KR20180011762A - 입자 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플 내에 포함된 입자를 식별하기 위한 방법으로서, 샘플을 향해서 전파되는 입사 광 파동을 생성하는 광원을 이용하여 샘플을 조명하는 단계, 이어서 매트릭스-어레이 광검출기를 이용하여, 입사 광 파동과 각각의 입자에 의해서 생성된 회절 파동 사이의 간섭의 결과인 광 파동에 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 방식으로 광원과 광검출기 사이에 배치되는 샘플의 화상을 획득하는 단계를 포함한다. 그러한 방법은, 검출기로부터의 복수의 거리에서, 검출기에 도달하는 광 파동의 특성적인 양을 추정하기 위해서, 광검출기에 의해서 획득된 화상에 수치적 재구축 알고리즘을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 거리에 따른 특성적인 양의 변동은 입자가 식별될 수 있게 한다.

Description

입자 분석 방법
본 발명은 액체, 특히 체액, 예를 들어 혈액 내에 존재하는 입자를 계수하고 식별하는 분야에 관한 것이다.
체액, 특히 혈액은, 유형 및 수를 아는 것이 유용한, 입자, 예를 들어 세포를 포함할 수 있다.
예를 들어, 혈액의 경우에, 완전한 혈액 계수 또는 완전한 혈액 검사는 의료 실험실에서 일반적으로 실시되는 테스트이다. 이러한 유형의 테스트는 혈액의 주요 성분(특히, 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판) 및 그 수를 식별할 수 있게 한다. 이러한 검사는 일반적으로 고성능의 자동화된 장치를 이용하여 실시되나, 유사한 성능 수준을 얻을 수 있으면서도 덜 고가인 더 단순한 방법이 연구되고 있다.
연구 추구 방향 중 하나는 무렌즈 화상화(lensless imaging)와 같은 단순한 광학적 방법을 이용하는 것이다. 무렌즈 화상화에 의한 생물학적 입자의 관찰은 2000년말 이후로 상당히 많이 발전되었다. 이러한 기술은 샘플을 광원과 매트릭스-어레이 광검출기 또는 화상 센서 사이에 배치하는 것으로 이루어진다. 광 검출기에 의해서 캡쳐된 화상은 광원에 의해서 생성된 입사 파동과 샘플을 구성하는 입자에 의해서 회절된 파동 사이의 간섭에 의해서 형성된다. 이러한 화상은 "홀로그램"으로 주로 지칭된다. 그에 따라, 각각의 입자에 대해서, 특이적인 회절 패턴을 센서 상에서 기록할 수 있다. 생물학적 샘플에 적용된 이러한 기술이 문헌 WO2008090330에서 설명되어 있다. 이어서, 생성된 회절 패턴과 이전에 확립되었고 기지의(known) 입자에 상응하는 회절 패턴을 비교함으로써, 각각의 입자의 단순한 분석을 실시할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 입자 농도가 증가됨에 따라 한계에 도달할 수 있다.
구체적으로, 화상 센서에 의해서 검출된 회절 패턴만을 기초로 입자를 계수 및 식별하는 것은 샘플 내의 입자 농도가 증가함에 따라 특정 한계에 도달한다. 특히, 샘플이 혈액일 때, 그리고 입자가 ㎕ 당 100000개의 입자를 초과하는 적혈구일 때, Seo Sungjyu에 의한 간행물인, "High-throughput lensfree blood analysis on a chip", Anal Chem, 2010, June 1에서 보고된 바와 같이, 계수는 더 이상 신뢰할 수 없다. 샘플 내에 존재하는 각각의 입자의 복합 화상으로 지칭되는 것을 구축하기 위해서, 수학적 기술 즉, 디지털 홀로그래픽 재구축 기술로 지칭되는 것을 적용할 수 있다. 이러한 유형의 기술은 광 파동을 입자가 위치되는 대상 평면으로 역-전파시키는 것(back-propagating)으로 이루어지고, 그러한 대상 평면은 화상화 장치로부터 알고 있는 거리에 위치된다. 전술한 간행물에는, 그러한 홀로그래픽 재구축이 샘플 내에서 고농도로 존재하는 적혈구를 계수할 수 있게 한다는 것이 기재되어 있다. 이러한 간행물은, 재구축된 복합 화상 내에서, 미리 마킹한 백혈구가 적혈구의 사인(signature)과 상이한 사인을 갖는다는 것을 보고한다.
문헌 US2014/0327944는 또한 화상 센서에 의해서 획득된 홀로그램을 시뮬레이트된 홀로그램 라이브러리에 비교하는 것에 의해서, 홀로그램을 기초로, 입자, 예를 들어 혈액 입자를 분류하기 위한 방법을 설명한다. 그러나, 이러한 방법은 동일한 한계를 가지며, 다시 말해서 입자 밀도가 높을 때 실시하기 어려워진다.
세포(이러한 경우에 정자)의 복합 화상이 재구축될 수 있게 하는 방법이 문헌 US2012/0148141 및 WO2014/012031에서도 설명된다. 그러나 이러한 방법은 재구축된 복합 화상으로부터 그러한 세포의 성질 및 그 경로가 추정될 수 있게 한다. 그러한 입자의 복합 화상 및 그러한 입자의 경로의 추적을 기초로 입자의 분류를 설명하는 문헌 US2009/0290156에서도 마찬가지다. 샘플의 복합 화상은 입자를 식별하는데 있어서 불충분할 수 있다.
입자의 농도가 높은 샘플에 적용될 수 있는, 입자 및 특히 혈액 세포를 식별하기 위한 방법이 요구된다. 그러한 방법은 큰 관찰 필드를 더 가져야 하고 실시가 단순하여야 하는 한편, 특히 입자를 미리 마킹할 필요가 없어야 한다. 또한, 방법은 체액 내에서 입자가 발견될 수 있게 하여야 하고, 특히 적혈구, 백혈구 및 혈소판이 신뢰 가능하게 구분될 수 있게 하여야 한다.
또한, 입자와 광검출기 사이의 거리를 정밀하게 알아야 할 필요가 없는 방법이 요구된다.
본 발명은, 샘플, 예를 들어 혈액과 같은 생물학적 액체의 샘플 내에 존재하는 입자를 식별하기 위한 방법을 제공하는 것에 의해서, 이러한 문제에 대응하기 위한 것으로서, 그러한 방법은 이하의 단계를 포함하고:
- 전파 축을 따라서 샘플을 향해서 전파되는 입사 광 파동을 생성하는 광원을 이용하여 샘플을 조명하는 단계;
- 매트릭스-어레이 광검출기를 이용하여 샘플의 화상을 획득하는 단계로서, 샘플은 매트릭스-어레이 광검출기가 광 파동에 노출되는 방식으로 광원과 광검출기 사이에 배치되고, 광 파동은 입사 광 파동과 각각의 입자에 의해서 생성된 회절 파동 사이의 간섭을 포함하는, 획득 단계;
그러한 방법은 이하의 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 한다:
- 매트릭스-어레이 광검출기가 내부에 놓이는 평면에 평행한 평면 내에서 입자의 위치를 결정하는 단계;
- 매트릭스-어레이 광검출기로부터의 복수의 재구축 거리에서, 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동의 적어도 하나의 특성적인 양을 추정하기 위해서, 획득된 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 단계;
- 전파 축에 평행하고 전술한 위치를 통과하는 축을 따라, 재구축 거리에 따른 특성적인 양의 변동을 나타내는 프로파일을 결정하는 단계; 및
- 그러한 프로파일에 따라서 입자를 식별하는 단계.
디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 것은, 일반적으로 합성곱(convolution product)의 형태로, 전파 연산자(propagation operator)를 화상에 적용하는 것을 의미한다.
특성적인 양은, 각각의 재구축 거리에서, 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동의 복합식을 추정함으로써 얻어질 수 있다.
특성적인 양은 그러한 복합식의 계수로부터 결정될 수 있고, 그러한 경우에 이는 검출기가 노출되는 광 파동의 진폭을 나타낸다.
특성적인 양은 그러한 복합식의 항(argument)으로부터 결정될 수 있고, 그러한 경우에 이는 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동의 위상을 나타낸다.
일 실시예에 따라서, 방법은:
- 매트릭스-어레이 광검출기에 의해서 획득된 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 것에 의해서 기준 복합 화상으로 지칭되는 복합 화상을 결정하는 단계;
- 그러한 기준 복합 화상으로부터, 매트릭스-어레이 광검출기로부터의 복수의 재구축 거리에서, 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동의 적어도 하나의 특성적인 양을 추정하는 단계를 포함한다.
이어서, 방법은:
- 재구축 평면으로부터 또는 매트릭스-어레이 광검출기가 놓이는 평면으로부터 복수의 거리에 대해서 이차적인 복합 화상으로 지칭되는 것을 계산하기 위해서, 전파 연산자를 기준 복합 화상에 적용하는 단계;
- 각각의 이차적인 복합 화상으로부터, 전술한 각각의 거리에서의 특성적인 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
기준 복합 화상은, 샘플의 평면으로부터 이격된 재구축 평면 내에 형성된 복합 화상일 수 있다. 이는 또한 검출 평면 내에 형성된 복합 화상이 문제일 수 있다.
식별은 특성적인 양의 변동을 학습 위상(learning phase)에서 결정된 기준 프로파일에 비교하는 것에 의해서 달성될 수 있다.
매트릭스-어레이 광검출기의 평면에 평행한 평면 내의, 각각의 입자의 위치는 광검출기에 의해서 획득된 화상을 이용하여 또는 광검출기가 노출되는 광 파동의 복합식을 이용하여 결정될 수 있다.
광원은 바람직하게 공간적으로 가간섭적인(coherent) 공급원이고, 예를 들어 광-방출 다이오드이며, 그러한 경우에, 공간적 필터가 바람직하게 광원과 샘플 사이에 배치된다. 광원은, 예를 들어 레이저 다이오드가 됨으로써, 일시적으로 가간섭적일 수 있다.
매트릭스-어레이 광검출기는, 광검출기가 노출되는 파동을 수집할 수 있는 화소의 매트릭스 어레이를 포함한다. 화소와 샘플 사이의 거리가 50 ㎛ 내지 2 cm, 및 바람직하게 100 ㎛ 내지 5 mm에서 변화될 수 있다. 바람직하게, 샘플은 광검출기의 화소와 직접적으로 접촉되게 배치되지 않는다.
바람직하게, 샘플과 매트릭스-어레이 광검출기 사이에는 확대 광학기기가 배치되지 않는다.
샘플은 특히 혈액 세포를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 입자는 백혈구, 적혈구 또는 혈소판의 세포계들 사이에서 식별될 수 있다.
본 발명의 다른 대상은 샘플 내에 포함된 입자를 식별하기 위한 장치로서, 그러한 장치는:
- 샘플의 방향으로, 전파 축을 따라, 입사 광 파동을 생성하도록 배열된 광원; 및
- 광원과 매트릭스-어레이 광검출기 사이에서 샘플을 유지하는 홀더를 포함하고;
- 샘플의 화상을 획득하도록 배열된 매트릭스-어레이 광검출기는 입사 광 파동과 입자에 의해서 형성된 회절 파동 사이의 간섭으로부터 초래되는 광 파동에 노출될 수 있는, 장치에 있어서;
마이크로프로세서 또는 전자 컴퓨터와 같은, 프로세서를 포함하며, 프로세서는:
- 매트릭스-어레이 광검출기의 평면에 평행한 평면 내에서 입자의 위치를 결정하는 동작;
- 매트릭스-어레이 광검출기로부터의 복수의 재구축 거리에서, 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동의 적어도 하나의 특성적인 양을 추정하기 위해서, 획득된 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 동작;
- 전파 축에 평행하고 전술한 위치를 통과하는 축을 따라, 재구축 거리에 따른 특성적인 양의 변동을 나타내는 프로파일을 결정하는 동작; 및
- 그러한 프로파일에 따라서 입자를 식별하는 동작을 실시하도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 장치는 매트릭스-어레이 광검출기와 분석되는 샘플 사이에 확대 광학기기를 포함하지 않는다.
프로세서는, 전술한 단계가 실시될 수 있게 하는 일련의 명령어를 포함하는, 프로그래밍 가능 메모리를 포함할 수 있거나 그에 연결될 수 있다.
특히:
- 각각의 재구축 거리에서, 검출기가 노출되는 광학적 복사선의 복합식을 결정할 수 있고; 그리고
- 복합 진폭의 항 또는 계수를 결정하는 것에 의해서, 각각의 재구축 거리에서, 특성적인 양을 추정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 장치를 도시한다.
도 2a는 매트릭스-어레이 광검출기에 의해서 획득된 화상을 도시한다.
도 2b는, 다양한 유형의 입자에 대한, 제1 예에 따른, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 3a는, 이러한 제1 예에 따른, 다양한 백혈구에 대한, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 3b는, 이러한 제1 예에 따른, 다양한 적혈구에 대한, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 4a는 이러한 제1 예에 따른, 혈소판 응집체 상에 센터링된, 광검출기에 의해서 획득된 화상의 관심 영역을 도시한다.
도 4b는 도 4a에 도시된 응집체의 일부를 형성하는 다양한 혈소판에 대한, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 5a는, 제2 예에 따른, 다양한 유형의 입자에 대한, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 5b는, 제2 예에 따른, 다양한 유형의 입자에 대한, 광검출기에 대한 거리(z)에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의 위상의 프로파일을 도시한다.
도 6a는, 제3 예에 따른, 다양한 유형의 입자에 대한, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의, 상보적인 진폭으로 지칭되는, 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 6b는, 제3 예에 따른, 다양한 유형의 입자에 대한, 광검출기에 대한 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의 위상의 프로파일을 도시한다.
도 7a, 도 7b 및 도 7c는 각각 제1, 제2, 및 제3 예에 따른, 거리에 따른, 광검출기가 노출되는 광 파동의 복합 특성적인 양의 프로파일을 도시한다.
도 8의 (A), (B), (C), 및 (D)는 각각:
- 샘플의, 기준 복합 화상으로 지칭되는, 복합 화상을 재구축 평면 내에서 계산할 수 있게 하는 방법;
- 매트릭스-어레이 광검출기에 의해서 획득된 홀로그램;
- 도 8의 (A)에 도시된 방법의 복수의 반복 이후에 재구축된, 기준 복합 화상으로 지칭되는, 화상의 도면; 및
- 기준 복합 화상으로부터 형성된 이차적인 복합 화상을 기초로 획득된 프로파일을 도시한다.
도 9a는 화상 센서에 의해서 획득된 홀로그램으로서, 샘플은 수성 용액 내에 분산된 적혈구를 포함한다. 도 9b 및 도 9c는 기준 화상으로 지칭되는 복합 화상의 계수 및 위상을 각각 도시하며, 이러한 복합 화상은 재구축 평면 내에 형성된다. 도 9d 및 도 9e는 적혈구를 통과하는 전파 축을 따른, 화상 센서가 노출되는 광 파동의 계수 및 위상의 변동을 각각 보여주는 프로파일이다.
도 1은 본 발명의 하나의 대상인 장치의 예를 도시한다. 광원(11)은 전파 축(Z)을 따라, 샘플(14)의 방향으로, 입사 광 파동으로 지칭되는, 광 파동(12)을 생성할 수 있다. 샘플(14)은 미리 설정된 유형의 입자들을 서로 간에 식별하는 것이 요구되는 입자(1, 2, 3, 4, 5, .., 9)를 포함하는 매체(10), 예를 들어 생물학적 액체를 포함한다.
입자가 세포일 수 있다. 특히, 매체(10)가 혈액, 또는 혈액을 포함하는 용액일 때, 입자는 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판일 수 있다.
입자는 또한 유기 또는 무기 마이크로비드(microbead), 예를 들어 금속 마이크로비드 또는 중합체나 유리의 마이크로비드일 수 있으며, 이러한 유형의 마이크로비드는 생물학적 프로토콜을 수행할 때 일반적으로 사용된다. 입자가 또한 매체(10) 내에 담겨진 액적, 예를 들어 지질 액적(lipid droplet)일 수 있다. 이는 또한 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 효모, 또는 엑소좀(exosome)의 문제일 수 있다. 일반적으로, 입자는 유리하게 1 mm 보다 작은, 심지어 500 ㎛보다 작은 크기, 그리고 바람직하게 0.5 ㎛ 내지 500 ㎛의 크기를 갖는다. 그에 따라, 입자라는 용어는 검사되는 샘플 내에 초기에 존재하는 내인성 입자 및 분석 전에 이러한 샘플에 첨가되는 외인성 입자 모두를 지칭한다.
매체(10)는 가장 빈번하게 액체 매체, 특히 체액이지만, 이는 또한 한천, 또는 공기, 또는 액체의 건조 잔류물의 문제일 수 있다.
본 발명의 하나의 대상인 방법은 관찰되는 각각의 입자가 식별될 수 있게 한다. 식별은, 입자의 미리 설정된 분류로 입자를 분류하는 것을 의미한다. 이는 미리 설정된 성질들 사이에서 입자의 성질을 결정하는, 또는 미리 설정된 성질들 사이에서 입자의 크기를 결정하는 문제일 수 있다.
광원과 샘플 사이의 거리(Δ)는 바람직하게 1 cm 초과이다. 이는 바람직하게 2 내지 30 cm이다. 바람직하게, 샘플에서 바라볼 때, 광원은 점과 같은 것으로 간주될 수 있다. 이는, 그 직경(또는 그 대각선)이 샘플과 광원 사이의 거리의 바람직하게 1/10 미만이고 더 바람직하게 1/100이라는 것을 의미한다. 그에 따라, 광은 평면 파동, 또는 그러한 것으로 간주될 수 있는 파동의 형태로 샘플에 도달한다.
광원(11)은 점 광원일 수 있거나, 점과 같이 보이도록 격막 또는 공간적 필터(도 1에 미도시)와 연관될 수 있다. 격막의 개구경(aperture)은 전형적으로 5 ㎛ 내지 1 mm이고 바람직하게 50 ㎛ 내지 500 ㎛이다.
격막은 광섬유에 의해서 대체될 수 있고, 그러한 광섬유의 제1 단부는 광원에 대면되어 배치되고, 그 제2 단부는 샘플에 대면되어 배치된다. 이러한 경우에, 제2 단부가 점 광원(11)에 비유될 수 있을 것이다.
샘플(14)은, 기부(15) 및 커버(13)를 포함하는 챔버에 의해서 경계 지어진다. 챔버의 측벽은 도시되어 있지 않다. 고려되는 예에서, 챔버는 Neubauer C-칩 유체 챔버이다. 기부(15)와 커버(13) 사이의 거리는 100 ㎛이다. 일반적으로, 전파 축(Z)을 따른 챔버의 두께는 몇 cm 미만, 예를 들어 1 cm 미만, 또는 심지어 1 mm 미만이고, 예를 들어, 50 ㎛ 내지 500 ㎛이다.
광원(11)은 일시적으로 가간섭적일 수 있으나, 이는 필수적인 것이 아니다.
이러한 제1 예에서, 광원은 450 nm의 파장을 방출하는 레이저 다이오드이다. 이는 샘플로부터 15 cm의 거리에 위치된다.
샘플(14)은 광원(11)과 매트릭스-어레이 광검출기 또는 화상 센서(16) 사이에 배치된다. 매트릭스-어레이 광검출기 또는 화상 센서는 바람직하게 샘플을 경계 짓는 챔버의 기부(15)에 평행하게, 또는 실질적으로 평행하게 연장된다.
실질적으로 평행하게라는 표현은, 2개의 요소가 엄격하게 평행이 아닐 수도 있고, 10°미만의, 몇 도의 각도 공차가 용인될 수 있다는 것을 의미한다.
바람직하게, 광원은 작은 스펙트럼 폭, 예를 들어 100 nm 또는 심지어 20 nm 그리고 더 바람직하게 5 nm 미만의 스펙트럼 폭이다. 스펙트럼 폭이라는 표현은 광원의 방출 피크의 최대치의 절반에서의 전체 폭을 나타낸다.
광검출기(16)는 CCD 또는 CMOS 화소의 매트릭스-어레이를 포함하는 매트릭스-어레이 광검출기일 수 있다. CMOS 광검출기가 바람직한데, 이는 픽셀의 크기가 더 작기 때문이고, 이는 공간적 해상도가 더 양호한 화상이 획득될 수 있게 하기 때문이다. 이러한 예에서, 검출기는 참조 MT9P031의 12-비트 APTINA 센서이다. 이는 픽셀간 피치가 2.2 ㎛인 RGB CMOS 센서의 문제이다. 광검출기의 유용 면적은 5.7 x 4.3 mm2이다.
광검출기는, 바람직하게 입사 광 파동(12)의 전파 축(Z)에 수직인 검출 평면(P) 내에 놓인다.
바람직하게, 광검출기는 화소의 매트릭스-어레이를 포함하고, 그러한 어레이 위에는 투명 보호 창이 배치된다. 화소의 매트릭스-어레이와 보호 창 사이의 거리는 일반적으로 수십 ㎛ 내지 150 또는 200 ㎛이다. 화상의 공간적 해상도를 개선하기 위해서, 화소간 피치가 3 ㎛ 미만인 광검출기가 바람직하다.
입자(1, 2,...9)와 광검출기(16)의 화소의 매트릭스-어레이 사이의 거리(d)는 이러한 예에서 1.5 mm이다. 그러나, 이는 사용되는 유체 챔버의 두께에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 그리고 실시예가 무엇이든지 간에, 입자와 광검출기의 화소 사이의 거리(d)는 바람직하게 50 ㎛ 내지 2 cm 및 바람직하게 100 ㎛ 내지 2 mm이다.
매트릭스-어레이 광검출기(16)와 샘플(14) 사이의 확대 광학기기의 부재를 주목할 수 있을 것이다. 이는, 선택적으로 광검출기(16)의 각각의 화소와 같은 높이로 존재하는 포커싱 마이크로-렌즈를 배제하는 것은 아니다.
이러한 제1 예에서, 샘플은, Alsever 용액 내의 6% Dextran(Sigma Aldrich 참조 D4876)의 존재 하에서의 적혈구의 침강 이후의, 이어서 혈소판-부화 및 백혈구-부화 혈장의 수집 이후의, 통상적인 프로토콜에 따라 획득된 백혈구-부화 혈장(white-blood-cell-rich plasma)이다. 이어서, 획득된 혈장이 생리적인 pH의 인산-완충 생리식염수(PBS) 완충액 내에서 희석된다. 적혈구의 제거는 완전하지 않고, 얻어진 부화 혈장은 잔류 적혈구를 포함한다.
입자는 많은 유형의 입자들 그리고 특히 적혈구, 백혈구 또는 혈소판 사이에서 분류될 수 있다. 바람직하게, 입자는 사전 마킹을 거치지 않는다.
도 2a는 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상을 도시한다. 이러한 화상은 전체 회절 패턴을 보여주고, 여기에서, 각각의 입자와 각각 연관되는 기본적인 회절 패턴이 확인될 수 있다. 각각의 기본적인 회절 패턴은 중앙 디스크-형상의 구역을 포함하고, 그러한 구역 주위에는 교번적인 어둡고 밝은 동심적 링들이 연장된다. 그러한 기본적인 패턴은 식별하고자 하는 입자가 선택될 수 있게 하고, 검출 평면(P) 내의 입자의 반경방향 좌표(radial coordinates)(x, y)로 지칭되는 것이 결정될 수 있게 한다. 이러한 좌표는 예를 들어 그러한 입자에 상응하는 기본적인 회절 패턴의 중심에 위치된다.
각각의 기본적인 회절 패턴은 샘플 상류의 공급원(11)에 의해서 생성된 입사 광 파동(12)과 입자에 의한 입사 파동의 회절로부터 초래되는 파동 사이의 간섭에 의해서 형성된다. 그에 따라, 광검출기(16)는:
- 샘플(14) 상류의, 공급원(11)에 의해서 방출된 광 파동(12); 및
- 샘플(14) 내에 존재하는 입자의 또는 다른 회절 요소의 각각에 의해서 회절된 광 파동의 중첩에 의해서 형성된 광 파동(22)에 노출된다.
프로세서(20), 예를 들어 마이크로프로세서는 매트릭스-어레이 광검출기(16)의 화상을 수신하고, 전파 축(Z)을 따라서, 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 광 파동(22)의 특성적인 양의 재구축을 실시한다. 마이크로프로세서(20)는 이러한 적용예에서 설명되는 계산 단계를 실시하기 위한 명령어를 저장할 수 있는 메모리(23)에 연결된다. 이는 화면(25)에 연계될 수 있다. 재구축은 특히 매트릭스-어레이 광검출기와 관찰된 샘플 사이에서 생성된다.
프로세서(20)는, 식별 방법의 단계를 실시하기 위해서, 메모리 내에 저장된 일련의 명령어를 실행할 수 있다. 프로세서는, 이러한 상세한 설명에서 설명된 하나 이상의 단계를 실행하기 위해서, 매트릭스-어레이 광검출기에 의해서 전달된 화상을 프로세스할 수 있는 마이크로프로세서, 또는 임의의 다른 전자적 컴퓨터일 수 있다.
도 2a에 도시된 화상인, 매트릭스-어레이 광검출기에 의해서 획득된 화상(I)은 광 파동(22)의 세기(I(x, y))의 공간적 분포를 나타내고, x 및 y는 광검출기의 평면(P) 내의 좌표이다.
Ryle 등에 의한 간행물인, "Digital in-line holography of biological specimens", Proc. of SPIE Vol. 6311 (2006)에서 설명된, 주지의 디지털 홀로그래픽 재구축 원리에 따라, 광검출기에 의해서 측정된 세기(I(x, y))와 전파 연산자(h(x, y, z))의 합성곱을 결정하는 것에 의해서, 공간적 좌표(x, y, z)의 임의 지점에서의 그리고 특히 광검출기로부터 거리(|z|)에 위치되는 평면 내의 광 파동(22)에 대한 복합식(U(x, y, z))을 재구축할 수 있다.
전파 연산자(h(x, y, z))의 함수는 광검출기(16)와 좌표(x, y, z)의 지점 사이의 광의 전파를 설명하기 위한 것이다. 이어서, 재구축 거리로서 지칭되는 이러한 거리(|z|)에서의 이러한 광 파동의 진폭(u(x, y, z)) 및 위상(φ(x, y, z))을 결정할 수 있으며, 여기에서는 다음과 같다.
-
Figure pct00001
;
-
Figure pct00002
.
연산자(abs 및 arg)는 각각 계수 및 항을 생성한다.
전파 연산자의 적용은 특히, 광검출기 상류의, 광검출기로부터의 거리(|z|)에서 복합식이 추정될 수 있게 한다. 그에 따라, 광 파동(22)이 검출기에 도달하기 전의 광 파동(22)의 복합 값이 재구축된다. 그에 따라 역-전파라고 한다. 만약 좌표(z=0)가 검출 평면(P)에 기인한다면, 이러한 역-전파는 전파 연산자(h(x, y,-|z|))를 적용하는 것에 의해서 구현된다. 상류 및 하류라는 용어는 입사 파동(12)의 전파 방향에 대한 것으로 이해될 수 있을 것이다.
만약 I(x, y) = I(x, y, z = 0)이 광검출기에 의해서 측정된 신호의 세기에 상응한다면, 검출 평면(P)을 따른, 광 파동의 측정된 세기(I(x, y))와 복합식(U(x, y)) 사이의 관계는 이하에 의해서 주어진다:
Figure pct00003
좌표(x, y, z)에서의 광 파동(22)의 복합식은 이하와 같이 주어지고:
Figure pct00004
, * 기호는 합성 연산자(convolution operator)를 나타내며:
여기에서:
- 검출 평면(P)에 의해서 표시되고 샘플(14)을 포함하는 절반-공간 내에서 z < 0이고; 그리고
- 검출 평면(P)에 의해서 표시되고 샘플(14)을 포함하지 않는 절반-공간 내에서 z > 0이다.
검출 평면(P)에 의해서 표시되고 샘플(14)을 포함하는 절반-공간에서, 광 파동의 복합식은 또한 다음과 같이 작성될 수 있다:
Figure pct00005
.
바람직하게, 홀로그래픽 재구축 이전에, 수학적 예비 프로세싱이 측정된 세기(I(x, y))에 대해서 미리 적용된다. 이는, 특히 전파 연산자가 적용될 때 생성되는 허상(artefact)의 수를 감소시킴으로써, 결과의 품질이 개선될 수 있게 한다.
따라서, 정규화된 세기로 지칭되는 세기(
Figure pct00006
)가 결정되고, 그에 따라
Figure pct00007
가 되고
여기에서:
- (I(x, y)) = 좌표(x, y)에서 광검출기에 의해서 측정된 세기이고;
- Average(I) = 좌표(x, y)를 포함하는, 화상(I)의 관심 영역에서 측정된 세기의 평균이다. 이러한 관심 영역은 광검출기에 의해서 형성된 전체 화상에 상응할 수 있다.
이러한 예비-프로세싱은 입사 광 파동(12)의 세기에 의한 측정된 세기의 정규화와 같고, 입사 광 파동(12)의 세기는 연산자(Average(I))에 의해서 추정된다.
다음에, 파동(22)의 복합식은 전술한 바와 같이 식(
Figure pct00008
)을 이용하여 정규화된 세기(
Figure pct00009
)로부터 결정된다.
디지털 재구축은 특히 프레넬(Fresnel) 회절 모델을 기초로 할 수 있다. 이러한 예에서, 전파 연산자는 프레닐-헬름홀츠 함수이고, 그에 따라:
Figure pct00010
이고,
여기에서 λ는 파장이다.
그에 따라,
Figure pct00011
이고,
여기에서:
- x' 및 y'는 광검출기의 평면 내의 좌표이고;
- x 및 y는 재구축 평면 내의 좌표이고, 그러한 재구축 평면은 광검출기로부터 거리(|z|)에 위치되며;
- z는 입사 광 파동(12)의 전파 축(Z)을 따른 재구축된 화상의 좌표이다.
복합식(U(x, y, z))의 값으로부터, 공급원(11)에 의해서 방출된 입사 광 파동(12)의 입자(1, 2..9)에 의한 회절로부터 초래된 광 파동(22)의 특성적인 양을 추출할 수 있다. 전술한 바와 같이, 진폭(u(x, y, z)) 또는 위상(φ(x, y, z))을 평가할 수 있지만, 진폭이나 위상의 임의 함수를 또한 평가할 수 있다.
예를 들어, 상보적인 진폭(
Figure pct00012
)으로 지칭되는 특성적인 양을 평가할 수 있고, 그에 따라:
Figure pct00013
가 된다.
각각의 재구축된 복합식(U(x, y, z))으로부터:
- 검출기의 평면으로부터 거리(|z|)에서, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의, 파동(22)의 진폭의 화상(uz)을 형성할 수 있고, 여기에서 uz(x,y) = abs[U(x, y, z)]이며;
- 검출기의 평면으로부터 거리(|z|)에서, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의, 파동(22)의 위상의 화상(φz)을 형성할 수 있고, 여기에서 Uz(x,y) = arg[U(x, y, z)]이며;
- 검출기의 평면으로부터 거리(|z|)에서, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의, 파동(22)의, 전술한 바와 같은 상보적인 진폭의 화상(
Figure pct00014
)을 형성할 수 있고, 여기에서
Figure pct00015
이다.
이러한 제1 예에서,
- 상보적인 진폭의 화상(
Figure pct00016
)은 전파 축(Z)을 따라서 복수의 좌표(z1..zM)에서 재구축되고，여기에서 Ｍ은 21과 같고;
-
Figure pct00017
인 각각의 화상(
Figure pct00018
)으로부터，값(
Figure pct00019
(xn, yn, zm))이 추출되고， (xn, yn)는 광검출기(16)의 평면에 평행한 평면 내의 입자(n)의 좌표를 나타내고;
- zm < z < zm -+1인,
Figure pct00020
(xn, yn, z)의 여러 값은 이전에 결정된 ２개의 양(
Figure pct00021
(xn , yn, zm )) 및
Figure pct00022
(xn, yn, zm +1)) 사이의 내삽에 의해서 획득된다.
각각의 검사된 입자(n)의, 광검출기(16)의 평면에 평행한 평면 내의, 좌표(xn, yn)는 획득된 화상(I(x, y))을 이용하여 또는 주어진 재구축 높이(z)에서의 화상(
Figure pct00023
z)으로부터 결정된다.
도 2b는, 이하와 같은 ９개의 상이한 입자들에 대한 재구축 거리(|z|)에 따른, 여러 가지 유형의 입자에 대해서, 전술한 바와 같은, 상보적인 진폭(
Figure pct00024
(xn, yn, z))의 변동을 도시한다:
- 입자 1 내지 4: 두문자어 WBC로 표시된 백혈구;
- 입자 5 및 6: 두문자어 RBC로 표시된 적혈구; 및
- 입자 7 내지 9: 문자 PLT로 표시된 혈소판.
재구축 거리(|z|)는 zmin= 1000 내지 zmax= 1500 ㎛로 변경된다.
이러한 동작과 병행하여, 각각의 입자(1, ..., 9)가 현미경으로 관찰되었고, 현미경하의 관찰은 기준 측정으로서의 역할을 하고, 그에 따라 반론의 여지가 없는 식별이 획득될 수 있게 한다.
이러한 예에서 연구되는 샘플에서, 이하를 확인할 수 있다:
- 백혈구(WBC)인 입자 1 내지 입자 4의 경우에, 재구축 거리에 따른 상보적인 진폭의 변동을 나타내는 곡선(
Figure pct00025
(z))은, 후속하여 기준선(BL)를 향해서 증가되는, 진폭 문턱값(
Figure pct00026
threshold) 보다 낮은 최소치를 가지며, 이러한 증가는 현저한 진동을 가지고;
- 적혈구(RBC)에 상응하는 입자 5 및 입자 6의 경우에, 곡선(
Figure pct00027
(z))은, 후속하여 기준선(BL)까지 단조롭게 증가되는, 기준선(BL)과 진폭 문턱값(
Figure pct00028
threshold) 사이에 포함되는 최소치를 가지며; 그리고
- 혈소판(PLT)에 상응하는 입자 7 내지 입자 9의 경우에, 곡선(
Figure pct00029
(z))은 기준선(BL)을 따르고 2개의 값들(BL ± ε) 사이에서 한정되어 유지된다.
그에 따라, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의 위치가 (xn, yn)인, 각각의 검출된 입자(n)에 대해서, 복수의 재구축 높이(z)에서의 상보적인 진폭의 변동을 나타내는 프로파일(
Figure pct00030
(xn, yn, z))을 확립할 수 있고, 입자가 적혈구, 백혈구 또는 혈소판인지의 여부를 식별하기 위해서 이러한 프로파일을 이용할 수 있다.
이러한 프로파일은 특히, 기지의 입자로, 학습 위상에서 생성된 프로파일의 라이브러리에 비교될 수 있다. 다시 말해서, 전파 축(Z)(좌표의 축(z))을 따른, 상보적인 진폭의 변동을 나타내는 프로파일(
Figure pct00031
(z))은 관찰되는 입자의 유형의 사인을 형성한다.
종래 기술과 대조적으로, 입자의 복합 화상은 샘플로부터 미리 설정된 거리에서 홀로그래픽 재구축을 실시하는 것에 의해서 형성되지 않고, 그 대신에 입사 파동(12)으로 입자의 회절로부터 초래되는 파동(22)의 특성이, 광검출기(16)로부터의 복수의 거리에서, 입사 파동의 전파 방향을 따라서 재구축된다. 얻어진 정보는 더 풍부하고, 여러 가지 유형의 입자들 사이의 명확한 분류를 가능하게 한다.
도 3a 및 도 3b는, 검출기가 노출되는 파동(22)의 상보적인-진폭 프로파일(
Figure pct00032
(z))을 도시하고, 그러한 프로파일은 50개의 백혈구(WBC) 및 240개의 적혈구(RBC) 각각에 대해서 획득되었다. 프로파일을 기초로 입자를 확실하게 분류할 수 있게 할 정도로 프로파일의 재현성이 충분하다. 이러한 프로파일은 선행하는 예의 실험 조건과 유사한 실험 조건 하에서 얻어졌다.
도 3a에 도시된 측정을 획득하기 위해서 이용된 샘플은 도 2a 및 도 2b를 참조하여 설명한 샘플과 유사한 부화 플라즈마였다.
도 3b에 도시된 측정을 획득하기 위해서 이용된 샘플은 전술한 바와 같은 인산-완충 생리식염수(PBS) 완충액 내의 1/400의 희석 인자로 희석된 전혈을 포함하였다.
도 4b는 전술한 유형의 부화 플라즈마의 샘플 내의, 4개의 혈소판(101, 102, 103, 104)에 대한, 축(Z)을 따른, 획득된 상보적인-진폭 프로파일(
Figure pct00033
(z))을 도시한다. 현미경 하의 관찰로 혈소판(101, 102, 103, 104)이 응집되었다는 것을 확인하였다.
도 4a는 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상(I)의 관심 영역을 도시한다. 이는 응집체의 각각의 혈소판의 좌표(x101,y101), (x102,y102), (x103,y103), (x104,y104)를 식별할 수 있게 한다.
이러한 프로파일은 제1 예의 실험 조건과 유사한 실험 조건 하에서 얻어졌다. 프로파일(
Figure pct00034
(z))은, 혈소판이 응집되거나 그렇지 않거나 간에 유사하고, 간격(BL ± ε) 내에서, 기준선(BL) 주위로 한정되어 유지된다는 것을 확인할 수 있을 것이다. 그에 따라, 본 발명의 하나의 대상인 식별 방법으로, 혈소판이 응집된 경우에도, 혈소판이 정확하게 식별된다.
제2 예에서, 광원(11)은 최대의 절반에서의 전체 폭이 22 nm이고 λ = 485 nm의 파장에서 센터링된 485-DF-22 오메가 광학 필터(Omega Optical filter)에 결합된 백색 발광 다이오드이다. 광원과 검출기 사이의 거리(Δ)는 8 cm이다. 샘플은 전술한 바와 같은 부화 플라즈마이다.
이러한 예에서, 파동(22)의 복합식(U(x, y, z))은 검출기로부터의 복수의 거리(z)에서 재구축되었고, 이어서 여러 입자의 좌표(x, y)에서, 복사선의 상보적인 진폭 및 위상이 결정되었다. (z)에 따른 상보적인 진폭 및 위상의 프로파일(
Figure pct00035
(z) 및 φ(z))이 이어서 확립되었다.
선행하는 예에서와 같이, 관찰되는 입자의 성질이 현미경 하의 관찰에 의해서 확인되었다.
도 5a 및 도 5b는 여러 입자에 대한 거리(z)에 따른 상보적인 진폭(
Figure pct00036
(x, y, z)) 및 위상(φ(x, y, z))을 각각 도시한다. 도 5a는 이하를 도시한다:
- 백혈구(WBC)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리에 따른 상보적인 진폭의 변동을 나타내는 곡선(
Figure pct00037
(z))은, 후속하여 기준선(BL)를 향해서 증가되는, 진폭 문턱값(
Figure pct00038
threshold) 보다 낮은 현저한 최소치를 가지며, 이러한 증가는 현저한 진동을 가지며;
- 적혈구(RBC)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(
Figure pct00039
(z))은 기준선(BL)과 진폭 문턱값(
Figure pct00040
threshold) 사이에 포함되는 최소치를 가지며, 이어서 그러한 곡선은 기준선(BL)까지의 단조로운 증가를 설명하고; 그리고
- 혈소판(PLT)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(
Figure pct00041
(z))은 기준선(BL)을 따르고 2개의 값들(BL ± ε) 사이에서 한정되어 유지된다.
그에 따라, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의 위치가 (xn, yn)인, 각각의 검출된 입자(n)에 대해서, 복수의 재구축 높이(z)에서, 검출기가 노출되는 파동(22)의, 전술한 바와 같은, 상보적인 진폭(
Figure pct00042
)의 변동을 나타내는 프로파일(
Figure pct00043
(xn, yn, z))을 확립할 수 있고, 입자가 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 또는 혈소판(PLT) 인지의 여부를 분류하기 위해서 이러한 프로파일을 이용할 수 있다.
그에 따라, 레이저 공급원 이외의 광원으로 분류를 할 수 있다.
도 5b는 이하를 도시한다:
- 백혈구(WBC)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리(z)에 따른 위상(φ)의 변동을 나타내는 곡선(φ(z))은 제1 위상 문턱값(φthreshold 1) 보다 큰 최대치를 가지고, 이어서 제2 위상 문턱값(φthreshold 2) 보다 작은 최소치를 가지며, 기준선(BL)을 향한 증가가 이어지며;
- 적혈구(RBC)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(φ(z))은 제1 위상 문턱값(φthreshold 1) 보다 큰 최대치를 가지고, 이어서 제2 위상 문턱값(φthreshold 2) 보다 큰 최소치를 가지며, 이어서 곡선은 기준선(BL)을 향한 단조로운 증가를 설명하고; 그리고
- 혈소판(PLT)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리에 따른 위상(φ)의 변동을 나타내는 곡선(φ(z))은 2개의 값들(φthreshold 1 및 φthreshold 2) 사이에서 한정되어 유지된다. 측정된 값은 제1 및 제2 위상 문턱값들 사이에서 유지된다.
그에 따라, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의 위치가 (xn, yn)인, 각각의 검출된 입자(n)에 대해서, 복수의 재구축 높이(z)에서, 검출기가 노출되는 복사선의 위상의 변동을 나타내는 프로파일(φ(xn, yn, z))을 확립할 수 있고, 입자가 적혈구, 백혈구 또는 혈소판인지의 여부를 분류하기 위해서 이러한 프로파일을 이용할 수 있다.
제3 예에서, 광원(11)은 최대의 절반에서의 전체 폭이 20 nm이고 λ = 610 nm의 파장에서 센터링된 610-DF-20 오메가 광학 필터에 결합된 백색 발광 다이오드이고, 그러한 광원은 샘플로부터 8 cm인 거리(Δ)에 배치된다. 동작 모드 및 샘플은 선행하는 예의 동작 모드 및 샘플과 유사하다.
도 6a 및 도 6b는 여러 입자에 대한 거리(z)에 따른 상보적인 진폭(
Figure pct00044
(x, y, z)) 및 위상(φ(x, y, z))을 각각 도시한다. 도 6a는 이하를 도시한다:
- 백혈구(WBC)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리(z)에 따른 진폭(u)의 변동을 나타내는 곡선(
Figure pct00045
(z))은, 상보적인 진폭 문턱값(
Figure pct00046
threshold) 보다 낮은 현저한 최소치를 가지며, 기준선(BL)를 향한 증가가 후속되며, 이러한 증가는 현저한 진동을 포함하고;
- 적혈구(RBC)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(
Figure pct00047
(z))은 기준선(BL)과 진폭 문턱값(
Figure pct00048
threshold) 사이에 포함되는 최소치를 가지며, 이어서 그러한 곡선은 기준선(BL)까지의 단조로운 증가를 설명하고; 그리고
- 혈소판(PLT)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(
Figure pct00049
(z))은 기준선(BL)을 따르고 2개의 값들(BL ± ε) 사이에서 한정되어 유지된다.
그에 따라, 검출기의 평면에 평행한 평면 내의 위치가 (xn, yn)인, 각각의 검출된 입자(n)에 대해서, 복수의 재구축 높이(z)에서, 검출기가 노출되는 복사선의, 전술한 바와 같은, 상보적인 진폭의 변동을 나타내는 프로파일(
Figure pct00050
(xn, yn, z))을 확립할 수 있고, 입자가 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 또는 혈소판(PLT) 인지의 여부를 분류하기 위해서 이러한 프로파일을 이용할 수 있다.
도 6b는 이하를 도시한다:
- 백혈구(WBC)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리(z)에 따른 위상(φ)의 변동을 나타내는 곡선(φ(z))은 제1 위상 문턱값(φthreshold 1) 보다 큰 최대치를 가지고, 이어서 제2 위상 문턱값(φthreshold 2) 보다 낮은 최소치를 가지며, 기준선(BL)을 향한 증가가 이어지며;
- 적혈구(RBC)에 상응하는 입자의 경우에, 곡선(φ(z))은 제1 위상 문턱값(φthreshold 1) 보다 큰 최대치를 가지고, 이어서 제2 위상 문턱값(φthreshold 2) 보다 큰 최소치를 가지며, 이어서 곡선은 기준선(BL)을 향한 단조로운 증가를 설명하고; 그리고
- 혈소판(PLT)에 상응하는 입자의 경우에, 재구축 거리(z)에 따른 위상(φ)의 변동을 나타내는 곡선(φ(z))은 2개의 값들(φthreshold 1, φthreshold 2) 사이에서 한정되어 유지된다. 측정된 값은 제1 및 제2 위상 문턱값들 사이에서 유지된다.
2개의 선행하는 예는, 상보적인 진폭 프로파일(
Figure pct00051
(z)) 또는 위상 프로파일(φ(z))이 입자가 특성화될 수 있게 한다는 것을 보여준다.
또한, 복합 광학적 매개변수 기호(k)로 지칭되는 것을 이용하여, 비율 형태로, 상보적인 진폭 및 및 위상을 조합할 수 있고, 예를 들어
Figure pct00052
이다.
도 7a, 도 7b 및 도 7c는, 제1 예(405 nm 레이저 공급원), 제2 예(λ = 485 nm에 센터링된 필터와 조합된 백색 LED 광원) 및 제3 예(λ = 610 nm에 센터링된 필터와 조합된 백색 LED 광원)의 구성에서, 전파 축(Z)을 따른 복합 광학적 매개변수의 변동을 도시한다. 각각의 구성에서, 관찰된 샘플은 전술한 바와 같은 부화 플라즈마이다.
각각의 그래프에서, 분석된 입자는 3개의 백혈구(WBC) 및 1개의 적혈구(RBC)이다.
공급원이 어떠하든 간에, 프로파일(k(z))의 요동이 적혈구의 경우 보다 백혈구의 경우에 더 크다는 것을 확인할 수 있을 것이다.
특히, 프로파일(k(z))이 제1 복합 문턱값(kthreshold 1) 미만 및 제2 복합 문턱값(kthreshold 2) 초과에서 유지될 때 분석된 입자가 적혈구가 되도록, 제1 복합 문턱값(kthreshold 1) 및 제2 복합 문턱값(kthreshold 2)을 결정할 수 있다. 프로파일이 이러한 문턱값 중 하나와 교차될 때, 검사된 입자는 백혈구로서 식별된다.
디지털 전파 연산자(h)를 매트릭스-어레이 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상(I) 또는 홀로그램에 적용하는 것은 특정 한계를 가질 수 있는데, 이는 획득된 화상이 위상-관련된 정보를 포함하고 있지 않기 때문이다. 그에 따라, 프로파일이 확립되기 전에, 광검출기(16)가 노출되는 광 파동(22)의 위상과 관련된 정보를 획득하는 것이 바람직하다. 이러한 위상-관련 정보는, 매트릭스-어레이 광검출기(16)의 평면(P) 내의 또는 매트릭스-어레이 광검출기로부터 거리(|z|)에 위치되는 재구축 평면(Pz) 내의 광 파장(22)의 진폭 및 위상의 추정을 획득하기 위해서, 종래 기술에서 설명된 방법을 이용하여, 샘플(14)의 복합 화상(Uz)을 재구축하는 것에 의해서 얻어질 수 있다. 본 발명자들은 기준 복합 화상의 계산을 기초로 하는 방법을 개발하였고, 그러한 방법은 도 8의 (A)를 참조하여 설명된다. 이러한 방법은 이하의 단계를 포함한다:
- 매트릭스-어레이 광검출기(16)로 샘플(14)의 화상(I)을 획득하는 단계로서, 이러한 화상이 홀로그램을 형성하는 단계(단계(100)).
재구축 평면(Pz) 내의 또는 검출 평면(P) 내의 샘플(14)의 기준 화상(Uref)으로 지칭되는 복합 화상을 계산하는 단계로서， 이러한 기준 복합 화상은 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 노출되는 광 파동(22)의 위상 및 진폭에 관한 정보를 포함하고; 이러한 단계는 전술한 전파 연산자(h)를 획득된 화상(I)에 적용하는 것에 의해서 실행되는 단계(단계(110 내지 170)). 이러한 복합 화상은 기준 화상으로 지칭되는데, 이는 입자가 기초로 하여 특성화되는 프로파일의 형성이 그러한 것을 기초로 하기 때문이다.
- 기준 복합 화상(Uref) 또는 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상(I)을 이용하여, 검출 평면 내의 또는 검출 평면에 평행한 평면 내의 입자의 반경방향 위치(x, y)를 선택하는 단계(단계(180)).
- 전파 축(Z)을 따라, 이차적인 화상으로 지칭되는 복합 화상(Uref,z)을 계산하기 위해서 전파 연산자(h)를 기준 복합 화상(Uref)에 적용하는 단계(단계(185)).
- 각각의 이차적인 복합 화상(Uref,z')으로부터, 이전에 선택된 입자의 반경방향 위치(x,y)에서, 그리고 재구축 평면(Pz)으로부터의 (또는 검출 평면(P)으로부터의) 복수의 거리에서, 광 파동(22)의 특성적인 양을 추정하고, 이어서 전파 축(Z)을 따른 특성적인 양의 변동을 나타내는 프로파일을 형성하는 단계(단계(190)).
- 그러한 프로파일에 따라서 입자를 특성화하는 단계. 전술한 바와 같이, 이러한 특성화는, 표준 샘플을 이용하여, 얻어진 프로파일을 교정 위상에서 얻어진 표준 프로파일과 비교하는 것에 의해서 달성될 수 있다(단계(200)).
도 8의 (A)에 제시된 알고리즘이 이하에서 구체적으로 설명되고, 특정 단계에서 얻어진 결과는 도 8의 (B) 내지 도 8의 (D)에 도시되어 있다. 단계(110 내지 170)는, Uref로 표시된, 기준 복합 화상을 획득하는 바람직한 방식이고, 이러한 화상은 재구축 평면(Pz) 내의 파동(22)의 복합식의 공간적 분포를 나타낸다. 당업자는, 다른 알고리즘이 그러한 복합 화상을 구축할 수 있게 한다는 것을 이해할 것이고, 이는 또한, 예를 들어, 종래 기술을 참조하여 언급된 알고리즘을 이용하여 계획될 수 있을 것이다.
단계(100): 화상 획득
이러한 단계에서, 화상 센서(16)는 샘플(14)의, 그리고 더 정확하게, 화상 센서가 노출되는, 샘플에 의해서 전달되는 광 파동(22)의 화상(I)을 획득한다. 그러한 화상, 또는 홀로그램이 도 8의 (B)에 도시되어 있다.
이러한 화상은 생리식염수 완충액 내에 담겨진 적혈구를 포함하는 샘플(14)을 이용하여 생성되고, 샘플은, 전술한 장치에서와 같이, CMOS 센서로부터 1500 ㎛ 의 거리(d)에 배치되는 100 ㎛ 두께의 유체 챔버 내에 포함된다.
단계(110): 초기화
이러한 단계에서, 화상 센서(16)에 의해서 획득된 화상(I)으로부터, 샘플(14)의 초기 화상(
Figure pct00053
)이 형성된다. 이러한 단계는 단계(120 내지 180)를 참조하여 이하에서 설명되는 반복적인 알고리즘의 초기화이며, 지수(k)는 각각의 반복의 순위를 나타낸다. 제곱근 연산자를 화상 센서에 의해서 획득된 화상(I)에 적용하는 것에 의해서 초기 화상(
Figure pct00054
)의 계수(
Figure pct00055
)가 얻어질 수 있고, 이러한 경우에
Figure pct00056
이다. 이러한 예에서, 화상(I)은, 샘플(14) 상에 입사되는 광 파동(12)의 세기를 나타내는 조항(term)에 의해서 정규화된다. 후자는 예를 들어 화상(I)의 평균 제곱근(
Figure pct00057
)일 수 있고, 이러한 경우에, 획득된 화상의 각각의 화소(
Figure pct00058
)를 전술한 평균으로 나누고, 그에 따라
Figure pct00059
가 된다.
초기 화상(
Figure pct00060
)의 위상(
Figure pct00061
)이 각각의 화소(x, y) 내에서 영이 되는 것으로 간주되거나, 임의의 값으로 미리 설정된다. 구체적으로, 초기 화상(
Figure pct00062
)은 매트릭스-어레이 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상(I)으로부터 직접적으로 초래된다. 그러나, 그러한 화상은 샘플(14)에 의해서 전달된 광 파동(22)의 위상과 관련된 정보를 포함하지 않고, 화상 센서(16)는 이러한 광 파동의 세기에만 민감하다.
단계(120): 전파
이러한 단계에서, 재구축 평면(Pz) 내의, 샘플(14)을 나타내는, 복합 화상(
Figure pct00063
)을 획득하기 위해서, 전술한 바와 같은 전파 연산자를 적용하는 것에 의해서, 샘플의 평면 내에서 얻어진 화상(
Figure pct00064
)이 재구축 평면(Pz)으로 전파된다. 전파는 화상(
Figure pct00065
)을 전파 연산자(
Figure pct00066
)와 합성하는 것에 의해서 실행되고, 그에 따라:
Figure pct00067
가 되고,
* 기호는 합성 연산자를 나타낸다. 지표(-z)는, 전파가 전파 축(Z)의 방향과 반대되는 방향으로 실행된다는 사실을 나타낸다. 역-전파라고 한다.
제1 반복(k=1)에서,
Figure pct00068
는 단계(110)에서 결정된 초기 화상이다. 이어지는 반복에서,
Figure pct00069
는 선행 반복에서 업데이트된 검출 평면(P) 내의 복합 화상이다.
재구축 평면(Pz)은 검출 평면(P)으로부터 이격된 평면이고, 바람직하게 검출 평면과 평행하다. 바람직하게, 재구축 평면(Pz)은, 샘플(14)이 내부에 놓이는 평면(P14)이다. 구체적으로, 이러한 평면 내에서 재구축된 화상은 일반적으로 높은 공간 해상도가 얻어질 수 있게 한다. 이는 또한, 검출 평면으로부터 영이 아닌 거리에 위치되고, 바람직하게 검출 평면에 평행한 다른 평면, 예를 들어 매트릭스-어레이 광검출기(16)와 샘플(14) 사이에 놓이는 평면의 문제일 수 있다.
단계(130): 복수의 화소 내의 표시자의 계산
이러한 단계에서, 복합 화상(
Figure pct00070
)의 복수의 화소(x, y)의 각각의 화소와 연관된 양(
Figure pct00071
)이, 바람직하게 이러한 화소의 각각에서, 계산된다. 이러한 양은, 계산되는 화소(x, y) 내의, 화상(
Figure pct00072
)의 값(
Figure pct00073
), 또는 그 계수의 값에 따라 달라진다. 이는 또한 이러한 화소 내의 화상의 차원적 미분(dimensional derivative), 예를 들어 이러한 화상의 차원적 미분의 계수에 따라 달라질 수 있다.
이러한 예에서, 각각의 화소와 연관된 양(
Figure pct00074
)은, 각각의 화소 내의, 화상(
Figure pct00075
)과 1의 값 사이의 차이의 계수이다. 그러한 양은 이하의 식을 이용하여 얻어질 수 있다:
Figure pct00076
단계(140): 화상(
Figure pct00077
)과 연관된 잡음 표시자의 확립
단계(130)에서, 양(
Figure pct00078
)이 복합 화상(
Figure pct00079
)의 복수의 화소에서 계산되었다. 이러한 양은 벡터(Ek)의 형태일 수 있고, 그 조항은 각각의 화소(x, y)와 연관된 양(
Figure pct00080
)이다. 이러한 단계에서, 잡음 표시자로 지칭되는 표시자는 벡터(Ek)의 표준(norm)으로부터 계산된다. 일반적으로, 차수(order)는 표준과 연관되고, 그에 따라 좌표
Figure pct00081
의 차원(n)의 벡터(x)의 차수(p)의 표준(
Figure pct00082
)은
Figure pct00083
가 되고, 여기에서 p ≤ 0이다.
본 경우에, 차수 1의 표준이 이용되고, 다시 말해서 p = 1 이다. 구체적으로, 본 발명자들은, 이하에서 설명되는 바와 같이, 차수 1, 또는 1 이하의 차수의 표준이 그러한 샘플에 특히 적합하다는 것으로 추정하였다.
이러한 단계에서, 복합 화상의 각각의 화소(x, y) 내에서, 복합 화상(
Figure pct00084
)으로부터 계산된 양(
Figure pct00085
)이 합산되고, 그에 따라 복합 화상(
Figure pct00086
)과 연관된 잡음 표시자(
Figure pct00087
)를 형성한다.
그에 따라,
Figure pct00088
가 된다.
1의 차수의, 또는 1 이하의 차수의 표준이 사용되기 때문에, 복합 화상(
Figure pct00089
)이 샘플을 점점 더 대표하기 시작함에 따라, 잡음 표시자(
Figure pct00090
)의 값이 감소된다. 구체적으로, 제1 반복에서, 화상(
Figure pct00091
)의 각각의 화소(x, y) 내에서, 위상(
Figure pct00092
)의 값은 좋지 못하게 추정된다. 이어서, 샘플의 화상의 검출 평면(P)으로부터 재구축 평면(Pz)으로의 전파는, 종래 기술과 관련하여 언급한 바와 같이, 실질적인 재구축 잡음을 수반한다. 이러한 재구축 잡음은 재구축된 화상 내의 요동의 형태를 취한다. 이러한 요동으로 인해서, 재구축된 화상 내의, 재구축 잡음의 기여가 증가됨에 따라, 앞서서 규정된 바와 같은 잡음 표시자(
Figure pct00093
)의 값이 증가된다. 구체적으로, 재구축으로 인한 요동은 이러한 표시자의 값을 증가시키는 경향을 갖는다.
이러한 단계의 중요한 양태는, 검출 평면(P) 내에서, 샘플의 화상(
Figure pct00094
)의 각각의 화소에 대한 위상 값(
Figure pct00095
)의 결정으로 구성되고, 이는, 이하의 반복에서, 표시자(
Figure pct00096
)가 표시자(
Figure pct00097
) 보다 작은 재구축된 화상(
Figure pct00098
)이 얻어질 수 있게 한다.
제1 반복에서, 전술한 바와 같이, 관련 정보는 광 파동(22)의 세기에서만 이용 가능하고, 그 위상에서는 그렇지 않다. 그에 따라, 재구축 평면(Pz) 내에서 재구축된 제1 화상(
Figure pct00099
)은 재구축 잡음의 실질적인 양에 의해서 영향을 받는데, 이는 검출 평면(P) 내의 광 파동(22)의 위상에 관한 관련 정보가 없기 때문이다. 그에 따라, 표시자(
Figure pct00100
)가 크다. 이하의 반복에서, 알고리즘은 검출 평면(P) 내의 위상(
Figure pct00101
)의 점진적인 조정을 실행하고, 그에 따라 표시자(
Figure pct00102
)를 점진적으로 최소화시킨다.
검출 평면 내의 화상(
Figure pct00103
)은, 그 세기 및 그 위상의 관점 모두로부터, 검출 평면(P) 내의 광 파동(22)을 나타낸다. 단계(120 내지 160)은, 화상(
Figure pct00104
)의 각각의 화소에 대해서, 화상(
Figure pct00105
)을 재구축 평면(Pz)에 전파시키는 것에 의해서 획득되는 화상(
Figure pct00106
)으로부터 획득된, 표시자(
Figure pct00107
)를 최소화하는 위상(
Figure pct00108
)의 값을 반복적으로 확립하려는 것이다.
최소화 알고리즘은 구배 감소 알고리즘일 수 있거나, 구배 하강 알고리즘을 활용할 수 있고, 그러한 알고리즘에 대해서는 이하에서 설명한다.
단계(150): 검출 평면 내의 위상의 값의 조정.
단계(150)는, 이하의 반복(k+1)에서, 복합 화상(
Figure pct00109
)의 재구축 평면(Pz)으로의 전파로부터 초래되는 표시자(
Figure pct00110
)를 최소화하기 위해서, 복합 화상(
Figure pct00111
)의 각각의 화소의 위상(
Figure pct00112
)의 값을 결정하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해서, 위상 벡터(
Figure pct00113
)가 구축되고, 그 각각의 조항은 복합 화상(
Figure pct00114
)의 화소(x, y)의 위상(
Figure pct00115
)이다. 이러한 벡터의 차원은 (Npix, 1)이고, 여기에서 Npix 은 해당 화소의 수이다. 이러한 벡터는, 이하의 업데이팅 식을 이용하여, 각각의 반복에서 업데이트된다.
Figure pct00116
여기에서:
-
Figure pct00117
는 거리를 나타내는 "단계 크기"로 지칭되는 정수이고;
-
Figure pct00118
는 차원(Npix, 1)의 방향 벡터이고, 그 각각의 조항(p(x, y))은 표시자(
Figure pct00119
)의 구배(
Figure pct00120
)의 방향을 형성한다.
이러한 식은 이하와 같은 벡터 형태로 표현될 수 있다:
Figure pct00121
이하가 확인될 수 있을 것이고:
Figure pct00122
여기에서:
-
Figure pct00123
는 차원(Npix, 1)의 구배 벡터이고, 그 각각의 조항은 미지의 문제의 자유도의 각각에 따른 표시자(
Figure pct00124
)의 변동, 즉 벡터(
Figure pct00125
)의 조항을 나타내며;
-
Figure pct00126
는 선행 반복에서 확립된 방향 벡터이고;
-
Figure pct00127
는 방향 벡터(
Figure pct00128
)에 적용된 환산 계수(scale factor)이다.
Figure pct00129
가 되도록 구배 벡터(
Figure pct00130
)의 각각의 조항(
Figure pct00131
)이 구성되며,
여기에서 Im은 피연산자의 가상 부분을 복귀시키는 연산자이고, r'는 검출 평면 내의 좌표(x, y)이다.
Figure pct00132
가 되도록 환산 계수(
Figure pct00133
)가 표현될 수 있다.
단계 크기(
Figure pct00134
)는 반복에 따라 달라질 수 있고, 예를 들어 제1 반복에서의 0.03과 마지막 반복에서의 0.0005 사이일 수 있다.
업데이팅 식은 벡터(
Figure pct00135
)의 조정이 얻어질 수 있게 하고, 이는 복합 화상(
Figure pct00136
)의 각각의 화소 내의 위상(
Figure pct00137
)의 반복적인 업데이트를 유도한다. 이어서, 이러한 복합 화상(
Figure pct00138
)은, 검출 평면 내에서, 업데이트되고, 위상의 이러한 새로운 값은 각각의 화소와 연관된다.
Figure pct00139
가 되도록, 매트릭스-어레이 광검출기(16)에 의해서 획득된 화상으로부터 결정되는, 복합 화상(
Figure pct00140
)의 계수가 수정되지 않는다는 것을 주목할 수 있을 것이다.
단계(160): 알고리즘의 반복 또는 알고리즘으로부터의 탈출.
수렴 기준에 도달되지 않는다면, 단계(160)는 알고리즘을 반복하는 것으로 구성되고, 단계(120 내지 160)의 새로운 반복은 단계(150)에서 업데이트된 복합 화상(
Figure pct00141
)을 기초로 한다. 수렴 기준은 미리 설정된 반복의 수(K), 또는 표시자의 구배(
Figure pct00142
)의 최소 값, 또는 2개의 연속되는 위상 벡터들(
Figure pct00143
) 사이의 무시될 수 있는 것으로 간주되는 차이일 수 있다. 수렴 기준에 도달될 때, 추정은, 검출 평면(P) 내의 또는 재구축 평면(Pz) 내의, 샘플의 복합 화상의 정확한 추정인 것으로 간주된다.
단계(170): 기준 복합 화상의 획득
마지막 반복의 말단에서, 방법은, 기준 복합 화상(
Figure pct00144
)을 획득하기 위해서, 마지막 반복으로부터 초래된 복합 화상(
Figure pct00145
)을 재구축 평면(Pz)에 전파시키는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기준 복합 화상(
Figure pct00146
)은 검출 평면(P) 내의 마지막 반복으로부터 초래된 복합 화상(
Figure pct00147
)이다. 그러나, 입자의 밀도가 높을 때, 이러한 대안은 덜 유리한데, 이는, 특히 재구축 평면(Pz)이, 샘플(14)이 놓이는 평면(P14)에 상응할 때, 검출 평면(P) 내의 공간적 해상도가 재구축 평면(Pz) 내에서 보다 낮기 때문이다.
도 8의 (C)는 8번의 반복 이후에 재구축 평면(Pz) 내에서 얻어진 기준 복합 화상(
Figure pct00148
)의 각각의 화소의 계수(
Figure pct00149
)의 화상을 도시한다. 이러한 화상의 공간적 해상도는 각각의 입자의 반경방향 좌표(x, y)의 양호한 식별을 가능하게 한다.
단계(180): 입자 반경방향 좌표의 선택.
이러한 단계에서, 입자의 반경방향 좌표(x, y)는 기준 화상(
Figure pct00150
)으로부터, 예를 들어 그 계수의 화상(
Figure pct00151
)으로부터, 또는 그 위상의 화상(
Figure pct00152
)으로부터 선택된다. 전술한 바와 같이, 반경방향 좌표라는 표현은 검출 평면 내의 또는 재구축 평면 내의 좌표를 나타낸다. 또한, 홀로그램(I0)을 기초로 또는 마지막 반복 이후에 검출 평면 내에서 획득되는 복합 화상(
Figure pct00153
)을 기초로 이러한 선택이 실행되는 것을 생각할 수 있을 것이다. 그러나, 입자의 수가 증가될 때, 재구축 평면 내에 형성된 화상에서 이러한 선택을 실행하는 것이 바람직한데, 이는, 특히 재구축 평면(Pz)이 샘플의 평면(P14)에 상응할 때, 더 양호한 그 공간 해상도 때문이다. 도 8의 (C)에서, 점선 외곽선에 의해서 둘러싸인 입자의 선택이 도시되어 있다.
단계(185): 전파 연산자의 적용
이러한 단계(185)에서, 검출 평면(P)으로부터 또는 재구축 평면(Pz)으로부터 여러 거리에서 재구축된 이차적인 복합 화상(
Figure pct00154
)으로 지칭되는 복수의 것을 획득하기 위해서, 기준 복합 화상(
Figure pct00155
)은, 전술한 바와 같은 전파 연산자(h)를 이용하여, 복수의 재구축 거리로 전파된다. 이러한 단계는 따라서 복수의 복합 화상(
Figure pct00156
)을 결정하는 것을 포함하며, 그에 따라
Figure pct00157
가 되고, 여기에서,
Figure pct00158
이다.
값(zmin 및 zmax)은, 기준 복합 화상이 전파되는, 축(Z)을 따른, 최소 및 최대 좌표이다. 바람직하게 복합 화상은 샘플(14)과 화상 센서(16) 사이의 복수의 좌표(z)에서 재구축된다. 복합 화상은 샘플(14)의 어느 한 측면 상에 형성될 수 있다.
이러한 이차적인 복합 화상은 홀로그래픽 재구축 연산자(h)를 기준 화상(
Figure pct00159
)에 적용하는 것에 의해서 확립된다. 기준 화상은, 단계(120 내지 160)의 반복 이후의, 화상 센서가 노출되는 광 파동(22)을 정확하게 설명하는 복합 화상, 및 특히 그 위상이다. 그에 따라, 이차적인 화상(
Figure pct00160
)은 전파 축(Z)을 따른 광 파동(22)의 전파의 양호한 설명체를 형성한다.
단계(190): 프로파일의 형성
이러한 단계에서, 각각의 이차적인 복합 화상(
Figure pct00161
)으로부터, 광 파동(22)의 전술한 바와 같은 특성적인 양이 결정되며, 그에 따라 전파 축(Z)을 따른 그러한 특성적인 양의 변동을 나타내는 프로파일을 형성한다. 특성적인 양은, 예를 들어, 계수 또는 위상 또는 그 조합일 수 있다. 도 8의 (D)는 전파 축(Z)을 따른 광 파동(22)의 위상(
Figure pct00162
)의 변동을 도시한다.
단계(200): 특성화
이어서, 입자는 선행 단계에서 형성된 프로파일로부터 특성화될 수 있다. 바람직하게, 기지의 표준 샘플을 이용하여 학습 위상에서 형성된 표준 프로파일의 데이터베이스가 이용 가능하다. 이어서, 특성화는, 표준 프로파일을 기초로 하여, 형성된 프로파일을 비교 또는 분류하는 것에 의해서 실행된다.
이러한 실시예는 적혈구를 포함하는 샘플에서 테스트되었다. 다른 예가 도 9a 내지 도 9e에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 샘플은 1/400까지 희석된 인산-완충 생리식염수(PBS) 완충액을 포함하는 수성 용액 내에서 희석된 적혈구를 포함한다. 샘플(14)을 100 ㎛ 두께의 유체 챔버(15) 내에 배치하였고, 그러한 챔버를 450 nm에 센터링된 스펙트럼 대역을 가지는, 전술한, 발광 다이오드로부터 8 cm의 거리에 배치하였다. 샘플을 전술한 CMOS 화상 센서로부터 1.5 mm의 거리에 배치하였다. 공간 필터(18)의 개구경의 크기는 150 ㎛였다.
도 9a는 화상 센서에 의해서 획득된 화상(I)을 도시한다. 샘플의 평면(P10) 내의, 재구축된 복합 화상(
Figure pct00163
)의 계수 및 위상의 화상이 도 9b 및 도 9c에 각각 도시되었다. 이러한 화상은 8번의 반복으로 획득되었다.
화상(
Figure pct00164
)은 기준 화상(
Figure pct00165
)을 형성하고, 그러한 기준 화상에서 전술한 바와 같은 전파 연산자(h)가 적용되며, 그에 따라 전파 축(Z)을 따른 복수의 이차적인 복합 화상(
Figure pct00166
)을 획득한다. 또한, 기준 화상의 계수의 화상 또는 위상의 화상에서, 적혈구가 식별되었고, 적혈구는 이러한 화상의 각각에서 점선으로 둘러싸였다. 이러한 적혈구의 반경방향 좌표(x, y)가 추출되었다. 이차적인 복합 화상(
Figure pct00167
)으로부터, 화상 센서(16)에 도달한 광 파동(22)의 계수를 나타내는 프로파일(u(z)) 및 위상을 나타내는 프로파일(
Figure pct00168
)이 형성되었다. 프로파일의 각각의 지점의 값은, 전술한 반경방향 좌표에서의 각각의 이차적인 화상의 계수 및 위상을 결정하는 것에 의해서 획득된다. 도 9d 및 도 9e는 각각 그렇게 선택된 적혈구의 계수의 프로파일 및 위상의 프로파일을 도시한다. 프로파일은 좌표들(zmin = 1000 ㎛ 및 zmax = 2000 ㎛) 사이에서 5 ㎛의 z-방식 단계 크기로 결정되었다. 재구축 평면은 검출 평면으로부터 1380 ㎛에 위치되고, 이는 도 9d 및 도 9e의 가로좌표에 상응한다.
설명된 방법은 혈액으로 제한되지 않고 다른 체액, 예를 들어, 소변, 뇌척수액, 골수 등에 적용될 수 있다. 또한, 방법은, 특히 물이나 임의의 다른 수성 용액 내의 오염물 또는 독소의 분석을 위해서, 비-체액에 적용될 수 있다.
방법은 액체가 아닌 매체, 예를 들어 한천이나 채액의 건조 잔류물, 예를 들어 슬라이드 상의 건조 혈액의 광범위한 침착을 초래하는 혈액 도말 내에 위치된 입자의 검출 및 식별에도 적용된다. 후자의 경우에, 입자는 건조 잔류물 또는 공기에 의해서 서로 격리된다.
또한, 전술한 바와 같이, 입자는 내인성(예를 들어, 혈액 입자) 또는 외인성(마이크로비드, 액적)일 수 있다.
전술한 예는 재구축 거리에 따른 특성적인 양의 프로파일의 변동, 및 미리 설정된 문턱값을 이용한 비교를 기초로 단순한 식별 기준을 제공한다. 기준의 유효성은, 입자가 내부에 배치되는 매체와, 그리고 샘플의 제조 프로토콜과 관련된다. 다른 기준이 상이한 제조 프로토콜을 거친 입자에 적용될 수 있다. 그에 따라, 주어진 유형의 샘플에 대해서, 식별 기준은, 기지의 입자를 포함하는 표준 샘플 상에서 실시된, 학습 위상에서 규정될 수 있다.
또한, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서, 더 복잡하고 더 확실한 다른 분류 방법이 구현될 수 있다.

Claims (15)

  1. 샘플(14) 내에 포함된 입자(1, 2,...9, 101...104)를 식별하기 위한 방법으로서:
    a) 전파 축(Z)을 따라서 샘플(14)을 향해서 전파되는 입사 광 파동(12)을 생성하는 광원(11)을 이용하여 상기 샘플을 조명하는 단계;
    b) 매트릭스-어레이 광검출기(16)를 이용하여 상기 샘플의 화상을 획득하는 단계로서, 상기 샘플은, 상기 매트릭스-어레이 광검출기가, 상기 입사 광 파동(12)과 각각의 입자에 의해서 생성된 회절 파동 사이의 간섭을 포함하는 광 파동(22)에 노출되는 방식으로 상기 광원과 상기 매트릭스-어레이 광검출기 사이에 배치되는, 획득 단계를 포함하는;
    방법에 있어서:
    c) 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 내부에 놓이는 평면(P)에 평행한 평면(x, y) 내에서 상기 입자의 위치를 결정하는 단계;
    d) 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)로부터의 복수의 재구축 거리(|z|)에서, 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 노출되는 상기 광 파동(22)의 적어도 하나의 특성적인 양(u,
    Figure pct00169
    , φ, k)을 추정하기 위해서, 상기 획득된 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 단계;
    e) 상기 전파 축(Z)에 평행하고 상기 위치(x, y)를 통과하는 축을 따라서, 상기 거리에 따른 상기 특성적인 양의 변동(u(z),
    Figure pct00170
    (z), φ(z), k(z))을 나타내는 프로파일을 결정하는 단계; 및
    f) 상기 프로파일에 따라서 입자를 식별하는 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 특성적인 양은, 각각의 재구축 거리에서, 상기 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 상기 광 파동(22)의 복합식(U(x,y,z))을 추정하는 것에 의해서 얻어지는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 특성적인 양은 상기 복합식(U(x,y,z))의 계수 또는 항으로부터 결정되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식별은 상기 특성적인 양의 변동을 학습 위상에서 결정된 기준 프로파일에 비교하는 것에 의해서 달성되는, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 매트릭스-어레이 광검출기의 평면에 평행한 평면 내의, 각각의 입자의 위치는 상기 광검출기에 의해서 획득된 화상을 이용하여 또는 상기 매트릭스-어레이 광검출기가 노출되는 상기 광 파동(22)의 복합식(U(x,y,z))을 이용하여 결정되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)에 의해서 획득된 상기 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 것에 의해서, 재구축 평면 내에서 또는 검출 평면 내에서 기준 복합 화상
    Figure pct00171
    을 결정하는 단계;
    - 상기 기준 복합 화상으로부터, 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)로부터의 복수의 재구축 거리(|z|)에서, 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 노출되는 상기 광 파동(22)의 적어도 하나의 특성적인 양(u,
    Figure pct00172
    , φ, k)을 추정하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    - 재구축 평면으로부터 또는 상기 매트릭스-어레이 광검출기가 놓이는 평면으로부터 복수의 거리에 대해서 이차적인 복합 화상
    Figure pct00173
    을 계산하기 위해서, 상기 전파 연산자(h)를 상기 기준 복합 화상
    Figure pct00174
    에 적용하는 단계;
    - 각각의 이차적인 복합 화상
    Figure pct00175
    으로부터, 상기 거리의 각각에서의 특성적인 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광원이 공간적으로 가간섭적인 공급원인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광원이 발광 다이오드 또는 레이저 다이오드인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플과 상기 매트릭스-어레이 광검출기 사이에는 확대 광학기기가 배치되지 않는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 혈액 세포를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 백혈구 또는 적혈구 또는 혈소판의 세포계들 사이에서 식별되는, 방법.
  13. 샘플(14) 내에 포함된 입자를 식별하기 위한 장치로서:
    - 상기 샘플(14)의 방향으로, 전파 축(Z)을 따라, 입사 광 파동(12)을 생성하도록 배열된 광원(11); 및
    - 상기 광원(11)과 매트릭스-어레이 광검출기(16) 사이에서 상기 샘플(14)을 유지하기 위한 홀더를 포함하고;
    - 상기 샘플의 화상을 획득하도록 배열된 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)는, 상기 입사 광 파동(12)과 상기 입자에 의해서 형성된 회절 파동 사이의 간섭으로부터 초래되는 광 파동(22)에 노출되는, 장치에 있어서;
    프로세서(20), 및 특히 마이크로프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는:
    - 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 내부에 놓이는 평면(P)에 평행한 평면(x, y) 내에서 상기 입자의 위치를 결정하는 단계;
    - 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)로부터의 복수의 재구축 거리(|z|)에서, 상기 매트릭스-어레이 광검출기(16)가 노출되는 상기 광 파동(22)의 적어도 하나의 특성적인 양(u,
    Figure pct00176
    , φ, k)을 추정하기 위해서, 상기 획득된 화상에 디지털 재구축 알고리즘을 적용하는 단계;
    - 상기 전파 축에 평행하고 상기 위치(x, y)를 통과하는 축을 따라, 상기 재구축 거리에 따른 상기 특성적인 양의 변동(u(z),
    Figure pct00177
    (z), φ(z), k(z))을 나타내는 프로파일을 결정하는 단계; 및
    - 상기 프로파일에 따라서 상기 입자를 식별하는 단계를 실시하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 매트릭스-어레이 광검출기와 상기 분석되는 샘플 사이에 확대 광학기기를 포함하지 않는, 장치.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 프로세서는:
    - 각각의 재구축 거리에서, 상기 검출기가 노출되는 광학적 복사선의 복합식(U(x, y, z)) 을 결정하도록; 그리고
    - 상기 복합 진폭(U(x, y, z))의 계수 또는 항을 결정하는 것에 의해서, 각각의 재구축 거리에서, 상기 특성적인 양을 추정하도록 구성되는, 장치.
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