KR20180015938A - 사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법에 관한 것이다.
상기 토릴린은 사상자로부터 분리한 것이므로, 친환경적이고, 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방으로부터 선택된 하나 이상의 성충 또는 유충의 방제 효과가 있는 것이다.

Description

사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법{Composition for controlling pest comprising torilin or its salt from Torilis japonica as effective component and method for controlling pest using the same}

본 발명은 사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법에 관한 것이다.

인류는 산업혁명 이후 효율적 생산과 소비를 지향하면서 꾸준히 발전해왔다. 현대 농업에 있어서 농약은 식량의 대량품질의 농작물을 안정적으로 대량 생산하기 위해서 필수적인 요소이며, 이러한 농약은 작물과 대상 병해충의 종류에 따라서 쓰임새가 달라지므로 현재 국내에도 수백 종의 농약이 제조 판매되고 있다. 그러나 화학적 기술에 기초한 농업의 산업화는 자연생태계의 파괴, 병해충의 농약 저항성 증대와 토양, 수질, 환경오염 등 예기치 않은 많은 사회적 문제를 야기하였다. 이렇게 유기합성농약을 수십 년에 걸친 연용과 남용으로 인하여, 해충군의 이상격발 또는 저항성 해충의 출현, 인간을 비롯한 비목적충에 대한 독성발현 및 환경 계의 오염 등의 많은 부작용을 야기하게 되었다. 그러므로 전 세계 석학들이 인류의 생존환경을 보존하기 위하여 지구의 온난화와 환경오염을 줄이자고 주장하였고 마침내 전 세계 국가가 합의하기에 이르렀다. 국제적인 협의 중에서 인축에 영향을 많이 미치는 유기 합성된 농약의 생산과 사용을 점차 제한하자고 합의하였으며, 전 세계국가들은 2004년에 지난 10년 전에 사용하던 화학합성 유기인계, 유기염소계 농약 총생산량의 50%까지 생산이 감축되었고, 2010년까지 다시 유기인계, 유기염소계 농약의 생산을 50% 감소시키기로 국제적으로 동의하여 현재 실행 중에 있다. 그러나 유기인계, 유기염소계 농약 감축생산에 협의한 이후, 전 세계적으로 많은 연구진이 유기인계, 유기염소계 농약을 대체할 수 있는 환경 친화적 살충제를 개발하려고 많은 노력을 하고 있으나 아직 유기인계살충제인 고독성 농약을 대체할 새로운 기작의 안전한 살충제를 개발하지 못하고 있는 실정이다. 그러므로 전 세계적인 농약생산 감축회의 협정내용이 지켜지기 어려운 상황이며, 조만간에 안전한 살충제가 생산되지 않고 사용할 살충제의 량이 부족하게 된다면 식량생산에 관련된 농업뿐만 아니라 여러 가지 산업에서 어려운 문제가 대두될 것으로 예상된다.

작물의 보호 목적으로 사용되는 농약은 잡초와 병해충에 대하여 방제 효과가 우수하여야 하지만, 인체 또는 가축에 대하여 독성이 없거나 크지 않아야 하며, 환경 중에서 쉽게 분해되어 환경오염 물질로 작용하지 않아야 한다. 이렇게 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여 저 독성 또는 무독성이며, 무공해성의 생물 농약에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 생물 농약에는 미생물 농약, 생화학 농약 및 천적을 이용한 농약으로 대별되어 있다. 미생물 농약은 진균, 세균, 바이러스 및 원생동물 등 살아있는 미생물을 이용한 농업용 미생물 방제제를 말하고, 생화학 농약은 자연계에서 생성된 천연화합물을 추출하여 이용하거나 신호전달에 관련된 활성물질 또는 생약 방제제로 구분되어있다. 한편, 생화학 농약에는, 동식물, 페로몬, 효소, 광물질 등의 천연성분으로 구성되는 천연물농약 및 식물체에 도입된 유전자에 의해 식물에서 생산되는 농약 등이 있다. 이와 같은 생물 농약은, 잔류성이 비교적 적으며 인축 및 환경에 영향을 미치지 않아 화학농약의 대체재로 이용하려고 개발이 진행되고 있다. 그러나 이와 같은 친환경적 농약은 현재까지는 일반적으로 원재료의 취급이 용이하지 않고, 방제가가 화학농약과 비교하면 아주 낮아, 친환경농약은 산업화에 어려움이 있으며 범용화에 한계를 나타내고 있는 실정이다. 대부분의 생물 농약 및 천연자원 유래 농약의 가격이 고가인 관계로 경제성이 낮고 실효성이 적으며, 방제 효과가 낮거나 효과가 극히 제한적이고, 약효가 속효성이 아닌 경우가 많기 때문에 이제까지 유기합성농약을 사용하던 사용자들로부터 호응을 얻지 못하고 있는 실정이다. 그러나 전세계는 화학 합성농약의 지나친 사용으로 인하여 토양과 수질의 오염 및 토양 미생물과 천적 감소로 인한 생태계 교란 등의 환경 문제가 커다란 사회적 이슈로 부각되어 있는 상태이다. 근래에 이르러서 농약의 연속적이고 지속적인 사용에 의해서 이전에 사용하던 농약보다 다량 살포하여도 방제 효과가 저조해지는 해충의 농약저항성 문제가 대두되고 있으며, 또한 농산물에서 종종 독성이 강한 농약이 허용치 이상으로 검출되어 식품으로서의 가치가 상실되는 경우까지 발생하고 있다. 이로 인하여 바람직하지 못한 다양한 직접 또는 간접적인 부작용이 발생하게 되었다. 그리고 농작물에 잔류된 농약 중에 인체에 영향을 미치는 농약인 경우에 이를 섭취하면 인체에 치명적인 위해 요인으로 작용하고 있다.

국민경제의 발전으로 소득수준이 향상되어 농산물에 대한 소비자의 인식이 전환됨에 따라 안전한 먹거리, 즉 유기농산물을 포함한 친환경 농산물을 찾는 소비자가 늘어나고 있다. 친환경 농산물의 생산을 위해서는 무엇보다도 화학농약과 비료를 대체할 수 있는 것이 필요하다. 고독성의 유기화학농약을 대체할 수 있는 약제를 확보하고 인간과 축산에 대하여 안전하고, 환경 독성 문제 해결 및 친환경 농산물 생산을 위한 종합적 병해충관리에서 가장 중요한 기술로 생물농약이 제시되고 있는데 생물 방제제라고 불리는 있는 생물농약은 자연계에 존재하는 생물체 및 그로부터 유래한 소재를 이용하여 농작물 생산 및 보존에 피해를 미치는 미생물, 해충 및 잡초 등을 방제하는 작물 보호제이다.

미국의 경우에 미국 환경청은 최소 위험 살충제로 분류된 제품에 들어간 천연 성분에 대해서는 안전성 실험을 면제해주고 있다. 하지만, 기존 일반 살충제 업체들을 대변하는 특수 소비자 제품 협회에서는 이러한 면제 조치 때문에 일부 몰지각한 기업에서는 천연 제품들을 약효도 입증받지 않은 상태에서 시장에 무차별적으로 상품을 내놓고 있다며, 안전성 실험 면제조치를 재검토해 달라는 청원을 미국환경청에 제출하였다. 한편, 우리나라를 포함한 OECD 국가에서는 환경오염 및 잔류농약 등 부작용으로부터 인류를 보호하기 위하여 고독성의 유기합성농약과 화학합성비료의 사용을 줄이자는 친환경농업정책을 적극 추진하고 있다. 2009년 친환경농산물 시장규모는 2008년 대비 17% 정도 증가한 3조 7,355억 원으로 증가하였다. 저 농약 신규 인증제가 폐지되는 2010년에는 증가세가 둔화하여 4조 940억 원, 2013년에는 5조 955억 원으로 추정된다. 저 농약 인증제 자체가 폐지되는 2015년에는 저 농약 농가 일부가 무농약 인증이나 유기 인증으로 전환을 가정하면 2013년보다 감소한 4조 9,216억 원이 될 것으로 전망이고, 이후 점차 회복되어 2020년에는 전체 농산물 시장규모의 20%인 7조 676억 원이 될 것으로 전망되고 있다.

현재 알려진 천연농약 조성물에 대한 종래기술인 식물성 추출물을 이용한 생물 살충제에 관한 기술로, 한국공개특허 제2006-71380호에는 제충국 추출물, 고삼 추출물, 콩 추출물, 참깨기름, 침투제로 조성하며, 필요에 따라 님 오일, 백부근 추출물, 백양나무 추출물, 측백나무 추출물, 피마자 추출물을 추가로 함유하는 식물 추출물을 이용한 생물농약으로서의 천연살충제가 개시되어 있고, 한국등록특허 제278796호에는 목초액, 이소레시친, 지방산을 함유한 살충 및 생육촉진용 목초액 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제415107호에 은행잎 추출물과 제조방법 및 용도에 대하여 개시되어 있고, 한국등록특허 제338712호에 항 진균용 생물농약제제 및 제조방법에 대하여 개시되어 있으며, 한국등록특허 제285208호에 신규한 칼슘함유 생물농약에 대하여 개시되어 있고, 미국등록특허 제6,051,233호에 천연계 토양 처리 및 살충제 조성물에 대하여 개시되어 있고, 미국등록특허 제6,582,712호에 계면활성제와 테르펜 유를 이용한 해충 제어에 대하여 개시되어 있으며, 미국등록특허 제6,548,085호에 살균제 조성물에 대하여 개시되어 있으나, 살충력에 문제가 있어 실제 사용하지 못하거나, 사용하더라도 일부 시험적으로만 사용되고 있는 실정이다.

또한, 최근농약의 개발의 동향을 분석해보면, 유기합성농약 이외에 향후 10년 안에 전 세계 생물학적 제제의 시장이 5조 원 이상으로 확대될 것으로 전망되고 있고, 국내 생물농약 시장도 1000억 원으로 확대될 것으로 예상되며 관련 생물공학 기술의 발전에 따라 그 가능성은 점점 높아질 것으로 전망된다.

현재 사용되는 살충제들은 작용 기작면에서 신경 전달 저해제, 에너지 생성 저해제, 생장조절제 및 성 페르몬 유인제로 분류할 수 있으며, 상기의 생장조절제는 유약호르몬 저해제 및 키틴 생합성 저해제로 구분할 수 있다.

많은 연구자에 의하여 심각한 독성을 갖지 않고 생태계를 파괴하지 않으면서도 살균, 항균 또는 살충 등의 효과가 우수한 농약 조성물의 개발이 진행되고 있으며 친환경 농업을 실현하기 위하여 인간과 주변 환경에 무해하면서 병해충을 효과적으로 제거할 수 있는 조성물의 개발이 요청되고 있다. 따라서 인간과 동식물에는 무해한 환경 친화적이면서도, 취급이 용이하여 생산 가격이 낮고, 방제가가 높은 살충제의 개발이 요구되고 있다. 그러므로 인체 또는 가축에 대하여 독성이 없으며, 환경 중에서 오염 인자로 작용하지 않는 농약을 개발하는 것이 농약 연구자들의 최대 목표로 꼽히고 있으며, 여러 가지 방법으로 농약의 사용량을 줄이기 위해서 다각적인 연구들이 행해지고 있으나, 본 발명의 사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법에 관한 기술은 언급된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법을 제공하고, 본 발명의 유효성분인 토릴린이 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방의 유충에 살충 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 농업용 또는 원예용 살충제를 제공한다.

또한, 본 발명은 토릴린 또는 이의 염을 해충으로부터 보호하기 위한 농작물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 해충의 방제방법을 제공한다.

본 발명은 사상자로부터 분리한 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물 및 이를 이용한 해충의 방제방법에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 토릴린은 해충의 살충효과가 있으며, 특히, 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방 중에서 선택된 1종 이상의 성충 또는 유충의 살충 효과가 우수할 뿐만 아니라, 천연물로부터 분리한 것이므로, 안전성이 탁월한 것이다.

도 1은 본 발명의 화학식 1 화합물의 질량분석스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 화학식 1 화합물의 수소핵자기공명 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 화학식 1 화합물의 탄소핵자기공명 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 화학식 1 화합물의 HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 화학식 1 화합물의 HMBC(Heteronuclear Multiple Quantum Bond Correlation) 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 화학식 1 화합물의 처리에 따른 배추좀나방 유충의 살유충 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물에 관한 것이다.

상기 해충은 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방 중에서 선택된 하나 이상의 성충 또는 유충인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 토릴린은 사상자(Torilis japonica) 추출물로부터 분리한 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 사상자 추출물의 용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 상기 추출물을 클로로포름, 에틸아세테이트, 노말 헥산 및 물을 이용하여 분획할 수 있으며, 상기 분획물은 각각 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 역상 칼럼크로마토그래피 및 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 순차적으로 수행할 수 있으며, 상기 실리카겔 크로마토그래피의 용출 용매는 클로로포름 및 메탄올을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 역상크로마토그래피는 메탄올을 용출 용매로 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 농업용 또는 원예용 살충제에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 살충제는 종래의 살충제에 대한 저항성이 강해진 해충의 유충을 효과적으로 방제하는데 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 살충제를 사용할 경우, 임의의 기타 성분들의 첨가 없이, 토릴린 화합물 자체 또는 염산이나 황산과 같은 무기산, 또는 p-톨루엔 술폰산과 같은 유기산과의 농화학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 살충제는 통상의 고체 담체, 액체 담체, 기체 담체 또는 유인물과 혼합하거나, 염기성 물질, 예를 들어 다공질 세라믹 플레이트 또는 부직포에 흡수시킨 후, 계면활성제 및 필요한 경우, 기타 보조제들을 첨가하여, 이를 각종 형태들, 예를 들어 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제, 증기화가 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기 방지용 시이트 또는 수지 제형물로 제형화 할 수 있다.

상기 각 제형물들은 통상적으로 본 발명의 유효성분을 0.01 내지 95중량% 함유할 수 있다. 상기 제형물에 사용될 수 있는 고체 담체의 종류에는, 카올린 점토, 규조토, 합성 수화된 산화 규소, 벤토나이트, 푸바사미 점토 및 산성 점토 등의 점토 물질의 미세 분말 또는 과립; 각종 탈크, 세라믹 및 기타 무기 물질, 예를 들어 견운모, 석영, 황, 활성탄, 탄산칼슘 및 수화된 실리카; 및 화학적 비료, 예를 들어 황산 암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄이 포함될 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니며, 액체 담체에는, 물; 알코올, 예를 들어 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예를 들어 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예를 들어 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예를 들어 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예를 들어 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예를 들어 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예를 들어 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예를 들어 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예를 들어 대두유 및 면실유가 포함될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니고, 기체 담체 또는 추진제에는, 프레온 가스, 부탄 가스, 액화 석유 가스, 디메틸 에테르 및 이산화탄소가 포함될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 독성 유인물에 사용되기 위한 염기 물질에는, 유인물 물질, 예를 들어 그레인 분말, 식물성 오일, 슈거 및 결정성 셀룰로오스; 산화방지제, 예를 들어 디부틸히드록시톨루엔 및 노르디히드로구아이아레트산; 보존제, 예를 들어 데히드로아세트산; 비식음 방지용 물질, 예를 들어 고추 분말; 및 유인성 풍미, 예를 들어 치즈 풍미 및 양파 풍미가 포함될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 계면활성제는, 알킬 술페이트, 알킬 술포네이트, 알킬 아릴술포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 알콜 에스테르 및 당 알콜 유도체가 포함될 수 있고, 접착제 또는 분산제와 같은 보조제에는, 카세인, 젤라틴; 다당류, 예를 들어 전분, 아라비아검, 셀룰로오스 유도체 및 알긴산; 리그닌 유도체, 벤토나이트, 슈거 및 합성 수용성 중합체, 예를 들어 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리아크릴산이 포함될 수 있으며, 안정화제는, 이소프로필 산 포스페이트, 2, 6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및 3-tert-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물, 식물성 오일, 미네랄 오일, 계면활성제, 지방산 및 그것의 에스테르가 포함될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 화합물이 농업용 살충제로 사용될 경우, 그것들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.1~100g이지만 이에 한정하는 것은 아니다. 물로 희석한 후 사용되는 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형화물들의 경우, 그 적용 농도는 통상 1~100,000ppm의 범위이다. 과립, 더스트 또는 기타 유사 제형물의 적용은, 희석하지 않은 제형물로서 수행된다. 본 발명의 화합물을 유행병 예방을 위한 살충제로 사용할 경우, 그것들은 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 또는 기타 유사 제형물의 경우, 물을 이용하여 0.1~500ppm의 농도로 희석하거나, 그것들을 오일 스프레이, 에어로졸, 훈연제, 독성 유인물, 진드기 방지용 시이트 또는 기타 유사 제형물의 경우에는, 그대로 적용될 수 있다. 상기 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감이 얼마든지 가능하다.

본 발명의 유효성분은 다른 살곤충제, 살선충제, 살진드기제, 살세균제, 살진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 및/또는 동물 사료와 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 해충으로부터 보호하기 위한 농작물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 해충의 방제방법에 관한 것이다. 상기 해충은 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방 중에서 선택된 하나 이상의 성충 또는 유충인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 해충으로부터 보호하기 위한 농작물은 배추, 옥수수 또는 벼인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 살유충 활성물질의 분리 및 정제

화학식 1의 화합물인 토릴린을 사상자로부터 분리 및 정제하였다. 사상자를 대전 약전 시장에서 구입하여 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조하고 분쇄기로 분말화 하였다. 1000g의 사상자 분말에 대하여, 3배의 중량비로 95%(v/v)의 에탄올을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였고, 상기 여과액을 감압 농축하여 201g의 조추출물을 수득하였다.

상기 조추출물에서 활성물질을 분리 및 정제하기 위하여, 클로로포름, 에틸아세테이트, 노말 헥산 및 물을 이용하여 각각의 분획물로 분리하고, 상기 분획물의 살유충 활성을 측정하였다. 상기 분획물 중에서, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 우수한 살유충 활성을 나타냈다. 따라서 에틸아세테이트 층을 감압 농축하여 173.1g을 수득하였다. 이후, 에틸아세테이트 분획물 내에 함유된 살유충 활성을 나타내는 활성물질을 분리정제하기 위하여, 20g의 에틸아세테이트 가용부를 5배량의 실리카겔 (230-400 mesh, Art. 9385, Merck사)이 포함된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때, 용출액으로는 클로로포름:메탄올(100:1, 90:1, 70:1, 50:1, 30:1, 15:1, 5:1, 1:1)로 구성된 단계의 농도 구배 시스템을 이용하여 총 8개 분획으로 나누어 분리하였다. 분리된 분획의 살유충 활성을 측정하여 그 중에서 가장 살유충 활성이 높은 분획을 감압 농축시켜 1.37g의 분획물을 수득하였다. 상기 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 분획물에서 살유충 활성물질을 분리하기 위하여, 역상 칼럼 크로마토그래피로 분획을 나누었는데 용출 용매로 60%, 70%, 80%, 90% 메탄올을 사용하였다. 이 중 살유충 활성이 높은 분획들을 모아 단일물질로 분리하기 위하여 최종적으로 고속액체크로마토그래피를 사용하였는데 칼럼은 YMC Jsphere ODS H-80(250×20 ㎜)를 사용하였고, 용출 용매는 80%(v/v) 메탄올을 6㎖/min로 흘려주면서, 물질을 분리하여 순수화합물을 얻었다. 물질의 검출은 UV 210㎚에서 행하였으며, 살유충 활성 물질은 32분에 용출되는 피크였으며, 상기 피크를 감압 건조시켜 229㎎의 단일 활성물질을 수득하였다. 사상자로부터 살유충 활성물질을 완전히 정제되어 순수 분리된 화학식 1은 무색의 오일로, 분자량을 측정한 결과, [M+Na]⁺가 m/z 399.6으로 나타나 분자량(MW)은 376으로 측정되었고(도 1), 고분해 ESI-MS에서 분자식이 C₂₅H₃₂O₅로 추정되었다. 화학식 1 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과, 최대 흡수치가 210㎚에서 나타났다. 상기 이화학적 특성을 참고하면서 순수분리한 활성물질을 CDCl₃에 녹여 300MHz에서 수소 핵자기공명스펙트럼을 얻고(도 2), CDCl₃에 녹여 75MHz에서 탄소 핵자기공명스펙트럼(도 3), HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) 스펙트럼(도 4) 및 HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 스펙트럼(도 5)을 얻어 기기분석하여 활성물질의 구조를 규명한 결과, 화학식 1 화합물은 토릴린(Torilin)과 일치하였다(Nakazaki M. et al 1966, Tetrahedron Lett. 37. 4499-4504).

[화학식 1]

실시예 2. 배추좀나방 ( Plutella xylostella L.) 유충에 대한 토릴린의 살충 활성 확인

본 발명에 사용된 시험곤충으로 배추좀나방(Plutella xylostella L.) 유충은 2016년 6월 대전시 유성구 어은동 한국생명공학연구원 산업바이오소재연구센터에서 분양받아 실험 유충으로 사용하였다.

본 발명의 살유충 활성을 가진 화합물인 토릴린을 정확하게 무게를 측정하여 아세톤에 적정량을 녹인 후, 100ppm의 트리톤 X-100 수용액 9배와 혼합하였다.

양배추 생육시 살충제를 사용하지 않았던 양배추를 선택하여 그 중에서 균일한 발육상태의 양배추 잎을 지름 3.0㎝ 잎 디스크 보러를 이용하여 원형으로 잘라내고, 상기 준비한 토릴린 용액에 30초간 충분히 잠길 정도로 침적한 후, 꺼내 후드 내에서 유기용매를 날려 보냈다. 증류수로 적신 여과지가 깔린 페트리 플레이트 (55×20mm)에 상기 토릴린이 처리된 잎을 올려놓고, 미리 키워 놓았던 배추좀나방 2령 유충을 유충체가 상하지 않도록 부드러운 붓으로 유충을 패트리 플레이트로 이동시켜 10마리씩 3번 반복으로 시험하였다.

토릴린(화학식 1의 화합물)이 처리된 배추좀나방 유충은 항온실(25±1℃, 상대습도 40~45%, 명암주기 16L:8D)에서 사육하며, 24, 48, 72 및 96시간 후에 유충의 살충율을 조사하였다.

무처리구는 살충을 위한 물질을 아무것도 넣지 않고, 10%(v/v)의 아세톤 용액에 100ppm의 트리톤 X-100 수용액 9배를 처리하여, 토릴린을 처리한 것과 동일한 방법으로 시험하였다.

토릴린의 살유충 활성검색 실험은 3번 반복으로 실시하였고, Finney(1982)의 프로빗(probit) 계산법에 의해 반수치사 농도(LC₅₀)를 산출하였다. 본 발명에 사용한 0~100㎍의 토릴린을 배추좀나방의 유충에 처리하고 24시간 간격으로 살유충 정도를 측정하였을 때, 대조구에 대비하여 지속적인 살유충 현상이 나타났으며 농도 의존적으로 배추좀나방 유충에 살충 효과가 나타났다 (표 1 및 도 6).

약제	농도 (㎍/㎖)	반복	개수 (n)	살충수				4일째 살충률(%)±SD
				1일	2일	3일	4일
화학식 1의 화합물	100	1	9	3	7	9	9	100.0±0.0
		2	10	4	5	8	10
		3	10	5	9	9	10
	10	1	10	0	6	6	8	72.4 ±13.2
		2	7	0	4	4	4
		3	10	1	1	6	8
	1	1	10	1	0	0	3	44.8 ±13.1
		2	10	0	0	2	5
		3	11	0	1	1	6
대조구	0	1	10	0	0	0	0	0.0±0.0
		2	11	0	0	0	0
		3	10	0	0	0	0

실시예 3. 복숭아혹진딧물 ( Myzus persicae ) 성충에 대한 토릴린의 살충 활성 확인

복숭아혹진딧물(Green peach aphid)은 실내에서 배추담배유묘를 공급하면서 아크릴 케이지(30×30×30cm)에서 사육하였다. 실내 사육조건은 25~28℃, 명암주기는 16L:8D, 상대습도(RH)는 50~60%이었다. 실험은 사육조건과 동일한 조건에서 수행하였다.

본 발명의 토릴린(화학식 1의 화합물)을 정확하게 무게를 측정하여 각 농도로 희석하여 약액으로 제조하였다. 약액에 배추 잎 절편(직경 5cm)을 30초 동안 침지 후, 음건시켜 1회용 페트리디쉬(5.5×2cm)에 솜과 여과지(Φ5.5cm)를 깔고 음건시킨 배추 잎을 올렸다. 복숭아혹진딧물 성충을 10마리씩 접종하고 약액 처리 1일, 2일, 3일 후에 살충률을 조사하였으며, 실험은 3번 반복으로 수행하였다. 본 발명에 따른 0~100㎍의 토릴린을 복숭아혹진딧물에 처리하고, 24 시간 간격으로 살충 정도를 측정하였을 때, 대조구에 대비하여 지속적인 살충현상이 나타났으며 농도 의존적으로 복숭아혹진딧물의 성충에 살충효과가 나타났다(표 2).

복숭아혹진딧물(Myzus persicae) 성충에 대한 토릴린의 살충 활성

약제	농도 (㎍/㎖)	반복	개수 (n)	살충률			3일째 살충률(%)±SD
				1일째	2일째	3일째
화학식 1의 화합물	100	1	9	0	4	8	96.3±6.4
		2	10	0	6	10
		3	13	0	7	13
	10	1	10	0	5	10	93.9±10.5
		2	11	0	7	9
		3	10	0	4	10
	1	1	11	0	4	10	78.8±13.9
		2	11	0	4	7
		3	11	0	6	9
대조구		1	13	0	0	1	2.6±4.4
		2	10	0	0	0
		3	10	0	0	0

실시예 4. 멸강나방 ( Pseudaletia separata ) 유충에 대한 토릴린의 살충 활성 확인

일반명으로 Rice armyworm인 멸강나방은 실내에서 누에 인공 사료를 공급하면서 아크릴 케이지(30×30×30cm)에서 사육하였다. 실내 사육조건은 25~28℃, 명암주기는 16시간 명, 8시간 암 주기이고, 상대습도는 50~60%이었다. 살충활성 평가 실험은 사육조건과 동일한 조건에서 수행하였다.

본 발명의 토릴린을 정확하게 무게를 측정하여 시험 살충제를 각 농도로 희석하여 약액에 배추 잎 절편(직경 5cm)을 30초간 침지 후, 음건시켜 1회용 페트리디쉬(5.5×2cm)에 솜과 여과지(Φ5.5cm)를 깔고 음건시킨 배추 잎을 올렸다.

멸강나방 유충을 10마리 정도씩 넣어주고 토릴린의 처리 1일, 2일, 3일, 4일 후에 살충률을 조사하였으며, 실험은 3번 반복으로 수행하였다. 본 발명에 따른 0~100㎍의 토릴린을 멸강나방 유충에 처리하고 24시간 간격으로 살충 정도를 확인하였을 때, 대조구에 대비하여 지속적인 살충현상이 나타났으며 농도 의존적으로 멸강나방 유충에 살충효과가 나타났다 (표 3).

멸강나방(Pseudaletia separata) 유충에 대한 토릴린의 살충 활성 확인

약제	농도 (㎍/㎖)	반복	개수 (n)	살충수				4일째 살충률(%)±SD
				1일	2일	3일	4일
화학식 1의 화합물	100	1	10	0	0	0	5	62.6±14.1
		2	10	0	0	0	6
		3	9	0	1	1	7
	10	1	9	0	2	2	4	47.0±18.5
		2	9	0	1	5	6
		3	10	0	0	1	3
	1	1	10	0	0	0	0	7.0±6.1
		2	10	0	0	0	1
		3	9	0	0	1	14
대조구	0	1	10	0	0	0	0	0.0±0.0
		2	11	0	0	0	0
		3	10	0	0	0	0

Claims (8)

1. 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 해충의 방제용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 해충은 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방 중에서 선택된 하나 이상의 성충 또는 유충인 것을 특징으로 하는 해충의 방제용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 토릴린은 사상자 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 해충의 방제용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 사상자 추출물의 용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 해충 방제용 조성물.
5. 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 농업용 또는 원예용 살충제.
   [화학식 1]
   

   
6. 하기 화학식 1의 토릴린 또는 이의 염을 해충으로부터 보호하기 위한 농작물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 해충의 방제방법.
   [화학식 1]
   

   
7. 제6항에 있어서, 상기 해충은 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 및 멸강나방 중에서 선택된 하나 이상의 성충 또는 유충인 것을 특징으로 하는 해충의 방제방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 해충으로부터 보호하기 위한 농작물은 배추, 옥수수 또는 벼인 것을 특징으로 하는 해충의 방제방법.

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