KR20180018377A

KR20180018377A - 광학 기반 바이오센싱을 위한 이중 금속 나노클러스터 및 전도성 고분자 구획을 포함한 이방성 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용

Info

Publication number: KR20180018377A
Application number: KR1020170100358A
Authority: KR
Inventors: 임동우; 황은영
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2018-02-21
Also published as: US20190170743A1; KR101986545B1; KR20180018375A; US11913946B2; KR101986531B1; KR101986535B1; KR101986537B1; KR20180018376A; KR20180018378A

Abstract

본 발명은 광학 기반 바이오센싱을 위한 이중 금속 나노클러스터 및 전도성 고분자 구획을 포함한 이방성 나노구조체, 즉, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 표적 물질 검출에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비대칭형 야누스 나노프로브는, 금속 나노클러스터 내의 코어-쉘 나노입자 사이의 입자 간 커플링으로부터 SERS 특성을 고도로 향상시킨다. 고분자 구획에서 타겟을 포획하고 금속 나노클러스터 구획에서 SERS를 측정하여 타겟 검출과 광학 특성을 동시에 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 비대칭형 야누스 나노프로브는 SERS 기반 바이오센싱을 위한 기능성 나노프로브로 활용할 수 있다.

Description

광학 기반 바이오센싱을 위한 이중 금속 나노클러스터 및 전도성 고분자 구획을 포함한 이방성 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용{Anisotropic Nanostructures with Bimetallic Nanocluster and Conducting Polymer Compartment for Photonics-based Biosensing, process for producing the same, and use thereof}

본 발명은 광학 기반 바이오센싱을 위한 이중 금속 나노클러스터 및 전도성 고분자 구획을 포함한 이방성 나노구조체, 즉, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 표적 물질 검출에 관한 것이다.

라만 분광법은 병원체의 검출 및 확인을 위해 연구되어 왔다. 구체적으로 표면-증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering, 이하 "SERS"라고 함) 기반 검출 방법이 고감도 분석법으로 각광을 받고 있다. SERS를 ELISA 및 PCR을 포함하는 검출 기술과 비교할 때, SERS는 고가의 시약을 매우 적게 사용하고 액체 또는 고체 시료에 대해 동등하게 적합하며(비특허문헌 1), 단기간에 비파괴적 생체내 및 시험관내 분석 모두에 대한 검출이 가능하도록 한다(비특허문헌 2).

플라즈몬(plasmon) 측정법의 발전으로, SERS는 높은 신호대 잡음비, 좁은 대역폭 및 다중화 기능을 갖춘 피분석물의 분광 검출을 위한 강력한 기술로 떠오르고 있다(비특허문헌 3). 최적화되고 재현성 있는 SERS 반응을 가지는 플라즈몬적으로 조작된 금속 나노입자를 개발하기 위한 핵심 쟁점은 서스펜션(suspension) 상태에서 조절가능한 응집체일 것이다. 집적된 금속 나노입자는 SERS 기반 센싱에 유용할지라도, 대칭형 나노 구조에서 발생하는 위치 선택성(regioselectivity)을 지닌 금속 나노입자에 분자를 부착하는 어려움을 포함하여 고유한 한계가 있다. 따라서 대칭성을 깨뜨리는 것은 시너지 효과를 발휘하고 선택적 기능화를 가능하게 하는데 중요하다.

그러나, 금속 나노입자 클러스터를 가지며 각 구획에서 고도로 향상된 광학 특성 및 상이한 표면 기능성을 나타내는 비대칭형 야누스 나노 구조물의 제조에 대한 보고는 없었다.

이에, 본 발명자들은 SERS 기반 표적 물질 검출을 위해, 이중 금속 나노클러스터를 가지는 비대칭형 야누스 나노프로브를 개발하는 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

Neng, J., et al., Surface-enhanced Raman scattering (SERS) detection of multiple viral antigens using magnetic capture of SERS-active nanoparticles. Biosens Bioelectron, 2013. 41: p. 316-21 Jiang, X., et al., Surface-Enhanced Raman Scattering-Based Sensing In Vitro: Facile and Label-Free Detection of Apoptotic Cells at the Single-Cell Level. Analytical Chemistry, 2013. 85(5): p. 2809-2816. McNay, G.; Eustace, D.; Smith, W. E.; Faulds, K.; Graham, D., Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) and Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering (SERRS): A Review of Applications. Applied Spectroscopy 2011, 65 (8), 825-837.

본 발명의 목적은 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브를 제공한다:

라만 염료를 가지고, 코어-쉘 구조로 이루어진 이중 금속 나노클러스터 구획;

및 전도성 고분자 구획;

으로 구성된 나노프로브로,

상기 나노프로브는 상기 전도성 고분자 구획이 상기 이중 금속 나노클러스터 구획의 한쪽 면에만 산화되어 비대칭형 구조를 나타냄.

본 발명에서 “프로브”란, 검출하고자 하는 표적(표적) 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 “나노프로브”란, 나노 크기의 프로브를 의미한다.

상기 "나노"란 이 기술분야의 통상의 기술자들이 이해하는 정도의 크기 범위를 포함한다. 구체적으로 상기 크기 범위는 0.1 에서 1000 nm의 크기일 수 있으며, 더 구체적으로는 10 에서 1000 nm, 더욱 바람직하게는 20 에서 500 nm, 더 더욱 바람직하게는 40 에서 250 nm 일 수 있다.

본 발명에서 상기 “라만 염료”는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, MGITC(Malachite green isothiocyanate), RBITC(rhodamine B isothiocyanate), 로다민6G, 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 이중 금속 나노클러스터 구획은, 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 코어와; 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 쉘;로 구성된 이중 금속 나노클러스터인 것일 수 있다.

상기 코어 금속과 상기 쉘 금속은 서로 동일한 금속일 수도 있고, 동일하지 않은 금속일 수도 있다.

상기 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole), 폴리싸이오펜(polythiophene), poly(3,4-ethylene dioxythiophene)(PEDOT) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 폴리아닐린일 수 있다.

본 발명에서 상기 "비대칭형 야누스 나노프로브"란, 구분되는 두 개의 서로 다른 구획(라만 염료를 가지며 코어-쉘 구조로 이루어진 이중 금속 나노클러스터 구획 및 전도성 고분자 구획)으로 구성된 나노프로브로, 전도성 고분자 구획이 상기 이중 금속 나노클러스터 구획의 한쪽 면에만 산화되어 성장하는, 즉, 편심 증착(eccentrically deposited)되는 비대칭 구조를 나타낸다. 본 명세서 상에서 "비대칭형 야누스 나노프로브"는 그 구조가 이중 금속 나노클러스터 구획-전도성 고분자 구획을 포함함에 따라, "비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자" 또는 “비대칭형 나노프로브” 또는 “비대칭형 야누스 나노 구조” 또는 “비대칭형 나노 구조”로도 명명된다.

본 발명에서 상기 “이중 금속”이란, 금속 코어-금속 쉘 구조를 이루는 두 종류의 금속을 의미한다.

본 발명에서 상기 “금속 나노클러스터”란, 금속 나노입자들이 모여서 응집된 응집물(aggregates)을 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.

본 발명에서 상기 “이중 금속 나노클러스터”란, 코어 금속 나노클러스터 위에 다른 종류의 금속 이온이 환원되어 코어-쉘 구조를 이루는 응집물(aggregates)을 의미한다.

본 발명에 따른 코어-쉘 구조로 이루어진 이중 금속 나노클러스터 구획; 및 전도성 고분자 구획으로 이루어진 비대칭형 야누스 나노구조체는, 상기 이중 금속 나노클러스터 내의 코어-쉘 나노입자 사이의 입자 간 커플링으로부터 SERS 특성을 고도로 향상시킬 수 있다. 또한 고분자 구획에 검출하고자 하는 표적에 대한 항체를 부착시켜서 표적과 항체 사이의 반응성도 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 비대칭형 야누스 나노프로브는 SERS 기반 표적 물질 검출용의 나노프로브로 활용 가능하다.

다른 측면에서 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법을 제공한다:

i) 코어(core)를 형성하는 금속 나노입자 및 라만 염료를 혼합하고 가열 또는 응집하여 라만 염료를 가지는 코어 금속 나노입자 클러스터를 형성하고;

ⅱ) 전도성 고분자 단량체 및 계면활성제를 용해시킨 수용액에 상기 코어 금속 나노입자 클러스터를 첨가하고;

ⅲ) 상기 ⅱ)의 코어 금속 나노클러스터가 첨가된 용액에 금속 이온 용액을 첨가하여 상기 금속 이온과 상기 전도성 고분자 단량체 사이의 산화-환원 반응을 수행하고; 그리고

ⅳ) 상기 금속 이온이 상기 전도성 고분자가 제공하는 전자를 받아 환원되면서 코어 금속 나노입자 표면에 증착되어 코어-쉘 구조의 이중 금속 나노입자 클러스터 구획을 형성하고; 상기 전도성 고분자 단량체는 산화되면서 상기 이중 금속 나노클러스터 구획의 한쪽 면에만 증착되어 전도성 고분자로 성장하면서 비대칭형적으로 전도성 고분자 고분자 구획을 형성하는; 단계.

상기 i) 단계 이후에, 상기 코어 금속 나노클러스터를 단백질로 안정화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 단백질은 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 BSA일 수 있다.

상기 i) 단계의 코어 금속은 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에 널리 사용되고 있는 금속은 어느 것이나 제한없이 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 코어 금속은 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 ⅲ) 단계의 금속 이온은 금 이온, 은 이온, 구리 이온 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 금 이온은 염화금수화물(Gold(III) chloride hydrate), 클로로카보닐금(Chlorocarbonylgold), 테트라클로로금산수소(Hydrogen tetrachloroaurate) 테트라클로로금산수소수화물(Hydrogen tetrachloroaurate hydrate), 클로로트리에틸포스핀금화합물(Chlorotriethylphosphinegold), 클로로트리메틸포스핀금화합물(Chlorotrimethylphosphinegold), 다이메틸(아세틸아세토네이트)금화합물(Dimethyl(acetylacetonate)gold), 염화금(Gold(I) chloride), 시안화금(Gold cyanide), 황화금(Gold sulfide) 및 이의 혼합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 염화금수화물일 수 있다.

상기 은 이온은 질산은(AgNO₃), 테트라플루오르붕산염 은(AgBF₄), 트리플루오르메탄술폰산염 은(AgCF₃SO₃), 과염소산은(AgClO₄), 아세트산은(Ag(CH₃COO)), 헥사플루오르인산염 은(AgPF₆), Ag(CF₃COO) 및 이의 혼합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 질산은일 수 있다.

상기 구리 이온은 구리(II) 아세틸아세토네이트(Cu(acac)₂), 염화구리(CuCl), 염화구리(II)(CuCl₂), 구리(II) 헥사플루오로아세틸아세토네이트(Cu(hfac)₂), 구리(II) 트리플루오로아세틸클로라이드(Cu(tfac)₂), 구리(II) 디피브알로이메타네이트(Cu(dpm)₂), 구리(II) 펜타플루오로디메틸헵탄디온(Cu(ppm)₂), 구리(II) 헵타플루오로디메틸옥탄(Cu(fod)₂), 구리(II) 이미노펜타논(Cu(acim)₂), 구리(II) 헥사플루오로-[(트리플루오로에틸)이미노]-펜타논(Cu(nona-F)₂), 구리(II) 아세틸아세토에틸렌디아민(Cu(acen)₂), 질산구리(Cu(NO₃)₂), 황산구리(CuSO₄) 및 이의 혼합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 ⅱ) 단계의 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole), 폴리싸이오펜(polythiophene), poly(3,4-ethylene dioxythiophene)(PEDOT) 및 폴리아닐린(polyaniline)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 폴리아닐린일 수 있다.

상기 ⅲ) 단계의 산화-환원 반응 이후에, 상기 반응 용액을 계면활성제 용액으로 인큐베이션 하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 ⅱ) 단계 및 상기 ⅲ) 단계의 산화-환원 반응 이후에서, 상기 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 및 트리톤 X-200(Triton X-200)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 SDS일 수 있다.

상기 ⅳ) 단계의 전도성 고분자로 성장하는 것은 표면 주형 중합법(surface-templated polymerization)에 의한 것일 수 있다.

상기 "표면 주형 중합법"이란 산화-환원 반응에 기반한 중합법으로, 본 명세서에서는 질산은과 아닐린 단량체 간의 자발적인 산화-환원 반응을 통해 이중 금속 나노클러스터 상에 전도성 고분자인 폴리아닐린이 증착되는 것을 의미한다. 구체적으로, 1급 아민 그룹을 가진 아닐린 단량체가 질산은에 전자를 공여하고 은 이온은 산화-환원 반응의 균형을 맞추기 위해 상응하는 전자를 받음으로써 전도성 고분자 단량체가 산화 중합됨에 따라 이중 금속 나노클러스터 상에 폴리아닐린이 증착되었다.

본 발명에 따른 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 합성 및 SERS 기반의 응용에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다. 도 1 (a)는 환원 산화 반응에 기반한 SERS 나노프로브의 제조 방법을 나타낸다. 첫째, 금 나노입자(AuNP) 클러스터는 AuNP를 라만 염료의 존재 하에서 응집시켜 형성되었고, BSA 코팅에 의해 안정화되었다. 구체적으로, 시트르산 캡핑된 AuNP는 라만 염료인 MGITC 또는 RBITC와 각각 1.5 μM 또는 3.8 μM의 최종 농도로 혼합되었다. 또한, 질산은과 시트르산 나트륨을 AuNP 콜로이드 용액에 첨가하고, 95 ℃에서 10-60 분 동안 인큐베이션하였다. 은 이온이 Au로 환원될 때, 표면에 라만 염료가 흡착됨으로써 Au 나노입자가 성장하고 동시에 응집되었다. MGITC와 RBITC의 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 그룹(-N = C = S)이 AuNP 표면에 강하게 결합되면 음전하를 띤 입자와 양이온성 표면 전하를 갖는 라만 염료로 표지된 입자 사이에서 정전기적 상호 작용이 발생하여 AuNP 클러스터를 형성하였다. 라만 염료를 포함하는 Au 나노클러스터는 더 이상의 응집을 막기 위해 BSA에 의해 안정화되었다. 둘째, 비대칭형 이중 금속 나노클러스터-고분자 나노구조체를 질산은과 아닐린 단량체 간의 산화-환원 반응을 통해 제조하였다. 농축된 AuNP 클러스터는 아닐린 모노머 및 계면활성제인 SDS를 함유하는 용액에 첨가되었다. 혼합 후, 질산은은 AuNP 클러스터에서 은 이온을 감소시켜 이중 금속 Au(코어)-Ag(쉘) 나노클러스터를 형성함으로써 폴리(아닐린)으로의 산화 중합을 개시하기 위해 용액에 첨가되었다. SDS의 존재 하에서, 이중 금속 나노클러스터와 폴리(아닐린)의 이방성(비대칭성) 구획화는 표면 영역을 최소화함으로써 폴리(아닐린)-이중 금속 나노클러스터와-물 간의 계면 장력의 균형을 맞추기 위해 형성되었다. 도 1 (b)는 두 전구체 사이의 자발적인 산화 환원 반응을 나타낸다. 1급 아민 그룹을 가진 아닐린 단량체는 질산은에 전자를 공여하고 은 이온은 산화-환원 반응의 균형을 맞추기 위해 상응하는 전자를 받았다. 도 1 (c)는 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노프로브를 이용한 SERS 기반 바이오센싱(biosensing) 방법을 보여준다. 구체적으로, 중합체 구획을 선택적으로 작용화시켜 항체를 도입하였다. 표적 분자가 존재하면, 표적 특이적 항체가 결합된 SERS 나노프로브와 자성 비드가 상응하는 표적을 포착하여 SERS 나노프로브, 표적 및 자성 비드로 구성된 샌드위치형 면역 복합체를 형성하였다. 이들 복합체는 자기장을 가함으로써 세척되었고, 라만 이동(Raman shift)은 표적 농도에 따라 나타났다.

또 다른 측면에서 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법을 제공한다:

a) 검출하고자 하는 표적 물질이 포함된 시료액을 준비하고;

b) 자성 나노입자에 상기 표적에 대한 제1 항체를 고정하여 준비하고;

c) 상기 금속 나노프로브에 상기 표적에 대한 제2 항체를 고정하여 준비하고;

d) 상기 제1 항체가 고정된 자성 나노입자를 상기 시료액에 첨가하여 상기 표적과 상기 자성 나노입자의 제1 항체가 접합된 면역복합체를 형성하고;

e) 상기 제2 항체가 고정된 금속 나노프로브를 상기 제1 항체가 접합된 면역복합체가 포함된 용액에 첨가하여 금속 나노프로브의 제2 항체-표적-자성 나노입자의 제1 항체의 샌드위치 면역복합체를 형성하고;

f) 자기장을 이용하여 상기 샌드위치 면역복합체를 형성하지 않은 자성 나노입자 및 금속 나노프로브를 분리하고; 그리고

g) 상기 샌드위치 면역복합체의 라만 신호를 측정하는; 단계.

상기 표적 물질은 단백질 또는 병원균일 수 있다.

상기 단백질은 항원, 생물학적 압타머(biological aptamer), 수용체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 "샌드위치형 면역 복합체"란 항체-항원-항체 반응을 통해 결합된 면역복합체를 의미한다. 항원이 항체 중간에 삽입되어 샌드위치 모양을 나타냄에 따라 명명되었다.

본 발명에 따른 비대칭형 야누스 나노프로브는, 금속 나노클러스터 내의 코어-쉘 나노입자 사이의 입자 간 커플링으로부터 SERS 특성을 고도로 향상시킨다. 고분자 구획에서 타겟을 포획하고 금속 나노클러스터 구획에서 SERS를 측정하여 타겟 검출과 광학 특성을 동시에 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 비대칭형 야누스 나노프로브는 SERS 기반 바이오센싱을 위한 기능성 나노프로브로 활용할 수 있다.

도 1은 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체의 합성 및 SERS 기반의 바이오센싱 응용에 대한 모식도이다; (a) 환원 산화 반응에 기반한 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체의 제조 방법, (b) 질산은과 아닐린 단량체 사이의 자발적인 산화 환원 반응, (c) 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체를 이용한 SERS 기반 바이오센싱 방법.
도 2는 AuNP, 라만 염료 유도된 Au 나노클러스터 및 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼이다; (a) AuNP(Au) 및 MGITC 유도된 Au 나노클러스터(Au_MG)의 UV-Vis 흡수 피크, (b) AuNP(Au) 및 RBITC 유도된 Au 나노클러스터(Au_RB)의 UV-Vis 흡수 피크, (c) 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체(Au-MG@Ag PANI 또는 Au-RB@Ag PANI)의 UV-Vis 흡광 피크, (d) AuNP, Au 나노클러스터 및 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체(Au-MG@Ag PANI 또는 Au-RB@Ag PANI)의 유체역학 직경과 크기 분포. AuNP, MGITC- 또는 RBITC- 유도된 Au 나노클러스터의 평균 직경은 18.9 ± 0.4 nm, 152.9 ± 2.8 nm 및 115.7 ± 1.8 nm이었고, MGITC- 또는 RBITC- 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노 구조는 205 ± 4.5 nm 및 186.3 ± 2.1 nm이었다.
도 3은 다양한 인큐베이션 시간에서 클러스터를 형성하는 동안의 MGITC 또는 RBITC 유도된 Au 나노클러스터의 상대적 라만 스펙트럼이다; (a) MGITC 유도된 Au 나노클러스터의 상대적 라만 스펙트럼, (b) MGITC 유도된 Au 나노클러스터의 라만 강도, (c) RBITC 유도된 Au 나노클러스터의 상대적 라만 스펙트럼, (d) RBITC 유도된 Au 나노클러스터의 라만 강도, (e) MGITC-표지 AuNPs(Au), MGITC 유도된 Au 나노클러스터(AuNC) 및 이를 포함하는 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체(Au-Ag cluster PANI, Au-MG@Ag PANI)의 상대적 라만 스펙트럼, (f)는 RBITC -표지 AuNPs(Au), RBITC 유도된 Au 나노클러스터(AuNC) 및 이를 포함하는 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노구조체(Au-Ag cluster PANI, Au-RB@Ag PANI)의 상대적 라만 스펙트럼.
도 4는 최종 농도 1.5 μM의 MGITC로 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 TEM 이미지이다; (a, b) BSA 안정화하지 않은 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자가 형성되지 않았다, (c, d) BSA 안정화한 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 스케일 바는 (a) 100 nm, (b) 10 nm, (c) 200nm, (d) 20 nm.
도 5는 최종 농도 3.75 μM의 RBITC로 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 TEM 이미지이다; (a, b) BSA 안정화하지 않은 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자가 형성되지 않았다, (c, d) BSA 안정화한 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 스케일 바는 (a, c) 100 nm, (b, d) 20 nm.
도 6은 최종 농도 0.75 μM의 MGITC로 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 TEM 이미지이다; (a, b) BSA 안정화하지 않은 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 낮은 수준의 클러스터링으로 인해 BSA 코팅 없이 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자가 형성되었다, (c, d) BSA 안정화한 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. BSA 코팅을 하지 않거나 BSA 코팅을 한 두 개의 나노 구조에는 유의한 차이가 없었다. 스케일 바는 (a, c) 200 nm, (b) 50 nm, (d) 20 nm.
도 7은 최종 농도 1.9 μM의 RBITC로 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 TEM 이미지이다; (a, b) BSA 안정화하지 않은 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. 낮은 수준의 클러스터링으로 인해 BSA 코팅 없이 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자가 형성되었다, (c, d) BSA 안정화한 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자. BSA 코팅을 하지 않거나 BSA 코팅을 한 두 개의 나노 구조에는 유의한 차이가 없었다. 스케일 바는 (a, c) 200 nm, (b, d) 20 nm.
도 8은 CEA 농도에 따른 서로 다른 표적 농도의 라만 스펙트럼 및 라만 강도이다. 1618 cm^-1에서 MGITC로 유도된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자의 SERS 피크 강도는 CEA 농도와 함께 선형적으로 증가했다. R² = 0.9047. control은 CEA가 없는 대조군이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 또한 본 발명에서 인용하고 있는 참고문헌은 본 발명의 명세서의 일부로 통합된다.

< 실시예 1> 금 나노클러스터(gold nanoparticle clusters, AuNCs ) 제조

금 나노입자(gold nanoparticles, AuNPs)는 시트르산(citrate) 환원 절차에 따라 합성되었다. 구체적으로, 염화 금(III) 수화물(HAuCl4.3H2O, Sigma-Aldrich, USA)의 모액(stock solution)을 100mL의 탈이온수에 총 농도 0.01 %가 되도록 첨가하고, 용액을 1.5 ml의 1 % 시트르산 나트륨(sodium citrate) 용액을 신속하게 첨가하면서 강하게 교반하며 끓였다. 용액은 5 분 이내에 금 이온의 환원을 나타내는 적색으로 변하였고, 반응은 20 분 동안 더 진행되었다. 생성된 용액을 실온으로 냉각시켰다. 또한, AuNP 클러스터는 AuNP를 라만 염료의 존재 하에서 응집시켜 제조하였다. 유리 바이알 내 시드(seed) AuNP를 라만 활성 분자인 MGITC(Malachite green isothiocyanate, Invitrogen, USA)의 모액, 질산은 및 시트르산 나트륨을 혼합하여 최종 농도가 1.5 μM 또는 0.75 μM MGITC, 0.5 mM 질산은 및 1.0 mM 시트르산 나트륨이 되도록 하였다. 혼합물을 5 분 동안 교반한 후 바이알을 10-60 분 동안 95℃로 가열하였다. 가열하는 동안 작은 분액(aliquots)을 공지된 간격으로 회수하여 MGITC를 갖는 금 나노클러스터의 UV-Vis 흡수 밴드 및 라만 강도를 특정하였다. 동일한 방법으로 RBITC(rhodamine B isothiocyanate, Sigma-Aldrich, USA)를 갖는 AuNP 클러스터는 최종 농도가 3.8 μM 또는 1.9 μM RBITC가 되도록 제조되었다. 충분한 클러스터링 후, 반응 용액을 실온으로 급속히 냉각시키고 0.5 % BSA를 첨가하여 클러스터를 안정화시켜 이후의 응집을 막았다.

< 실시예 2> 이중 금속 나노클러스터-고분자의 비대칭형 야누스 나노프로브 제조

Au 코어-Ag 쉘의 이중 금속 나노클러스터 구획과 폴리(아닐린) 구획으로 구성된 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자는 산화-환원 반응에 기초한 표면 주형 중합을 통해 제조되었다. Au 코어-Ag 쉘을 제조하기 위해, 실시예 1의 BSA로 안정화된 AuNP 클러스터 용액 15 mL을 7,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 농축시킨 후, 상등액을 제거하였다. 7.5 mL의 탈이온수에 아닐린과 SDS를 최종 농도가 각각 5 mM과 0.9 mM가 되도록 용해시켰다. 제조된 용액에 농축된 AuNP 클러스터를 첨가한 후, 간단히 교반하고(voltexing), 질산은 용액 2.5 ml을 첨가하고 혼합하여 최종 농도가 2.5 mM가 되도록 하였다. 반응은 어두운 조건에서 실온에서 24 시간 동안 교반하지 않고 진행되었다. 이때 Au 코어에 Ag 쉘이 형성되었다. 반응액을 3.6 mM SDS 용액에서 밤새 인큐베이션하여 Au 시드의 한쪽에만 폴리(아닐린)을 편심 증착(eccentrically deposited)하였다. 계면활성제인 SDS는 폴리(아닐린)-Ag 및 폴리(아닐린)-물인 2개의 인접한 상 사이의 계면 장력에 영향을 미치고, 총 표면 에너지를 최소화하기 위해 Au 시드의 한 면에 별도의 폴리(아닐린) 구획이 형성되었다. 그 결과 생성된 용액을 8,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 정제하고, 응집을 방지하기 위해 3.6 mM의 SDS 용액에 재현탁시켰다.

최종 농도 1.5 μM의 MGITC로 유도된 이중 금속 나노클러스터를 포함하는 비대칭형 야누스 나노구조체의 TEM 이미지를 도 4에 나타내었다. 도 4 (a) 및 (b)에서 보여지듯이, Au 나노클러스터를 BSA 코팅하지 않은 경우, Au 코어-Ag 쉘을 가진 이중 금속 나노클러스터가 잘 형성되지 않았다. 그러나, Au 나노클러스터를 BSA로 코팅하면, 도 4 (c) 및 (d)에 도시된 바와 같이, 이중 금속 나노클러스터 구획-고분자 구획으로 구성된 비대칭형 야누스 나노구조체가 형성되었다. 유사하게, 최종 농도 3.8 μM의 RBITC에서 RBITC로 유도된 Au 나노클러스터로부터 비대칭형 야누스 나노구조체가 산화 환원 반응을 통해 형성되었다.

도 5 (a) 및 (b)는 BSA 코팅이 없는 경우, 비대칭형 야누스 나노구조체가 존재하지 않음을 나타내었다. 그러나 도 5 (c) 및 (d)에 도시된 바와 같이, BSA로 MNP 클러스터를 안정화시킨 경우, 비대칭형 고분자 구획을 갖는 야누스 나노구조체가 형성되었다.

도 6은 최종 농도 0.75 μM의 MGITC로 유도된 야누스 나노클러스터를 포함하는 비대칭형 야누스 나노구조체의 TEM 이미지를 나타낸다. 클러스터 크기를 제어하기 위해 라만 염료의 농도가 최적화되었다. 낮은 농도의 MGITC가 AuNP의 응집을 유도하기 위해 사용되었을 때, 몇 개의 나노클러스터가 관찰되었다. 도 6 (a) 및 (b)는 BSA 안정화가 없는 비대칭형 야누스 나노구조체를 나타낸다. 1.5 μM 농도의 MGITC를 사용하여 제조된 나노구조체와 비교하여, BSA 코팅 없이도 낮은 수준의 금속 클러스터링으로 인해 야누스 나노클러스터를 갖는 야누스 나노구조체가 형성될 수 있다. 도 6 (c) 및 (d)에서 볼 수 있듯이 BSA 코팅을 하지 않거나 또는 BSA 코팅을 한, 두 개의 나노구조체에는 유의한 차이가 없었다.

도 7은 최종 농도 1.9 μM의 RBITC로 유도된 야누스 나노클러스터를 포함하는 비대칭형 야누스 나노구조체의 TEM 이미지를 나타낸다. 마찬가지로, RBITC의 농도가 낮으므로 BSA 코팅은 비대칭형 야누스 나노구조체의 형성에 영향을 미치지 않았다.

< 실시예 3> 전기유체역학( electrohydrodynamic , EHD ) 분사를 통한 자성 나노입자(magnetic nanoparticles , MNPs )와 자성 비드(magnetic beads)의 합성

산화철 나노입자(Fe3O4)는 침전제로 Fe² ⁺와 Fe³ ⁺가 1 : 2의 몰비로 혼합된 암모니아수를 사용한 화학적 공침법을 이용하여 제조하였다. 염화 제1철4수화물(FeCl₂) 0.86 g 및 염화 제2철(FeCl₃) 2.35 g을 격렬한 교반 하에서 탈이온수 40 mL에 혼합하고 30 분 동안 질소 가스로 탈기시켰다. 반응 용액을 80 ℃로 가열하고 수산화암모늄(NH₄OH) 5 mL를 30 분 동안의 기계적 교반 하에 첨가하였다. 시트르산 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 온도를 90 ℃로 증가시킨 다음, 추가로 90 분 동안 격렬하게 교반하였다. 마지막으로, Fe₃O₄ 자성 나노입자(MNPs)를 수백 가우스(Gauss)의 정적 자기장 하에서 2 회 탈이온수로 세척하였다. 또한, MNP 용액의 작은 분액을 자기장을 이용하여 농축하고 중합체 용액에 첨가하여 자성 비드를 제조하였다. 탈이온수와 에틸렌글리콜이 3 : 1의 부피비로 혼합된 혼합물에서 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)(poly(acrylamide-co-acrylic acid), 폴리(AAm-co-AA)) 4.5 w/v%를 제조하고, 이 중합체 용액에 농축된 MNP를 균일하게 분산시켜 MNPs의 현탁액을 제조하였다. 전기유체역학(EHD) 분사 공정을 위해 분산된 MNPs의 현탁액을 23 게이지(gage) 스테인리스 스틸 모세관이 있는 1.0 mL 주사기(BD, Franklin Lakes, USA)에 넣었다. 안정한 테일러 원뿔(Taylor cone) 및 원뿔 분사 모드(con-jet mode)를 달성하기 위해, 중합체 농도를 증가시키지 않고 중합체를 에틸렌 글리콜과 같은 점성 용매에 용해시킴으로써 최적화된 점도를 얻었다. 주사기에는 일정한 속도로 MNPs 현탁액을 흐르게 하는 마이크로 주사기 펌프 KDS-100(KD Scientific, Inc, USA)가 장착되었다. 포집 기판으로 두께 0.018mm의 알루미늄 호일(Fisherbrand; Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하였다. 고전압 전원 NNC HV 30(Nano NC, Korea)을 이용하여 양전극에 연결된 모세관과 음전극에 연결된 알루미늄 호일 사이에 고전압을 가했다. 두 전극 사이의 거리는 20-25 cm였다. 고전압은 10-15 kV의 범위로 유지되었고, 두 용액의 유속은 0.08-0.15 ml/hour으로 유지되었다. 고해상도의 디지털 카메라(D-90, Nikon Corporation, Japan)를 사용하여 EHD 분사 중에 단상의 테일러 원뿔, jet stream 및 jet break-up을 시각화하고 캡처했다. EHD 분사 후, 생성된 자성 비드를 175 ℃에서 밤새 열가교(thermally crosslinked)시켰다. 마지막으로, 분말 형태의 자성 비드를 수집하고 이후 실험에 사용하였다.

< 실시예 4> 이중 금속 나노클러스터 구획 및 고분자 구획을 가지는 비대칭형 야누스 나노구조체의 특성

이중 금속 나노클러스터-고분자의 비대칭형 야누스 나노구조체의 UV-Vis 스펙트럼은 300~900 nm의 파장을 실온에서 중간 스캔 속도의 1 회 10 스캔 모드에서 1 nm의 고정 슬릿 폭으로 변화시킨 UV-vis 분광계(UV-1800, Shimadzu, Japan)를 사용하여 수득하였다. 기준선은 탈이온수로 채워진 두 개의 빈 셀(cell)을 사용하여 교정되었다. 콜로이드 용액 특성은 90 °의 산란각에서 광원으로써 5 mW의 최대 출력을 가지며 633 nm에서 Ne-He 레이저가 공급되는 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)(Zeta-sizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK)을 사용하여 유체역학 직경(hydrodynamic diameter) 및 그 크기 분포를 특성화하였으며, 온도는 25 ℃로 제어하였다. 탈이온수에 샘플을 1 : 1의 부피비로 2 회 희석시키고, 이들의 평균 크기를 최소 20 스캔 주기에서 측정하였다. 또한, 탈이온수에서 표면 전하를 특성화하기 위해 제타 전위(ζ-potential) 측정을 수행했다. 투과전자현미경(Transmission Electron Microcopy)을 이용해 가속 전압 80~200 kV에서 작동하는 JEM-2100F FE-STEM(JEOL, Germany)을 사용하여 개별 AuNP와 비대칭형 야누스 나노클러스터-고분자 나노입자를 분석하였다. 샘플은 탄소의 초박막 층(Ted Pella, Inc., USA)으로 코팅 된 400 메쉬 구리 격자 상에 증착되었다. 평균 직경, 크기 분포 및 표면 모폴로지는 0.5-30 kV의 집속된 빔을 갖는 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)(VEGA-SB3, TESCAN, Czech Republic)에 의해 측정되었다. 소수의 나노입자 용액을 실리콘 웨이퍼 위에 놓고 실온에서 건조시켰다. 샘플을 코팅기(K575X Turbo Sputter Coater, Emitech Ltd, UK)를 사용하여 얇은 전도성 백금 층으로 코팅하였다. 입자의 평균 크기는 미국의 국립 보건원에서 개발된 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 TEM 및 SEM 이미지에서 임의로 선택된 약 50-100 개의 입자를 측정하여 분석되었다. 또한, 모든 SERS 측정은 12.5 mW의 레이저 출력을 가진 자극 소스에 대해 632.8 nm의 파장(λ)에서 작동하는 Renishaw He-Ne 레이저가 장착된 Renishaw inVia 라만 현미경 시스템을 사용하여 수행되었다. Rayleigh 선은 수집 필터에 위치한 홀로그램 노치 필터(holographic notch filter)를 사용하여 수집된 SERS 스펙트럼에서 제거되었다. 라만 산란은 분광 해상도 1 cm^-1의 전하 결합 소자(charge-coupled device, CCD) 카메라를 사용하여 얻었으며 모든 SERS 스펙트럼은 520 cm^-1 실리콘 라인으로 보정되었다. RBITC 또는 MGITC로 표지된 나노입자의 콜로이드 용액을 작은 유리 모세관(Kimble Chase, 평 모세관 튜브(plain capillary tubes), 소다 석회 유리, 내경 : 1.1-1.2 mm, 벽 : 0.2 ± 0.02 mm, 길이 : 75 mm)에 넣었다. SERS 스펙트럼은 20x 대물 렌즈를 사용하여 608-1738 cm^-1의 파장 범위에서 유리 모세관에 레이저 스팟을 집중시키는 데 사용된 노출 시간의 1 초 동안 수집되었다.

AuNP, 라만 염료 유도 Au 나노클러스터 및 이중 금속 나노클러스터를 가지는 비대칭형 야누스 나노구조체의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. AuNP의 UV-Vis 흡수 피크는 510 nm에서 나타났다(도 2 (a)). MGITC를 AuNP 용액에 첨가하고 10 내지 90 분 동안 인큐베이션하였을 때, 원래 흡수 피크는 적색 편이(red-shifted)되었고, 새로운 흡수 피크는 650-850 nm의 범위에서 나타났다. 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 두 피크는 AuNP의 응집으로 인해 적색 편이를 나타내었다. 도 2 (b)는 RBITC로 유도된 Au 나노클러스터의 UV-Vis 흡광도를 10 분에서 90 분까지의 서로 다른 인큐베이션 시간에서 나타내었다. MGITC 유도된 나노클러스터와 유사하게, 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 피크가 적색 편이되었다. 도 2 (c)는 이중 금속 나노클러스터를 가지는 비대칭형 야누스 나노구조체의 UV-Vis 흡광도를 보여준다. 이중 금속 나노클러스터의 합성 후, 새로운 흡수 피크는 410-550 nm의 범위에서 나타나며, 이는 Au 나노클러스터에 Ag의 존재를 나타내었다. 또한, AuNPs의 응집에 기인하여 600-700 nm의 범위에서 넓은 피크가 나타났다. 도 2 (d)와 같이 AuNP, Au 나노클러스터 및 비대칭형 야누스 나노구조체의 유체역학 직경과 크기 분포를 특성화하기 위해 동적 광 산란 (DLS)이 수행되었다. AuNP, MGITC- 또는 RBITC- 유도 Au 나노클러스터의 평균 직경은 18.9 ± 0.4 nm, 152.9 ± 2.8 nm 및 115.7 ± 1.8 nm이었고, MGITC- 또는 RBITC- 유도 이중 금속 나노클러스터를 갖는 비대칭형 야누스 나노구조체는 205 ± 4.5 nm 및 186.3 ± 2.1 nm이었다.

도 3은 높은 SERS 효율을 위한 클러스터링 정도를 최적화하기 위해 10 분에서 90 분까지 다양한 인큐베이션 시간에서 클러스터를 형성하는 동안의 (a) MGITC 또는 (c) RBITC 유도 Au 나노클러스터의 상대적 라만 스펙트럼을 나타낸다. 또한, Au 나노클러스터의 라만 염료 농도와 BSA 코팅은 클러스터 크기를 제어하고 추가 응집을 방지하기 위해 조정되었다. 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 라만 강도가 점차 감소하여 더 큰 응집체가 형성되고 침전되었다는 것을 알 수 있었다. 도 3 (b)와 (d)에서 볼 수 있듯이, MGITC- 및 RBITC- 유도 Au 나노클러스터의 라만 강도는 1618 cm^-1 및 1648 cm^-1로 나타났다. 도 3 (e) 및 (f)는 동일한 라만 염료 및 입자 농도에서 MGITC- 또는 RBITC- 표지 AuNPs, MGITC- 또는 RBITC- 유도 Au 나노클러스터 및 이들의 비대칭형 야누스 나노구조체의 상대적 라만 스펙트럼을 도시한다. MGITC- 및 RBITC- 유도 Au 나노클러스터의 라만 강도는 AuNP의 10.42 및 2.32 배였으며, 이는 AuNP 클러스터 간의 입자 간 커플링이 핫 스팟(hot spot)으로 인해 SERS 효율을 크게 향상시키는 것을 의미한다. 또한, MGITC- 또는 RBITC- 유도 이중 나노클러스터를 갖는 비대칭형 야누스 나노구조체의 라만 강도는 라만 염료-표지 AuNP보다 8.87 및 1.82 배 더 높았다. MGITC- 및 RBITC- 유도 Au 나노클러스터의 라만 강도와 비교했을 때, 비대칭형 야누스 나노구조체의 라만 강도는 다소 감소하였다. MGITC- 또는 RBITC- 유도 이중 나노클러스터를 갖는 비대칭형 야누스 나노구조체는 동일한 라만 염료 및 입자 농도에서 MGITC- 또는 RBITC- 표지 AuNPs 보다 더 우수한 광학 신호를 갖는다.

< 실시예 5> 이중 금속 나노클러스터 구획 및 고분자 구획을 가지는 비대칭형 야누스 나노구조체와 항체 결합

이중 금속 나노클러스터-고분자의 비대칭형 야누스 나노구조체는 표적 단백질인 CEA(carcinoembryonic antigen)에 대한 단클론 항체(mAb)와 다클론 항체(pAbs)와 각각 결합되었다. 먼저, 폴리(아닐린) 구획에 잔류하는 아민기와 항체에 존재하는 카르복실기 간의 아미드 결합 반응을 이용하여 고분자 구획과 항-인간 CEA 다클론 항체(anti-human CEA pAb)의 공유 결합(bioconjugation) 반응을 수행하였다. 이러한 결합 반응은 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide ester) 화학을 기반으로 하였다. 구체적으로, EDC 60 mM과 sulfo-NHS 9.2 mM을 함유한 pH 7.4의 PBS 10 mM을 포함하는 비대칭형 야누스 나노구조체의 분산 용액에 2.0 mg/ml의 항-인간 CEA pAb 5 ㎕를 첨가하고, 3 시간 동안 교반하여 전체 pAb 농도가 10 ㎍/㎖가 되도록 하였다. 항-인간 CEA pAb- 결합된 고분자 구획을 3,000 rpm에서 원심분리하여 세척하고 PBS로 재현탁하였다. 또한, 175 ℃에서 밤새 열 안정화한 고분자 나노입자 상의 잔류 카르복실기를 활성화시킴으로써 자성 비드를 항-인간 CEA 단클론 항체(anti-human CEA mAb)와 화학적으로 결합시켰다. 구체적으로, 1.25 mg의 자성 비드를 0.9ml의 PBS에 현탁시키고, 진폭 20.0 %에서 3/3 초 온/오프 사이클을 사용한 팁-초음파 발생장치(sonicator)를 사용하여 2 분 동안 초음파 처리하였다. 균일하게 현탁된 자성 비드를 5.0 mM EDC 및 5.0 mM sulfo-NHS와 혼합하고 1 시간 동안 교반하였다. 3.56 ㎎/㎖의 항-인간 CEA mAb를 100 ㎕의 PBS 완충액으로 희석시킨 다음, 자성 비드 용액에 최종 농도가 8.9 ㎍/㎖가 되도록 천천히 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 결합되지 않은 항-인간 CEA mAb를 자기장을 사용하여 분리하고, 항체-결합된 자성 비드를 CEA의 SERS-기반 바이오센싱을 위해 PBS로 재현탁시켰다(도 1 (c)).

< 실시예 6> 비대칭형 야누스 나노구조체를 이용한 SERS 기반 바이오센싱

라만 리포터로 표지된 비대칭형 야누스 나노구조체를 SERS 나노프로브로 이용하여 표적 단백질인 CEA의 정량 분석을 수행하였다. 항-인간 CEA mAb와 결합된 자성 비드를 사용하여 샌드위치형 면역 복합체를 형성함으로써 분리 도구(자석)로 면역 복합체를 선택적으로 분리하였다. 먼저, 항-인간 CEA 단클론 항체가 결합된 자성 비드를 22.5 ~ 67.5 ng/ml 범위의 상이한 3 가지 농도의 CEA를 함유하는 완충액에 첨가하고, 1 시간 동안 반응시켰다. 표적 단백질을 외부 자기장으로 세척하고 새로운 PBS 완충액으로 재현탁시켰다. 이어서, 표적 단백질 및 자성 비드가 형성된 각각의 면역 복합체에 항-인간 CEA pAb가 결합된 SERS 나노프로브를 첨가하고 1 시간 동안 반응시켜 자성 비드, 표적 단백질 및 SERS 나노프로브로 구성된 샌드위치형 면역 복합체를 제조하였다. 결합되지 않은 SERS 나노프로브를 자기장을 사용하여 제거하고, 생성물인 샌드위치형 면역 복합체를 SERS 측정을 위해 PBS로 재현탁하였다. 표적 단백질이 없는 SERS 나노프로브의 선택적인 결합 능력을 평가하기 위해 대조군(control)에 대한 실험 또한 함께 수행되었다.

Claims

라만 염료를 가지고, 코어-쉘 구조로 이루어진 이중 금속 나노클러스터 구획; 및
전도성 고분자 구획;
으로 구성된 나노프로브로,
상기 나노프로브는 상기 전도성 고분자 구획이 상기 이중 금속 나노클러스터 구획의 한쪽 면에만 산화되어 비대칭형 구조를 나타내는 것인,
표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브.
제1항에 있어서,
상기 이중 금속 나노클러스터 구획은,
금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 코어와;
금, 은, 구리 및 이의 혼합물로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 쉘;
로 구성된 이중 금속 나노클러스터인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브.
제1항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole), 폴리싸이오펜(polythiophene), poly(3,4-ethylene dioxythiophene)(PEDOT) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브.
i) 코어(core)를 형성하는 금속 나노입자 및 라만 염료를 혼합하고 가열 또는 응집하여 라만 염료를 가지는 코어 금속 나노입자 클러스터를 형성하고;
ⅱ) 전도성 고분자 단량체 및 계면활성제를 용해시킨 수용액에 상기 코어 금속 나노입자 클러스터를 첨가하고;
ⅲ) 상기 ⅱ)의 코어 금속 나노클러스터가 첨가된 용액에 금속 이온 용액을 첨가하여 상기 금속 이온과 상기 전도성 고분자 단량체 사이의 산화-환원 반응을 수행하고; 그리고
ⅳ) 상기 금속 이온이 상기 전도성 고분자가 제공하는 전자를 받아 환원되면서 코어 금속 나노입자 표면에 증착되어 코어-쉘 구조의 이중 금속 나노입자 클러스터 구획을 형성하고; 상기 전도성 고분자 단량체는 산화되면서 상기 이중 금속 나노클러스터 구획의 한쪽 면에만 증착되어 전도성 고분자로 성장하면서 비대칭형적으로 전도성 고분자 고분자 구획을 형성하는;
단계를 포함하는,
표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 i) 단계 이후에, 상기 코어 금속 나노클러스터를 단백질로 안정화시키는 단계를 더 포함하는, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 단백질은 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 i) 단계의 코어 금속은 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 ⅲ) 단계의 금속 이온은 금 이온, 은 이온, 구리 이온 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 폴리피롤(polypyrrole), 폴리싸이오펜(polythiophene), poly(3,4-ethylene dioxythiophene)(PEDOT) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 ⅲ) 단계의 산화-환원 반응 이후에, 상기 반응 용액을 계면활성제 용액으로 인큐베이션 하는 단계를 더 포함하는, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 및 트리톤 X-200(Triton X-200)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 ⅳ) 단계의 전도성 고분자로 성장하는 것은 표면 주형 중합법(surface-templated polymerization)에 의한 것인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반 표적 물질 검출용의 비대칭형 야누스 나노프로브의 제조 방법.
a) 검출하고자 하는 표적 물질이 포함된 시료액을 준비하고;
b) 자성 나노입자에 상기 표적에 대한 제1 항체를 고정하여 준비하고;
c) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 금속 나노프로브에 상기 표적에 대한 제2 항체를 고정하여 준비하고;
d) 상기 제1 항체가 고정된 자성 나노입자를 상기 시료액에 첨가하여 상기 표적과 상기 자성 나노입자의 제1 항체가 접합된 면역복합체를 형성하고;
e) 상기 제2 항체가 고정된 금속 나노프로브를 상기 제1 항체가 접합된 면역복합체가 포함된 용액에 첨가하여 금속 나노프로브의 제2 항체-표적-자성 나노입자의 제1 항체의 샌드위치 면역복합체를 형성하고;
f) 자기장을 이용하여 상기 샌드위치 면역복합체를 형성하지 않은 자성 나노입자 및 금속 나노프로브를 분리하고; 그리고
g) 상기 샌드위치 면역복합체의 라만 신호를 측정하는;
단계를 포함하는,
표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 표적 물질은 단백질 또는 병원균인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법.