CN110405198B - 基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法及应用,具体对贵金属纳米颗粒选择性修饰巯基生物分子,同时加入还原剂、贵金属溶液,反应后加入贵金属生长液,在巯基修饰的贵金属纳米颗粒表面再生长贵金属层,使贵金属纳米颗粒溶液颜色发生改变,且纵向等离子体共振峰发生红移。该调控方法简单,条件温和快速;且制得再生长贵金属纳米颗粒分散性好可用于检测与癌症相关生物分子等。在巯基修饰时,针对性选取序列上具有与贵金属纳米颗粒结合位点以及酶切位点的巯基生物分子,利用再生长贵金属纳米颗粒溶液颜色的变化、纵向表面等离子体共振峰的红移,作为检测酶活性的表达信号,大大提高了检测灵敏度。
Description
技术领域:
本发明属于纳米材料合成技术领域,具体涉及一种***有规律地调节金纳米棒形态的方法。本发明可用于调节金纳米棒形态,并且利用金纳米棒形态的变化导致的纵向表面等离子体共振峰的红移,超灵敏检测胰蛋白酶的活性。
背景技术:
等离子体贵金属纳米颗粒由于具有独特的物理化学性质(例如光学、电磁学、催化等),使其在表面增强拉曼检测、生物传感器件的构造、光热治疗、燃料电池、工业催化等诸多领域具有极大的应用前景。然而,传统以等离子金属纳米粒子的聚集为基础进行生物传感的比色方法,通常以金属溶胶的等离子共振吸收峰的强度变化来进行定量。而金属溶胶的吸收谱带一般会在聚集过程中展宽并产生一定程度的红移,导致峰位与峰强度难以确定,最终影响了方法的可信度。而金纳米棒因为其独特的依赖于形貌的各向异性的光学性质,具体表现为金纳米棒的纵向表面等离子体共振(LSPR)峰依赖于其尺寸和形状的变化,其长径比增加时,LSPR峰发生红移。因此,为了克服传统紫外定量的弊端以及提高检测信噪比,可以利用LSPR峰红移的程度作为检测信号构建一系列生物传感器用于检测生物大分子。
虽然现今调控金纳米棒的形貌已经有了较大的进展,包括专利号CN108048906A介绍了一种DNA调控金纳米棒形貌的方法,但是DNA的尺寸比较小,所以原位生长时光学效应对外界变化的敏感度大大降低。因此现今缺乏一种简单快速的调控金纳米棒形态的方法,并且利用其***有规律的形态变化导致的光学信号超灵敏检测生物大分子,例如蛋白酶。蛋白酶在多种生物过程中起着至关重要的作用,许多病理条件与蛋白酶的错误调节蛋白水解活性有关。因此,有很多与癌症相关的蛋白酶已成为疾病诊断的中心目标,促进了新型生物检测方法和工具的开发。因而利用大尺寸多肽***地调节金纳米棒的形貌,利用金纳米棒的LSPR峰红移来超灵敏检测蛋白酶的活性具有非常大的意义。
发明内容:
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足,提供一种简单快速调节金纳米棒的形态的方法,并且利用形态变化产生的LSPR峰红移来检测蛋白酶的活性。为了提高检测的灵敏度,我们选择了较大尺寸的多肽作为调控金纳米棒形态的配体,并且在多肽的序列上设计了与金纳米棒表面结合的位点以及蛋白酶的酶切位点,使得金纳米棒的形态对外界的变化非常敏感,相应的LSPR峰的红移而不是峰强度作为检测蛋白酶活性的表达信号,大大提高了检测的信噪比。并且利用透射电镜、紫外光谱图对这一过程中金纳米棒的形态演变进行了深入的研究。
基于含巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法。具体描述为以贵金属纳米颗粒为内核,修饰含巯基的生物分子,再在上述含巯基生物分子修饰的贵金属纳米颗粒表面再生长一层贵金属层,生成了再生长的贵金属纳米颗粒。其中,贵金属纳米颗粒内核可以是各向同性或者各向异性的贵金属纳米颗粒。所述具有各向同性的纳米颗粒包括金纳米粒子、银纳米粒子等中的任意一种或至少两种的组合;各向异性的贵金属纳米颗粒包括金纳米棒、金纳米星、银纳米棒、银纳米星中的任意一种或至少两种的组合;包含巯基的生物分子可以是含巯基的核酸、氨基酸、多肽、蛋白质或者细菌等。大概过程如下:向具有各向同性或者异性的贵金属材料的溶液中,依次加入表面活性剂、还原剂、贵金属的盐溶液和含巯基的生物分子,得到混合溶液,进行含巯基生物分子的吸附,得到了含巯基的生物分子修饰的贵金属纳米颗粒的溶液;向上述步骤得到的含巯基生物分子修饰的贵金属纳米颗粒的溶液中,加入贵金属的盐溶液,得到混合溶液,进行再生长反应,得到不同形态的再生长的贵金属纳米颗粒。因而,制备再生长的贵金属纳米颗粒包括如下具体步骤:
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法,包括以下步骤:
步骤1,巯基修饰:
按体积比,1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和巯基生物分子溶液,25-70℃加热条件下反应30-120min,将含巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
步骤2,贵金属纳米颗粒溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-70℃加热条件下反应15-120min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控。
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液为具有各向同性或者异性的贵金属纳米颗粒溶液,具体为金纳米粒子溶液、银纳米粒子溶液、金纳米棒溶液、金纳米星溶液、银纳米棒溶液或者银纳米星溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选金纳米棒溶液。
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM,优选0.05-0.2nM。
所述步骤1中,表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液或十六烷基三甲基氯化铵溶液中的一种或两种的混合物,所述表面活性剂溶液浓度为5-100mM。
所述步骤1中,还原剂溶液包括抗坏血酸溶液、抗坏血酸钠溶液、羟胺溶液或硼氢化钠溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为抗坏血酸溶液;所述还原剂的浓度为0.1-1M。
所述步骤1中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为1mM。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液包括含巯基的核酸溶液、氨基酸溶液、肽溶液、蛋白质溶液或者细菌溶液等,优选为含巯基的多肽溶液。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液为还原型谷胱甘肽溶液,属于含巯基的三肽,浓度为1-100μM。
所述步骤1中,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度≤500nM,具体通过调整巯基生物分子溶液自身浓度获得,当巯基生物分子溶液自身浓度为20μM,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度为250nM;当巯基生物分子溶液自身浓度为40μM,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度为500nM。
所述步骤1中,加热操作在水浴条件下进行,所述加热温度为25-40℃,所述吸附的时间为60-120min。
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液市购或制备均可,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.1-10nM;当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,所述金纳米棒的长径比为2-6,优选为3-4。
所述的步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液使用前经纯化处理,具体纯化过程为:将贵金属纳米颗粒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,溶液浓度为0.1-10nM。
所述的步骤1中,当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,制备过程如下:
步骤(1),金种合成:
向十六烷基三甲基溴化铵溶液中加入氯金酸溶液,混合均匀后,磁力搅拌条件下,加入硼氢化钠溶液,进行第一反应,反应时间为2min,静置得到金种溶液,其中,十六烷基三甲基溴化铵溶液、氯金酸溶液与硼氢化钠溶液加入体积比为10:(0.25-2.5):(0.6-1)。
所述步骤(1)中,十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.1M,氯金酸溶液浓度为0.01M,硼氢化钠溶液浓度为0.01M。
步骤(2),生长液配制:
另取十六烷基三甲基溴化铵溶液,向十六烷基三甲基溴化铵溶液中依次加入硝酸银溶液,氯金酸溶液,盐酸溶液,以及抗坏血酸溶液进行生长反应,混匀过后得到无色的生长液,其中,所述的十六烷基三甲基溴化铵溶液、硝酸银溶液、氯金酸溶液、盐酸溶液和抗坏血酸溶液加入体积比为40:(0.29-1):(2-4):(0.23-0.46):(0.36-0.72)。
所述步骤(2)中,十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.1M,硝酸银溶液浓度为0.01M,氯金酸溶液浓度为10mM,盐酸溶液浓度为1M,坏血酸溶液浓度为0.1M。
所述步骤(2)中,金纳米棒生长溶液以十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂、以抗坏血酸为还原剂、可溶性银盐为硝酸银。
步骤(3),金纳米棒合成:
取金种溶液加入生长液中,混匀过后,置于25℃恒温水浴中,静置反应24h,得到金纳米棒溶液。
步骤(4),金纳米棒纯化:
将金纳米棒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,浓度为0.1-10nM。
所述的步骤(4)中,制备的金纳米棒溶液置于冰箱,4℃下冷藏。
所述步骤2中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的一种或两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为10mM,贵金属的盐溶液添加体积同步骤1。
所述步骤2中,加热反应的温度为25-40℃,反应时间为30-60min。
所述步骤2中,贵金属纳米颗粒溶液经再生长,在纳米颗粒表面生成一层新的贵金属层,所述贵金属层包括金纳米层、银纳米层的任意一种或至少两种的组合,所述贵金属层厚度为3-10nm。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液保存方式为:4℃以下冰箱中保存。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒形态的各向异性随着巯基生物分子浓度的增加而增加,具体表现为贵金属纳米颗粒表面尖端个数的增加。当巯基生物分子浓度低时,尖端个数较少,随着巯基生物分子浓度的增加,尖端个数增加,LSPR峰红移。当巯基生物分子浓度足够大时,尖端个数的持续增加,生成了纳米星。
所述步骤2中,对所述再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行电镜和光谱检测,经紫外和电镜表征获知,贵金属纳米颗粒形态和LSPR峰的红移与巯基生物分子溶液浓度有关。在巯基生物分子溶液浓度≤500nM范围内,当巯基生物分子的浓度为50-75nM,贵金属纳米颗粒的尖端个数较少,大多为1个尖端;当巯基生物分子的浓度为75-150nM时,尖端个数从1增加到3个;当巯基生物分子浓度为150-500nM时,尖端的个数从3个逐渐变为6个。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液表征过程为:将再生长贵金属纳米颗粒溶液经离心处理,转速和时间分别为5000-8000rpm、10-30min,优选为5000rpm,10min。去上清液后,分散进与上清液相同体积二次水中,进行紫外和电镜的表征:通过肉眼观察到的颜色的变化、透射电镜和紫外光谱图可知,金纳米棒的形态和LSPR峰的红移与还原型谷胱甘肽的浓度有关。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,该方法获得的再生长贵金属纳米颗粒所具有的的尖端的形态特点,用于作为表面增强拉曼的基底。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,以获得的再生长贵金属纳米颗粒的形态演变,通过等离子体成像,用于探索各种形态的再生长贵金属纳米颗粒在细胞中运动轨迹以及分布的研究。
在上述理论基础上,通过设计了含有酶切位点的巯基生物分子,以及能与贵金属纳米颗粒结合的位点(巯基)在酶切位点的两边。用于检测酶的活性,由于巯基生物分子尺寸效应,所以在酶浓度很低时,可以非常灵敏的检测到酶的活性。
具体的,设计一条含巯基和酶切位点的多肽,酶切反应完全后,将产物作为制备再生长贵金属纳米颗粒中的含巯基的生物分子进行再生长,获得不同形态的再生长贵金属纳米颗粒,使得LSPR峰发生红移,利用红移的程度定量酶的活性。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,将巯基生物分子溶液经酶切后,再进行巯基修饰与溶液再生长,将获得的再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行紫外和电镜的表征,记录再生长贵金属纳米颗粒溶液的等离子共振峰红移数据与酶浓度的关系,建立标准曲线,用于酶活性检测。
所述步骤中,由于酶切反应过后,巯基生物分子浓度变大,也就是对应于酶的浓度越大。根据巯基生物分子调节生成的再生长贵金属纳米颗粒的等离子共振峰的红移与酶浓度的关系建立标准曲线,即可快速灵敏检测酶的活性。
巯基生物分子溶液经酶切后,再进行巯基修饰与溶液再生长,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液具体包括步骤如下:
步骤1,巯基生物分子的酶切反应:
按体积比(18-40):(2-10):(50-80),将巯基生物分子溶液和酶溶液加入磷酸盐缓冲溶液中,获得混合溶液,进行巯基生物分子切割反应,制得酶切后巯基生物分子溶液,其中,所述的切割反应温度为35-40℃,切割反应时间为2-4h;
步骤2,巯基修饰:
按体积比1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和酶切后巯基生物分子溶液,25-70℃加热条件下反应0.5-2h,将巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
步骤3,贵金属纳米颗粒溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-70℃加热条件下反应15-120min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液中的巯基生物分子为含有酶切位点的巯基生物分子,且酶切位点的两侧均有巯基。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液浓度为1-10μg/mL,酶溶液浓度≤750ng/mL。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液为多肽溶液,多肽序列为Gly-Cys-Lys-Gly-Gly-Cys-Gly。
所述步骤1中,酶包括胰蛋白酶、细胞凋亡酶、胃蛋白酶或者金属蛋白酶等与癌症相关的蛋白酶以及DNA酶等,优选为胰蛋白酶。
所述步骤2中,巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度≤40pM,具体通过调整酶溶液自身浓度获得,当酶溶液自身浓度为1.5ng/mL,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度为80fM;当酶溶液自身浓度为750ng/mL,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度为40pM。
所述步骤1中,切割反应温度为37℃,切割反应时间为2h。
所述步骤2中,巯基生物分子与贵金属纳米颗粒通过贵金属-S键结合,巯基生物分子序列要有酶切位点,且酶切位点两边都必须要有巯基。
所述步骤2中:
贵金属纳米颗粒溶液为具有各向同性或者异性的贵金属纳米颗粒溶液,具体为金纳米粒子溶液、银纳米粒子溶液、金纳米棒溶液、金纳米星溶液、银纳米棒溶液或者银纳米星溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选金纳米棒溶液;所述贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM,优选0.05-0.2nM;
表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液或十六烷基三甲基氯化铵溶液中的一种或两种的混合物,所述表面活性剂溶液浓度为5-100mM;
还原剂溶液包括抗坏血酸溶液、抗坏血酸钠溶液、羟胺溶液或硼氢化钠溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为抗坏血酸溶液;所述还原剂的浓度为0.1-1M;
贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为1mM。
所述步骤2中:
贵金属纳米颗粒溶液市购或制备均可,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM;当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,所述金纳米棒的长径比为2-6,优选为3-4;
贵金属纳米颗粒溶液使用前经纯化处理,具体纯化过程为:将贵金属纳米颗粒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,溶液浓度为0.01-10nM。
当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,制备过程同上述调控方法。
所述步骤3中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的一种或两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为10nM,贵金属的盐溶液添加体积同步骤1。
所述步骤3中,加热反应的温度为25-40℃,反应时间为30-60min。
所述步骤3中,贵金属纳米颗粒溶液经再生长,在纳米颗粒表面生成一层新的贵金属层,所述贵金属层包括金纳米层、银纳米层的任意一种或至少两种的组合。
所述步骤3中,再生长贵金属纳米颗粒溶液为巯基生物分子介导贵金属纳米颗粒溶液,再生长贵金属纳米颗粒溶液保存方式为:4℃以下冰箱中保存。
所述步骤3中,再生长贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒形态的各向异性随着酶浓度的增加而增加,具体表现为贵金属纳米颗粒表面尖端个数的增加。当酶浓度低时,尖端个数较少,随着酶浓度的增加,尖端个数增加,LSPR峰红移。当酶浓度足够大时,尖端个数的持续增加,生成了纳米星。
本发明的有益效果:
(1)提供了一种非常简便快速调控金纳米棒形貌和LSPR峰的方法。
(2)传统比色方法聚集过程中等离子体共振峰展宽并产生一定程度的红移,导致峰位与峰强度难以确定,影响方法可信度,以LSPR峰红移作为检测的信号克服了传统比色方法的弊端。
(3)由于多肽尺寸较大,对金纳米棒形貌和紫外光谱图的改变非常明显,因而较低的酶浓度就能引起LSPR峰的红移,提高了检测的灵敏度。
附图说明:
图1是本发明制备的纯化后的金纳米棒溶液的透射电镜图。
图2是本发明制备的纯化后的金纳米棒溶液的紫外吸收图。
图3是本发明实施例1中纯化后的不同浓度还原型谷胱甘肽介导的金纳米棒溶液的透射电镜图。
图4是本发明实施例1中纯化后的不同浓度还原型谷胱甘肽介导的金纳米棒溶液的紫外吸收图。
图5是本发明实施例2制备的纯化后的金纳米棒溶液的LSPR峰红移数据与胰蛋白酶浓度的曲线变化图。
图6是本发明实施例2制备的纯化后的金纳米棒溶液的LSPR峰红移数据与胰蛋白酶浓度的标准曲线图。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
以上的实施例仅是对本发明的实施方式进行描述,并非对范围进行限定。在不脱离本发明设计精神的前提下,对本实验新型作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
本发明的制备例、实施例以及检测过程中,所用试剂如下所示:氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵、硼氢化钠、抗坏血酸、硝酸银、盐酸、还原型谷胱甘肽均购自国药集团化学试剂有限公司;多肽序列购自强耀生物科技有限公司,胰蛋白酶购自上海阿拉丁生化可见有限公司。
紫外光谱在U-3900UV-vis紫外光谱仪上于室温下测得。透射电子显微图像在JEM-2100透射电子显微镜上获得(加速电压为200KV)。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法,包括以下步骤:
步骤1,巯基修饰:
按体积比,从1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和巯基生物分子溶液,25-70℃加热条件下反应0.5-2h,将含巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液为具有各向同性或者异性的贵金属纳米颗粒溶液,具体为金纳米粒子溶液、银纳米粒子溶液、金纳米棒溶液、金纳米星溶液、银纳米棒溶液或者银纳米星溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选金纳米棒溶液。
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM,优选0.05-0.2nM。
所述步骤1中,表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液或十六烷基三甲基氯化铵溶液中的一种或两种的混合物,所述表面活性剂溶液浓度为5-100mM。
所述步骤1中,还原剂溶液包括抗坏血酸溶液、抗坏血酸钠溶液、羟胺溶液或硼氢化钠溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为抗坏血酸溶液;所述还原剂的浓度为0.1-1M。
所述步骤1中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为1mM。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液包括含巯基的核酸溶液、氨基酸溶液、多肽溶液、蛋白质溶液或者细菌溶液等,优选为含巯基的多肽溶液。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液为还原型谷胱甘肽溶液,属于含巯基的三肽,浓度为1-100μM。
所述步骤1中,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度≤500nM,具体通过调整巯基生物分子溶液自身浓度获得,当巯基生物分子溶液自身浓度为20μM,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度为250nM;当巯基生物分子溶液自身浓度为40μM,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度为500nM。
所述步骤1中,加热操作在水浴条件下进行,所述加热温度为25-30℃,所述吸附的时间为0.5-1h。
所述步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液市购或制备均可,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.1-10nM;当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,所述金纳米棒的长径比为2-6,优选为3-4。
所述的步骤1中,贵金属纳米颗粒溶液使用前经纯化处理,具体纯化过程为:将贵金属纳米颗粒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,溶液浓度为0.1-10nM。
所述的步骤1中,当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,制备过程如下:
步骤(1),金种合成:
向十六烷基三甲基溴化铵溶液中加入氯金酸溶液,混合均匀后,磁力搅拌条件下,加入硼氢化钠溶液,进行第一反应,反应时间为2min,静置得到金种溶液,其中,十六烷基三甲基溴化铵溶液、氯金酸溶液与硼氢化钠溶液加入体积比为10:(0.25-2.5):(0.6-1)。
所述步骤(1)中,十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.1M,氯金酸溶液浓度为10mM,硼氢化钠溶液浓度为0.01M。
步骤(2),生长液配制:
另取十六烷基三甲基溴化铵溶液,向十六烷基三甲基溴化铵溶液中依次加入硝酸银溶液,氯金酸溶液,盐酸溶液,以及抗坏血酸溶液进行生长反应,混匀过后得到无色的生长液,其中,所述的十六烷基三甲基溴化铵溶液、硝酸银溶液、氯金酸溶液、盐酸溶液和抗坏血酸溶液加入体积比为40:(0.29-1):(2-4):(0.23-0.46):(0.36-0.72)。
所述步骤(2)中,十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.1M,硝酸银溶液浓度为10mM,氯金酸溶液浓度为10mM,盐酸溶液浓度为1M,坏血酸溶液浓度为0.1M。
所述步骤(2)中,金纳米棒生长溶液以十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂、以抗坏血酸为还原剂、可溶性银盐为硝酸银。
步骤(3),金纳米棒合成:
取金种溶液加入生长液中,混匀过后,置于25℃恒温水浴中,静置反应24h,得到金纳米棒溶液。
步骤(4),金纳米棒纯化:
将金纳米棒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,浓度为0.1-10nM。
所述的步骤(4)中,制备的金纳米棒溶液置于冰箱,4℃下冷藏。
步骤2,贵金属纳米颗粒溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-70℃加热条件下反应15-120min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控。
所述步骤2中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的一种或两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为10nM。
所述步骤2中,加热反应的温度为25-40℃,反应时间为30-60min。
所述步骤2中,贵金属纳米颗粒溶液经再生长,在纳米颗粒表面生成一层新的贵金属层,所述贵金属层包括金纳米层、银纳米层的任意一种或至少两种的组合,所述贵金属层厚度为3-10nm。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液保存方式为:4℃以下冰箱中保存。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒形态的各向异性随着巯基生物分子浓度的增加而增加,具体表现为贵金属纳米颗粒表面尖端个数的增加。当巯基生物分子浓度低时,尖端个数较少,随着巯基生物分子浓度的增加,尖端个数增加,LSPR峰红移。当巯基生物分子浓度足够大时,尖端个数的持续增加,生成了纳米星。
所述步骤2中,对所述再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行电镜和光谱检测,经紫外和电镜表征获知,贵金属纳米颗粒形态和LSPR峰的红移与巯基生物分子溶液浓度有关。在巯基生物分子溶液浓度≤500nM范围内,当巯基生物分子的浓度为50-75nM,贵金属纳米颗粒的尖端个数较少,大多为1个尖端;当巯基生物分子的浓度为75-150nM时,尖端个数从1增加到3个;当巯基生物分子浓度为150-500nM时,尖端的个数从3个逐渐变为6个。
所述步骤2中,再生长贵金属纳米颗粒溶液表征过程为:将再生长贵金属纳米颗粒溶液经离心处理,转速和时间分别为5000-8000rpm、10-30min,优选为5000rpm,10min。去上清液后,分散进与上清液相同体积二次水中,进行紫外和电镜的表征:通过肉眼观察到的颜色的变化、透射电镜和紫外光谱图可知,金纳米棒的形态和LSPR峰的红移与还原型谷胱甘肽的浓度有关。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,该方法获得的再生长贵金属纳米颗粒所具有的的尖端的形态特点,用于作为表面增强拉曼的基底。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,以获得的再生长贵金属纳米颗粒尖端的形态演变,通过等离子体成像,用于探索各种形态的再生长贵金属纳米颗粒在细胞中运动轨迹以及分布的研究。
在上述理论基础上,通过设计了含有酶切位点的巯基生物分子,以及能与贵金属纳米颗粒结合的位点(巯基)在酶切位点的两边。用于检测酶的活性,由于巯基生物分子尺寸较大,所以在酶浓度很低时,可以非常灵敏的检测到酶的活性。
具体的,设计一条含巯基和酶切位点的多肽,酶切反应完全后,将产物作为制备再生长贵金属纳米颗粒中的含巯基的生物分子进行再生长,获得不同形态的再生长贵金属纳米颗粒,使得LSPR峰发生红移,利用红移的程度定量酶的活性。
基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,将巯基生物分子溶液经酶切后,再进行巯基修饰与溶液再生长,将获得的再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行紫外和电镜的表征,记录再生长贵金属纳米颗粒溶液的等离子共振峰红移数据与酶浓度的关系,建立标准曲线,用于酶活性检测。
巯基生物分子溶液经酶切后,再进行巯基修饰与溶液再生长,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液具体包括步骤如下:
步骤1,巯基生物分子的酶切反应:
按体积比,从(18-40):(2-10):(50-80)将巯基生物分子溶液和酶溶液加入磷酸盐缓冲溶液中,获得混合溶液,进行巯基生物分子切割反应,制得酶切后巯基生物分子溶液,其中,所述的切割反应温度为35-40℃,切割反应时间为2-4h;
所述步骤1中,巯基生物分子溶液中的巯基生物分子为含有酶切位点的巯基生物分子,且酶切位点的两侧均有巯基。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液浓度为1-10μg/mL,酶溶液浓度≤750ng/mL。
所述步骤1中,巯基生物分子溶液为多肽溶液,多肽序列为Gly-Cys-Lys-Gly-Gly-Cys-Gly。
所述步骤1中,酶包括胰蛋白酶、细胞凋亡酶、胃蛋白酶或者金属蛋白酶等与癌症相关的蛋白酶以及DNA酶,优选为胰蛋白酶。
所述步骤2中,巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度≤40pM,具体通过调整酶溶液自身浓度获得,当酶溶液自身浓度为1.5ng/mL,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度为80fM;当酶溶液自身浓度为750ng/mL,巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中酶浓度为40pM。
所述步骤1中,切割反应温度为37℃,切割反应时间为2h。
步骤2,巯基修饰:
按体积比1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和酶切后巯基生物分子溶液,25-70℃加热条件下反应0.5-2h,将巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
所述步骤2中,巯基生物分子与贵金属纳米颗粒通过贵金属-S键结合,巯基生物分子序列要有酶的酶切位点,且酶切位点两边都必须要有巯基。
所述步骤2中:
贵金属纳米颗粒溶液为具有各向同性或者异性的贵金属纳米颗粒溶液,具体为金纳米粒子溶液、银纳米粒子溶液、金纳米棒溶液、金纳米星溶液、银纳米棒溶液或者银纳米星溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选金纳米棒溶液;所述贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM,优选0.05-0.2nM;
表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液或十六烷基三甲基氯化铵溶液中的一种或两种的混合物,所述表面活性剂溶液浓度为5-100mM;
还原剂溶液包括抗坏血酸溶液、抗坏血酸钠溶液、羟胺溶液或硼氢化钠溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为抗坏血酸溶液;所述还原剂的浓度为0.1-1M;
贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的任意一种或至少两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为1mM。
所述步骤2中:
贵金属纳米颗粒溶液市购或制备均可,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10nM;当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,所述金纳米棒的长径比为2-6,优选为3-4;
贵金属纳米颗粒溶液使用前经纯化处理,具体纯化过程为:将贵金属纳米颗粒溶液经离心处理后,分散进二次水中,获得纯化后金纳米棒溶液,溶液浓度为0.01-10nM。
当所述的贵金属纳米颗粒溶液为金纳米棒溶液时,制备过程同上述调控方法。
步骤3,溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-70℃加热条件下反应15-120min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控。
所述步骤3中,贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的一种或两种的混合物,优选为氯金酸溶液,所述贵金属的盐溶液浓度为10nM。
所述步骤3中,加热反应的温度为25-40℃,反应时间为30-60min。
所述步骤3中,贵金属纳米颗粒溶液经再生长,在纳米颗粒表面生成一层新的贵金属层,所述贵金属层包括金纳米层、银纳米层的任意一种或至少两种的组合。
所述步骤3中,再生长贵金属纳米颗粒溶液为巯基生物分子介导贵金属纳米颗粒溶液,再生长贵金属纳米颗粒溶液保存方式为:4℃以下冰箱中保存。
所述步骤3中,再生长贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒形态的各向异性随着酶浓度的增加而增加,具体表现为贵金属纳米颗粒表面尖端个数的增加。当酶浓度低时,尖端个数较少,随着酶浓度的增加,尖端个数增加,LSPR峰红移。当酶浓度足够大时,尖端个数的持续增加,生成了纳米星。
制备例1
本发明所述方法中贵金属材料的制备为现有技术,本领域技术人员可以参照现有技术公开的方法进行制备。例如,将金种溶液与金纳米棒生长液混合,将混合物置于水浴条件下使得金种缓慢生长,所述金纳米棒生长溶液大多以十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂、以抗坏血酸为还原剂、可溶性银盐为硝酸银。
以下实施例中采用的金纳米棒溶液制备方法包括以下步骤:
(1)金种的制备
25℃恒温水浴条件下,取10mL浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化铵水溶液,向其中加入0.25mL浓度为10mM的氯金酸水溶液,混合均匀后,在磁力搅拌的条件下加入0.6mL浓度为0.01M的冰水配制的新鲜硼氢化钠水溶液,制得混合溶液,搅拌2min后静置2小时,得到金种溶液。
(2)金纳米棒溶液的制备
取40mL浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液,向其中依次加入0.29mL浓度为10mM的硝酸银水溶液,2mL浓度为10mM的氯金酸水溶液,混合均匀后,再加入0.36mL浓度为0.1M的抗坏血酸水溶液,混合溶液逐渐由桔红色变为无色;然后加入32μL金种溶液,混合均匀后放入25℃恒温水浴中,静置24小时,制得金纳米棒溶液。
(3)金纳米棒溶液的纯化
将步骤(2)制得的金纳米棒溶液在常温下,以8000rpm的转速离心20min,吸去上清液后加入相同体积的二次水,以相同的条件再次离心,加入去二次水,获得纯化后溶液,测得溶液中金纳米棒的浓度为0.1nM,命名为0.1nM金纳米棒溶液,置于冰箱(4℃)冷藏备用。该金纳米棒溶液的透射电镜图见图1,紫外吸收图见图2。从图1和2中可以看出,合成了粒径均一、分散良好、且球形纳米颗粒很少的金纳米棒。
实施例1
本实施例用来说明金纳米棒被还原型谷胱甘肽修饰后,加入再生长溶液进行再生长,得到各种颜色、各种形态的金纳米棒(制备离散的金纳米棒的电镜图参见图1,紫外光谱图见图2)。
(A)向1mL浓度为40mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液,加入20μL 0.1M抗坏血酸溶液,25ul 1mM氯金酸溶液,并行七组实验,分别加入20μL的4μM、8μM、12μM、16μM、20μM、40μM的还原型谷胱甘肽溶液,250ul的0.1nM金纳米棒得到混合溶液,七组混合溶液中还原型谷胱甘肽浓度依次为0、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM和500nM,然后在25℃恒温水浴中静置吸附0.5h;
(B)向步骤(A)得到的七组溶液中分别加入25μL 10mM氯金酸溶液,在25℃恒温水浴中静置0.5h,进行再生长,金纳米棒溶液经再生长,在纳米棒表面生成一层新的金纳米层,厚度为3-10nm,完成金纳米棒形态调控。反应完全后离心,再生长后的样品溶液在室温下,以5000rpm的转速离心10min,吸去上清液后加入相同体积的二次水,以相同的条件再次离心,加入二次水,得到离散的金纳米棒,获得七组不同浓度还原型谷胱甘肽介导的金纳米棒溶液,观察其颜色的变化,并测其紫外光谱,不同浓度还原型谷胱甘肽介导的金纳米棒溶液TEM图如图3所示,其中图3A浓度为0,图3B浓度为50nM,图3C浓度为250nM,图3D浓度为500nM;紫外吸收图如图4所示。
结合图3和图4,说明在一定范围内,随着还原型谷胱甘肽浓度的增加,伴随着LSPR峰红移程度增强。即更多的还原型谷胱甘肽被嵌入到再生长金层中,产生更多的尖端,因而各向异性系数增加、LSPR峰红移更强。这是因为还原型谷胱甘肽优先吸附于金纳米棒头部和尾部替换掉金纳米棒上的十六烷基三甲基溴化铵,可以在原位增长金纳米棒的长度。然而随着还原型谷胱甘肽浓度的增加,越来越多的还原型谷胱甘肽吸附于金纳米棒的侧面,使得红移程度减小。
基于上述还原型谷胱甘肽调控金纳米棒形态的方法的应用,该方法获得的再生长金纳米棒所具有的的尖端的形态特点,用于作为表面增强拉曼的基底。
基于上述还原型谷胱甘肽调控金纳米棒形态的方法的应用,以获得的再生长金纳米棒的形态演变,通过等离子体成像,用于探索各种形态的再生长金纳米棒在细胞中运动轨迹以及分布的研究。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上,根据还原型谷胱甘肽介导的金纳米棒得到了各种颜色的、各种形态的金纳米棒,进一步研究设计了一段多肽序列Gly-Cys-Lys-Gly-Gly-Cys-Gly。研究证明,胰蛋白酶可作为丝氨酸蛋白酶,在赖氨酸或精氨酸的羧基侧特异性切割肽链。肽的切割位点的两边都有一个半胱氨酸残基作为和金纳米棒结合的位点,其被胰蛋白酶从二硫醇肽特异性识别、切割成两个单硫醇肽,即Gly-Cys-Lys和Gly-Cys-Gly。然后将酶切产物加入到纯化后的金纳米棒溶液中进行再生长,得到粉紫色,紫色甚至到蓝色的各种颜色的金纳米棒。获得酶切后多肽溶液;
(C)并行八组实验,分别向80uL磷酸盐缓冲溶液中加入2μL 1.5ng/mL、3.75ng/mL、7.5ng/mL、15ng/mL、37.5ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、375ng/mL、750ng/mL胰蛋白酶溶液,和18μL 1μg/mL多肽溶液。三者体积100uL。混匀获得混合溶液,37℃恒温水浴下反应2h,获得八组胰蛋白酶酶切后多肽溶液。
(D)取1mL制备例1中制备的0.1nM纯化后金纳米棒溶液,向其中依次加入1mL浓度为40mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液,20μL 0.1M抗坏血酸溶液,25ul 1mM氯金酸溶液,分别加入上述八组100μL的胰蛋白酶酶切后多肽溶液,得到混合溶液,混匀之后,在25℃恒温水浴中静置吸附0.5h,获得八组酶切后多肽修饰的金纳米棒溶液,酶切后多肽修饰的金纳米棒溶液中胰蛋白酶浓度为80fM、200fM、400fM、800fM、2pM,4pM、8pM和20pM,40pM;
(E)然后向步骤(D)得到的八组溶液中分别加入25μL 10mM氯金酸溶液,在25℃恒温水浴中静置0.5h,金纳米棒溶液经再生长,在纳米棒表面生成一层新的金纳米层,厚度为3-10nm,获得再生长金纳米棒溶液。反应完全后离心,再生长后的样品溶液在室温下以5000rpm的转速离心10min,吸去上清液后加入相同体积的二次水,以相同的条件再次离心,加入二次水,获得八组纯化后的金纳米棒溶液,观察其颜色的变化并测其紫外光谱。纯化后的金纳米棒溶液的LSPR峰红移数据与胰蛋白酶浓度的曲线变化图如图5所示,胰蛋白酶浓度分别为:0,80fM,200fM,400fM,800fM,2pM,4pM,8pM,20pM,40pM;标准曲线图如图6所示,胰蛋白酶线性范围为80fM,200fM,400fM,800fM,2pM,4pM。
可以观察到酶浓度的改变与再生长的贵金属纳米颗粒的LSPR峰有关,随着酶浓度的增大,LSPR峰红移程度增强。当酶浓度增加到一定程度时,红移程度减弱;
从图5可以看出随着胰蛋白酶浓度的增加伴随着LSPR峰红移。即更多的多肽被嵌入到再生长金层中,产生更多的尖端,因而长径比增加、LSPR峰红移更强。这是因为多肽被胰蛋白酶进行切割,产生了数目更多的、序列更短的多肽序列,这些短的多肽序列和还原型谷胱甘肽一样,优先吸附于金纳米棒头部和尾部,替换掉金纳米棒上的十六烷基三甲基溴化铵,可以在原位增长金纳米棒的长度。然而随着胰蛋白酶浓度的增加,长序列多肽被切割完全,使得红移程度减缓。在线性范围内,可以定量检测酶浓度,当超过线性范围时,也可以通过肉眼观察溶液颜色的变化,判断是否有蛋白酶的存在。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,巯基修饰:
按体积比,1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和巯基生物分子溶液,25-70℃加热条件下反应0.5-2 h,将含巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
步骤2,贵金属纳米颗粒溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-40 ℃加热条件下反应30-60 min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控,所述的贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的一种或两种的混合物,所述贵金属的盐溶液浓度为10 mM,贵金属的盐溶液添加体积同步骤1;所述的贵金属纳米颗粒溶液经再生长,在纳米颗粒表面生成一层新的贵金属层,所述贵金属层包括金纳米层、银纳米层的任意一种或两种的组合,所述贵金属层厚度为3-10 nm;
对所述再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行电镜和光谱检测,经紫外和电镜表征获知,贵金属纳米颗粒形态和LSPR峰的红移与巯基生物分子溶液浓度有关,在巯基生物分子溶液浓度≤500 nM范围内,当巯基生物分子的浓度为50-75 nM,贵金属纳米颗粒的尖端个数为1个;当巯基生物分子的浓度为75-150 nM时,尖端个数为1-3个;当巯基生物分子浓度为150-500 nM时,尖端的个数为3-6个;且随着巯基生物分子浓度的增加,尖端个数增加,LSPR峰发生红移。
2.根据权利要求1所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法,其特征在于,所述步骤1中:
贵金属纳米颗粒溶液为金纳米粒子溶液、银纳米粒子溶液、金纳米棒溶液、金纳米星溶液、银纳米棒溶液或者银纳米星溶液中的任意一种或至少两种的混合物,贵金属纳米颗粒溶液浓度为0.01-10 nM;
表面活性剂溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液或十六烷基三甲基氯化铵溶液中的一种或两种的混合物,所述表面活性剂溶液浓度为5-100 mM;
还原剂溶液为抗坏血酸溶液、抗坏血酸钠溶液、羟胺溶液或硼氢化钠溶液中的任意一种或至少两种的混合物,所述还原剂的浓度为0.1-1 M;
贵金属的盐溶液为氯金酸溶液、硝酸银溶液或醋酸银溶液中的任意一种或至少两种的混合物,所述贵金属的盐溶液浓度为1 mM;
巯基生物分子溶液包括含巯基的核酸溶液、氨基酸溶液、肽溶液、蛋白质溶液或者细菌溶液;
巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中巯基生物分子浓度≤500 nM。
3.根据权利要求2所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法,其特征在于,所述步骤1中,巯基生物分子溶液为还原型谷胱甘肽溶液,还原型谷胱甘肽溶液浓度为1-100 μM。
4.权利要求1所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,应用该方法获得的再生长贵金属纳米颗粒所具有的尖端形态特点,用于作为表面增强拉曼的基底。
5.权利要求1所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,以该调控方法获得的再生长贵金属纳米颗粒的形态演变,通过等离子体成像,用于探索各种形态的再生长贵金属纳米颗粒在细胞中运动轨迹以及分布的研究。
6.权利要求1所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,将巯基生物分子溶液经酶切后,再进行巯基修饰与溶液再生长,将获得的再生长贵金属纳米颗粒溶液经纯化后,进行紫外和电镜的表征,记录再生长贵金属纳米颗粒溶液的等离子共振峰红移数据与酶浓度的关系,建立标准曲线,用于酶活性检测。
7.根据权利要求6所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,所述的再生长贵金属纳米颗粒溶液的获得包括步骤如下:
步骤1,巯基生物分子的酶切反应:
按体积比(18-40):(2-10):(50-80)将巯基生物分子溶液和酶溶液加入磷酸盐缓冲溶液中,进行巯基生物分子切割反应,制得酶切后巯基生物分子溶液,其中,所述的切割反应温度为35-40 ℃,切割反应时间为2-4 h;
步骤2,巯基修饰:
按体积比1:(1-10):(0.02-0.2):(0.025-0.25):(0.01-0.1),取贵金属纳米颗粒溶液,向其中加入表面活性剂溶液,还原剂溶液,贵金属的盐溶液和酶切后巯基生物分子溶液,25-70 ℃加热条件下反应0.5-2 h,将巯基生物分子吸附在贵金属纳米颗粒表面,获得巯基吸附的贵金属纳米颗粒溶液,完成巯基修饰;
步骤3,贵金属纳米颗粒溶液再生长:
向巯基吸附贵金属纳米颗粒溶液中加入贵金属的盐溶液,25-40 ℃加热条件下反应30-60 min,获得再生长贵金属纳米颗粒溶液,完成贵金属纳米颗粒形态调控。
8.根据权利要求7所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,所述步骤1中,巯基生物分子溶液中的巯基生物分子为含有酶切位点的巯基生物分子,且酶切位点的两侧均有巯基,所述巯基生物分子溶液浓度为1-10 μg/mL,酶溶液浓度≤750 ng /mL;所述酶包括胰蛋白酶、细胞凋亡酶、胃蛋白酶或者金属蛋白酶以及DNA酶。
9.根据权利要求8所述的基于巯基生物分子调控贵金属纳米颗粒形态的方法的应用,其特征在于,所述步骤1中,巯基生物分子溶液为多肽溶液,多肽序列为Gly-Cys-Lys-Gly -Gly-Cys-Gly。
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