM_001719	4502426	CAUCGAGAGUUCCGGUUUG
BMP7	655	NM_001719	4502426	GAUCAGCGUUUAUCAGGUG
BMP7	655	NM_001719	4502426	GCACAACUCGGCACCCAUG
CCND1	595	NM_053056	77628152	ACAACUUCCUGUCCUACUA
CCND1	595	NM_053056	77628152	GUUCGUGGCCUCUAAGAUG
CCND1	595	NM_053056	77628152	GCAUGUAGUCACUUUAUAA
CCND1	595	NM_053056	77628152	GCGUGUAGCUAUGGAAGUU
CDKN2B	1030	NM_004936	47132608	GCACUUAUGCAGUAAAUUA
CDKN2B	1030	NM_004936	47132608	CUUAAGCACUCAAUCAUUA
CDKN2B	1030	NM_004936	47132608	ACUAGUGGCUCUCAGUUAA
CDKN2B	1030	NM_004936	47132608	GCACUGCUUUGGGAUUUAA
CYP19A1	1588	NM_000103	13904857	CGAAAGUGCUAUCGUGGUU
CYP19A1	1588	NM_000103	13904857	GCAAAGCACCCUAAUGUUG
CYP19A1	1588	NM_000103	13904857	GAAACGUGGUGACCUGACA
CYP19A1	1588	NM_000103	13904857	GAGAAAGGCAUCAUAUUUA
DKK1	22943	NM_012242	61676924	GUUCUCAAUUCCAACGCUA
DKK1	22943	NM_012242	61676924	ACUGAUGAGUACUGCGCUA
DKK1	22943	NM_012242	61676924	AGGUCUGUCUUGCCGGAUA
DKK1	22943	NM_012242	61676924	UAGAAAUAUUCCAGCGUUG
EGR1	1958	NM_001964	31317226	GAUGAACGCAAGAGGCAUA
EGR1	1958	NM_001964	31317226	CGACAGCAGUCCCAUUUAC
EGR1	1958	NM_001964	31317226	GGACAUGACAGCAACCUUU
EGR1	1958	NM_001964	31317226	GACCUGAAGGCCCUCAAUA
EREG	2069	NM_001432	4557566	UGACCGUGAUUCUUAUUAU
EREG	2069	NM_001432	4557566	GUACAACUGUGAUUCCAUC
EREG	2069	NM_001432	4557566	GAAGUGGGUUAUACUGGUG
EREG	2069	NM_001432	4557566	GCUCAAGUGUCAAUAACAA
FABP4	2167	NM_001442	4557578	CACGAGAGUUUAUGAGAGA
FABP4	2167	NM_001442	4557578	AUACUGAGAUUUCCUUCAU
FABP4	2167	NM_001442	4557578	GGUGGAAUGCGUCAUGAAA
FABP4	2167	NM_001442	4557578	GAAAACGAGAGGAUGAUAA
FOLR1	2348	NM_016731	12719454	GAUGUUUCCUACCUAUAUA
FOLR1	2348	NM_016731	12719454	UAACAAGUGCGCAGUGGGA
FOLR1	2348	NM_016731	12719454	GCCAACCUUUCCAUUUCUA
FOLR1	2348	NM_016731	12719454	GAGGACAAGUUGCAUGAGC
FOS	2353	NM_005252	6552332	GGGAUAGCCUCUCUUACUA
FOS	2353	NM_005252	6552332	ACAGUUAUCUCCAGAAGAA
FOS	2353	NM_005252	6552332	GAACCUGUCAAGAGCAUCA
FOS	2353	NM_005252	6552332	GCAAUGAGCCUUCCUCUGA
FOXA1	3169	NM_004496	24497500	GCACUGCAAUACUCGCCUU
FOXA1	3169	NM_004496	24497500	CCUCGGAGCAGCAGCAUAA
FOXA1	3169	NM_004496	24497500	GAACAGCUACUACGCAGAC
FOXA1	3169	NM_004496	24497500	CCUAAACACUUCCUAGCUC
GPC3	2719	NM_004484	5360213	UGGUGGAGAUUGACAAGUA
GPC3	2719	NM_004484	5360213	AAGGUAGAGUUCUGGAUAA
GPC3	2719	NM_004484	5360213	GAGCAAGACGUGACCUGAA
GPC3	2719	NM_004484	5360213	GGAUCAGAUUUGCAAGUAU
GSTM1	2944	NM_146421	23065546	GGCCAUGGUUUGCAGGAAA
GSTM1	2944	NM_146421	23065546	CAAUCCAGAAUUUGAGAAA
GSTM1	2944	NM_146421	23065546	CUGCUACAAUCCAGAAUUU
GSTM1	2944	NM_146421	23065546	GGGCAUGAUCUGCUACAAU
GSTM2	2946	NM_000848	23065549	CAGUUUAUGGACAGCCGUA
GSTM2	2946	NM_000848	23065549	GCGAAGACAUUUUGGAGAA
GSTM2	2946	NM_000848	23065549	CCUACCUGAUGGAAGUAAA
GSTM2	2946	NM_000848	23065549	CACUAUCCUUCGUGAACAU
GSTM3	2947	NM_000849	39995110	UUACAGCUCUGACCACGAA
GSTM3	2947	NM_000849	39995110	GGGAAAUUCUCAUGGUUUG
GSTM3	2947	NM_000849	39995110	GAGUGGACAUCAUAGAGAA
GSTM3	2947	NM_000849	39995110	CAACAUGUGUGGUGAGACU
HSD17B1	3292	NM_000413	4504500	GCAAGCAAGUCUUUCGCGA
HSD17B1	3292	NM_000413	4504500	GGACGUGAAUGUAGUAGGG
HSD17B1	3292	NM_000413	4504500	GCACUUGGCCGUACGUCUG
HSD17B1	3292	NM_000413	4504500	GCACGGACAUCCACACCUU
ITGB4	3691	NM_001005619	54607026	GUGGAUGAGUUCCGGAAUA
ITGB4	3691	NM_001005619	54607026	ACGAGAAGCUUCACACCUA
ITGB4	3691	NM_001005619	54607026	GUACCCGUAUUGCGACUAU
ITGB4	3691	NM_001005619	54607026	GUACAGCGAUGACGUUCUA
ITGB5	3693	NM_002213	34147573	GCUCGCAGGUCUCAACAUA
ITGB5	3693	NM_002213	34147573	GGUCUAAAGUGGAGUUGUC
ITGB5	3693	NM_002213	34147573	GGGAUGAGGUGAUCACAUG
ITGB5	3693	NM_002213	34147573	GUGCAUUGGUUACAAGUUG
KLK10	5655	NM_145888	22208983	GAACGGAUGAGCACGAUCU
KLK10	5655	NM_145888	22208983	GCAAAUACAUGUCCUGGAU
KLK10	5655	NM_145888	22208983	GGAGACCAGUGCCAGGUUG
KLK10	5655	NM_145888	22208983	AGUCAUACGCUCCAACUGA
KLK11	11012	NM_006853	21618355	ACGAAAGUCUGCAAAUAUG
KLK11	11012	NM_006853	21618355	CAACAAAGACCACCGCAAU
KLK11	11012	NM_006853	21618355	GAAGAACAAUUAGACUGGA
KLK11	11012	NM_006853	21618355	CCAGAUGGCUCCUGACAGC
KLK5	25818	NM_012427	22208993	GAAGAAUUCGUCCCACUAA
KLK5	25818	NM_012427	22208993	CCAAGUGGAUCCAGGAAAC
KLK5	25818	NM_012427	22208993	GGGACAAAGUGCUUGGUGU
KLK5	25818	NM_012427	22208993	ACAAUGAUGUUUCCUGUGA
KLK7	5650	NM_139277	21327704	GAUCAAGGCCUCGAAGUCA
KLK7	5650	NM_139277	21327704	GCACGAAGGUUUACAAGGA
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KLK7	5650	NM_139277	21327704	UGUCAUCCAUGGUGAAGAA
KLK8	11202	NM_144507	21464130	AUGGUGCACUCCAGGGCAU
KLK8	11202	NM_144507	21464130	CGGCCAAGACGUGGAUGUU
KLK8	11202	NM_144507	21464130	CACUAGAUCUCCCUUAAUA
KLK8	11202	NM_144507	21464130	UCAAGAAGAUCAUAGGCAG
LAMC2	3918	NM_018891	9845499	GCACAAGAAGCACUGAGUA
LAMC2	3918	NM_018891	9845499	GCAGGUGUUUGAAGUGUAU
LAMC2	3918	NM_018891	9845499	GGGUGGUGAUGGAGUAGUA
LAMC2	3918	NM_018891	9845499	GAAGGUUACUGCGGAAUCU
PTK6	5753	NM_005975	27886594	GAGAAAGUCCUGCCCGUUU
PTK6	5753	NM_005975	27886594	CCAUUAAGGUGAUUUCUCG
PTK6	5753	NM_005975	27886594	UGCCCGAGCUUGUGAACUA
PTK6	5753	NM_005975	27886594	GGCCAUUACUCCACCAAAU
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RARRES1	5918	NM_002888	46255040	UGGAAGCUCUUACGUGAUG
RARRES1	5918	NM_002888	46255040	GCGCUUCACUUCUUCAACU
S100P	6286	NM_005980	45827727	ACAAGGAUGCCGUGGAUAA
S100P	6286	NM_005980	45827727	GAAGGCAGGACUCAAAUGA
S100P	6286	NM_005980	45827727	CAAUGGAGAUGCCCAGGUG
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SCGB2A2	4250	NM_002411	4505168	GACAGCAGUCUUUGUGAUU
SCGB2A2	4250	NM_002411	4505168	CUACAAAUGCCAUAGAUGA
SCGB2A2	4250	NM_002411	4505168	GACAAUCAAUCCACAAGUG
SCGB2A2	4250	NM_002411	4505168	GAAACUCUGAGCAAUGUUG
SERPINE1	5054	NM_000602	10835158	GGACAUCCAGCGUGACGGA
SERPINE1	5054	NM_000602	10835158	UGCAGAAAGUGAAGAUCGA
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SERPINE1	5054	NM_000602	10835158	GAGACAGGCAGCUCGGAUU
SFRP1	6422	NM_003012	56117837	CCGAGAUGCUUAAGUGUGA
SFRP1	6422	NM_003012	56117837	GAAAUCUGAGGCCAUCAUU
SFRP1	6422	NM_003012	56117837	GAACAUCUCUGUGCCAGCG
SFRP1	6422	NM_003012	56117837	GAAGAAGCUUGUGCUGUAC
TIMP3	7078	NM_000362	75905820	GCUGACAGGUCGCGUCUAU
TIMP3	7078	NM_000362	75905820	GGGCUGAACUAUCGGUAUC
TIMP3	7078	NM_000362	75905820	CCGACAUGCUCUCCAAUUU
TIMP3	7078	NM_000362	75905820	GCUACUACCUGCCUUGCUU
TIMP4	7079	NM_003256	48255910	GCUCCGGUAUGAAAUCAAA
TIMP4	7079	NM_003256	48255910	GAAGCAGUAUCUCUUGACU
TIMP4	7079	NM_003256	48255910	GAAGGUAGUUCCGGCCAGU
TIMP4	7079	NM_003256	48255910	AACGAAAGCUCUAUGGUUA
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TRIM29	23650	NM_058193	17402906	GAAGAGAUACUCCAUGUAC
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TRIM29	23650	NM_058193	17402906	AGCCGUAACUUCAUUGAGA
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WISP2	8839	NM_003881	18491001	AAACAGUGCCUUCUAGAGC
WISP2	8839	NM_003881	18491001	GCAAGUGCUGCCCUGAGUG
PLK1	5347	NM_005030	34147632	GCACAUACCGCCUGAGUCU
PLK1	5347	NM_005030	34147632	CCACCAAGGUUUUCGAUUG
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ON-TARGETplus Non-targeting Control	0		0	UGGUUUACAUGUCGACUAA
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ON-TARGETplus Non-targeting Control	0		0	UGGUUUACAUGUUUUCUGA
ON-TARGETplus Non-targeting Control	0		0	UGGUUUACAUGUUUUCCUA

39개의 유전자를 각각 siRNA로 넉다운(knock-down)시켰을 때, 세포 생존율을 도 11에 나타낸 바와 같이 표시하였다. 그 결과, 4개의 삼중음성유방암 세포 중 HCC1937 세포는 대부분의 유전자에 대한 siRNA에 의해 세포 생존율이 현저하게 감소하여 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인하였으며, HCC38, HCC1143 및 HCC1806 세포 또한 일부 유전자에 대한 siRNA에 의해 세포 생존율이 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에서 선별된 예후 관련 바이오마커 후보 유전자는 삼중음성유방암 환자를 치료하기 위한 타겟으로 유용함을 확인할 수 있다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Biomarkers for Predicting Triple Negative Breast Cancer Prognostication <130> 1042737 <160> 251 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAM9 forward primer <400> 1 acaaaatgtg gtgctggaaa g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAM9 reverse primer <400> 2 gcagtattca tttcccatgt cc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALCAM forward primer <400> 3 agaacacgat gaggcagacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALCAM reverse primer <400> 4 ccagtagacg acaccagcaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA3 forward primer <400> 5 aagcttagag accggtgagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA3 reverse primer <400> 6 ctctcgactc cacctgattg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AR-2 forward primer <400> 7 atggtgagca gagtgcccta tc 22 <210> 8 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reverse primer <400> 32 gtggaagtga cgcctttcat 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOLR1-2 forward primer <400> 33 aaggcaaggg ggagtgtaga 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOLR1-2 reverse primer <400> 34 accaggtgat cctttgggtt c 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOS forward primer <400> 35 ttactaccac tcacccgcag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOS reverse primer <400> 36 agtgaccgtg ggaatgaagt 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA1-2 forward primer <400> 37 gcaatactcg ccttacggct ct 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA1-2 reverse primer <400> 38 gggtctggaa tacacacctt gg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3-2 forward primer <400> 39 cattggaggc tctggtgatg ga 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3-2 reverse primer 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<211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP4 siRNA <400> 231 gcuccgguau gaaaucaaa 19 <210> 232 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP4 siRNA <400> 232 gaagcaguau cucuugacu 19 <210> 233 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP4 siRNA <400> 233 gaagguaguu ccggccagu 19 <210> 234 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP4 siRNA <400> 234 aacgaaagcu cuaugguua 19 <210> 235 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIM29 siRNA <400> 235 ggaauuuggu gcauugaug 19 <210> 236 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIM29 siRNA <400> 236 gaagagauac uccauguac 19 <210> 237 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIM29 siRNA <400> 237 gaagccaccc guuaccuuu 19 <210> 238 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRIM29 siRNA <400> 238 agccguaacu ucauugaga 19 <210> 239 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WISP2 siRNA <400> 239 uuucuggccu ugucucuuc 19 <210> 240 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WISP2 siRNA <400> 240 gcgaccaacu ccacgucug 19 <210> 241 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WISP2 siRNA <400> 241 aaacagugcc uucuagagc 19 <210> 242 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WISP2 siRNA <400> 242 gcaagugcug cccugagug 19 <210> 243 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK1 siRNA <400> 243 gcacauaccg ccugagucu 19 <210> 244 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK1 siRNA <400> 244 ccaccaaggu uuucgauug 19 <210> 245 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK1 siRNA <400> 245 gcucuucaau gacucaaca 19 <210> 246 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLK1 siRNA <400> 246 ucucaaggcc uccuaauag 19 <210> 247 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Non-targeting Control siRNA <400> 247 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 248 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Non-targeting Control siRNA <400> 248 ugguuuacau guuguguga 19 <210> 249 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Non-targeting Control siRNA <400> 249 ugguuuacau guuuucuga 19 <210> 250 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ON-TARGETplus Non-targeting Control siRNA <400> 250 ugguuuacau guuuuccua 19 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGR-2 reverse primer <400> 251 tcactaaaac cctggggcta 20

Claims

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GSTM2(Entrez, 2946) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 GSTM2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 GSTM2 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 조성물.
제3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 삼중음성유방암 예후 예측용 키트.
제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 삼중음성유방암 예후 예측용 키트.
a) 삼중음성유방암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 GSTM2(Entrez, 2946) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 얻는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준이 외과 수술을 받은 후 36개월 이후 재발하지 않고 생존하거나 완치된 양호한 예후를 가진 것으로 알려진 삼중음성유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준보다 높은 경우, 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발하는 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하고,
상기 a) 단계에서 얻은 발현수준이 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발하는 불량한 예후를 가진 것으로 알려진 삼중음성유방암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 외과 수술을 받은 후 36개월 이후 재발하지 않고 생존하거나 완치되는 양호한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계;
를 포함하는 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제7항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것인 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제7항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것인 삼중음성유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
a) 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발된 불량한 예후(poor prognosis)의 삼중음성유방암 환자에서 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
b) 후보물질이 처리된 상기 불량한 예후의 삼중음성유방암 환자의 시료에서 GSTM2(Entrez, 2946) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 상기 불량한 예후의 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는, 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발되는 불량한 예후의 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
서열번호 159 내지 162로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 siRNA; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발되는 불량한 예후(poor prognosis)의 삼중음성유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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