KR20180010235A - 생물학적으로 절단가능한 테트라펩티드 연결제 - Google Patents

생물학적으로 절단가능한 테트라펩티드 연결제 Download PDF

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Abstract

제1 화합물을 아민-함유 제2 화합물에 가역적으로 연결하기 위한 테트라펩티드 링커가 기술된다. 상기 테트라펩티드 링커를 함유하는 화합물 및 상기 테트라펩티드 링커의 사용방법도 또한 기술된다.

Description

생물학적으로 절단가능한 테트라펩티드 연결제
생리적으로 불안정한 링커 또는 변형제는 치료 약물 전달을 포함한 다양한 과정에 유용하다. 링커가 절단됨으로써 링커 또는 변형제의 흔적 없이 변형되지 않은 상태의 원래의 성분 중 적어도 하나를 재생시키는 경우에 링커 또는 변형제의 유용성이 더욱 개선될 수 있다.
화합물을 가역적으로 연결하거나 변형시키기 위한 임상 및 임상전 설정에서 여러 전략이 조사되었다. 이러한 가역성 접합체(reversible conjugates)는 화합물의 독성 효과를 줄이고, 약물학적 특성을 개선시키는데 사용된다. 효과적이기 위해, 가역성 접합체는 혈류에서 안정한 상태를 유지해야하지만, 접합체와 표적 세포의 상호작용 이후에 화합물의 방출을 허용한다. 또한, 링커 또는 변형제의 절단은 화합물이 그의 생화학적 표적에 도달하고, 그것과 효과적으로 상호작용하도록 허용되어야한다. 종종 화합물은 변형되지 않은 상태로 방출되어야한다.
가역성 접합체의 예는 프로드럭(prodrug), 프로토타입 형태로 불활성이지만, 체내에서 대사되어 활성 약물을 생성하는 약물 유도체 및 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)와 같은 담체(carriers)를 포함한다. 가역성 접합체의 형성은 항종양 화학요법 약물의 개발 및 뉴클레오티드 전달에 유용한 것으로 나타났다.
Rozema et al.(미국 특허 제8137695호)는 pH 민감성 말레아미드 결합(sensitive maleamide linkages)을 형성하는 디메틸말레산 무수물(dimethylmaleic anhydrides)을 사용하여 폴리아민의 가역적 변형을 나타내었다. 변형된 중합체를 세포에 전달하고 내재화하면, 감소된 pH 환경의 엔도솜(endosome)에서 말레아미드 결합이 절단되어 중합체 아민(polymer amines)이 재생된다.
pH 민감성 결합 이외에, 생체내 프로테아제에 의해 활성화되는 펩티드-함유 결합이 개발되었다. Rozema et al.(미국 특허 제8426554호)는 디펩티드 p-아미도 벤질-카르바메이트 스페이서(p-amidobenzyl-carbamate spacer, PABC)를 통해 중합체성 아미노-함유 측쇄에 접합된 입체 안정화제 또는 타겟팅 기를 사용하여 막 활성 폴리아민의 막 파괴 활성을 가역적으로 조절하는 수단을 제공하였다. 공개된 디자인에 따르면, 단백질분해 효소의 존재하에서, 아닐리드 결합의 가수분해는 1,6-제거 캐스케이드를 유발하여, 복원된 막 분해 특성을 갖는 변형되지 않은 다중양이온성 중합체를 생성시킨다.
프로드럭 디자인에 자기-희생성(self-immolative) PABC 스페이서(spacer)를 적용하는 것은 원래 Carl et al.(1981)에 의해 제안되었다. 이 전략은 공유 아닐리드 결합의 절단을 원하는 기질의 자발적인 방출과 조합한다. PABC 스페이서는 특히 항암 요법을 위한 치료제의 제어된 약물 방출에 대해 광범위하게 연구되어왔다(Dorywalska et al. 2015, Zhang et al. 2014, Florent et al 1998, Toki et al. 2002, Shamis et al. 2004, Amir et al. 2005, Amir et al. 2005, Gopin et al. 2006, Zhang et al. 2013, Zhang et al. 2013). 그러나, 퀴논이민 메티드(quinonimine methide, QIM)로도 알려져 있는 아자-퀴논 메티드(aza-quinone methide)가 PABC 제거 과정에서 생성되며, N, O 및 S-친핵체와 반응하는 성향 때문에 독성의 근원이 될 수 있다(Reboud-Ravaux et al. 2009).
Figure pct00001
PABC 스페이서가 결핍된 특정 펩티드 단백질분해성 프로드럭이 기술되어왔다(Zhong et al. 2013, Cho KY et al. 2012). 그러나, 앞서 기술된 펩티드 단백질분해성 프로드럭의 한계는 자기-희생성 PABC 유형 유사체의 속도와 유사한 속도로 모 약물의 1차 아민 성분을 유리시키지 않는다는 점이다. 프로드럭의 단백질분해동안 엔도펩티다제에 의한 C-말단 아미노산 잔기의 절단은 속도 제한 단계인 것으로 보인다(Masquelier et al. 1980, Schmid et al. 2007, Schmid et al. 2007, Elsadek et al. 2010, Trouet et. al., 1982).
요약
본원에 기술된 것은 제1 화합물을 아민-함유 제2 화합물에 가역적으로 연결하기 위한 테트라펩티드 링커이다. 생리적으로 절단가능한 링커(링커들)는 구조식: -A4-A3-A2-A1-을 갖는 테트라펩티드를 포함하며, 여기서 A4는 소수성 L-아미노산이며, A3은 친수성 L-아미노산이고, A2는 소수성 L-아미노산이고, A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이다. 테트라펩티드 링커는 유기체, 특히 포유 동물, 조직, 세포 또는 준세포 구획 또는 세포소기관에 존재하는 내인성 프로테아제와 같은 단백질분해 효소에 의해 절단(소화)된다. 또한, 단백질분해 효소는 A1의 C-말단 부분의 펩티드 결합을 쉽고 빠르게 절단시켜 아민-함유 제2 화합물을 유리시킨다. 또한 기술된 테트라펩티드 링커를 함유하는 조성물 및 아민 또는 아민-함유 화합물을 가역적으로 연결하거나 두 부분을 가역적으로 변형시키기 위해 테트라펩티드를 사용하는 방법이 기술되어있다. 상기 기술된 가역성 링커 및 변형제는 혈청 안정한 변형에 대하여 준비하고 생체내에서 절단될 수 있다.
본원에는 구조식: R5-A4-A3-A2-A1-R7을 갖는 테트라펩티드 연결제가 기술되어 있으며, 상기 구조식에서 R5가 제1 화합물을 포함하고, A4가 소수성 L-아미노산이고, A3이 친수성 L-아미노산이고, A2가 소수성 L-아미노산이며, A1이 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, R7은 아민-반응성 기이다. R7은 아민 또는 아민-함유 화합물과의 반응이 A1과 아미드 결합을 형성하도록 선택된다. 일부 구현예에서, A3은 극성 하전되지않은 L-아미노산이다. 일부 구현예에서, 테트라펩티드 연결제는 제1 화합물을 아민-함유 화합물에 가역적으로 연결시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 테트라펩티드 연결제는 아민-함유 화합물을 가역적으로 변형시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 테트라펩티드 연결제는 폴리아민을 가역적으로 변형시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 막 활성 폴리아민이다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 테트라펩티드 연결제를 통해 제2 화합물에 연결된 제1 화합물을 포함하는 조성물을 기술하고 있으며, 여기서 테트라펩티드 연결제는 A4A3A2A1로 구성되고, 상기 A4는 소수성 L-아미노산이고, A3은 친수성 L-아미노산이고, A2는 소수성 L-아미노산이고, A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, A1은 아미드 결합을 통해 제2 화합물에 연결된다. 일부 구현예에서, A3은 극성 하전되지않은 L-아미노산이다. 시험관내 또는 생체내에서 단백질분해 효소에 의한 테트라펩티드의 절단(소화)은 A1과 제2 화합물 사이의 절단을 초래하여 제2 화합물을 유리시킨다. 일부 구현예에서, A4A3A2A1은 서열: FCitFP(서열번호 12), VCitFP(서열번호 19), ACitFP(서열번호 3), FKFP(서열번호 16), FCitVP(서열번호 13), FCitFL(서열번호 11), FCitF(Nme)A(서열번호 9) 또는 FCitAP(서열번호 8)를 가지고, 상기 F는 L-페닐알라닌이고, Cit는 L-시트룰린이고, P는 L-프롤린이고, V는 L-발린이고, A는 L-알라닌이고, K는 L-리신이고, L은 L-류신이고, (Nme)A는 L-N-메틸-알라닌이다.
일부 구현예에서, 가역적으로 변형된 폴리아민을 포함하는 조성물이 기술되어있다. 폴리아민은 본원에 기술된 테트라펩티드 연결제로 폴리아민 상의 다수의 아민의 가역적인 변형에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 양친매성 막 활성 폴리아민이다. 일부 구현예에서, 조성물은 RNAi 트리거를 추가로 포함한다. 폴리아민은 RNAi 트리거에 공유 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아민의 RNAi 트리거로의 공유 결합을 위한 연결은 디설파이드 결합과 같은 생리적으로 불안정한 연결을 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 RNAi 트리거에 공유적으로 연결되지 않고, RNAi 트리거는 타겟팅 기에 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 화합물을 아민-함유 제2 화합물에 연결시키는 방법이 기술되며, 상기 방법은 제1 화합물을 테트라펩티드의 아미노-말단에 부착시키는 단계 및 테트라펩티드의 카르복시-말단과 아민-함유 제2 화합물 사이에 아미드 결합을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 테트라펩티드는 아미노산 서열 A4A3A2A1을 가지고, A4는 소수성 L-아미노산이고, A3는 친수성 L-아미노산이고, A2는 소수성 L-아미노산이고, A1는 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이다. 일부 구현예에서, A4는 페닐알라닌이다. 일부 구현예에서, A3은 극성 하전되지않은 L-아미노산이다. 일부 구현예에서, 극성 하전되지않은 아미노산은 L-시트룰린이다. 일부 구현예에서, A2는 페닐알라닌이다. 일부 구현예에서, A1은 프롤린이다.
일부 구현예에서, 테트라펩티드 링커 또는 연결제는: FCitFP(서열번호 12), VCitFP(서열번호 19), ACitFP(서열번호 3), FKFP(서열번호 16), FCitVP(서열번호 13), FCitFL(서열번호 11), FCitF(Nme)A(서열번호 9), FCitAP(서열번호 8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 아미노산 서열을 가지며, F는 L-페닐알라닌이며, Cit는 L-시트룰린이고, P는 L-프롤린이고, V는 L-발린이고, A는 L-알라닌이고, K는 L-리신이고, L은 L-류신이고, (Nme)A는 L-N-메틸-알라닌이다.
생리적으로 절단가능한 링커를 형성하기 위한 페닐알라닌-시트룰린-페닐알라닌-프롤린(FCitFP(서열번호 12)) 테트라펩티드의 용도가 기술되어 있다. FCitFP 링커는 포유동물, 포유류 조직, 포유류 세포 또는 포유 동물의 준세포 구획 또는 세포소기관에서 단백질분해 효소에 의해 빠르게 절단된다. 일부 구현예에서, 아민-함유 화합물은 아미드 결합을 통해 프롤린에 연결된다. 프롤린 C-말단 아미드 결합은 생체내 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되어 아민-함유 화합물을 방출한다.
일부 구현예에서, 제1 화합물은 타겟팅 기, 세포 수용체 리간드, 인테그린 리간드, RGD 리간드, RGD 모사물, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr) 리간드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, N-아세틸갈락토사민, 폴레이트(folate), 입체 안정화제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리뉴클레오티드, 중합체, 폴리아민, 항체, 약물 제품, 합텐, 디곡시게닌, 비타민, 비오틴, 형광 발색단, 항체, 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 아민-함유 제2 화합물은 타겟팅 기, 세포 수용체 리간드, 인테그린 리간드, RGD 리간드, RGD 모사물, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr) 리간드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, N-아세틸갈락토사민, 폴레이트, 입체 안정화제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리뉴클레오티드, 중합체, 폴리아민, 항체, 약물 제품, 합텐, 디곡시게닌(digoxigenin), 비타민, 비오틴, 항체, 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 트리거를 생체내 세포에 전달하기 위한 조성물이 기술되어있다.
도 1. 본원에 기술된 테트라펩티드 링커의 제조 또는 시험에 사용되는 일부 성분의 구조.
도 2. A) 화합물 39의 소화율, 및 B) 화합물 29의 소화율을 나타내는 그래프.
도 3. 화합물 29 및 39의 반응 동역학, 시간(hr)에 대한 중간 생성물의 비율(%)(C = 시트룰린)을 나타내는 그래프.
제 1 화합물을 아민-함유 제2 화합물과 가역적으로 연결하고, 및/또는 아민-함유 제2 화합물을 가역적으로 변형시키는데 유용한 테트라펩티드 링커 및 테트라펩티드 연결제가 기술되어 있다. 상기 기술된 테트라펩티드 링커는 프로드럭 전달에 사용된 상기 기술된 펩티드 링커에 비해 개선된 절단 동역학을 나타낸다(Rejmanova et al. 1983, Malugin et al. 2007, Miller et al. 2009, Soler et al. 2015, Chu et al. 2012). 테트라펩티드 링커는 단백질분해 효소의 부재하에 가수분해에 안정적이다. 시험관내 또는 생체내에서 단백질분해 효소(소위 프로테이나제, 프로테아제 또는 펩티다제라고도 함)의 존재하에 테트라펩티드는 쉽게 절단된다. 보다 구체적으로, 상기 기술된 테트라펩티드 링커 및 테트라펩티드 연결제는 테트라펩티드의 카르복시 말단 아미노산과 아민-함유 제2 화합물 사이에서 신속하게 절단되어 아민-함유 제2 화합물을 방출한다.
일부 구현예에서, 테트라펩티드 링커가 기술되며, 상기 테트라펩티드 링커는 하기로 나타내는 구조를 포함하며:
[구조식 I]
Figure pct00002
,
[구조식 Ⅱ]
Figure pct00003
, 또는
[구조식 Ⅲ]
Figure pct00004
여기에서,
R4는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이며,
R3은 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 -28 또는 그 이하이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 하전되지않은 친수성 또는 염기성 친수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이며, 및
R2는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이다.
일부 구현예에서, R2 및 R4는 -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3 및 -CH2C6H6(페닐알라닌)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, R3은 -(CH2)3NHC(=O)NH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3 + 및 -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R3은 -(CH2)3NHC(=O)NH2이다.
리소좀에서와 같이 생체내 프로테아제에 노출된 후에는 테트라펩티드 C-말단 아미드 결합이 빠르게 절단(소화)된다.
일부 구현예에서 테트라펩티드 링커는 하기 구조식으로 나타내는 구조를 포함한다:
[구조식 ⅩⅠⅠ]
Figure pct00005
.
일부 구현예에서, 생물학적으로 불안정한 화합물이 기술되며, 생물학적으로 불안정한 화합물은 하기 구조식 IV를 포함하는 테트라펩티드 링커를 통해 아민-함유 제2 화합물에 연결된 제1 화합물을 포함하며:
[구조식 IV]
R5-A4-A3-A2-A1-R6
여기에서,
R5는 제1 화합물을 나타내고,
R6은 아민-함유 제2 화합물을 나타내고,
A4는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
A3은 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 -28 또는 그 이하이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
A2는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, 및
A1은 아미드 결합을 통해 R6에 연결된다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), 및 A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴 또는 L-리신이다(각각, -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3 + 또는 -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린(FCitFP(서열번호 12))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-리신이고, A4는 L-페닐알라닌(FKFP(서열번호 16))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-발린이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitVP(서열번호 13))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-발린(VCitFP(서열번호 19))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitAP(서열번호 8))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-알라닌(ACitFP(서열번호 3))이다.
일부 구현예에서, A1은 류신이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), 및 A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴 또는 L-리신, 또는 L-아르기닌이다(각각, -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-류신이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitFL(서열번호 11))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각, -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), 및 A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, L-리신, L-아르기닌이다(각각, -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 + 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitF(Nme)A(서열번호 9))이다.
일부 구현예에서, R5는 입체 안정화제, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1- 5OO-O0-1-(CH2)0-2-, PEG1 -100, 타겟팅 기, 세포 수용체 리간드, 인테그린-결합 리간드, RGD 리간드, RGD 모사물, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr) 리간드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, N-아세틸갈락토사민, 폴레이트, 폴리뉴클레오티드, 중합체, 폴리아민, 항체, 약물 제품, 합텐, 디곡시게닌, 비타민, 비오틴, 형광발색단, 항체, 면역글로불린, 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 목록으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
R6은 입체 안정화제, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1- 5OO-O0-1-(CH2)0-2-, PEG1 -100, 타겟팅 기, 세포 수용체 리간드, 인테그린-결합 리간드, RGD 리간드, RGD 모사물, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr) 리간드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, N-아세틸갈락토사민, 폴레이트, 폴리뉴클레오티드, 아민-변형된 폴리뉴클레오티드, 중합체, 아민-함유 중합체, 폴리아민, 양친매성 막 활성 폴리아민, 항체, 약물 제품, 합텐, 디곡시게닌, 비타민, 비오틴, 형광발색단, 항체, 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 1차 아민-함유 화합물이다.
일부 구현예에서, 생물학적으로 불안정한 테트라펩티드 링커를 통해 제1 화합물을 아민-함유 제2 화합물에 가역적으로 부착시키기 위한 테트라펩티드 변형제로서, 상기 테트라펩티드 변형제는 하기 구조식 V를 포함한다:
[구조식 V]
R5-A4-A3-A2-A1-R7
여기에서,
R5는 제1 화합물을 나타내고,
A4는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
A3은 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 -28 또는 그 이하이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
A2는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, 및
R7은 TFP(테트라플루오로 페닐) 또는 NHS(N-히드록시숙신이미드) 2-MT(2-메르캅토티아졸린)의 활성화 에스테르와 같은 아민-반응성 기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, A1은 프롤린이고, A2 및 A4는 독립적으로 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), 및 A3은 시트룰린 또는 아스파라긴이다(각각, -(CH2)3NHCONH2, 또는 -CH2CONH2의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 프롤린이고, A2 및 A4는 페닐알라닌이고, A3은 시트룰린(FCitFP(서열번호 12))이다. 일부 구현예에서, A1은 프롤린이고, A2는 페닐알라닌이고, A3은 시트룰린이고, A4는 알라닌(ACitFP(서열번호 3))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린(FCitFP(서열번호 12))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-리신이고, A4는 L-페닐알라닌(FKFP(서열번호 16))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-발린이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitVP(서열번호 13))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-발린(VCitFP(서열번호 19))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitAP(서열번호 8))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-알라닌(ACitFP(서열번호 3))이다.
일부 구현예에서, A1은 류신이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-류신이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-리신이고, A4는 L-페닐알라닌(FKFL(서열번호 15))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-류신이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitFL(서열번호 11))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitF(Nme)A(서열번호 9))이다.
일부 구현예에서, R5는 입체 안정화제, PEG, H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1- 5OO-O0-1-(CH2)0-2-, PEG1 -100, 타겟팅 기, 세포 수용체 리간드, 인테그린-결합 리간드, RGD 리간드, RGD 모사물, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGPr) 리간드, 갈락토스, 갈락토스 유도체, N-아세틸갈락토사민, 폴레이트, 폴리뉴클레오티드, 중합체, 폴리아민, 지질, 리포좀, 항체, 약물 제품, 합텐, 디곡시게닌, 비타민, 비오틴, 형광발색단, 항체, 면역글로불린, 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 목록으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 타겟팅 기는 세포 표면 수용체 리간드를 포함한다. 세포 표면 수용체는 아시알로글리코단백질 수용체 및 인테그린 수용체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 아시알로글리코단백질 수용체 리간드는 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일갈락토사민 또는 이의 이량체, 삼량체 또는 사량체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 인테그린 수용체는 αvβ3 인테그린 및 αvβ6 인테그린을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 인테그린 수용체 리간드는 RGD 또는 RGD 모사물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 공개 공보 US-2015-0045573 A1 참조).
입체 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. PEG는 1 내지 120개의 에틸렌 단위, 3 내지 30개의 에틸렌 단위 또는 3 내지 24개의 에틸렌 단위를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 생물학적으로 불안정한 테트라펩티드 링커를 통해 아민-함유 제2 화합물에 제1 화합물을 가역적으로 부착시키는 화합물이 기술되며, 상기 화합물은 하기 구조식으로 나타낸 구조를 포함하며:
[구조식 Ⅵ]
,
[구조식 Ⅶ]
Figure pct00007
, 또는
[구조식 Ⅷ]
Figure pct00008
여기에서,
R5는 제1 화합물을 나타내고,
R4는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이며,
R3은 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 -28 또는 그 이하이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 하전되지않은 친수성 또는 염기성 친수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이며, 및
R2는 pH 7에서의 소수성 지수(Monera et al, J. Protein Sci. 1995, 1, 319)가 41 또는 그 이상이고, 아미노산 측쇄(R-기)의 조성과 관련하여 글리신으로 표준화된, 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 R-기(측쇄)이며,
R7은 아민-반응성 기를 포함한다.
R7은 아민 또는 아민-함유 화합물과의 반응이 A1과 아미드 결합을 형성하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 아민-반응성 기는 TFP(테트라플루오로 페닐), 또는 NHS(N-히드록시숙신이미드)이다.
일부 구현예에서, R2 및 R4는 -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3 및 -CH2C6H6로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, R3은 -(CH2)3NHCONH2 및 -CH2CONH2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 생물학적으로 불안정한 테트라펩티드 링커를 통해 제1 화합물을 아민-함유 제2 화합물에 가역적으로 부착시키는 화합물이 기술되며, 상기 화합물은 하기 구조식 Ⅸ로 나타낸 구조를 포함하며:
[구조식 Ⅸ]
Figure pct00009
여기에서, R5는 제1 화합물을 나타내고, 및 R7은 아민 반응성 기를 포함한다. R7은 아민 또는 아민-함유 화합물과의 반응이 A1과 아미드 결합을 형성하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 아민-반응성 기는 TFP(테트라플루오로 페닐), 또는 NHS(N-히드록시숙신이미드)이다.
일부 구현예에서, 가역적으로 변형된 폴리아민이 기술되며, 가역적으로 변형된 폴리아민은 하기 구조식 X를 포함하며:
[구조식 X]
(R5-A4-A3-A2-A1)n-P
여기에서,
R5, A4, A3, A2 및 A1은 각각 상기한 바와 같고,
P는 폴리아민을 포함하고,
n은 1 이상의 정수이고,
각각의 A1은 아미드 결합을 통해 폴리아민 상의 아민에 연결된다.
일부 구현예에서, 폴리아민은 막 활성 폴리아민이다. 일부 구현예에서, 막 활성 폴리아민은 양친매성 막 활성 폴리아민이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이며(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2 및 A4는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린(FCitFP(서열번호 12))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-리신이고, A4는 L-페닐알라닌(FKFP(서열번호 16))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-발린이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitVP(서열번호 13))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-발린(VCitFP(서열번호 19))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitAP(서열번호 8))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-프롤린이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-알라닌(ACitFP(서열번호 3))이다.
일부 구현예에서, A1은 류신이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이며(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-류신이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-리신이고, A4는 L-페닐알라닌(FKFL(서열번호 15))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-류신이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitFL(서열번호 11))이다.
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2 및 A4는 독립적으로 L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이며(각각 -CH3, -CHCH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, 또는 -CH2C6H6의 측쇄), A3은 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신이다(각각 -(CH2)3NHCONH2, -CH2CONH2, 또는 -(CH2)4NH3 +의 측쇄).
일부 구현예에서, A1은 L-N-메틸-알라닌이고, A2는 L-페닐알라닌이고, A3은 L-시트룰린이고, A4는 L-페닐알라닌(FCitF(Nme)A(서열번호 9))이다.
일부 구현예에서, 폴리아민을 다수의 기술된 테트라펩티드 변형제와 반응시킴으로써 가역적으로 변형된 폴리아민이 형성된다. 일부 구현예에서, 막 활성 폴리아민에 테트라펩티드 변형제가 부착되면, 차폐된(masked) 폴리아민 또는 전달 중합체를 형성함으로써 막 활성 폴리아민의 막 활성을 마스킹한다.
일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 50% 초과가 변형된다(n의 값은 폴리아민 상의 아민 수의 50% 초과이다). 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 60% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 70% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 75% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 80% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 85% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 90% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 95% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 100%가 변형된다.
일부 구현예에서, R5는 타겟팅 기를 포함하고, 가역적으로 변형된 폴리아민이 RNAi 트리거에 추가로 접합된다. RNAi 트리거-가역적으로 변형된 폴리아민 접합체는 표적 유전자 발현을 녹다운하기 위해 생체내 세포에 RNAi 트리거를 전달하는데 사용될 수 있다. 접합체가 형성되어, 환자에게 투여된다. 투여는 혈관내 주사 및 피하 주사가 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시험관내 또는 생체내에서 단백질분해 효소에 의한 테트라펩티드의 절단(소화)은 A1과 폴리아민 사이를 절단하여 폴리아민을 유리시킨다. 폴리아민의 방출 속도는 약물 또는 RNAi 트리거 전달을 제공하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 가역적으로 변형된 폴리아민이 기술되며, 가역적으로 변형된 폴리아민은 하기 구조식을 포함하며:
[구조식 ⅩⅠ]
(R9-A4-A3-A2-A1)n-P-(A1'-A2'-A3'-A4'-R8)m
A4, A3, A2 및 A1은 각각 상기한 바와 같고,
A1', A2', A3' 및 A4'는 각각 독립적으로 A1, A2, A3 및 A4에 대해 상기한 바와 같고,
R9는 타겟팅 기를 포함하고,
R8은 입체 안정화제를 포함하고,
P는 폴리아민을 포함하고,
n 및 m은 각각 1 이상의 정수이고, 및
각각의 A1 및 A1'은 아미드 결합을 통해 폴리아민 상의 아민에 연결된다.
가역적으로 변형된 폴리아민은 폴리아민을 다수의 기술된 테트라펩티드 변형제와 반응시킴으로써 형성된다.
일부 구현예에서, 폴리아민은 막 활성 폴리아민이다. 일부 구현예에서, 막 활성 폴리아민은 양친매성 막 활성 폴리아민이다.
일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 50% 초과가 변형된다(n+m의 값은 폴리아민 상의 아민의 수의 50% 초과이다). 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 60% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 70% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 75% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 80% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 85% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 90% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 95% 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 폴리아민 상의 아민의 100%가 변형된다.
일부 구현예에서, 가역적으로 변형된 폴리아민은 RNAi 트리거에 추가로 접합된다. RNAi 트리거-가역적으로 변형된 폴리아민 접합체는 표적 유전자 발현을 녹다운시키기 위해 생체내 세포에 RNAi 트리거를 전달하는 데 사용될 수 있다. 접합체가 형성되어 환자에게 투여된다. 투여는 혈관내 주사 및 피하 주사가 될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 시험관내 또는 생체내에서 단백질분해 효소에 의한 테트라펩티드의 절단(소화)은 A1과 폴리아민 사이를 절단하여 폴리아민을 유리시킨다. 폴리아민의 방출 속도는 약물 또는 RNAi 트리거 전달을 제공하기에 충분하다.
놀랍게도, 본 발명자들은 테트라펩티드 링커의 C-말단 L-프롤린 잔기의 삽입이 링커의 절단 특성을 크게 개선시킨다는 것을 보았다. H2N-R6(화학식 X 및 ⅩⅠ로부터의 H2N-P)의 재생은 A1에 L-프롤린이 존재할 때 상당히 빠른 속도로 일어난다. 이론에 구애받기를 원하지 않지만, 내인성 효소는 A3과 A2 사이의 테트라펩티드를 빠르게 절단하여 A4-A3 디펩티드에 연결된 제1 화합물(R5-A4-A3-C02H) 및 A2-A1 디펩티드에 연결된 제2 화합물(H2N-A2-A1-N(H)-R6)을 생성한다. A1에서 프롤린의 존재는 A2와 A1 사이의 절단을 억제한다. 프롤린 이외의 여러 아미노산이 A1 위치에 존재하면, 내인성 엑소프로테아제가 (H2N-A2-A1-N(H)-R6)로부터 A2를 빠르게 절단하여, H2N-A2-C02H 플러스 H2N-A1-N(H)-R6을 생성하는 것으로 나타났다. 제2 화합물로부터의 단일 아미노산의 절단은 천천히 진행되어, 원래의 아민-함유 화합물(H2N-R6)의 재생을 느리게한다. A1 위치의 프롤린의 부재하에, 본 발명자들은 A2와 A1 사이의 초기 절단 또는 A3과 A2 사이의 절단 후 A2와 A1 사이의 절단에 의한 단일 아미노산 접합체(H2N-A1-N(H)-R2)가 용이하게 형성됨을 관찰했다. 대조적으로, 프롤린이 A1 위치에 존재한다면, 디펩티드 A2-A1은 내인성 디펩티다제에 의해 신속하게 절단되어 H2N-A2-Pro-C02H 및 방출된 제2 화합물 H2N-R6을 생성하는 것으로 나타난다. 유사한 결과가 L-류신 또는 N-메틸 알라닌 및 A1 위치에서 달성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 막 활성 폴리아민은 생물학적 막에 대한 하나 이상의 효과: 즉 비-막 투과성 분자가 세포로 들어가거나 막을 횡단하도록 하는 막의 변경 또는 파괴, 막의 기공 형성, 막의 분열, 또는 막의 파괴 또는 용해를 유도할 수 있는 표면 활성의 양친매성 중합체이다. 본원에서 사용된 막 또는 세포막은 지질 이중층을 포함한다. 막의 변경 또는 파괴는 적어도 하나의 분석: 적혈구 용해(용혈), 리포좀 누출, 리포솜 융합, 세포 융합, 세포 용해 및 엔도좀 방출에서 중합체의 활성에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 세포막의 용해를 일으킬 수 있는 막 활성 중합체(membrane active polymers)는 막 용해성 중합체(membrane lytic polymers)로도 불린다. 원형질막을 통해 엔도좀 또는 리소좀을 우선적으로 파괴시키는 중합체는 엔도좀분해성(endosomolytic)으로 간주된다. 막 활성 중합체가 세포막에 미치는 영향은 일시적일 수 있다. 막 활성 중합체는 막에 대하여 친화성을 가지며, 이중층 구조의 변성 또는 변형을 일으킨다. 막 활성 중합체는 합성 또는 비-천연 양친매성 중합체일 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달은 막 내에 공극을 형성하거나 엔도솜 또는 리소좀 소포를 파괴하여 소포의 내용물을 세포질에 방출하는 것을 허용하는 것을 포함하여, 원형질막 또는 내부 소포 막(예컨대, 엔도좀 또는 리소좀)을 파괴하거나 불안정화시키는 막 활성 중합체에 의해 매개된다.
본원에서 사용되는 입체 안정화제는 입체 안정화제를 함유하지 않은 분자에 비해 입체 안정화제가 부착된 분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 방지 또는 억제하는 비이온성 친수성 중합체(천연, 합성 또는 비-천연)이다. 입체 안정화제는 그것이 부착된 분자가 정전기적 상호작용을 하는 것을 방해한다. 정전기적 상호작용은 양전하와 음전하 사이의 인력 때문에 2개 이상의 물질의 비공유 결합이다. 입체 안정화제는 혈액 성분과의 상호작용을 억제하여, 옵소닌 작용(opsonization), 식균 작용 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의한 흡수를 억제할 수 있다. 따라서 입체 안정화제는 그것이 부착된 분자의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 입체 안정화제는 또한 분자의 응집을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 입체 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG 유도체이다. 적합한 PEG 분자는 약 1 내지 120개의 에틸렌 글리콜 단량체를 갖는다.
타겟팅 기(또한 타겟팅 리간드)는 표적 세포 또는 조직, 또는 특정 세포 유형에 대한 화합물의 타겟팅 또는 전달을 위해 사용된다. 타겟팅 기는 표적 세포와의 분자 결합을 향상시킨다. 따라서, 타겟팅 기는 접합체의 세포 분포 및 세포 흡수를 개선시키기 위해, 그들이 부착된 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 향상시킬 수 있다. 리간드와 같은 타겟팅 기를 세포 또는 세포 수용체에 결합시키는 것은 세포내섭취(endocytosis)를 개시할 수 있다. 타겟팅 기는 세포 표면 분자에 대하여 친화성을 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드 및 항체, 항체 단편 및 세포 표면 분자에 대한 친화성을 갖는 항체 모사물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 타겟팅 기는 세포 수용체 리간드를 포함한다. 세포 및 특정 세포 수용체에 약물 및 유전자를 타겟팅하기 위해 다양한 리간드가 사용되어왔다. 세포 수용체 리간드는 탄수화물, 글리칸, 당류(갈락토스, 갈락토스 유도체, 만노스 및 만노스 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않음), 비타민, 폴레이트, 비오틴, 앱타머, 펩티드(RGD-함유 펩티드, 인슐린, EGF 및 트랜스페린을 포함하지만, 이에 한정되지는 않음) 및 RGC 모사물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ASGPr 리간드(또는 ASGPr 리간드)는 갈락토스 및, 갈락토스의 친화력 이상으로 ASGPr에 대해 친화력을 갖는 갈락토스 유도체를 포함한다. 갈락토스 타겟팅 기를 ASGPr(들)에 결합시키면, 전달 펩티드를 간세포로 세포-특이적으로 타겟팅하고, 및 전달 펩티드의 간세포로의 세포내섭취하는 것을 용이하게 한다. ASGPr 리간드는 락토스, 갈락토스, N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민 및 N-이소-부타노일-갈락토사민을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다(Iobst, S.T. 및 Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). ASGPr 리간드는 (예를 들어, 단일 갈락토사민을 갖는) 단량체 또는 (예를 들어, 다중 갈락토사민을 갖는) 멀티머일 수 있다.
RNAi 트리거(dsRNAi 트리거라고도 함)는 RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 과정을 통해 유전자 발현을 억제한다. RNAi 트리거는 전형적으로 15-50개의 염기쌍 또는 18-26개의 염기쌍을 함유하고, 코어 영역에 대해 세포내 발현된 표적 유전자내 코딩 서열과 적어도 90% 상보적인 핵염기 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 또는 RNA-유사 구조물을 포함한다. RNAi 트리거는: 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 다이서 기질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다(미국 특허 제8,084,599호, 제8,349,809호 및 제8,513,207호).
유전자 발현을 억제, 하향-조절 또는 넉다운시킨다는 것은, 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된 바와 같은 유전자의 발현이 본원에 기술된 차단 폴리뉴클레오티드-접합체의 부재하에 관찰된 것 미만으로 감소된다는 것을 의미한다. 본원에 기술된 조성물에 의해 전달된 폴리뉴클레오티드에 의한 유전자 발현의 억제, 하향-조절 또는 넉다운은 대조군 비활성 핵산, 스크램블된(scrambled) 서열을 갖는 핵산, 또는 불활성화 미스매치의 존재하에, 또는 가역적으로 변형된 중합체에 대한 폴리뉴클레오티드의 접합의 부재하에 관찰된 수준 미만이다 .
약리학 및 독성학에서 투여 경로는 약물, 유체, 독 또는 기타 물질이 신체와 접촉하게되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위해 약물 및 핵산을 투여하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본원에 기술된 화합물은 특정 경로에 적절하게 조절된 제제로 비경구를 포함한 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 화합물은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피부내, 피하 또는 복강내로 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 조성물은 약학적 조성물에 포함될 수 있고 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 일부를 형성할 수 있다.
비경구 투여 경로로는 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용하는 혈관내(정맥내, 동맥내), 근육내, 뇌실질내(intraraparenchymal), 피내, 피하(subdermal), 피하(subcutaneous), 종양내, 복강내, 경막내, 경막하, 및 림프관내 주사가 포함된다.
기술된 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 용액으로 주입된다. 약학적으로 허용가능한 것은 약물학적/독성학적 관점에서 포유 동물이 받아들일 수 있는 특성 및/또는 물질을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한이란 구절은 생리적으로 견딜 수 있고, 포유류에 투여 될 때 전형적으로 알레르기 반응 또는 다른 부작용 또는 독성 반응을 생성하지 않는 분자 본체, 조성물 및 특성을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한이란 용어는 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 또는 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 약전에 등재될 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적 조성물"은 약물학적 유효량의 활성 약학 성분(API, 또한 치료제, 예를 들어, RNAi 트리거), 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제(부형제들)는 API 이외의 물질로서, 안전성에 대하여 적당하게 평가받았고, 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되어있다. 부형제는 의도한 투여량으로는 치료효과를 발휘하지 않거나, 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 과정동안 약물 전달 시스템을 처리하는데 도움을 주고, b) API의 안정성, 생체이용율 또는 환자 수용성을 보호, 지지 또는 강화하고, c) 생성물 식별을 지원하고, 및/또는 d) 저장 또는 사용 중 API 전달의 전반적인 안전성, 효과 또는 임의의 다른 속성을 개선시키도록 작용할 수 있다.
부형제는: 흡수 증진제, 항-부착제, 소포제, 항산화제, 결합제, 결합제들, 완충제, 담체, 코팅제, 색소, 전달-증강제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향료, 활택제, 보습제, 윤활제, 오일, 중합체, 방부제, 식염수, 염, 용제, 당, 현탁제, 서방성 매트릭스, 감미제, 증점제, 긴장성 제제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 비활성 물질일 수 있거나, 아닐 수 있다.
약학적 조성물은 약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가 성분을 함유할 수 있다. 약학적으로-활성인 물질은 진양제(anti-pruritic), 아스트린젠트, 국소 마취제, 또는 항염증제(예를 들어, 항히스타민, 디펜히드라민 등)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 정의된 RNAi 트리거를 발현하거나 포함하는 세포, 조직 또는 분리된 기관은 "약학적 조성물"로서 사용될 수 있다는 것도 또한 예상된다. 본원에 사용된 "약물학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 단순히 "유효량"은 의도된 약물학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하기 위한 RNAi 트리거의 양을 지칭한다.
테트라펩티드 링커를 함유하는 약제가 또한 본 발명의 목적이며, 상기 약제의 제조를 위한 방법은 테트라펩티드 링커를 함유하는 하나 이상의 화합물, 및 필요에 따라 하나 이상의 다른 치료적으로 가치있는 물질을 생약 투여 형태(galenical administration form)로 전달하는 단계를 포함한다.
실시예
실시예 1. 테트라펩티드 링커 및 테트라펩티드 링커를 갖는 접합체의 합성.
A) 펩티드 및 AENA 표지된 펩티드의 합성.
Figure pct00010
(ⅰ) 화합물 1-21 의 고상 합성: 프롤린, 류신, 알라닌 또는 N-메틸 알라닌이 미리 로딩된 상업용으로 사용가능한 2-Cl-Trt 수지(EMD Millipore, Billerica, MA)로부터 펩티드 산을 합성하였다. 고체상 합성 분야의 표준 방법을 사용하여 단계적 첨가를 수행하였다. 커플링은 PYBOP(4당량), 아미노산(4당량) 및 DIEA(8당량)를 사용하여 수행하였다. DMF 내 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
펩티드 합성 후, N-말단 아미노산을 탈보호시키고, 지시된 R5 기와 커플링시켰다. 4당량의 DIEA를 함유하는 DMF 내 NAG(OAc)3(미국 특허 제8802773호 및 Rozema et al 2015에서 제조된 바와 같음) 또는 PEG12(Quanta Biodesign, Plain City, OH, CAS #:756525-94-7) 중 어느 하나의 2 당량의 NHS 활성화 에스테르를 사용하여 커플링을 수행하였다. 유사한 합성을 사용하여 다른 R5 기가 부착될 수 있다. R5를 부착한 후, DCM 내 HFIP(30%)를 사용하여 수지로부터 0.25시간동안 펩티드를 분열하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 Et2O로 분쇄하였다. 이어서, 기질을 추가 정제없이 사용하였다.
(ii) 화합물 22-43(22a, 24a, 25a, 32a, 34a)의 일반적인 제조: 조 펩티드 기질(1-21)의 용액에 PyBOP(2당량), DIEA(2ea),이어서 AENA(2당량)를 첨가하고, 실온에서 1시간동안 교반하였다. 완료시 용매를 진공하에 제거하였다. 이어서 화합물 24a, 25a, 32a 및 34a를 추가 정제없이 사용하였다. 다른 모든 기질은 0.1% 포름산으로 완충된 아세토니트릴 및 물의 구배로 용리시키는 Thermo Scientific Aquasil C18 역상 컬럼(250×21.2, Waltham, MA)을 사용하여 HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제 후, 모든 화합물을 동결건조에 의해 건조시켰다.
(iii) 화합물 22b , 24b , 25b , 32b 및 34b 의 제조: 화합물 24a 및 25a를 DMF 내 2% 히드라진으로 15분동안 처리하고, 이어서 모든 용매를 진공하에 제거하였다. 화합물 32a를 DCM 내 50% TFA로 1시간동안 처리하고, 이어서 모든 용매를 진공하에 제거하였다. 화합물 34a를 순수한 포름산으로 18시간동안 처리하고, 이어서 모든 용매를 진공하에 제거하였다. 미정제 화합물 22a의 일부를 MeOH(25%), H2O(45%) 및 TEA(35%)로 처리하고, 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 모든 용매를 진공하에 제거하였다. 기술된 바와 같이 탈보호된 모든 화합물을 단계(ii)에서 기술한 바와 같이 후속으로 HPLC에 의해 정제하였다.
B. 화합물 44a, 44b, 45a, 45b 및 34b의 일반적인 제조, 펩티드 기질의 에스테르 활성화(iv):
Figure pct00011
조 화합물 01a, 01b, 08a, 08b, 15b 및 20을 먼저 단계 (ii)에 기술된 바와 같이 HPLC상에서 정제하였다. 단계 (iii)에서 기술된 화합물 22b의 제조에서와 같이, HPLC에 의한 정제 전에 화합물 O1a 및 08a를 MeOH(25%), H2O(45%) 및 TEA(35%)로 처리하였다. 이어서 모든 화합물을 다음과 같이 활성화시켰다. 불꽃 건조 플라스크에서, 0.2 M 농도의 DMF 또는 DCM 내 정제된 기질을 함유하는 0℃의 용액에 NHS(3당량) 및 DCC(3당량)를 첨가하고, 아르곤 하에서 실온에서 밤새 교반하였다. 완료시, 혼합물을 부분적으로 농축시키고, -20℃로 냉각시키고, 여과시킨다음, 모든 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 최소 DCM 및 MeOH에 용해시키고, 냉각된 Et2O로 침전시키고, 원심분리 후 용매를 디캔팅하여 수집하였다. NMR에 의해 확인할때 잔류 디시클로헥실우레아가 검출되지 않을 때까지 Et2O로의 침전을 반복하였다. 이후, 모든 제조된 화합물을 추가 정제없이 사용하였다.
C) EDANS로 표지된 기질의 합성, 화합물 48-59의 일반적인 제조:
Figure pct00012
에탄올 아민이 미리 로딩된, 상업용으로 사용가능한 2-Cl-Trt 수지(EMD Millipore, Billerica, MA)로부터 각각의 펩티드 산을 합성하였다. 단계별 고체상 합성은 단계(i)에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 펩티드 합성 후, N-말단 FMOC를 제거하고, 서열을 DCM 내 5% TFA, 5% H2O를 사용하여 0.5시간동안 수지로부터 분열하고, 단계(ii)에 기술된 바와 같이 HPLC로 정제하였다. 정제하기 전에, 화합물 52 및 53을 DCM 내 50% TFA, 5% TIS, 5% H2O로 1시간동안 처리하였다.
D) 화합물 60 (vi)의 제조, 분해 분석을 위한 대조군의 합성:
Figure pct00013
상기한 바와 같이 제조된(미국 특허 제8802733호, Rozema et al 2015, Carlson et al. 2015), DMF(400 uL) 내 PEG12-ACit-PABC-PNP(0.052 mmol, 56 mg) 및 TEA(0.078 mmol, 10.8 μL)를 함유하는 용액에 EDANS(0.052 mmol, 14 mg)를 첨가하고, 아르곤하에 실온에서 현탁액으로서 밤새 교반하였다. 완료시 모든 용매를 진공하에 제거하고, 조 잔류물을 Et2O로 분쇄하고, CHCl3 내 MeOH(10-20%)의 구배를 용리시켜 SiO2를 사용하여 정제하였다. 수득량 58 mg(92%).
[표 1]
Figure pct00014
Figure pct00015
일부 구성성분에 대한 구조는 도 1에 도시된다.
실시예 2. 테트라펩티드 링커의 절단속도.
다양한 아미노산 조합인 테트라펩티드를 사용하여 다양한 제1 부분(R5) 및 AENA 보고(reporting) 그룹 제2 화합물(R6)을 연결하여 분석 기질(기질들)을 형성시켰다. 펩티드의 절단속도는 래트 리소좀 추출물의 존재 하에서 기질의 분해 분석에 의해 평가하였다.
HPLC에 의한 펩티드 분해 동역학에 대한 아미노산 서열의 영향을 조사하기 위해 UV-vis 모니터링에 대해 상기한 바와 같은 펩티드 기질의 C-말단에 보고 그룹을 커플링시켰다. HPLC 모니터링을 위한 보고 그룹으로 N-(2-아미노에틸)-4-니트로아닐린(AENA) 또는 N-(아미노에틸)-5-나프틸아민-1-설폰산(EDANS)을 사용하였으며, 펩티드로부터의 절단 후 흡수성도 람다 최대값도 영향을 받지 않았다. 각 펩티드 기질의 N-말단은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(PEG12) 또는 N-아세틸 갈락토사민(NAG(OR)3)으로 변형시켰다(도 1).
소화 분석: 37℃에서 배양된 1% CHAPS 및 1.8mM DTT를 함유하는, pH 5로 완충된 25mM MES 용액 내 간 리소좀(효소) 추출물(0.45㎍/㎕)을 사용하여 고정 기질 농도(0.51㎛)에서 단백질분해 소화 실험을 수행하였다. AENA 표지된 펩티드 기질을 첨가하기 전에 37℃에서 15분동안 DTT의 존재하에 효소 추출물을 활성화시켰다. 다양한 시점에서 최대 26시간, 20μl 분취액을 제거하고, TFA에 의해 pH 3으로 산성화시켰다. AENA 및 EDANS 각각에 대해 390 nm 및 335 nm에서 모니터링한 Aquasil C18 역상 컬럼(250×4.6, Thermofisher, Waltham, MA)을 갖는 HPLC를 사용하여 분획 분석을 수행하였다. 용출은 0.1% 포름산으로 완충된 아세토니트릴 및 물의 구배로 수행하였다. 변형되지 않은 리포터 분자의 생성을 측정하였다. 동결 해동주기를 최소화하기 위해, 리소좀 추출물을 -80℃에서 보관하기 전에 여러 분취액으로 분배했다. 각 연구에 새로운 분취액을 적용하여 해동 즉시 사용했다. 리소좀 추출물은 차등 밀도 구배 원심분리(Graham et al. 2000)에 의해 암컷 Hans Wistar 래트에서 유래되었다. 리소좀 추출물의 단백질 농도는 표준 BCA 단백질 분석 프로토콜에 의해 결정되었다. 화합물 60은 실험 사이의 속도의 표준화에 사용되었다(표 2-4). 다중 분석시험에서 60에 대하여 관찰된 평균 실험 속도는 123.8 nmol/h이었다. 표준화된 샘플 속도는: [(평균 화합물 60 속도 ÷ 실험 화합물 60 속도)] × 샘플 실험 속도로 계산되었다.
속도(rate)(절단속도 또는 속도(velocity)라고도 함)는 초기 선형 턴오버(turnover)동안 추정되었다(표 2). 본원에서 사용된 속도는 50% 미만의 완료(소화 속도는 50% 미만 완료시 선형으로 가정됨)시에 보고 그룹 발생의 선형 속도로 정의된다. 절단이 연속적인 1차 반응 동역학에서 벗어난 기질의 경우, 소화 완료 시점(endpoint)에서 유리된 보고 그룹의 퍼센트를 비교를 위한 척도로 사용했다.
표 2의 날짜는 A2 및 A4 위치의 벌키(bulky)한 소수성 아미노산, A3 위치의 벌키한 친수성(극성) 아미노산, 및 A1 위치의 프롤린 또는 류신을 갖는 테트라펩티드에서 가장 빠른 절단속도가 관찰되었음을 나타낸다. 일부 구현예에서, A1 위치의 아미노산은 프롤린이다.
A1 위치의 프롤린을 갖는 테트라펩티드 링커는 가장 빠른 속도를 가졌다. 화합물 30(FCitAP(서열번호 8)) 및 23(FCitFP(서열번호 12))의 프롤린을 화합물 33(FCitAA(서열번호 7)) 및 39(FCitFA(서열번호 10))의 알라닌으로 변경하면, 소화 완료까지의 속도 및 시간의 현저한 감소가 관찰되었다. 화합물 23에 나타난 바와 같이, 화합물 27의 A1의 류신을 프롤린으로 치환하면, 프롤린-함유 테트라펩티드의 속도가 상당히 증가하였다. 류신-함유 화합물 25b와 비교할때 프롤린-함유 화합물 24b에서 약간의 속도 증가가 관찰되었다.
A2 및 A4 위치에 더 큰(벌키한) 소수성 아미노산을 갖는 테트라펩티드는 일반적으로 더 높은 속도를 나타냈다. A2 위치에서 측쇄 벌크가 증가하면, 화합물 30, 26 및 23은 소화 속도를 증가시킨다. 유사하게, A4 위치에서의 측쇄 벌크의 증가는 각각 화합물 31, 28 및 23에 나타낸 바와 같이 소화 속도를 증가시켰다.
A3 위치에 벌키한 극성(중성 또는 양성으로 하전됨) 아미노산을 갖는 테트라펩티드는 보다 빠른 절단속도를 나타냈으며, 화합물 23, 24b, 32b 및 34b를 참조한다.
A1에서의 화합물 39의 N-메틸화로 인해 화합물 29가 생성되어, 소화 속도가 더 빨라지고, 더 빨리 완료되었다(도 2 참조).
[표 2]
Figure pct00016
주어진 테트라펩티드에 대해, 절단속도(변형되지 않은 H2N-R6의 유리 속도)는 화합물 R5의 동일성에 의해 유의미하게 영향을 받지 않았다. 화합물 22a 및 23은 단백질분해 소화 속도면에서 본질적으로 동등했다(표 3). 유사하게, 아세틸 변형된 NAG(OAc)3, 화합물 22a는 변형되지않은 유사체인 화합물 22b와 비교할 때 소화 속도에 무시할 수 있는 영향을 미치는 것으로 나타났다(표 3).
[표 3]
Figure pct00017
실시예 3. 아미노산 A 1 및 A 2 가 디펩티드의 소화속도에 미치는 영향. 절단속도에 대한 아미노산 A1 및 A2의 효과를 추가로 분석하기 위해 아민 말단 및 C-말단(R6) EDANS 리포터를 갖는 디펩티드 기질을 제조하였다. 디펩티드 기질은 아미노산 A2 및 A3 사이의 테트라펩티드의 제1 절단반응 다음에 테트라펩티드 링커를 모방한다. 디펩티드를 추출물로 처리하고, 소화 생성물을 상기한 바와 같이 분석하였다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, A1에 프롤린을 갖는 디펩티드는 가장 빠른 절단속도를 나타냈다. 표 2의 데이터에 따라, 절단속도는 A1 위치의 아미노산 및 A2 위치의 아미노산의 크기 및 전하에 의존하는 것으로 밝혀졌다(표 4). A1 위치의 프롤린을 갖는 펩티드는 가장 큰 절단속도를 갖는다. 또한 화합물 48, 49, 50, 52, 55 및 58에서 보이는 바와 같이, 절단속도는 A2 아미노산의 크기 및 소수성이 증가함에 따라 증가한다.
(각각 화합물 54 및 56을 생성하기 위해) 화합물 57 및 59에 페닐알라닌을 첨가하면, 추가의 아미노산에도 불구하고 소화 속도가 실질적으로 증가하였다.
[표 4]
Figure pct00018
실시예 4. 상이한 공급원의 추출물을 이용한 소화 분석. 관찰된 절단속도는 단백질분해 효소의 공급원에 의존하지 않았다. 상업적으로 이용가능한 래트 및 인간 간 S9 추출물(Xenotech LLC, Lenexa, KS)을 사용하여 소화시킬 때 증가하는 속도의 순서(23 > 30 > 37 > 42)가 유지되었다(표 5). 따라서 절단속도는 다른 종과 세포 유형에 걸쳐 유사할 것으로 예상된다.
[표 5]
Figure pct00019
실시예 5. 펩티드 링커 소화 중간체의 분석. 실시예 2 및 3의 분취액을 HPLC 및 전기-분사 이온화 질량 분석법으로 추가 분석하여 소화 중간체를 동정하였다. 이 분석은 기질 분해의 초기 내단백질분해(endoproteolytic) 반응을 위한 여러 분리되기 쉬운 위치를 나타냈다. A1 위치에 프롤린을 갖는 테트라펩티드 링커(22a, 22b, 23, 24b, 26, 28, 30, 31, 34b, 37 및 42)는 상당한 양의 H2N-Pro-R6 중간체를 생성하는 것으로 나타나지 않았으며, 즉 A1 위치의 프롤린과 A2 위치의 아미노산 사이에 유의미한 소화 반응이 나타나지 않았다. A2-프롤린-AENA 또는 유리 AENA만 관찰되었다. A1이 알라닌 또는 류신인 경우, 속도 제한 단계는 최종 잔류물의 단백질분해였다. 도 2에서 화합물 39(FCitFA(서열번호 10)) 및 29(FCitF(Nme)A(서열번호 9))에 대한 분해 중간체가 도시되어있다.
실시예 6. H 2 N -R 6 의 방출은 R 6 에서 중합체 화합물의 입체적 벌크에 의해 손상되지 않았다.
R5의 PEG 기 및 R7의 활성화 에스테르(구조식 V)를 사용하여 PEG 테트라펩티드 변형제를 합성하였다. 상기한 바와 같이, 막 활성 폴리아민(하기 참조)을 인자 Ⅶ siRNA, CDM-NAG 및 지시된 테트라펩티드(45b, 46) 또는 트리펩티드 대조군(47) 변형제로 변형시켜(미국 특허 제8137695호 및 제8426554호), 동적 다중접합 전달 중합체를 생성하였다. 이어서, 0.25 mg/kg siRNA에 접합된 1 mg/kg 중합체를 마우스에 주사하였다. 5일째, 샘플을 수집하고 인자 Ⅶ에 대해 분석하였다. 인자 Ⅶ의 넉다운은 상기한 CDM 차폐제(masking agent) 및 디펩티드-PABC 차폐제와 유사한 비율로 폴리아민으로부터 변형제의 절단을 필요로 한다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 기술된 테트라펩티드 제제(45b, 46)는 DPC-매개된 siRNA 전달과 함께 사용되는 경우(미국 특허 제8137695호 및 제8426554호), 효과적인 변형제로서 막 활성 폴리아민을 방출하기 위한 세포내 신속한 절단을 나타낸다. 효과적인 시험관내 녹다운은 또한 PEG 기의 존재가 생체내에서 링커의 소화에 역효과를 미치지 않았다는 것을 나타낸다. PEG12로 기능화된 테트라펩티드로 변형된 동적 다중접합 전달 중합체에 있어서, 생체내에서의 넉다운 증가 순서(45b > 46 > 47)는 시험관내 동역학 결과와 상관 관계가 있었다. 동역학 평가를 위한 시험관내 모델의 검증은 동물 연구에서 얻어진 결과에 의해 나타났다.
[표 6]
Figure pct00020
실시예 7. 생체내 불안정성 분석. 테트라펩티드는 링커를 DPC-매개된 siRNA 전달을 위한 변형제로 시험함으로써 생체내 불안정성 및 가역성을 분석하였다.
A) RNA 간섭 트리거 ( siRNA ).
siRNA 합성: 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 다음 서열의 대조군 siRNA를 합성하였다.
Figure pct00021
(소문자, 2'-OMe 치환; f, 2'-F 치환; d, 2'-데옥시 치환; 및 s, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합).
DBCO 디설파이드에 의한 아민 siRNA의 변형: 4℃에서 5' 아민-변형된 siRNA와 1중량 당량(wt. eq.)의 디벤조시클로옥틴-S-S-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(ALDRICH 카탈로그 # 761532) 및 0.36 중량% 당량의 수중 NaHCO3를 16시간동안 반응시켜, DBCO-변형된 siRNA를 합성하였다. 그후, 에탄올 9 부피를 첨가하고, -80℃에서 2시간동안 배양하여, 변형된 siRNA를 침전시켰다. 침전물을 RN아제-유리 PBS 완충액에 용해시키고 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
B) 중합체 합성 :
N- Boc - 에톡시에틸아민 아크릴레이트와 sec-부틸 아크릴레이트(EAB)의 RAFT 공중합체: 부틸 아세테이트 내 AIBN(1.00 mg/mL) 및 RAFT 제제 CPCPA(10.0 mg/mL)의 용액을 제조하였다. 단량체 몰 공급율은 55% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트, 45% sec-부틸 아크릴레이트(CAS # 2998-08-5)였다. 이론적인 Mw는 100,000이었다.
N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트(0.890g, 3.43 mmol) sec-부틸 아크릴레이트(0.391 mL, 0.360 g, 2.81 mmol) CPCPA 용액(0.350 mL, 0.0125 mmol), AIBN 용액(0.308 mL, 0.00188 mmol) 및 부틸 아세테이트(5.3 mL)를 교반 막대가 달린 20 mL 유리 바이알에 넣었다. 바이알을 셉타 캡(septa cap)으로 밀봉하고, 용액을 1시간동안 출구로서의 제2 주사기를 갖는 긴 주사기를 사용하여 질소로 버블링시켰다. 주사기를 제거하고, 오일 배스(oil bath)를 사용하여 바이알을 16시간동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 후, 헥산(35 mL)을 그 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 4,400 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상등액 층을 조심스럽게 디캔팅하고, 바닥(고체 또는 겔형) 층을 헥산으로 헹구었다. 이어서, 바닥 층을 DCM(7 mL)에 재용해시키고, 헥산(40 mL)에 침전시키고, 한번 더 원심분리했다. 상등액을 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹군 후, 중합체를 감압하에 수시간동안 건조시켰다. 조 EAB 공중합체의 수율은 0.856 g이었다. 조 중합체의 샘플을 다중-각 광산란(MALS)을 위해 취하였다. 건조된 조 공중합체를 DCM(100 mg/mL)에 용해시켰다. 담점(cloud point)에 도달하기 직전까지 헥산을 첨가하였다. 생성된 밀키 용액(milky solution)을 원심분리하였다. 바닥층을 추출하고, 헥산으로 완전히 침전시켰다. 분획물을 원심분리한 후, 공중합체를 분리시키고, 진공하에 건조시켰다. EAB 공중합체의 분리된 분획물의 수득량은 0.478g이었다. 1H-NMR 및 MALS을 위해 분획화된 공중합체의 샘플을 취하였다. 1H-NMR에 의해 측정된 조성은 61% N-Boc-에톡시에틸아민 및 아크릴레이트, 39% sec-부틸 아크릴레이트였다.
MALS 분석: 약 10 mg의 공중합체를 0.5 mL 75% 디클로로메탄, 20% 테트라히드로푸란 및 5% 아세토니트릴에 용해시켰다. 분자량 및 다분산도(PDI)는 Jordi 5 μm 7.8×300 혼합 베드 LS DVB 컬럼을 사용하여 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Heleos II 다각도 광산란 검출기를 사용하여 측정하였다. 조 중합체: MW: 59,000(PDI 1.3), 분별된 중합체: MW 70,000(PDI:1.1).
탈보호 /투석: 건조된 샘플을 1시간동안 아세트산(약 7ml) 내 2M HCl로 처리하여, BOC 보호기를 제거하였다. 이어서, 반응물을 20 ml의 물로 희석하고, 10 내지 15분동안 교반하였다. 이어서 분획물을 고염(high salt), 고염 및 물에서 각각 15시간, 8시간 및 15시간동안 3500 MW 투석 튜빙으로 투석하였다. 그런 다음 분획물을 50ml 원심분리 튜브로 옮기고 3일 동안 또는 건조될 때까지 동결건조시켰다. 건조 샘플을 추가 연구를 위해 수중에서 20 mg/ml로 성장시켰다.
C) 가역적으로 변형된 siRNA -폴리아민 접합체의 형성: 5 mM pH 8.0 HEPES 완충액 내 폴리아크릴레이트 EAB를 N-히드록시숙신이미딜 활성화 PEG4 아지드(Quanta Biodesign제 아지도-dPEG4-NHS 에스테르)에 의해 1.5 중량%로 변형시켜, 이후에 siRNA 부착을 위한 아지드 기를 제공하였다. 그리고나서 아지드-변형된 중합체를 60 mg/mL HEPES 염기내에서 5 mg/mL로 희석하였다. 이 용액에 지시된 프로테아제-절단가능한 PEG 변형 제제(본원에 기술된 테트라펩티드제 또는 PEG12-FCit-PABC-PNP(8426554)) 15 mg/mL(3 중량 당량)을 첨가하여, 사용가능한 아민 기의 40-50%를 변형시켰다. 1시간 후, DBCO-변형된 설치류 인자 VII siRNA(중합체에 대해 0.25 중량 당량)를 중합체 용액에 첨가하였다. 밤새 배양 후, N-아세틸갈락토사민 유도체 CDM-NAG, NAG-A4-A3-A2-A1-NHS 또는 NAG-ACit-PABC-PNP의 사용가능한 아민 기에 대해 몰 과량을 첨가함으로써 접합체를 추가로 변형시키고(미국 특허 제8426554호, Rozema 등, 2015, Carlson et al. 2015), 30분동안 배양하여, 남은 중합체 EAB 아민을 가역적으로 변형시켰다.
D) 생체내 분석.
마우스 및 주사 과정. 6 내지 8주령의 수컷 Wistar Han 래트와 암컷 ICR 마우스를 Harlan Sprague-Dawley(Indianapolis, IN)로부터 입수했다. 동물은 Arrowhead Madison Inc.의 동물 관리 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee)가 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 처리했다. 설치류는 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암 사이클에서 유지되었다(Harlan Teklad Rodent Diet, Harlan, Madison, WI). 동물에게 0.25 mg/kg siRNA에 접합된 1 mg/kg 중합체를 주사하였다. 샘플을 주사 5일 후에 수집하였다.
혈청 FVII 활성 측정. 혈청 샘플은 표준 과정에 따라 0.109 M 시트르산 나트륨 항응고제(1 부피)를 함유하는 미세원심분리 튜브에 턱밑 출혈로 혈액을 채취하여 준비했다. 혈청에서의 FVII 활성은 제조자의 권고에 따라, 시험 키트(BIOPHEN VII, Aniara, Mason, OH)를 사용한 발색법으로 측정하였다. 비색질 발색의 흡광도는 Tecan Safire-2 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.
표 7의 데이터는 테트라펩티드 변형된 DPC 전달 중합체가 생체내에서 siRNA의 전달에 효과적이었음을 나타낸다. 또한, 테트라펩티드제는 상기한 디펩티드-PABC 변형제만큼 효과적이었다. 단백질분해성 FCitFP(서열번호 12) 사량체를 함유하는 접합체 함유 44a 및 44b는 PABC 매개된 녹다운 분해를 이용하여 접합체에 동등한 활성을 나타내었다(표 7). 효과적인 siRNA 전달은 폴리아민의 효과적인 변형 및 타겟팅, 및 세포로의 전달 후에 간세포에서 중합체의 성공적인 소화 및 방출을 나타낸다.
생체내 활성 및 기능은 FCitFP(서열번호 12) 변형된 DPC 전달 중합체에 의한 시험관내 소화 속도 데이타와 상관 관계가 있으며, 이는 FCitAP 변형된 DPC 전달 중합체보다 개선된 siRNA 전달을 나타낸다. 따라서, 시험관내 소화 속도 데이터는 생체내 소화 및 방출 데이터를 정확하게 예측했다.
[표 7]
Figure pct00022
실시예 8. RGD는 테트라펩티드 및 PEG- 테트라펩티드 변형된 DPC 전달 중합체를 모방한다. A) APN 1170-100A(100A) 및 APN 1203-006(006) 양친매성 막 활성 폴리아민의 합성.
Figure pct00023
i) 재료. 2,2'-아조비스(2,4-디메틸 발레로니트릴)(V-65, 라디칼 개시제)는 Wako Pure Chemical Industries로부터 구입하였다. 프로필 아크릴레이트는 Polysciences Inc.에서 구입했다. N-Boc-에톡시-에틸아민 아크릴레이트는 WuXi Inc.로부터 입수하였다. 2-(도데실티오-카르보노티오일티오)-2-메틸프로피온산(DDMAT, RAFT 제제), 1,1'-아조비스-(시클로-헥산카르보니트릴)(ACHN), 1-에틸피페리딘 하이포포스파이트(EPHP), 펜타플루오로페놀, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N,N-디이소프로필-에틸아민은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 0-(2-아미노에틸)-0'-(2-아지도에틸)트리에틸렌 글리콜(아지도-PEG4-아민)은 Biomatrik Inc.로부터 구입하였다.
ii). N- Boc - 에톡시에틸아민 아크릴레이트와 프로필 아크릴레이트(EAP)의 RAFT 공중합체. 부틸 아세테이트 내 V-65(2 mg/mL) 및 RAFT 제제 DDMAT(10 mg/mL)의 용액을 제조하였다. 단량체 몰 공급물은 52% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트, 48% 프로필 아크릴레이트였다. 이론적인 Mw는 75,000이었다. RAFT 제제(DDMAT) 대 개시제(V-65)의 몰비는 6.67:1이었다.
N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트(1.778 g, 6.86 mmol), 프로필 아크릴레이트(0.794 mL, 0.722 g, 6.33 mmol), DDMAT 용액(1.215 mL, 0.0333 mmol), V-65 용액(0.621 mL, 0.005 mmol) 및 부틸 아세테이트(10.2 mL)를 교반 막대가 달린 20 mL 유리 바이알에 첨가하였다. 바이알을 셉타 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간동안 출구로서의 제2 바늘을 갖는 긴 바늘을 사용하여 질소로 버블링시켰다. 바늘을 제거하고, 바이알을 교반하면서 24시간동안 50℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 두개의 50 mL 원심분리 튜브 사이에서 동일하게 전달한 후, 헥산(35 mL)을 두 튜브에 첨가하였다. 상기 용액을 4400 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상등액 층을 조심스럽게 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹구었다. 각 튜브의 바닥 층을 디클로로메탄(7 mL)에 재용해시키고, 헥산(40 mL)에 침전시키고, 한번 더 원심분리했다. 상등액을 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹구고, 층을 50 mL 원심분리 튜브에 조합시키고, 중합체를 감압하에 수시간동안 건조시켰다. 조 EAP 공중합체의 수득량은 2.1 g이었다. 공중합체의 샘플을 다중-각 광산란(MALS) 및 1H-NMR을 위해 취하였다.
중합체 006: 1H-NMR로 측정된 조성은 55% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 45% 프로필 아크릴레이트였다. MALS로 측정한 006의 Mw는 58,600 g/mol이었고, 다분산 지수(PDI)는 1.04이었다.
중합체 100A: 1H-NMR에 의한 조성: 56% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 44% 프로필 아크릴레이트. MALS에 의한 MW: 65,150, PDI는 1.122이었다.
iii). 라디칼 유도된 ω- 말단기 제거(중합체 006만 해당됨 ). 1,1'-아조비스-(시클로헥산카르보니트릴)(ACHN, 20 mg/mL) 및 1-에틸피페리딘 하이포포스파이트(EPHP, 100 mg/mL)의 용액을 톨루엔에서 제조하였다. 교반 막대가 달린 40 mL 유리 바이알에 EAP(2 g, 0.035 mmol), ACHN(0.213 mL, 0.5 eq, 0.0174 mmol), EPHP(1.25 mL, 20 eq, 0.697 mmol) 및 톨루엔(25.2 mL)을 첨가하였다. 상기 바이알을 셉타 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간동안 출구로서의 제2 바늘을 갖는 긴 바늘을 사용하여 질소로 버블링시켰다. 바늘을 제거하고, 바이알을 2시간동안 100℃로 가열했다. 상기 용액을 실온으로 냉각시키고, ~20 ㎖ 톨루엔을 회전 증발에 의해 제거하였다. 남아있는 용액을 50 mL 원심분리 바이알에 옮기고, 헥산(35 mL)을 첨가하였다. 상기 용액을 4400 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상등액 층을 조심스럽게 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹구었다. 이어서, 바닥 층을 디클로로메탄(7 mL)에 재용해시키고, 헥산(40 mL) 중에 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상등액을 디캔팅하고, 바닥층을 헥산으로 헹구고, 중합체를 약 1시간동안 감압하에 건조시켰다. 중합체를 메틸 tert-부틸 에테르(80 mL)에 용해시키고, 분액 깔대기로 옮겼다. 그런 다음 용액을 3×30 mL 부피의 H2O, 이어서 3×30 mL 부피의 포화 NaCl로 세척하였다. 이어서, 중합체 용액을 황산나트륨상에서 건조시키고, 0.45 ㎛ GHP 필터를 통해 진공 여과하였다. 회전 증발 및 고진공을 통해 MTBE를 제거하였다. UV 분광광도계를 사용하여 말단기 제거를 모니터링하기 위해 샘플을 취하였다. 말단기 제거율은 99%로 계산되었다. MALS, GC-FID 및 1H-NMR을 위한 샘플을 취하였다. 1H-NMR에 의한 006의 조성은 55% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 45% 프로필 아크릴레이트였다. GC-FID에 의해 측정된 006의 전환율은 N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트의 경우 81.4%이고, 프로필 아크릴레이트의 경우 77.3%였다. GC-FID 전환에 의해 측정된 100A의 전환율은 N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트의 경우 87%이고, 프로필 아크릴레이트의 경우 83%였다. MALS에 의해 결정된 중합체 006에 대한 Mw는 57,700 g/mol이었고, 다분산 지수(PDI)는 1.06이었다.
iv). α- 말단기의 펜타플루오로페놀 활성화. 교반 막대가 달린 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 EAP 중합체(2 g, 0.0347 mmol), 펜타플루오로페놀(63.8 mg, 0.3466 mmol), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(71.5 mg, 0.3466 mmol), 및 디클로로메탄(40 mL)을 첨가하였다. 플라스크를 고무 격벽으로 마개하고, 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하였다. 용액을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 추가의 펜타플루오로페놀(63.8 mg, 0.3466 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(71.5 mg, 0.3466 mmol)를 첨가하고, 플라스크를 고무 격벽으로 마개하고, 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하였다. 용액을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 중합체를 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 디클로로메탄에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 에틸 아세테이트에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 고체가 일정한 중량에 도달할 때까지 중합체 침전물을 고진공하에 건조시켰다.
v). α- 말단기의 아지드 기능화. 고무 격벽 및 교반 막대가 구비된 100 ml 둥근 바닥 플라스크에서, 이전 단계로부터의 중합체(1.9 g, 0.0329 mmol)를 디클로로메탄(38 mL)에 용해시켰다. 교반하에 아지도-PEG4-아민(86.4 mg, 0.3293 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(46.8 mg, 63.1 μL, 0.3622 mmol)을 플라스크에 첨가하였다. 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 추가의 아지도 PEG4 아민(86.4 mg, 0.3293 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(46.8 mg, 63.1 μL, 0.3622 mmol)을 플라스크에 첨가하고, 시스템을 N2 가스로 퍼징하고, 반응물을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 중합체를 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 디클로로메탄에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체 침전물을 고체가 일정한 중량에 도달할 때까지 고진공하에 건조시켰다. 아지드로 기능화된 EAP의 수득량은 1.77g이었다. 다중-각 광산란(MALS) 및 1H-NMR에 대해 공중합체의 샘플을 취하였다.
중합체 006: 1H-NMR에 의해 측정된 조성은 56% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 44% 프로필 아크릴레이트였다. MALS에 의해 결정된 Mw는 60,330 g/mol이었고, 다분산 지수(PDI)는 1.05이었다.
중합체 100A: 1H-NMR에 의한 조성은 56% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 44% 프로필 아크릴레이트였다. MALS에 의해 결정된 Mw: 64,430, PDI는 1.217이었다.
모노-아지드: 용어 "모노-아지드" 또는 "모노-아지드 중합체"는 상기 과정 중 단계 D 및 E가 수행되고, 아지드 기가 중합체의 α-말단기에 커플링된 것을 나타낸다.
vi). Boc 탈보호 및 접선 유동 여과. 100 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 아세트산(28 mL) 내 2M HCl을 아지드로 기능화된 EAP 공중합체(1.67 g, 0.0277 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 탈이온수(56 mL)를 첨가하고, 10분동안 교반하였다. 그런 다음 접선 유동 여과 시스템(KrosFlo Research)이 장착된 mPES 30kD 115cm2 필터 모듈을 사용하여, 10 당량 부피의 5 mM 포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5)으로 상기 용액을 즉시 교환했다. 이어서, 상기 장치를 사용하여 상기 용액을 최종 부피 55 mL로 농축시켰다. 5.1의 pH 값이 기록되었다. 헤드스페이스 가스 크로마토그래피에 의한 농도 측정을 위해 샘플을 채취하였다. 분취액을 동결 건조시킨 다음, 1H-NMR 분석을 위해 10mg/mL의 농도로 산화중수소 내 33.3% 아세토니트릴에서 재구성하였다. 이론적 MW는 006 및 100A에 대해 각각 43,026 g/mol 45,765 g/mol로 계산되었다.
vii). 유사 기술을 사용하여, 유사한 양친매성 막 활성 폴리아민을 쉽게 형성할 수 있다. 특히, 분자량(Mw)이 40-120k 보호되고(25k 내지 85k 탈보호됨), PDI 범위가 1.03 내지 1.2이고, 35% 아민 단량체/65% 소수성기 단량체 대 70% 아민 단량체/30% 소수성 기 단량체의 단량체 비율을 갖는 양친매성 막 활성 폴리아민.
B) APN 1095-126(126)의 합성.
Figure pct00024
APN 1095-126의 합성은 100A 및 006의 합성에 사용된 트리티오카르보네이트 부분 RAFT 제제 및 V-65 RAFT 개시제와 대조되는, 디티오벤조에이트 부분 RAFT 제제 및 AIBN RAFT 개시제를 사용하였다. 이 중합을 위한 조건은 상이한 가열 온도 및 시간을 필요로 하였다. 또한, 이 중합체는 분별 침전을 필요로 했다. 중합체는 말단 캡핑되지 않았지만, 아지드 첨가 방법은 100A 및 006과 동일하였다.
i). 재료. 프로필 아크릴레이트는 Polysciences Inc.에서 구입했다. N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트는 WuXi Inc.로부터 입수했다. 4-시아노-4-(페닐카르보노티오일티오) 펜탄산(CPCPA, RAFT 제제), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN, 라디칼 개시제), 펜타플루오로페놀, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 0-(2-아미노에틸)-0'-(2-아지도에틸)트리에틸렌 글리콜(아지도-PEG4-아민)은 Biomatrik Inc.로부터 구입하였다.
ii). N- Boc - 에톡시에틸아민 아크릴레이트와 프로필 아크릴레이트(EAP)의 RAFT 공중합체. 하기 과정을 8회 반복하여 총 4.5513g의 분획화된 EAP 공중합체를 수득하였다. 부틸 아세테이트 내 AIBN(1.035 mg/mL) 및 RAFT 제제 CPCPA(50.54 mg/mL)의 용액을 제조하였다. 단량체 몰 공급율은 52% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트, 48% 프로필 아크릴레이트였다. 이론적 Mw는 75,000이었다. RAFT 제제(CPCPA) 대 개시제(AIBN)의 몰비는 6.67:1이었다.
N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트(1.7879g, 6.9mmol), 프로필 아크릴레이트(0.774mL, 0.7121g, 6.24mmol), CPCPA 용액(0.184mL, 0.0333mmol), AIBN 용액(0.793mL, 0.005mmol) 및 부틸 아세테이트(11.02 mL)를 교반 막대가 달린 20 mL 유리 바이알에 첨가하였다. 바이알을 셉타 캡으로 밀봉하고, 1시간동안 출구로서의 제2 바늘을 갖는 긴 바늘을 사용하여 용액을 질소로 버블링시켰다. 바늘을 제거하고, 바이알을 교반하면서 50℃로 24시간동안 가열했다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 헥산(35 mL)을 첨가하였다. 상기 용액을 4400 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상등액 층을 조심스럽게 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹구었다. 각 튜브의 바닥 층을 디클로로메탄(7 mL)에 재용해시키고, 헥산(40 mL)에 침전시키고, 한번 더 원심분리했다. 상등액을 디캔팅하고, 바닥 층을 헥산으로 헹구고, 중합체를 감압하에 수시간동안 건조시켰다. 조 EAP 공중합체의 수득량은 1.734 g이었다. 다각도 광산란(MALS) 및 1H-NMR을 위해 조 공중합체의 샘플을 취하였다. 건조된 조 공중합체를 DCM(100 mg/mL)에 용해시켰다. 담점(cloud point)에 도달하기 직전까지 헥산을 첨가하였다. 생성된 밀키 용액(milky solution)을 원심분리하였다. 바닥층을 추출하고, 헥산으로 완전히 침전시켰다. 분획물을 원심분리한 후, 공중합체를 분리시키고, 진공하에 건조시켰다. EAP 공중합체의 분리된 분획물의 수득량은 0.602g이었다. 1H-NMR 및 MALS을 위해 분획화된 공중합체의 샘플을 취하였다. 1H-NMR에 의해 측정된 조성은 56% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 44% 프로필 아크릴레이트였다. MALS에 의해 결정된 Mw는 62,010 g/mol이었고, 다분산 지수(PDI)는 1.14였다.
iii). α- 말단기의 펜타플루오로페놀 활성화. EAP 중합체(2 g, 0.0347 mmol), 펜타플루오로페놀(63.8 mg, 0.3466 mmol), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(71.5 mg, 0.3466 mmol) 및 디클로로메탄(40 mL)을 교반 막대가 달린 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 고무 격벽으로 마개하고, 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하였다. 용액을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 추가의 펜타플루오로페놀(63.8 mg, 0.3466 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(71.5 mg, 0.3466 mmol)를 첨가하고, 플라스크를 고무 격벽으로 마개하고, 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하였다. 용액을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 중합체를 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 디클로로메탄에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 에틸 아세테이트에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체 침전물을 고체가 일정한 중량에 도달할 때까지 고진공하에 건조시켰다.
iv). α- 말단기의 아지드 기능화. 고무 격벽 및 교반 막대가 구비된 100 ml 둥근 바닥 플라스크에서, 이전 단계로부터의 중합체(1.9 g, 0.0329 mmol)를 디클로로메탄(38 mL)에 용해시켰다. 교반하에 아지도-PEG4-아민(86.4 mg, 0.3293 mmol) 및 N,N-디이소프로필-에틸아민(46.8 mg, 63.1 μL, 0.3622 mmol)을 플라스크에 첨가하였다. 시스템을 질소로 15분동안 퍼징하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 추가의 아지도 PEG4 아민(86.4 mg, 0.3293 mmol) 및 N,N-디이소프로필-에틸아민(46.8 mg, 63.1 μL, 0.3622 mmol)을 플라스크에 첨가하고, 시스템을 N2 가스로 퍼징하고, 실온에서 반응물을 3시간동안 교반하였다. 중합체를 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 중합체를 최소 디클로로메탄에 용해시키고, 헥산(~10× 부피)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 디캔팅하였다. 고체가 일정한 중량에 도달할 때까지 중합체 침전물을 고진공하에 건조시켰다. 아지드로 기능화된 EAP의 수득량은 1.77g이었다. 다각도 광산란(MALS) 및 1H-NMR을 위해 공중합체의 샘플을 취하였다. 1H-NMR에 의해 측정된 조성은 56% N-Boc-에톡시에틸아민 아크릴레이트 및 44% 프로필 아크릴레이트였다. MALS에 의해 결정된 Mw는 66,670 g/mol이고, 다분산 지수(PDI)는 1.11이었다.
v). Boc 탈보호 및 접선 유동 여과. 100 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 아세트산(28 mL) 내 2M HCl을 아지드로 기능화된 EAP 공중합체(1.67 g, 0.0277 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 탈-이온수(56 mL)를 첨가하고, 10분동안 교반하였다. 그런 다음 접선 유동 여과 시스템(KrosFlo Research)이 장착된 mPES 30kD 115cm2 필터 모듈을 사용하여 상기 용액을 10 당량의 5 mM 포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5)으로 즉시 교환했다. 이어서, 상기 용액을 상기 장치를 사용하여 최종 부피 55 mL로 농축시켰다. 5.1의 pH 값이 기록되었다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피에 의한 농도 측정을 위해 샘플을 채취하였다. 분취액을 동결건조시킨 후, 1H-NMR 분석을 위해 10mg/mL의 농도로 산화중수소 내 33.3% 아세토니트릴에서 재구성하였다. 이론적 MW는 43,026 g/mol로 계산되었다.
C). RGD - PEG n - FCitFP - TFP 및 PEG n - FCitFP - TFP 제 합성. Fmoc-프롤린-OH로 예비로딩된 2-Cl-Trt 수지를 사용하여 일반적인 Fmoc 화학적 고체상 합성을 사용하여 변형제 전구체 (di-Boc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFPro-COOH를 제조하였다. (각각의 단계에서 Fmoc 탈보호 후) 수지-Pro-Fmoc에 순차적으로 하기를 첨가하였다: FMoc-Phe-OH, Fmoc-Cit-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-NH-PEGn-COOH, 4-(N-Fmoc-p-아미노페녹시)-부티르산(APBA), Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH 및 diboc-m-구아니디노 벤조산.
(diboc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFPro-COOH(458 mg, 0.200 mmol) 및 TFP(66.5 mg, 0.400 mmol)를 무수 DCM(5.0 mL)에 용해시키고, 아르곤하에 교반하면서 얼음/수조에서 0℃로 냉각하였다. EDC(77 mg, 0.400 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 얼음/수조에서 30분동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(8.5:1.5 CHCl3:MeOH)로 모니터링하고, 90분 후에 완료되었으며, TLC에 의해 출발 물질이 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 DCM으로 전체 부피 100 mL로 희석하고, DI H2O(pH=5)로 3×40 mL로 세척하고, 1×40 mL 포화 NaCl 수용액으로 세척하였다. 이어서, 유기물을 Na2S04 상에서 건조시키고, 회전증발기(rotovap) 상에서 농축시켜 황갈색/오렌지색 발포체 448 mg(92% 수율)을 수득하였다. 구조를 1H NMR 및 ESI MS(PEG20(n=20)의 경우 상기 도시된 반응식)에 의해 확인하였다.
Figure pct00025
(diboc)RGD(OtBu)-PEGn-FCitFPro-TFP(497 mg, 0.204 mmol)을 [9.25:0.75:0.50]TFA:H20:티오아니솔(5.0mL)에 용해시키고, 실온에서 45℃의 밀봉된 플라스크에서 교반하였다. 출발 물질과 관련된 질량 또는 부분적으로 탈보호된 중간체가 관찰되지 않은 MS(ESI, scan neg, 300-3000)에 의해 반응 완료를 확인하였다. 이어서, 반응 혼합물을 디에틸 에테르 45 mL 중에 침전시키고, 스펀-다운(spin down)하고, 상등액을 부어 내고, 2×10 mL 디에틸 에테르로 세척하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. H2O 및 ACN 내 이동상 0.1% TFA를 갖는, Thermo Aquasil C18 5um 세미 예비 컬럼을 사용하여 예비 HPLC 상에서 최종 생성물을 정제하였다. 39-(5)-39-(35)-43-(5)-95-(10)-95-(2)-39-(5)-39(%B로 표시됨)의 구배에서 수행된 [61:39] H2O:ACN 내 0.1% TFA 3.0 mL에 용해된 50 mg의 조 물질을 각각 주입하였다. 주입을 위한 각 샘플을 주입 15분 이내에 제조(용해)하고, 양성 분획물을 한 플라스크에 풀링하고, 그 날의 마지막 주입이 끝날 때까지 냉동고에서 차가운 상태로 유지하였다. 이어서, 양성 분획물을 32℃의 배쓰 온도로 회전증발기 상에서 농축 건조시킨 다음, ACN/톨루엔으로 2회 추적하고, ACN으로 3회 추적한후 고진공에서 밤새 건조시켰다. 257 mg 주입 원료 중 180 mg(70%)이 순수한 물질로 분리되었다(PEG20(n=20)의 경우 상기 도시된 반응).
Figure pct00026
4-(N- Fmoc -p- 아미노페녹시 )-부티르산 1 합성. DMF(75 mL) 내 에틸 4-브로모부티레이트(8.45 ml, 59 mmol) 및 K2CO3(7.5 g, 54 mmol)과 p-니트로-페놀(2)(7.5 g, 53.9 mmol)을 조합하였다. 혼합물을 100℃에서 2시간동안 교반하였다. DMF를 제거하고, 조 생성물(crude product)을 2N NaOH 및 메탄올의 3:1 혼합물의 혼합물로 희석시키고, 실온에서 4시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 6M HCl로 산성화시켰다. 백색 침전물을 수집하여 4-(p-니트로페닐옥시)-부티르산 3:(10.9 g, 수율 90%)을 수득하였다.
암모늄 포르메이트(35g, 555mmol)을 사용하여 4-(p-니트로페닐옥시)-부티르산 3(37.1 g, 165 mmol)을 MeOH 내에 용해하고, 10% Pd/C(Degussa Type)(3.5g)을 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 밤새 환류시켰다. 반응물을 셀라이트 여과하여 생성물 4-(p-아미노페닐옥시)-부티르산 4(30.5 g, 95% 수율)의 적갈색 고체를 수득하였다.
H2O(450 mL) 및 THF(300 mL) 내 포화 NaHCO3 수용액(3.36 g, 40 mmol)의 6:4 혼합물에 4-(p-아미노페닐옥시)-부티르산 4(5.1 g, 26 mmol)를 용해하여, 백색 슬러리를 제조하였다. Fmoc-OSu(8.82 g, 26.1 mmol)를 첨가하고, 반응물을 4시간동안 교반하였다. 아세톤을 제거하고, 반응물을 산성화시키고(HCl), 회백색의 침전물을 수집하고, 1N HCl에서 분쇄하여 9.6g의 생성물 4-(N-Fmoc-p-아미노페녹시)-부티르산 1(88% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00027
Riches AG et al. Tetrahedron(2012) 68, p. 9448-9455에 따라 diBoc -m- 구아니디노 -벤조산 5를 합성하였다.
유사한 화학을 사용하여 PEGn-FCitFP 변형제를 제조하였다.
D) 중합체의 차폐(변형) 실온에서, 모노-아지드-중합체를 프로테아제 절단가능한-RGD 제제(RGD-PEG8-ACit-PNP, RDG-PEG8-FCitFP-TFP, RGD-PEG15-FCitFP-TFP, RGD-PEG19-FCitFP-TFP, 또는 RGD-PEG20-FCitFP-TFP)와 50 mM HEPES, pH 8.5 완충액 내 1:0.125, 1:0.25, 1:0.5, 1:1, 1:1.5, 1:2(중합체:RGD)의 중량비로 4시간동안 반응시켰다. 이어서, 실온에서, 변형된 중합체를 프로테아제 절단가능한-PEG 제제(PEG6-ACit-PABC-PNP, PEG12-ACit-PABC-PNP, PEG12-FCit-PABC-PNP, PEG12-FCitFP-TFP)와 50 mM HEPES, pH 8.5 완충액 내 1:8(중합체:PEG)의 중량비로 2시간동안 반응시켰다. 실온에서, 5일 동안 100 mM 아세트산 나트륨-아세트산 완충 용액, pH 5.0 내 변형된 중합체에 1:0.3(중합체:알킨-RNAi 트리거)의 중량비로 알킨-RNAi 트리거를 첨가하였다. 완성된 접합체를 TFF 정제하고, 접합 효율을 측정하였다.
E) 테트라펩티드 변형된 DPC 전달 중합체를 사용한 생체내 전달 평가. 신장 RCC 종양-보유 마우스를 등장성 글루코스(G1) 또는 지시된 Hif2α-ITG-DPC(Hif2α-ITG-DPC = Hif2α RNAi 트리거-전달 중합체 접합체)의 단일 꼬리 정맥 주사로 치료하였다. 전달 중합체를 RGD 리간드 및 PEG 변형제로 변형시킨다. 마우스를 주사 후 72시간 후에 안락사시키고, 전체 RNA를 제조사의 권고에 따라 Trizol 시약을 사용하여 신장 종양으로부터 제조하였다. 이하에 기술된대로 RT-qPCR에 의해 상대적 HiF2α mRNA 수준을 측정하고, 전달 완충액(등장성 글루코스)으로만 처리한 마우스와 비교하였다(표 8).
[표 8]
Figure pct00028
실시예 9. 기술된 테트라펩티드 링커의 유용성을 설명하는 추가의 구조식.
Figure pct00029
<110> ARROWHEAD PHARMACEUTICALS, INC. <120> BIOLOGICALLY CLEAVABLE TETRAPEPTIDE LINKING AGENTS <130> IP-ARROW1709 <150> US 62/168244 <151> 2015-05-29 <150> US 62/235833 <151> 2015-10-01 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 1 Ala Xaa Ala Ala 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = citrulline <400> 2 Ala Xaa Ala Pro 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = citrulline <400> 3 Ala Xaa Phe Pro 1 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor 7 siRNA sense strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide <400> 4 gcaaaggcgu gccaacucat 20 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa = Citrulline <400> 5 Xaa Ala Ala Ala 1 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor 7 siRNA antisense strand <220> <221> modified_base <222> (2)..(19) <223> ribonucleotide <400> 6 tgaguuggca cgccuuugct t 21 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 7 Phe Xaa Ala Ala 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 8 Phe Xaa Ala Pro 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa = N-methyl alanine <400> 9 Phe Xaa Phe Xaa 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 10 Phe Xaa Phe Ala 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 11 Phe Xaa Phe Leu 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 12 Phe Xaa Phe Pro 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 13 Phe Xaa Val Pro 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <400> 14 Phe Asp Phe Pro 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <400> 15 Phe Lys Phe Leu 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <400> 16 Phe Lys Phe Pro 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <400> 17 Phe Asn Phe Pro 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <400> 18 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetrapeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Citrulline <400> 19 Val Xaa Phe Pro 1

Claims (33)

  1. 하기 구조식으로 나타낸 구조를 포함하는 테트라펩티드 링커:
    [구조식 I]
    Figure pct00030
    ,
    [구조식 Ⅱ]
    Figure pct00031
    , 또는
    [구조식 Ⅲ]
    Figure pct00032

    (여기에서,
    R4는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 측쇄이며,
    R3은 하전되지않은 친수성 또는 염기성 친수성 L 아미노산의 측쇄이며, 및
    R2는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산의 측쇄이다.)
  2. 제1항에 있어서, R4 및 R2는 독립적으로 -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3 또는 -CH2C6H6인, 테트라펩티드 링커.
  3. 제1항에 있어서, R3은 -(CH2)3NHC(=O)NH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3 + 및 -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2인, 테트라펩티드 링커.
  4. 제1항에 있어서, R4 및 R2은 독립적으로 -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3 또는 -CH2C6H6이고, R3은 -(CH2)3NHC(=O)NH2, -CH2CONH2, -(CH2)4NH3 + 및 -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2인, 테트라펩티드 링커.
  5. 제1항에 있어서, 상기 테트라펩티드 링커는 하기 구조식으로 나타낸 구조를 포함하는, 테트라펩티드 링커:
    Figure pct00033
  6. 하기 구조식을 포함하는 조성물:
    [구조식 Ⅳ]
    R5-A4-A3-A2-A1-R6
    (여기에서,
    R5는 제1 화합물이고,
    R6은 아민-함유 제2 화합물이며,
    A4는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
    A3은 하전되지않은 친수성 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
    A2는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
    A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, 및
    A1은 아미드 결합을 통해 R6에 연결된다.)
  7. 제6항에 있어서, R4 및 R2는 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, R3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, R4 및 R2가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고, R3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, R4 및 R2가 모두 L-페닐알라닌이고, R3이 L-시트룰린이며, R1이 프롤린인, 조성물.
  11. 제6항에 있어서, R6이 폴리아민인, 조성물.
  12. 제6항에 있어서, R6이 막 활성 폴리아민인, 조성물.
  13. 하기 구조식을 포함하는 조성물:
    (R5-A4-A3-A2-A1)n-P
    (여기에서,
    R5는 타겟팅 기 또는 입체 안정화제를 포함한다.
    A4는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
    A3은 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
    A2는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
    A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고,
    P는 폴리아민을 포함하며,
    n은 1 이상의 정수이며, 및
    각 A1은 아미드 결합을 통해 폴리아민 상의 아민에 연결된다.)
  14. 제13항에 있어서, A4 및 A2가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌인, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, A3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  16. 제13항에 있어서, A4 및 A2가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고, A3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  17. 제13항에 있어서, A4 및 A2가 모두 L-페닐알라닌이고, A3이 L-시트룰린이고, A1이 프롤린인, 조성물.
  18. 제13항에 있어서, P가 막 활성 폴리아민인, 조성물.
  19. 제13항에 있어서, n이 폴리아민 상의 아민 수의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과인, 조성물.
  20. 하기 구조식을 포함하는 조성물:
    (R5-A4-A3-A2-A1)n-P-(A1'-A2'-A3'-A4'-R8)m
    (여기에서,
    A4는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
    A3은 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
    A2는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
    A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고,
    A4'는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
    A3'은 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
    A2'는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
    A1'은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고,
    R5는 타겟팅 기를 포함하고,
    R8은 입체 안정화제를 포함하고,
    P는 폴리아민을 포함하고,
    n 및 m은 각각 1 이상의 정수이고, 및
    각각의 A1 및 A1'은 아미드 결합을 통해 폴리아민 상의 아민에 연결된다.)
  21. 제20항에 있어서, A4, A4', A2 및 A2'가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌인, 조성물.
  22. 제20항에 있어서, A3 및 A3'이 독립적으로 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  23. 제20항에 있어서, A4, A4', A2 및 A2'가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고, A3 및 A3'이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 조성물.
  24. 제20항에 있어서, A4, A4', A2 및 A2'가 각각 L-페닐알라닌이고, A3 및 A3'이 각각 L-시트룰린이고, 및 A1 및 A1'이 각각 프롤린인, 조성물.
  25. 제20항에 있어서, P가 막 활성 폴리아민인, 조성물.
  26. 제20항에 있어서, n+m의 값이 폴리아민 상의 아민 수의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과인, 조성물.
  27. 하기 구조식을 포함하는 생물학적으로 불안정한 테트라펩티드 링커를 통해 제1 화합물을 아민-함유 화합물에 가역적으로 부착시키기 위한 테트라펩티드 변형제:
    [구조식 V]
    R5-A4-A3-A2-A1-R7
    (여기에서,
    R5는 제1 화합물을 나타내고,
    A4는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이며,
    A3은 소수성 지수가 있는, 하전되지않은 또는 염기성 친수성 L 아미노산이며,
    A2는 천연의, 비-천연 이성질체 또는 합성 소수성 L 아미노산이고,
    A1은 L-프롤린, L-류신 또는 L-N-메틸 알라닌이고, 및
    R7은 아민-반응성 기를 포함한다.)
  28. 제27항에 있어서, A4 및 A2가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌인, 테트라펩티드 변형제.
  29. 제27항에 있어서, A3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 테트라펩티드 변형제.
  30. 제27항에 있어서, A4 및 A2가 독립적으로 L-발린, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌이고, A3이 L-시트룰린, L-아스파라긴, 또는 L-리신인, 테트라펩티드 변형제.
  31. 제27항에 있어서, A4 및 A2가 모두 L-페닐알라닌이고, A3이 L-시트룰린이고, A1이 프롤린인, 테트라펩티드 변형제.
  32. 제27항에 있어서, R7이 테트라플루오로 페닐 또는 N-히드록시숙신이미드인, 테트라펩티드 변형제.
  33. 제27항에 있어서, 상기 변형제가 하기 구조식으로 나타낸 구조를 갖는, 테트라펩티드 변형제:
    Figure pct00034
KR1020177036710A 2015-05-29 2016-05-27 생물학적으로 절단가능한 테트라펩티드 연결제 KR102633963B1 (ko)

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