KR102143476B1 - 항ｂｍｐ９ 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 인간 BMP9(Bone morphogenetic protein-9)에 결합하는, 항BMP9 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 산생하는 하이브리도마, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 해당 하이브리도마 또는 해당 형질 전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약을 제공한다. 또한 본 발명은, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물 및 그것을 사용한 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈의 치료 방법을 제공한다.

Description

항ＢＭＰ９ 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제{THERAPEUTIC AGENT FOR ANEMIA INCLUDING RENAL ANEMIA AND CANCER-INDUCED ANEMIA WHICH CONTAINS ANTI-BMP9 ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은, 인간 BMP9(Bone morphogenetic protein-9)에 결합하는, 항BMP9 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 산생하는 하이브리도마, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 해당 하이브리도마 또는 해당 형질 전환체를 사용하는 해당 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로 하는 치료약에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물 및 그것을 사용한 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈의 치료 방법에 관한 것이다.
BMP9는 Bone morphogenetic protein 9의 약칭으로, 별칭 GDF2라고도 불린다. BMP9는, 약 20종류를 포함하는 BMP(골 형성 단백질) 패밀리 분자에 속하고, 인간 BMP9는, 429 아미노산을 포함하는 분비 단백질이다(비특허문헌 1).
BMP9는, 태아기에서는 척수 또는 체절간 막에서, 성체기에서는 간장에서 주로 발현하고(비특허문헌 2, 3, 4), 인간 BMP9는, 혈액 중에 2-12ng/mL의 농도로 존재하는 혈중 순환 인자인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5).
생체 내에서의 BMP9의 역할에 대해서, 지금까지 BMP9 결손 마우스 또는 동물에 대한 항BMP9 항체 투여에 기초하는 보고는 행해진 적이 없지만, 생체 외의 지식에 기초하는 보고는 몇 가지 행해졌다. 예를 들어, 비대 연골 세포의 형성 또는 간엽 세포로부터 연골로의 분화에 대한 촉진 작용의 발현(비특허문헌 6, 7, 8), 또는 혈액 전구 세포의 산생 또는 콜로니 형성에 대한 촉진 작용의 발현(비특허문헌 9)이다. 그러나, 이러한 보고로부터, 항BMP9 항체가 생체 내에서의 적혈구 조혈 작용을 갖는 것을 예상하는 것은 매우 곤란하였다.
또한, 항BMP9 모노클로날 항체로서, R&D 시스템즈사로부터 BMP9에 대한 중화 활성을 갖는 모노클로날 항체(클론 No.360107)가 시판되고 있지만, 그밖의 항체는 알려져 있지 않았다.
빈혈이란, "단위 용적 혈액 중의 적혈구 수, 헤모글로빈 농도 및 헤마토크리트(hematocrit) 값이 정상보다 저하된 상태"을 가리킨다 (비특허문헌 10). 적혈구 산생 조절에는 다양한 인자가 작용하는데, 가장 중요하면서도 또한 특이적인 인자는 에리트로포이에틴(erythropoietin)(이하, EPO라 표기함)이다.
EPO는, 후기 적아구 콜로니 형성 세포(colony-forming unit-erythroid: CFU-E)의 증식·분화를 촉진하여, 결과적으로 생체 내의 적혈구를 증가시킨다(비특허문헌 10). EPO는, 165 아미노산을 포함하는 분자량 30kDa의 당 단백질 호르몬이며, 주로 신장으로부터 산생된다(비특허문헌 10).
신장 질환에 수반하는 빈혈(신장성 빈혈)은, EPO의 산생 조직인 신장이 장애를 받음으로써 EPO의 산생이 저하되어 적혈구 수가 저하되는, 만성 신장 질환(CKD) 환자에서 가장 빈도가 많은 합병증이다(비특허문헌 11). 신장성 빈혈은, QOL에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 심혈관 병변의 발병·진전·신장 기능 장애의 진행에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 11, 12).
신장성 빈혈 치료약인 유전자 재조합 인간 에리트로포이에틴과, 최근 시판된 혈중 반감기가 긴 지속형의 제2 세대 EPO 제제는, 널리 ESA(적혈구 조혈 자극제; erythropoiesis-stimulating agent)라고 불린다(비특허문헌 13).
ESA는 강력한 적혈구 조혈 작용을 갖지만, 신부전 투석 환자의 15-20％에는 ESA를 투여해도 빈혈 개선 효과가 부족한 증례가 존재한다(이것을 ESA 저항성 빈혈 또는 ESA 저반응성 빈혈이라 칭함)(비특허문헌 13).
이러한 ESA 저항성을 나타내는 환자에 대한 ESA의 과잉 투여는, 생명 예후의 악화를 야기하는 것이 대규모 개입 임상 시험(CREATE 시험 및 CHOIR 시험)의 결과로부터 나타나 있다(비특허문헌 11, 12, 13). 이러한 배경으로부터, ESA 저항성의 극복은 신장성 빈혈 치료의 큰 과제로 되어 있어, EPO와는 상이한 기서를 갖는 새로운 적혈구 조혈약의 개발이 강하게 요망되고 있다.
한편, 악성 종양에 수반하는 빈혈(암성 빈혈)은, 다양한 암에서 나타나는 증상이며, 그의 원인으로서는, 실혈을 포함하는 병상의 진행에 수반하는 것과, 화학 요법 또는 방사선 요법 등에 관련된 것의 2가지가 있다(비특허문헌 14).
암성 빈혈에 대해서도 ESA는 유효한 것으로 나타나 있지만, ESA 투여에 의한 암 증식 촉진의 가능성 또는 혈전 경색증의 증가의 우려도 지적되고 있어(비특허문헌 14), 암성 빈혈에 대해서도 EPO와는 상이한 기서를 갖는 새로운 적혈구 조혈약의 개발이 요망되고 있다.
상술한 바와 같이, 신장성 빈혈 및 암성 빈혈에서는, EPO와는 상이한 기서를 갖는 적혈구 조혈약이 요구되고 있다. 당연히, 약제에는 약효의 강도도 필요해진다. 구체적으로는, 일본의 ESA의 투여 개시 기준은, 투석 환자에게는, 헤모글로빈 농도가 10g/dL 미만이 되고, 약제에는 헤모글로빈 농도를 10-11g/dL 사이로 컨트롤할 수 있는 약효가 요구된다. 한편, 보존기 만성 신장병 환자에게는, 11g/dL 미만이 된 시점이 되고, 헤모글로빈 농도를 11-13g/dL 사이로 컨트롤할 수 있는 약효가 요구된다(비특허문헌 15).
즉, 새로운 적혈구 조혈약에는, EPO 비의존성 외에, 헤모글로빈 농도를 적어도 1-2g/dL 상승시킬 수 있을 정도의 약효라는 2가지의 특징이 요구되고 있다.
J. Biol. Chem., 280, 26, 25111(2005) Nat. Biotechnology, 21, 294(2003) J. Biol. Chem., 275, 24, 17937(2000) J. Physiology-Paris, 96, 53(2002) Circ. Res., 102, 8, 914(2008) Gene Ther., 11, 17, 1312(2004) J. Biol. Chem., 284, 1, 649(2009) J. Boneminer. Res., 26, 6, 1166(2011) Growth Factors, 21, 2, 71(2003) 표준 혈액병학(의학서원)(2000) 혈액 프런티어, 18, 2, 17(2008) 신장과 투석, 71, 2, 247(2011) 임상 투석, 26, 2, 59(2010) 임상 투석, 26, 2, 276(2010) 일본 투석 의학회 잡지, 41, 10, 661(2008)
본 발명이 해결하는 과제는, 항BMP9 항체를 유효 성분으로 하는 치료제를 제공함으로써, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈을 개선하는 데에 있다.
본 발명자들은, 항BMP9 항체의 생체 내에서의 작용을 밝힐 목적으로, BMP9 결손 마우스를 사용하여 항BMP9 항체의 취득을 시도한 결과, 기존 항체에 비해, 현저하게 BMP9에 대한 결합성이 향상된 항BMP9 항체의 취득에 성공하였다.
또한 취득한 항체를 사용하여, 항BMP9 항체의 생체 내에서의 작용에 대하여 예의 검토한 결과, 놀랍게도, 이들 항BMP9 항체에는, 적혈구 조혈 작용이 있다는 것, 또한 그 적혈구 조혈 작용은 기존 항체의 작용 강도보다 우수하다는 것, 이들 항체는 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 저해한다는 것을 알아냈다.
또한 그의 작용 기서 해석으로부터, 취득 항체의 적혈구 조혈 작용은, 혈중 EPO 농도의 상승을 통한 것이 아니라는 것, 즉 EPO와는 상이한 기서에 의한 것임을 밝혔다. 또한 신장성 빈혈 모델인 5/6 신장 적출 래트를 사용한 해석으로부터, 항BMP9 항체에, 신장성 빈혈에 대한 개선 작용이 있다는 것도 밝혔다.
본 발명자들은 이러한 지식에 기초하여, 항BMP9 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제를 제공할 수 있다고 생각하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (16)에 관한 것이다.
(1) 이하의 (a) 내지 (e)에서 선택되는 하나의 항체, 또는 해당 항체와 경합하여 인간 BMP9에 결합하며 인간 BMP9에 대한 결합 해리 상수가 1×10-10mol/L 이하인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
(a) 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함) 1 내지 3이 각각 서열 번호 54 내지 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 57 내지 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 항체
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 60 내지 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 63 내지 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 항체
(c) 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체
(d) 서열 번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체
(e) 서열 번호 128로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 132로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(2) 상기 (a) 내지 (e)에서 선택되는 하나의 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체인, (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(3) 유전자 재조합 항체인, (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(4) 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택되는 유전자 재조합 항체인, (3)에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
(5) 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
(a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 54 내지 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 57 내지 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 60 내지 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 63 내지 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편
(c) 서열 번호 128로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 132로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 및 항체 단편.
(6) 서열 번호 67로 표시되는 인간 BMP9 성숙(mature) 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met 및 93번째 Pro에 결합하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 및 해당 항체 단편.
(7) Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA.
(9) (8)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
(10) (9)에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
(11) (10)에 기재된 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
(12) 인간 BMP9에 결합하며, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, BMP9가 관여하는 빈혈을 수반하는 질환의 치료제.
(13) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하는 인간 BMP9의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(14) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편과 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
(15) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간 BMP9가 관여하는 빈혈의 치료 방법.
(16) 인간 BMP9에 결합하며, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, BMP9가 관여하는 빈혈의 치료 방법.
본 발명의 항체는, 기존 항체에 비해, 현저하게 BMP9에 대한 결합성이 향상된 항BMP9 항체이며, 기존 항체의 작용 강도보다 우수한 적혈구 조혈 작용을 갖고, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 저해한다. 또한, 본 발명의 항체의 적혈구 조혈 작용은, 혈중 EPO 농도의 상승을 통한 것이 아니다. 또한, 본 발명의 항체는, 신장성 빈혈에 대한 개선 작용을 갖는다. 이러한 특성을 갖는 본 발명의 항체를 유효 성분으로 함으로써, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제를 제공할 수 있다.
도 1은, 마우스 BMP9 유전자 녹아웃(knock out)용 벡터의 구조를 도시하는 도면이다. 마우스 5' 게놈은, BMP9 유전자 녹아웃 벡터 5' 상동 영역을, Neor은 네오마이신 내성 유전자를, 마우스 3' 게놈은 BMP9 유전자 녹아웃 벡터 3' 상동 영역을, DT-A는 디프테리아 톡신 A쇄 유전자를, T3은 T3 프로모터를, T7은 T7 프로모터를, pBluescript는 클로닝 벡터를 각각 나타낸다.
도 2는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 인간 BMP9에 대한 결합 특이성을 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)에 의해 측정한 도이다. 종축은 흡광도(450-570nm)를 나타낸다. 고상화한 항원이 인간 BMP9인 경우를 흑색, 인간 BMP10인 경우를 백색으로 나타낸다.
도 3은, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 인간 BMP9에 대한 결합성을 ELISA에 의해 측정한 도이다. 횡축에 항체 농도(ng/mL)를, 종축에 각 항체 농도에서의 흡광도(450-570nm)를 나타낸다. 각각, 6D10-1-1 항체는 △, 10D5-2-3 항체는 □, 3B7-3-3 항체는 ■, R&D 항체는 ●로 나타낸다.
도 4는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 인간 BMP9와 표식 R&D 항체의 결합에 대한 저해 작용을 도시하는 도면이다. 횡축에 표식을 하지 않은 항체 농도(ng/mL)를, 종축에 저해 활성(％)을 나타낸다. 각각, 6D10-1-1 항체는 △, 10D5-2-3 항체는 □, 3B7-3-3 항체는 ■, R&D 항체는 ●로 나타낸다.
도 5는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 인간 BMP9와 BMPRII의 결합에 대한 저해 작용을 도시하는 도면이다. 종축은 저해 활성(％)을 나타낸다.
도 6a는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 단기 투여(2주일)에 의한, 마우스 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 6a의 그래프는 적혈구 수의 변화를 나타낸다. 그래프의 횡축은 항체 투여량(mg/kg)을, 종축은 적혈구 수(×104/μL)를 나타낸다. 6D10-1-1 항체는 △, 10D5-2-3 항체는 □, R&D 항체는 ●로 나타낸다. 도면 내의 0mg/kg의 값은 매체 투여군의 것을, 에러 바는 표준 오차(SE, n=6)를 나타낸다.
도 6b는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 단기 투여(2주일)에 의한, 마우스 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 6b의 그래프는 헤모글로빈 농도의 변화를 나타낸다. 그래프의 횡축은 항체 투여량(mg/kg)을, 종축은 헤모글로빈 농도(g/dL)를 나타낸다. 6D10-1-1 항체는 △, 10D5-2-3 항체는 □, R&D 항체는 ●로 나타낸다. 도면 내의 0mg/kg의 값은 매체 투여군의 것을, 에러 바는 표준 오차(SE, n=6)를 나타낸다.
도 7a는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 장기 투여(2개월간)에 의한, 마우스 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 7a의 그래프는 적혈구 수의 변화를 나타낸다. 그래프의 종축은 적혈구 수(×104/μL)를 나타낸다. 도면 내의 에러 바는 표준 오차(SE, n=8)를 나타낸다. 매체 투여군에 대한 각종 항체 투여군의 측정값의 통계학적 유의차 검정은 스튜던트 티-테스트(Student's t-test)를 사용하여 해석하고, **는 P<0.01, ***는 P<0.001을 나타낸다.
도 7b는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 장기 투여(2개월간)에 의한, 마우스 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 7b의 그래프는 헤모글로빈 농도의 변화를 나타낸다. 그래프의 종축은 헤모글로빈 농도(g/dL)를 나타낸다. 도면 내의 에러 바는 표준 오차(SE, n=8)를 나타낸다. 매체 투여군에 대한 각종 항체 투여군의 측정값의 통계학적 유의차 검정은 스튜던트 티-테스트를 사용하여 해석하고, **는 P<0.01, ***는 P<0.001을 나타낸다.
도 8은, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 장기 투여에 의한, 혈중 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 농도에 대한 영향을 도시하는 도면이다. 종축은 마우스 EPO 농도(pg/mL)를 나타낸다. 도면 내의 에러 바는 표준 오차(SE, n=8)를 나타낸다.
도 9a는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 단기 투여(2주일)에 의한, 래트 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 9a의 그래프는 적혈구 수의 변화를 나타낸다. 그래프의 종축은 적혈구 수(×104/μL)를 나타낸다. 도면 내의 에러 바는 표준 오차(SE, n=6)를 나타낸다. 매체 투여군에 대한 각종 항체 투여군의 측정값의 통계학적 유의차 검정은 스튜던트 티-테스트를 사용하여 해석하고, *는 P<0.05, **는 P<0.01, ***는 P<0.001을 나타낸다.
도 9b는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 단기 투여(2주일)에 의한, 래트 적혈구 조혈에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 9b의 그래프는 헤모글로빈 농도의 변화를 나타낸다. 그래프의 종축은 헤모글로빈 농도(g/dL)를 나타낸다. 도면 내의 에러 바는 표준 오차(SE, n=6)를 나타낸다. 매체 투여군에 대한 각종 항체 투여군의 측정값의 통계학적 유의차 검정은 스튜던트 티-테스트를 사용하여 해석하고, *는 P<0.05, **는 P<0.01, ***는 P<0.001을 나타낸다.
도 10a는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 투여에 의한, 신장성 빈혈 래트 모델에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 10a의 그래프는 적혈구 수의 변화를 나타낸다. 그래프의 횡축은 항체 투여 후의 경과 시간(주)을 나타내고, 그래프의 종축은 적혈구 수(×104/μL)를 나타낸다. 가짜 수술 개체에 대한 매체 투여군은 ○, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 매체 투여군은 ●, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 6D10-1-1 항체 투여군은 △, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 10D5-2-3 항체 투여군은 □로 각각 나타낸다. 도면 내 0mg/kg의 값은 매체군의 것을, 에러 바는 표준 편차(SE, 매체 투여군 n=5, 그 이외의 군 n=8)를 나타낸다.
도 10b는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체의 투여에 의한, 신장성 빈혈 래트 모델에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 10b의 그래프는 헤모글로빈 농도의 변화를 나타낸다. 그래프의 횡축은 항체 투여 후의 경과 시간(주)을 나타내고, 그래프의 종축은 헤모글로빈 농도(g/dL)를 나타낸다. 가짜 수술 개체에 대한 매체 투여군은 ○, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 매체 투여군은 ●, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 6D10-1-1 항체 투여군은 △, 5/6 신장 적출 수술 개체에 대한 10D5-2-3 항체 투여군은 □로 각각 나타낸다. 도면 내 0mg/kg의 값은 매체군의 것을, 에러 바는 표준 편차(SE, 매체 투여군 n=5, 그 이외의 군 n=8)를 나타낸다.
도 11a는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체와 인간 BMP9의 복합체의 인간 BMP10 의존성 인간 ALK1 유래 시그널에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 11a의 그래프는 6D10-1-1 항체와 인간 BMP9의 복합체의 결과를 나타낸다. 그래프의 횡축은 인간 BMP10의 첨가 농도를 나타내고, 종축은 상대적인 루시퍼라아제 발광량(Relative Luciferase Unit)을 나타낸다. 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL) 단독 첨가군을 ■, 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL)와 2ng/mL 인간 BMP9의 복합체 첨가군을 △, 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL)와 10ng/mL 인간 BMP9의 복합체 첨가군을 ○으로 나타낸다.
도 11b는, 취득한 항BMP9 모노클로날 항체와 인간 BMP9의 복합체의 인간 BMP10 의존성 인간 ALK1 유래 시그널에 대한 작용을 도시하는 도면이다. 도 11b의 그래프는 10D5-2-3 항체와 인간 BMP9의 복합체의 결과를 나타낸다. 그래프의 횡축은 인간 BMP10의 첨가 농도를 나타내고, 종축은 상대적인 루시퍼라아제 발광량(Relative Luciferase Unit)을 나타낸다. 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL) 단독 첨가군을 ■, 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL)와 2ng/mL 인간 BMP9의 복합체 첨가군을 △, 항BMP9 모노클로날 항체(3μg/mL)와 10ng/mL 인간 BMP9의 복합체 첨가군을 ○으로 나타낸다.
도 12는, 제작한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 중쇄 가변 영역을 나타낸다.
도 13은, 제작한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 경쇄 가변 영역을 나타낸다.
본 발명은 인간 BMP9에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 항체와 경합하여 인간 BMP9에 결합하는 항체란, 인간 BMP9에 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 또는 부분적으로 동일한 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 갖고, 해당 에피토프에 결합하는 항체를 말한다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 인간 BMP9의 아미노산 서열과 동일한 배열을 인식하여 결합하는 항체를 말한다.
인간 BMP9는, 서열 번호 66으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 단일쇄의 전구체 단백질(Pre-Pro체)로서 합성된다. 이 단일쇄의 Pre-Pro체는, 서열 번호 66으로 표시되는 아미노산 서열 중, 골지체로, 1부터 22번째까지의 시그널 펩티드 영역이 절단된 후, 392번째에 존재하는 시스테인 잔기간에 의한 디술피드 결합을 통해 2량체(Pro 2량체)를 형성한다.
그 후, furin 유사 프로테아제에 의해, 서열 번호 66으로 표시되는 아미노산 서열의 319번째와 320번째의 아미노산 잔기 사이에서 절단이 일어나고, 디술피드 결합을 갖지 않는 N말측 단편의 프로 펩티드 영역(서열 번호 66으로 표시되는 아미노산 서열 중, 23번째의 아미노산부터 319번째의 아미노산까지를 포함하는 펩티드)과 서열 번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 C말단측 단편(성숙 영역)으로 분할된다.
상기 성숙 영역은, 프로 펩티드 영역의 절단 후에도, 서열 번호 67의 73번째에 남는 시스테인 잔기간에 의한 디술피드 결합을 통해 2량체를 형성한다(이하, 성숙 2량체라 표기함). 절단된 N말단측의 프로 펩티드 영역의 2 분자는, 이 성숙 2량체 1 분자와 비공유 결합을 통해 복합체를 형성하고, 그 복합체의 형태로 세포로부터 분비된다(문헌 [J. Biol. Chem., 280(26), 25111(2005)]). 성숙 2량체 및 성숙 2량체에 N말단 프로 펩티드 영역이 결합한 복합체 모두, BMP9의 기능을 갖고 있다.
따라서, 본 발명에서의 인간 BMP9로서는, 서열 번호 66 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_057288로 표시되는 아미노산 서열 중, 성숙 영역에 상당하는 320번째부터 429번째까지의 아미노산 서열(서열 번호 67)을 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드, 성숙 영역에 상당하는 320번째부터 429번째까지의 아미노산 서열(서열 번호 67)에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 번호 67로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 상술한 성숙 2량체, 및 성숙 2량체에 N말단 프로 펩티드 영역이 결합한 복합체도 포함된다.
상술한 BMP9의 기능으로서는, BMP9의 세포 내의 시그널 전달에 대한 관여를 말한다. 세포 내의 시그널 전달에서는, BMP9가 TGF β슈퍼 패밀리에 속하는 타입 I 및 타입 II의 2개의 수용체에 결합함으로써, 당해 수용체가 활성화되어, Smad1/5/8이 인산화되고, 또한 인산화에 의해 활성화된 Smad1/5/8이, Smad4와 복합체를 형성한 후, 핵 내로 이행해, 전사 인자로서 기능한다.
타입 I 수용체로서는, ALK1 및 ALK2를 들 수 있다. 또한, 타입 II 수용체로서는 BMP 타입 II 수용체(BMPRII), activin 타입 IIa 수용체(ActRIIa), 및 activin 타입 IIb 수용체(ActRIIb)를 들 수 있다.
서열 번호 67로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는, 부위 특이적 변이 도입법(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)], [Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)], [Gene, 34, 315(1985)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)]) 등을 사용하여, 예를 들어 서열 번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 부위 특이적 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다.
결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십 개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.
인간 BMP9를 코딩하는 유전자로서는, 서열 번호 68 또는 진뱅크(GenBank) 액세션 번호 NM_016204로 표시되는 염기배열을 들 수 있다. 그 중, 성숙 영역에 상당하는 서열 번호 69로 표시되는 염기배열에 있어서, 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기배열을 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 서열 번호 69로 표시되는 염기배열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 염기배열, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기배열, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기배열을 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 및 서열 번호 69로 표시되는 염기배열을 갖는 DNA와 스트린젠트(stringent)한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA를 포함하며, 인간 BMP9의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자 등도, 본 발명의 인간 BMP9를 코딩하는 유전자에 포함된다.
스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서는, 서열 번호 69로 표시되는 염기배열을 갖는 DNA를 프로브에 사용한, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법, 서던 블롯·하이브리다이제이션법, 또는 DNA 마이크로 어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 의미한다.
구체적으로는, 하이브리다이즈한 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA, 또는 해당 배열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 글래스를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재 하, 65℃에서 하이브리다이제이션(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)], [DNA Cloning 1: Coretechniques, a Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)])을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하고, 65℃ 조건 하에서 필터 또는 슬라이드 글래스를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.
상기 하이브리다이즈 가능한 DNA로서는, 서열 번호 69로 표시되는 염기배열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기배열에는, 종종 유전자의 다형이 확인된다. 본 발명에서 사용되는 유전자에, 이러한 다형에 의해 염기배열에 소규모의 변이를 발생시킨 유전자도, 본 발명의 BMP9를 코딩하는 유전자에 포함된다.
본 발명에서의 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이면 되는데, 염기배열에 대해서는, BLAST(문헌 [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)])에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2(문헌 [Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997)], [Genome Res., 7, 649(1997)], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html)에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기배열인 경우에는 5, 아미노산 서열인 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기배열인 경우에는 2, 아미노산 서열인 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기배열인 경우에는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우에는 3 잔기, -y[Dropoff (X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
서열 번호 66 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_057288로 표시되는 아미노산 서열의 부분 배열을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작할 수 있고, 예를 들어 서열 번호 66으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다.
또한, 상기의 방법으로 제작되는 폴리펩티드 또는 DNA에 기초하여, 상기와 마찬가지의 방법에 의해, 서열 번호 66 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_057288로 표시되는 아미노산 서열의 부분 배열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
또한, 서열 번호 66 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_057288로 표시되는 아미노산 서열의 부분 배열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 66 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_057288로 표시되는 아미노산 서열의 부분 배열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법, t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체(이하, 본 발명의 항체라고도 함)는, 인간 BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 인식하며, 결합하는 항체 또는 그 항체 단편, 또는 인간 BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에 결합하여, BMP9와 BMPRII의 결합을 저해하고, BMP9와 ALK1의 결합을 저해하지 않는 성질을 갖고 있다. 본 발명의 모노클로날 항체로서는, 인간 BMP9에 결합하며 인간 BMP9에 대한 결합 해리 상수가 1×10-10mol/L 이하인 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명의 항체로서는, 구체적으로는 서열 번호 67로 표시되는 인간 BMP9 성숙 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 84번째 Val, 95번째 Leu, 97번째 Tyr 및 98번째 His에 결합하는 항체, 또는 적어도 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met 및 93번째 Pro에 결합하는 항체를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met 및 93번째 Pro에 결합하는 항체를 들 수 있다.
본 발명에서의 인간 BMP9의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 서열 번호 67로 표시되는 인간 BMP9 성숙 영역의 아미노산 서열을 2개 포함하고, 73번째의 시스테인 잔기 사이가 디술피드 결합을 형성하고 있는 것을 들 수 있다.
본 발명에서의 인간 BMP9의 입체 구조로서는, 서열 번호 66, 진뱅크 액세션 번호 NP_057288 또는 서열 번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 BMP9가 천연 상태에서 취할 수 있는 구조와 동등한 구조를 갖고 있으면 어떤 구조이든 상관없다. 인간 BMP9가 천연 상태에서 취할 수 있는 입체 구조란, 인간 BMP9의 천연형의 입체 구조인 것을 말한다.
본 발명에서의 BMPRII로서는, 서열 번호 70 또는 진뱅크 액세션 번호 NP_001195로 표시되는 아미노산 서열 중, 세포외 영역에 상당하는 27번째부터 150번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 발명에서의 ALK1로서는, 서열 번호 71 또는 진뱅크 액세션 번호 AAH42637로 표시되는 아미노산 서열 중, 세포외 영역에 상당하는 22번째부터 118번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 해리 상수(Kd값)는, 비아코어(Biacore) 시스템(GE 헬스케어(Healthcare)사 제조)을 사용하여 측정한 센서 그램으로부터, 싱글 사이클 키네틱스 산출법 (BIA이밸류에이션 소프트웨어 버전 3(BIAevaluation Software ver.3), GE 헬스케어사 제조)에 의해 해석함으로써 산출할 수 있다.
상기 항체로서, 구체적으로는, 이하의 (i) 내지 (ii)의 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
(i) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 54 내지 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라 기재함)를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 57 내지 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라 기재함)를 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(ii) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 60 내지 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 63 내지 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서 보다 구체적으로는, 이하의 (a), (b) 및 (c)의 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH라 기재함)을 포함하며, 서열 번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(이하, VL이라 기재함)을 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(b) 서열 번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 서열 번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편
(c) 서열 번호 128로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 서열 번호 132로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 항체 및 그 항체 단편
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서는, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 BMP9에 존재하는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편이, 인간 BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것은, 고상 항원을 사용한 효소 결합 면역 흡착법(ELISA) 등, 인간 BMP9 또는 인간 BMP9를 발현한 조직에 대한 공지된 면역학적 검출법, 특정한 항원과 특정 항원에 대한 항체의 결합성을 조사할 수 있는 방법 등에 의해 확인할 수 있다.
예를 들어, 비아코어 시스템(GE 헬스케어사 제조) 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명, ITC(DKSH사 제조) 등을 사용한 등온 적정 칼로리메트리 등의 방법을 들 수 있다.
항원에 대한 항체의 결합 해리 상수(Kd값)는, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 등온 적정 칼로리메트리 중 어떤 방법으로든, 스캐차드·플롯(scatchard·plot), 또는 각 장치의 첨부 문서에 따른 해석을 행함으로써 구할 수 있다.
또한, 공지된 면역학적 검출법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)], [단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등을 조합하여 확인할 수도 있다.
인간 BMP9를 발현한 조직으로서는, 해당 BMP9를 발현하고 있으면 어느 조직이든 좋으며, 예를 들어 혈액, 간장 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 산생 세포가 분비하는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하여, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 구조)이 균일한 것이 특징이다.
에피토프로서는, 예를 들어 모노클로날 항체가 인식하여, 결합하는 단일의 아미노산 서열, 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조, 당쇄가 결합한 아미노산 서열 및 당쇄가 결합한 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는, 인간 BMP9의 아미노산 서열에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프는, 인간 BMP9의 아미노산 서열에 포함되는 것이 바람직하다.
하이브리도마는, 예를 들어 상기의 인간 BMP9를 항원으로서 제조하고, 해당 항원을 면역한 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하고, 또한 해당 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 해당 하이브리도마를 배양하거나, 또는 해당 하이브리도마 세포를 동물에게 투여하여 해당 동물을 복수 암화시켜, 해당 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 항BMP9 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
항원을 면역하는 동물로서는, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 닭 또는 래빗 등이 사용된다. 또한, 이러한 동물로부터 항체 산생능을 갖는 세포를 취득하고, 해당 세포에 생체 외에서 면역을 실시한 후에, 골수종 세포와 융합하여 제작한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에서의 유전자 재조합 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체, 인간 항체 또는 항체 단편 등, 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 갖고, 항원성이 낮고, 혈중 반감기가 연장된 것은 치료약으로서 바람직하다. 유전자 재조합 항체는, 예를 들어 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 사용하여 개변한 것을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH라 기재함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL이라 기재함)을 포함하는 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 키메라 항체는, 상기한 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 이뮤노글로블린(이하, hIg라 표기함)에 속하면 어떠한 것이든 상관없지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 모두를 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이든 상관없으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체로서 구체적으로는, 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 서열 번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 키메라 항체를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하고, 서열 번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 키메라 항체를 들 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체란, 인간화 항체라고 하는 경우도 있으며, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 CDR 이식 항체는, 인간 BMP9를 특이적으로 인식하며, 인간 BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에 결합하는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마로부터 산생되는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임 워크 영역(이하, FR이라 표기함)에 이식한 가변 영역(이하, V 영역이라 표기함)을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이어도 상관없지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스 모두를 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이든 상관없으며, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 CDR 이식 항체로서 구체적으로는, CDR1 내지 3이 서열 번호 54 내지 56으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, CDR1 내지 3이 서열 번호 57 내지 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다. 또한, CDR1 내지 3이 서열 번호 60 내지 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, CDR1 내지 3이 서열 번호 63 내지 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서, 구체적으로는 이하의 (a) VH 및 (b) VL 중 적어도 한쪽을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.
(a) 서열 번호 116의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 116의 아미노산 서열의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 49번째의 Gly, 79번째의 Asn, 81번째의 Leu, 94번째의 Ala, 95번째의 Val, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH
(b) 서열 번호 118의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met, 40번째의 Tyr, 81번째의 Ser, 82번째의 Leu, 89번째의 Val 및 91번째의 Tyr에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VH로서는, 이하의 (1) 내지 (6)이 바람직하다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 49번째의 Gly, 79번째의 Asn, 81번째의 Leu, 94번째의 Ala, 95번째의 Val, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 49번째의 Gly, 81번째의 Leu, 94번째의 Ala, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 49번째의 Gly, 79번째의 Asn, 94번째의 Ala, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 49번째의 Gly, 95번째의 Val, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 79번째의 Asn 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의 49번째의 Gly, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg가, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 VH
상기 VH의 아미노산 서열로서는, 예를 들어, 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 또는 100번째의 Arg를 Gly로 치환하는 개변에서 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
9개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 및 99번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (8)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 99번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 49번째의 Gly를 Ala로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (7)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 79번째의 Asn을 Ser로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 99번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 81번째의 Leu를 Val로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 81번째의 Leu를 Val로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 94번째의 Ala를 Gly로, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (12)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 81번째의 Leu를 Val로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 94번째의 Ala를 Gly로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 99번째의 Ala를 Thr로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 및 49번째의 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로, 및 49번째의 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 및 81번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(10) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 및 94번째의 Ala를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(11) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 및 99번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열
(12) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로, 및 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (9)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 18번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 49번째의 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 79번째의 Asn을 Ser로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 81번째의 Leu를 Val로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 94번째의 Ala를 Gly로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 95번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 99번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 100번째의 Arg를 Gly로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 인간화 항체에 포함되는 VL로서는, 이하의 (1) 내지 (4)가 바람직하다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met, 40번째의 Tyr, 81번째의 Ser, 82번째의 Leu, 89번째의 Val, 및 91번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met, 81번째의 Ser, 82번째의 Leu, 및 89번째의 Val이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr, 81번째의 Ser, 및 91번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr, 및 91번째의 Tyr이, 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL
상기 VL의 아미노산 서열로서는, 예를 들어, 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 또는 91번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 개변에서 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (10)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 및 81번째의 Ser을 Pro로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 및 82번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 및 82번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(7) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(8) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 82번째의 Leu를 Met로, 및 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(9) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 82번째의 Leu를 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(10) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 89번째의 Val을 Met로, 및 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는, 예를 들어 이하의 (1) 내지 (6)의 아미노산 서열을 들 수 있다.
(1) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 4번째의 Met를 Leu로 치환한 아미노산 서열
(2) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 40번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
(3) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 81번째의 Ser을 Pro로 치환한 아미노산 서열
(4) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 82번째의 Leu를 Met로 치환한 아미노산 서열
(5) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 89번째의 Val을 Met로 치환한 아미노산 서열
(6) 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의 91번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
또한, 본 발명의 인간화 항체의 구체예로서는, 항체의 VH가 서열 번호 116 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 116 및/또는 항체의 VL이 도 12에서 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 또는 항체의 VH가 도 11에서 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하는데, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈 림프구를 단리하여, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하여 클로닝함으로써, 해당 항체를 산생하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양 상청 중으로부터 해당 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 제조한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 산생 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 내장된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES 세포를 마우스의 초기 배에 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 산생 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체는, 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법을 사용하여, 인간 항체 산생 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 산생 축적시킴으로써 제작할 수 있다.
상술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되며, 상술한 항체 또는 그 항체 단편과 마찬가지의 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편도, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 포함된다.
결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며, 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 부위 특이적 변이 도입법(문헌 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)], [Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)], [Gene, 34, 315(1985)], [Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)]) 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이다. 예를 들어, 바람직하게는 1 내지 수십 개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 특히 바람직하게는 1 내지 5개이다.
상기 항체의 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 다음과 같은 경우를 나타낸다. 즉, 동일 배열 중의 임의, 또한 1 또는 복수의 아미노산 서열 중에서, 1개 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미한다. 또한, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 발생하는 경우도 있고, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형의 모든 경우도 있다.
천연형 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 또는 L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C군: 아스파라긴, 글루타민
D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F군: 세린, 트레오닌, 호모 세린
G군: 페닐알라닌, 티로신
본 발명에 있어서, 항체 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fab', 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab는, 본 발명의 모노클로날 항체를 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 해당 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 Fab를 제조할 수도 있다.
F(ab')2는, IgG의 힌지 영역의 디술피드 결합의 하부를 단백질 분해 효소인 펩신으로 분해하여 얻어진, 2개의 Fab 영역이 힌지 부분에서 결합하여 구성된, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 단편이다.
본 발명의 F(ab')2는, 본 발명의 모노클로날 항체를 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합시켜 제작할 수도 있다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'는, 본 발명의 F(ab')2를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 해당 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 Fab'를 제조할 수도 있다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P라 표기함)를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 scFv는, 본 발명의 모노클로날 항체 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
2량체화 V 영역은 scFv가 2량체화한 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 한쪽을 다른 항원 결합 활성으로 할 수도 있다.
본 발명의 2량체화 V 영역은, 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, scFv를 코딩하는 DNA를 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
dsFv는, VH 및 VL 중 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 해당 시스테인 잔기간의 디술피드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, 기지의 방법(문헌 [Protein Engineering, 7, 697(1994)])에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.
본 발명의 dsFv는, 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하여, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다.
본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하여, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 방사성 동위 원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다. 항체의 유도체를 검출 방법, 정량 방법, 검출용 시약, 또는 정량용 시약으로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 결합하는 약제로서, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표식체를 들 수 있다.
본 발명에서의, 항체의 유도체는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 그 항체 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 중의 당쇄 등에, 방사성 동위 원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 등을 화학적 방법(문헌 [항체 공학 입문, 치진서관(1994)])에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서의 항체의 유도체는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고자 하는 단백질을 코딩하는 DNA를 연결시켜서 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시키는 유전자 공학적 방법으로부터 제조할 수 있다.
방사성 동위 원소로서는, 예를 들어 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는, 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시켜도 된다. 킬레이트제로서는, 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자의 약제로서는, 예를 들어 아크리디늄에스테르 또는 로핀(rofin) 등의 발광 물질, 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 또는 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
저분자의 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 또는 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자의 약제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 또는 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 다양한 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 산생의 억제 등의 효과가 기대된다(문헌 [바이오 콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]). 예를 들어, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다[바이오 콘쥬게이트 의약품, 히로카와 쇼텐(1993)]). PEG화 수식 시약으로서는, 리신의 e-아미노기에 대한 수식제(일본 특허 공개 (소)61-178926호 공보), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실기에 대한 수식제(일본 특허 공개 (소)56-23587호 공보), 또는 아르기닌의 구아니디노기에 대한 수식제(일본 특허 공개 (평)2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.
단백질로서는, 예를 들어 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 또는 루시퍼라아제 등의 효소를 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 BMP9가 관여하는 빈혈을 수반하는 질환의 치료제에 관한 것이다.
BMP9가 관여하는 빈혈을 수반하는 질환으로서는, 혈액 또는 조혈 기능 자체에 원인이 있는 1차성 빈혈과, 다른 병이 원인으로 야기되는 2차성 빈혈을 들 수 있다. 1차성 빈혈에는 철 결핍성 빈혈, 거대 적아구성 빈혈, 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈 등이 있고, 2차성 빈혈에는 신장 질환, 감염증(결핵, 감염성 심내막염, 간농양 등), 교원병(만성 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스 등), 암 등의 악성 질환, 간 질환, 내분비 질환 등이 있다.
암으로서는, 예를 들어 혈액암, 유방암, 자궁암, 대장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암 또는 췌장암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암을 들 수 있다.
혈액암으로서는, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 골수 이형성 증후군(myelodysplasticsyndromes, MDS), 다발성 골수종(multiple myeloma), 피부 T세포성 림프종(cutaneous Tcell lymphoma, CTCL), 말초 T세포성 림프종(peripheral Tcell lymphoma, PTCL), 미분화 대세포형 림프종(anaplastic largecell lymphoma, ALCL), 급성 림프성 백혈병(acute lympatic leukemia, ALL), 만성 림프성 백혈병(chronic lympatic leukemia, CLL), 기타 림프성 백혈병, NK 세포 림프종, 호지킨(Hodgkin) 림프종 또는 버킷(Burkitt) 림프종을 비롯한 비(非)호지킨 림프종 등을 들 수 있다.
간 질환으로서는, 예를 들어 만성 간염, 간경변, 간부전 등을 들 수 있고, 내분비 질환으로서는, 예를 들어 갑상선 기능 저하증, 부신피질 기능 저하증, 하수체 기능 저하증, 부갑상선 기능 항진증 등을 들 수 있다.
본 발명의 치료제로서는, 상술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유한다.
본 발명의 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 피하 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라 상이하지만, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 10mg/kg이다.
또한, 본 발명은 BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며, 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, BMP9의 면역학적 검출 또는 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 BMP9의 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서는, 임의의 공지된 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표식을 실시한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 방사성 물질 표식 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴 블롯법 또는 물리 화학적 방법 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 항체의 제조 방법, 질환의 치료 방법, 및 질환의 진단 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
1. 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 항원의 제조
항원이 되는 BMP9 또는 BMP9를 발현한 조직은, BMP9 전체 길이 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를, 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또한, BMP9를 다량으로 발현하고 있는 인간 조직으로부터 BMP9를 정제하여 얻을 수 있다. 또한, 해당 조직 등을 그대로 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 BMP9의 부분 배열을 갖는 합성 펩티드를 제조하여 항원에 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 BMP9는, 문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 [Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해, 해당 BMP9를 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜서 제조할 수 있다.
먼저, BMP9를 코딩하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에 완전 길이 cDNA를 바탕으로 하여 제조된, 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용해도 된다. 이어서, 얻어진 해당 재조합 벡터를, 해당 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 내장이 가능해서, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 대장균 등의 에스케리키아(Escherichia)속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 재조합 벡터는, 원핵생물 중에서 자율 복제가 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 배열, BMP9를 코딩하는 부분을 포함하는 DNA, 및 전사 종결 배열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 전사 종결 배열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 배열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 된다.
해당 재조합 벡터로서는, 리보솜 결합 배열인 샤인·달가노(Shine·Dalgarno) 배열(SD 배열이라고도 함)과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리(예를 들어 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 해당 BMP9를 코딩하는 DNA의 염기배열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이것에 의해 목적으로 하는 BMP9의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈·다이아그노스틱스사 제조), pKK233-2(파마시아사 제조), pSE280(인비트로젠사 제조), pGEMEX-1(프로메가사 제조), pQE-8(퀴아젠사 제조), pKYP10(일본 특허 공개 (소)58-110600호 공보), pKYP200(문헌 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)]), pLSA1(문헌 [Agricbiol. Chem., 53, 277(1989)]), pGEL1(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)]), pBluescript II SK(-)(스트라테이진사 제조), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 제조], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 제조], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091호 공보], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP6798)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091호 공보], pTerm2(미국 특허 제4686191호 명세서, 미국 특허 제4939094호 명세서, 미국 특허 제5160735호 명세서), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400(문헌 [J.Bacteriol., 172, 2392(1990)]), pGEX(파마시아사 제조), pET 시스템(노바젠사 제조), 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 또는 T7 프로모터 등의, 대장균 또는 파지 등에서 유래되는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 let I 프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 대장균 XL-1Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 사용하는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972), Gene, 17, 107(1982)], [Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)])을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어, pcDNA I, pcDM8(후나고시사 제조), pAGE107[일본 특허 공개 (평)3-22979호 공보; Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보), pcDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNA I/Amp(인비트로젠사 제조), pcDNA 3.1(인비트로젠사 제조), pREP4(인비트로젠사 제조), pAGE103(문헌 [J. Biochemistry, 101, 1307(1987)]), pAGE210, pME18SFL3, 또는 pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV)의 급속 초기 발현(immediate early)(IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로서는, 예를 들어 인간 백혈병 세포 Namalwa 세포, 원숭이 세포 COS 세포, 차이니즈·햄스터 난소 세포 CHO 세포(문헌 [Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968)]; [Genetics, 55, 513(1968)]; [Chromosoma, 41, 129(1973)]; [Methods in Cell Science, 18, 115(1996)]; [Radiation Research, 148, 260(1997)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)]; [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968)]; [Cell, 6, 121(1975)]; [Molecular Cellgenetics, Appendix I, II(pp.883-900)]), CHO/DG44, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포Y B2/3HL.P 2.G 11.16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 말함), 마우스 미엘로마 세포NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14, 시리안 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 특허 공개 (소)63-000299호 공보) 등을 들 수 있다.
숙주 세포에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법(문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]), 인산칼슘법(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보), 또는 리포펙션법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]) 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 BMP9를 코딩하는 DNA를 내장한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 또는 동물 세포 등의 유래의 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 해당 BMP9를 생성 축적시켜, 해당 배양물로부터 채취함으로써, BMP9를 제조할 수 있다. 해당 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
진핵생물 유래의 세포에서 발현시켰을 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 BMP9를 얻을 수 있다. 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물을 배양할 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물을 배양할 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 예를 들어, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지(문헌 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)]), Eagle의 MEM 배지(문헌 [Science, 122, 501(1952)]), 둘베코(Dulbecco's) 개변 MEM 배지(문헌 [Virology, 8, 396(1959)]), 199 배지(문헌 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)]), 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)) 배지, 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상 pH6 내지 8, 30 내지 40℃, 5％ CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양중 필요에 따라, 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
BMP9를 코딩하는 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)])을 사용할 수 있다.
BMP9의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포외 막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포, 또는 생산시키는 BMP9의 구조를 바꿈으로써, 적절한 방법을 선택할 수 있다.
BMP9가 숙주 세포내 또는 숙주 세포외 막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법(문헌 [J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)]), 로우 등의 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989)], [Genes Develop., 4, 1288(1990)]), 일본 특허 공개 (평)05-336963호 공보, 또는 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 사용함으로써, BMP9를 숙주 세포 외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 (평)2-227075호 공보)를 이용하여 BMP9의 생산량을 상승시킬 수도 있다. 얻어진 BMP9는, 예를 들어 이하와 같이 하여 단리, 정제할 수 있다. BMP9가 세포 내에 용해 상태에서 발현했을 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤-가울린 호모게나이저 또는 다이노 밀 등을 사용해서 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다.
상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, 디아이온(DIAION) HPA-75(미쯔비시 가가꾸사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로오스(Sepharose) FF(파마시아사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 또는 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 또는 조합해서 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
BMP9가 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우에는, 상기와 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 획분으로서 해당 BMP9의 불용체를 회수한다. 회수한 해당 BMP9의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화 액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 BMP9를 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 마찬가지의 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
BMP9 또는 그의 당 수식체 등의 유도체가 세포 외로 분비되었을 경우에는, 배양 상청에 있어서 해당 BMP9 또는 그의 당 수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 해당 배양물을 상기와 마찬가지로 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 획분을 취득하고, 해당 가용성 획분으로부터, 상기와 마찬가지의 단리 정제법을 사용함으로써, 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 BMP9는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드반스트 켐테크사 제조, 퍼킨·엘머사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루멘트사 제조, 신세셀-베가(Synthecell-Vega)사 제조, 퍼셉티브사 제조 또는 시마즈 세이사꾸쇼사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 산생 세포의 제조
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에게, (1)에서 얻어지는 항원을 면역하고, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 산생 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮고 상기의 동물에서 충분한 항체값의 상승이 확인되지 않는 경우에는, BMP9 녹아웃 마우스를 피 면역 동물로서 사용할 수도 있다.
면역은, 동물의 피하, 정맥내 또는 복강 내에, 예를 들어 프로인드의 완전 아쥬반트, 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 아쥬반트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA(소 혈청 알부민), 또는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)) 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는, 1회째의 투여 후, 1 내지 2주일 간격으로 2 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하여, 그 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]) 등을 사용하여 측정한다. 면역에 사용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 동물을 융합용 항체 산생 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역한 동물로부터 비장 등의 항체 산생 세포를 포함하는 조직을 적출하여, 항체 산생 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용하는 경우에는, 비장을 세단하여 푼 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거하여 융합용 항체 산생 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 제조
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하고, 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스(Balb/C 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(문헌 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)]), P3-NS1/1Ag41(NS-1)(문헌 [European J. Immunology, 6, 511(1976)]), SP2/0-Ag14(SP-2)(문헌 [Nature, 276, 269(1978)]), P3-X63-Ag8653(653)(문헌 [J. Immunology, 123, 1548(1979)]), 또는 P3-X63-Ag8(X63)(문헌 [Nature, 256, 495(1975)]) 등이 사용된다.
해당 골수종 세포는, 정상 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, FBS, 및 8-아자구아닌을 첨가한 RPMI1640 배지]에서 계대하고, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지에서 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포 수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 산생 하이브리도마의 제조
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 산생 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium(MEM)) 또는 PBS(인산2나트륨 1.83g, 인산1칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세정하고, 세포 수가, 융합용 항체 산생 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하여 원심 분리한 후, 상청을 제거한다.
침전한 세포군을 잘 푼 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸술폭시드의 혼합액을 37℃에서 교반하면서 첨가한다. 또한 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가하여 전량이 50mL가 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제거한다. 침전된 세포군을 천천히 푼 후, 융합용 항체 산생 세포에 HAT 배지[히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 첨가한 정상 배지] 중에 천천히 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 5％ CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 빼내어, 후술하는 바인딩 분석 등의 하이브리도마의 선택 방법에 의해, BMP9를 포함하는 항원에 반응하고, BMP9를 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용함], 안정적으로 강한 항체값이 확인된 것을 모노클로날 항체 산생 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 제조
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(프리스탄(Pristane)) 0.5mL를 복강내 투여하고, 2주일 사육함]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 복강 내에 주사한다. 10 내지 21일에 하이브리도마는 복수 암화한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하여, 원심 분리해서 고형분을 제거한 후, 40 내지 50％ 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 단백질 A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행해, IgG 또는 IgM 획분을 모아 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를, 10％ FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제거하고, 하이브리도마-SFM 배지에 현탁하여, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청으로부터 단백질 A-칼럼 또는 단백질 G-칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 획분을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, 하이브리도마-SFM 배지에는 5％ 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은, 로리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 나타내는 효소 면역 측정법에 의한 바인딩 분석, 및 비아코어에 의한 키네틱스(kinetics) 해석에 의해 행한다.
(6-a) 결합 검정
항원으로서는, (1)에서 얻어지는 BMP9를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입하여 얻어진 유전자 도입 세포, 리콤비넌트 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드 또는 부분 펩티드 등을 사용한다. 항원이 부분 펩티드일 경우에는, BSA 또는 KLH 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하여, 이것을 사용해도 된다.
항원을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하여 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하여 반응시킨다. PBS 또는 PBS-트윈 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표식한 항 이뮤노글로블린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-트윈으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행해, 면역원에 대해 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체는, 상술한 바인딩 분석계에, 피검 항체를 첨가하여 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 첨가했을 때에 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, BMP9의 아미노산 서열, 또는 그의 입체 구조에 대한 결합에 대해서, 취득한 모노클로날 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는, 상술한 바인딩 분석계에서 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의, 부분적인 합성 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태 시킨 합성 펩티드 등을 제작하여 면역함으로써 취득할 수 있다.
(6-b) 비아코어에 의한 키네틱스 해석
비아코어 T100을 사용하여, 항원과 피검물 사이의 결합에서의 키네틱스를 측정하고, 그 결과를 기기 부속의 해석 소프트웨어로 해석을 한다. 항 마우스 IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 흘려서 적당량 결합시키고, 또한 농도 기지의 복수 농도의 항원을 흘려서, 결합, 해리를 측정한다.
얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용해서, 1:1 바인딩 모델에 의해 키네틱스 해석을 행해 각종 파라미터를 취득한다. 또는, 인간 BMP9를 센서 칩 상에, 예를 들어 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 농도 기지의 복수 농도의 정제 모노클로날 항체를 흘려서, 결합, 해리를 측정한다. 얻어진 데이터를 기기 부속의 소프트웨어를 사용하여, 바이밸런트 바인딩 모델에 의해 키네틱스 해석을 행하고, 각종 파라미터를 취득한다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작 예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 제작 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 내장된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 정상 영역(이하, C 영역이라 표기함)은, 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA에는, cDNA를 사용하는데, 엑손과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터에는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 내장해서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107(문헌 [Cytotechnol., 3, 133(1990)]), pAGE103(문헌 [J.Biochem., 101, 1307(1987)]), pHSG274(문헌 [Gene, 27, 223(1984)]), pKCR(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)]), pSG1bd2-4(문헌 [Cytotechnol., 4, 173(1990)]), 또는 pSE1UK1Sed1-3(문헌 [Cytotechnol., 13, 79(1993)]) 등을 사용한다.
동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서에는, SV40의 초기 프로모터(문헌 [J. Biochem., 101, 1307(1987)]), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR(문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)]), 또는 면역 글로불린 H쇄의 프로모터(문헌 [Cell, 41, 479(1985)])와 인핸서(문헌 [Cell, 33, 717(1983)]) 등을 사용한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포에 대한 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터(문헌 [J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)])를 사용하는데, 항체 H쇄 및 L쇄가 따로 따로의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호 공보), pEE18(문헌 [Hybridoma, 17, 559(1998)]) 등을 사용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다.
상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기배열을 각각 결정하고, 염기배열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 래트, 햄스터, 또는 래빗 등을 사용하는데, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 동물이든 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 제조에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법(문헌 [Methods in Enzymol., 154, 3(1987)]), 또는 RNA 이지 키트(easy kit)(퀴아젠사 제조) 등의 킷 등을 사용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 제조에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]), 또는 Oligo-dT30<Super>mRNA 정화 키트(Purification Kit)(다카라 바이오사 제조) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, 패스트 트랙(Fast Track) mRNA 단리 키트(단리 키트)(인비트로젠사 제조), 또는 퀵 프레프(Quick Prep) mRNA 정화 키트(파마시아사 제조) 등의 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 제조할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지된 방법(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)]), 또는 cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝용 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(SperScript plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(인비트로젠사 제조), 또는 ZAP-cDNA 합성 키트(스트라테이진사 제조) 등의 키트 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 내장하는 벡터에는, 해당 cDNA를 내장할 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP ExPress(문헌 [Strategies, 5, 58(1992)]), pBluescript II SK(+)(문헌 [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]), λZAPII(스트라테이진사 제조), λgt10, λgt11(문헌 [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49(1985)]), 람다 브루미드(Lambda BlueMid)(클론테크사 제조), λEx Cell, pT7T3-18U(파마시아사 제조), pcD2(문헌 [Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)]), 또는 pUC18(문헌 [Gene, 33, 103(1985)]) 등을 사용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL-1Blue MRF(문헌 [Strategies, 5, 81(1992)]), C600(문헌 [Genetics, 39, 440(1954)]), Y1088, Y1090(문헌 [Science, 222, 778(1983)]), NM522(문헌 [J. Mol. Biol., 166, 1(1983)]), K802(문헌 [J. Mol. Biol., 16, 118(1966)]), 또는 JM105(문헌 [Gene, 38, 275(1985)]) 등을 사용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택에는, 동위 원소 또는 형광 표식한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법, 또는 플라크·하이브리다이제이션법(문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]) 등을 사용한다.
또한, 프라이머를 제조하여, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)법(이하, PCR법이라 표기함, 문헌 [Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)], [Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)])을 행함으로써, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 제조할 수도 있다.
선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(스트라테이진사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 사용되는 염기배열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기배열을 결정한다. 염기배열 해석 방법에는, 예를 들어, 디데옥시법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)]) 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE 바이오 시스템즈사 제조) 또는 A. L. F. DNA 시퀀서(파마시아사 제조) 등의 염기배열 자동 분석 장치 등을 사용한다.
결정한 염기배열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 배열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 각각 확인한다.
분비 시그널 배열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써, 분비 시그널 배열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그것들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열(문헌 [A. L. F. DNA, Us Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써 알아낼 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대해 BLAST법(문헌 [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]) 등의 상동성 검색을 행해, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규한 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해서, 연결 부분의 염기배열이 적절한 아미노산을 코딩하며, 적당한 제한 효소 인식 배열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다.
제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, 적당한 제한 효소의 인식 배열을 양단에 갖는 합성 DNA를 사용해서 PCR법에 의해 각각 증폭하여, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체 유래의 것이면, 어떠한 것이라도 사용할 수 있다.
예를 들어, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열(문헌 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]) 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해서, 원래의 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60％ 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하여, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을, 항체의 유전자의 염기배열에 나타나는 코돈의 사용 빈도(문헌 [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)])를 고려하여 DNA 배열로 변환하여, 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 배열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 배열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이를 포함하는 몇 개의 합성 DNA를 합성하고, 그것들을 사용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 H쇄, L쇄 모두 6개의 합성 DNA를 설계한다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 배열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터에 용이하게 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 수 있다.
또는, 설계한 DNA 배열에 기초하여, 1개의 DNA로서 합성된 각 H쇄, L쇄 전체 길이 합성 DNA를 사용함으로써 실시할 수 있다.
PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라테이진사 제조) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하여, (2)에 기재된 방법과 마찬가지의 방법에 의해, 염기배열을 결정하고, 원하는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 배열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간형 CDR 이식 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식하는 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다(문헌 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]).
인간형 CDR 이식 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하여, 그것들의 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해서, X선 결정 해석(문헌 [J. Mol. Biol., 112, 535(1977)]) 또는 컴퓨터 모델링(문헌 [Protein Engineering, 7, 1501(1994)]) 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대하여 수종의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하여 시행착오함으로써, 필요한 항원 결합 활성을 갖는 개변 인간형 CDR 이식 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대하여 (2)에 기재된 방법에 의해 염기배열을 결정하고, 원하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 배열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간형 CDR 이식 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그것들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 그것들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행해, 제작한 다종류의 인간형 CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포라도 사용할 수 있는데, 예를 들어 COS-7 세포(ATCC 번호: CRL1651)를 사용한다(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)]). COS-7 세포에 대한 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, (1991)]), 또는 리포펙션법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]) 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)], [단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등을 사용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 제조
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포에 대한 발현 벡터의 도입에는, 일렉트로포레이션법(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보, 문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]) 등을 사용한다. 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.
예를 들어, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스, Cat#11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NSO, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3-X63-Ag8653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로 엽산 환원 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)]), 렉틴 내성을 획득한 Lec13(문헌 [Somaticcell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)]), α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(ATCC 번호: CRL1662) 등을 사용한다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주는, G418 황산염 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보).
동물 세포 배양용 배지에는, RPMI1640 배지(인비트로젠사 제조), GIT 배지(일본제약사 제조), EX-CELL301 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(인비트로젠사 제조), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사 제조), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다.
얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, DHFR 증폭계(일본 특허 공개 (평)2-257891호 공보) 등을 이용하여 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 단백질 A-칼럼을 사용하여 정제한다(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]). 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(문헌 [Nature, 227, 680(1970)]), 또는 웨스턴 블로팅법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)], [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]) 등을 사용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가는, 이하와 같이 행할 수 있다.
BMP9 및 BMP9 발현 조직에 대한 결합 활성은, 상술한 1-(6-a)에 기재된 결합 검정 및 (6-b)에 기재된 비아코어 시스템 등을 사용한 표면 플라즈몬 공명법을 사용하여 측정한다. 또한, 형광 항체법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]) 등을 사용하여 측정할 수 있다.
4. 본 발명의 항BMP9 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, BMP9가 관여하는 빈혈을 수반하는 질환의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 해당 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에서 공지된 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.
투여 경로로서는, 예를 들어 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등을 들 수 있다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 제조물은 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유(sesame oil), 올리브유 또는 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.
비 경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 주사제, 좌제 또는 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는, 염 용액, 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용하여 제조한다.
좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않으며, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜서 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 담체로서는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다.
또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 사용하는 시약류는, 특별히 기재가 없는 한, 첨부 문서에 따라 사용하는 것으로 한다.
실시예
[실시예 1]
마우스 BMP9 유전자 녹아웃용 타겟팅 벡터의 구축
1-1) 카세트 벡터 pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A의 구축
녹아웃(KO)용 타겟팅 벡터를 제작하기 위한 기본 벡터가 되는 카세트 벡터 pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A는, pBluescript에 제한 효소 사이트를 부가한 후, 네오마이신 내성 마커 유전자 발현 유닛의 양단에 LoxP 배열을 갖는 LoxP-Neo 및 디프테리아독소 A쇄 유전자(DT-A)를 삽입한 벡터로, 국제 공개 제2006/078072호 공보의 실시예 7에서 기재한 벡터와 동일하다. 이하에, 당해 벡터 제작의 개략을 기재한다.
pBluescript II SK(-) (도요보사 제조) 벡터에 새로운 제한 효소 사이트를 부가하기 위하여 이하의 올리고 DNA(LinkA1: 서열 번호 1, LinkA2: 서열 번호 2, LinkB1: 서열 번호 3, 및 LinkB2: 서열 번호 4)를 합성하였다.
pBluescript II SK(-)를 제한 효소 SalI 및 XhoI로 처리하여, 반응액으로부터 플라스미드 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 이 플라스미드 단편에, 새로운 제한 효소 사이트, NruI, SgrAI 및 AscI를 부가하기 위해서, LinkA1 및 LinkA2를 포함하는 링커를 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 플라스미드 pBlueLA를 취득하였다.
pBlueLA를 제한 효소 NotI 및 EcoRI로 처리하여, 반응액으로부터 플라스미드 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 이 플라스미드 단편에 새로운 제한 효소 사이트, PacI, FseI 및 SalI를 부가하기 위해서, LinkB1 및 LinkB2를 포함하는 링커를 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 플라스미드 pBlueLAB를 취득하였다.
국제 공개 제00/10383호에 기재된 플라스미드 pLoxP-STneo를 XhoI로 효소 소화하고, 양단에 LoxP 배열을 갖는 Neo 내성 유전자(LoxP-Neo)를 취득하였다. T4DNA 폴리메라제를 사용해서 LoxP-Neo의 양쪽 말단을 평활화하여 LoxP-Neo-B를 취득하였다.
pBlueLAB를 EcoRV로 효소 소화하고, 반응액으로부터 플라스미드 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 얻어진 플라스미드 단편에, LoxP-Neo-B를 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 플라스미드 pBlueLAB-LoxP-Neo를 취득하였다.
pMC1DT-A(라이프테크 오리엔탈사 제조)를 XhoI 및 SalI로 효소 소화한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(퀴아젠사 제조)를 사용하여 DT-A 유전자를 포함하는 단편을 회수하였다.
pBlueLAB-LoxP-Neo를 XhoI로 효소 소화하고, 반응액으로부터 플라스미드 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 얻어진 플라스미드 단편에, DT-A 유전자를 포함하는 단편을 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 카세트 벡터 pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A를 취득하였다.
1-2) 마우스 BMP9 유전자 3'측 게놈 영역 단편의 취득
앙상블 게놈 브라우저(Ensemble Genome Browser)로부터 취득한 마우스 BMP9(GDF2) 유전자를 포함하는 게놈 DNA 배열(액세션 번호: ENSMUSG00000072625)로부터 프라이머(서열 번호 5, 6)를 설계하였다.
대장균 인공 염색체[Bacterial Artificial Chromosome(BAC)] 중 C57BL/6J 마우스 BMP9 유전자를 포함하는 클론 RP23-181N8 유래의 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 5 및 6의 프라이머를 각 10pmol, KOD-plus-(도요보사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하여, 94℃에서 3분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 및 68℃에서 5분간을 1 사이클로 하여 35 사이클 PCR을 행하였다.
얻어진 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 2.1kbp의 단편을 회수하였다. 회수한 PCR 증폭 단편을 ClaI 및 AscI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 효소 처리 단편(ClaI-AscI 단편)을 회수하였다.
pBlueLAB를 ClaI 및 AscI로 효소 소화하고, 쉬림프 알칼리성 포스파타제(Shrimp Alkaline Phosphatase(SAP)) 처리한 후, 이 ClaI-AscI 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 상기에서 회수한 ClaI-AscI 단편을 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다.
얻어진 형질 전환체로부터, PCR에 기인하는 변이가 없는 삽입 유전자를 갖는 클론을 선택하였다. 이 플라스미드 DNA를 ClaI 및 AscI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 2.1kbp의 마우스 BMP9 유전자의 3'측 게놈 배열을 포함하는 효소 처리 단편을 회수하였다.
1-3) 마우스 BMP9 유전자 5'측 게놈 영역 단편의 취득
앙상블 게놈 브라우저로부터 취득한 마우스 BMP9 유전자를 포함하는 게놈 DNA 배열(액세션 번호: ENSMUSG00000072625)로부터 프라이머(서열 번호 7, 8)를 설계하였다.
BAC 클론 RP23-181N8 유래의 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 7 및 8의 프라이머를 각 10pmol, KOD-plus-(도요보사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하여, 94℃에서 3분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 및 68℃에서 5분간을 1 사이클로 하여 35 사이클 PCR을 행하였다.
얻어진 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 5.1kbp의 단편을 회수하였다. 회수한 PCR 증폭 단편을 PacI 및 FseI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 효소 처리 단편(PacI-FseI 단편)을 회수하였다.
pBlueLAB를 PacI 및 FseI로 효소 소화하여 SAP 처리한 후, 이 PacI-FseI 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. 상기에서 회수한 PacI-FseI 단편을 삽입하여, 대장균 DH5α에 도입하였다.
얻어진 형질 전환체로부터, PCR에 기인하는 변이가 없는 삽입 유전자를 갖는 클론을 선택하였다. 이 플라스미드 DNA를 PacI 및 FseI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 5.1kbp의 마우스 BMP9 유전자의 5'측 게놈 배열을 포함하는 효소 처리 단편을 회수하였다.
1-4) 카세트 벡터에 대한 마우스 BMP9 유전자 3'측 게놈 영역 단편의 삽입
실시예 1-1에서 얻어진 pBlueLAB-Lox-Neo-DT-A를 ClaI 및 AscI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 약 7.6kbp의 DNA 단편에, 실시예 1-2에서 얻어진 효소 처리 단편을 삽입한 후, 대장균 DH5α에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 DNA 단편이 삽입되어 있는 클론을 선택하였다. 연결 부분의 염기배열에 문제가 없음을 확인하였다.
1-5) 마우스 BMP9 유전자 3'측 게놈 영역 단편을 갖는 카세트 벡터에 대한 마우스 BMP9 유전자 5'측 게놈 영역 단편의 삽입
실시예 1-4에서 얻어진 플라스미드를 PacI 및 FseI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 효소 처리 단편을 회수하였다. 회수한 9.7kbp의 DNA 단편에, 실시예 1-3에서 제작한 효소 처리 단편을 삽입한 후, 대장균 DH5α에 도입하였다.
얻어진 형질 전환체로부터 DNA 단편이 삽입되어 있는 클론을 선택하였다. 연결 부분의 염기배열에 문제가 없음을 확인하고, 마우스 BMP9 유전자 녹아웃용의 타겟팅 벡터 pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO(도 1)를 취득하였다.
[실시예 2]
마우스 BMP9 유전자 타겟팅 벡터의 제조
실시예 1-5에서 얻어진 pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO 60μg을, 최종 농도가 1mmol/L가 되도록 스페르미딘(시그마사 제조)을 첨가하고, pH를 7.0으로 제조한, 제한 효소용 H버퍼(로슈·다이아그노스틱스사 제조) 중에서, NotI로 효소 소화하였다.
반응액으로부터, 벡터 단편을 페놀/클로로포름 추출하고, 에탄올 침전하였다. DNA 농도가 0.5μg/μL가 되도록, pH 7.05의 HBS 용액[1리터당, HEPES 5g, NaCl 8g, KCl 0.37g, Na2HPO4·2H2O 0.125g, 덱스트로오스(D-글루코오스) 1g을 포함하는 용액]을 첨가하여, 1시간 실온에서 보존함으로써, 일렉트로포레이션용 마우스 BMP9 유전자 타겟팅용 벡터 pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO-NotI를 제조하였다.
[실시예 3]
게놈 서던 블롯 해석용 프로브의 제조
3-1) 마우스 BMP9 유전자의 5'측 게놈 확인용 프로브의 제작
BAC 클론 RP23-181N8의 염기배열 정보를 기초로, 마우스 BMP9 유전자의 5'측 게놈 영역 약 500bp를 포함하는 프로브를 취득하기 위해서, 프라이머(서열 번호 9, 10)를 설계하였다.
BAC 클론 RP23-181N8 유래의 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 9 및 10의 프라이머를 각 10pmol, TaKaRa Z Taq(다까라주조사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하여, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 20초간, 및 72℃에서 1분간을 1 사이클로 하여 25 사이클 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 약 500bp의 5'측 게놈 서던 블롯용 프로브(5'KO-probe)를 회수하였다.
3-2) 마우스 BMP9 유전자의 3'측 게놈 확인용 프로브의 제작
BAC 클론 RP23-181N8의 염기배열 정보를 기초로, 마우스 BMP9 유전자의 3'측 게놈 영역 약 500bp를 포함하는 프로브를 취득하기 위해서, 프라이머(서열 번호 11, 12)를 설계하였다.
BAC 클론 RP23-181N8 유래의 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 11 및 12의 프라이머를 각 10pmol, TaKaRa Z Taq(다까라주조사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하여, 94℃에서 2분간 보온한 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 20초간, 및 72℃에서 1분간을 1 사이클로 하여 25 사이클 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 약 500bp의 3'측 게놈 서던 블롯용 프로브(3'KO-probe)를 회수하였다.
[실시예 4]
마우스 BMP9 KO ES 세포주의 취득
상동 재조합을 사용한 마우스 BMP9 유전자 KO ES 세포의 취득을 위해, 확립되어 있는 방법(문헌 [아이자와 신이치 저, 바이오 매뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 요도사, 1995])에 따라, 실시예 2에서 제조한 pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO-NotI를 마우스 ES 세포 TT2(문헌 [Yagi 등, Analytical Biochem., 214: 70, 1993])에 도입하였다. 상세한 방법을 이하에 기재한다.
영양 세포로서 마이토마이신 C(시그마사 제조)로 처리한 G418 내성 초대 배양 세포(인비트로젠사 제조)를 사용하여 TT2 세포의 배양 증식을 37℃, 5％ CO2의 조건 하에 행하였다. TT2 세포를 트립신 처리하고, 3×107개/mL가 되도록 실시예 2에 기재한 HBS 용액으로 현탁하였다. 세포 현탁액을 0.5mL와, pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO-NotI를 10μg 혼화하여, 진 펄서 큐벳(전극 거리: 0.4cm, 바이오래드사 제조)에 넣고, 일렉트로포레이션을 행했다(용량: 960μF, 전압: 240V, 실온).
일렉트로포레이션한 세포를, ES 배지[1리터당, 소 태자 혈청(FBS) 180mL, D-글루코오스 3.5g, 둘베코 개변 이글 배지 분말(인비트로젠사 제조) 10g, 비필수 아미노산 용액(100배 농축액; 인비트로젠사 제조) 10mL, 탄산수소나트륨 1.9g을 포함하는 용액] 10mL에 현탁하고, 미리 상술한 영양 세포를 파종한 100mm 조직배양용 플라스틱 샤알레(팔콘사 제조) 1장에 파종하였다. 24시간 후, 배지를 200μg/mL의 네오마이신(시그마사 제조)을 포함하는 ES 배지로 치환하였다. 7일 후에 발생한 콜로니를 픽업하여, 각각 24 구멍 플레이트에 파종하였다.
컨플루언트될 때까지 증식시킨 후, 3분의 1의 세포를 12 구멍 젤라틴 코트 플레이트에 파종하여 2일간 배양함으로써, 106 내지 107개의 세포로부터 게놈 DNA를 퓨어진(Puregene) DNA 단리 키트(Isolation Kits)(젠트라 시스템(Gentra System)사 제조)로 제조하였다. 이들 네오마이신 내성 TT2 세포 게놈 DNA를 EcoRI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하였다. 이어서, 실시예 3-2에서 얻은 3'KO-probe를 사용한 서던 블롯을 행하였다. 야생형 TT2 세포에서는, 1개의 밴드(약 15.5kbp)가 검출되고, 상동 재조합체에서는, 2개의 밴드(약 11.5kbp와 약 15.5kbp)가 검출되었다.
또한, 상동 재조합이 확인된 클론의 게놈 DNA를 NcoI로 효소 소화하여, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하였다. 이어서, 실시예 3-1에서 얻은 5'KO-probe를 사용한 서던 블롯을 행하였다. 야생형 TT2 세포에서는, 1개의 밴드(약 13.4kbp)가 검출되고, 상동 재조합체에서는, 2개의 밴드(약 8.5kbp와 약 13.4kbp)가 검출되었다.
이상의 결과, 마우스 BMP9 유전자를 탈락한 것이 예상되는 상동 재조합체는 7주 발견되었다. 이어서, 상동 재조합체의 핵형 해석을 기보(문헌 [아이자와 신이치 저, 바이오 매뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 요도사, 1995])에 따라 행한 결과, 발견된 7주 중 5주는 정상 핵형을 갖는 마우스 BMP9 유전자 KO ES 세포인 것이 확인되었다.
[실시예 5]
BMP9 KO 헤테로 접합형 마우스의 제작
실시예 4에서 취득한 ES 세포는, 털색이 짙은 갈색 CBA×C57BL/6 F1 마우스 유래(문헌 [Yagi 등, Analytical Biochemistry, 214: 70-76, 1993])의 TT2 세포이다. 따라서, ES 세포 유래의 유전자를 갖는 키메라 마우스와, ES 세포 유래의 유전자를 갖지 않는 숙주 마우스를 간편하게 판별하기 위해서, 숙주 마우스에는, 털색이 백색인 ICR 마우스를 선택하였다.
먼저, 실시예 4에서 정상 핵형을 갖는 것을 확인할 수 있었던 마우스 BMP9 유전자 KO ES 세포 중 4주를, ICR 계통의 자웅 마우스의 교배에 의해 얻어진 8 세포기 배에, 각각 배 1개당 8 내지 10개 주입하였다. 그 후, ES 배지를 사용하여 밤새 배양함으로써, 인젝션 배를 배반포까지 발생시킨 후, 위장 임신 처리 후 2.5일의 가친 ICR 마우스(일본 크레어 사)의 자궁에, 편측의 자궁당 각각 약 10개의 배반포까지 발생시킨 인젝션 배를 이식하였다.
배반포까지 발생시킨 인젝션 배를 총 260개 이식한 결과, 102마리의 자(子) 키메라 마우스가 탄생하였다. 탄생한 102마리 중 털색이 짙은 갈색을 포함하는 마우스, 즉 ES 세포의 공헌이 인정된 키메라 마우스는 89마리이었다. 이들 89마리 중, 털색이 모두 짙은 갈색이고 백색 부분을 포함하지 않는 마우스, 즉 ES 세포 유래의 키메라율이 높은 키메라 마우스는 40마리이었다.
이어서, 이들 키메라율이 높은 수컷의 키메라 마우스를 C57BL/6의 암컷과 교배시킨 결과, 털색이 짙은 갈색인 자(子) 마우스가 탄생한 점에서, ES 세포 게놈의 생식세포 계열로의 전달이 확인되었다.
BMP9 유전자가 타겟팅된 헤테로 접합형 마우스의 스크리닝은, 꼬리부 생검 유래 DNA를 주형으로 한 PCR 해석에 의해 행하였다. 그 때문에, 실시예 1에서 제작한 마우스 BMP9 유전자 녹아웃용 벡터 pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3'KO-5'KO 내의 네오마이신 내성 유전자 영역에 특이적인 프라이머인 mBMP9_FW5915(서열 번호 13) 및 mBMP9_RV17165(서열 번호 14)를 제작하였다.
출생 후 3주 이상을 경과한 마우스로부터 꼬리를 취득하여(문헌 [가쓰키 모토야 저, 발생 공학 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽, 1987]), 퓨어진 DNA 단리 키트를 사용해서 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 13 및 14의 프라이머를 각 10pmol, EX Taq(다까라주조사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하여, 95℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 및 72℃에서 2분간을 1 사이클로 하여 35 사이클 PCR을 행하였다.
아가로오스 겔 전기 영동을 행한 결과, 약 1.3kbp의 증폭 산물이 검출되는 개체가 복수 존재하였다. 이 결과는, 내재성 BMP9 유전자가 상동 재조합되어, 네오마이신 내성 유전자가 삽입된 헤테로 접합형 마우스[BMP9KO(+/-)]가 복수 얻어진 것을 나타내고 있다.
[실시예 6]
BMP9KO 호모 접합형 마우스의 제작
실시예 5에서 제작된 BMP9KO(+/-)의 자웅 개체를 교배시켜, 자 마우스를 얻었다. 실시예 5와 마찬가지로, 마우스의 꼬리로부터 퓨어진 DNA 단리 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 해서, 실시예 5와 마찬가지로 PCR을 행하였다. 또한, 아가로오스 전기 영동을 행함으로써, BMP9KO 헤테로 접합형[BMP9KO(+/-)]과 호모 접합형[BMP9KO(-/-)]을 선발하였다.
선발한 개체의 게놈 DNA를 주형으로 해서, 서열 번호 15 및 16의 프라이머를 각 10pmol, Ex Taq(다까라주조사 제조)를 포함하는 50μL의 반응액을 제조하고, 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 및 72℃에서 1분간을 1 사이클로 하여 35 사이클 PCR을 행하였다. 아가로오스 겔 전기 영동을 행한 결과, 약 200bp의 증폭 산물이 검출되는 개체, 및 검출되지 않은 개체가 존재하는 것이 명확해졌다.
야생형 대립 유전자를 갖는 BMP9KO(+/-)에서는 약 200bp의 증폭 산물이 검출되지만, BMP9KO(-/-)에서는 검출되지 않는 점에서, 이 결과는, BMP9KO(-/-)가 얻어진 것을 나타내고 있다. 항BMP9 모노클로날 항체 취득에는, 얻어진 자웅의 호모 접합형[BMP9KO(-/-)] 중, 암컷 마우스를 10마리 사용하였다.
[실시예 7]
항 인간 BMP9 모노클로날 항체의 제작
7-1) 면역원의 제조
면역원으로서 사용한 인간 BMP9 재조합 단백질은, 국제 공개 제2010/126169호의 실시예 12에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
7-2) 동물에 대한 면역과 항체 산생 세포의 제조
아쥬반트에, RIBI 아쥬반트(코릭사(Corixa)사 제조), 또는 티터 맥스 골드(Titer Max Gold)(티터맥스(Titermax)사 제조)를 사용하여, 실시예 7-1에서 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질을, 실시예 6에서 얻어진 BMP9 KO(-/-)마우스에 면역하였다. 구체적으로는, RIBI 아쥬반트의 첨부 문서에 따라, 인간 BMP9 재조합 단백질의 현탁액을 제조한 후, 1마리 25μg의 인간 BMP9 재조합 단백질이 투여되도록, 해당 현탁액을 KO 마우스의 복강 내에 투여하였다.
티터 맥스 골드를 사용할 때도 마찬가지로, 첨부문서에 따라, 인간 BMP9 재조합 단백질의 현탁액을 제조한 후, 1마리당 25μg의 인간 BMP9 재조합 단백질이 투여되도록, 해당 현탁액을 KO 마우스의 피하에 투여하였다. 면역은 최종 부스트를 포함하여 모두 총 3회 행하였다. 비장은, 최종 투여 3일 후에 적출하였다.
적출한 비장을 PBS(포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline)) 중에서 세단한 후, 비세포를 원심 분리(1500rpm, 3분간)에 의해 회수하였다. 얻어진 비세포 획분은 적혈구를 포함하므로, 레드 블러드 셀 라이싱 버퍼(RED Blood Cell Lysing Buffer)(시그마사 제조)를 첨가하여, 빙상에서 처리함으로써 적혈구를 제거하였다. 얻어진 비세포는, DMEM(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium); 인비트로젠사 제조) 배지에서 2회 세정한 후, 세포 융합에 제공하였다.
7-3) 마우스 골수종 세포의 제조
마우스 골수종 세포주(Sp2/0, ATCC: CRL1581)를 10％ 소 태아 혈청 첨가 DMEM에서 배양하여, 세포융합의 친주로서 사용하였다.
7-4) 하이브리도마의 제작
실시예 7-2에서 얻어진 마우스 비세포와 실시예 7-3에서 얻어진 골수종 세포를 5:1이 되도록 혼합하여, 원심 분리(1500rpm, 3분간)하였다. 얻어진 침전 획분(세포군)에 대하여 폴리에틸렌글리콜-1500(로슈·다이아그노스틱스사 제조) 1mL를, 천천히 흔들면서 서서히 첨가하였다. 이어서, 해당 세포액에 DMEM 배지 5mL를 천천히 흔들면서 첨가하고, 또한 DMEM 배지를 10mL 첨가하였다. 이어서, 상기 해당 세포액을 포함하는 튜브를 37℃에서 5분간 인큐베이팅하여, 원심 분리(1500rpm, 3분간)하였다.
얻어진 침전 획분(세포군)을 컴플리트 배지(FCS 10V/v％, β-머캅토에탄올 50㎛ol/L, 인슐린 50μg/mL, 및 IL-6 10ng/mL를 포함하는 DMEM 배지]를 사용하여 비세포 수가 1×106개/mL가 되도록 현탁한 후, 96웰 플레이트에 100μL씩 파종하였다.
그 1.5시간 후, 메이커가 권장하는 최종 농도의 2배의 HAT 메디아 서플리멘트(media supplement)(시그마사 제조, Cat#H0262-10VL)를 포함하는 컴플리트 배지를 각 웰에 100μL씩 첨가하여, 37℃, 5％ CO2의 조건 하에서 배양하였다. 배지 교환은, 웰 내의 세포가 스크리닝에 적합한 세포 수로 될 때까지, 메이커가 권장하는 최종 농도의 HAT 메디아 서플리멘트를 포함하는 컴플리트 배지를 사용하여 주 3회의 빈도로 행하였다.
7-5) ALK1/BMP9 샌드위치 ELISA의 구축
ALK1/BMP9 샌드위치 ELISA는, 항 인간 BMP9 마우스 모노클로날 항체(R&D 시스템즈사 제조, 클론 No.360107, 이하 R&D 항체라고 기재), 및 인간 BMP9의 타입 I수용체로서 알려져 있는 인간 ALK1 세포외 영역 인간 IgG1 Fc 영역 퓨전 단백질(hsALK1-Fc)을 사용하여, 이하와 같이 구축하였다.
먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사 제조, Cat#439454)에, 국제 공개 제2010/126169호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조한 hsALK1-Fc를, 50mmol/L NaHCO3 완충액(와코(Wako)사 제조, Cat#191-01305)으로 0.05μg/mL로 제조한 것을 100μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.
고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록(SuperBlock)(써모 사이언티픽(Thermo SCIENTIFIC)사 제조, Cat#37535)을 250μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, 0.1％의 트윈(Tween)-20을 포함하는 PBS(PBS-T)로 3회 세정하였다.
이어서, 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조 Cat#3209-BP)을 슈퍼 블록과 PBS-T를 1:9의 비율로 혼합한 PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록(10％ SuperBlock in PBS-T)으로 1ng/mL의 농도로 제조한 것을 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하고, PBS-T로 4회 세정하였다.
이어서, 슈어링크 크로모포릭 비오틴 라벨링 키트(SureLINK Chromophoric Biotin Labeling Kit)(KPL사 제조)를 사용하여 비오틴 표식한 R&D 항체를 PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록로 30ng/mL로 제조한 후, 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정한 후, PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록로 500배 희석한 Streptavidin-polyHRP80(스테레오스페서픽 디텍션(Stereospecific Detection) 테크놀로지스사 제조, Cat#SP80D50)을 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 30분 내지 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정하고, TMB 발색액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코(Dako)사 제조, Cat#S1599)을 100μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 100μL/웰 첨가하여, ARVO(퍼킨엘머사 제조)를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정하였다.
7-6) ALK1/BMP9 샌드위치 ELISA를 사용한 항 인간 BMP9 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝
실시예 7-5에서 구축한 샌드위치 ELISA에 있어서, 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질의 첨가 시에, 1ng/mL 농도의 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질, 및 50％ 농도의 실시예 7-4에서 제작한 하이브리도마의 배양 상청을 포함하도록 제조한 PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록 용액을, 100μL/웰로 분주하였다.
음성 컨트롤에는, 하이브리도마용 배지를 사용하였다. 하이브리도마용 배지를 첨가한 웰을 기준으로 하여, 발색이 억제된 웰을 양성이라 판단하고, hsALK1-Fc와 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질, 또는 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질과 R&D 항체의 상호 작용을 저해하는 항체를 산생하는 하이브리도마주를 선발하였다.
선발한 하이브리도마에 대해서는, HT(시그마사 제조, Cat#H0137-10VL)를 포함하는 컴플리트 배지에서 한계 희석하고, 96웰 플레이트에 파종해서 클론화를 행하였다. 클론화는, 1회째에 양성이라고 판단한 웰 유래의 하이브리도마에 대하여 총 3회 행하였다. 이상의 조작에 의해, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 3B7-3-3 항체를 산생하는 하이브리도마주를 단리하였다.
7-7) 하이브리도마의 eRDF 배지로의 순화
항체를 대량 취득하기 위해서, 하이브리도마의 배지를 컴플리트 배지로부터 eRDF 배지[Ultra-Low IgG FBS(GIBCO사 제조) 1v/v％, 트랜스펠린(Transfelin) 5μg/mL, 인슐린 5μg/mL, 에탄올아민 10㎛ol/L, 및 소듐 셀레나이트(Sodium Selenite) 25nmol/L를 포함하는 e-RDF 배지(극동제약 제조)]로 단계적으로 치환하여, 하이브리도마 세포의 eRDF 배지로의 순화를 행하였다.
7-8) 하이브리도마로부터의 항체의 대량 취득
실시예 7-8에서 순화한 하이브리도마를, 세포 밀도 1 내지 2×105cells/mL로 롤러 보틀(850cm2, BD 사이언스사 제조) 100개에 파종하였다. 배지에는 eRDF 배지를 사용하였다. 파종한 롤러 보틀을 롤러 보틀 회전 배양기로 회전시키면서, 37℃에서 6-8일간 배양한 후, 세포를 포함하는 배지를 회수하였다. 회수한 배지를 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터에 의해 여과하였다.
필터로 여과한 배양 상청으로부터, 프로테인 세파로오스 4 패스트 플로우(Protein Sepharose 4 Fast Flow)(GE 헬스케어사 제조)를 충전한 오픈 칼럼을 사용하여, 항 인간 BMP9 항체를 정제하였다. 얻어진 항체는, 0.22㎛ 필터를 사용하여 멸균한 후, 생체 내 시험에 제공하였다.
[실시예 8]
고상 항원을 사용한 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)에 의한 취득 항체의 특이성의 평가
취득한 항체의 인간 BMP9에 대한 특이성을 확인하기 위해서, 인간 BMP9 및 인간 BMP9와 호몰로지가 가장 높은 분자인 인간 BMP10에 대한 결합성을 비교하는 실험을 행하였다. 먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#442404)에, 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#3209-BP), 또는 인간 성숙 2량체 BMP10 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#2926-BP)을 50mmol/L NaHCO3 완충액(와코사 제조, Cat#191-01305)으로 100ng/mL로 제조한 것을 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.
고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록(써모 사이언티픽사 제조, Cat#37535)을 200μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, TBST(Tris Buffered Saline with Tween 20; 산타 크루즈(SANTA CRUZ)사 제조, SC-24953)로 3회 세정하였다.
이어서, 비오틴 라벨링 키트(Biotin Labeling Kit)-NH2(코스모·바이오사 제조, Cat#LK03)를 사용하여 비오틴 표식한 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체, 3B7-3-3 항체, R&D 항체, 또는 항BMP10 항체(R&D 시스템즈사 제조, Cat#MAB2926)를 슈퍼 블록과 TBST를 1:9의 비율로 혼합한 TBST 중 10％ 슈퍼블록로 100ng/mL로 제조한 후, 1차 항체로서 50μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 3회 세정한 후, TBST 중 10％ 슈퍼블록로 500배 희석한 Streptavidin-polyHRP80(스테레오스페서픽 디텍션 테크놀로지스사 제조, Cat#SP80D50)을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 5회 세정하고, TMB 기질액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 50μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 50μL/웰 첨가하고, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에서의 흡광도(450nm-570nm)를, 플레이트 리더(스펙트라 맥스(Spectra Max), 몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices)사 제조)를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 2에 기재한다. 도 2에 도시한 바와 같이, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 3B7-3-3 항체는, R&D 항체와 마찬가지로, 인간 BMP9에 강하게 결합하는 것, 또한 인간 BMP10에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 이 결과는, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 3B7-3-3 항체가, 인간 BMP9에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 나타내고 있다.
[실시예 9]
취득 항체의 인간 BMP9 재조합 단백질에 대한 결합성의 평가
취득된 항 인간 BMP9 항체의 인간 BMP9에 대한 결합 활성을 측정하기 위해서, 이하의 실험을 행하였다.
먼저, 96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#439454)에, 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#3209-BP)을 50mmol/L NaHCO3 완충액으로 100ng/mL로 제조한 것을 50μL/웰로 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.
고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록(써모 사이언티픽사 제조, Cat#37535)을 200μL/웰로 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, TBST로 3회 세정하였다. 이어서, 비오틴 표식한 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체, 3B7-3-3 항체 또는 R&D 항체를, TBST 중 10％ 슈퍼블록로 각각 1, 5, 20, 100, 300ng/mL가 되도록 제조한 것을, 각각 50μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 3회 세정한 후, TBST 중 10％ 슈퍼블록(10％ Super Block in TBST)으로 500배 희석한 Streptavidin-polyHRP80을 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 5회 세정하고, TMB기질액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 50μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 50μL/웰 첨가하여, 샘플 파장 450nm, 레퍼런스 파장 570nm에서의 흡광도(450nm-570nm)를, 플레이트 리더(스펙트라 맥스, 몰레큘러 디바이시스사 제조)를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 3에 기재한다. 도 3에 도시한 바와 같이, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 3B7-3-3 항체는, R&D 항체와 마찬가지로, 항체 농도가 높아짐에 따라서 인간 BMP9에 결합하였다. 또한 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 인간 BMP9에 대한 결합 활성은 R&D 항체에 비해 높은 것이 명확해졌다.
[실시예 10]
인간 BMP9와 R&D 항체의 결합에 대한 취득 항체의 작용
실시예 7에서 사용한 계의 특징으로부터, 취득 항체는 hsALK1-Fc와 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질의 상호 작용, 또는 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질과 R&D 항체의 상호 작용 중 어느 하나를 저해하는 항체라고 생각된다. 따라서, 먼저, 인간 BMP9와 R&D 항체의 결합 분석계를 구축하였다.
96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#439454)에, 실시예 7-1에서 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질을 50mmol/L NaHCO3 완충액으로 100ng/mL로 제조한 것을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하여 흡착시켰다. 고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록을 250μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 정치해서 블로킹하고, PBS-T로 3회 세정하였다.
이어서, PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록으로 각각 100 내지 3000ng/mL로 제조한 취득 항체 및 50ng/mL의 비오틴 표식한 R&D 항체를 포함하는 용액을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정한 후, PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록으로 500배 희석한 Streptavidin-polyHRP80(스테레오스페서픽 디텍션 테크놀로지스사 제조, Cat#SP80D50)을 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 30분 내지 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정하고, TMB 발색액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 100μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 100μL/웰 첨가하여, ARVO(퍼킨엘머사 제조)를 사용하여 450nm의 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 4에 기재한다.
도 4에 도시한 바와 같이, 인간 BMP9와 비오틴 표식 R&D 항체의 결합은, 비표식의 R&D 항체의 첨가로 저해되고, 10D5-2-3 항체 또는 6D10-1-1 항체의 첨가로도 저해되었다. 한편, 3B7-3-3 항체에서는 저해는 인정되지 않았다.
이 결과는, 10D5-2-3 항체 및 6D10-1-1 항체의 인간 BMP9 인식 부위(에피토프)는, R&D 항체의 인식 부위와 동일하거나, 또는 그 근방이며, 3B7-3-3 항체의 인간 BMP9 인식 부위(에피토프)는, R&D 항체의 인식 부위와는 상이한 것을 시사하고 있다.
또한 저해 활성이 R&D 항체에 비해서 보다 저농도로부터 인정됨으로써, 10D5-2-3 항체 및 6D10-1-1 항체의 인간 BMP9에 대한 결합 활성(어피니티)은 R&D 항체에 비해 높은 것이 명확해졌다.
[실시예 11]
인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합에 대한 취득 항체의 작용
이어서, 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합 분석계를 구축하였다.
96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#439454)에, 실시예 7-1에서 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질을 50mmol/L NaHCO3 완충액으로 100ng/mL로 희석한 것을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하여 흡착시켰다.
고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록을 250μL/웰로 첨가하여, 실온에서 1시간 정치해서 블로킹하고, PBS-T로 3회 세정하였다. 이어서, PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록으로 각각 100, 1000 또는 10000ng/mL로 제조한 취득 항체 또는 R&D 항체, 및 100ng/mL의 비오틴 표식한 hsALK1-Fc 단백질을 포함하는 용액을 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정한 후, PBS-T 중 10％ 슈퍼 블록으로 500배 희석한 Streptavidin-polyHRP80(스테레오스페서픽 디텍션 테크놀로지스사 제조, Cat#SP80D50)을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 30분 내지 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 PBS-T로 4회 세정하고, TMB 발색액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 100μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 100μL/웰 첨가하여, ARVO(퍼킨엘머사 제조)를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정하였다.
100, 1000 또는 10000ng/mL 농도의 3B7-3-3 항체는, 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합을 각각 10.3％, 29.2％, 64％로 저해한 것에 반해, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체는, 최고 용량인 10000ng/mL 농도의 첨가로도 저해하지 않았다.
이상의 결과로부터, 3B7-3-3 항체는 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합을 저해하는 항BMP9 항체인 것에 반해, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체는, 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합을 저해하지 않는 항BMP9 항체인 것이 명확해졌다.
[실시예 12]
인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합에 대한 취득 항체의 작용
BMP9의 수용체는 BMP 타입 I 수용체와 BMP 타입 II 수용체로 구성되며, BMP9는 그것들 양쪽 타입의 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다. 실시예 11로부터, 10D5-2-3 항체, 6D10-1-1 항체 및 R&D 항체는, 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합을 저해하지 않는 것이 명확해졌고, 이 항체는, BMP9와 BMP 타입 I 수용체의 결합을 저해하지 않는 것으로 시사되었다.
이어서, 이 항체가 BMP9와 BMP 타입 II 수용체의 결합을 저해하는지 검토하기 위해서, 인간 BMP9와 인간 BMP9 타입 II 수용체의 하나인 것으로 알려져 있는 인간 BMPRII와의 결합 검증계를 구축하였다.
96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#439454)에 실시예 7-1에서 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질을 50mmol/L NaHCO3 완충액으로 3μg/mL로 제조한 것을, 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하여 흡착시켰다. 고상화 액을 제거한 후, 슈퍼 블록을 260μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 정치해서 블로킹하고, TBST로 4회 세정하였다.
이어서, TBST 중 10％ 슈퍼블록로 1000ng/mL로 제조한 취득 항체, R&D 항체 또는 음성 대조 마우스 IgG1 모노클로날 항체(다코사 제조, X0931) 및 3μg/mL로 제조한 BMPRII-Fc(인간 BMPRII의 세포외 영역과 인간 IgG1Fc 영역의 퓨전 재조합 단백질, R&D 시스템즈사 제조)를 포함하는 TBST 중 10％ 슈퍼블록 용액을 100μL/웰로 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 4회 세정한 후, TBST 중 10％ 슈퍼 블록으로 20000배 희석한 Goat anti-human IgG HRP(써모 사이언티픽사 제조)를 100μL/웰로 분주하여, 실온에서 30분 내지 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 TBST로 4회 세정하고, TMB 발색액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 100μL/웰 첨가하여 발색시키고, 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 100μL/웰 첨가하여, 멀티스캔 애선트(Multiskan Ascent)(써모 랩시스템즈(Thermo Labsystems)사 제조)를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 5에 기재한다.
도 5에 도시한 바와 같이, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합은, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체에 의해 저해된 점에서, 이 항체는, BMP9와 BMPRII 수용체의 결합을 저해하는 항 인간 BMP9 항체인 것이 명확해졌다.
[실시예 13]
취득 항체의 인간 BMP9 재조합 단백질에 대한 결합 활성(비아 코어 해석)
취득 항체의 인간 BMP9 재조합 단백질에 대한 결합 활성(어피니티)을 비아코어 2000(GE 헬스케어사 제조)을 사용하여 검토하였다. 마우스 항체 포획 키트(Mouse Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여, 항 마우스 IgG 항체를 센서 칩 CM5 상에 고정화한 후, 항 인간 BMP9 항체를 RU값으로서 700-1100이 되도록 결합시켰다.
그 후, 실시예 7-1에서 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질을 HBS-EP 용액(GE 헬스케어사 제조)을 사용하여 0.152nmol/L, 0.457nmol/L, 1.37nmol/L, 4.1nmol/L, 12.3nmol/L, 36.89nmol/L, 110.67nmol/L, 322nmol/L의 농도로 제조한 것을 아날라이트(analytes)로서 첨가하여, 결합 강도를 측정하였다.
결합 해리 상수(Kd값)는, 얻어진 값을 기초로 싱글 사이클 키네틱스 산출법(BIA이밸류에이션 소프트웨어 버전 3, GE 헬스케어사 제조)으로 산출하였다. 결과를 표 1에 기재한다.
Figure 112014126937119-pct00001
표 1에 나타낸 바와 같이, R&D 항체의 Kd값은 6.16×10-10mol/L이었던 것에 반해, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체의 Kd값은 각각 2.97×10-11mol/L, 9.69×10-12mol/L를 나타내고, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 인간 BMP9에 대한 결합 활성은, R&D 항체에 비해, 20.7배, 63.6배로 현저하게 높은 것임이 명확해졌다. 또한, 이상의 결과는, 실시예 9 및 10의 결과와 모순되지 않는 것이었다.
[실시예 14]
정상 Balb/c 마우스의 적혈구 조혈에 대한 취득 항체의 작용(단기 투여)
실시예 9에서 명확해진 바와 같이, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체는 인간 BMP9 성숙 2량체에 결합하는 항체이다. 서열 번호 67로 표시되는, 인간 BMP9의 성숙 영역 110 아미노산 중, 마우스 BMP9는 106 아미노산, 래트 BMP9는 104 아미노산이 완전 일치하는 점에서, BMP9는 종간의 보존성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 이 항체는, 설치류의 BMP9에 인간 BMP9와 마찬가지로 결합하는 것으로 추측된다.
따라서, BALB/c 마우스를 사용하여 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈에 대한 작용을 평가하였다. 6주령의 웅성 BALB/c 마우스(일본 찰스 리버사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 체중을 지표로 해서, 7군으로 나누어(각 군 n=6), 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체를 1mg/kg, 3mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다. 구체적으로는, 각각의 항체를 생리 식염수로 0.1mg/mL 또는 0.3mg/mL가 되도록 제조한 것을 10mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 10mL/kg의 용량으로 피하 투여하였다.
항체 또는 매체는, 주 1회의 빈도로 총 2회 투여하였다. 첫회 투여로부터 2주일 후, 이소플루란 마취 하에서 개복 후, 후대정맥으로부터 채혈을 행하고, EDTA가 들어 있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴사 제조)를 사용하여, 혈구수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 도 6a와 도 6b에 기재한다.
도 6a 및 도 6b에 도시한 바와 같이, 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도는, 어떠한 항 인간 BMP9 항체의 투여에 의해서든 증가하여, 항 인간 BMP9 항체에 적혈구 조혈 작용이 있는 것이 발견되었다. R&D 항체는, 투여량 1mg/kg과 3mg/kg 모두, 거의 동일 정도의 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도의 증가를 보인 점에서, R&D 항체의 최대 활성은 투여량 1mg/kg 이하인 것을 알았다. 또한, 최대 활성을 나타내는 투여량 1mg/kg에서의 헤모글로빈 농도의 증가는 약 0.7g/dL이었다.
한편, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체는, R&D 항체의 약 2배의 최대 활성을 나타내고, 특히 헤모글로빈 농도의 증가는 약 1.5-2g/dL 정도 인정되었다. 이상의 결과로부터, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체는, BMP9에 대한 결합 활성뿐만 아니라, 적혈구 조혈 작용에서도, R&D 항체를 능가하는 항체인 것으로 나타났다.
[실시예 15]
정상 BALB/c 마우스 적혈구 조혈에 대한 취득 항체의 작용(장기 투여)
BALB/c 마우스를 사용하여, 6D10-1-1체 및 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈에 대한 장기 투여의 효과를 검토하였다. 6주령의 웅성 BALB/c 마우스(일본 찰스 리버사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 체중을 지표로 해서, 3군으로 나누어(각 군 n=8), 고지방식(HFD-32; 일본 크레어사 제조)의 자유 섭취로 전환하였다. 이어서, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체를, 1mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다. 구체적으로는, 각각의 항체를 생리 식염수로 0.1mg/mL가 되도록 제조한 것을 10mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 10mL/kg의 용량으로 피하 투여하였다.
항체 또는 매체는, 주 1회의 빈도로 총 8회 투여하였다. 첫회 투여로부터 8주일 후, 이소플루란 마취 하에서 개복 후, 후대정맥으로부터 채혈을 행하고, 일부를 EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하고, 나머지를 혈청 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴사 제조)를 사용하여, 혈구 수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 도 7a와 도 7b에 기재한다.
도 7a 및 도 7b에 도시한 바와 같이, 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도는, 6D10-1-1 항체 또는 10D5-2-3 항체의 투여에 의해 유의미하게 증가하고, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체는, 단기뿐만 아니라, 장기 투여(2개월간 투여)에 의해서도, 지속적인 적혈구 조혈 작용을 나타내는 것이 확인되었다. 또한, 체중에 대한 영향은, 어느 항체든 모두 인정되지 않았다.
이어서, 항 인간 BMP9 항체의 적혈구 조혈 작용이, 적혈구 증가 인자인 혈중 에리트로포이에틴(EPO)을 통한 것인지 여부를 확인하기 위해서, 얻어진 혈청 샘플을 사용하여 혈중 EPO 농도를 측정하였다. 측정에는 퀀티카인 마우스/래트 에리트로포에틴(Quantikine Mouse/Rat Erythropoetin) ELISA킷(R&D 시스템즈사 제조)을 사용하였다. 결과를 도 8에 기재한다.
도 8에 도시한 바와 같이, 혈중 EPO 농도는, 항 인간 BMP9 항체 투여에 의해 감소 경향만으로, 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 항 인간 BMP9 항체의 적혈구 조혈 작용은 EPO 산생 상승을 통한 것이 아닐 가능성이 나타났다.
[실시예 16]
다양한 마우스 계통의 적혈구 조혈에 대한 항 인간 BMP9 항체의 작용
BALB/c 이외의 계통의 마우스를 사용하여, 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈에 대한 작용을 검토하였다. BALB/c 이외의 계통으로서, CBA/J 및 ICR 마우스를 사용하였다. 모두 7주령의 웅성 마우스(일본 찰스 리버사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 체중을 지표로 해서, 2군으로 나누어(각 군 n=6), 10D5-2-3 항체를, 1mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다. 구체적으로는, 생리 식염수로 0.1mg/mL가 되도록 제조한 10D5-2-3 항체를 10mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 10mL/kg의 용량으로 피하 투여하였다.
항체 또는 매체는, 주 1회의 빈도로 총 2회 투여하였다. 첫회 투여로부터 14일 후, 이소플루란 마취 하에서 개복 후, 후대정맥으로부터 채혈을 행하고, 일부를 EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하고, 나머지를 혈청 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴사 제조)를 사용하여, 혈구 수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 그 결과, 적혈구 수(×104/μL)는, BALB/c, CBA/J 및 ICR에 있어서, 매체군은 각각 958±8.0, 789±25.3 및 717±22.9(평균값±표준 오차)이었던 것에 반해, 10D5-2-3 항체 투여군은, 각각 1028±18.1, 853±8.1 및 777±13.2(평균값±표준 오차)이며, 10D5-2-3 항체 투여에 의해, 각각 70, 64 및 60 증가하였다.
또한, 헤모글로빈 농도(g/dL)는, BALB/c, CBA/J 및 ICR에 있어서, 매체군은 각각 15.4±0.16, 12.9±0.13 및 13.1±0.50(평균값±표준 오차)이었던 것에 반해, 10D5-2-3 항체 투여군에서는 각각 16.6±0.26, 13.6±0.13 및 13.7±0.25(평균값±표준 오차)이며, 10D5-2-3 항체 투여에 의해, 각각 1.2, 0.7 및 0.6 증가하였다.
10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈 작용은, 어떠한 계통에서든 인정된 점에서, 항 인간 BMP9 항체의 적혈구 조혈 작용은 계통을 넘어선 작용인 것으로 시사되었다.
이어서, 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈 작용이, EPO 증가를 통한 것인지 여부를 확인하기 위해서, 얻어진 혈청 샘플을 사용하여 혈중 EPO 농도를 측정하였다. 측정에는 퀀티카인 마우스/래트 에리트로포에틴 ELISA킷(R&D 시스템즈사 제조)을 사용하였다.
혈중 EPO 농도(pg/mL)는, BALB/c, CBA/J 및 ICR에 있어서, 매체군은 각각 88.5±8.7, 181.2±28.5 및 291.5±106.4(평균값±표준 오차)이었던 것에 반해, 10D5-2-3 항체 투여군은 각각 77.6±5.7, 126.1±20.1 및 236.2±46.1(평균값±표준 오차)이며, 10D5-2-3 항체 투여에 의해, 각각 10.9, 55.1 및 55.3 감소하였다.
이로부터, 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈 작용은 EPO 산생 상승을 통한 것이 아님이, 실시예 15와 마찬가지로 시사되었다.
[실시예 17]
정상 래트의 적혈구 조혈에 대한 취득 항체의 작용
위스타(Wistar) 래트를 사용하여, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 래트 적혈구 조혈에 대한 작용을 평가하였다. 5주령의 웅성 위스타 래트(일본 크레어사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 체중을 지표로 해서, 4군으로 나누어(각 군 n=6), 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체를 1mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다. 구체적으로는, 각각의 항체를 생리 식염수로 0.5mg/mL가 되도록 제조한 것을 2mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 2mL/kg의 용량으로 피하 투여하였다.
항체 또는 매체는, 주 1회의 빈도로 총 2회 투여하였다. 첫회 투여로부터 2주일 후, 이소플루란 마취 하에서 개복 후, 복대동맥으로부터 채혈을 행하고, 일부를 EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하고, 나머지를 혈청 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴사 제조)를 사용하여, 혈구 수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 도 9a와 도 9b에 나타내었다.
도 9a 및 도 9b에 도시한 바와 같이, 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도는, 어떤 항 인간 BMP9 항체의 투여에 의해서든 증가하여, 항 인간 BMP9 항체의 적혈구 조혈 작용은, 마우스뿐만 아니라, 래트에서도 인정되는 것이 명확해졌다. 또한 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 적혈구 조혈 작용은, 마우스와 마찬가지로, 래트에서도, R&D 항체에 비해 강한 경향이 인정되었다.
[실시예 18]
신부전 래트의 빈혈에 대한 항 인간 BMP9 항체의 작용
위스타 래트에 5/6 신장 적출 수술을 실시한 신부전 래트를 사용하여, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체의 신장성 빈혈에 대한 작용을 검토하였다. 5주령의 웅성 위스타 래트(일본 크레어사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 먼저, 펜토바르비탈 마취 하에서 좌측 등부를 절개하여, 좌측 신장을 노출시켜 신장의 2/3를 절제하였다. 신장 절제부로부터의 출혈이 없어진 것을 확인한 후, 절개부를 봉합하였다. 1주일 후, 동 래트를 펜토바르비탈 마취 하에서, 우측 등부를 절개하여, 우측 신장을 결찰한 후, 우측 신장을 적출함으로써, 5/6 신장 적출 래트를 제작하였다. 정상 대조군으로서 설정한 가짜 수술 래트에는, 등부 절개, 봉합 수술만을 실시하였다.
5/6 신장 적출 래트 제작 2주일 후, 각 래트로부터 무마취 하에서 꼬리정맥으로부터 채혈하여, 일부를 EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하고, 나머지를 혈청 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴제)를 사용하여, 혈구 수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다.
이어서, 얻어진 혈청 샘플에 대해서, 히타치 자동 분석 장치 7170(히타치사 제조)을 사용하여, 요소질소(BUN) 농도 및 크레아티닌 농도를 측정하였다.
얻어진 적혈구값, 헤모글로빈 농도, BUN 농도, 크레아티닌 농도를 기초로, 각 군의 평균값이 가능한 한 균등해지도록, 3군으로 나누어(각 군 n=8), 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체를 1mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다.
구체적으로는, 각각의 항체를 생리 식염수로 0.5mg/mL가 되도록 제조한 것을, 2mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 2mL/kg의 용량으로 투여하였다. 또한, 정상 대조로서의 매체 투여 가짜 수술 래트군(n=5)에는 생리 식염수를 2mL/kg의 용량으로 투여하였다.
항체 또는 매체는, 주 1회의 빈도로 투여하였다. 첫회 투여로부터 2주일, 4주일, 6주일 및 8주일 후에 꼬리정맥으로부터 채혈을 행해, 일부를 EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하고, 나머지를 혈청 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플에 대해서, 전자동 혈구 계수기 Celltac α(닛본 고덴사 제조)를 사용하여, 혈구 수 및 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 도 10a와 도 10b에 나타내었다. 또한, 5/6 신장 적출 래트 매체 투여군에 대한 각종 항체 투여군의 측정값의 통계학적 유의차 검정은 스튜던트 티-테스트를 사용하여 해석하고, P<0.05를 유의로 하였다.
도 10a 및 도 10b에 도시한 바와 같이, 매체 투여 5/6 신장 적출군의 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도는, 매체 투여 가짜 수술 래트군에 비해, 0주에서 8주까지의 모든 실험 기간에서 감소하였다. 한편, 6D10-1-1 항체 또는 10D5-2-3 항체가 투여된 5/6 신장 적출군의 적혈구 수 및 헤모글로빈 농도는, 항체 투여 후 2주 이후 8주까지, 610D-1-1 항체의 항체 투여 후 6주의 샘플을 제외하고, 매체 투여 5/6 신장 적출군에 비해 유의미하게 증가하였다. 또한, 어떤 항체도 체중에 대하여 영향을 주지 않았다.
이 결과로부터, 6D10-1-1 항체 및 10D5-2-3 항체에 신장성 빈혈에 대한 개선 작용이 있는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 19]
항 인간 BMP9 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 유전자 배열의 단리
19-1) 항 인간 BMP9 모노클로날 항체 산생 하이브리도마 세포로부터의 총 RNA의 제조
실시예 7에 기재된 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 3B7-3-3 항체를 산생하는 하이브리도마 1×106개로부터, RNA이지 미니 키트(easy Mini Kit)(퀴아젠(QIAGEN)사 제조, Cat#74104) 및 QIA 슈레더(shredder)(퀴아젠사 제조, Cat#79654)를 사용하여, 총 RNA를 제조하였다.
19-2) 항 인간 BMP9 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 유전자 클로닝
실시예 19-1에서 취득한 각 하이브리도마의 총 RNA 1μg으로부터, SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(Amplification Kit)(클론테크(Clontech)사 제조, Cat#634924)를 사용하여, cDNA를 제작하였다. 얻어진 cDNA를 주형으로 해서, 킷 첨부의 유니버설 프라이머 A mix(정방향 프라이머를 함유함)와, 마우스의 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 중쇄 정상 영역을 코딩하는 특이적인 서로 다른 2종의 역방향 프라이머를 조합하여 사용함으로써, VH의 cDNA 배열 결정을 행하였다.
구체적으로는, 마우스 IgG1에 특이적인 프라이머(서열 번호 17 및 18), 마우스 IgG2a에 특이적인 프라이머(서열 번호 19 및 20), 마우스 IgG2b에 특이적인 프라이머(서열 번호 21 및 22), 마우스 IgG2c에 특이적인 프라이머(서열 번호 23), 또는 마우스 IgG3에 특이적인 프라이머(서열 번호 24 및 25)를 사용하여 각각 유니버설 프라이머 A와 조합함으로써 PCR 반응을 행하고, 각 항체의 VH의 cDNA 단편을 증폭하였다.
또한, 마우스 Ig(κ) 특이적인 프라이머(서열 번호 26 및 27), 또는, 마우스 Ig(λ) 특이적인 프라이머(서열 번호 28 및 29)를 마찬가지로 사용하여 각각 유니버설 프라이머 A와 조합함으로써 PCR을 행하고, 각 항체의 VL의 cDNA 단편을 증폭하였다.
PCR은, 94℃에서 30초간, 72℃에서 3분간을 포함하는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 30초간, 70℃에서 30초간, 72℃에서 3분간을 포함하는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 30초간, 68℃에서 30초간, 72℃에서 3분간을 포함하는 반응 사이클을 25회 행하였다.
아가로오스 겔 전기 영동을 행한 결과, 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 산생 및 3B7-3-3 항체 하이브리도마 유래의 cDNA는, IgG1 중쇄 정상 영역을 코딩하는 특이적 프라이머를 사용했을 때에 PCR 증폭 산물이 얻어졌다.
또한, 양쪽 하이브리도마 유래의 cDNA는, 마우스 Ig(κ) 특이적 프라이머를 사용했을 때에도 PCR 증폭 산물이 얻어졌다. 각각의 PCR 증폭 산물을 겔 익스트랙션 키트(Gel Extraction Kit)(퀴아엑스(QIAEX) II, 퀴아젠사 제조, Cat#20021)를 사용하여 정제하였다.
얻어진 유전자 단편을, 시퀀싱용 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing)(인비트로젠사 제조, Cat#K287540SP)을 사용하여, pCR4 벡터(인비트로젠사 제조)에 삽입하였다.
얻어진 플라스미드를, 대장균 DH5α주에 도입하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 자동 플라스미드 추출기(구라보사 제조)를 사용하여 플라스미드를 추출하고, 염기배열을 해석하였다. 그 결과, cDNA의 5' 말단에 개시 코돈이라 추정되는 ATG 배열이 존재하는 완전 길이의 VH cDNA, 및 VL cDNA가 취득된 것을 확인하였다.
19-3) 항 인간 BMP9 모노클로날 항체 V 영역의 유전자 배열의 해석
실시예 19-2에서 얻어진 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체, 3B7-3-3 항체의 VH의 전체 염기배열을 서열 번호 30, 31, 32로, 해당 배열로부터 추정된, 시그널 배열을 포함한 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 33, 34, 35에, VL의 전체 염기배열을 서열 번호 36, 37, 38에, 해당 배열로부터 추정된, 시그널 배열을 포함한 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 39, 40, 41에 각각 나타낸다.
또한, 서열 번호 30, 31, 32로부터 시그널 배열을 제외한 염기배열을 서열 번호 42, 43, 44에, 서열 번호 36, 37, 38로부터 시그널 배열을 제외한 염기배열을 서열 번호 45, 46, 47에, 서열 번호 33, 34, 35로부터 시그널 배열을 제외한 아미노산 서열을 서열 번호 48, 49, 50에, 서열 번호 39, 40, 41로부터 시그널 배열을 제외한 아미노산 서열을 서열 번호 51, 52, 53에 각각 나타낸다.
기지의 마우스 항체의 배열 데이터(문헌 [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, Us Dept. Health and Human Services(1991)])와의 비교로부터, 단리한 각각의 cDNA는 분비 시그널 배열을 포함하는 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체, 3B7-3-3 항체를 코딩하는 완전 길이 cDNA인 것을 확인할 수 있었다.
각 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을, 기지의 항체 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. 6D10-1-1 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 54, 55 및 56에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 57, 58 및 59에 각각 나타낸다.
10D5-2-3 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 60, 61 및 62에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 63, 64 및 65에 각각 나타낸다.
[실시예 20]
취득 항체의 에피토프 해석
20-1) 취득 항체의 재조합 발현
6D10-1-1, 10D5-2-3 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역(시그널 배열 포함함)의 염기배열을, 각각 마우스 경쇄(κ쇄), 중쇄(IgG1) 정상 영역의 염기배열과 결합시켜, 항체 발현용의 벡터에 서브 클로닝하였다. BMP9 항체의 가변 영역 부분의 염기배열의 증폭에는, 실시예 19에서 제작한 플라스미드를 주형으로 해서, 각각 서열 번호 72 내지 79로 표시되는 염기배열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였다.
마우스 경쇄(κ쇄), 중쇄(IgG1) 정상 영역 부분의 염기배열의 증폭은, 각각 인공 유전자 합성(다카라 바이오 사)에 의해 제작된, 서열 번호 80, 81로 표시되는 염기배열을 주형으로 해서, 서열 번호 82 내지 85로 표시되는 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였다.
모든 PCR을, PrimeSTAR HS(Premix)(다카라 바이오사 제조, R040A)를 사용하여, 96℃에서 2분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 및 72℃에서 1 내지 2분간(증폭물의 사이즈에 따라 조정함)을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응을 행하였다. 얻어진 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용해서 정제하여, 인서트로 하였다.
N5KG1 벡터(비오젠(Biogen) IDEC사)를 BglII, EcoRI를 사용하여 효소 처리하고, 상기와 마찬가지의 수순으로 정제하여, 인서트 삽입용 벡터로 하였다.
6D10-1-1 항체의 경쇄 가변 영역 및 마우스 경쇄 정상 영역의 인서트를 인-퓨젼 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(In-fusion Advantage PCR Cloning Kit)(다카라 바이오사 제조)를 사용해서 효소 처리한 N5KG1 벡터에 집어넣어, 대장균에 도입하였다.
얻어진 형질 전환체로부터, 올바른 배열이 삽입된 클론을 선택하였다. 이 플라스미드 DNA를 SalI, BamHI를 사용하여 효소 소화하고, 상기와 마찬가지의 수순에 의해 정제하였다. 6D10-1-1 항체의 중쇄 가변 영역 및 마우스 중쇄 정상 영역의 인서트를, 이미 경쇄가 삽입된 상기의 벡터에 집어넣어, 대장균에 도입하였다.
얻어진 형질 전환체로부터, 올바른 배열이 삽입된 클론을 선택하였다. 얻어진 6D10-1-1 항체 발현 벡터와 마찬가지의 수순으로, 10D5-2-3 항체의 발현 벡터도 제작하였다. 경쇄 가변 영역은 제한 효소 BglII, BsiWI 절단 사이트 사이에, 중쇄 가변 영역은 제한 효소 SalI, NheI 절단 사이트 사이에 삽입하였다.
제작한 6D10-1-1 항체, 또는 10D5-2-3 항체 발현 벡터를 사용하여 대장균을 형질 전환하여, 뉴클레오본드 엑스트라 맥시(NucleoBond Xtra Maxi)(다카라 바이오사 제조)에 의해 벡터를 제조하였다. 프리스타일(FreeStyle) 293 익스프레션 시스템(Expression System)(라이프 테크놀로지스사 제조)을 사용하여 일과성 발현을 행하고, 재조합 항체를 발현시켰다. 배양 상청을, 원심 분리와 0.22㎛ 필터를 사용한 여과에 의해 배양액으로부터 취득하였다.
계속해서, 프로테인 세파로오스 4 패스트 플로우(GE 헬스케어사 제조)를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다. NAP-25 칼럼(GE 헬스케어사 제조)을 사용하여 버퍼를 시트르산 버퍼(10mM 시트르산-NaOH(pH6.0), 150mM NaCl)로 치환하였다. 280nm의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다. 분자 흡광 계수로서, 1.4mL/(mg·cm)를 사용하였다.
20-2) 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질의 제작
인간 BMP9 성숙 영역 중, 서열 번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 인간 BMP9 영역 C, 인간 BMP10 성숙 영역 중, 서열 번호 139로 표시되는 아미노산 서열을 인간 BMP10 영역 C라 정의한다.
인간 BMP9와 가장 상동성이 높은 분자는 인간 BMP10인데, 취득한 6D10-1-1 항체, 10D5-2-3 항체 및 R&D 항체는 BMP10에 교차성을 갖지 않는다. 인간 BMP9 영역 C에 포함되는 아미노산 잔기 중, 인간 BMP10 영역 C와 상이한 것은, 서열 번호 67로 표시되는 인간 BMP9 성숙 영역에서, 80번째 Ser, 84번째 Val, 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met, 93번째 Pro, 95번째 Leu, 97번째 Tyr, 98번째 His, 103번째 Ser, 105번째 Ala이다.
이 영역 C의 차이에 기초하여, BMP9의 아미노산 잔기를 대응하는 BMP10의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 인간 BMP9/10의 키메라 단백질 1 내지 5를 설계하였다.
키메라 단백질 1은, 인간 BMP9 중, 성숙 영역의 87, 89, 및 93번째의 아미노산 잔기를 각각 Leu, Lys, Val로 치환하고, 90번째의 아미노산 잔기를 결손시킨 것이다. 키메라 단백질 2는, 인간 BMP9 중, 성숙 영역의 84, 95, 97 및 98번째의 아미노산 잔기를 각각 Ile, Tyr, Phe 및 Lys로 치환한 것이다.
키메라 단백질 3은, 인간 BMP9 중, 성숙 영역의 80, 103 및 105번째의 아미노산 잔기를 각각 Glu, Ala 및 Ser로 치환한 것이다. 키메라 단백질 4는, 인간 BMP9 중, 성숙 영역의 84, 87, 89, 93, 95, 97 및 98번째의 아미노산 잔기를 각각 Ile, Leu, Lys, Val, Tyr, Phe 및 Lys로 치환하고, 90번째의 아미노산 잔기를 결손시킨 것이다.
키메라 단백질 5는, 인간 BMP9 중, 성숙 영역의 80, 84, 95, 97, 98, 103 및 105번째의 아미노산 잔기를 각각 Glu, Ile, Tyr, Phe, Lys, Ala 및 Ser로 치환한 것이다. 키메라 단백질 1 내지 5에서의, 인간 BMP9 영역 C 및 인간 BMP10 영역 C에 상당하는 아미노산 서열을 서열 번호 78 내지 91에 나타내었다.
국제 공개 제2010/126169호의 실시예 12 및 도 7에 기재된 N말 His형 hBMP9 complex 재조합체 발현 벡터(이하, pLN1V5_인간 BMP9 벡터라고 기재)를 StuI 및 XhoI를 사용하여 효소 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 정제하였다.
인간 BMP9/10 영역 C의 키메라 단백질 1 내지 5는, 서열 번호 92 내지 101로 나타내는 키메라 단백질 제작용 프라이머의 각 Fwd, Rv를 1/6, 2/7, 3/8, 4/9, 5/10의 조합으로 혼합하여 하이브리다이즈시킨 것을, 정제한 벡터에 인-퓨젼 HD 클로닝 키트(다카라 바이오사 제조, Z9649N)를 사용해서 삽입하여 제작하였다.
또한, pLN1V5_인간 BMP10 벡터는 이하의 수순으로 제작하였다. pLN1V5_인간 BMP9 벡터를 NheI 및 XhoI를 사용하여 효소 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 정제하였다.
휴먼 하트 PCR-레디(Human Heart PCR-Ready) cDNA(앰비온(Ambion)사, 3326)를 템플릿으로 해서, 서열 번호 102 내지 105로 나타내는 Fwd-1/Rv-1, Fwd-2/Rv-2의 프라이머 조합으로 PCR을 행하였다.
PCR은, PrimeSTAR HS(Premix)(다카라 바이오사 제조, R040A)를 사용하여, 96℃에서 2분간 보온한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 5초간, 및 72℃에서 2분간을 1 사이클로 하여 32 사이클 반응을 행하였다.
얻어진 2개의 PCR 증폭 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후, QIA퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용해서 정제하여, 인서트로 하였다. 인-퓨젼 HD 클로닝 키트를 사용하여, 인서트를 먼저 정제한 pLN1V5 벡터에 삽입하여 서브 클로닝을 행해, pLN1V5_인간 BMP10 벡터로 하였다.
서열 번호 106 내지 109에, 인간 BMP10과 그 성숙 영역의 아미노산 서열 및 염기배열을 나타낸다. 서열 번호 110, 111에, pLN1V5_인간 BMP10 벡터에 의해 발현하는, N말에 His 태그를 부여한 BMP10의 아미노산 서열 및 염기배열을 나타낸다.
전항에서 제작한 pLN1V5_인간 BMP10 벡터, 및 pLN1V5_인간 BMP9 벡터를 사용해서 대장균을 형질 전환하여, 뉴클레오본드 엑스트라 맥시(다카라 바이오사 제조)에 의해 벡터를 제조하였다.
프리스타일 293 익스프레션 시스템(라이프 테크놀로지스사 제조)을 사용하여 일과성 발현을 행해, 인간 BMP9, 인간 BMP10, 및 인간 BMP9/10 영역 C의 키메라 단백질 1 내지 5를 발현시켰다.
배양 상청을, 원심 분리와 0.22㎛ 필터를 사용한 여과에 의해 배양액으로부터 취득하였다. 계속해서, Ni-NTA 아가로오스(Agarose)(퀴아젠사 제조)를 사용하여 각 단백질을 정제하였다. 결합 버퍼(Binding buffer)로서 20mM HEPES-NaOH(pH7.4), 500mM NaCl 40mM 이미다졸을 사용하고, 용리 버퍼(Elution buffer)로서 20mM HEPES-NaOH(pH7.4), 500mM NaCl 200mM 이미다졸을 사용하였다. NAP-25 칼럼(GE 헬스케어사 제조, 17-0852-02)을 사용하여, 버퍼를 PBS로 치환하였다.
280nm의 흡광도를 측정하여 각 단백질 용액의 농도를 결정하였다. 분자 흡광 계수로서, 인간 BMP9, 인간 BMP10은 각각 1.05, 0.96mL/(mg·cm), 키메라 1 내지 5는 1.055mL/(mg·cm)를 사용하였다.
20-3) 취득 항체의 키메라 단백질에 대한 특이적 결합성
키메라 단백질을 사용하여, 취득 항체의 고상 항원 ELISA를 행하였다. 실시예 20-2에서 제조한 인간 BMP9, BMP10, BMP9/10 키메라 재조합 단백질을 50mmol/L NaHCO3 완충액으로 3μg/mL로 제조하여, 96웰의 ELISA용 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, 써모 피셔 사이언티픽사 제조, Cat#442404)에 50μL/웰 가하여 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.
고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS를 200μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, PBST로 5회 세정하였다. 이어서, 1％ BSA-PBS로 1000ng/mL로 제조한 취득 항체(실시예 20-1에서 제작한 것), R&D 항체, BMP10 항체(R&D사 제조, MAB2926), BMP9 염소 폴리클로 항체(R&D사 제조, AF3209), 음성 대조 마우스 IgG1, IgG2b 모노클로날 항체(MAB002, MAB004(모두 R&D사 제조))를 50μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
이 플레이트를 PBST로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 2000배 희석한 Goat anti-mouse IgG HRP(다코사 제조, P0447) 또는 Rabbit anti-goat IgG HRP(다코사 제조, P0160)를 50μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하였다.
플레이트를 PBST로 10회 세정하고, TMB 발색액(TMB+Substrate-Chromogen, 다코사 제조, Cat#S1599)을 50μL/웰 첨가하여 발색시키고, 충분한 발색이 얻어진 시점에서, 1N 황산 용액(와코사 제조, Cat#192-04755)을 50μL/웰 첨가하여, 멀티스캔 스펙트럼(Multiskan Spectrum)(써모 랩시스템즈사 제조)을 사용해서 450, 570nm의 흡광도를 측정하였다.
결과를 표 2에 기재한다. 표 내의 + 및 -는, 흡광도의 값이 1 이상인 경우를 +로 하고, 1 미만이었을 경우를 -로 하였다.
Figure 112014126937119-pct00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 항원이 적당량 고상화되어 있는 것을 확인하기 위하여 사용한 BMP9 염소 폴리클로 항체에 대해서는, 인간 BMP9 및 키메라 1 내지 5 중 어떤 단백질에 대해서도 결합을 나타내어, 플레이트 상에 충분한 항원이 고상화되어 있음을 확인하였다.
한편, 6D10-1-1 항체와 R&D 항체는, 키메라 단백질 1, 키메라 단백질 3에 특이적으로 결합한 것에 반해, 10D5-2-3 항체는, 키메라 단백질 2, 키메라 단백질 3, 키메라 단백질 5에 특이적으로 결합하는 것을 알았다.
이 결과는, 6D10-1-1 항체와 R&D 항체는, 인간 BMP9 성숙 영역의 적어도 84번째 Val, 95번째 Leu, 97번째 Tyr, 98번째 His에 결합하는 것, 10D5-2-3 항체는 인간 BMP9 성숙 영역의 적어도 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met, 93번째 Pro에 결합하는 것을 나타내고 있다. 이상으로부터, 적어도, 10D5-2-3 항체는, 기존의 R&D 항체와는 다른 BMP9의 에피토프를 인식하는 항체인 것이 명확해졌다.
[실시예 21]
BMP9와 취득 복합체의 BMP10 시그널 저해 작용
실시예 11, 12의 결과로부터, 10D5-2-3 항체, 6D10-1-1 항체는, 모두 인간 BMP9와 인간 ALK1의 결합은 저해하지 않고, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 특이적으로 저해하는 항체인 것으로 판명되었다.
또한 실시예 20의 결과로부터는, 10D5-2-3 항체, 6D10-1-1 항체의 BMP9 에피토프가 상이한 것이 명확해졌다. ALK1 리셉터의 리간드로서는, BMP9 외에, BMP10이 알려져 있다. 6D10-1-1 항체 또는 10D5-2-3 항체가 결합한 BMP9는, ALK1에 결합함으로써, BMP10의 ALK1에 대한 결합을 저해하고, BMP10에 의한 ALK1 시그널을 감약시킬 가능성이 상정되었다.
그 가능성을 검증하기 위해서, 인간 ALK1 발현 리포터 세포주를 제작하여, BMP9와 취득 항체 복합체의 인간 BMP10 의존성 인간 ALK1 유래 시그널에 대한 저해 작용을 평가하였다. 또한 동시에 양자의 인식 에피토프의 차이에 의한 항체간에서의 작용의 차이에 대해서도 검증하였다.
21-1) 인간 ALK1 발현 리포터 세포주의 제작
인간 ALK1 발현 리포터 세포는, 국제 공개 제2010/126169호의 실시예 2에 기재된 BMP 시그널 검출주[p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)]에 전체 길이 인간 ALK1 유전자를 강제 발현시킴으로써[ALK1/p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)] 제작하였다.
인간 ALK1 발현 벡터는, 양단에 EcoRI 및 NotI 제한 효소 사이트를 갖는 인간 ALK1의 전체 길이 cDNA를 EcoRI 및 NotI로 소화한 것을, pEAK8 발현 벡터(엣지바이오시스템즈(Edgebiosystems)사 제조)에 내장함으로써 제작하였다. 인간 ALK1의 전체 길이 cDNA(cDNA의 진뱅크 액세션 번호: BC042637. 1, 서열 번호 112, 아미노산 서열의 진뱅크 액세션 번호: AAH42637, 서열 번호 71)는, 인간 폐 cDNA 라이브러리와 프라이머(서열 번호 113, 114)를 사용한 PCR에 의해 제작하였다.
21-2) 인간 BMP9와 취득 항체를 포함하는 복합체의 BMP10 의존성 ALK1 유래 시그널에 대한 작용
상기의 방법에 의해 만들어 낸 인간 ALK1 리포터 세포주[ALK1/p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)]를 1μg/mL의 hsALK1-Fc를 포함하는 DMEM 증식 배지[FCS를 10％가 되도록 첨가한 DMEM(인비트로젠(Invitrogen)사 제조)]에 현탁하고, 1.5×104개/웰이 되도록 96웰 백색 플레이트(퍼킨엘머사 제조)에 파종하였다.
다음날, 웰 내를 200μL의 혈청을 포함하지 않는 DMEM으로 세정한 후, 2ng/mL 또는 10ng/mL의 인간 성숙 2량체 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#3209-BP) 및 3μg/mL의 6D10-1-1 항체 또는 10D5-2-3 항체를 포함하는 0.1％ BSA(보빈 세럼 알부민(Bovine serum albumin)) 함유 DMEM 배지를 100μL씩 첨가하였다.
그 30분 후, 최종 농도로 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10ng/mL가 되도록 0.1％ BSA(보빈 세럼 알부민)를 사용하여 조정한 인간 성숙 2량체 BMP10 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#2926-BP-0255)을 5μL씩 첨가하여, 6시간 배양하였다. 6시간 후, 화학 발광 시약[스테디글로 루시퍼라아제 어세이 시스템(Steadyglo Luciferase assay system), 프로메가사 제조]을 50μL 첨가하여, 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 음성 대조 웰에는, 0.1％ BSA 함유 DMEM 배지를 첨가하였다. 결과를 도 11에 도시한다.
도 11에 도시한 바와 같이, 인간 BMP9와 6D10-1-1 항체의 복합체는, BMP10 의존성 ALK1 유래 시그널에 대하여 억제적으로 작용한 것에 반해, 인간 BMP9와 10D5-2-3 항체의 복합체는 억제하지 않는 것이 명확해졌다. BMP10은, 유전자 결손 동물을 사용한 시험에 의해 심장의 발생에 중요한 분자인 것으로 알려져 있어(문헌 [Development, 131(9), 2219(2004)]), 부작용의 관점에서, 항BMP9 항체로서는, 심장 형성에 중요한 BMP10 시그널에는 영향을 미치지 않는 항체일 것이 요구된다.
따라서, 10D5-2-3 항체는, 6D10-1-1 항체 또는 R&D 항체로부터, 부작용의 관점에서 바람직한 항BMP9 항체인 것이 시사되었다.
[실시예 22]
10D5-2-3 키메라 항체(c10D5-2-3 항체) 및 인간화 항체의 제작
22-1) 10D5-2-3 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 설계
10D5-2-3 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다. 10D5-2-3VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(서열 번호 60, 61 및 62)의 이식에 적합한 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 선택하였다.
먼저, 기지의 인간 항체 중쇄 가변 영역 배열은, 미국 국립 생물 공학 정보 센터(The National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 Ig Germline Genes 데이터베이스에 의해, 10D5-2-3 항체 VH의 FR 배열과 상동성이 높은 인간 항체 배열을 검색하였다. 그 결과, IGVH3-72가 가장 상동성이 높은 인간 항체 배열이었기 때문에, 이 항체의 FR을 선택하였다. 이상과 같이 하여 결정한 인간 항체 FR 배열의 적절한 위치에 서열 번호 60, 61 및 62에 나타내는 10D5-2-3 항체 VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식함으로써 HV0(서열 번호 116)를 설계하였다.
이어서, 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다. 10D5-2-3 항체 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(서열 번호 63, 64 및 65)을 이식하기에 적합한 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을, 이하와 같이 하여 선택하였다.
카바트 등은, 기지의 다양한 인간 항체의 VL을 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 서브그룹(HSGI 내지 IV)으로 분류하고, 그러한 서브그룹마다 공통 배열을 보고하고 있다(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Us Dept Health and Human Services(1991)]). 따라서, 인간 항체의 VL의 서브그룹 I 내지 IV의 공통 배열의 FR의 아미노산 서열과 10D5-2-3 항체 VL의 FR의 아미노산 서열의 상동성 검색을 실시하였다.
상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII, HSGIII 및 HSGIV의 상동성은 각각 67.1％, 67.1％, 68.4％, 75.9％이었다. 따라서, 10D5-2-3 항체 VL의 FR의 아미노산 서열은 서브그룹 IV와 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
이상의 결과로부터, 인간 항체의 VL의 서브그룹 IV의 공통 배열의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에, 10D5-2-3 항체 VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열(서열 번호 63, 64 및 65)을 이식하였다. 그러나, 10D5-2-3 항체 VL의 아미노산 서열(서열 번호 52) 중의 108번째의 Leu는, 카바트 등이 말하는 인간 항체 FR의 아미노산 서열이 상당하는 부위에 있어서, 가장 사용되는 빈도가 높은 아미노산 잔기는 아니지만, 비교적 높은 빈도로 사용되는 아미노산 잔기이기 때문에, 상기 10D5-2-3 항체 VL의 아미노산 서열에서 인정되는 아미노산 잔기를 사용하기로 하였다. 이와 같이 하여, 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열인 10D5-2-3 항체 LV0(서열 번호 118)을 설계하였다.
상기에서 설계한 10D5-2-3 항체의 VH의 아미노산 서열 10D5-2-3 항체 HV0, 및 VL의 아미노산 서열 10D5-2-3 항체 LV0은, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에, 마우스 모노클로날 항체인 10D5-2-3 항체 유래의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 배열이다.
그러나, 일반적으로, 인간화 항체를 제작하는 경우에는, 간단히 인간 항체의 FR에 마우스 항체의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 것만으로는, 결합 활성이 저하되어버리는 경우가 많다. 이러한 결합 활성의 저하를 피하기 위해서, CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께, 인간 항체와 마우스 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기를 개변하는 것이 행해지고 있다. 따라서, 본 실시예에서도, 결합 활성에 영향을 주는 것이라 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 해서 동정하여, 개변하기로 하였다.
먼저, 상기에서 설계한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 10D5-2-3 항체 HV0, 및 VL의 아미노산 서열 10D5-2-3 항체 LV0을 포함하는 항체 V 영역(이하, HV0LV0라 나타냄)의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델링의 방법을 사용하여 구축하였다. 삼차원 구조 좌표 제작 및 삼차원 구조의 표시에는, 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio)(액셀리스사)를 사용하였다.
또한, 10D5-2-3 항체의 V 영역의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델도 마찬가지로 하여 구축하였다. 또한, HV0LV0의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 10D5-2-3 항체와 상이한 아미노산 잔기를 선택하여, 10D5-2-3 항체의 아미노산 잔기로 개변된 아미노산 서열을 제작하고, 마찬가지로 삼차원 구조 모델을 구축하였다.
이들 제작한 10D5-2-3 항체, HV0LV0 및 개변체의 각 V 영역의 삼차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 주는 것이라 예측되는 아미노산 잔기를 동정하였다.
그 결과, HV0LV0의 FR의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 삼차원 구조를 변화시켜, 항체의 결합 활성에 영향을 주는 것이라 생각되는 아미노산 잔기로서, 10D5-2-3 항체 HV0에서는, 서열 번호 116의 아미노산 서열의 8번째의 Gly, 18번째의 Leu, 49번째의 Gly, 79번째의 Asn, 81번째의 Leu, 94번째의 Ala, 95번째의 Val, 99번째의 Ala 및 100번째의 Arg를, 10D5-2-3 항체 LV0에서는, 서열 번호 118의 아미노산 서열의 4번째의 Met, 40번째의 Tyr, 81번째의 Ser, 82번째의 Leu, 89번째의 Val 및 91번째의 Tyr을 각각 선택하였다.
이들 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 1개 이상의 아미노산 서열을 10D5-2-3 항체의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 개변하여, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VH 및 VL을 설계하였다.
구체적으로는, VH에 대해서는, 서열 번호 116의 아미노산 서열 중의, 8번째의 Gly를 Arg로, 18번째의 Leu를 Met로, 49번째의 Gly를 Ala로, 79번째의 Asn을 Ser로, 81번째의 Leu를 Val로, 94번째의 Ala를 Gly로, 95번째의 Val을 Ile로, 99번째의 Ala를 Thr로 또는 100번째의 Arg를 Gly로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 1개의 개변을 도입하였다.
또한, VL에 대해서는, 서열 번호 118의 아미노산 서열 중의, 4번째의 Met를 Leu로, 40번째의 Tyr을 Phe로, 81번째의 Ser을 Pro로, 82번째의 Leu를 Met로, 89번째의 Val을 Met로 또는 91번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 아미노산 개변 중, 적어도 1개의 개변을 도입하였다.
HV0LV0의 FR에 존재하는, 적어도 1개의 아미노산 잔기를 개변한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 항체 V 영역으로서, HV0LV0, HV0LV2, HV0LV3, HV0LV4, HV0LV6, HV9LV0, HV9LV2, HV9LV3, HV9LV4, HV9LV6, HV3LV0, HV4aLV0, HV4bLV0, HV7aLV0, HV3LV2, HV3LV3, HV3LV6, HV4bLV2, HV4bLV3, HV4bLV6, HV7aLV2 및 HV7bLV2를 각각 설계하였다.
이후의 기술에서는, 상술한 V 영역을 포함하는 10D5-2-3 항체 인간화 항체를 각각 HV0LV0, HV0LV2, HV0LV3, HV0LV4, HV0LV6, HV9LV0, HV9LV2, HV9LV3, HV9LV4, HV9LV6, HV3LV0, HV4aLV0, HV4bLV0, HV7aLV0, HV3LV2, HV3LV3, HV3LV6, HV4bLV2, HV4bLV3, HV4bLV6, HV7aLV2 및 HV7bLV2라 약기한다.
H쇄 가변 영역 HV3(서열 번호 120), HV4a(서열 번호 122), HV4b(서열 번호 124), HV7a(서열 번호 126), HV7b(서열 번호 128), HV9(서열 번호 130), 및 L쇄 가변 영역 LV2(서열 번호 132), LV3(서열 번호 134), LV4(서열 번호 136), LV6(서열 번호 138)의 아미노산 서열을 각각 도 12 및 도 13에 나타내었다.
22-2) 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 가변 영역 유전자의 설계
인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는, 10D5-2-3 항체 VH 및 10D5-2-3 항체 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA(각각 서열 번호 31, 37)에서 사용되고 있는 코돈을 이용해서 설계하여, 아미노산 개변을 행하는 경우에는, 포유 동물 세포에서 고빈도로 사용되는 코돈을 사용해서 설계하여 각각 제작하였다. 이들 DNA 배열을 사용하여, 항체 발현 벡터의 구축 및 인간화 항체의 발현을 행하였다.
22-3) c10D5-2-3 항체 및 인간화 항체의 VH를 코딩하는 cDNA의 구축
서열 번호 49로 표시되는 10D5-2-3 항체의 VH, 및 실시예 22-1)에서 설계한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0(서열 번호 116), 및 실시예 22-1)의 방법에 의해 설계한 HV3, HV4a, HV4b, HV7a, HV7b, HV9를 코딩하는 cDNA를 전체 합성으로 제작하였다.
22-4) c10D5-2-3 항체, 및 인간화 항체의 VL을 코딩하는 cDNA의 구축
서열 번호 52로 표시되는 10D5-2-3 항체의 VL, 및 실시예 22-1)에서 설계한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열 LV0(서열 번호 118), 및 실시예 22-1)의 방법에 의해 설계한 LV2, LV3, LV4, LV6을 코딩하는 cDNA를 전체 합성으로 제작하였다.
22-5) c10D5-2-3 항체, 및 인간화 항체 발현 벡터의 구축
국제 공개 제97/10354호에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93의 적당한 위치에 10D5-2-3 항체의 VH, 실시예 22-3)에서 얻어진 HV0, HV3, HV4a, HV4b, HV7a, HV7b, HV9 중 어느 하나를 코딩하는 cDNA, 및 10D5-2-3 항체의 VL, 실시예 22-4)에서 얻어진 LV0, LV2, LV3, LV4, LV6 중 어느 하나를 코딩하는 cDNA를 삽입하여, 각종 10D5-2-3 항체 인간화 항체 발현 벡터를 구축하였다.
22-6) 동물 세포를 사용한 c10D5-2-3 항체, 및 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 발현
실시예 22-5)에서 구축한 동물 세포용의 항체 발현 벡터의 유전자 도입은, CHO-S 세포주(인비트로젠사 제조)를 사용하였다.
CHO-S를 숙주 세포로서, 프리스타일Tm MAX CHO 익스프레션 시스템(MAX CHO Expression System)(인비트로젠사 제조)의 설명서에 기초하여, 일과성으로 도입하였다. 312.5μL의 프리스타일Tm 맥스 트랜스펙션 리어젠트(MAX Transfection Reagent)(인비트로젠사 제조)를 옵티프로(OptiPro)Tm SFM과 혼합하여 총 5mL로 하였다. 발현 벡터 플라스미드 용액과 프리스타일Tm 맥스 트랜스펙션 리어젠트 용액을 혼합하여, 실온에서 10분간 정치하였다. 프리스타일Tm CHO 익스프레션 메디엄(Expression Medium)(인비트로젠사 제조)으로, 1.0×106cells/mL의 밀도로 배양한 CHO-S 250mL에 대하여 전량을 첨가한 후, 37℃, 8％ CO2, 135rpm의 설정 조건 하에서, 5일 내지 7일간 배양하였다.
배양 후, 세포 현탁액을 회수하고, 3000rpm, 4℃의 조건에서 20분간의 원심 분리를 행하고, 배양 상청을 회수한 후, 0.22㎛ 구멍 직경 밀렉스(Millex) GV 필터(밀리포어(MILLIPORE)사)를 통과시켜 여과 멸균하였다.
22-7) 정제 c10D5-2-3 항체 및 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 취득
0.8cm 직경의 칼럼에 맵셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)(GE 헬스케어사 제조) 0.5mL를 충전하고, 정제수 3.0mL, 0.1M 시트르산 완충액(pH3.5) 2.0mL, 및 150mM NaCl, 0.2M 붕산나트륨산 완충액(pH7.5) 1.5mL를 순차적으로 통탑시켜, 담체의 평형화를 행하였다.
이어서, 실시예 22-6)에서 회수한 배양 상청을 칼럼에 통탑시킨 후, 150mM NaCl, 0.2M 붕산나트륨산 완충액(pH7.5) 5.0mL로 세정하였다. 세정 후, 0.1M 시트르산 완충액(pH3.5) 2.0mL를 사용하여 담체에 흡착시킨 항체의 용출을 행하였다. 용출은 500μL씩, 4획분으로 나누어서 취득하였다.
이어서, 얻어진 정제 획분의 SDS-PAGE 해석을 행하고, 목적 단백질의 용출이 확인된 획분을 통합하여, 150mM NaCl, 10mM 시트르산 Na 용액(pH 6.0)을 사용하여, 4℃에서 일주야 투석을 행하였다.
투석 후, c10D5-2-3 항체, 인간화 항체 용액을 회수하고, 0.22㎛ 구멍 직경 MillexgV(밀리포어사)를 사용하여 멸균 여과한 후에, 280nm의 흡광도(OD280nm)를 흡광 광도계(SHIMADZU UV-1700)를 사용해서 측정하여, 각 정제 c10D5-2-3 항체, 인간화 항체의 농도를 산출하였다.
그 결과, 10D5-2-3 항체의 VH, 및 10D5-2-3 항체의 VL을 포함하는 1종류의 키메라 항체 c10D5-2-3 항체, 및 항체의 VH가 HV0, 및 VL이 LV0, 또는 LV2, 또는 LV3, 또는 LV4, 또는 LV6을 포함하는 인간화 항체 HV0LV0, HV0LV2, HV0LV3, HV0LV4, HV0LV6, 항체의 VH가 HV9, 및 VL이 LV0, 또는 LV2, 또는 LV3, 또는 LV4, 또는 LV6을 포함하는 인간화 항체 HV9LV0, HV9LV2, HV9LV3, HV9LV4, HV9LV6, 항체의 VH가 HV3, 및 VL이 LV0, 또는 LV2, 또는 LV3, 또는 LV6을 포함하는 인간화 항체 HV3LV0, HV3LV2, HV3LV3, HV3LV6, 항체의 VH가 HV4a, 및 VL이 LV0을 포함하는 인간화 항체 HV4aLV0, 항체의 VH가 HV4b, 및 VL이 LV0, 또는 LV2, 또는 LV3, 또는 LV6을 포함하는 인간화 항체 HV4bLV0, HV4bLV2, HV4bLV3, HV4bLV6, 항체의 VH가 HV7a, 및 VL이 LV0, 또는 LV2를 포함하는 인간화 항체 HV7a LV0, HV7a LV2, 항체의 VH가 HV7b, 및 VL이 LV2를 포함하는 인간화 항체 HV7bLV2의 22종류가 제작된 것을 확인하였다.
[실시예 23]
항BMP9 인간화 항체의 활성 평가
23-1) 비아 코어에 의한 c10D5-2-3 항체 및 인간화 항체의 인간 BMP9 단백질에 대한 결합 활성 평가
실시예 22-7에서 얻어진 c10D5-2-3 항체 및 22종류의 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 인간 BMP9에 대한 반응성을 비교하는 것을 목적으로, 인간 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사)에 대한 결합 활성을, 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)에 의한 비아코어T100(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)을 사용하여 측정하였다.
Anti-human IgG antibody를, 인간 항체 포획 키트(Human Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)를 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라서, CM5 센서 칩(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 고정화하였다. Anti-human IgG antibody를 고정화한 플로우 셀에, 0.4μg/mL로 제조한 c10D5-2-3 항체 또는 각 인간화 항체를 10μL/분의 유속으로 2분간 첨가하였다.
계속해서, 1nm로부터 2배 희석으로 단계적으로 5 농도 제조한 인간 BMP9 재조합 단백질(R&D 시스템즈사 제조, Cat#3209-BP)을 10μL/분의 유속으로, 결합 반응을 3분간, 해리 반응을 3분간 모니터하였다. 취득한 센서 그램은, Bia이밸류에이션 소프트웨어(BiaEvaluation Software)(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)를 사용해서 해석하여, 각 항체의 속도론 상수를 산출하였다.
산출된 각 항체의 결합 속도 상수(ka1), 해리 속도 상수(kd1) 및 해리 상수[kd1/ka1=KD]를 표 3에 기재하였다. 그 결과, 17종류의 10D5-2-3 항체 인간화 항체는, 인간 BMP9 단백질에 대하여 10E-11 이하의 특이적인 반응성을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
Figure 112014126937119-pct00003
[실시예 24]
정상 BALB/c 마우스의 적혈구 조혈에 대한 10D5-2-3 항체 인간화 항체의 작용
다음으로 10D5-2-3 항체 인간화 항체에 실제로 적혈구 증가 작용이 유지되고 있는지, BALB/c 마우스를 사용하여 4종류의 인간화 항체(HV9LV2, HV9LV3, HV7aLV2, HV7bLV2)의 적혈구 조혈에 대한 작용을 평가하였다. 7주령의 웅성 BALB/c 마우스(일본 찰스 리버사 제조)를 구입하여 실험에 제공하였다. 음수는 멸균 수돗물을, 식사는 고형 사료 FR-2(후나바시 팜사 제조)를 자유 섭취로 제공하였다.
예비 사육 후, 체중을 지표로 해서, 7군으로 나누어(각 군 n=6), 4종류의 인간화 항체(HV9LV2, HV9LV3, HV7aLV2, HV7bLV2) 외에도, c10D5-2-3 항체 및 10D5-2-3 항체를 1mg/kg의 투여량이 되도록 피하 투여하였다.
구체적으로는, 각각의 항체를 생리 식염수로 0.1mg/mL가 되도록 제조한 것을 10mL/kg의 용량으로 투여하였다. 매체군에는 생리 식염수를 10mL/kg의 용량으로 피하 투여하였다. 항체 투여로부터 1주일 후, 이소플루란 마취 하에서 안와정맥으로부터 채혈을 행해, EDTA가 들어있는 채혈관에 가하여 혈액 샘플로 하였다.
얻어진 혈액 샘플을 생리 식염수로 2배 희석하고, 자동 혈구 계수 장치 ADVIA120(바이엘 메디컬사 제조)을 사용하여, 각종 혈구 수를 측정하였다. 각 군의 적혈구 수(×104/μL)는, 식염수(saline)군이 1036.3±10.9이었던 것에 반해, HV9LV2 투여군, HV9LV3 투여군, HV7aLV2 투여군, HV7bLV2 투여군, c10D5-2-3 항체 투여군, 10D5-2-3 항체 투여군은 각각 1168.0±13.4, 1157.3±8.7, 1145.3±12.8, 1144.3±14.4, 1127.7±10.9, 1106.0±7.5(평균값±표준 오차)의 값을 나타내어, 어떤 인간화 항체에든 유의한 적혈구 증가 작용이 있는 것으로 확인되었다.
본 발명을 특정한 형태를 사용하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은, 2012년 7월 2일자로 출원된 미국 가출원(61/666,981호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
서열 번호 1: LinkA1의 염기배열
서열 번호 2: LinkA2의 염기배열
서열 번호 3: LinkB1의 염기배열
서열 번호 4: LinkB2의 염기배열
서열 번호 5: Bmp9KOClaI-3'Fw의 염기배열
서열 번호 6: Bmp9KOAscI-3'Rv의 염기배열
서열 번호 7: Bmp9KOPacI-5'Fw의 염기배열
서열 번호 8: Bmp9KOFseI-5'Rv의 염기배열
서열 번호 9: Bmp9KO5'probe FW2의 염기배열
서열 번호 10: Bmp9KO5'probe RV2의 염기배열
서열 번호 11: Bmp9KO3'probe FW2의 염기배열
서열 번호 12: Bmp9KO3'probe RV2의 염기배열
서열 번호 13: mBMP9_FW5915의 염기배열
서열 번호 14: mBMP9_RV17165의 염기배열
서열 번호 15: mBMP9_FW1의 염기배열
서열 번호 16: mBMP9_RV1의 염기배열
서열 번호 17: 마우스 IgG1에 특이적인 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 18: 마우스 IgG1에 특이적인 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 19: 마우스 IgG2a에 특이적인 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 20: 마우스 IgG2a에 특이적인 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 21: 마우스 IgG2b에 특이적인 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 22: 마우스 IgG2b에 특이적인 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 23: 마우스 IgG2c에 특이적인 프라이머 RV의 염기배열
서열 번호 24: 마우스 IgG3에 특이적인 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 25: 마우스 IgG3에 특이적인 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 26: 마우스 Ig(κ) 특이적 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 27: 마우스 Ig(κ) 특이적 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 28: 마우스 Ig(λ) 특이적인 프라이머 RV1의 염기배열
서열 번호 29: 마우스 Ig(λ) 특이적인 프라이머 RV2의 염기배열
서열 번호 30: 6D10-1-1 항체의 VH 전체 염기배열
서열 번호 31: 10D5-2-3 항체의 VH 전체 염기배열
서열 번호 32: 3B7-3-3 항체의 VH 전체 염기배열
서열 번호 33: 6D10-1-1 항체의 VH 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 34: 10D5-2-3 항체의 VH 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 35: 3B7-3-3 항체의 VH 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 36: 6D10-1-1 항체의 VL 전체 염기배열
서열 번호 37: 10D5-2-3 항체의 VL 전체 염기배열
서열 번호 38: 3B7-3-3 항체의 VL 전체 염기배열
서열 번호 39: 6D10-1-1 항체의 VL 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 40: 10D5-2-3 항체의 VL 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 41: 3B7-3-3 항체의 VL 전체 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 42: 6D10-1-1 항체의 VH 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 43: 10D5-2-3 항체의 VH 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 44: 3B7-3-3 항체의 VH 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 45: 6D10-1-1 항체의 VL 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 46: 10D5-2-3 항체의 VL 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 47: 3B7-3-3 항체의 VL 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 48: 6D10-1-1 항체의 VH 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 49: 10D5-2-3 항체의 VH 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 50: 3B7-3-3 항체의 VH 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 51: 6D10-1-1 항체의 VL 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 52: 10D5-2-3 항체의 VL 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 53: 3B7-3-3 항체의 VL 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 54: 6D10-1-1 항체 VH의 CDR1 아미노산 서열
서열 번호 55: 6D10-1-1 항체 VH의 CDR2 아미노산 서열
서열 번호 56: 6D10-1-1 항체 VH의 CDR3 아미노산 서열
서열 번호 57: 6D10-1-1 항체 VL의 CDR1 아미노산 서열
서열 번호 58: 6D10-1-1 항체 VL의 CDR2 아미노산 서열
서열 번호 59: 6D10-1-1 항체 VL의 CDR3 아미노산 서열
서열 번호 60: 10D5-2-3 항체 VH의 CDR1 아미노산 서열
서열 번호 61: 10D5-2-3 항체 VH의 CDR2 아미노산 서열
서열 번호 62: 10D5-2-3 항체 VH의 CDR3 아미노산 서열
서열 번호 63: 10D5-2-3 항체 VL의 CDR1 아미노산 서열
서열 번호 64: 10D5-2-3 항체 VL의 CDR2 아미노산 서열
서열 번호 65: 10D5-2-3 항체 VL의 CDR3 아미노산 서열
서열 번호 66: 인간 BMP9 단백질의 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 67: 인간 BMP9 성숙 영역의 아미노산 서열
서열 번호 68: 인간 BMP9 단백질을 코딩하는 염기배열(시그널 배열 포함함)
서열 번호 69: 인간 BMP9 성숙 영역을 코딩하는 염기배열
서열 번호 70: 인간 BMPRII의 아미노산 서열
서열 번호 71: 인간 ALK1의 아미노산 서열
서열 번호 72: 6D10-1-1 항체의 경쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 73: 6D10-1-1 항체의 경쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 74: 6D10-1-1 항체의 중쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 75: 6D10-1-1 항체의 중쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 76: 10D5-2-3 항체의 경쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 77: 10D5-2-3 항체의 경쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 78: 10D5-2-3 항체의 중쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 79: 10D5-2-3 항체의 중쇄의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 80: 마우스 경쇄(κ쇄) 정상 영역의 주형으로 한 염기배열
서열 번호 81: 마우스 중쇄(IgG1) 정상 영역의 주형으로 한 염기배열
서열 번호 82: 마우스 경쇄(κ쇄) 정상 영역의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 83: 마우스 경쇄(κ쇄) 정상 영역의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 84: 마우스 중쇄(IgG1) 정상 영역의 증폭에 사용한 프라이머 Fwd의 염기배열
서열 번호 85: 마우스 중쇄(IgG1) 정상 영역의 증폭에 사용한 프라이머 Rv의 염기배열
서열 번호 86: 인간 BMP9 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 87: 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질 1의 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 88: 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질 2의 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 89: 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질 3의 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 90: 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질 4의 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 91: 인간 BMP9/BMP10 키메라 단백질 5의 영역 C의 아미노산 서열
서열 번호 92: 키메라 단백질 제작용 프라이머 1의 염기배열
서열 번호 93: 키메라 단백질 제작용 프라이머 2의 염기배열
서열 번호 94: 키메라 단백질 제작용 프라이머 3의 염기배열
서열 번호 95: 키메라 단백질 제작용 프라이머 4의 염기배열
서열 번호 96: 키메라 단백질 제작용 프라이머 5의 염기배열
서열 번호 97: 키메라 단백질 제작용 프라이머 6의 염기배열
서열 번호 98: 키메라 단백질 제작용 프라이머 7의 염기배열
서열 번호 99: 키메라 단백질 제작용 프라이머 8의 염기배열
서열 번호 100: 키메라 단백질 제작용 프라이머 9의 염기배열
서열 번호 101: 키메라 단백질 제작용 프라이머 10의 염기배열
서열 번호 102: 인간 BMP10 클로닝용 프라이머Fwd-1의 염기배열
서열 번호 103: 인간 BMP10 클로닝용 프라이머 Rv-1의 염기배열
서열 번호 104: 인간 BMP10 클로닝용 프라이머 Fwd-2의 염기배열
서열 번호 105: 인간 BMP10 클로닝용 프라이머 Rv-2의 염기배열
서열 번호 106: 인간 BMP10 단백질의 아미노산 서열(시그널 배열을 포함함)
서열 번호 107: 인간 BMP10 성숙 영역의 아미노산 서열
서열 번호 108: 인간 BMP10 단백질을 코딩하는 염기배열(시그널 배열 포함함)
서열 번호 109: 인간 BMP10 성숙 영역을 코딩하는 염기배열
서열 번호 110: pLN1V5_인간 BMP10 벡터에 의해 발현되는 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 111: pLN1V5_인간 BMP10 벡터에 의해 발현되는 아미노산을 코딩하는 염기배열
서열 번호 112: 인간 ALK1의 전체 길이 cDNA
서열 번호 113: hALK1 FPN의 염기배열
서열 번호 114: hALK1 RP
서열 번호 115: 인간화 항체 개변체 VH(HV0)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 116: 인간화 항체 개변체 VH(HV0)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 117: 인간화 항체 개변체 VL(LV0)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 118: 인간화 항체 개변체 VL(LV0)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 119: 인간화 항체 개변체 VH(HV3)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 120: 인간화 항체 개변체 VH(HV3)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 121: 인간화 항체 개변체 VH(HV4a)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 122: 인간화 항체 개변체 VH(HV4a)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 123: 인간화 항체 개변체 VH(HV4b)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 124: 인간화 항체 개변체 VH(HV4b)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 125: 인간화 항체 개변체 VH(HV7a)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 126: 인간화 항체 개변체 VH(HV7a)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 127: 인간화 항체 개변체 VH(HV7b)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 128: 인간화 항체 개변체 VH(HV7b)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 129: 인간화 항체 개변체 VH(HV9)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 130: 인간화 항체 개변체 VH(HV9)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 131: 인간화 항체 개변체 VL(LV2)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 132: 인간화 항체 개변체 VL(LV2)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 133: 인간화 항체 개변체 VL(LV3)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 134: 인간화 항체 개변체 VL(LV3)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 135: 인간화 항체 개변체 VL(LV4)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 136: 인간화 항체 개변체 VL(LV4)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 137: 인간화 항체 개변체 VL(LV6)의 염기배열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 138: 인간화 항체 개변체 VL(LV6)의 아미노산 서열(시그널 배열을 제외함)
서열 번호 139: 인간 BMP10 영역 C의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> A Pharmaceutical Agent Comprising Anti-BMP9 Antibody as Active Ingredient for Treatment of Anemia such as Renal Anemia and Cancer Anemia <130> W513672 <150> US61/666981 <151> 2012-07-02 <160> 139 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LinkA1 <400> 1 tcgagtcgcg acaccggcgg gcgcgccc 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LinkA2 <400> 2 tcgagggcgc gcccgccggt gtcgcgac 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LinkB1 <400> 3 ggccgcttaa ttaaggccgg ccgtcgacg 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LinkB2 <400> 4 aattcgtcga cggccggcct taattaagc 29 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bmp9KOClaI-3'Fw <400> 5 ccatcgattg gggatacagg acatggaaga ggttctgg 38 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bmp9KOAscI-3'Rv <400> 6 ttggcgcgcc gtctgagcat gacagtggtg gacagacact 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 133 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LV3 <400> 133 gacattgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60 atcaactgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatctcc 240 cctctgcagg ccgaggatgt ggcagtgtat ttctgtcaac aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtc agggcaccaa gctggaaatc aag 333 <210> 134 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV3 amino acids <400> 134 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 135 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LV4 <400> 135 gacattgtgc tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60 atcaactgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatctcc 240 cctatgcagg ccgaggatgt ggcaatgtat tactgtcaac aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtc agggcaccaa gctggaaatc aag 333 <210> 136 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV4 amino acids <400> 136 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Met Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 137 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LV6 <400> 137 gacattgtgc tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60 atcaactgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatctcc 240 cctatgcagg ccgaggatgt ggcaatgtat ttctgtcaac aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtc agggcaccaa gctggaaatc aag 333 <210> 138 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV6 amino acids <400> 138 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Met Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 139 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BMP10 region C <400> 139 Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly 1 5 10 15 Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys 20 25 30 Gly Cys Arg 35

Claims (16)

  1. 이하의 (a) 내지 (c)에서 선택되는 하나의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편:
    (a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 60 내지 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 포함하며, CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 63 내지 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 포함하는 항체
    (b) 서열 번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체
    (c) 서열 번호 128로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 번호 132로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  3. 제2항에 있어서, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택되는 유전자 재조합 항체인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 67로 표시되는 인간 BMP9 성숙(mature) 영역의 아미노산 서열 중, 적어도 87번째 Lys, 89번째 Asp, 90번째 Met 및 93번째 Pro에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 2량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드에서 선택되는 항체 단편인, 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA.
  7. 제6항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
  8. 제7항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체 또는 해당 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는, 상기 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편의 제조 방법.
  10. 인간 BMP9에 결합하며, 인간 BMP9와 인간 BMPRII의 결합을 저해하는 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, BMP9가 관여하는 빈혈을 수반하는 질환의 치료제.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 사용하는 인간 BMP9의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 포함하는, 인간 BMP9가 관여하는 빈혈의 치료제.
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