KR20180004816A

KR20180004816A - GATA-3 inhibitors for use in the treatment of TH2-induced asthma

Info

Publication number: KR20180004816A
Application number: KR1020177036013A
Authority: KR
Inventors: 요아힘 빌레; 요나스 렌츠
Original assignee: 스터나 바이올로지칼스 게엠바하 운트 콤파니 카게
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2018-01-12
Also published as: US10487325B2; CN107771082A; CA2985858C; AU2016264772A1; SI3093022T1; WO2016184556A1; DK3093022T3; RU2720988C2; HUE046190T2; EP3093022A1; CN115137827A; CA2985858A1; PT3093022T; AU2016264772B2; PL3093022T3; BR112017024394A2; ES2753436T3; US20190062737A1; JP2018515611A; EP3093022B1

Abstract

본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것으로서, 상기 환자는 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 10⁶ / L 이상, 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a GATA-3 inhibitor for use in the treatment of a Th2-induced asthma, in particular to a DNA molecule for GATA-3 for use in the treatment of patients suffering from allergic asthma, A number of 3% or more, specifically 4% or more, more specifically 5% or more; And / or (ii) a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, specifically 450 x 10 ⁶ / L or more; And / or (iii) nitrogen oxides of fraction 40 ppb or higher.

Description

TH2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제GATA-3 inhibitors for use in the treatment of TH2-induced asthma

본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임 (DNAzymes)에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 (blood eosinophil count) 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 10⁶ / L 이상, 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 (fractional expiratory nitric oxide) 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.The present invention relates to GATA-3 inhibitors for use in the treatment of Th2-induced asthma, specifically to DNAzymes for GATA-3 for use in the treatment of patients suffering from allergic asthma, (I) a blood eosinophil count of 3% or more, specifically 4% or more, more specifically 5% or more; And / or (ii) a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, specifically 450 x 10 ⁶ / L or more; And / or (iii) fractional expiratory nitric oxide of at least 40 ppb.

만성 염증은 날로 증가하는 의학적 문제 분야로서 높은 사회경제적 중요성을 갖는다. 여기에는 구체적으로 다음과 같은 질병 그룹이 포함된다: 자가면역 질환 및 류마티스 질환 분야의 질환 (피부, 폐, 신장, 혈관계, 신경계, 결합 조직, 운동계, 내분비계에서 나타남), 직접형 알레르기 반응 및 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 동맥경화증, 건선 및 접촉성 습진 및 장기 및 골수 이식 후의 만성 거부 반응. 이러한 질병 중 대부분은 지난 수십 년간 선진국뿐만 아니라 부분적으로는 전세계에서 확산되고 있다. 예를 들면, 유럽, 북아메리카, 일본 및 호주에서는 인구의 20% 이상이 알레르기성 질환 및 천식을 앓고 있다. 만성 폐쇄성 폐질환은 현재 전 세계적으로 다섯 번째로 많이 발생하는 사망 원인일 뿐만 아니라 WHO의 산출에 따르면 2020년에는 세 번째로 빈번하게 발생하는 질병이 될 것으로 보인다. 동맥경화증과 이에 따른 질병인 심장마비, 뇌졸중 및 말초 동맥 질환은 전 세계적으로 이환율 (morbidity) 및 사망률 (mortality) 통계를 이끌고 있다. 건선 및 접촉성 습진은 일반적으로 신경피부염과 더불어 피부에서 가장 빈번하게 발생하는 만성 염증 질환이다.Chronic inflammation has a high socioeconomic importance as an ever - increasing area of medical problems. These include specifically the following disease groups: diseases of the autoimmune and rheumatic diseases (skin, lung, kidney, vasculature, nervous system, connective tissue, motor system, endocrine system), direct allergic reactions and asthma , Chronic obstructive pulmonary disease (COPD), arteriosclerosis, psoriasis and contact eczema, and chronic rejection after organ or bone marrow transplantation. Most of these diseases have spread in the past decades not only in developed countries but also partly worldwide. For example, in Europe, North America, Japan and Australia, more than 20% of the population have allergic diseases and asthma. Chronic obstructive pulmonary disease is not only the fifth most common cause of death worldwide, but is also the third most frequent disease in 2020, according to WHO calculations. Arterial sclerosis and its associated diseases, heart attack, stroke and peripheral artery disease, are leading morbidity and mortality statistics worldwide. Psoriasis and contact eczema are chronic inflammatory diseases that most commonly occur in the skin, along with neurodermatitis in general.

천식은 일반적인 기도의 만성 염증 질환이고, 다양한 기도 폐쇄, 점액 과다-분비, 기도 염증 및 증가된 기도 과민반응을 포함한다. 선천적 및 후천적 면역 반응의 조절장애가 상기 질환의 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 다양한 임상적 표현형과 병태생리학적 엔도타입의 정의를 유도하는 상이한 환자 집단 간에 고도의 개체간 이질성이 확인되었다.¹ 최선으로 연구된 병태생리학적 천식 상태는 T-헬퍼 (TH)-2 유도된 (알레르기) 반응이고,² ^,3 이는 또한 "TH2 분자 엔도타입"이라고 한다⁴ ^,5.Asthma is a common inflammatory disease of the airways and includes a variety of airway obstruction, mucus hyper-secretion, airway inflammation and increased airway hyperresponsiveness. Congenital and acquired immune response disorders may play an important role in the development of these diseases. High degree of intergenerational heterogeneity was identified among different patient populations that led to the definition of various clinical phenotypes and pathophysiologic endotypes. The pathophysiology of asthma conditions studied is ¹ best T- helper (TH) and -2-induced (allergic) reactions, ^{^2, 3,} which is also called "TH2 molecule endo type" ^{^4,5.}

천식 환자의 약 절반은, 질병의 중증도와 관계없이, 상기 TH2 엔도타입을 나타내고, 이는 IL-4, IL-5, 및 IL-13과 같은 시토킨을 생성하는 TH2 세포의 주된 활성화를 특징으로 한다. 모든 상기 TH2 시토킨의 발현 및 생성은 징크 핑거 전자 인자 (zinc finger transcription factor) GATA-3에 의해 결정적으로 조절되고, 이는 TH2 세포 분화 및 활성화에 필수적이고, 면역 활성화의 타입 2 (TH2) 경로의 마스터 전사 인자로 간주된다⁶. GATA-3은 주로 나이브 (naive) CD4⁺ T 세포의 TH2 세포로의 분화를 담당한다. 상기 과정에서, 상기 TH2 세포 분화는 주로 2개의 시그날 전달 경로인, T 세포 수용체 (TZR) 및 IL-4 수용체 경로에 의해 조절되고: TZR로부터 전달된 시그날은 TH2 세포-특이적 전사 인자 cMaf 및 GATA-3뿐만 아니라 전사 인자 NFAT 및 AP-1을 활성화시킨다. 상기 IL-4 수용체의 활성화는 상기 IL-4 수용체의 세포질 도메인 상에 STAT6의 결합을 유도하고, 여기서 상기는 Jak1 및 Jak3 키나제에 의해 포스포릴화된다. 그 일부에 대한 포스포릴화에 의해 이량체화 및 STAT6의 핵 (nucleus)으로의 전좌 (translocation)를 유도하고, 여기서 STAT6은 GATA-3 및 다른 유전자의 전사를 활성화시킨다. GATA-3은 TH1 세포가 아닌 성숙한 TH2 세포에서 독점적으로 발현되는 징크 핑거 전사 인자이다. GINA 지침에 따라 최적의 치료에도 불구하고 중증 천식 환자의 기관지폐포 세척 시료 및 폐 생검에서 GATA-3 과발현이 관찰되었다⁷. 그러므로, 상기 면역 네트워크는 유망한 치료 표적이다. 이미 승인된 항-IgE 모노클로날 항체 이외에도, 전사 인자 GATA-3의 하류에 있는 개별 성분을 표적으로 하는 몇가지 새로운 치료제가 개발 중에 있다⁸.About half of asthmatic patients exhibit the TH2 endotype, regardless of the severity of the disease, which is characterized by the predominant activation of TH2 cells producing cytokines such as IL-4, IL-5, and IL-13 . The expression and production of all of the above TH2 cytokines are crucially regulated by the zinc finger transcription factor GATA-3, which is essential for TH2 cell differentiation and activation, and the type 2 (TH2) pathway of immune activation It is considered a master transcription factor. ⁶ . GATA-3 is mainly responsible for the differentiation of naive CD4 ⁺ T cells into TH2 cells. In this process, the TH2 cell differentiation is regulated mainly by two signal transduction pathways, the T cell receptor (TZR) and the IL-4 receptor pathway: the signal delivered from the TZR is regulated by the TH2 cell-specific transcription factors cMaf and GATA -3 as well as the transcription factors NFAT and AP-1. Activation of the IL-4 receptor induces binding of STAT6 on the cytoplasmic domain of the IL-4 receptor, where it is phosphorylated by Jak1 and Jak3 kinase. Induces dimerization and translocation of STAT6 into the nucleus by phosphorylation to a portion of it, where STAT6 activates transcription of GATA-3 and other genes. GATA-3 is a zinc finger transcription factor exclusively expressed in mature TH2 cells but not TH1 cells. According to the GINA guidelines, GATA-3 overexpression was observed in bronchoalveolar lavage and lung biopsies of patients with severe asthma despite optimal treatment ⁷ . Therefore, the immune network is a promising therapeutic target. In addition to the monoclonal antibodies with anti -IgE has already been approved monoclonal antibody, a number of new therapeutic agents to the individual components in the downstream of the transcription factor GATA-3 as a target in development ^8.

대안의 접근법은 전략적인 전사 인자 GATA-3을 직접적으로 표적으로 하여 모든 하류 분자/시토킨을 동시에 방해한다. 만성 염증 질환을 앓고 있는 환자의 분자 표현형을 결정하고 및 환자를 "TH2 high" 및 "TH2 low" 하위그룹으로 계층화하기 위해 GATA-3 발현이 분석되었고, "TH2 high" 환자를 GATA-3 특이적 불활성화제 (inactivators)로 치료하는 것이 제안되었다 (WO 2014/040891). GATA-3은 세포내에서만 발현되기 때문에, 인 비보 세포-침투 능력을 갖는, GATA-3-특이적 DNA자임과 같은 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 개발되었다 (WO 2005/033314).An alternative approach directly targets the strategic transcription factor GATA-3 and simultaneously interferes with all downstream molecules / cytokines. GATA-3 expression was analyzed to determine the molecular phenotype of patients with chronic inflammatory disease and to group patients into subgroups of "TH2 high" and "TH2 low " It has been proposed to treat with inactivators (WO 2014/040891). Because GATA-3 is expressed only in cells, nucleic acid-based inactivation agents of GATA-3, such as the GATA-3-specific DNA molecule, with in vivo cell-penetrating ability have been developed (WO 2005/033314).

알레르기성 천식과 같은 만성 염증 질환에서, 적절한 치료 계획을 확인하는 과제는 더욱 복잡하다. 알레르기 반응에서, 호산구의 수가 증가하여, 특정 환자에서 호산구증가증을 일으키는 것이 알려져 있다. 그러나, 호산구는 또한 GATA-3을 발현시키는 것이 알려져 있고 (Zon et al., Blood 81 (1993) 3234-3241), GATA-3의 발현은 T-세포에 제한되지 않기 때문에, GATA-3의 발현은 또한 호염기구 (basophils), 비만 세포 (mast cells) 및 상피 세포 (epithelial cells)에서 확인될 수 있다. GATA-3은 만성 염증 질환, 구체적으로 알레르기성 천식의 면역병인 (immunopathogenesis)에서 중요한 역할을 한다. 알레르겐에 의한 급성 감작 및 챌린지 (challenges)는, 림프구의 최소 보충과 함께, 기도내 호산구 축적의 정도가 매우 높고 (Paul Justice et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282 (2002) L302-L309), 알레르겐 챌린지는 폐 호산구에서 GATA-3 및 GATA-3 반응 유전자의 발현을 유도한다고 개시하였다. 요약하면, 이는 호산구가 염증 반응에 대해 긍정적인 피드백을 제공할 수 있다고 가정하였다. 대조적으로, 알레르기성 천식과 같은 만성 알레르기성 기도 염증에서, 인간 폐 조직에서 GATA-3 포지티브 세포의 60-90%는 CD3-포지티브 T 세포이고, 단지 15% 미만의 세포가 호산구로 확인되었다 (Nakamura et al., J Allergy Clin Immunol 103 (1999) 215-222). 그러므로, 인간 천식에서, GATA-3-반응성 유전자의 호산구 발현은 기도 염증을 일으키는 전염증성 (proinflammatory) 시토킨의 주요 근원은 아니라는 결론을 내렸지만, 만성 염증 과정을 지원하기 위한 TH2 시토킨의 풍부한 근원을 제공할 수도 있다 (Paul Justice et al., loc. cit.).In chronic inflammatory diseases such as allergic asthma, the task of identifying an appropriate treatment plan is more complex. In allergic reactions, it is known that the number of eosinophils increases, causing eosinophilia in certain patients. However, since eosinophils are also known to express GATA-3 (Zon et al., Blood 81 (1993) 3234-3241), GATA-3 expression is not restricted to T- Can also be identified in basophils, mast cells, and epithelial cells. GATA-3 plays an important role in chronic inflammatory diseases, specifically immunopathogenesis of allergic asthma. Acute sensitization and challenges with allergens are associated with a very high degree of airway eosinophilia accumulation with minimal replenishment of lymphocytes (Paul Justice et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282 (2002) L302-L309) , An allergen challenge has been shown to induce the expression of GATA-3 and GATA-3 response genes in lung eosinophils. In summary, it was assumed that eosinophils could provide positive feedback on the inflammatory response. In contrast, in chronic allergic airway inflammation such as allergic asthma, 60-90% of GATA-3 positive cells in human lung tissue are CD3-positive T cells, with less than 15% of cells identified as eosinophils (Nakamura et al., J Allergy Clin Immunol 103 (1999) 215-222). Therefore, in human asthma, we conclude that eosinophil expression of the GATA-3-responsive gene is not a major source of proinflammatory cytokines that cause airway inflammation, but the abundant source of TH2 cytokines to support the chronic inflammatory process (Paul Justice et al., Loc. Cit.).

그러므로, TH2 세포에서 GATA-3은 알레르기성 천식과 같은 알레르기 장애의 사례에서 치료적 개입을 위한 매력적인 표적인 것으로 보이고, 이는 GATA-3을 발현하는, 호산구의 동시 존재가 어떠한 영향을 미치는지, 이러한 치료 접근법의 성공 여부에 대해 전혀 알려져 있지 않다. 또한 이러한 접근법으로부터 혜택을 얻는 특정 환자 집단을 동정할 수 있는지 여부를 전혀 예측할 수 없다.Thus, in TH2 cells, GATA-3 appears to be an attractive target for therapeutic intervention in the case of allergic disorders such as allergic asthma, which suggests the simultaneous presence of eosinophils expressing GATA-3, The success of the approach is not known at all. It is also impossible to predict at all whether a particular patient population can benefit from this approach.

그러므로, 알레르기성 천식 환자에 대한 신규하고 효율적인 치료법을 개발해야 한다는 여전히 많은 요구가 있다. 특정 GATA-3 저해제의 투여로부터 구체적으로 혜택을 얻는 특정 환자 집단의 동정에 기반하여, 본 출원에서 제시된 해결책은 지금까지는 알려져 있지 않았고, 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 기대될 수 없었다.Therefore, there is still a great need to develop new and efficient therapies for allergic asthmatic patients. Based on the identification of a particular patient population specifically benefiting from the administration of a particular GATA-3 inhibitor, the solutions presented in this application have not been known heretofore and could not be expected by those of ordinary skill in the art.

본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 GATA-3 저해제, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 특정 하위집단의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것이다.The present invention relates to a GATA-3 inhibitor for use in the treatment of Th2-induced asthma, in particular a DNA molecule for GATA-3 for use in the treatment of a particular subpopulation of patients suffering from allergic asthma.

그러므로, 제1 양태에서, 본 발명은, 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 10⁶ / L 이상, 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 한다.Therefore, in a first aspect, the present invention relates to a nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3, in particular a DNA molecule for GATA-3, for use in the treatment of patients suffering from allergic asthma, (I) the number of blood eosinophils is at least 3%, specifically at least 4%, more particularly at least 5%; And / or (ii) a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, specifically 450 x 10 ⁶ / L or more; And / or (iii) nitrogen oxides of fraction 40 ppb or higher.

제2 양태에서, 본 발명은 Th2-유도된 천식, 구체적으로 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 3% 이상, 구체적으로 각각 4% 또는 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 10⁶ / L 이상, 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 40 ppb 이상인 것을 특징으로 하고, 상기 방법은 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 GATA-3에 대한 DNA자임을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.In a second aspect, the present invention relates to a method of treating a patient suffering from a Th2-induced asthma, in particular an allergic asthma, wherein the patient has (i) a blood eosinophil count of 3% or more, 5% or more; And / or (ii) a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, specifically 450 x 10 ⁶ / L or more; And / or (iii) at least 40 ppb of fractionated nitric oxide nitrogen, said method comprising administering to said patient a nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3, specifically a DNA sequence for GATA-3 .

도 1은 연구 설계 및 순서도를 나타낸다. 도 1a는 연구 설계 및 주요 연구 절차의 개요를 보여준다. 도 1b는 상기 분석에 등록되고 포함된 환자 수를 요약하였다. SB010 그룹의 21명의 환자가 모든 연구 평가를 완료하였고, 1명의 환자는 치료 전 및 치료 후 알레르겐 챌린지에서 상이한 알레르겐 용량의 투여로 인해서 평가 대상이 되지 못했다. 플라시보 그룹에서, 2명의 환자는 평가 대상이 되지 못했다 (1명은 알레르겐 챌린지 중에 SABA를 필요로 했고; 1명은 치료 전과 치료 후 알레르겐 챌린지에서 다른 알레르겐 용량이 투여되었다). 그러므로, SB010 그룹의 평가가능한 환자 21명과 플라시보 그룹의 평가가능한 환자 19명이 상기 연구를 완료했다^"*": 상기 플라시보 그룹에서, 알레르겐 유발하고 4시간 후에 연속 폐활량측정 (serial spirometry)이 의도하지 않게 중단되었기 때문에 1명 환자의 LAR 데이터가 누락되었다.
도 2는 치료전 및 치료 4주 후 알레르겐 챌린지 후에 폐 기능의 변화를 보여주었다. 도 2a: 알레르겐 챌린지 후에 기준 FEV₁의 백분율로 FEV₁ 수준이 개시되었다. 알레르겐 챌린지는 치료 전 () 및 4주 치료 기간의 완료 후 ()에 수행되었다. 폐 기능이 알레르겐 챌린지 후 7시간 동안 기록되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. SB010에 의한 치료 (▲)는, 플라시보 (■)와 비교하여, 초기 단계 천식 반응 (P=0.04, Wilcoxon 순위 합 검정)뿐만 아니라 후기 단계 천식 반응 (P=0.02, ANCOVA)을 현저하게 감쇠시켰다. 전체적인 상기 연구 그룹에 대한 결과가 도 2a에 개시되었고; 혈중 호산구 ≥ 4% (도 2b) 및 FeNO ≥ 40ppb (도 2c)를 갖는 사전-지정된 하위그룹이 개시되었다. 혈중 호산구 및 FeNO 수준이 무작위 배정 전에 측정되었다. 하위그룹은 12명의 SB010/12명의 플라시보 환자로 구성되고, 여기서 상기 SB010 그룹의 9명의 환자 및 플라시보 그룹의 11명의 환자가 양쪽 하위그룹에 존재한다. EAR 및 LAR 둘 다가 혈중 호산구 ≥ 4% 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05) 및 FeNO ≥ 40 ppb 하위그룹 (각각 P=0.02 및 P=0.05)에서 현저하게 향상되었다. 알레르겐 챌린지 후에 처음 1시간 동안 스프레드 X-축이 확대되어 있다는 것에 주의한다. 도 2b: 폐 기능이 경시적으로 기준 FEV1의 백분율로 표시된다. 각각 혈중 호산구 ≥ 3 %, ≥ 4 % 및 ≥ 5 %인 3개의 하위 그룹에 대해 SB010 및 플라시보 치료에 대한 개별의 치료 전 및 치료 후 곡선이 개시되었다. 치료 그룹 당 평균 값 +/- SEM으로 나타내었다. 삽입된 네모는 초기 단계 반응 (좌측 네모) 및 후기 단계 반응 (우측 네모)에 대해 플라시보와 비교하여, SB010 치료 그룹에서 FEV1 곡선 아래 면적 (AUC)의 개선 %를 나타낸다. 통계 분석은 ANCOVA에 의한다. X-축은 알레르겐 챌린지 후 처음 1시간 동안 다른 척도로 신장시켰음에 주의한다. 폐 기능의 연속적인 향상은 기준 혈중 호산구 수에 기반한다. 도 2c: 여기서, SB010으로 치료하고 28일 후 알레르겐 챌린지에 대한 반응이 기준 혈중 호산구 수로 계층화된 모두 3개의 하위그룹에 대해 조합하여 개시되었다. 비교를 위해, 혈중 호산구 ≥ 3 % 하위그룹에 있어서 치료 후 플라시보 반응에서 다른 2개의 하위그룹에서 플라시보 반응과 현저하게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 상세한 내용은 도 2의 범례를 참조한다.
도 3은 후기 천식 반응 (LAR) 동안 곡선하 면적 (AUC)에서 개별 절대 변화를 나타내었다. 상기 SB010 치료 그룹 (n=21) 및 상기 플라시보 그룹 (n=18)에서 각 환자에 있어서, 후기 단계 반응 (LAR) 동안 AUC 값에서의 절대 변화가 산출 및 도시되었다. 선 (line)은 평균을 나타내고; 검정색 점 (black points): 기준에서 혈중 호산구 수 ≥ 4%인 환자; 원 (circles): 기준에서 혈중 호산구 수 < 4%인 환자. LAR 반응은 상기 2개의 하위그룹 사이에서 현저하게 상이하지 않았다. 전체 그룹에 있어서, SB010 치료는 상기 후기 단계 천식 반응을 현저하게 감쇠시켰다 (P=0.02, 도 2). 개별 데이터 요소는 보충 부록 (Supplementary Appendix) 표 S4A 및 S4B를 참조한다.
도 4는 SB010 또는 플라시보로 치료하기 전 및 후에 알레르겐 챌린지 후 혈장 IL-5 수준에서의 변화를 나타내었다. 이는 치료전 알레르겐 챌린지에 반응하여 검출가능한 혈장 IL-5 수준을 나타내는 환자의 혈장 IL-5 농도에서 절대 변화의 평균 ± SEM으로 개시되었고, 이는 각각 상기 SB010 그룹 (13명의 환자)에서 4.21 ± 1.51pg/ml이고, 상기 플라시보 그룹 (12명의 환자)에서 4.03 ± 0.92pg/ml이었다. 상기 차이는 P=0.05 (^*)로 통계적 유의성이 있다.
도 5 (= 보충 부록의 도 S1)는, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, 알레르기성 천식의 발병기전 (pathogenesis) 및 SB010의 작용 기작 (mode-of-action)에서 Th2 세포 및 GATA-3의 중심 역할을 보여주었다.
도 6 (= 보충 부록의 도 S2)은, 보충 부록에서 토의된 바와 같이, mRNA 절단 활성 및 GATA-3 DNA자임을 나타내었다. GATA-3 카피 (c)RNA에 대한 GATA-특이적 DNA자임 hgd40의 인 비트로 절단 활성. 인 비트로 전사된 전체 오픈 리딩 프레임 cRNA가 hgd40의 다른 시간 간격 동안 (키네틱스 - A) 또는 증가된 용량으로 (용량 의존성 - B) 인큐베이트되었고, 결과의 절단 산물 (cleavage products)이 분리되었고, 아가로스 겔 상에 에티듐 브로미드 (ethidium bromide)로 염색되었다. 유사하게, GATA-3 cRNA가, 스크램블된 결합 도메인을 갖지만 온전한 촉매적 서열 (catalytic sequence)을 갖는 비특이적 DNA자임 (스크램블된 DNA자임 1-6) 또는 상이한 전사 인자 서열에 대한 DNA자임 (T 박스 전사 인자 Tbet, Tbet DNA자임 1-3)과 인큐베이트되어서, 상기 DNA자임 접근법 (C)의 서열 특이성을 입증하였다.
도 7 (= 보충 부록의 도 S3)은 hgd40 - SB010의 활성 성분의 생체활성 (bioactivity) 및 인간 원발성 T 세포 및 비강 조직 이식편에서 hgd40 치료의 효과를 나타내었다. A - 인간 극성화된 (polarized) Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 GATA-3 단백질 발현의 감소. B - 인간 극성화된 Th2 세포의 hgd40 형질감염에 의한 IL-13 분비의 감소. 도 S2A 및 S2B의 데이터는 FAM-포지티브 형질감염된 세포의 세포내 (intracellular) 염색을 나타내었고, 그룹당 n = 8-10에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. C 및 D - 코 폴립을 갖는 만성 코굴염 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps: CRSwNP)을 앓는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에 존재하는 CD3+ T 세포 (녹색)에 의해 형광 표지된 hgd40 (적색)의 흡수율. 결과는 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)에 의해서 수득되었고, 치료되지 않은 (도 C) 및 hgd40 치료된 세포 (도 D)에 대해 두 색상을 오버레이 (overlay)하여 나타내었다. E - 엑스 비보 (ex vivo) 조직 분석에서 CRSwNP를 앓고 있는 환자로부터 수득된 인간 코 폴립 조직 이식편에서 GATA-3 mRNA의 발현. 데이터는 정규화된 상대 발현 유닛으로 나타내었고, 그룹 당 n=6에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. F - 엑스 비보 조직 분석에서 인간 코 폴립으로부터 IL-5 단백질의 방출. 데이터는 그룹 당 n=16에 대해 평균 + SEM으로 나타내었다. 유의성이 GraphPad Prism 5를 사용하여 students t 검정에 의해 산출되었다; (^*) P<0.05; (^**) P<0.01. 기술적인 상세는 보충 부록, 물질 및 방법을 참조한다.
도 8 (= 보충 부록의 도 S4)은 전체 ITT 개체군 및 사전-지정된 하위그룹에서 평균 치료 차이를 나타내었다. 이는 SB010 치료 그룹과 플라시보 그룹 사이에서 상대 변화의 델타를 반영하는 그룹 차이를 시각화하였다. 전체 연구 개체군에 대한 값이 표 S2에 개시되었고, 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값이 표 S3a에 개시되었고, 및 FeNO ≥ 40 ppb인 환자의 사전-지정된 하위그룹에 대한 값을 표 S3B에서 찾을 수 있다. 상단: 치료전 및 치료후 사이에서 폐 기능의 백분율 변화가 곡선하 면적 (AUC)으로 표시되었다. 하단: FEV₁에서 최대 감소로서 폐 기능의 백분율 변화가 표시되었다. EAR: 초기 단계 천식 반응; LAR: 후기 단계 천식 반응.
도 9 (= 보충 부록의 도 S5)는 객담 호산구에서 SB010 및 플라시보 치료의 효과를 나타내었다 (백분율로). 측정은 유도된 객담 시료에서, 상기 물질 및 방법에 개시된 바와 같은 알레르겐 흡입 전 및 후에, 수행되었다. 알레르겐 흡입이 SB010 (▲) 및 플라시보 (■)에 의한 치료 이전 및 치료하고 28일 후에 수행되었다. 각 시점 및 치료 그룹에 대해서 중간 값 및 25 및 75 백분위수 범위를 나타내었다. 좌측 패널: 전체 그룹; 중간 패널: 사전-지정된 하위그룹, 혈중 호산구 ≥ 4%; 우측 패널: 사전-지정된 하위그룹, FeNO ≥ 40ppb. 전체 그룹에서 호산구 백분율당 챌린지 후 절대 변화는 상기 치료 그룹들 사이에서 비-유의성 추세 (P=0.06)를 나타내었고, 이는 상기 호산구 하위그룹 (P=0.009) 및 상기 FeNO 하위그룹 (P=0.02)에서 유의성이 있었다. 객담 호산구의 감소 백분율은 보충 부록의 표 S8에 개시된 바와 같이 증가된 중성구의 유입에 기인하는 것은 아니다. Figure 1 shows a study design and flowchart. Figure 1A shows an overview of the study design and major research procedures. Figure 1B summarizes the number of patients enrolled and included in the analysis. Twenty-one patients in the SB010 group completed all study assessments and one patient was not assessed due to the administration of different allergen doses before and after the allergen challenge. In the placebo group, two patients were not evaluated (one required SABA during the allergen challenge; one was given different allergen doses before and after the allergen challenge). Therefore, 21 evaluable patients in the SB010 group and 19 patients evaluable in the placebo group completed the study ^{"*." In} the placebo group, serial spirometry after allergen induction and after 4 hours unintentionally stopped LAR data of one patient was missing.
Figure 2 shows changes in pulmonary function after the allergen challenge before and 4 weeks after treatment. 2a : FEV ₁ level was initiated as a percentage of baseline FEV ₁ after an allergen challenge. The allergen challenge was performed before () and after completion of () the 4 week treatment period. Pulmonary function was recorded for 7 hours after the allergen challenge. Mean values per treatment group +/- SEM. Treatment with SB010 markedly attenuated late phase asthma response (P = 0.02, ANCOVA) as well as early stage asthmatic response (P = 0.04, Wilcoxon rank sum test) as compared with placebo (). The results for the entire study group are disclosed in Figure 2a ; Pre-assigned subgroups with blood eosinophils ≥ 4% ( Fig. 2b ) and FeNO ≥ 40 ppb ( Fig. 2c ) have been described. Serum eosinophil and FeNO levels were measured before randomization. The subgroup consists of 12 SB010 / 12 placebo patients, where 9 patients in the SB010 group and 11 patients in the placebo group are in both subgroups. Both the EAR and LAR were significantly improved in serum eosinophil ≥4% subgroups (P = 0.02 and P = 0.05, respectively) and FeNO ≥ 40 ppb subgroups (P = 0.02 and P = 0.05, respectively). Note that the spread X-axis is magnified for the first hour after the allergen challenge. Figure 2b: lung function is shown as a percentage of the reference FEV1 with time. Individual pretreatment and posttreatment curves for SB010 and placebo treatment were initiated for three subgroups of blood eosinus ≥ 3%, ≥ 4%, and ≥ 5%, respectively. Mean values per treatment group +/- SEM. Inserted squares represent percent improvement in area under the FEV1 curve (AUC) in the SB010 treatment group compared to placebo for the early phase response (left square) and late phase response (right square). Statistical analysis is by ANCOVA. Note that the X-axis was elongated on a different scale for the first hour after the allergen challenge. Continuous improvement of pulmonary function is based on baseline blood eosinophil count. Figure 2c : Here, the treatment with SB010 and after 28 days the response to the allergen challenge was initiated in combination for all three subgroups stratified by baseline blood eosinophil count. For comparison, we showed that in the serum eosinophil ≥ 3% subgroup, the placebo response after treatment was not significantly different from the placebo response in the other two subgroups. For details, refer to the legend of FIG.
Figure 3 shows individual absolute changes in area under the curve (AUC) during the late asthma reaction (LAR). For each patient in the SB010 treatment group (n = 21) and the placebo group (n = 18), an absolute change in AUC value during the late phase reaction (LAR) was calculated and shown. Line represents the average; Black points: Patients with a blood ≥4% eosinophil count in the baseline; Circles: Patients with a blood eosinophil count of <4%. The LAR response was not significantly different between the two subgroups. In the whole group, treatment with SB010 markedly attenuated this late stage asthmatic response (P = 0.02, FIG. 2). Individual data elements are referenced in Supplementary Appendix Tables S4A and S4B.
Figure 4 shows changes in plasma IL-5 levels before and after treatment with SB010 or placebo and after allergen challenge. This was initiated as the mean ± SEM of absolute changes in plasma IL-5 levels in patients exhibiting detectable levels of plasma IL-5 in response to the pre-treatment allergen challenge, which was 4.21 ± 1.51 pg in the SB010 group (13 patients) / ml, and 4.03 ± 0.92 pg / ml in the placebo group (12 patients). The difference is statistically significant at P = 0.05 ( ^* ).
Figure 5 ( Figure S1 in the Supplement to Appendix) shows that at the center of Th2 cells and GATA-3 in the pathogenesis of allergic asthma and mode-of-action of SB010, as discussed in the supplementary appendix Role.
Figure 6 (= Figure S2 in the supplementary appendix) shows mRNA cleavage activity and GATA-3 DNA mismatch, as discussed in the supplementary appendix. In vitro cleavage activity of the GATA-specific DNAzyme hgd40 on GATA-3 copy (c) RNA. The entire open reading frame cRNA transcribed in-vitro was incubated for another time interval of hgd40 (kinetic- A ) or increased capacity (dose dependent- B ) and the resulting cleavage products isolated, The gel was stained with ethidium bromide on the gel. Similarly, the GATA-3 cRNA is a nonspecific DNA that has a scrambled binding domain but has an intact catalytic sequence (scrambled DNAzyme 1-6) or DNA for a different transcription factor sequence (T-box transcription Factor Tbet, Tbet DNA fragment 1-3) to demonstrate the sequence specificity of the DNA self-approach ( C ).
Figure 7 (= supplement S3 ) shows the effect of hgd40 treatment on the bioactivity of the active ingredients of hgd40-SB010 and human primary T cells and nasal tissue grafts. A - Reduction of GATA-3 protein expression by hgd40 transfection of humanized polarized Th2 cells. Reduction of IL-13 secretion by hgd40 transfection of B -human polarized Th2 cells. The data in Figures S2A and S2B showed intracellular staining of FAM-positive transfected cells, expressed as mean + SEM for n = 8-10 per group. (Red) by CD3 + T cells (green) present in human corpus tissue grafts obtained from patients suffering from chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP) with C and D- Absorption rate. Results were obtained by confocal laser scanning microscopy and represented by overlaying two colors for untreated (Figure C) and hgd40 treated cells (Figure D). Expression of GATA-3 mRNA in human collagen tissue grafts obtained from patients suffering from CRSwNP in E - ex vivo tissue analysis. Data are presented as normalized relative expression units and expressed as mean + SEM for n = 6 per group. Release of IL-5 protein from human corpoli in F -Xvibo tissue analysis. Data are expressed as mean + SEM for n = 16 per group. Significance was calculated by students t test using GraphPad Prism 5; ( ^* ) P <0.05; ( ^** ) P < 0.01. For technical details, refer to supplementary appendices, materials and methods.
Figure 8 (= Fig. S4 of supplementary appendix) shows the mean treatment differences in the entire ITT population and pre-assigned subgroups. This visualized a group difference reflecting the delta of relative change between the SB010 treatment group and the placebo group. Values for the entire study population are set forth in Table S2 and values for pre-specified subgroups of patients with blood eosinophilia ≥ 4% are set forth in Table S3a , and for pre-specified subgroups of patients with FeNO ≥ 40 ppb The values can be found in Table S3B . Top: Percent change in pulmonary function before and after treatment was expressed as area under the curve (AUC). Bottom: Percent change in pulmonary function was noted as the maximum reduction in FEV ₁ . EAR: early stage asthmatic response; LAR: late stage asthmatic reaction.
Figure 9 (= supplement S5 in Figure 5 ) showed the effect of SB010 and placebo treatment on sputum eosinophil (as a percentage). Measurements were carried out in the induced sputum samples before and after allergen inhalation as described in the above materials and methods. Allergen inhalation was performed prior to treatment with SB010 () and placebo (), and 28 days after treatment. Median and 25th and 75th percentile ranges were shown for each viewpoint and treatment group. Left panel: whole group; Intermediate panel: pre-assigned subgroup, blood eosinophil ≥ 4%; Right panel: Dictionary - Assigned subgroup, FeNO ≥ 40 ppb. (P = 0.009) and the FeNO subgroup (P = 0.02) between the treatment groups showed an absolute change after the challenge per eosinophil percentage in the whole group, Respectively. The percentage reduction in sputum eosinophil count is not due to increased neutrophil inflow as described in Table S8 of the Supplementary Appendix.

본 발명은 Th2-유도된 천식의 치료에 사용하기 위한 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 DNA자임, 특히 특정 환자 하위집단의 치료에 사용하기 위한 GATA-3에 대한 핵산-기반 불활성화제, 구체적으로 DNA자임에 관한 것이다.The present invention relates to a nucleic acid-based inactivation agent for use in the treatment of Th2-induced asthma, in particular a DNA-based inactivation agent for GATA-3 for use in the treatment of a particular patient subpopulation, It is about the self.

본 발명의 문맥에서, 용어 "핵산-기반 불활성화제"는 표적 유전자 서열과 적어도 일부 상보적이고, 예컨대 중복 (reduplication), 전사 (transcriptions) 또는 번역 (translation)을 차단, 또는 상기 표적 서열을 절단하여, 상기 표적 유전자 활성을 불활성화시키는 핵산-기반 물질을 나타낸다. 핵산-기반 불활성화제는 리보뉴클레오티드, 데속시리보뉴클레오티드, 비-자연 발생하는 뉴클레오티드 및 그 혼합물로 구성될 수 있고, 단일-가닥 서열, 이중-가닥 서열 또는 그 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 핵산-기반 불활성화제는 siRNA 분자, shRNA 분자 및 DNA자임을 포함한다.In the context of the present invention, the term "nucleic acid-based deactivation agent" refers to a nucleic acid that is at least partially complementary to a target gene sequence and which, for example, blocks reduplication, transcriptions or translation, Based material that deactivates the target gene activity. The nucleic acid-based inactivating agent may be comprised of a ribonucleotide, a deoxyribonucleotide, a non-naturally occurring nucleotide, and mixtures thereof, and may be a single-stranded sequence, a double-stranded sequence, or a mixture thereof. The nucleic acid-based inactivating agent according to the present invention includes siRNA molecules, shRNA molecules and DNA molecules.

본 발명의 문맥에서, 용어 "DNA자임"은 촉매적으로 활성인 단일-가닥, 합성 DNA 분자를 나타내고, 이는 자연에서 발생되지 않는다. 10-23 패밀리의 DNA자임은 안티-센스 분자의 새로운 부류를 나타내고, 이는 1990년대에 개발되었지만, 최근에 임상적 적용이 발견되었다⁹.In the context of the present invention, the term "DNA molecule" refers to a catalytically active single-stranded, synthetic DNA molecule, which is not naturally occurring. DNA ribozyme of 10 to 23 families are anti-sense represents a new class of molecules, which have been developed in the 1990s, it was recently discovered in ^nine clinical application.

본 발명의 문맥에서, 용어 "10-23 패밀리"는 일반적인 DNA자임 모델을 나타낸다 (Sontoro & Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94 (1997) 4262-4266). 또한 "10-23 DNA자임"으로 언급되는 상기 10-23 모델의 DNA자임은 15개의 데속시리보뉴클레오티드의 촉매적 도메인을 가지며, 이는 2개의 기질 결합 도메인에 의해 플랭크 (flank)된다 (WO 2005/033314 참조). DNA자임의 잠재적 이점은 상대적으로 높은 안정성을 포함하지만, 세포내 효소에 대한 의존성은 없다는 것이다.In the context of the present invention, the term "10-23 family" represents a generic DNA self-model (Sontoro & Joyce, Proc. Natl. Acad Sci U S. A., 94 (1997) 4262-4266). The DNA sequence of the above 10-23 model, referred to as "10-23 DNA < / RTI > DNA " has a catalytic domain of 15 transient ribonucleotides, which is flanked by two substrate binding domains (WO 2005 / 033314). The potential benefits of DNA self-assembly include relatively high stability, but no dependence on intracellular enzymes.

특정 구현예에서, 상기 촉매적 도메인은 서열 ggctagctacaacga (서열번호: 1)를 갖는다. 상기 기질 결합 도메인의 길이는 가변할 수 있다: 이는 동일하거나 또는 상이한 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 6개 내지 14개의 뉴클레오티드로 구성되고, 더 구체적으로 각 경우에 적어도 9개의 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 DNA자임은 일반적 서열 nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (서열번호: 2)을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 단백질 GATA-3을 코딩하는 mRNA에 결합한다.In certain embodiments, the catalytic domain has the sequence ggctagctacaacga (SEQ ID NO: 1). The length of the substrate binding domain can be variable: it has the same or a different length. In certain embodiments, the substrate binding domain is comprised of six to fourteen nucleotides, more specifically at least nine nucleotides in each case. Such a DNA sequence includes the general sequence nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (SEQ ID NO: 2). In certain embodiments of the invention, the substrate binding domain binds to an mRNA encoding the protein GATA-3.

명시된 중심 촉매적 도메인 ggctagctacaacga은 단지 특정 구현예이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 변형된 촉매적 도메인에 의해 비교가능한 생물학적 활성을 갖는 "10-23 DNA자임"이 수득될 수 있다는 사실을 알 수 있다.The specified central catalytic domain ggctagctacaacga is only a specific implementation. One of ordinary skill in the art can see that a "10-23 DNA strand" with comparable biological activity by modified catalytic domains can be obtained.

일 특정 구현예에서, 상기 기질 결합 도메인은 상기 절단 부위를 플랭크하는 영역에 완전히 상보적이다. 그러나, 상기 표적 RNA에 결합하고 이를 절단하기 위해서, 상기 DNA자임은 완전히 상보적일 필요는 없다. 10-23 타입의 DNA자임은 퓨린-피리미딘 서열에서 표적 mRNA를 절단한다. 본 발명의 범위안에서, 상기 DNA자임은 바람직하게 WO 2005/033314에 따른 GATA-3에 대한 인 비보 활성인 DNA자임을 포함하고, 그 전문이 임의의 적용가능한 특허법 하에 참조로 포함된다.In one particular embodiment, the substrate binding domain is completely complementary to the region flanking the cleavage site. However, in order to bind to and cleave the target RNA, the DNA molecule need not be completely complementary. A DNA sequence of type 10-23 cleaves the target mRNA from the purine-pyrimidine sequence. Within the scope of the present invention, the DNA domain preferably comprises a DNA sequence which is an in vivo activity for GATA-3 according to WO 2005/033314, the entirety of which is incorporated by reference under any applicable patent law.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 4% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.In certain embodiments of the invention, the patient has a blood eosinophil count of 4% or more.

특정 구현예에서, 상기 환자는 5% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.In certain embodiments, the patient has a blood eosinophil count of 5% or greater.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 350 x 10⁶ / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.In certain embodiments of the invention, the patient has a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more.

특정 구현예에서, 상기 환자는 450 x 10⁶ / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는다.In certain embodiments, the patient has a blood eosinophil count of 450 x 10 ⁶ / L or more.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 혈중 호산구 수가 (i) 종래의 자동 분별 혈구 계산 (automated differential blood counting) (예컨대 Coulter Technology 또는 Sysmex Technology 또는 다른 기술 사용), 또는 (ii) 종래의 혈액 도말표본 (blood smear)을 사용하는 수동 현미경 세포 분별화에 의해 결정된다.In certain embodiments of the present invention, the blood eosinophil count may be determined by (i) using automated conventional differential blood counting (e.g., using Coulter Technology or Sysmex Technology or other techniques), or (ii) blood smear). < / RTI >

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 환자는 40 ppb 이상의 분획 호기 산화질소를 갖는다.In certain embodiments of the invention, the patient has a fractionated aerobic nitric oxide of at least 40 ppb.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 분획 호기 산화질소가 휴대용 (hand-held) NIOX MINO^® 장치를 사용하여 결정된다.In certain embodiments of the present invention, the fractionated exhaled nitric oxide is determined using a hand-held NIOX MINO ( ^R ) device.

본 발명의 특정 구현예에서, GATA-3에 대한 DNA자임이, WO 2005/033314의 서열 hgd1 내지 hgd70으로부터 선택되고 (WO 2005/033314의 도 3 참조), 구체적으로 서열들 hgd11, hgd13, hgd17 및 hgd40, 더 구체적으로 서열 hgd40 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG; 서열번호: 3)으로부터 선택된다.In certain embodiments of the invention, the DNA sequence for GATA-3 is selected from the sequences hgdl to hgd70 of WO 2005/033314 (see Figure 3 of WO 2005/033314), specifically the sequences hgdll, hgdl3, hgd40, more specifically the sequence hgd40 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG; SEQ ID NO: 3).

본 발명의 문맥에서, 용어 "hgd40"은 GATA-3에 대한 DNA자임을 나타내고, 이는 서열 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG를 갖는 34개의 염기로 구성된다. 상기 3' 및 5' 영역 둘 다에서 9개의 염기는 2개의 결합 도메인을 형성하고, 이는 GATA-3의 표적 mRNA에 고도로 특이적으로 결합한다. 상기 분자의 중심 코어는 hgd40이 상기 GATA-3 mRNA에 결합한 후에 상기 표적의 절단을 설명하는 촉매적 도메인을 나타낸다¹⁰ (도 5 및 6 참조). 상기 약제 물질 hgd40은 흡입에 의해 약물 전달의 부위에서 높은 생물활성 및 생체이용률을 특징으로 한다.¹² In the context of the present invention, the term "hgd40 " refers to the DNA sequence for GATA-3, which consists of 34 bases with the sequence 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG. In both of the 3 'and 5' regions, 9 bases form two binding domains, which bind highly specifically to the target mRNA of GATA-3. A central core of the molecule hgd40 After binding to the GATA-3 mRNA represents the catalytic domain for explaining the cutting of the target ¹⁰ (see Figs. 5 and 6). The drug substance hgd40 is characterized by high bioactivity and bioavailability at the site of drug delivery by inhalation. ¹²

본 발명의 특정 구현예에서, 환자에게 경구, 직장, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌수조내 (intracisternally), 질내, 복강내, 지주막하강내 (intrathecally), 혈관내, 국소 (분말, 연고 또는 점적약 (drops)) 또는 스프레이 또는 흡입제의 형태로 투여될 수 있는 제형내에 상기 hgd40이 포함된다. 상기 활성 성분이 멸균 조건 하에 생리학적으로 허용가능한 부형제 및 가능한 보존제, 완충제 또는 분사제 (propellants)와 필요에 따라 혼합된다.In certain embodiments of the present invention, the compound of formula (I) is administered to a patient in an orally, rectally, parenterally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, intrathecally, intravascularly, topically , Ointment or drops), or in the form of a spray or inhalant. The active ingredient is mixed under sterile conditions with physiologically acceptable excipients and possible preservatives, buffers or propellants as required.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 hgd40이 흡입을 위한 제형에 포함된다.In certain embodiments of the invention, the hgd40 is included in a formulation for inhalation.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 hgd40이 PBS에 용해된다.In certain embodiments of the invention, the hgd40 is dissolved in PBS.

투여량 (dosage)의 타입 및 투여량 계획 (dosage scheme)이 임상적 요인들에 따라 참석한 의사에 의해 결정될 것이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 투여량 타입 및 투여량 계획이 상이한 요인들, 가령 예컨대 환자의 몸 크기, 체중, 체 표면, 연령, 성별 또는 일반적인 건강 상태에 의존할 뿐만 아니라, 투여되는 작용제, 투여 기간 및 형태 및 동시에 투여될 수 있는 기타 약제에 의존한다. 상기 과정에서, 특히 유익한 구현예에 따르면, 상기 약제의 활성 성분의 양이 측정된 발현 수준으로 조정될 수 있다. 그러므로, 하위 그룹 "Th2 high"의 배정 및 수립된 매우 높은 GATA-3 유전자 발현의 경우에, 상기 활성 성분, 구체적으로 GATA-3에 대해 특이적인 DNA자임의 증가된 용량이 투여될 수 있다. 상응하게, 하위그룹 "Th1 high"의 배정 및 수립된 매우 높은 Tbet 유전자 발현의 경우에, 상기 활성 성분, 구체적으로 Tbet에 대해 특이적인 DNA자임의 증가된 용량이 투여될 수 있다.The type of dosage and dosage scheme will be determined by the attending physician according to clinical factors. Those of ordinary skill in the art will recognize that dosage type and dosage regimens will depend not only on factors that are different, such as body size, weight, body surface, age, sex or general health of the patient, The duration and form of administration, and other medicaments that may be administered concurrently. In the above process, according to a particularly advantageous embodiment, the amount of active ingredient of the agent can be adjusted to the measured expression level. Therefore, in the case of the assignment of the subgroup "Th2 high " and the very high GATA-3 gene expression established, an increased dose of the active component, specifically DNA specific for GATA-3, can be administered. Correspondingly, in the case of the assignment of the subgroup "Th1high " and the very high Tbet gene expression established, an increased dose of the active component, specifically DNA specific for Tbet, can be administered.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 투여량은 5 내지 50 mg의 hgd40, 구체적으로 5 내지 20 mg의 hgd40, 구체적으로 10 mg의 hgd40으로 구성된다. 특정 구현예에서, 상기 투여량이 2 ml의 PBS에 용해된다. 특정 구현예에서, 상기 투여량은 일일 (daily) 투여량이다.In certain embodiments of the invention, the dose comprises 5 to 50 mg of hgd40, specifically 5 to 20 mg of hgd40, specifically 10 mg of hgd40. In certain embodiments, the dose is dissolved in 2 ml of PBS. In certain embodiments, the dosage is a daily dose.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 1일 1회, 1일 2회, 또는 1일 3회, 구체적으로 1일 1회로 투여된다.In certain embodiments of the invention, the nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 is administered once a day, twice a day, or three times a day, specifically once a day.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3에 대한 DNA자임이 연속 요법, 구체적으로 유지 요법에서 연속 28일 동안 1일 1회 투여된다.In certain embodiments of the invention, the DNA molecule for GATA-3 is administered once a day for consecutive 28 days in continuous therapy, specifically, maintenance therapy.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 천식 치료를 위해 하기의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 흡입 또는 경구 요법제에 대한 부가 (add-on) 요법으로 사용된다: 코르티코스테로이드, 장시간-작용 베타 작용제 (long-acting beta agonists: LABAs), 장시간 작용 무스카린성 길항제 (long acting muscarinic antagonists: LAMAs), 항류코트리엔 (antileukotrienes), 단시간-작용 베타 작용제 (short-acting beta agonists: SABAs), 항콜린작용제 (anticholinergics) 및 모노클로날 항체.In certain embodiments of the invention, the nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3 is used as an add-on regimen for one or more inhalation or oral therapies selected from the following list for the treatment of asthma: corticosteroids Long-acting beta agonists (LABAs), long acting muscarinic antagonists (LAMAs), antileukotrienes, short-acting beta agonists (SABAs) ), Anticholinergics and monoclonal antibodies.

본 발명의 부가의 특성, 상세 및 이점은 하기 청구범위뿐만 아니라 도면을 참고로 하기 예시되는 실시예의 설명으로부터 나온다.Additional features, details and advantages of the invention emerge from the description of the embodiments illustrated below with reference to the drawings, as well as the appended claims.

실시예Example

실시예Example 1: 임상 연구 "흡입된 1: Clinical Study "Inhaled GATAGATA -3 특이적 DNA자임에 의한 알레르겐-유도된 천식 반응의 감쇠"Attenuation of allergen-induced asthma reactions by -3 specific DNA methylation "

요약summary

배경background

천식의 가장 우세한 표현형은 TH2-유도된 호산구 지배 염증 (TH2-driven eosinophil dominated inflammation)인 것을 특징으로 한다. GATA-3의 치료적 표적화인 TH2 경로의 마스터 전사 인자가 도움이 될 수 있다. 본 발명자들은 GATA-3 mRNA에 대해 특이적인 신규한 DNA자임 (SB010)의 안전성 및 효능을 평가하였다.The most prevalent phenotype of asthma is characterized by TH2-driven eosinophil dominated inflammation (TH2-driven eosinophil dominated inflammation). The TH2 pathway master transcription factor, a therapeutic targeting of GATA-3, may be helpful. We evaluated the safety and efficacy of the novel DNA sequence (SB010) specific for GATA-3 mRNA.

방법Way

본 무작위 배정, 이중-맹검, 플라시보-대조, 다기관 임상 실험에서, 알레르겐 유발 후에 이상 (biphasic) 초기 및 후기 단계 천식 반응 (EAR 및 LAR)을 나타내는 객담 호산구증가증이 있는 알레르기성 천식 환자에게 10 mg의 SB010 (21명의 평가가능한 환자) 또는 플라시보 (19명의 평가가능한 환자)를 몇일 동안 1일 1회 흡입에 의해 투여받도록 배정하였다. 알레르겐 챌린지가 치료 전과 치료 후에 수행되었다. LAR에서 FEV₁ 곡선하 면적 (AUC)에서의 변화가 1차 종료점이었다.In this randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter clinical trial, patients with allergic asthma who had sputum eosinophilia with biphasic early and late stage asthma reactions (EAR and LAR) SB010 (21 evaluable patients) or placebo (19 evaluable patients) were assigned to receive by inhalation once a day for several days. Allergen challenge was performed before and after treatment. The change in the area under the FEV ₁ curve (AUC) in the LAR was the primary endpoint.

결과result

SB010 치료 28일 후에, 치료전과 비교하여 평균 LAR AUC가 34%까지 감쇠되었고, 반면 1%의 LAR AUC 증가가 플라시보 그룹 (P=0.02)에서 관찰되었다- EAR AUC가 SB010에 의해 11%까지 감쇠된 것에 대해, 플라시보는 10% 증가되었다 (P=0.03). 이러한 효과는 혈중 호산구증가증 ≥ 4% (향상 LAR 41.7%, P=0.05; 향상 EAR 28.3%, P=0.02) 또는 FeNO ≥ 40 ppb인 환자들의 사전-지정된 하위그룹에서 더 두드러졌다. SB010에 의한 LAR 저해는 알레르겐 유도된 객담 호산구증가증의 감쇠 (P=0.06 전체 그룹; P=0.009 호산구 하위그룹; P=0.02 FeNO 하위그룹), 더 적은 객담 트립타제 (P=0.05) 및 혈장 IL-5 수준 (P=0.05)과 관련이 있었다. 알레르겐 유도된 FeNO 수준 및 메타콜린에 대한 기도 과민반응은 치료에 의해 영향을 받지 않았다. After 28 days of SB010 treatment, the mean LAR AUC was attenuated by 34% compared to before treatment, whereas the 1% LAR AUC increase was observed in the placebo group (P = 0.02) - the EAR AUC was attenuated by 11% For the placebo, the placebo was increased by 10% (P = 0.03). This effect was more pronounced in pre-specified subgroups of patients with serum eosinophilia ≥ 4% (improved LAR 41.7%, P = 0.05; enhanced EAR 28.3%, P = 0.02) or FeNO ≥ 40 ppb. LAR inhibition by SB010 was associated with attenuation of allergen-induced sputum eosinophilia (P = 0.06 whole group; P = 0.009 eosinophil subgroup; P = 0.02 FeNO subgroup), less sputum tryptase (P = 5 levels (P = 0.05). Allergen-induced FeNO levels and airway hyperresponsiveness to methacholine were not affected by treatment.

결론conclusion

SB010 치료는 알레르겐 유발 후에 알레르기성 천식에서 LAR 및 EAR 모두를 현저하게 감쇠시켰다. 바이오마커 분석으로 TH2 조절된 염증 반응에 있어서 현저한 효과를 확인하였다 (Clinical Trials - gov number, NCT 01743768).SB010 treatment markedly attenuated both LAR and EAR in allergic asthma after allergen challenge. Biomarker analysis confirmed a significant effect on TH2-mediated inflammatory response (Clinical Trials - gov number, NCT 01743768).

도입Introduction

SB010의 활성 약물 제품의 중심 코어는, hgd40의 상기 GATA-3 mRNA로의 결합 후에 상기 표적을 절단하는 촉매적 도메인을 나타낸다¹⁰ (보충 부록의 도 S1 및 S2 참조). Sel et al.¹¹은 DNA자임의 발생으로 GATA-3 mRNA를 절단할 수 있다고 보고하였고, 또한 알레르기성 기도 염증의 임상전 모델에서 그 효능을 입증하였다. 상기 약제 물질인 hgd40은 흡입에 의한 약물 전달의 부위에서 높은 생물활성 및 생체이용률을 특징으로 하고¹², 그러므로 추가의 임상 개발을 위해 선택되었고; hgd40은 GATA-3 mRNA 및 단백질뿐만 아니라 후속하는 인간 T-세포 및 조직 이식편에서 TH2시토킨의 생성을 현저하게 감소시켰다 (도 S3, 보충 부록). 원하지 않는 오프-타켓 (off-target) 효과가 배제되었고¹³, 또한 광범위한 독성 프로그램에서 주요 안전성 우려가 확인되지 않았다¹⁴. 해당하는 약물 제품인 SB010이 3가지 최근 완료된 무작위 배정, 플라시보 대조된 용량 증가 (dose escalation) I상 실험 (수정 논문)에서 연구되었다. 유망한 결과가 SB010의 효능을 평가하기 위한 IIa상 실험에서 증명되었다. 상기 연구는 지금까지 흡입된 DNA자임의 제1 IIa상 실험을 나타낸다.A central core of SB010 active drug product represents the catalytic domain to cut the target after bonding to the GATA-3 mRNA in hgd40 ¹⁰ (see Fig. S1 and S2 of the supplementary Appendix). Sel et al. ¹¹ reported that GATA-3 mRNA could be cleaved by the generation of DNA-DNA, and its efficacy was demonstrated in a preclinical model of allergic airway inflammation. The drug substance of hgd40 are at the site of drug delivery by inhalation characterized by high biological activity and bioavailability, and ^12, were therefore selected for further clinical development; hgd40 significantly reduced the production of TH2 cytokines in GATA-3 mRNA and protein as well as subsequent human T-cells and tissue grafts (Fig. S3, Supplementary Appendix). Unwanted off-target (off-target) effects were excluded ^13, and also a major safety concerns were identified in the comprehensive Toxicology Program ^14. The corresponding drug product, SB010, was studied in three recently completed randomized, placebo controlled dose escalation Phase I trials (revised papers). Promising results were demonstrated in Phase IIa experiments to evaluate the efficacy of SB010. The above study represents the first phase IIa phase experiment of the inhaled DNA.

방법Way

연구 설계 및 감독Research design and supervision

본 무작위 배정, 이중-맹검, 플라시보-대조 연구가 독일내 호흡기 연구 전문 7개의 연구 사이트에서 2013년 1월 (첫번째 환자가 등록)부터 10월 (마지막 환자의 마지막 방문)까지 수행되었다. 스크리닝 및 기준 평가 후에, 참가자들은, 활성 치료 또는 플라시보의 4-주 치료 기간에 대한 계층화 (stratification) 없이, 중앙 생성된 무작위 배정 목록 (Inamed GmbH, Munich, Germany)을 사용하여 무작위 배정되었다. 3번 흡입되는 알레르겐 챌린지는 스크리닝 시 (적격성), 무작위 배정 전 (치료 전) 및 28일 (치료 후)에 수행되었다. 상기 실험은 시작 전에 독일 규제 기관인 "Bundesinstitut fuer Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM)" 및 각 참여 센터의 중앙 및 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 상기 연구가 양호한 임상 실무 원리 및 헬싱키 선언 (Declaration of Helsinki)에 따라 수행되었다. 모든 참가자들에게 연구-특이적 절차가 수행되기 전에 서면으로 정보 동의서를 제공하였다. 각 연구 사이트에서 데이터가 수집되었고, 이를 INAMED GmbH (Gauting, Germany)의 데이터 베이스로 넣었다. 통계 분석이 FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany)에 의해 독립적으로 수행되었다. 상기 논문의 제1 초안이 제1 및 마지막 저자에 의해 작성되었고, 이들은 또한 공개를 위해 논문 제출을 결정했다. 후원자에 의해 후원받은 전문 의학 저자는 작성 및 편집을 지원하였다. 제1 및 마지막 저자, 및 후원자의 고용인들인 저자들은 상기 데이터의 정확도 및 완전성, 통계 분석 및 최종 프로토콜에 대한 실험의 충실도를 보장한다.This randomized, double-blind, placebo-controlled study was performed from January 1, 2013 (first patient enrollment) to October (last patient's last visit), in seven study sites on respiratory studies in Germany. After screening and baseline assessment, participants were randomly assigned using a centrally generated random assignment list (Inamed GmbH, Munich, Germany) without stratification of the active treatment or placebo for the 4-week treatment period. The 3 inhalation allergen challenge was performed at screening (eligibility), before randomization (before treatment) and 28 days (after treatment). The experiment was approved by the German regulatory body "Bundesinstitut fuer Arzneimittel und Medizinprodukte" (BfArM) and by the central and local ethics committees of each participating center before the start. The study was conducted in accordance with good clinical practice principles and the Declaration of Helsinki. All participants were informed in writing before the research-specific procedure was performed. Data was collected at each study site and put into the database of INAMED GmbH (Gauting, Germany). Statistical analysis was performed independently by FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany). The first draft of the paper was written by the first and last authors, who also decided to submit the paper for publication. A professional medical author sponsored by the sponsor supported the writing and editing. Authors who are employees of the first and last authors and sponsors ensure the accuracy and completeness of the data, statistical analysis and fidelity of the experiment to the final protocol.

환자patient

본 발명자들은, 스크리닝되기 적어도 6개월 전에 GINA 지침¹⁵에 따라 경미한 천식으로 진단받았고, 또한 흡입하는 단시간 작용하는 기관지확장제 이외의 임의의 천식 약제로 치료되지 않은, 18세 내지 64세의 백인 남성 환자를 모집하였다. 스크리닝 시에, FEV₁은 단시간-작용하는 기관지확장제를 흡입하고 적어도 6시간 후에 예측된 정상의 ≥ 70%이었다. 이들 천식의 알레르기 특성은 통상의 공기알레르겐에 대한 포지티브 피부 단자 시험 (skin prick test) 및 포지티브 알레르겐-유도된 초기- 및 후기-단계 반응 (FEV₁에서 각각 ≥20% 및 ≥15% 감소)을 통해 증명되어야 한다. 객담 호산구의 존재는 알레르겐 챌린지의 스크리닝 전 또는 후에 증명되어야 한다. 포함 및 배제 기준의 상세한 사항은 보충 부록에서 찾을 수 있다.We have identified a white male patient aged 18 to 64 years who was diagnosed with mild asthma according to GINA Guideline ¹⁵ at least six months prior to screening and who had not been treated with any asthma medication other than the inhaled short acting bronchodilator . Upon screening, FEV ₁ was ≥70% predicted normal at least 6 hours after inhaling short-acting bronchodilator. The allergic properties of these asthmatics were assessed through a positive skin prick test for normal air allergens and positive allergen-induced early- and late-stage responses (≥20% and ≥15% reduction in FEV ₁ , respectively) It must be proven. The presence of sputum eosinophils must be demonstrated before or after the screening of the allergen challenge. Details of the inclusion and exclusion criteria can be found in the supplementary appendix.

연구 치료Research therapy

약물 제품인 SB010은 2 mL의 포스페이트 완충된 식염수 중 10 mg의 인간 GATA-3-특이적 DNA자임 hgd40 (BioSpring GmbH에 의해 제조, Frankfurt, Germany) (또는 부합하는 플라시보)이다. 최종 약물 제품은 블라인딩 (blinding)을 확실하게 하기 위해서 동일한 포장으로 중앙에서 제조되었다 (BAG Health Care GmbH, Lich, Germany). 약물 제품 또는 플라시보가, 최적화된 약물 침적을 보장하기 위해서¹⁶ AKITA² APIXNEB 네불라이저 (Activaero GmbH, Gemuenden, Germany)를 사용하여 연속 28일 동안 약 3-8분 지속하는 흐름- 및 부피 조절된 흡입에 의해서 아침에 1일 1회 투여되었다. 환자는 등록 전에, 상기 장치의 사용에 대해 의무적인 훈련을 받았다. 상기 치료 기간 동안 각 방문에서, 활성 치료 또는 플라시보가 연구 스태프의 감독하에 연구 사이트에서 투여되었다. 남아있는 용량이 자가-투여되었고, 상기 장치의 스마트 카드를 사용하여 순응도가 체크되었다.The drug product, SB010, is 10 mg human GATA-3-specific DNA, hgd40 (manufactured by BioSpring GmbH, Frankfurt, Germany) (or a matching placebo) in 2 mL of phosphate buffered saline. The final drug product was prepared centrally in the same package to ensure blinding (BAG Health Care GmbH, Lich, Germany). The drug product or placebo was added to the flow-and volume-controlled inhalation to last for about 3 to 8 consecutive days using a ¹⁶ AKITA ² APIXNEB Nebulizer (Activaero GmbH, Gemuenden, Germany) to ensure optimized drug deposition In the morning once a day. The patient was compulsorily trained for the use of the device prior to registration. At each visit during the treatment period, active therapy or placebo was administered at the study site under the supervision of the research staff. The remaining dose was self-administered and compliance was checked using the smart card of the device.

연구 절차Research procedure

주요 연구 절차 및 개입에 대한 개요가 도 1a에 개시되었다 (연구 절차의 전체 요약은 보충 부록에서 찾을 수 있다).A summary of key research procedures and interventions is presented in Figure 1A (a full summary of the study procedures can be found in the Supplementary Appendix).

알레르겐 챌린지 및 폐 기능 테스트

Allergen challenge and lung function tests

알레르겐 챌린지를 위한 적합한 알레르겐이 첫번째 스크리닝 방문에서 피부 단자 시험에 의해 확인되었다 (상세한 사항은 보충 부록 표 S1 참조). (메타콜린 유발에 의한) 기도 반응성과 함께 두번째 스크리닝 방문에서 (첫번째 방문하고 적어도 1주 후) 후속하는 피부 단자 희석 시험을 사용하여 스크리닝 알레르겐 챌린지에 대한 안전한 개시 농도를 정의하였다¹⁷. 흡입된 공기알레르겐의 증가하는 농도가, FEV₁에서 ≥20% 감소에 도달할 때까지, 투여되었다¹⁸. FEV₁에서 20% 감소를 유도하는 흡입된 공기알레르겐의 최종 3개의 농도 단계가 무작위 배정 전 (치료 전) 및 치료 기간 28일 후 (치료 후)에 동일한 방식으로 투여되었다¹⁹. 일련의 폐활량측정법 측정이 최신 지침에 따라 알레르겐 챌린지 후에 10분 내지 180분 사이 (초기 단계 천식 반응, EAR) 및 7시간 사이 (후기 단계 천식 반응, LAR)에서 이중으로 수행되었다. 챌린지들 사이에 적절한 세척 횟수가 FEV₁을 보장하기 위해서 수행되었고, FeNO 수준을 모든 환자에서 추가의 챌린지 전에 기준 값으로 되돌렸다.Suitable allergens for the allergen challenge have been identified by skin tester testing at the first screening visit (see Supplementary Table S1 for details). It was in the second screening visit with (by methacholine-induced) airway reactivity define a safe start concentration for screening allergen skin prick challenge using the dilution test the subsequent (first visit and at least 1 week after) ^17. The increased concentration of the intake air allergens, until reaching a ≥20% decrease in FEV _1, was administered ^18. The final three concentrations of inhaled air allergens leading to a 20% reduction in FEV ₁ were administered in the same manner before randomization (before treatment) and 28 days after treatment (after treatment) ¹⁹ . A series of spirometry measurements were performed in duplicate between 10 minutes and 180 minutes (early stage asthma response, EAR) and between 7 hours (late stage asthmatic response, LAR) following the allergen challenge according to the latest guidelines. An appropriate number of washes between challenges was performed to ensure FEV ₁ and the FeNO levels were returned to baseline values before further challenge in all patients.

메타콜린 챌린지 테스트

Methacoline Challenge Test

기도 반응성이, ATS 지침에 따라 FEV₁에서 ≥20% 감소를 유도하는 메타콜린 (Provocholine, Metapharm Inc., Brantford, ON, Canada)의 농도 (PC20 농도)로 도 1a에 개시된 시간에서 평가되었다²¹.Airway reactivity were evaluated in the time described in Figure 1a in a concentration (concentration PC20) of methacholine (Provocholine, Metapharm Inc., Brantford, ON, Canada) for deriving a ≥20% decrease in FEV ₁ in accordance with the ATS guidelines ^21.

날숨에서 산화질소 측정

Measure nitric oxide from exhalation

분획 호기 산화질소 (FeNO)의 수준이 제조사의 지시에 따른 ATS/ERS 권장사항²²에 따라 휴대용 NIOX MINO® 장치 (Aerocrine, Solna, Sweden)를 사용하여 도 1a에 지시된 시간에서 측정되었다.Levels of fractionated exhaled nitric oxide (FeNO) were measured at the times indicated in FIG. 1A using a portable NIOX MINO® device (Aerocrine, Solna, Sweden) according to ATS / ERS Recommendation ²² according to the manufacturer's instructions.

객담 유도

Inducing sputum

유도된 객담 시료가 5회의 시점에서 채취되었다 (도 1a): 스크리닝시, 치료전 챌린지 전 (최대 2주) 및 24시간 후, 및 치료후 전 (24-48시간) 및 24시간 후. 상층액 중 세포 분포 및 매개체의 분석이 중앙 실험실에서 평가되었다.Induced sputum samples were collected at five time points (Figure 1a): at screening, before challenge (max 2 weeks) and after 24 hours, and before (24-48 hours) and 24 hours after treatment. Cell distribution and mediator analysis in supernatants was evaluated in the central laboratory.

면역학적 파라미터의 측정Measurement of immunological parameters

시토킨 및 케모킨 TNF-α, IL-1β, IL-8 MCP-1, MCP-4, MIP-1β, MDC, IP10 및 IL-4, IL-5 및 IL-13, 및 IFN-γ가 제조사의 지시에 따라 TH1/TH2 및 케모킨 다중 분석 (Meso Scale Discovery, Rockville, USA)에 의해 혈장 및/또는 객담 상층액에서 측정되었다. 객담 상층액 중 호산구 양이온 단백질 (Eosinophil cationic protein: ECP) 및 트립타제가 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 ELISA (ECP 및 트립타제: Cloud- Clone, Houston, USA)를 사용하여 측정되었다. MCP-1, MCP-1, MCP-1, MCP-1, MCP-1 and MCP-1, IL-4, IL-5 and IL-13, and IFN- / RTI > were measured in plasma and / or sputum supernatant by TH1 / TH2 and chemokine assay (Meso Scale Discovery, Rockville, USA) according to the manufacturer's instructions. Eosinophil cationic protein (ECP) and tryptase in the sputum supernatant were measured using a commercially available ELISA (ECP and tryptase: Cloud-Clone, Houston, USA) according to the manufacturer's instructions.

안전도 평가Safety assessment

유해 사례 및 수반되는 투약이 매 방문시 평가되었다. 안전도 실험실 분석 (혈액학, 임상 화학 및 소변검사 포함)이 처음 투여 전 및 치료 동안 2주 간격으로 수행되었다 (상세한 사항은 보충 부록 참조). 또한, 항핵 항체 (antinuclear antibodies) (면역형광 스크리닝 테스트) 및 류마티스 혈청학 (rheumatoid serology) (IgM)이, DNA자임-기반 약물에 의한 치료에 기인한 (자가-)항체 발생을 배제시키기 위해서 치료 전 및 후에 측정되었다.Adverse events and concomitant medications were evaluated at each visit. Safety analysis (including hematology, clinical chemistry, and urinalysis) was performed at two week intervals prior to and during the first dose of treatment (see Appendix for details). In addition, antinuclear antibodies (immunofluorescence screening test) and rheumatoid serology (IgM) may be administered before and / or after treatment to exclude (self-) antibody development due to treatment with a DNA- Was measured later.

연구 결과 측정Measuring Research Results

1차 결과 측정은 (알레르겐 챌린지 4시간 후) LAR 동안 기준 FEV₁의 백분율로 표시되는 FEV₁ 곡선하 면적 (AUC)에 있어서 흡입된 SB010의 다중 투여의 영향이 있다. AUC가 사다리꼴 규칙 (trapezoidal rule)을 사용하여 산출되었다. 탐색적 종료점 (exploratory endpoints)은 EAR (0-3시간) 동안 FEV₁ 곡선하 면적에 있어서 SB010의 영향, 기도 반응성 (PC20 메타콜린)에서 알레르겐-유도된 변화, FeNO 수준, 및 혈장 및 객담내 바이오마커를 포함한다.The primary outcome measure is the effect of multiple doses of SB010 inhaled in the area under the FEV ₁ curve (AUC), expressed as a percentage of baseline FEV ₁ during LAR (after 4 hours of allergen challenge). AUC was calculated using the trapezoidal rule. Exploratory endpoints were defined as the effect of SB010 on area under the FEV ₁ curve for EAR (0-3 h), allergen-induced changes in airway reactivity (PC20 methacholine), FeNO levels, Markers.

시료 크기 및 통계 분석Sample size and statistical analysis

타입 I 오차 확률이 10%이고, 치료 그룹 간 효과 크기의 차이가 8%이고, 및 검정력 (power)이 적어도 80%인 것을 가정할 때, 적어도 38명의 평가가능한 피험체를 필요로 한다. 예상되는 탈락률 15%를 기준으로, 43명의 피험체가 무작위로 배정되고, 시험 약물 또는 플라시보에 노출되었다. 효능 및 약력학 결과가 도 1에 개시된 바와 같이 모든 평가가능한 환자들 (치료 의도 집단)에서 분석되었다.Assuming that the Type I error probability is 10%, the difference in effect size between treatment groups is 8%, and the power is at least 80%, at least 38 evaluable subjects are required. Based on the expected drop out rate of 15%, 43 subjects were randomly assigned and exposed to the test drug or placebo. Efficacy and pharmacodynamic results were analyzed in all evaluable patients (treatment intention group) as described in FIG.

상기 1차 효능 결과 (LAR에서 AUC)가, 공변수로서 LAR에서 기준 AUC를 갖는 ANCOVA 모델을 사용하여 치료 그룹들 사이에서 비교되었다. 4명의 SB010 그룹의 환자 및 3명의 플라시보 그룹의 환자는 처음 치료전 알레르겐 챌린지에서 LAR만 증명하였다. 상기 환자들에 있어서, 상기 알레르겐 챌린지로부터의 폐 기능 데이터가 치료전 값으로 사용되었다. 다른 종료점이 또한 동일한 모델에 의해 또는 통계적 분석 계획에서 정의된 바와 같이 백분율 변화의 그룹 비교들 사이에 있어서 Wilcoxon 순위 합 검정 (rank sum tests)을 사용하여 또한 분석되었다. 안전도 결과 측정이 환자에 의해 열거되었고, 서술되는 통계학이 산출되었다. 통계적 방법의 더 상세한 사항은 보충 부록에서 찾을 수 있다.The primary efficacy outcome (AUC in LAR) was compared between treatment groups using the ANCOVA model with baseline AUC in LAR as a covariate. Patients in four SB010 groups and three placebo groups demonstrated only LAR in the pre-treatment allergen challenge. In these patients, pulmonary function data from the allergen challenge was used as the pretreatment value. Other endpoints were also analyzed using the Wilcoxon rank sum tests between group comparisons of percentage changes as defined in the same model or statistical analysis scheme. Safety measures The results were listed by the patient and the statistics described were calculated. Further details of statistical methods can be found in the supplementary appendix.

결과result

환자patient

21명의 환자가 SB010 그룹에서 모든 연구 평가를 완료하였고, 18명 및 19명의 환자가 플라시보 그룹에서 각각 LAR 및 EAR 평가를 완료하였다 (도 1b). 상기 환자들에 대한 인구통계학적 (demographic) 및 기준 데이터가 표 1a 및 표 1b에 개시되었다.Twenty-one patients completed all study assessments in the SB010 group, and 18 and 19 patients completed LAR and EAR assessments, respectively, in the placebo group (FIG. 1b). Demographic and baseline data for the patients are shown in Tables 1a and 1b.

천식 초기 및 후기 단계 반응Early and late asthmatic reactions

도 2a에 개시된 바와 같이 (보충 부록 표 S2), LAR이 SB010 치료 후에 감쇠되었고, 여기서 상기 평균 곡선하 면적 (AUC)이 33.7%로 현저하게 향상되었고 (P=0.02) 및 최대 FEV₁ 감소에서 31.6% 향상되었다 (P=0.09). EAR은 또한, 11.3%의 평균 AUC 향상 (P=0.04) 및 21.5%까지의 최대 FEV₁ 감소의 향상 (P=0.04)으로 현저하게 감쇠되었다.(Supplementary Appendix Table S2), as disclosed in Figure 2a, LAR this was attenuated after SB010 treatment, in which was the average area under the curve (AUC) is markedly improved by 33.7% (P = 0.02) and the maximum FEV ₁ decreased from 31.6 % (P = 0.09). The EAR was also significantly attenuated with an average AUC improvement (P = 0.04) of 11.3% and an improvement of the maximum FEV ₁ reduction by 21.5% (P = 0.04).

사전-지정된 하위그룹에서 천식 초기 및 후기 단계 반응Pre-initial and late phase response of asthma in designated subgroup

사전-지정된 하위그룹에서, 기준에서 상대 혈중 호산구 수 ≥ 4%인 환자는, SB010 치료 후에 LAR에서 AUC의 더 큰 향상 및 EAR에서 현저한 효과를 보였다 (도 2b 및 보충 부록 S3A). LAR에서 AUC의 감소가 상기 SB010 그룹에서 41.7%까지 감쇠되었다 (P=0.05) (표 S3A). 이는 EAR에서 28.3%까지의 감쇠를 수반한다 (P=0.02). SB010 및 플라시보 치료 후에 상기 AUC의 개별 변화가 도 3 (및 보충 부록 표 S4A 및 S4B)에 도시되었다. 유사한 관찰이 기준에서 FeNO ≥ 40 ppb인 하위그룹에 대해 보고되었다 (도 2c, 보충 부록 표 S3B). 상기 하위그룹들의 계층들 사이의 이질성 (heterogeneity)에 대한 테스트는 유의성이 없었다.In the pre-assigned subgroup, patients with relative blood eosinophil counts ≥ 4% in baseline showed a greater improvement in AUC in LAR and a significant effect on EAR after SB010 treatment (Fig. 2b and Supplement Appendix S3A). A decrease in LAR was attenuated by 41.7% in the SB010 group (P = 0.05) (Table S3A). This is accompanied by attenuation of up to 28.3% in the EAR (P = 0.02). Individual changes of the AUC after SB010 and placebo treatment are shown in Fig. 3 (and Supplemental Appendices Tables S4A and S4B). A similar observation was reported for subgroups of FeNO ≥ 40 ppb in the standard (Fig. 2c, Supplementary Appendix Table S3B). Testing for heterogeneity between the layers of the subgroups was not significant.

TH2-유도된 염증의 Of TH2-induced inflammation 마커에On the marker 의한 간섭 Interference by

치료 28일 후에, SB010은 플라시보에 대해 알레르겐 유도된 객담 호산구증가증을 감쇠시켰고, 비록 이러한 차이는 전체 연구 그룹에서 통계적으로 유의하지 않았지만 (P=0.06), 혈중 호산구 ≥ 4% (P=0.009) 및 FeNO ≥ 40ppb (P=0.02)인 사전-지정된 하위그룹에서는 유의성이 있었다. 객담 호산구증가증에서 변화는 혈중 IL-5 수준에서 유의한 차이 (P=0.05)를 수반하였다 (도 4). 플라시보 그룹에서 관찰된 IL-5 수준의 치료후 증가는 SB010 치료 후에 부재했다. 치료 과정 28일 마지막에, 객담 트립타제 수준은, 플라시보와 비교하여 (중간 13.10 IQR 6.05-22.77 ng/mL), 상기 SB010 치료 그룹에서 현저하게 (P=0.05) 더 낮았다 (중간 6.39 IQR 2.03-13.88 ng/mL). 알레르겐-유도된 FeNO 수준 및 챌린지 24시간 후에 메타콜린에 대한 기도 과민반응은 연구 치료에 의해 영향을 받지 않았다 (보충 부록 표 S5).After 28 days of treatment, SB010 attenuated allergen-induced sputum eosinophilia in the placebo, although this difference was not statistically significant in the entire study group (P = 0.06), blood eosinophil ≥4% (P = 0.009) and There was significance in pre-assigned subgroups with FeNO ≥ 40 ppb (P = 0.02). Changes in sputum eosinophilia were accompanied by a significant difference in blood IL-5 levels (P = 0.05) (Fig. 4). The post-treatment increase in IL-5 levels observed in the placebo group was absent after SB010 treatment. At the end of the 28-day course of treatment, sputum tryptase levels were significantly lower (P = 0.05) in the SB010 treatment group compared to placebo (median 13.10 IQR 6.05-22.77 ng / mL) (median 6.39 IQR 2.03-13.88 ng / mL). The allergen-induced FeNO levels and the airway hyperresponsiveness to methacholine after 24 hours of challenge were not affected by study treatments (see Appendix Table S5).

안전도 및 내성 (tolerability)Safety and Tolerability

SB010 또는 플라시보를 투여받은 환자들 사이에서 치료 응급 유해 사례 (treatment emergent adverse events: TEAEs)의 주목할만한 차이는 관찰되지 않았다. 플라시보 그룹에서 8명의 환자가 TEAEs를 가졌고, SB010 그룹에서 6명의 환자와 비교되었다 (표 3). 심각한 TEAEs나, 임의의 가능한 또는 특정한 SB010-관련 TEAEs는 없었다. 2명의 환자에서 2건의 TEAEs (구역 및 가려움)가 SB010과 관련이 있을 가능성이 있다. 심각한 TEAEs는 없었다. 다른 안전도 변수는, 보충 부록에 열거된 모든 안전도 종료점을 포함하여, 어떤 안전도 문제도 드러내지 않았다. TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1, MCP-4, MIP-1β, MDC 및 IP-10의 치료전 및 치료후 측정에서 연구 그룹들 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았고 (보충 부록 표 S7); 류마티스 혈청학 및 검출된 항핵 항체의 유의한 증가도 없었고, 이는 본래의 면역 활성화의 부재 및 오프-타켓 효과의 부재를 나타낸다.No notable differences in treatment emergent adverse events (TEAEs) between patients receiving SB010 or placebo were not observed. Eight patients in the placebo group had TEAEs and six patients in the SB010 group (Table 3). There were no serious TEAEs or any possible or specific SB010-related TEAEs. In two patients, two TEAEs (zone and itch) may be associated with SB010. There were no serious TEAEs. Other safety variables, including all safety end points listed in the supplement annex, did not reveal any safety issues. There was no significant difference between the study groups in pre- and posttreatment measurements of TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1, MCP-4, MIP-1β, MDC and IP- Appendix Table S7); There was also no significant increase in rheumatic serology and detected antinuclear antibodies, indicating the absence of intrinsic immune activation and the absence of off-target effects.

토의discussion

흡입된 기관지 알레르겐 챌린지는 알레르기성 염증 및 기관지수축의 널리 허용되는 인 비보 모델이고¹⁸, 또한 초기 임상 단계 실험에서 LAR의 치료적 저해는 약물 개발 프로그램의 나중 단계에서 임상 효능에 대한 합리적인 양호한 예측인자이다²⁴. 예로는 TH2 시토킨 가령 IL- 4^25,26,27, IL-5^28,29,30, IL-13^31,32, 및 TSLP³³의 표적화 경로를 포함한다. 본 연구에서, SB010에 의한 치료는 알레르겐 흡입 후에 EAR 및 LAR 동안 폐 기능을 현저하게 향상시켰다. SB010이 전사 인자 GATA-3을 특이적 및 선택적으로 표적화하기 때문에, 상기 데이터는 TH2-유도된 천식 표현형을 갖는 환자에서 알레르겐 흡입 후에 천식 반응에서 GATA-3 의존성 및 조절된 경로의 중요성을 강하게 뒷받침하고, 또한 SB010이 알레르기성 천식에 대한 유망한 치료를 나타낼 수 있다고 제시하였다.Inhaled bronchial allergen challenge and in vivo model it is widely accepted in the allergic inflammation and ^{bronchoconstriction. 18,} also therapeutically effective inhibition of the LAR in the early clinical phase experiments at later stages of drug development programs is reasonably good predictor of clinical efficacy ²⁴ . Examples include the targeting pathway of TH2 cytokines such as IL-4 ^25,26,27 , IL-5 ^28,29,30 , IL-13 ^31,32 , and TSLP ³³ . In this study, treatment with SB010 significantly improved lung function during EAR and LAR after allergen inhalation. Because SB010 specifically and selectively targets the transcription factor GATA-3, the data strongly support the importance of GATA-3-dependent and regulated pathways in asthmatic responses after allergen inhalation in patients with TH2-induced asthma phenotypes , Suggesting that SB010 may also represent promising treatment for allergic asthma.

본원의 환자들은 향상된 혈중 및 객담 호산구뿐만 아니라 향상된 수준의 FeNO로 개시되는 바와 같이 통상의 TH2-유도된 엔도타입의 경미한 알레르기성 천식을 갖는다³⁴ ^, ³⁵. 상기 타입-2 엔도타입은 프로토타입 아토피 (prototypic atopic) 및 알레르기성 천식에서 나타날 뿐만 아니라, 과-호산구성 후기 발병 천식 (hyper-eosinophilic late onset asthma), 지속성 및 중증 천식, 및 아스피린-민감성 천식을 포함하는 다른 임상 표현형의 천식에서 최근에 관찰되었다⁵ ^,36, ³⁷. 포함 기준은 상기 엔도타입을 갖는 환자들의 더 넓은 스펙트럼을 커버하도록 정의되었고 (예컨대 단지 "객담 호산구의 존재"), 또한 폐 기능 데이터는 SB010이 전체적으로 본 연구 그룹에서 유의한 영향을 갖는다는 것을 보여주었다. 그러나, 사전-지정된 하위그룹 분석에서, 더 현저한 TH2-유도된 표현형 (적어도 4%의 혈중 호산구 수준 또는 적어도 40 ppb의 FeNO 수준)을 가진 환자는 SB010 치료로부터 특별한 혜택을 받는 것으로 보였다. LAR에 있어서 더 현저한 치료적 효과 외에도, EAR은 또한 현저한 감쇠를 보였다. 상기 천식 반응의 두 단계를 통한 이중 작용 기전은 항-IgE³⁸ 및 가장 최근의 항-TSLP³³ 이래로 임의의 생물학적 약물 후보체에 대해 보고되지 않았다. SB010 치료는 중증으로 악화되는 경향이 있는 환자에게 특히 유익할 수 있는지 여부가 앞으로의 임상 실험에서 연구될 필요성이 있다³⁶. 상기 TH2 반응의 조절에서 GATA-3의 중심 역할이 잘 확립되었다. TH2 이펙터 기능의 개발 및 유지는 엄격하게 GATA-3에 의존한다³⁹. 최근에, GATA-3의 필수 기능이 타입 2 본래의 림프 세포에서 확인되었다⁴⁰. 그러나, 상기 전사 인자는 또한 상기 TH2-세포의 서브세트를 초과하는 중요한 기능을 발휘한다. GATA-3이 또한 비만-세포³⁹, 호산구⁴¹ 및 기도 상피세포에서 발현되었고, 여기서 상기는 알레르겐-유도된 알레르기 반응과 관련된 중요한 기능 및 이펙터 기전을 조절한다⁴² ^, ⁴³. 알레르겐 챌린지 후에, EAR은 비만-세포 탈과립 (degranulation)에 의존하고, 반면에 LAR은 바람직한 T-세포 의존성이고, 또한 기도 및 기도 내강으로 호산구의 뚜렷한 유입을 수반한다. 비만-세포 트립타제는 비만-세포 활성화 및 비만-세포 탈과립을 반영하는 신뢰할 수 있고 강력한 마커를 나타낸다. 본 발명의 결과는 SB010 치료는 상기 천식 반응의 이펙터 세포에 직접 또는 간접적으로 영향을 준다는 것을 나타내었다. SB010은, TH2 세포를 조절하여 생존 및 활성화 인자를 갖는 이펙터 세포를 박탈할 뿐만 아니라 국소 염증 조직 중 호산구 및 비만-세포에서 GATA-3 mRNA와 직접적인 간섭을 통해서, 이중 형태로 저해 및 조절 기능을 수행할 것이다. 그러나, GATA-3 DNA자임 치료의 모든 생물학적 효과를 완전하게 설명하기 위해서는 부가의 기전 연구가 필요하다.Present in the patient have the usual TH2- mild allergic asthma induced endo type, as well as improved blood and sputum eosinophils disclosed with enhanced levels of FeNO ^{^34,} ^35. The type-2 endotypes are not only seen in prototypic atopic and allergic asthma, but also in hyper-eosinophilic late onset asthma, persistent and severe asthma, and aspirin-sensitive asthma Recently, it has been observed in asthma of other clinical phenotypes including ⁵ ^{, 36,} ³⁷ . Included criteria were defined to cover a broader spectrum of patients with the endo type (e. G., "Presence of sputum eosinophils only") and lung function data also showed that SB010 overall had a significant effect in this study group . However, in the pre-assigned subgroup analysis, patients with a more prominent TH2-induced phenotype (at least 4% blood eosinophil level or at least 40 ppb FeNO level) appeared to receive particular benefit from SB010 treatment. In addition to the more prominent therapeutic effects on LAR, the EAR also showed significant attenuation. Double action mechanisms through the two phases of the asthmatic response have not been reported for any biological drug candidates since anti-IgE ³⁸ and the most recent anti-TSLP ³³ . Whether SB010 therapy may be particularly beneficial to patients who are severely aggravated needs to be studied in future clinical trials ³⁶ . The central role of GATA-3 in regulating TH2 response was well established. Development and maintenance of the TH2 effector function is strictly dependent on the GATA-3 ^39. Recently, the essential function of GATA-3 has been identified in type 2 native lymphocytes ⁴⁰ . However, the transcription factor also exerts an important function beyond the subset of TH2-cells. GATA-3 is also ^obesity-39 cells, eosinophils, and ⁴¹ was expressed in the airway epithelium, wherein the allergen-regulate important functions and effects related to the mechanism of the induced allergic reaction ^{^{^42,43.}} After an allergen challenge, the EAR relies on obesity-cell degranulation, whereas LAR is a favorable T-cell dependent and also involves a pronounced uptake of eosinophils into the airways and airway lumens. Obesity-cell tripyridides represent a reliable and powerful marker that reflects obesity-cell activation and obesity-cell degranulation. The results of the present invention show that SB010 treatment directly or indirectly affects the effector cells of the asthmatic response. SB010 regulates TH2 cells to deprive effector cells with survival and activation factors as well as to inhibit and regulate in a dual fashion through direct interference with GATA-3 mRNA in eosinophils and obesity-cells in local inflammatory tissues something to do. However, additional mechanism studies are needed to fully explain all the biological effects of GATA-3 DNA fingerprinting.

I상 프로그램 동안 노출된 개체들과 조합하여, 본 연구에 노출된 환자들은 120명 이상의 개인들에서 1200건 초과의 적용의 안전도 데이터베이스를 포함하고, 이중 39명은 천식을 가졌다. 광범위한 비-임상 프로그램의 결과와 함께 임상 개발 중에 안전도 시그날이 검출되지 않았다. 결론적으로, 본 개념-입증 실험 (proof-of-concept trial)은 흡입된 DNA자임 SB010 치료의 효능에 대한 증거를 제공하며, 알레르겐 유발 후 초기 및 후기 단계 천식 반응 둘 다에서 현저하게 감쇠되었다. 상기 효과가 우세한 TH2 표현형을 갖는 증상적, 지속적 천식 환자에서 임상적 혜택으로 해석될 수 있는지를 탐색하기 위한 추가의 임상 연구가 필요하다.In combination with exposed individuals during the I-phase program, patients exposed to the study included more than 1200 applications of safety data in more than 120 individuals, of whom 39 had asthma. A safety signal was not detected during clinical development with the results of a wide range of non-clinical programs. In conclusion, this proof-of-concept trial provided evidence for the efficacy of inhaled DNA-based SB010 therapy and was markedly attenuated in both early and late asthmatic responses after allergen challenge. Further clinical studies are needed to explore whether these effects can be interpreted as clinical benefits in symptomatic and persistent asthma patients with predominant TH2 phenotype.

[표 1A][Table 1A]

본 연구를 완료한 환자들에 대한 인구통계학적 및 기준 데이터Demographic and baseline data for patients who completed this study

모든 데이터는 평균 (SD)으로 표시되었고, 단 객담 중 호산구는 예외이다 (중간값, 제1 및 제3 사분위수). 분획 호기 산화질소 (FeNO), 기도 과-반응성 (PC20), 혈중 호산구 및 유도된 객담 중 호산구가 무작위 배정 전에 측정되었다. 객담 중 호산구 값은 각각 SB010에 대해 n=20 및 플라시보 그룹에 대해 n=17에 기반한다. P 값은 Wilcoxon 순위 합 검정에 따른다 (물질 및 방법 참조).All data were expressed as mean (SD), except for eosinophils in sputum (median, first and third quartiles). Fractional airway nitric oxide (FeNO), airway-responsiveness (PC20), eosinophils in blood and eosinophils in induced sputum were measured before randomization. The eosinophil values during sputum are based on n = 20 for SB010 and n = 17 for placebo groups, respectively. P values are based on the Wilcoxon rank sum test (see Materials and Methods).

[표 1B][Table 1B]

본 연구를 완료한 Completed this study 환자들에 대한 상세한 인구통계학적Detailed demographic data on patients 및 기준 데이터 And reference data

모든 데이터는 평균 (SD)으로 표시되었다. 분획 호기 산화질소 (FeNO), 기도 과민반응성 (PC20), 혈중 호산구 및 유도된 객담 중 호산구가 무작위배정 전에 측정되었다. P 값은 Wilcoxon 순위 합 검정에 따른다 (물질 및 방법 참조).All data are expressed as mean (SD). Fractional nitric oxide (FeNO), airway hyperreactivity (PC20), eosinophils in blood and eosinophils in induced sputum were measured before randomization. P values are based on the Wilcoxon rank sum test (see Materials and Methods).

[표 2][Table 2]

치료전Before Treatment 및 And 치료후After treatment 알레르겐 Allergen 챌린지challenge 후에 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 Changes in late and early stage reactions after

후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지의 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. AUC 치료전 및 치료후 값, 후속하는 SB010 및 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화가 제공된다. 상기 변화는 AUC의 전-후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양 (positive)의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음 (negative)의 값은 치료전과 비교하여 치료 후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 완전한 데이터세트는 보충 부록의 표 S2를 참조한다.Mean values for the area under the curve (AUC) for late asthma response (LAR) and initial asthma response (EAR) were disclosed. The decrease in AUC values from pre-treatment to post-treatment reflects an improvement in pulmonary function. Changes in lung function before and after AUC treatment and for each subsequent SB010 and placebo group are provided. The change was expressed as the pre-post-AUC value and the percentage change between pre-treatment and post-treatment. A positive value reflects an improvement in pulmonary function and a negative value corresponds to a larger area under the curve in the post-treatment challenge compared to before treatment. Refer to Table S2 in the supplementary appendix for the complete data set.

[표 3][Table 3]

체계 기관 분류에 의한 치료 응급 유해 사례 (Emergency case of treatment by system organ classification TEAEsTEAEs ))

장기 시스템Long-term system

^1One 현기증; dizziness; ²² 설사, 구역; Diarrhea, area; ³³ 단순 헤르페스, 비인두염; Herpes simplex, nasopharyngitis; ⁴⁴ 열상; laceration; ⁵⁵ 근육통; Muscle pain; ⁶⁶ 두통, 좌골신경통; Headache, sciatica; ⁷⁷ 천식, 기관지 폐쇄, 호흡곤란, Asthma, bronchial obstruction, dyspnea, 증가된Increased 상기도 분비, The degree of secretion, 구인두Princess 통증, 상기도 기침 증후군; Pain, upper respiratory cough syndrome; ⁸⁸ 가려움. itch.

보충 부록: 흡입된 Supplement Appendix: Inhaled GATAGATA -3 특이적 DNA자임에 의한 알레르겐-유도된 천식 반응의 감쇠Attenuation of allergen-induced asthma reactions by -3 specific DNA methylation

물질 및 방법Materials and methods

포함 및 배제 기준Inclusion and exclusion criteria

포함 기준Inclusion criteria

1. ≥ 18세 및 ≤ 60세의 성인 남성 백인 환자,1. Adult male Caucasian patients ≥18 years and ≤60 years,

2. 스크리닝 전 적어도 6개월 동안 경미한 천식의 임상적 진단 (GINA 지침 2008에 따름). 흡입된 단시간 작용하는 기관지확장제 이외에 수반되는 천식 치료 없고,2. Clinical diagnosis of mild asthma for at least 6 months before screening (according to GINA guidelines 2008). In addition to the inhaled short-acting bronchodilator, there is no accompanying asthma treatment,

3. 흡입된 단시간-작용하는 기관지확장제에 대해 적어도 6시간 씻어낸 후에 FEV₁이 예측된 정상 값(ECSC)의 ≥ 70 %인 FEV₁ 값을 스크리닝하고,3. inhaled short-screening of the FEV ₁ values ≥ 70% of the rinse after at least 6 hours for the bronchodilator FEV ₁ is the predicted normal value (ECSC) to act, and

4. 환자는 충분히 유도된 객담 생성을 입증해야 하고,4. The patient must demonstrate well-induced sputum production,

5. 통상적인 공기알레르겐 (예컨대, 동물 상피, 먼지 진드기)에 대한 포지티브 피부 단자 테스트 (피부 반응성),5. Positive skin prick test (skin reactivity) against conventional air allergens (e.g., animal epithelium, dust mite)

6. 환자는 포지티브 알레르겐-유도된 초기- 및 후기-단계 기도 기관지수축을 입증해야 하고,6. The patient must demonstrate positive allergen-induced early- and late-stage airway bronchoconstriction,

7. AC 및 MCh 이전의 모든 시점에서, 환자는 FEV₁이 예측된 65 %보다 낮지 않아야 하고,7. At all time points prior to AC and MCh, the patient should be under 65% of the predicted FEV ₁ ,

8. 알레르겐 챌린지를 스크리닝하기 전 또는 후에 객담 호산구의 존재 (제1 또는 제2 유도된 객담),8. Presence or absence of sputum eosinophils (first or second induced sputum) before or after screening of the allergen challenge,

9. 환자에게 임상 실험의 목적, 방법, 예상되는 혜택 및 잠재적인 위험 및 노출될 수 있는 불편함에 대해 구두 및 서면으로 통보해야 하고, 실험 시작 및 임의의 실험-관련 절차 이전에 실험에 참여하는 것에 대한 서면 동의를 받았음.9. The patient must be verbally and in writing informed of the purpose, method, expected benefits and potential risks of the clinical trial and any inconveniences that may be encountered and should be informed of the initiation of the trial and of participating in the trial prior to any trial- I have received your written consent.

10. 환자는 서면 정보 동의서를 이해하고 제공받을 수 있고, 조사자의 연구 윤리 위원회 (Research Ethics Board)가 승인한 서면 정보 동의서 양식에 서명했고,10. The patient signed and signed a written informed consent form approved by the investigator's research ethics board,

11. 비-흡연자 또는 연간 < 10 팩으로 임상 연구 시작 전에 적어도 1년 동안 금연한 전-흡연자,11. Non-smokers or ex-smokers who quit smoking for at least one year prior to commencing clinical study with <10 packs per year,

12. 적합한 방식으로 흡입할 수 있는 능력 (환자는 스크리닝 방문에서 플라시보 약제로 AKITA2 APIXNEB® 장치로부터 흡입하는 것을 훈련받을 것임),12. The ability to inhale in a suitable manner (the patient will be trained to inhale from the AKITA2 APIXNEB® device as a placebo in screening visits)

13. SB010을 마지막으로 투여한 후 6개월 동안 아이를 갖기를 원치 않는 남성만이 본 연구에 포함될 것이다.13. Only men who do not want to have a child for six months after the last administration of SB010 will be included in the study.

배제 기준Exclusion criteria

1. 천식 이외의 임상적으로 중요한 질병 (심혈관, 신장, 간장, 위장관, 혈액, 신경계, 비뇨생식기, 자가면역, 내분비, 대사 등)의 존재, 이는 조사자의 의견으로, 상기 실험의 참여로 환자를 위험에 빠뜨릴 수 있거나 또는 본 연구의 결과 또는 연구에 참여하는 환자의 능력에 영향을 줄 수 있음,1. The presence of clinically significant diseases (cardiovascular, kidney, liver, gastrointestinal tract, blood, nervous system, genitourinary, autoimmune, endocrine, metabolism, etc.) other than asthma, May be at risk or may affect the ability of the patient to participate in the study or the outcome of the study,

2. 관련 폐 질환 또는 흉부 수술의 병력의 존재, 가령:2. Presence of a history of associated lung disease or thoracic surgery, such as:

알려져 있는 활성 결핵,

Known active tuberculosis,

간질성 폐 또는 폐의 혈전색전성 질환의 병력,

The history of interstitial thrombotic disease of the lung or lung,

지난 12개월 동안 폐장 절제,

During the last 12 months,

천식 지속증의 병력,

History of asthma persistence,

호흡기 질환에 이은 기관지 확장증의 병력 (예컨대 낭성 섬유증, 카르타게너 증후군 (Kartagener's syndrome) 등),

A history of bronchodilatation following respiratory diseases (such as cystic fibrosis, Kartagener's syndrome, etc.)

만성 기관지염, 폐공기증, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (allergic bronchopulmonary aspergillosis) 또는 처음 아침에 IMP를 투여하고 4주 내에 호흡기 감염의 병력,

Chronic bronchitis, pulmonary embolism, allergic bronchopulmonary aspergillosis or a history of respiratory infections within 4 weeks of IMP administration on the first morning,

3. 조사자에 의해 판단되는 바와 같이 흡입된 단시간-작용하는 기관지확장제를 제외하고, 수반되는 치료가 있는 환자, 3. Except for inhaled short-acting-acting bronchodilators as judged by the investigator, patients with concomitant therapy,

4. 2, 3, 4, 5, 11, 및 12회 연구 방문 6시간 전에 단시간-작용하는 β2-작용제의 사용,4. Use of short-acting-functioning β2-agonists 6 hours before 2, 3, 4, 5, 11, and 12 study visits,

5. 스크리닝 전 6개월내, 스크리닝과 치료 기간의 시작 사이에 급성 천식으로 입원 또는 응급실 치료,5. Within 6 months prior to screening, between the screening and the beginning of the treatment period, hospitalization or emergency room treatment with acute asthma,

6. 상기 스크리닝 방문 이전 6개월 내에 천식 악화의 관리를 위해 24시간 이상 동안 삽관 (항상) 또는 입원,6. Within 6 months prior to the screening visit, for the management of asthma exacerbation, intubation (always) for 24 hours or more,

7. 약물에 대한 임상적 관련 알레르기 또는 특이체질의 병력 또는 현재 증거, 7. History or current evidence of clinical-related allergies or anomalies in the drug,

8. 네불라이저 용액의 임의의 활성 또는 비활성 성분에 대한 알레르기 반응의 병력,8. History of an allergic reaction to any active or inactive component of the nebulizer solution,

9. 임상 관련성의 ECG 이상,9. ECG abnormalities of clinical relevance,

10. 안정기 심박수 < 45 bpm, 수축기 혈압 < 100 mmHg, 이완기 혈압 < 60 mmHg인 피험체, 10. Subjects with stabilizer heart rate <45 bpm, systolic blood pressure <100 mmHg, diastolic blood pressure <60 mmHg,

11. 기립성 조절장애, 기절, 또는 실신에 대한 경향11. Trends in orthostatic control disorder, stunning, or syncope

12. 절제된 기저세포암을 제외하고, 지난 5년 내에 악성종양의 병력,12. With the exception of resected basal cell carcinomas, the history of malignant tumors,

13. 조사자의 판단에서와 같이 임상 화학, 혈액학 또는 임의의 다른 실험실 변수에서 임상적으로 관련된 이상,13. Clinically relevant abnormalities in clinical chemistry, hematology, or any other laboratory parameter, such as at the investigator's discretion,

14. AC 이전 지난 4주 내에 임상 관련 급성 감염,14. Within the past 4 weeks of AC transfer,

15. 임상 관련 만성 감염,15. Clinical Related Chronic Infection,

16. 급성 또는 만성 감염 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 간염 B/C 바이러스 감염의 바이러스 테스트에서 양성 결과,16. Positive results in viral testing of acute or chronic infections of human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis B / C virus infections,

17. 포지티브 약물 스크린,17. Positive drug screen,

18. 알코올 또는 약물의 남용,18. Abuse of alcohol or drugs,

19. 포지티브 코티닌 (cotinine) 테스트,19. Positive cotinine test,

20. 임상 약제의 처음 투여전 30일 내 또는 상기 실험의 치료 기간 동안 임의의 알려져 있는 효소를 유도 또는 저해하는 작용제 (St. John's Wort (Johanniskraut), 바르비투레이트 (barbiturates), 페노티아진 (phenothiazines), 시메티딘 (cimetidine), 케토코나졸 (ketoconazole) 등)에 의한 치료,20. Agents which induce or inhibit any known enzymes within 30 days prior to the first administration of the clinical agent or during the course of the experiment, such as St. John's Wort (Johanniskraut), barbiturates, phenothiazines ), Cimetidine, ketoconazole, and the like)

21. 처음 임상 약제 투여전 2주 내 (생물학적 제제의 경우: 6개월 또는 해당 약물의 제거 반감기의 10배 기간) 또는 상기 해당 약물의 제거 반감기 또는 약력학적 효과의 기간 중 더 긴 것의 < 10배 기간 내에, 임의의 금지된 수반된 약제 또는 치료 기간 동안 기대되는 수반되는 약제의 사용,21. Within <10-fold of the longer of the first 2 weeks before the first clinical drug administration (6 months for biologic agents or 10-fold for the elimination half-life of the drug) or longer for the half-life or pharmacodynamic effect of the drug The use of any contraindicated medicaments or contemplated medicaments expected during the course of treatment,

22. 처음 실험 약제 투여하기 전 14일 내에 및 상기 실험의 치료 기간 동안 임의의 효소를 유도 또는 저해하는 영양물 및 음료 (예컨대 브로콜리, 브뤼셀 스프라우트 (Brussels sprout), 자몽, 자몽 쥬스, 스타 플루트 (star fruit) 등)의 소비,22. Nutrients and beverages that induce or inhibit any enzyme within 14 days prior to the first experimental drug administration and during the treatment period of the experiment (eg, broccoli, Brussels sprout, grapefruit, grapefruit juice, starfruit fruit, etc.) consumption,

23. 각 연구 방문에서 처음 절차 시작 6시간 전에 카페인-함유 제품의 소비,23. Consumption of caffeine-containing products 6 hours before the start of the first step in each study visit,

24. 삼켜진 분획의 약물 흡수를 방해할 수 있는 위장관의 수술 (주의: 충수절제술 또는 탈장절개술과 같은 경미한 복부 수술은 적용되지 않음), 24. Surgery of the gastrointestinal tract that may interfere with the absorption of the drug in the swallowed fraction (note: minor abdominal surgery such as appendectomy or hernia cutting is not applied)

25. 스크리닝하기 전 지난 30일 내에 헌혈,25. Within 30 days prior to screening,

26. 실험 과정 동안 또는 그 후 6개월 내에 배아 세포, 혈액, 장기 또는 골수의 계획된 기증,26. Planned donation of embryonic cells, blood, organ or bone marrow during or after 6 months of experimentation,

27. 지난 1개월 내에 또는 해당 약물의 반감기의 10배 기간 이내에 연구 대상 약물 또는 장치로 또 다른 임상 실험에 참여. 생물학적 제제의 경우, 최소 기간은 적어도 6개월 또는 약력학적 효과 기간 또는 본 실험에 포함되기 전 해당 약물의 반감기의 10 배이고,27. Participate in another clinical trial with the drug or device under study within the past month or within 10-fold of the half-life of the drug. For biological agents, the minimum duration is at least 6 months or a pharmacodynamic duration or 10 times the half-life of the drug before inclusion in the experiment,

28. 정보에 입각하여 동의할 수 있는 능력 또는 의향의 결여 또는 적절하게 협조할 수 없는 능력, 28. Lack of ability or intent to agree on information or ability to cooperate properly,

29. 실험 방문/절차에 대한 예상치 못한 이용가능성,29. Unexpected availability of laboratory visits / procedures,

30. 취약 계층 (예컨대, 구금 상태의 사람),30. Vulnerable classes (eg, persons in custody),

31. 연구 사이트에서 고용인, 상기 조사자의 친척 또는 배우자.31. Employees, relatives or spouses of the investigator in the study site.

인-비트로 실험In-beat experiment

인-비트로 실험이 상기 GATA-3 DNA자임의 절단 활성 및 특이성을 입증하기 위해 수행되었다. 생물활성 및 작용 기전이 점막 기도 조직의 모델로서 말초 혈액 T-세포 및 부비동 조직 (sino-nasal tissue) 단편을 사용한 세포 배양 실험에서 평가되었다.In-vitro experiments were performed to demonstrate cleavage activity and specificity of the GATA-3 DNA strand. Biological activity and mechanism of action were evaluated in cell culture experiments using peripheral blood T-cells and sino-nasal tissue fragments as models of mucosal airway tissue.

절단 분석 (보충 부록 도 S2)

Cut-off analysis (Supplementary Annex S2)

DNA자임의 RNA 절단 촉매적 활성의 분석이 전술한 바와 같이 인 비트로 절단 분석을 사용하여 수행되었다 (Sel et al. JACI 2008). 간단하게, 2 μl의 인 비트로 전사된 GATA-3 카피(c)RNA (250 ng/μl)가 4 μl의 무-RNAse 물, 1 μl의 1 M NaCl, 1 μl의 10 mM MgCl₂ 및 1 μl의 500 mM 트리스 pH 7.4의 혼합물에 첨가되었다. 1 μl의 각 DNA자임 (hgd40, 스크램블된 결합 영역을 갖지만 본래의 촉매적 서열을 갖는 스크램블된 DNA자임 1-6, 전사 인자 Tbet-특이적 DNA자임 1-3) 또는 물 (네가티브 대조군)이 첨가되었고, 상기 혼합물이 37℃에서 인큐베이트되었다. 달리 명시되지 않으면, DNA자임이 10 μM의 농도로 적용되었고, 표준 인큐베이션 시간은 60분이다. 그 후, 반응 믹스가 아가로스 겔을 사용하여 전기영동으로 분리되었고, 표준 절차를 사용하는 에티듐 브로미드 염색에 의해 시각화되었다.Analysis of the DNA cleavage catalytic activity of the DNA probe was performed using in vitro cleavage assays as previously described (Sel et al. JACI 2008). Briefly, 2 μl of in vitro transcribed GATA-3 copy (c) RNA (250 ng / μl) was mixed with 4 μl of non-RNAse, 1 μl of 1 M NaCl, 1 μl of 10 mM MgCl ₂ and 1 μl Of 500 mM Tris pH 7.4. 1 μl of each DNA strand (hgd40, scrambled DNA ligase 1-6 with a scrambled binding region but having the original catalytic sequence, transcription factor Tbet-specific DNA ligase 1-3), or water (negative control) And the mixture was incubated at < RTI ID = 0.0 > 37 C. < / RTI > Unless otherwise stated, DNA was applied at a concentration of 10 [mu] M and the standard incubation time was 60 min. The reaction mix was then separated by electrophoresis using an agarose gel and visualized by ethidium bromide staining using standard procedures.

환자 및 시료 수집 (보충 부록 도 S3, C - F)

Patient and Sample Collection (Supplementary Figures S3, C - F)

연구 대상이 코 폴립을 갖는 만성 코굴염 (CRSwNP)에 대한 서류 병력, 병리학적 비내시경 (pathological nasal endoscopy) 및 부비동의 CT-스캔에 기반하여 선택되었다. 벌집뼈동굴 (ethmoidal sinuses)로부터의 시료가, 현재 유럽 및 미국 지침에 따라, 벨기에의 Ghent University 병원 이비인후과에서, 본 연구와 독립적으로 지시되는 바와 같이, 기능적 부비동 내시경술 (functional endoscopic sinus surgery: FESS) 절차 동안 n=16 환자 (연령 16-72세, 중간 연령 44세; 남성 11명, 여성 5명; 아토피 8명 및 천식 10명)로부터 수집되었다. 모든 환자는 그들의 참여 전에 정보 동의서를 받았고, 본 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인받았다. 매개체의 측정에 가능한 영향을 줄 수 있는 임의의 경구 또는 국소 약제의 사용은 수술 시작 적어도 4주 전에 모든 피험체에서 중지되었다.The subjects were selected based on documented history of chronic cor- onitis (CRSwNP) with nasal polyps, pathological nasal endoscopy, and CT scan of the sinuses. Samples from ethmoidal sinuses were tested for functional endoscopic sinus surgery (FESS), as indicated independently from this study, at Ghent University Hospital Otorhinolaryngology, Belgium, according to current European and US guidelines. During the procedure, n = 16 patients (age 16-72 years, median age 44 years; 11 males, 5 females; 8 atopic and 10 with asthma) were collected. All patients received informed consent prior to their participation, and this study was approved by the local ethics committee. The use of any oral or topical medication that could have a possible effect on the measurement of the mediator was discontinued in all subjects at least 4 weeks prior to the start of the surgery.

부비동 조직 단편의 제조 및 치료 (보충 부록 도 S3, C 및 D)

Preparation and Treatment of Sinus Tissue Fragments (Supplementary Figures S3, C and D)

환자로부터 코 폴립의 수술 제거 직후, 약 0.9 mm3의 각 조직 단편이 부비동 이식편을 절단함으로써 제조되었다. 상기 조직 단편이 RPMI-1640 배지에 현탁되었고, 조직 배양 배지 (tissue culture medium: TCM) 단독 또는 4 mg/ml의 DNA자임 hgd40과 6시간 (RNA) 및 24시간 (단백질) 동안 인큐베이트되었다. 그 후, 조직 단편 및 상층액이 스냅 동결 (snap frozen)되었고, -20℃ / -80℃에서 단백질 및 mRNA 분석때까지 보관되었다. DNA자임 hgd40 흡수의 조사를 위해서, 조직 단편이, TCM 단독 또는 4 mg/ml의 로다민 (rhodamine) 6G 표시된 hgd40과, 리포펙타민 형질감염 시약 (lipofectamine transfection reagent)의 존재 하에 24시간 동안 인큐베이트되었다. 그 후, 조직 단편이 내장되었고, 즉시 스냅 동결시키고, 5 μm 단면으로 절단되었다. 단편이 제조사의 권고사항에 따라 CD3 마커에 대해 염색되었다. 그 후, 슬라이드가 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 평가되었다.Immediately after surgical removal of the corpus from the patient, approximately 0.9 mm3 of each tissue fragment was prepared by cutting the sinus graft. The tissue fragments were suspended in RPMI-1640 medium and incubated for 6 hours (RNA) and 24 hours (protein) with tissue culture medium (TCM) alone or with 4 mg / ml DNA mRNA hgd40. The tissue fragments and supernatant were then snap frozen and stored at -20 [deg.] C / -80 [deg.] C until protein and mRNA analysis. For investigation of DNA finger hgd40 uptake, tissue fragments were incubated with hGd40 labeled with TCM alone or with rhodamine 6G at 4 mg / ml and incubated for 24 hours in the presence of lipofectamine transfection reagent . The tissue fragments were then embedded, immediately snap frozen and cut into 5 μm sections. The fragments were stained for CD3 markers according to the manufacturer's recommendations. The slides were then evaluated using a confocal laser scanning microscope.

극성화된 Th2 세포의 생성 및 형질감염 (보충 부록 도 S3, A 및 B)

Polarized The production and transfection of Th2 cells (Supplementary Figures S3, A and B)

나이브 (naive) 인간 CD4+ 세포가 Ficoll 구배 원심분리에 의해 전혈 또는 버피 코트 (buffy coats)로부터 단리되었고, 그후 제조사의 지시서에 따라 나이브 CD4 T-세포 단리 키트 (Miltenyi)를 사용하여 농축시켰다. 단리된 세포가, 전술한 바와 같이, IL-2 (20 ng/ml), IL-4 (20 ng/ml) 및 항-IFNγ (1 μg/ml)의 존재 하에 10일 동안 항-CD3 및 항-CD28에 의한 자극에 의해서 Th2 세포로 극성화되었다. 극성화 (polarization) 후에, 상기 Th2 세포가 Amaxa 시스템을 사용하는 전기천공에 의해서 FAM-표지된 인간 GATA- 3특이적 DNA자임 hgd40 또는 FAM-표지된 스크램블된 조절 DNA자임 ODNg3으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포가 재플레이트 (replate)되었고, 22시간 동안 인큐베이트되었다.Naive human CD4 + cells were isolated from whole blood or buffy coats by Ficoll gradient centrifugation and then concentrated using a Naïve CD4 T-cell isolation kit (Miltenyi) according to the manufacturer's instructions. Isolated cells were treated with anti-CD3 for 10 days in the presence of IL-2 (20 ng / ml), IL-4 (20 ng / ml) and anti- Lt; / RTI > cells were polarized to Th2 cells by stimulation with CD28. After polarization, the Th2 cells were transfected with FAM-labeled human GATA-3 specific DNA hgd40 or FAM-labeled scrambled regulatory DNA strand ODNg3 by electroporation using the Amaxa system. Transfected cells were replated and incubated for 22 hours.

극성화된 Th2 세포에서 GATA -3 발현 분석 (보충 부록 도 S3A )

Polarized Analysis of GATA- 3 expression in Th2 cells (Supplementary Appendix S3A )

인큐베이션 기간 후에, 상기 형질감염된 세포가 수확되었고, 형광 유세포측정 (fluorescence flow cytometry: FACS) 분석에 의해서 GATA-3 단백질 발현에 대해 분석되었다. 그러므로, 제조사의 지시서에 따라 "전사 인자 염색 버퍼 세트 (Transcription Factor Staining Buffer Set)" (eBioscience)를 사용하여 Alexa Fluor 647-표지된 마우스 항-GATA-항체 (Clone L50-823, BD Pharmingen)에 의해 GATA-3 단백질에 대해 세포가 세포내 염색되었다. 분석을 위해서, 게이트가 포지티브 형질감염된 세포에 설정되었고, GATA-3 발현 수준이 기하학적 평균 수준으로 상기 세포에서 결정되었다. FAM 양성화 (positivity)에 의해 조절되는 바와 같이 형질감염된 세포에서 GATA-3 단백질 발현의 기하학적 평균 수준이 hgd40 형질감염된 세포와 대조군 감염된 세포 사이에서 비교되었다. After the incubation period, the transfected cells were harvested and analyzed for GATA-3 protein expression by fluorescence flow cytometry (FACS) analysis. Therefore, by Alexa Fluor 647-labeled mouse anti-GATA-antibody (Clone L50-823, BD Pharmingen) using the "Transcription Factor Staining Buffer Set" (eBioscience) according to the manufacturer's instructions Cells were stained intracellularly for GATA-3 protein. For analysis, gates were set up in positive transfected cells and GATA-3 expression levels were determined in these cells at geometric mean levels. The geometric mean levels of GATA-3 protein expression in transfected cells were compared between hgd40 transfected cells and control infected cells as controlled by FAM positivity.

부비동 조직 단편에서 GATA -3 유전자 발현 (보충 부록 도 S3E )

GATA- 3 gene expression in sinus tissue fragments (Supplementary Appendix S3E )

6시간의 인큐베이션 시간 후에, 전체 RNA가 Aurum Total RNA Mini 키트 (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 추출되었고, cDNA가 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad Laboratories)에 의해 합성되었다. 실시간 PCR 증폭이 하기 조건으로 수행되었다: 10분 동안 95℃, 이 후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 10초의 45 사이클, 60℃부터 95℃까지 해리 곡선 분석. β-액틴 (ACTB), 히포크산틴 포스포리보실트란스퍼라제 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) 1, 및 신장 인자 (elongation factor) 1이 정규화를 위한 내인성 참조로 사용되었다.After an incubation time of 6 hours, total RNA was extracted using the Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad Laboratories) and the cDNA was synthesized by iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories). Real-time PCR amplification was performed under the following conditions: 95 ° C for 10 minutes, then 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 10 seconds, and 60 ° C to 95 ° C dissociation curve analysis. β-actin (ACTB), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, and elongation factor 1 were used as endogenous references for normalization.

IL-5 단백질 측정 (보충 부록 도 S3F )

Measurement of IL-5 protein (Supplementary Appendix S3F )

24시간의 인큐베이션 기간 후에, 상층액이 수집되었고, IL-5의 농도가 제조사의 지침에 따라 상업적으로 이용가능한 Fluorokine MAP 키트 (R&D Systems Europe Ltd,)를 사용하여 Luminex xMAP 기술에 의해 측정되었고, Bio-Plex 200 Platform (Bio-Rad Laboratories)에서 측정되었다. 검출 한계는 1.5 pg/ml이었다.After an incubation period of 24 hours, supernatants were collected and the concentration of IL-5 was measured by Luminex xMAP technology using a commercially available Fluorokine MAP kit (R & D Systems Europe Ltd) according to the manufacturer's instructions and Bio -Plex 200 Platform (Bio-Rad Laboratories). The detection limit was 1.5 pg / ml.

IL-13 분비 분석 (보충 부록 도 S3B )

Analysis of IL-13 secretion (Supplementary Appendix S3B )

IL-13 방출의 분석을 위해서, 형질감염된 세포가 1μg/ml의 스타필로코쿠스 아우레우스 엔테로톡신 B (Staphylococcus aureus enterotoxin B: SEB)로 22시간 동안 자극되었다. IL-13 분비가 제조자의 지시에 따라 IL-13 분비 분석 검출 키트 (Miltenyi)를 사용하여 FACS 분석에 의해 검출되었다. 분석을 위해서, 게이트가 포지티브 형질감염된 세포에 설정되었고, IL-13 발현 수준이 기하학적 평균 수준 (GeoMean)으로 상기 세포에서 결정되었다. FAM 양성화에 의해 조절되는 바와 같이 형질감염된 세포에서 IL13 단백질 발현의 기하학적 평균 수준이 hgd40 형질감염된 세포와 대조군 형질감염된 세포 사이에서 비교되었다.For analysis of IL-13 release, transfected cells were stimulated with 1 ug / ml Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) for 22 hours. IL-13 secretion was detected by FACS analysis using the IL-13 secretion assay detection kit (Miltenyi) according to the manufacturer's instructions. For analysis, gates were set up in positive transfected cells and IL-13 expression levels were determined in these cells at geometric mean levels (GeoMean). The geometric mean levels of IL13 protein expression in transfected cells were compared between hgd40 transfected cells and control transfected cells as regulated by FAM positive.

안전도 Safety factor 종료점End point

하기의 임상 화학 파라미터가 평가되었다: 크레아티닌, 알카리성 포스파타제, 총 빌리루빈, 알라닌 아미노트란스퍼라제, 아스파르테이트, 아미노트란스퍼라제, 감마 글루타밀 트란스펩티다제, 총 단백질, 요산 (uric acid), 우레아, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 클로리드, 글루코스 (공복시), 락테이트 데히드로게나제, 및 크레아틴 포스포키나제. 혈액검사 파라미터는 하기이다: 헤모글로빈, 헤마토크리트 (haematocrit), 평균 적혈구 부피, 평균 적혈구 헤모글로빈, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, 적혈구 세포수, 분별 계수에 의한 백혈구 세포수 (중성구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구), 및 혈소판 계수, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 프로트롬빈 시간, INR, 피브리노겐. 하기의 소변검사 파라미터가 평가되었다: 백혈구, 니트라이트 (nitrite), pH, 단백질, 글루코스, 케톤, 유로빌리노겐 (urobilinogen), 빌리루빈, 혈액 (헤모글로빈 및 적혈구). 하기의 ECG 파라미터가 기록되었다: 12-유도 ECG가 Einthoven and Goldberger에 따른 유도뿐만 아니라 Wilson에 따른 6개의 심장전 유도 (precordial leads)를 사용하여 누운 자세에서 5분 휴식 후에 기록되었다.The following clinical chemical parameters were evaluated: creatinine, alkaline phosphatase, total bilirubin, alanine aminotransferase, aspartate, aminotransferase, gamma glutamyltranspeptidase, total protein, uric acid, urea , Sodium, potassium, calcium, chloride, glucose (fasting), lactate dehydrogenase, and creatine phosphokinase. Hematology parameters are as follows: hemoglobin, hematocrit, mean erythrocyte volume, mean erythrocyte hemoglobin, mean erythrocyte hemoglobin concentration, red blood cell count, white blood cell count (neutrophil, eosinophil, lymphocyte, mononuclear cell) , And platelet count, activated partial thromboplastin time, prothrombin time, INR, fibrinogen. The following urine test parameters were evaluated: leukocyte, nitrite, pH, protein, glucose, ketone, urobilinogen, bilirubin, blood (hemoglobin and red blood cells). The following ECG parameters were recorded: a 12-lead ECG was recorded after induction according to Einthoven and Goldberger as well as a 5 minute rest in a lying position using six cardiac precursor leads according to Wilson.

통계 분석Statistical analysis

통계 분석이 FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany)의 SAS (버전 9.3) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 S2가 GraphPad Prism (버전 5.0) 소프트웨어를 사용하여 제조되었다.Statistical analysis was performed using SAS (version 9.3) software from FGK Clinical Research GmbH (Munich, Germany). S2 was manufactured using GraphPad Prism (version 5.0) software.

도 S1의 토의:Discussion of Figure S1:

알레르겐 노출 후, 기도 수지상 세포는 TSLP, IL25 및 IL-33 및 초기 IL-4 (예컨대, 타입 2 본래 림프구 [ILC2]에 의해 생성)와 같은 상피-유도된 시토킨의 영향 하에 Th2 세포로 분화하는 Th0 세포에 대한 알레르겐을 제공한다. GATA-3은 Th2 분화 및 활성화를 위한 마스터 전사 인자를 나타내며, Th2 시토킨, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-13의 생성에 필수적이다. 이러한 시토킨의 방출에 의해서 Th2 세포는 몇가지 이펙터 메카니즘 가령 B 세포에 의한 IgE의 생성, 이후 비만-세포로의 결합, 호산구의 보충 및 활성화, 및 술잔세포 과다형성 (Goblet cell hyperplasia)의 발생에 관여한다. 상기 이펙터 세포에 의해 방출된 매개체는 염증을 더 촉진하고, 평활근 수축 및 점액 생성을 유도하여, 이후 기도 협착 및 혈관 누출을 유발한다. SB010은 Th2 세포에서 GATA-3에 대한 메신저 RNA를 특이적으로 절단함으로써 상기 과정에서 업-스트림을 방해한다. 결과적으로, 보다 적은 GATA-3 단백질이 생성되어, 전사 Th2 시토킨을 충분히 활성화시키지 못하여, 이후 모든 다운-스트림 과정을 저해할 수 있다. Th2 세포에서의 그 작용과 유사하게, SB010은 또한, 타입-2 시토킨 방출의 다운-스트림 저해 및 또한 비만 세포 및 호산구에서 이펙터 분자 생성에 의해서, ILC2, 비만-세포 및 호산구와 같은 다른 GATA-3 발현 세포에서 GATA-3 생성을 억제할 수 있다. 도 S1은 SB010의 활성 화합물인 hgd40의 생체활성을 추가로 나타내었다. 이는 GATA-3 발현 및 다운스트림 생물학적 효과에 있어서 SB010에서 활성인 GATA-3 DNA자임인 hgd40의 직접적이고 특별한 효과에 대한 구체적인 증거이다. 일련의 인 비트로 및 인 시투 실험은 도 S2 및 S3에서와 같이 포함된 결과인 SB010의 작용 기전을 입증하였다 (기술적 상세한 사항은 보충 부록 참조). SB010에서 활성인 GATA-3 DNA자임인 hgd40의 초기 특정 활성이 10-23 DNA자임의 촉매적 활성을 결정하기 위해서 고도로 특별한 인-비트로 방법을 나타내는 절단 분석 (부가의 도 S2)을 사용하여 개시되었다. 이를 위해서, 인-비트로 전사된 카피-RNA (cRNA) - 본 사례에서 인간 GATA-3 cRNA -가 DNA자임과 인큐베이트되었다. 상기 인큐베이션 동안, 활성인 DNA자임은 표적 cRNA를 2개의 절단 산물로 촉매적으로 절단하고, 이는 아가로스 겔 전기영동에 의해 입증될 수 있다. 일련의 절단 분석 분석법에 기반하여, SB010에서 활성 성분인 hgd40은 GATA-3 cRNA 절단 활성과 관련하여 가장 활성인 DNA자임이다. hgd40은 투여량과 시간-의존성으로 GATA-3 cRNA를 절단하는 것으로 개시되었다 (도 S2A 및 S2B). GATA-3 cRNA에 있어서 비-GATA-3-특이적 DNA자임의 효능 분석에 의해서 입증되는 바와 같이, 절단은 고도의 서열 특이적이다 (도 S2C). 또한, hgd40은 저농도 (0.5 μM hgd40)에서 조차도 단일가닥 RNA를 특이적으로 절단하고, 고농도가 아닐지라도 (20 μM hgd40) 이중가닥 DNA를 절단하지 않는다는 것이 입증되었다. 또한, 원치않는 오프 타겟 효과, 가령 본래 면역 세포의 활성화 또는 알레르기성 이펙터 기전에 관여하는 세포에서 효과가 사전에 배제되었다 (Dicke T et al. Nucleic Acid Therapeutics 2012;22(2):117-26). 이후에, 본 발명자들은 인간 세포 및 조직 물질에서 상기 분자의 생체활성을 입증하였다 (부가의 도 S3). hgd40에 의한 인간 극성화된 CD4+ TH2-세포의 형질감염은, 스크램블된 대조군 DNA자임 ODNg3에 의해 형질감염된 세포와 비교하여, GATA-3 단백질 발현 및 그 후 IL-13의 생성을 상당히 억제하였다 (도 S3A , S3B). 다음, 아토피성 천식으로부터 입수된 코 조직 이식편이 hgd40 DNA자임과 인큐베이트되었다. 도 3C 및 3D에서 개시된 바와 같이, 상기 이식편내에서 CD3+ 및 CD3- 세포에 의해서 hgd40이 흡수되었고, 6시간 내에 GATA-3 mRNA의 수준이 현저하게 감소되었고 (도 S3E) 또한 24시간에서 IL-5의 생성이 현저하게 감소되었다 (도 S3F).Following allergen exposure, airway dendritic cells differentiate into Th2 cells under the influence of epithelial-derived cytokines such as TSLP, IL25 and IL-33 and early IL-4 (eg, produced by type 2 native lymphocyte [ILC2]) Lt; RTI ID = 0.0 > Th0 < / RTI > GATA-3 represents a master transcription factor for Th2 differentiation and activation and is essential for the production of Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13. By the release of such cytokines, Th2 cells are involved in several effector mechanisms, such as the production of IgE by B cells, subsequent binding to obesity-cells, eosinophil replenishment and activation, and goblet cell hyperplasia do. The mediator released by the effector cells further promotes inflammation, induces smooth muscle contraction and mucus production, and then induces airway stenosis and vascular leakage. SB010 specifically up-regulates messenger RNA for GATA-3 in Th2 cells, thereby interfering with up-stream in the process. As a result, fewer GATA-3 proteins are generated, failing to fully activate transcriptional Th2 cytokines, and subsequently inhibiting all downstream processes. Similar to its action in Th2 cells, SB010 also inhibits down-stream inhibition of type-2 cytokine release and also effector molecule production in mast cells and eosinophils, as well as other GATA- 3 < / RTI > expression in the cells expressing GATA-3. Figure S1 further shows the bioactivity of hgd40, the active compound of SB010. This is the concrete evidence for the direct and specific effect of GATA-3 DNA, hgd40, which is active in SB010 in GATA-3 expression and downstream biologic effects. A series of in vitro and in situ experiments have demonstrated the mechanism of action of SB010 as an included result as in Figures S2 and S3 (see Appendix for technical details). The initial specific activity of the GATA-3 DNA molecule hgd40, active at SB010, was initiated using a cleavage assay (additional S2 ) representing a highly specific in-vitro method for determining the catalytic activity of 10-23 DNA molecules . To this end, copy-RNA (cRNA) transcribed in-bit-in this case human GATA-3 cRNA- was incubated with DNA. During the incubation, the active DNA fragment catalytically cleaves the target cRNA into two cleavage products, which can be demonstrated by agarose gel electrophoresis. Based on a series of cleavage analysis assays, the active ingredient hgd40 in SB010 is the most active DNA molecule in relation to GATA-3 cRNA cleavage activity. hgd40 was disclosed to cleave GATA-3 cRNA in a dose and time-dependent manner ( Figures S2A and S2B ). As demonstrated by the potency assay of non-GATA-3-specific DNA in GATA-3 cRNA, cleavage is highly sequence specific ( Fig. S2C ). In addition, hgd40 specifically cleaves single-stranded RNA even at low concentrations (0.5 μM hgd40) and proved that it does not cleave double-stranded DNA (20 μM hgd40), although not at high concentrations. In addition, effects have been previously ruled out in cells involved in unwanted off-target effects, such as innate immune cell activation or allergic effector mechanisms (Dicke T et al. Nucleic Acid Therapeutics 2012; 22 (2): 117-26) . Thereafter, the inventors have demonstrated the bioactivity of the molecule in human cells and tissue material (additional figure S3 ). Transfection of human polarization of CD4 + TH2- cells with hgd40 are, as compared with cells transfected by a scramble control DNA atom ODNg3 cells, GATA-3 protein expression, and was then significantly inhibited the production of IL-13 (Fig. S3A , S3B ). Next, the nasal tissue graft obtained from atopic asthma was incubated with hgd40 DNA. As shown in Figures 3C and 3D, hgd40 was absorbed by CD3 + and CD3- cells in the graft, and the level of GATA-3 mRNA was significantly decreased within 6 hours ( Fig. S3E ) ( Fig. S3F ).

보충 부록 표 S1. 알레르겐 유발을 위해 사용된 알레르겐Supplement Appendix Table S1. Allergens used for allergen induction

알터나리아 테누이스 (Alternaria tenuis)의 경우, ALK-Abello Arzneimittel GmbH, Germany, 또는 Allergopharma Joachim Ganzer KG, Germany에 의해 공급된 알레르겐.In the case of Alternaria tenuis, the allergen supplied by ALK-Abello Arzneimittel GmbH, Germany, or Allergopharma Joachim Ganzer KG, Germany.

보충 부록 표 Supplementary Appendix Table S2. 치료S2. cure 전 및 치료 후에 알레르겐 Allergens before and after treatment 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 폐 기능 데이터의 완전한 세트 Changes in late-late and early-stage reactions - a complete set of lung function data

범례 표 S2: 치료 전 및 치료 후에 알레르겐 Legend Table S2: Pre-treatment and post-treatment allergen 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - Changes in late and early stage reactions - 폐 기능Lung function 데이터의 완전한 세트 Complete set of data

알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의해 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화 (percent change)로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타내었다. LAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV₁ 감소가 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.Allergen induction was performed with SB010 or placebo before (pre) and post (post) 28 days. Mean values for the area under the curve (AUC) for late asthma response (LAR) and initial asthma response (EAR) were disclosed. Decrease in AUC from pre-treatment to post-treatment reflects an improvement in pulmonary function. Pre- and post-treatment AUC values are provided and then provide a change in pulmonary function for each of the SB010 and the placebo group. The change was expressed as a percent change in the pre-treatment value of the AUC and the post-treatment value versus the post-treatment value. Positive values reflect improvements in pulmonary function, and negative values correspond to larger areas under the curve in the post-treatment challenge compared to before treatment. The difference in the group indicated the delta of the relative change between SB010 and the placebo group. P values for LAR AUC and maximum FEV ₁ reduction in LAR and EAR were calculated by the ANCOVA model; The P value for EAR AUC was calculated by the Wilcoxon rank sum test.

보충 부록 표 Supplementary Appendix Table S3A. 치료S3A. cure 전 및 치료 후에 알레르겐 Allergens before and after treatment 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석 Changes in late-onset and early-stage reactions - Analysis of pre-specified subgroups of patients with blood eosinophilia ≥ 4%

범례 표 Legend table S3AS3A : 치료 전 및 치료 후에 알레르겐 : Allergen before and after treatment 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - 혈중 호산구 ≥ 4%인 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석 Changes in late-onset and early-stage reactions - Analysis of pre-specified subgroups of patients with blood eosinophilia ≥ 4%

알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의해 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타낸다. LAR AUC에 대한 P 값이 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV₁ 감소가 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.Allergen induction was performed with SB010 or placebo before (pre) and post (post) 28 days. Mean values for the area under the curve (AUC) for late asthma response (LAR) and initial asthma response (EAR) were disclosed. Decrease in AUC from pre-treatment to post-treatment reflects an improvement in pulmonary function. Pre- and post-treatment AUC values are provided and then provide a change in pulmonary function for each of the SB010 and the placebo group. The change was expressed as the pre-treatment value of AUC and as a percentage change between pre-treatment and post-treatment. Positive values reflect improvements in pulmonary function, and negative values correspond to larger areas under the curve in the post-treatment challenge compared to before treatment. The difference in the group represents the delta of the relative change between SB010 and the placebo group. The P value for LAR AUC was calculated by the ANCOVA model; The P value for EAR AUC and the maximum FEV ₁ reduction in LAR and EAR were calculated by the Wilcoxon rank sum test.

보충 부록 표 Supplementary Appendix Table S3B. 치료S3B. cure 전 및 치료 후에 알레르겐 Allergens before and after treatment 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - Changes in late and early stage reactions - FeNOFeNO ≥ ≥ 40 ppb인40 ppb 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석 Analysis of pre-assigned subgroups of patients

범례 표 Legend table S3BS3B : 치료 전 및 치료 후에 알레르겐 : Allergen before and after treatment 챌린지challenge 후 후기 및 초기 단계 반응에서 변화 - Changes in late and early stage reactions - FeNOFeNO ≥ ≥ 40 ppb인40 ppb 환자의 사전-지정된 하위그룹의 분석 Analysis of pre-assigned subgroups of patients

알레르겐 유발이 SB010 또는 플라시보에 의한 치료 전 (pre) 및 후 (post) 28일에 수행되었다. 후기 천식 반응 (LAR) 및 초기 천식 반응 (EAR)에 대한 곡선하 면적 (AUC)에 대한 평균 값이 개시되었다. 치료전으로부터 치료후까지 AUC 값의 감소는 폐 기능의 향상을 반영한다. 치료전 및 치료후 AUC 값이 제공되고, 그 후 상기 SB010 및 상기 플라시보 그룹 각각에 대한 폐 기능의 변화를 제공한다. 상기 변화는 AUC의 치료전-치료후 값 및 치료전과 치료후 사이의 백분율 변화로 나타내었다. 양의 값은 폐 기능의 향상을 반영하고, 음의 값은 치료전과 비교하여 치료후 챌린지에서 곡선하 면적이 더 큰 것에 해당한다. 상기 그룹의 차이는 SB010과 플라시보 그룹 사이의 상대 변화의 델타를 나타낸다. LAR AUC에 대한 P 값 및 LAR 및 EAR에서 최대 FEV₁ 감소가 ANCOVA 모델에 의해 산출되었고; EAR AUC에 대한 P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.Allergen challenge was performed before (pre) and post 28 days with SB010 or placebo. Mean values for the area under the curve (AUC) for late asthma response (LAR) and initial asthma response (EAR) were disclosed. Decrease in AUC from pre-treatment to post-treatment reflects an improvement in pulmonary function. Pre- and post-treatment AUC values are provided and then provide a change in pulmonary function for each of the SB010 and the placebo group. The change was expressed as the pre-treatment value of AUC and as a percentage change between pre-treatment and post-treatment. Positive values reflect improvements in pulmonary function, and negative values correspond to larger areas under the curve in the post-treatment challenge compared to before treatment. The difference in the group represents the delta of the relative change between SB010 and the placebo group. P values for LAR AUC and maximum FEV ₁ reduction in LAR and EAR were calculated by the ANCOVA model; The P value for EAR AUC was calculated by the Wilcoxon rank sum test.

보충 부록 표 Supplementary Appendix Table S4AS4A : 알레르겐 : Allergens 챌린지에At the challenge 대한 개별 반응, 후기-단계 천식 반응 (LAR, 3-7시간) Individual response, late-stage asthma response (LAR, 3-7 hours)

^*: 혈중 호산구 ≥ 4%인 사전-지정된 하위그룹에 포함된 환자. ^* : Patients included in pre-assigned subgroups with blood eosinophilia ≥ 4%.

보충 부록 표 Supplementary Appendix Table S4BS4B : 알레르겐 : Allergens 챌린지에At the challenge 대한 개별 초기-단계 천식 반응 (EAR, 0-3시간) Individual early-stage asthmatic responses (EAR, 0-3 h)

보충 부록 표 S5. Supplement Appendix Table S5. 챌린지challenge 후 after FeNOFeNO 및 PC20 And PC20 수준에 있어서At the level 28일의 SB010 또는 플라시보 치료의 효과 Effect of 28 days of SB010 or placebo treatment

범례 표 S5: Legend Table S5: 챌린지challenge 후 after FeNOFeNO 및 PC20 And PC20 수준에 있어서At the level 28일의 SB010 또는 28 days of SB010 or 플라시보Placebo 치료의 효과 Effect of treatment

FeNO 및 PC20 수준에 있어서 28일의 SB010 또는 플라시보 치료의 효과. FeNO 수준의 측정 및 기도 과민반응 (PC20)의 평가가 알레르겐 챌린지 후 SB010 또는 플라시보 치료전 및 28일의 치료 과정 후에 수행되었다. FeNO 수준이 ppb로 표시되었고, PC20이 메타콜린 mg/dl로 표시되었다. P 값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.Effect of SB010 or placebo treatment for 28 days at FeNO and PC20 levels. Measurements of FeNO levels and evaluation of airway hyperresponsiveness (PC20) were performed after the allergen challenge SB010 or before the placebo treatment and after 28 days of treatment. FeNO levels were expressed in ppb and PC20 was expressed as methacholine mg / dl. P values were calculated by Wilcoxon rank sum test.

보충 부록 표 S6. 비-Supplement Appendix Table S6. ratio- 챌린지된Challenged FeNOFeNO 수준에 있어서At the level 28일의 SB010 또는 28 days of SB010 or 플라시보Placebo 치료의 효과 Effect of treatment

범례 표 S6: 비-Legend Table S6: Non- 챌린지된Challenged FeNOFeNO 수준에 있어서At the level 28일의 SB010 또는 28 days of SB010 or 플라시보Placebo 치료의 효과 Effect of treatment

FeNO가 기준 알레르겐 챌린지 전, 치료 전, 이후 60일의 추적 기간의 마지막인 88일에 측정되었다. 치료 의도 연구 집단뿐만 아니라 혈중 Eos ≥ 4% 및 기준 FeNO ≥ 40 ppb의 사전-지정된 하위그룹에 대해 중간 및 사분위 범위 (inter-quartile ranges: IQR)가 개시되었다. P-값이 Wilcoxon 순위 합 검정에 의해 산출되었다.FeNO was measured 88 days before the baseline allergen challenge, before treatment, and at the end of the 60-day follow-up period. Intermediate and quartile ranges (IQR) were initiated for pre-assigned subgroups of serum Eos ≥ 4% and baseline FeNO ≥ 40 ppb, as well as the treatment intention study group. P-values were calculated by Wilcoxon rank sum test.

보충 부록 표 S7: 안전도 Supplement Appendix Table S7: Safety Diagram 바이오마커Biomarker

혈중 IL-4, IL-13 및 IFN-γ: 대부분의 값은 정량의 하한 미만임; IL-5는 보충 부록 도 S6을 참조한다.Blood IL-4, IL-13 and IFN-γ: most values are below the lower limit of quantification; IL-5 is refer to Supplement S6.

보충 부록 표 S8: Supplement Appendix Table S8: 객담내In sputum 분별화된Fractionated 세포 계수 - 세포 x10 Cell Count - Cell x10 ⁶⁶ /g 객담으로 표시함)/ g spam)

표는 평균값 + 표준 편차 / 각각 치료전 및 치료후 알레르겐 후 변화를 나타내었다.The mean values + standard deviation / before and after treatment were all shown in the table.

보충 부록 표 S9: 연구 Supplement Table S9: Study 종료점의Endpoint 목록 List

참조 목록Reference List

Claims

Th2-유도된 천식을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제로서, 상기 환자는 (i) 혈중 호산구 수 (blood eosinophil count) 3% 이상, 구체적으로 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상; 및/또는 (ii) 혈중 호산구 수 350 x 10⁶ / L 이상, 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상; 및/또는 (iii) 분획 호기 산화질소 (fractional expiratory nitric oxide) 40 ppb 이상인 것을 특징으로 하는 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.3. A nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 for use in the treatment of a patient suffering from a Th2-induced asthma, said patient having (i) a blood eosinophil count of at least 3%, in particular at least 4% More specifically 5% or more; And / or (ii) a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, specifically 450 x 10 ⁶ / L or more; And / or (iii) a fractional expiratory nitric oxide of at least 40 ppb. The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3.

청구항 1에 있어서, 상기 핵산-기반 불활성화제는 GATA-3에 대한 DNA자임 (DNAzyme)인 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 1, wherein the nucleic acid-based inactivating agent is a DNAzyme for GATA-3.

청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 환자는 4% 이상, 더 구체적으로 5% 이상의 혈중 호산구 수를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 1 or 2, wherein the patient has a blood eosinophil count of 4% or more, more particularly 5% or more.

청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 350 x 10⁶ / L 이상, 더 구체적으로 450 x 10⁶ / L 이상의 혈중 호산구 수를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to any one of claims 1 to 3, wherein the patient has a blood eosinophil count of 350 x 10 ⁶ / L or more, more specifically 450 x 10 ⁶ / L or more.

청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 혈중 호산구 수가 (i) 자동 분별 혈구 계산 (automated differential blood counting); 또는 (ii) 종래의 혈액 도말표본 (blood smear)을 사용하는 수동 현미경 세포 분별화 (manual microscopic cell differentiation)에 의해 결정되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The method of claim 3 or 4, wherein the blood eosinophil count is (i) automated differential blood counting; Or (ii) is determined by manual microscopic cell differentiation using a conventional blood smear (nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3).

청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 40 ppb 이상의 분획 호기 산화질소를 갖는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.6. The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to any one of claims 1 to 5, wherein the patient has a fractionated aerobic nitric oxide of at least 40 ppb.

청구항 6에 있어서, 상기 분획 호기 산화질소가 휴대용 (hand-held) NIOX MINO^® 장치를 사용하여 결정되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.7. The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 6, wherein the fractionated nitric oxide is determined using a hand-held NIOX MINO ( ^R ) device.

청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제는 DNA자임 hgd40 (서열번호: 3)인 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to any one of claims 1 to 7, wherein the nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3 is the DNA finger hgd40 (SEQ ID NO: 3).

청구항 8에 있어서, 상기 hgd40이 흡입을 위한 제형에 포함되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.9. The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 8, wherein said hgd40 is included in a formulation for inhalation.

청구항 9에 있어서, 상기 hgd40이 PBS에 용해되어 있는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 9, wherein the hgd40 is dissolved in PBS.

청구항 10에 있어서, 5 내지 50 mg의 hgd40, 구체적으로 5 내지 20 mg의 hgd40, 구체적으로 10 mg의 hgd40의 hgd40이 2 ml의 PBS에 용해되어 있는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 10, wherein 5 to 50 mg of hgd40, specifically 5 to 20 mg of hgd40, specifically 10 mg of hgd40, hgd40 is dissolved in 2 ml of PBS.

청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회, 구체적으로 1일 1회로 투여되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3 is administered once a day, twice a day, or three times a day, Based inactivation agent.

청구항 12에 있어서, 상기 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제가 연속 요법, 구체적으로 유지 요법에서 1일 1회로 투여되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제.13. The nucleic acid-based inactivating agent of GATA-3 according to claim 12, wherein the nucleic acid-based inactivation agent of GATA-3 is administered once a day in continuous therapy, specifically in maintenance therapy.

청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산-기반 불활성화제가 천식 치료를 위해 하기의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 흡입 또는 경구 요법제에 대한 부가 (add-on) 요법으로 사용되는 것인 GATA-3의 핵산-기반 불활성화제: 코르티코스테로이드, 장시간-작용 베타 작용제 (long-acting beta agonists: LABAs), 장시간 작용 무스카린성 길항제 (long acting muscarinic antagonists: LAMAs), 항류코트리엔 (antileukotrienes), 단시간-작용 베타 작용제 (short-acting beta agonists: SABAs), 항콜린작용제 (anticholinergics) 및 모노클로날 항체.
The use according to any one of claims 1 to 13, wherein the nucleic acid-based inactivation agent is used as an add-on regimen for one or more inhalation or oral remedies selected from the list below for the treatment of asthma, 3 nucleic acid-based inactivation agents: corticosteroids, long-acting beta agonists (LABAs), long acting muscarinic antagonists (LAMAs), antileukotrienes, short-acting Short-acting beta agonists (SABAs), anticholinergics and monoclonal antibodies.