KR20170128342A - 감염성 질병을 검출하기 위한 시약 및 방법 - Google Patents
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Abstract
표면 증강된 라만 산란 (SERS)-활성 시약 및 샘플에서 하나 이상의 분석물을 검출하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 SERS-활성 시약은 환자의 감염성 질병의 진단 또는 생체 시료 중의 독소, 박테리아, 바이러스, 병원체, 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체 또는 불법 약물의 검출에 맞춤가능하고 민감성이 있으며 사용이 용이하다. 이러한 방법은 경찰, 군인 또는 건강 관리자에 의해 실제로 취급될 수 있으며, 특별한 훈련은 필요하지 않다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 2월 19일 출원된 미국 가출원 제 62/118,453호, 2015년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/263,995 및 2015년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/264,088에 대한 우선권을 주장하며, 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 표면-증강된 라만 산란(SERS)을 사용하여 작용기화된 앱타머에 의해 결합된 분석물을 검출하기 위한 생성물 및 이의 방법에 관한 것이다. 시스템은 3개의 기본 파트로 구성된다: SERS-활성 표면, 앱타머, 및 앱타머에 부착된 라만-활성 마커. 작용기화된 앱타머는 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된다. 이러한 복합물이 앱타머 결합 표적(즉, 분석물)을 함유하는 시료와 접촉되는 경우, 앱타머 상의 라만-활성 마커는 SERS-활성 기질에 근접하게 되고, 라만-활성 마커의 시그니쳐 스펙트럼 특징을 갖는 강한 라만 신호를 생성한다. 각 앱타머(또는 특정 표적에 대한 앱타머 세트)에 대한 다양한 라만-활성 마커를 사용하여, 본 검정은 다중화를 위해 용이하게 맞춰질 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 한 구체예는 시료를 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 하나 이상의 표적-특이적 앱타머와 접촉시키는 것을 포함하여 상기 시료 중의 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 앱타머 (각각)는 여기에 공유적으로 부착된 라만-활성 마커를 가져서 상기 표적이 상기 하나 이상의 앱타머에 결합될 때 상기 라만-활성 마커는 라만-활성 표면에 충분히 근접하여 검출가능한 라만 신호를 발생시키는, 방법에 관한 것이다. 따라서, 표적-특이적 신호가 복합물 형성시 검출되는데 왜냐하면 라만 활성 마커가 SERS-활성 기질에 근접하게 이동되었기 때문이다. 이러한 검출 방식은 당업계에 공지된 것보다 많은 이점을 갖는다. 예를 들어, 이는 ELISA 포맷에 사용되는 것과 같은 샌드위치 검정의 복잡성을 피하고, 다른 유형의 검정에 종종 사용되는 신호 감소보다는 신호 증가를 찾는다.
본 발명은 또한 앱타머의 5' 또는 3' 말단에서, 또는 대안적으로, 앱타머의 말단의 1-10개 염기 이내에서, 또는 대안적으로 앱타머 백본에 걸친 임의의 위치에서 공유적으로 결합된 라만-활성 마커를 갖는 표적-특이적 앱타머를 제공하는데, 단 분석물의 결합은 앱타머가 입체구조 변화를 겪게 하여, 라만-활성 마커가 SERS-활성 표면에 아주 근접하게 이동해야 한다. 앱타머는 티올 연결을 통해, 또는 기타 편리한 모이어티에 의해 부착될 수 있으며, 마커는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 기타 공유 또는 비-공유 연결을 통해 혼입될 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 앱타머에 하이브리드화될 수 있는 SERS 활성 표면으로 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 말단 티올 변형에 따라 표적-특이적이다. 일부 구체예에서, 라만-활성 마커는 앱타머 백본을 따라 소정의 위치에서 앱타머에 공유적으로 컨쥬게이션된다. 일부 구체예에서, 마커는 FAM, TAMRA, Cy3, Texas-Red (TR), Cy3.5, Rhodamine 6G, Cy5 또는 기타 등등, 또는 이들의 조합물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 DNA 백본의 길이를 따라 소정의 위치에서 DNA 백본에 통합된 라만-활성 마커를 갖는 표적-특이적 DNA 앱타머와 공유적으로 또는 배위 공유적으로 결합된 SERS-활성 표면을 포함하는 물질의 조성물을 제공하며, 상기 앱타머의 이의 표적으로의 결합시, 상기 마커는 상기 SERS-활성 표면에 충분히 근접하여 여기시 상기 마커에 대한 라만 시그니쳐 스펙트럼을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기를 포함하는, 분석물을 검출하기 위한 표면 증강된 라만 분광법(SERS)-활성 시약에 관한 것이다:
(b) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (a) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (c) 하나 이상의 라만-활성 마커. 일부 구체예에서, 시약은 (c) 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
특정 구체예에서, SERS-활성 표면은 금속(비제한적으로, 은, 금, Cu, 특정 기타 전이 금속 및 질화티탄 포함), 반도체 기판(비제한적으로, 산화티탄, 산화아연, 셀렌화아연 포함) 또는 반금속(비제한적으로, 그래핀 및 이황화몰리브덴 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, SERS 활성 표면은 생체 시료 내로 도입되는 나노입자(NP)일 수 있거나, SERS 활성 물질은 NP(SERS-활성 또는 불활성)가 매립되거나 매립되지 않은 고체 지지체일 수 있다. 지지 물질은 비제한적으로, 종이, 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리디메틸 실록산(PDMS)를 포함하는 플라스틱을 포함하는 물질로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 지지 물질은 하나 또는 수개의 SERS-활성 물질로 코팅된다. 또 다른 구체예는 하나 또는 수개의 SERS-활성 물질로 코팅된 하나 또는 수개의 이러한 지지 물질로 구성된 패턴화된 표면일 것이다. 특정 구체예에서, 앱타머는 작용기화된다.
특정 구체예에서, 앱타머는 1) 티올로 작용기화되어 SERS-활성 표면에 결합되고 2) 라만-활성 마커로 작용기화되어 검출을 향상시킨다.
특정 구체예에서, 앱타머는 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된다.
특정 구체예에서, SERS-활성 표면은 하나 이상의 앱타머로 변형되지 않는다.
특정 구체예에서, 앱타머는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 및 66으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 염료 또는 형광 마커를 포함한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 형광 마커이며, 상기 형광 마커는 플루오레세인(FAM), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), Cy3, Texas-Red(TR), Cy3.5, Rhodamine 6G, Cy5, TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플로우레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 석시닐플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 및 풀러렌으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 분석물의 결합시 입체형태 변화를 겪는다.
특정 구체예에서, 앱타머는 분석물의 결합시 입체형태 변화를 겪는다.
특정 구체예에서, 분석물의 결합시 앱타머의 입체형태 변화는 라만-활성 마커가 SERS-활성 표면의 표면에 근접하게 이동하여 라만 신호의 증강을 유도한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 앱타머에 공유적으로 부착된다.
특정 구체예에서, 분석물은 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 리피드, 호르몬, 대사산물, 사이토킨, 케모킨, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약제, 영양분, 프리온, 독소, 독, 폭발물, 살충제, 화학 전쟁 약물, 바이오해저드 제제, 방사성 동위원소, 비타민, 헤테로시클릭 방향족 화합물, 발암원, 돌연변이원, 마약, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 노폐물, 남용 약물, 오염물 및 화약 잔여물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 또 다른 양태는 a) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약; b) 라만-기반 검출 시스템이 작동하고 있음을 보여주는 라만-활성 마커 대조군; c) 적어도 하나의 혈액, 혈청, 기타 유체 또는 조직 시료, 또는 실험실 제조된 양성 대조군; 및 c) 적어도 하나의 혈액, 혈청, 기타 유체 또는 조직 시료, 또는 실험실 제조된 음성 대조군을 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 키트는 샘플링 카트리지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 하나 이상의 SERS-활성 시약으로 변형되거나 변형되지 않은 것; 및 b) 라만 검출기 또는 라만 기구를 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 라만 검출기는 휴대용이다.
특정 구체예에서, 시스템은 시료 수집 장치를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 생체 시료 중 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 생체 시료를 받는 단계; b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 분석물이 앱타머와 접촉되게 하는 단계; d) 앱타머에 의해 분석물을 결합시키는 단계로서, 상기 결합은 앱타머가 입체형태 변화를 겪게하는 단계; e) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사(irradiate)하는 단계; f) 라만 신호를 검출하여 라만 스펙트럼을 생성시키는 단계; 및 g) 대조군의 기준 라만 신호와 (f)에서 검출된 라만 신호를 비교하는 단계로서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재가 결정되는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 단계 (e)의 특정 구체예에서, SERS-활성 표면이 분석물을 인지하는 앱타머에 결합된다. 단계 (g)의 특정 구체예에서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 표적 분석물의 부재하에 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재가 결정된다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
유사하게는, 본 발명은 생체 시료 중 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 생체 시료를 획득하는 단계; b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 분석물이 앱타머와 접촉되게 하는 단계; d) 앱타머에 의해 분석물을 결합시키는 단계로서, 상기 결합은 앱타머가 입체형태 변화를 겪게 하는 단계; e) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; f) 라만 신호를 검출하여 라만 스펙트럼을 발생시키는 단계; 및 g) 대조군의 기준 라만 신호와 (f)에서 검출된 라만 신호를 비교하는 단계로서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii)에서 하나 이상의 라만-활성 마커의 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 대조군과 비교하여 (f)에서 라만 스펙트럼의 라만 신호 증가가 하나 이상의 분석물의 양과 상관관계가 있다.
특정 구체예에서, 분석물의 결합시 앱타머의 입체형태 변화는 라만-활성 마커를 SERS-활성 물질에 근접하게 이동시킨다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 생체 시료 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) 대상체로부터 생체 시료를 얻는 단계; b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 생체 시료 중의 적어도 하나의 SERS 시약에 의한 분석물의 결합을 허용하는 단계로서, 상기 결합이 SERS 시약의 하나 이상의 앱타머(들)로의 입체형태 변화를 초래하는 단계; d) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; e) 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 검출하는 단계; 및 f) 대조군 대상체 (건강한 대상체)로부터 받은 생체 시료에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 기준 라만-신호와 (e)에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호가 라만-민감성 마커 피크의 위치 및/또는 강도에서 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 상기 질병이 진단되는 단계를 포함하여, 대상체에서 질병 또는 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii)에서 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
유사하게는, 본 발명은 a) 대상체로부터 생체 시료를 수득하는 단계; b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 생체 시료 중의 적어도 하나의 SERS 시약에 의한 하나 이상의 분석물의 결합을 허용하는 단계로서, 상기 결합이 SERS 시약의 하나 이상의 앱타머에 대한 입체형태 변화를 초래하는 단계; d) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; e) 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 검출하는 단계; 및 f) 대조군 대상체(건강한 대상체)로부터 받은 생체 시료에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 기준 라만 신호와 (e)에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호가 라만-민감성 마커 피크의 위치 및/또는 강도에서 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 상기 질병이 진단되는 단계를 포함하여, 대상체에서 질병 또는 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시약은 (iii)에서 하나 이상의 라만-활성 마커로 변형되거나 변형되지 않은 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 a) 대상체의 생체 시료에서 측정된 라만 신호를 수신하는 단계; b) 대조군 대상체의 생체 시료에서 측정된 기준 라만 신호를 수신하는 단계; 및 c) (b)의 기준 라만 신호와 (a)의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (a)의 상기 라만 신호가 (b)의 상기 기준 라만 신호로부터의 위치 및/또는 강도가 상이한 경우 상기 질병이 진단되는 단계를 포함하여, 대상체에서 질병 또는 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 질병 또는 장애는 감염성 질병, 증식성 질병, 신경퇴행성 질환, 암, 심리적 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 성매개 병, 위-장관 질환, 폐 질환, 심혈관 질환, 스트레스- 및 피로-관련 장애, 진균병, 병원성 질환, 및 비만-관련 장애로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 표면-증강된 라만 산란(SERS)을 이용하여 작용기화된 앱타머에 의해 결합된 분석물을 검출하기 위한 시약 및 이의 방법에 관한 것이다. 시스템은 3개 파트로 구성된다: SERS-활성 표면 또는 나노입자 (이후 SERS-활성 표면으로 불림), 앱타머, 및 앱타머에 부착된 라만-활성 마커. 작용기화된 앱타머는 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된다. 이러한 복합물이 앱타머 결합 표적 (즉, 분석물)을 함유하는 시료와 접촉되는 경우, 앱타머 상의 라만-활성 마커는 SERS-활성 기질에 근접하게 이동되고, 라만-활성 마커의 시그니쳐 특징(들)을 갖는 강한 라만 신호의 관찰을 유도한다. 이러한 검정은 각 앱타머 (또는 특정 표적에 대한 앱타머 세트)에 대한 다양한 라만-활성 마커를 사용하여 다중화에 용이하게 맞춰질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 하나 이상의 표면 증강된 라만 분광법 (SERS)-활성 표면; (b) 보렐리아(Borrelia) 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (c) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 보렐리아 종에서 하나 이상의 분석물을 검출하기 위한 SERS-활성 시약에 관한 것이다.
특정 구체예에서, SERS-활성 표면이 금속 (비제한적으로, 은, 금, Cu, 특정한 다른 전이 금속 및 질화티탄 포함), 반도체 기판 (비제한적으로, 산화티탄, 산화아연, 셀렌화아연 포함) 또는 반금속 (비제한적으로, 그래핀 및 이황화몰리브덴 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 앱타머는 작용기화된다.
특정 구체예에서, 앱타머는 작용기화되어 1) 앱타머를 SERS-활성 표면에 결합시키고, 2) 라만-활성 마커를 이용하여 검출을 향상시킨다.
특정 구체예에서, 앱타머는 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된다.
특정 구체예에서, 앱타머는 SEQ ID NO: 67-84로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 염료, 아지드, 알킨, 양자점, 탄소 나노튜브, 또는 형광 마커를 포함한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 형광 마커이며, 상기 형광 마커는 아지드, 알킨, 플루오레세인(FAM), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), Cy3, Texas-Red(TR), Cy3.5, Rhodamine 6G, Cy5, TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플로우레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 석시닐플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 및 풀러렌으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커에 컨쥬게이션된 앱타머는 분석물의 결합시 재구성을 겪는다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커에 컨쥬게이션된 앱타머는 분석물의 결합시 입체형태 변화를 겪는다.
특정 구체예에서, 분석물의 결합시 앱타머의 입체형태 변화는 라만-활성 마커가 SERS-활성 표면의 표면에 근접하게 이동하여 라만 신호의 증강을 유도한다.
특정 구체예에서, 라만-활성 마커는 앱타머에 공유적으로 부착된다.
특정 구체예에서, 분석물은 표면 단백질, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 리피드, 호르몬, 대사산물, 사이토킨, 케모킨, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약제, 영양분, 프리온, 독소, 독, 폭발물, 살충제, 화학 전쟁 약물, 바이오해저드 제제, 방사성 동위원소, 비타민, 헤테로시클릭 방향족 화합물, 발암원, 돌연변이원, 마약, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 노폐물, 남용 약물, 오염물 및 화약 잔여물로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 보렐리아의 종은 보렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii), 보렐리아 아메리카나(Borrelia americana), 보렐리아 앤더소니이(Borrelia andersonii), 보렐리아 앤세리나(Borrelia anserina), 보렐리아 발타자르디(Borrelia baltazardii), 보렐리아 바바리엔시스(Borrelia bavariensis), 보렐리아 비스셋티이(Borrelia bissettii ), 보렐리아 브라실리엔시스(Borrelia brasiliensis), 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 칼리포르니엔시스(Borrelia californiensis), 보렐리아 카롤리넨시스(Borrelia carolinensis), 보렐리아 카우카시카(Borrelia caucasica), 보렐리아 코리아세애(Borrelia coriaceae), 보렐리아 크로시두래(Borrelia crocidurae), 보렐리아 두게시이(Borrelia dugesii), 보렐리아 둣토니이(Borrelia duttonii), 보렐리아 가리니이(Borrelia garinii), 보렐리아 그레인게리(Borrelia graingeri), 보렐리아 하르베이(Borrelia harveyi), 보렐리아 헤름시이(Borrelia hermsii), 보렐리아 히스파니카(Borrelia hispanica), 보렐리아 자포니카(Borrelia japonica), 보렐리아 쿠르텐바치이(Borrelia kurtenbachii), 보렐리아 라티스체위(Borrelia latyschewii), 보렐리아 로네스타리(Borrelia lonestari), 보렐리아 루시타니애(Borrelia lusitaniae), 보렐리아 마조티이(Borrelia mazzottii), 보렐리아 메리오네시(Borrelia merionesi), 보렐리아 미크로티(Borrelia microti ), 보렐리아 미야모토이(Borrelia miyamotoi), 보렐리아 파르케리(Borrelia parkeri), 보렐리아 페르시카(Borrelia persica), 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 보렐리아 시니카(Borrelia sinica), 보렐리아 스피엘마니이(Borrelia spielmanii), 보렐리아 타누키이(Borrelia tanukii), 보렐리아 텍사센시스(Borrelia texasensis), 보렐리아 테일레리(Borrelia theileri), 보렐리아 틸래(Borrelia tillae), 보렐리아 투르시카(Borrelia turcica), 보렐리아 투르디(Borrelia turdi), 보렐리아 투리카태(Borrelia turicatae), 보렐리아 발라이시아나(Borrelia valaisiana), 보렐리아 베네주엘렌시스(Borrelia venezuelensis), 보렐리아 빈센티이(Borrelia vincentii), 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) B31, 보렐리아 버그도르페리 N40, 보렐리아 버그도르페리 JD1, 또는 보렐리아 버그도르페리 297로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약; b) 적어도 하나의 양성 대조군; 및 c) 적어도 하나의 음성 대조군을 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 하나 이상의 SERS-활성 시약; 및 b) 라만 검출기를 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 라만 검출기는 휴대용이거나 휴대용이 아니다.
특정 구체예에서, 시스템은 시료 수집 장치를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 생체 시료 중 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 생체 시료를 얻는 단계; b) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 분석물이 앱타머와 접촉되게 하는 단계; d) 앱타머에 의해 분석물을 결합시키는 단계로서, 상기 결합은 하나 이상의 앱타머(들)가 입체형태 변화를 겪게하는 단계; e) 하나 이상의 앱타머에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; f) 라만 신호를 검출하여 라만 스펙트럼을 발생시키는 단계; 및 g) 대조군의 기준 라만 신호와 (f)에서 검출된 라만 신호를 비교하는 단계로서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 라만-민감성 마커와 관련된 피크의 위치 및/또는 강도에서 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재가 결정되는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 보렐리아의 직접 검출 및/또는 항-보렐리아 항체의 검출을 허용한다.
유사하게는, 본 발명은 생체 시료 중 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 생체 시료를 얻는 단계; b) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 분석물이 앱타머와 접촉되게 하는 단계; d) 앱타머에 의해 분석물을 결합시키는 단계로서, 상기 결합은 하나 이상의 앱타머가 입체형태 변화를 겪게 하는 단계; e) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; f) 라만 신호를 검출하여 라만 스펙트럼을 발생시키는 단계; 및 g) 대조군의 기준 라만 신호와 (f)에서 검출된 라만 신호를 비교하는 단계로서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재가 결정되는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 항-보렐리아 항체의 검출과 대조적으로, 보렐리아의 직접 검출을 허용한다.
특정 구체예에서, 대조군과 비교하여 (f)의 라만 스펙트럼에서 라만 신호 증가가 하나 이상의 분석물의 양과 상관관계가 있다.
특정 구체예에서, 분석물의 결합시 앱타머의 입체형태 변화는 라만-활성 마커가 SERS-활성 나노입자의 표면에 근접하게 이동시킨다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 생체 시료 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 분석물을 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 a) 대상체로부터 생체 시료를 얻는 단계; b) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면(들); (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물에 의한 적어도 하나의 SERS 시약의 결합을 허용하는 단계로서, 상기 결합이 SERS 시약의 하나 이상의 앱타머에 대한 입체형태 변화를 초래하는 단계; d) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; e) 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 검출하는 단계; 및 f) 대조군 대상체(건강한 대상체)로부터 얻은 생체 시료에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 기준 라만 신호와 (e)에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 상기 라임병이 진단되는 단계를 포함하여, 대상체에서 라임병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 단계 (d)의 특정 구체예에서, SERS-활성 시약은 분석물을 인식하는 앱타머에 결합된다. 단계 (f)의 특정 구체예에서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호는 표적 분석물의 부재하의 라만 신호와 상이하다.
유사하게는, 본 발명은 a) 대상체로부터 생체 시료를 얻는 단계; b) (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; (ii) 보렐리아 종에서 발견된 하나 이상의 분석물로 안내된 하나 이상의 앱타머; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계; c) 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물에 의한 적어도 하나의 SERS 시약의 결합을 허용하는 단계로서, 상기 결합이 SERS 시약의 하나 이상의 앱타머에 대한 입체형태 변화를 초래하는 단계; d) 하나 이상의 앱타머에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계; e) 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 검출하는 단계; 및 f) 음성 대조군 대상체(건강한 대상체)로부터 얻은 생체 시료, 많은 음성 대조군 대상체로부터 풀링된 시료, 또는 실험실에서 제조된 음성 대조군 시료에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 기준 라만 신호와 (e)에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 상기 라임병이 진단되는 단계를 포함하여, 대상체에서 라임병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
대안적으로, 본 발명은 대상체에서 라임병을 진단하는 방법으로서, a) 대상체의 생체 시료에서 측정된 라만 신호를 수신하는 단계; b) 대조군 대상체의 생체 시료에서 측정된 기준 라만 신호를 수신하는 단계; 및 c) (b)의 기준 라만 신호와 (a)의 라만 신호를 비교하는 단계로서, (a)의 상기 라만 신호가 (b)의 상기 기준 라만 신호로부터의 위치 및/또는 강도가 상이한 경우 상기 라임병이 진단되는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내면서, 단지 예시로서 제공됨이 이해되어야 하는데, 왜냐하면 본 발명의 사상 및 범위 내에 다양한 변경 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하게 될 것이기 때문이다.
도 1은 SELEX를 사용하여 앱타머의 시험관내 진전을 보여주는 개략도를 묘사한다. 전형적으로 8-12 라운드의 선택이 단단한 결합의 높은 특이성 앱타머를 발생시키는데 이용된다. (도면 : http://sitemaker.umich.edu/ntr/aptamers)
도 2는 6개 패널을 갖는다. 패널 a는 마이크로웨이브-기반 합성 방법을 이용하여 생성된 은 NP의 흡수 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 401nm에서의 최대 플라스몬 흡수 및 60nm의 FWHM은 3주 기간에 걸쳐 Ag NP에 의해 유지된다. NP가 합성된 날의 NP (청색), 합성 후 3주에서의 동일한 NP (적색), 및 합성 후 3주에서 원심분리한 반응 혼합물에 저장된 NP (녹색)의 흡수 스펙트럼을 보여주며, 이는 관찰된 스펙트럼 특징을 유지하는 NP의 능력이 정제 방법에 의존적이지 않았음을 입증한다. 패널 b는 Ag NP의 존재 (청색) 및 부재 (적색) 하에 200 μM의 메르캅토페놀(MCP) 용액의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 별표는 시료가 건조된 실리콘 기판의 스펙트럼 기여도를 나타낸다. 패널 c는 NaCl의 첨가시 디티올 종결된 DNA-변형된 Ag NP의 흡수 스펙트럼을 묘사한다. 25 mM NaCl의 첨가는 15분 후 꾸준한 흡수를 달성하는 흡수 강도 감소를 발생시켰다. 50 mM로의 NaCl 농도 증가는 플라스몬 흡수 강도의 추가 감소를 발생시켰다. 세 번째 분취물의 첨가는 분취물의 첨가 직후 플라스몬 흡수의 거의 완전한 손실을 초래하였다. 패널 d 및 e는 디티올-변형된 DNA로의 Ag NP의 표면 변형의 스펙트럼 호출(interrogation)을 묘사한다. 패널 d는 환원제의 부재하에 DNA로 변형된 NP의 DNA-변형된 Ag NP 플라스몬 흡수의 대표적인 스펙트럼 분석을 보여준다. 스펙트럼은 25mM 증분으로 0 내지 100 mM 소듐 클로라이드 첨가의 플라스몬 흡수에 대한 효과를 따르기 위해 기록되었다. 패널 e는 디티올-종결된 DNA로 변형된 Ag NP에의 소듐 클로라이드 첨가에 따른 플라스몬 흡수 강도의 감소 비교를 보여준다. 403nm에서 플라스몬의 흡수 변화가 초기 플라스몬 흡수 강도의 분율로 제시된다. 스펙트럼을 플라스몬 흡수 강도가 초기 강도의 50% 아래로 떨어질 때 까지 수집하였다. 패널 f는 DTT 처리 후 5'-FAM, 3'-디티올 변형된 DNA의 방출 스펙트럼을 묘사한다. 환원시키는 TCEP의 존재하의 DNA (적색, 바닥) 및 환원제의 부재하의 디설파이드 DNA (청색, 상단)로 처리된 Ag NP의 DTT 처리로부터 발생한 FAM 방출 스펙트럼.
도 3는 6개 패널을 갖는다. 패널 a는 100 μM의 포타슘 니트레이트 (적색, 상단) 또는 소듐 클로라이드 (녹색) 용액의 존재하에 및 염의 부재하에 (청색, 바닥) 200 μM의 메르캅토페놀(MCP) 수용액의 라만 스펙트럼 비교를 묘사한다. 패널 b는 증가하는 라만 신호 강도에 대한 염 첨가제의 효능 비교를 묘사한다. 5'-FAM 디티올화된 DNA로 변형된 AgNP 표면의 라만 스펙트럼은, 가장 강한 스펙트럼 피쳐 생성에 있어서 KNO3의 첨가 (녹색)가 NaCl의 존재 (적색) 또는 첨가된 염의 부재 (청색) 하에서 보다 더욱 강한 스펙트럼 피쳐를 생성함을 드러낸다. DNA 변형은 50 mM NaCl의 존재하에 수행되었다. 패널 c는 메트캅토페놀 및 FAM-종결된 DNA로 구성된 혼합된 단일층으로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 바닥으로부터 상단으로 보여지는 스펙트럼은 각 스펙트럼에서 10배 크기로 감소하는 4 mM 내지 4 μM 범위의 MCP 농도로 FAM-변형된 DNA의 혼합된 단일층 및 4 μM 메르캅토페놀의 단일층을 갖는 Ag NP이다. 패널 d는 4 mM 메르캅토페놀(MCP)을 갖는 FAM-종결된 DNA의 혼합된 단일층 (상단), FAM-종결된 DNA (중간) 및 MCP (하단)로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 명확성을 위해 모든 스펙트럼을 오프셋하였다; 데이터는 632.8 nm의 입사광으로 수집하였다. 화살표의 색은 스펙트럼 피쳐의 소스와 일치한다; 적색 화살표는 MCP의 기여를 나타내며, 흑색 화살표는 FAM-종결된 DNA로부터의 기여를 나타낸다. 패널 e는 785 nm 입사광으로 수집된, 4 mM 메르캅토페놀(MCP)을 갖는 FAM-종결 DNA의 혼합된 단일층 (상단), FAM-종결 DNA (중간) 및 MCP (하단)로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 화살표는 혼합된 단일층의 성분으로부터 유도된 스펙트럼 피쳐를 나타낸다. 305 cm-1, 714 cm-1 및 1050 cm-1에서의 피쳐는 디티올-변형된 DNA의 5'-말단에서 발견된 FAM 염료로부터 유래된 반면, 393 cm-1, 636 cm-1, 1010 cm-1, 1080 cm-1 및 1175 cm-1에서의 피쳐는 MCP 단일층에 의해 기여된다. 패널 f는 혼합된 단일층 Ag NP 상에서 MCP 및 FAM의 스펙트럼 강도에 대한 MCP 및 MCH의 농도 효과의 비교를 묘사한다. 두 농도의 MCP에서 MCP 유래 피쳐 (1076 cm-1; 적색 및 보라색) 및 FAM-유래 피쳐 (1050 cm-1; 청색 및 녹색)의 관찰된 스펙트럼 강도가 도시된다. 혼합된 단일층의 두 성분의 스펙트럼 강도는 40 μM MCP (청색 및 적색), 및 4 μM MCP (녹색 및 보라색)로 수집되었다.
도 4는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 TAMRA-함유 바소프레신-표적화된 앱타머로 변형된 Ag NP가 구조적으로 관련된 단백질인 옥시토신 및 물질 P에 대항하는 바소프레신에 대한 선택성을 입증함을 묘사한다. 선형 상관관계가 바소프레신 (R2: 0.99)으로 관찰된 반면, 물질 P (R2: 0.63)와 옥시토신 (R2: 0.19) 간의 상호작용은 농도와 스펙트럼 강도 간의 선형 상관관계를 발생시키지 않았다. 패널 b는 TAMRA-함유 바소프레신-표적화된 앱타머로 변형된 Ag NP의 단일층 조성의 비교를 묘사한다. 바소프레신-표적화된 앱타머 단독으로의 또는 40 μM MCP (R2: 각각 0.99 및 0.96)와 함께 Ag NP 표면의 변형은 바소프레신 농도와 스펙트럼 피쳐 강도 간의 선형 상관관계를 발생시켰다. 이에 반해, 바소프레신-표적화 앱타머 및 4M MCH로 변형된 NP는 선형 상관관계를 발생시키지 않았다 (R2: 0.03).
도 5는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 마이크로웨이브-기반 합성 방법을 사용하여 생성된 은 NP의 흡수 스펙트럼을 묘사하며, 여기에서 용액은 30초에 걸쳐 120℃로 가열되고, 이 온도에서 30, 60 및 90초 동안 유지되었다. 생성된 NP는 유리하게는 문헌의 스펙트럼과 비교하여 우수한 스펙트럼 특징 (401 nm; FWHM=60 nm)을 나타낸다. 패널 b는 문헌 [Leona, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009, 106, 14757]으로부터의 마이크로웨이브 합성된 Ag NP의 예시적인 흡수 스펙트럼을 묘사한다.
도 6는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 인간 혈액으로부터 보렐리아 버그도르페리의 SERS-기반 검출의 개략적 대표도를 묘사한다. 혈액, 혈청 또는 혈장의 드롭(drop)이 B. 버그도르페리-특이적 단백질의 검출에 직접 사용된다. 혈액, 혈청 또는 혈장은 앱타머 코팅된 SERS-활성 표면에 노출되고, 여과되고, 라만 분광법에 의해 호출된다. 스펙트럼은 작은 도구로 분석되며 결과는 30분 내에 입수가능하다. 패널 b는 익소데스 스카풀라리스(Ixodes scapularis) 약충의 보렐리아 버그도르페리의 제안된 SERS-기반 검출의 개략적 대표도를 묘사한다. 블랙레그드 진드기(Blacklegged tick) 약충을 수집하고 세포 용해한다. 균질물을 앱타머 코팅된 나노입자와 혼합하고, 라만 분광법에 의해 호출한다. 스펙트럼은 휴대용 도구로 분석되며 결과는 20분 내에 입수가능하다.
도 7은 마이크로-칼럼의 사용에 의해 다중 표적에 대한 앱타머 선택 작업흐름을 묘사하는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 10 μL의 GFP-고정화된 수지로 충전된 마이크로-칼럼을 보여준다. 패널 b는 RNA 앱타머의 다중화된 선택을 보여준다. 점선 화살표로 나타낸 단계는 선택적이며, 각 라운드에서 반드시 수행할 필요는 없다. (Szeto, K. et al. PLoS ONE 2013, 8, e82667).
도 8은 B. 버그도르페리 OspA 단백질에 대한 OspA 앱타머 (SEQ ID NO: 4)의 높은 친화성 결합을 묘사한다. 결합에 대한 Kd는 형광 이방성에 의해 측정된 바와 같이 대략 2.2 nM이다.
도 9는 개략적 대표도 (패널 a) 및 생물학적 표적의 검출을 위한 라만-활성 마커 변형된 앱타머의 원리의 입증 (패널 b)을 묘사하는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 표적 분석물 (적색원으로 표시됨)에 노출 시 라만 활성 염료 (청색 원으로 표시됨)가 라만 기질 표면 (황색 블록으로 표시됨)에 근접하게 이동됨을 보여준다. 염료 및 SERS 기질의 근접성은 고강도 SERS 신호를 발생시키며 이는 4개의 표적 분석물의 검출을 용이하게 한다 (문헌 [Baker, B. R. et al. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3138]으로부터 유래된 도면). 패널 b는 본 발명자들이 바소프레신-표적화 앱타머를 라만 활성 염료 TAMRA로 변형시킨 원리를 입증하는 스펙트럼을 묘사한다. TAMRA 라만 신호의 강도는 표적 분자 바소프레신의 농도에 따라 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 생물학적 표적의 검출에서 라만-활성 염료-변형된 앱타머의 효능을 입증한다.
도 10은 다중 검출에서 사용될 라만-활성 염료의 라만 스펙트럼을 묘사한다. 각각의 염료는 4가지 표적 분석물 각각에 대한 대용물로서 작용하고, 다른 염료를 함유하는 시료의 스펙트럼에서 이들의 식별을 가능하게 하는 스펙트럼 피쳐를 가지며, 타액 또는 기타 생물학적 기질에서 분석물 검출을 용이하게 한다. (Cao, Y. C. et al. Science 2002, 297, 1536).
도 2는 6개 패널을 갖는다. 패널 a는 마이크로웨이브-기반 합성 방법을 이용하여 생성된 은 NP의 흡수 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 401nm에서의 최대 플라스몬 흡수 및 60nm의 FWHM은 3주 기간에 걸쳐 Ag NP에 의해 유지된다. NP가 합성된 날의 NP (청색), 합성 후 3주에서의 동일한 NP (적색), 및 합성 후 3주에서 원심분리한 반응 혼합물에 저장된 NP (녹색)의 흡수 스펙트럼을 보여주며, 이는 관찰된 스펙트럼 특징을 유지하는 NP의 능력이 정제 방법에 의존적이지 않았음을 입증한다. 패널 b는 Ag NP의 존재 (청색) 및 부재 (적색) 하에 200 μM의 메르캅토페놀(MCP) 용액의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 별표는 시료가 건조된 실리콘 기판의 스펙트럼 기여도를 나타낸다. 패널 c는 NaCl의 첨가시 디티올 종결된 DNA-변형된 Ag NP의 흡수 스펙트럼을 묘사한다. 25 mM NaCl의 첨가는 15분 후 꾸준한 흡수를 달성하는 흡수 강도 감소를 발생시켰다. 50 mM로의 NaCl 농도 증가는 플라스몬 흡수 강도의 추가 감소를 발생시켰다. 세 번째 분취물의 첨가는 분취물의 첨가 직후 플라스몬 흡수의 거의 완전한 손실을 초래하였다. 패널 d 및 e는 디티올-변형된 DNA로의 Ag NP의 표면 변형의 스펙트럼 호출(interrogation)을 묘사한다. 패널 d는 환원제의 부재하에 DNA로 변형된 NP의 DNA-변형된 Ag NP 플라스몬 흡수의 대표적인 스펙트럼 분석을 보여준다. 스펙트럼은 25mM 증분으로 0 내지 100 mM 소듐 클로라이드 첨가의 플라스몬 흡수에 대한 효과를 따르기 위해 기록되었다. 패널 e는 디티올-종결된 DNA로 변형된 Ag NP에의 소듐 클로라이드 첨가에 따른 플라스몬 흡수 강도의 감소 비교를 보여준다. 403nm에서 플라스몬의 흡수 변화가 초기 플라스몬 흡수 강도의 분율로 제시된다. 스펙트럼을 플라스몬 흡수 강도가 초기 강도의 50% 아래로 떨어질 때 까지 수집하였다. 패널 f는 DTT 처리 후 5'-FAM, 3'-디티올 변형된 DNA의 방출 스펙트럼을 묘사한다. 환원시키는 TCEP의 존재하의 DNA (적색, 바닥) 및 환원제의 부재하의 디설파이드 DNA (청색, 상단)로 처리된 Ag NP의 DTT 처리로부터 발생한 FAM 방출 스펙트럼.
도 3는 6개 패널을 갖는다. 패널 a는 100 μM의 포타슘 니트레이트 (적색, 상단) 또는 소듐 클로라이드 (녹색) 용액의 존재하에 및 염의 부재하에 (청색, 바닥) 200 μM의 메르캅토페놀(MCP) 수용액의 라만 스펙트럼 비교를 묘사한다. 패널 b는 증가하는 라만 신호 강도에 대한 염 첨가제의 효능 비교를 묘사한다. 5'-FAM 디티올화된 DNA로 변형된 AgNP 표면의 라만 스펙트럼은, 가장 강한 스펙트럼 피쳐 생성에 있어서 KNO3의 첨가 (녹색)가 NaCl의 존재 (적색) 또는 첨가된 염의 부재 (청색) 하에서 보다 더욱 강한 스펙트럼 피쳐를 생성함을 드러낸다. DNA 변형은 50 mM NaCl의 존재하에 수행되었다. 패널 c는 메트캅토페놀 및 FAM-종결된 DNA로 구성된 혼합된 단일층으로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 바닥으로부터 상단으로 보여지는 스펙트럼은 각 스펙트럼에서 10배 크기로 감소하는 4 mM 내지 4 μM 범위의 MCP 농도로 FAM-변형된 DNA의 혼합된 단일층 및 4 μM 메르캅토페놀의 단일층을 갖는 Ag NP이다. 패널 d는 4 mM 메르캅토페놀(MCP)을 갖는 FAM-종결된 DNA의 혼합된 단일층 (상단), FAM-종결된 DNA (중간) 및 MCP (하단)로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 명확성을 위해 모든 스펙트럼을 오프셋하였다; 데이터는 632.8 nm의 입사광으로 수집하였다. 화살표의 색은 스펙트럼 피쳐의 소스와 일치한다; 적색 화살표는 MCP의 기여를 나타내며, 흑색 화살표는 FAM-종결된 DNA로부터의 기여를 나타낸다. 패널 e는 785 nm 입사광으로 수집된, 4 mM 메르캅토페놀(MCP)을 갖는 FAM-종결 DNA의 혼합된 단일층 (상단), FAM-종결 DNA (중간) 및 MCP (하단)로 변형된 Ag NP의 라만 스펙트럼의 비교를 묘사한다. 화살표는 혼합된 단일층의 성분으로부터 유도된 스펙트럼 피쳐를 나타낸다. 305 cm-1, 714 cm-1 및 1050 cm-1에서의 피쳐는 디티올-변형된 DNA의 5'-말단에서 발견된 FAM 염료로부터 유래된 반면, 393 cm-1, 636 cm-1, 1010 cm-1, 1080 cm-1 및 1175 cm-1에서의 피쳐는 MCP 단일층에 의해 기여된다. 패널 f는 혼합된 단일층 Ag NP 상에서 MCP 및 FAM의 스펙트럼 강도에 대한 MCP 및 MCH의 농도 효과의 비교를 묘사한다. 두 농도의 MCP에서 MCP 유래 피쳐 (1076 cm-1; 적색 및 보라색) 및 FAM-유래 피쳐 (1050 cm-1; 청색 및 녹색)의 관찰된 스펙트럼 강도가 도시된다. 혼합된 단일층의 두 성분의 스펙트럼 강도는 40 μM MCP (청색 및 적색), 및 4 μM MCP (녹색 및 보라색)로 수집되었다.
도 4는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 TAMRA-함유 바소프레신-표적화된 앱타머로 변형된 Ag NP가 구조적으로 관련된 단백질인 옥시토신 및 물질 P에 대항하는 바소프레신에 대한 선택성을 입증함을 묘사한다. 선형 상관관계가 바소프레신 (R2: 0.99)으로 관찰된 반면, 물질 P (R2: 0.63)와 옥시토신 (R2: 0.19) 간의 상호작용은 농도와 스펙트럼 강도 간의 선형 상관관계를 발생시키지 않았다. 패널 b는 TAMRA-함유 바소프레신-표적화된 앱타머로 변형된 Ag NP의 단일층 조성의 비교를 묘사한다. 바소프레신-표적화된 앱타머 단독으로의 또는 40 μM MCP (R2: 각각 0.99 및 0.96)와 함께 Ag NP 표면의 변형은 바소프레신 농도와 스펙트럼 피쳐 강도 간의 선형 상관관계를 발생시켰다. 이에 반해, 바소프레신-표적화 앱타머 및 4M MCH로 변형된 NP는 선형 상관관계를 발생시키지 않았다 (R2: 0.03).
도 5는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 마이크로웨이브-기반 합성 방법을 사용하여 생성된 은 NP의 흡수 스펙트럼을 묘사하며, 여기에서 용액은 30초에 걸쳐 120℃로 가열되고, 이 온도에서 30, 60 및 90초 동안 유지되었다. 생성된 NP는 유리하게는 문헌의 스펙트럼과 비교하여 우수한 스펙트럼 특징 (401 nm; FWHM=60 nm)을 나타낸다. 패널 b는 문헌 [Leona, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009, 106, 14757]으로부터의 마이크로웨이브 합성된 Ag NP의 예시적인 흡수 스펙트럼을 묘사한다.
도 6는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 인간 혈액으로부터 보렐리아 버그도르페리의 SERS-기반 검출의 개략적 대표도를 묘사한다. 혈액, 혈청 또는 혈장의 드롭(drop)이 B. 버그도르페리-특이적 단백질의 검출에 직접 사용된다. 혈액, 혈청 또는 혈장은 앱타머 코팅된 SERS-활성 표면에 노출되고, 여과되고, 라만 분광법에 의해 호출된다. 스펙트럼은 작은 도구로 분석되며 결과는 30분 내에 입수가능하다. 패널 b는 익소데스 스카풀라리스(Ixodes scapularis) 약충의 보렐리아 버그도르페리의 제안된 SERS-기반 검출의 개략적 대표도를 묘사한다. 블랙레그드 진드기(Blacklegged tick) 약충을 수집하고 세포 용해한다. 균질물을 앱타머 코팅된 나노입자와 혼합하고, 라만 분광법에 의해 호출한다. 스펙트럼은 휴대용 도구로 분석되며 결과는 20분 내에 입수가능하다.
도 7은 마이크로-칼럼의 사용에 의해 다중 표적에 대한 앱타머 선택 작업흐름을 묘사하는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 10 μL의 GFP-고정화된 수지로 충전된 마이크로-칼럼을 보여준다. 패널 b는 RNA 앱타머의 다중화된 선택을 보여준다. 점선 화살표로 나타낸 단계는 선택적이며, 각 라운드에서 반드시 수행할 필요는 없다. (Szeto, K. et al. PLoS ONE 2013, 8, e82667).
도 8은 B. 버그도르페리 OspA 단백질에 대한 OspA 앱타머 (SEQ ID NO: 4)의 높은 친화성 결합을 묘사한다. 결합에 대한 Kd는 형광 이방성에 의해 측정된 바와 같이 대략 2.2 nM이다.
도 9는 개략적 대표도 (패널 a) 및 생물학적 표적의 검출을 위한 라만-활성 마커 변형된 앱타머의 원리의 입증 (패널 b)을 묘사하는 2개의 패널을 갖는다. 패널 a는 표적 분석물 (적색원으로 표시됨)에 노출 시 라만 활성 염료 (청색 원으로 표시됨)가 라만 기질 표면 (황색 블록으로 표시됨)에 근접하게 이동됨을 보여준다. 염료 및 SERS 기질의 근접성은 고강도 SERS 신호를 발생시키며 이는 4개의 표적 분석물의 검출을 용이하게 한다 (문헌 [Baker, B. R. et al. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3138]으로부터 유래된 도면). 패널 b는 본 발명자들이 바소프레신-표적화 앱타머를 라만 활성 염료 TAMRA로 변형시킨 원리를 입증하는 스펙트럼을 묘사한다. TAMRA 라만 신호의 강도는 표적 분자 바소프레신의 농도에 따라 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 생물학적 표적의 검출에서 라만-활성 염료-변형된 앱타머의 효능을 입증한다.
도 10은 다중 검출에서 사용될 라만-활성 염료의 라만 스펙트럼을 묘사한다. 각각의 염료는 4가지 표적 분석물 각각에 대한 대용물로서 작용하고, 다른 염료를 함유하는 시료의 스펙트럼에서 이들의 식별을 가능하게 하는 스펙트럼 피쳐를 가지며, 타액 또는 기타 생물학적 기질에서 분석물 검출을 용이하게 한다. (Cao, Y. C. et al. Science 2002, 297, 1536).
A. 정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모았다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수 정관사는 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 정관사의 문법적 대상을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
B. 나노입자 및 기타
SERS
활성 기질 물질
SERS-활성 나노입자는 본 발명의 라만-활성 표면을 제공하는데 사용되며 당업계에 공지되어 있다. 기타 SERS-활성 물질-코팅된 표면, 금속-코팅된 표면, 또는 매립된 SERS-활성 나노입자를 갖는 표면이 본 발명에 고려된다. SERS-활성 나노입자는 비제한적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0134997에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 은 (Ag) 나노입자는 AgNO3의 마이크로웨이브-기반 환원을 이용하여 또는 당업자에게 공지된 임의의 수의 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 은 및 금 나노입자가 또한 공지되어 있으며, 사용되며, 상업적으로 또는 합성적으로 수득될 수 있으며, 본 방법에 사용하기에 적합하다. 나노입자 이외에, 비제한적으로, 라만 활성을 위한 금속으로 코팅된 코어 쉘, 중공 또는 Si 비드, 또는 적절한 지지체 상의 금속, 반도체 또는 반-금속으로 구성된 기타 SERS 활성 기질, 또는 매립된 NP를 가질 수 있거나 가질 수 없는 SERS-활성 물질로 코팅된 폴리머 표면을 포함하는 기타 SERS 활성 기질이 사용될 있다. Wang, W.; et al., Appl. Phys. Lett. 106, 2015, 211604.
특정 구체예에서, SERS 활성 NP는 자유로울 수 있으며 생체 시료 내로 도입될 수 있거나, SERS 활성 물질은 NP (SERS-활성 또는 불활성)가 매립된 고체 지지체일 수 있다. 지지 물질은 비제한적으로, 종이, 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리디멘틸 실록산 (PDMS) 또는 기타 폴리머 물질을 포함하는 플라스틱을 포함하는 물질로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 지지 물질은 하나 또는 수개의 SERS-활성 물질로 코팅된다. 또 다른 구체예는 하나 또는 수개의 SERS-활성 물질로 코팅된 이러한 지지 물질 중 하나 또는 수개로 구성된 패턴화된 표면일 수 있다 (Wang, W.; et al., Appl. Phys. Lett. 106, 2015, 211604).
앱타머가 SERS 활성 물질로 부착되는 경우, 앱타머는 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. DNA 앱타머는 티올로 변형될 수 있다. 공유, 부여 또는 배위 공유 부착에 있어서, 표면 또는 SERS-활성 기질은 DNA 또는 RNA 앱타머 또는 올리고뉴클레오티드, 전형적으로, 티올을 부착시키기에 적합한 다양한 반응기를 함유하도록 변형될 수 있으나, 당업계에 공지된 임의의 기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 캡핑 시약 예컨대, 디하이드로리포산은 라만-활성 표면에 공유적으로 부착될 수 있으며, 아민-종결된 DNA 앱타머는 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)를 갖는 카르복실산 컨쥬게이션에 대한 표준 아민을 사용하여 나노입자에 공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유 앱타머 부착에 있어서, 바코드 DNA, 보편적 프라이머 또는 DNA (또는 RNA)의 기타 결합 특이적 서열 즉, 포획 올리고는 나노입자 또는 SERS-활성 표면에 부착될 수 있다. 이러한 포획 올리고는 포획 올리고의 상보적 서열을 갖는 표적-특이적 앱타머와 하이브리드화된다 (전형적으로, 라만 활성 마커로부터 반대 말단에 근접하거나 현저하게 거리를 둠).
C.
앱타머
앱타머는 단일-가닥 핵산 (DNA 또는 RNA) 분자이며, 전형적으로, 그러나 항상 그렇지는 않지만, 100개 염기 미만의 길이이며, 높은 친화성 및 특이성을 갖는 기타 분자에 결합하는 능력을 갖는다. 앱타머는 예를 들어, 지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화 (Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) (SELEX; 도 1)로 불리는 공정에 의해 무작위 올리고뉴클레오티드 풀을 사용하여 예를 들어, 시험관내 진화 공정을 사용하여 생성될 수 있다. SELEX 공정은 높은 특이성 및 친화성을 갖는 특이적 표적과 상호작용할 수 있는 독특한 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 이러한 작은 올리고뉴클레오티드의 능력에 의해 제어된다. 앱타머는 금속 이온1, 소분자 예컨대, 유기 염료2 및 아미노산3, 의학적 관련 분자 예컨대, 항생제4 및 펩티드5, 및 생물학적 관련 분자 예컨대, 단백질6 ,7, 전세포, 바이러스 및 바이러스-감염된 세포8, 및 박테리아9 , 10를 포함하는 광범위한 표적에 대하여 발생될 수 있다. 일단 특정 앱타머 또는 앱타머 세트에 대한 서열이 알려지면, 앱타머는 올리고뉴클레오티드에 대해 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 또는 합성 또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 옥시토신, 바소프레신, 기타 호르몬, 감염성 질병 제제, 및 질병 마커 단백질에 결합하는 앱타머가 특히 흥미롭다.
또한, 앱타머는 불법 약물 예컨대, 비제한적으로, 칸나비노이드(cannabinoid)/칸나비스(Cannabis)/마리주아나(Marijuana) (Δ9-테트라하이드로칸나비놀(Tetrahydrocannabinol), THC), 합성 칸나비노이드, 카리소프로돌(Carisoprodol) (및 메프로바메이트(Meprobamate)), 코카인(Cocaine) (메틸벤조일크고닌(Methylbenzoylecgonine)), 덱스트로메토르판(Dextromethorphan), 디페닐하이드라민(Diphenhydramine), 감마-하이드록시부티레이트(Gamma-Hydroxybutyrate) (GHB, GBL, 및 1,4-BD), 케타민(Ketamine), 리세르그산 디에틸아미드 (LSD), 부프레노르핀 (수부텍스(subutex)), 메타돈(Methadone), 메탐페타민(Methamphetamine), 암페타민(Amphetamine), 메틸렌디옥시메탐페타민(Methylenedioxymethamphetamine) (MDMA, 엑스타시(Ecstasy)), 바르비투레이트(barbiturate), 벤조디아제핀, 오피에이트(opiate) (옥시코돈(Oxycodone), 프로폭시펜, 몰핀(Morphine) 및 헤로인(Heroin)), 또는 펜시클리딘(Phencyclidine) (PCP)에 결합될 수 있다.
본 발명의 앱타머는 진단 및 예후 적용분야 예컨대, 지속적인 감염성 질병, 증식성 질병, 신경퇴행성 질환, 암, 심리적 질환, 대사성 질환, 자가면역 질환, 성매개병, 위장관 질환, 폐 질환, 심혈관 질환, 스트레스- 및 피로-관련 장애, 진균병, 병원성 질환, 비만-관련 장애, 또는 이에 대한 바이오마커를 진단하는데 유용하다. 바이러스 감염성 질병은 인간 파필로마 바이러스 (HPV), A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 레트로바이러스 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1 및 HIV-2), 헤르페스 바이러스 예컨대, 엡스테인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus) (EBV), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) (CMV), HSV-1 및 HSV-2, 인플루엔자 바이러스, A형 및 B형 간염, FIV, 렌티바이러스(lentiviruses), 페스티바이러스(pestiviruses), 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 홍역, 마마, 우두, 에볼라, 코로나바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 포테이토 S 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40), 마우스 유암 바이러스 (Mouse Mammary Tumor Virus) (MMTV) 프로모터, 몰로니 바이러스(Moloney virus), ALV, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) (CMV), 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus) (EBV), 또는 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus) (RSV)를 포함한다. 본 발명의 앱타머는 병원체 예컨대, 말라리아와 같은 다양한 기생충과 관련된 항원, 항체, 또는 기타 분석물을 검출할 수 있다. 또한, 박테리아, 진균 및 기타 병원성 질환 예컨대, 아스퍼길루스(Aspergillus), 브루기아(Brugia), 캔디다(Candida), 치쿤구니아(Chikungunya), 클라미디아(Chlamydia), 콕시디아(Coccidia), 크립토코커스(Cryptococcus), 덴귀(Dengue), 디로필라리아(Dirofilaria), 고노콕커스(Gonococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 레이쉬마니아(Leishmania), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 파라메시움(Paramecium), 페르투시스(Pertussis), 플라스모디움(Plasmodium), 뉴모콕커스(Pneumococcus), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 아노펠레스 모스퀴토 벡터(Anopheles mosquito vector)에서 P. 비박스(P. vivax), 리켓시아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 톡소플라스마(Toxoplasma) 및 비브리오콜레라(Vibriocholerae)가 포함된다. 예시적 종은 나이세리아 고노르헤(Neisseria gonorrhea), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 캔디다 알비칸(Candida albican), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 해모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 그룹 B 스트렙토코커스 종(Group B Streptococcus sp.), 마크로플라스마 호미니스(Microplasma hominis), 헤모필루스 두크레이(Hemophilus ducreyi), 그라눌로마 인구이날레(Granuloma inguinale), 림포파티아 베네레움(Lymphopathia venereum), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 페투스 인테스티날리스(Campylobacter fetus intestinalis), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 리스테리아 모노사이토겐(Listeria monocytogenes), 브루셀라 오비스(Brucella ovis), 클라미디아 프싯타시(Chlamydia psittaci), 트리코모나스 포에투스(Trichomonas foetus), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 악티노바실러스 에퀼리(Actinobacillus equuli), 살모넬라 아보르투스 오비스(Salmonella abortus ovis), 살모넬라 아보르투스 에퀴(Salmonella abortus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi), 코리네박테리움 피오게네스(Corynebacterium pyogenes), 악티노바실러스 세미니스(Actinobaccilus seminis), 마이코플라스마 보비게니탈륨(Mycoplasma bovigenitalium), 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 압시디아 라모사(Absidia ramosa), 트리파노소마 에퀴페르둠(Trypanosoma equiperdum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum); 또는 진균류 예컨대, 예를 들어, 파라콕시디오아이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis); 또는 기타 병원체 예를 들어, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)을 포함한다. 또한 국립 알레르기 및 전염병 (NIAID) 우선 병원체도 포함된다. 이들은 카테고리 A 제제 예컨대, 대두창 (마마), 탄저균 (탄저병), 페스트균 (흑사병), 클로스트리듐 보톨리늄 톡신 (Clostridium botulinum toxin)(보툴리늄 중독증), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(야생토끼병), 필로바이러스(filoviruses) (에볼라 출혈열, 마르부르크 출혈열), 아레나바이러스 (라싸(Lassa) (라싸열), 후닌(Junin) (아르헨티나 출혈열) 및 관련 바이러스); 카테고리 B 제제 예컨대, 콕시엘라 부르넷티(Coxiella burnetti) (큐열), 브루셀라 종 (브루셀라병), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei) (비저), 알파바이러스 (베네주엘라 뇌염바이러스(Venezuelan encephalomyelitis), 동부 및 서부 말 뇌염 척수염(eastern & western equine encephalomyelitis)), 피마자(Ricinus communis) (아주까리씨)로부터의 리신 독소, 클로스트리듐 퍼프린겐(Clostridium perfringen)의 엡실론 독소; 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B), 살모넬라 종(Salmonella species), 쉬겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 에스체리치아 콜라이 균주 O157:H7, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum); 카테고리 C 제제 예컨대, 니파 바이러스(nipah virus), 한타바이러스(hantaviruses), 애데스 모기 (Aedes mosquitoes)에서 황열, 및 다중약-내성 투베르쿨로시스(tuberculosis); 기생충(helminths), 예컨대, 쉬스토소마 (Schistosoma) 및 태니아(Taenia); 및 원생동물 예컨대, 샌드 플라이에서 레이쉬마니아(Leishmania) (예를들어, L. 멕시카나(L. mexicana)), 플라스모듐(Plasmodium), 침노린재에서 샤가스병 (Chagas disease)을 포함한다.
박테리아 병원체는 비제한적으로, 예컨대, 박테리아 병원성 그람-양성 콕커스를 포함하며, 이는 비제한적으로, 뉴모콕커스; 스타필로콕커스; 및 스트렙토콕커스를 포함한다. 병원성 그람-음성 콕커스는 메닌고콕커스; 및 고노콕커스를 포함한다. 병원성 장내 그람-음성 바실러스는 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae); 슈도모나스(pseudomonas), 아시네토박테리아(acinetobacteria) 및 에이케넬라(eikenella); 멜리오아이도시스(melioidosis); 살모넬라(salmonella); 쉬겔로시스(shigellosis); 헤모필루스(hemophilus); 찬크로이드(chancroid); 브루셀로시스(brucellosis); 툴라레미아(tularemia); 예르시니아(yersinia) (파스테우렐라(pasteurella)); 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(streptobacillus moniliformis) 및 스피릴룸(spirilum); 리스테리아 모노사이토게네스(listeria monocytogenes); 에리시펠로트릭스 루시오파티애(erysipelothrix rhusiopathiae); 디프테리아(diphtheria); 콜레라(cholera); 안트락스(anthrax); 및 도노바노시스(donovanosis) (그라눌로마 인구이날레(granuloma inguinale))를 포함한다. 병원성 혐기성 박테리아는 테타누스(tetanus); 보툴리슴(botulism); 기타 클로스트리디아(clostridia); 투베르쿨로시스(tuberculosis); 레프로시(leprosy); 및 기타 마이코박테리아(mycobacteria)를 포함한다. 병원성 스피로헤타병(spirochetal disease)은 매독, 트레포네마병: 요스, 핀타, 지방유행성 매독; 및 렙토시피라증을 포함한다. 고병원성 박테리아 및 병원성 진균류에 의해 초래된 기타 감염은 바퀴살균증(actinomycosis); 노카르디아증(nocardiosis); 크립토콕커스증(cryptococcosis), 분아균증(blastomycosis), 히스토플라스마증(histoplasmosis) 및 콕시디오이데스진균증(coccidioidomycosis); 캔디다증(candidiasis), 아스페르길루스증(aspergillosis), 및 털곰팡이증(mucormycosis); 스포로트릭스증(sporotrichosis); 파라콕시디오이데스진균증(paracoccidiodomycosis), 페트리엘리듐증(petriellidiosis), 토룰롭시스증(torulopsosis), 균종(mycetoma) 및 색조진균증(chromomycosis); 및 백선증(dermatophytosis)을 포함한다. 리케차 감염은 리케차(rickettsial) 및 리케차병(rickettsioses)을 포함한다. 마이코플라스마 및 클라미디아 감염의 예는 마이코플라스마 뉴모니애(mycoplasma pneumoniae); 성병림프육아종(lymphogranuloma venereum); 앵무새병(psittacosis); 및 주산기 클라미디아 감염을 포함한다. 병원성 원충 및 기생충 및 이에 의한 감염 진핵생물은 아메바증(amebiasis); 말라리아(malaria); 리슈만편모충증(leishmaniasis); 파동편모충증(trypanosomiasis); 톡소포자충증(toxoplasmosis); 쥐폐포자충(pneumocystis carinii); 편모충증(giardiasis); 선모충증(trichinosis); 사상충증(filariasis); 주혈흡충증(schistosomiasis); 선충(nematodes); 흡충(trematodes) 또는 흡충류(flukes); 및 촌충류(cestode) (촌충(tapeworm)) 감염을 포함한다.
본 발명의 앱타머는 지속적인 감염성 질병을 검출하는 것과 같은 진단 및 예후 용도에 유용하다. 특정 구체예에서, 앱타머는 핑거 스틱 또는 표준 혈액 추출로부터 취해진 인간 혈액, 혈청 또는 혈장을 사용하여 인간에서 B. 버그도르페리 감염과 같은 보렐리아 과의 종에 의해 초래된 감염을 검출할 수 있다. 또한, 앱타머는 라임 및 기타 진드기-전달 병원체 예컨대, 바베시아(Babesia), 에르리치아(Ehrlichia), 아나플라스마(Anaplasma), 바르토넬라(Bartonella), 및 기타 출현 진드기 전달 병원체 예컨대, 보렐리아 미야모토이(Borrelia miyamotoi), 반점열(spotted fevers), 및 파와산 바이러스(Powassan virus)를 검출할 수 있다. 앱타머는 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii), 보렐리아 아메리카나(Borrelia americana), 보렐리아 앤더소니이(Borrelia andersonii), 보렐리아 앤세리나 (Borrelia anserina), 보렐리아 발타자르디(Borrelia baltazardii), 보렐리아 바바리엔시스(Borrelia bavariensis), 보렐리아 비스셋티이(Borrelia bissettii), 보렐리아 브라실리엔시스(Borrelia brasiliensis), 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 칼리포르니엔시스(Borrelia californiensis), 보렐리아 카롤리넨시스(Borrelia carolinensis), 보렐리아 카우카시카(Borrelia caucasica), 보렐리아 코리아세애(Borrelia coriaceae), 보렐리아 크로시두래(Borrelia crocidurae), 보렐리아 두게시이(Borrelia dugesii), 보렐리아 둣토니이(Borrelia duttonii), 보렐리아 가리니이(Borrelia garinii), 보렐리아 그레인게리(Borrelia graingeri), 보렐리아 하베이(Borrelia harveyi), 보렐리아 헤름시이(Borrelia hermsii), 보렐리아 히스파니카(Borrelia hispanica), 보렐리아 자포니카(Borrelia japonica), 보렐리아 쿠르텐바치이(Borrelia kurtenbachii), 보렐리아 라티스체위(Borrelia latyschewii), 보렐리아 로네스타리(Borrelia lonestari), 보렐리아 루시타니애(Borrelia lusitaniae), 보렐리아 마조티이(Borrelia mazzottii), 보렐리아 메리오네시(Borrelia merionesi), 보렐리아 미크로티(Borrelia microti), 보렐리아 미야모토이(Borrelia miyamotoi), 보렐리아 파르케리(Borrelia parkeri), 보렐리아 퍼시카(Borrelia persica), 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 보렐리아 시니카(Borrelia sinica), 보렐리아 스피엘마니이(Borrelia spielmanii), 보렐리아 타누키이(Borrelia tanukii), 보렐리아 텍사센시스(Borrelia texasensis), 보렐리아 테일레리(Borrelia theileri), 보렐리아 틸래(Borrelia tillae), 보렐리아 투르시카(Borrelia turcica), 보렐리아 투르디(Borrelia turdi), 보렐리아 투리카태(Borrelia turicatae), 보렐리아 발라이시아나(Borrelia valaisiana), 보렐리아 베네주엘렌시스(Borrelia venezuelensis), 보렐리아 빈센티이(Borrelia vincentii), 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) B31, 보렐리아 버그도르페리 N40, 보렐리아 버그도르페리 JD1, 또는 보렐리아 버그도르페리 297을 검출하는데 사용될 수 있다. 보렐리아 종은 익소데스 스카풀라리스 진드기에서 발견될 수 있다.
"바베시아(Babesia)"는 비제한적으로, 바베시아 비게미나(Babesia bigemina), 바베시아 보비스(Babesia bovis), 바베시아 카니스(Babesia canis), 바베시아 카티(Babesia cati), 바베시아 디베르겐스(Babesia divergens), 바베시아 둔카니(Babesia duncani), 바베시아 펠리스(Babesia felis), 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 헤르파일루리(Babesia herpailuri), 바베시아 자키모비(Babesia jakimovi), 바베시아 메이저(Babesia major), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 바베시아 오베이트(Babesia ovate), 또는 바베시아 판테래(Babesia pantherae )를 포함하는 바베시아 과의 감염성 원충 종을 나타낸다. "에르리치아(Ehrlichia)"는 비제한적으로, 에르리치아 차펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 에르리치아 무리스(Ehrlichia muris), 에르리치아 에윙이(Ehrlichia ewingii), 에르리치아 루미난티움(Ehrlichia ruminantium), 또는 에르리치아 카니스(Ehrlichia canis)를 포함하는 에르리치아 과의 감염 병원성 종을 나타낸다. "아나플라스마(Anaplasma)"는 비제한적으로, 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아나플라스마 마르기날레(Anaplasma marginale), 아나플라스마 센트랄레(Anaplasma centrale), 아나플라스마 메새테룸(Anaplasma mesaeterum), 아나플라스마 오비스(Anaplasma ovis), 또는 아나플라스마 플라티스(Anaplasma platys)를 포함하는 아나플라스마 과의 감염 병원성 종을 나타낸다. "바르토넬라(Bartonella)"는 비제한적으로, 바르토넬라 헨셀래(Bartonella henselae ), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis), 바르토넬라 엘리자베새(Bartonella elizabethae), 또는 바르토넬라 클라리드제이애(Bartonella clarridgeiae)를 포함하는 바르토넬라 과의 감염 병원성 종을 나타낸다.
이들의 표적-인식 능력, 선택성 및 고친화성 결합에 기초하여, 앱타머는 항체에 비유되었다. 그러나, 앱타머는 이들의 고유한 피쳐로 인해 이들의 개발 및 응용 범위에서 더욱 큰 유연성을 갖는다. 특히, SELEX 공정에 의한 앱타머의 생성에 필요한 시간은 비교적 짧다. 또한, 앱타머는 화학적으로 합성될 수 있으며, 이는 다양한 작용기 및 특이적 모이어티 예컨대, 바이오틴, 카르복실, 아미노 및 티올 기를 혼입하는데 필요한 생화학적 조작을 허용하며, 이들 대부분은 앱타머에 의한 표적의 인식에 영향을 미치지 않는다. 앱타머는 시험관내 진화로 처리될 수 있으며, 이때 증가된 압력은 선택 공정 동안 가해질 수 있어, 잠재적으로 이들의 표적에 대한 앱타머의 친화성 또는 선택성을 잠재적으로 증가시킨다.
예를 들어, 앱타머는 1014 내지 1015 램덤 DNA 또는 RNA 서열 앱타머의 풀(합성 올리고뉴클레오티드를 생성하는 시중의 공급원으로부터의 풀로 구입)로부터 선택되며, 서열-특이적 앱타머는 SELEX 공정을 이용하여 풍부화된다. SELEX는 전형적으로 고체 지지체 상의 표적뿐만 아니라 "음성" 표적(즉, 공정의 다른 부분 예컨대, 표적의 부재하에 고체 지지체 또는 공정에 사용된 플라스틱)에 DNA 또는 RNA 앱타머 풀을 노출하는 것을 포함하여 풀이 "음성" 표적에 대해 풍부화되지 않게 됨을 보장한다. 앱타머는 표적과 상호작용하여 이에 결합하고, 비-결합된 앱타머는 세척 제거된다. 결합된 앱타머는 용출되고, 증폭 프라이머 부위로서 측면인접 불변 영역을 사용하여 PCR에 의해 복사된다. 이러한 공정은 소수개의 앱타머가 풀의 대부분이 될 때까지 풍부화된 앱타머 풀로 반복된다. 겔 이동 검정, 형광 이방성 실험 또는 기타 결합 실험이 해당 표적에 대한 앱타머의 친화성을 결정하는데 사용될 수 있다.
용어 "상동성 %"은 본원의 용어 "동일성 %"와 상호교환적으로 본원에서 사용되며, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 경우 본 발명의 DNA 또는 RNA 앱타머의 핵산 서열 간의 핵산 동일성 수준을 일반적으로 나타낸다.
예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 80% 상동성은 규정된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 동일성과 동일한 것을 의미하며, 따라서 해당 서열의 상동성은 해당 서열의 길이에 걸쳐 80% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성의 예시적 수준은 비제한적으로, 본원에 기술된 바와 같은 해당 서열과 80, 85, 90, 95, 98% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함한다.
두 서열 간의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 프로그램은 비제한적으로, BLAST 프로그램 세트 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTBLAST에서 공개적으로 접근가능한 BLASTIN, BLASTX 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN, 및 기타 차세대 DNA 시퀀싱 분석 프로그램을 포함한다. 기타 프로그램은 Galaxy, Lasergene Genomics Suite, CLC Genomics Workbench, DNANexus, GenomeQuest, Softgene NextGENe를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 및 66, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 50% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 포함한다. 특정 구체예에서, 앱타머는 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 및 66, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
라임 검출을 위한 예시적인 앱타머 서열은 표 1에 제공된다.
표 1: OspA, OspC, 및 BmpA로 안내된 앱타머
특정 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No. 67-84 또는 이들의 임의의 상동물, 또는 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 50% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 포함한다. 특정 구체예에서, 앱타머는 SEQ ID No. 67-84, 또는 이들의 임의의 상동물, 또는 이들의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
참고 문헌
D. 라만-활성
마커
분자
라만-활성 마커는 하나 이상의 앱타머에 공유적으로 부착된 화학적 모이어티이다. 마커는 전형적으로, 합성 올리고뉴클레오티드에 혼입하기 위해 설계된 포스포르아미다이트(고체 지지체 상에 DNA 서열을 설립하는데 사용된 모노머)로 혼입된 형광 마커이다. 또한, 그렇게 크지 않은(따라서, 앱타머와 표적의 상호작용에 영향을 미치지 않을 정도의 가능성이 있는) 라만 활성 마커의 제 2 부류 예컨대, 포스포르아미다이트로서의 합성 올리고 분자로 또한, 혼입될 수 있는 알킨, 아지드, 등(Yamakoshi (2012) J Am Chem Soc 134: 20681-9)이 존재한다. 유용한 라만 활성 마커는 비제한적으로, Cy3, TAMRA, Texas-Red (TR), Cy3.5, Rhodamine 6G, Cy5를 포함한다. 두 분자가 거의 구별할 수 없는 형광 스펙트럼을 보일지라도 라만 마커 분자의 사소한 화학적 변형이 다른 라만 스펙트럼을 갖는 새로운 것으로 유도할 수 있기 때문에, 형광 염료를 이용하는 것보다 더 많은 라만-활성 마커가 이용가능하다 (Kneipp et al. Chem. Rev. 99, 2957 (1999); Graham et al., Angew. Chem. Int. Ed. 39, 1061 (2000). 이는 해당 표적에 대한 각 앱타머 또는 앱타머 세트에 있어서 고유의 스펙트럼 시그니쳐를 갖는 라만-활성 마커를 사용함으로써 다중화를 가능하게 한다.
라만 분광법에 사용될 수 있는 라만-활성 마커의 비제한적 예는 알킨, 아지드, TRIT (테트라메틸 로다민 이소티올), NBD (7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), Texas Red (TR) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플로우레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 석시닐플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 및 풀러렌을 포함한다. 이러한 및 다른 라만 라벨은 시중의 공급처 (예를 들어, Molecular Probes, Eugene, OR; Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO; Glen Research, Sterling, VA)로부터 수득될 수 있으며/거나 당업계에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다.
폴리시클릭 방향족 화합물이 당업계에 공지된 바와 같은 라만-활성 마커로서 기능할 수 있다. 당업자는 사용된 라만 라벨이 구별가능한 라만 스펙트럼을 발생시켜야 하며, 상이한 유형의 앱타머에 특이적으로 결합될 수 있거나 이와 회합될 수 있음을 인지할 것이다.
라벨 또는 라만-활성 마커는 앱타머에 직접적으로 부착될 수 있거나 고체상 DNA 합성 동안 다양한 링커 화합물을 통해 부착될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 가교 시약 및 링커 화합물은 당업계에 공지되어 있다. 다른 분자 예컨대, 앱타머와 공유적으로 반응하도록 설계된 반응기를 함유하는 라만 라벨은 시중에서 입수가능하다 (예를 들어, Thermo Scientific, Eugene, OR). 라벨링된 분석물의 제조 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,962,037; 5,405,747; 6,136,543; 6,210,896).
E. 표적 정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적" 또는 "분석물"은 상호교환적으로 사용되며, 검출 및/또는 식별을 위한 관심이 있는 임의의 원자, 화학물질, 분자, 화합물, 조성물 또는 응집물을 의미한다. 분석물의 비제한적 예는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 리피드, 호르몬, 대사산물, 사이토킨, 케모킨, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약제, 영양분, 프리온, 독소, 독, 폭발물, 살충제, 화학 전쟁 약물, 바이오해저드 제제, 방사성 동위원소, 비타민, 헤테로시클릭 방향족 화합물, 발암원, 돌연변이원, 마약, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 남용 약물, 노폐물, 화약 잔여물 및/또는 오염물을 포함한다.
특정 구체예에서, 분석물 또는 표적은 보렐리아 과의 종에 존재한다. 특정 구체예에서, 분석물은 OspA, OspB, OspC, BmpA, 또는 이들의 조합물로부터 선택된 B. 버그도르페리 표면 단백질이다. OspA, OspB, OspC, 및 BmpA는 B. 버그도그페리 상에서 발견된 외표면 단백질이다; 이들은 인간에서 또는 진드기 해부구조에서 상이하게 발현된다. OspA 및 OspB는 진드기에서 B. 버그도르페리의 생존에 필수적인 것으로 보이며, OspC는 감염된 진드기에 의한 포유동물 숙주의 감염에 필수적이다.
F. 생체 시료
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체 시료"는 비제한적으로, 혈액, 혈액 생성물, 혈청, 혈장, 기타 혈액 분획물, 조직, 조직 추출물, 소변, 뇌척수액, 타액, 대변, 피부, 모발, 볼 조직, 기관 조직, 호흡, 흉수, 땀 또는 가래를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "시료 수집 장치" 또는 "시료 수집 디바이스"는 비제한적으로, 면봉 또는 기타 매트릭스 (필터지, 면, 패드, 또는 포말), 딥스틱, 테스트 스트립, 컵, 카트리지, 모세관, 또는 튜브를 포함할 수 있다. 본원에서 수집되거나 함유된 생체 시료는 예를 들어, 물 또는 적합한 완충액에서 재구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 생체 시료는 재구성을 필요로 하지 않는다. 시료 수집 디바이스는 예를 들어, 염료, 검출가능한 태그 또는 바 코드를 사용하여 색상 코딩되어 디바이스가 양성 또는 음성 대조군인지의 여부를 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, 매트릭스 또는 수집 디바이스는 결합된 폴리올레핀 섬유 예컨대, Bonded Polyolefin Fibre, Glass Fiber, 셀룰로스, 면, 폴리에틸렌, 나일론, 천연 마크로분자, 폴리비닐 설폰, 실리카, 유리 섬유, 결합제를 지닌 유리 섬유, 셀룰로스 아세테이트, 또는 니트로셀룰로스 (NC)로 제조될 수 있다. "시료 수집 장치" 또는 "시료 수집 디바이스"는 하우징을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 하우징은 시료 수집에 적합하게 맞춰진 물질 예컨대, 플라스틱, 및 기타 등등을 포함할 수 있다.
시료 수집 디바이스는 효소 또는 프로테아제, 단백질, 생체 시료를 처리하고 반감기를 증가시키기 위한 화합물 또는 보존제, 화학적 안정화제, 희석제, 완충제, 첨가제, 세정제, 리피드, 당, 탄수화물 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 효소 또는 프로테아제는 생체 또는 검사 시료를 용해시킬 수 있다. 예를 들어, 효소는 비제한적으로, 뮤신일 수 있다. 단백질은 비제한적으로, 소 혈청 알부민일 수 있다. 보존제는 비제한적으로, 소듐 아지드일 수 있다. 기타 첨가제 및 안정화제를 비제한적으로, 디-소듐 하이드로겐 오르토포스페이트 무수물, 포타슘 디하이드로겐 오르토포스페이트, d-만니톨, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
G. 라만 검출기 또는 기구
분석물은 SERS 라만 분광법 또는 기타 적절한 라만 분광 기법의 공지된 방법 예컨대, 팁 증강 라만 산란법(TERS) 및 단일 분자 라만 산란법(SMERS)에 의해 검출되고/거나 확인될 수 있다. 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS), 초-라만 분광법 및 간섭성 항-스톡스 라만 분광법(CARS)에 대한 변형이 공개되어 있다. SERS 및 SERRS에서, 은, 금, 플라티늄, 구리 또는 알루미늄 표면과 같은 거친 금속 표면 또는 나노입자 상에 흡착된 분자에 대해 라만 검출 민감도가 106배 이상 향상된다. 본 발명에 따라 앱타머에 라만-활성 마커를 첨가함으로써, 추가로 더욱 강력한 신호 증강이 존재한다; 또한, 마커의 첨가는 마커를 둘러싼 매트릭스 또는 비변형된 앱타머와 비교할 경우 고유할 것으로 예상되는 마커의 공지되고 별개의 스펙트럼 특징을 통해 표적의 식별을 허용한다. SERS 검출의 한 유용한 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0107254에 기술되어 있다.
라만 검출 유닛의 비제한적 예는 미국 특허 번호 6,002,471에 기재되어 있다. 여기 빔은 532 nm 파장에서 주파수가 두배 증가된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서 주파수가 두배 증가된 Ti:사파이어 레이저 중 어느 하나에 의해 발생된다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔이 사용될 수 있다. 여기 빔은 공 촛점 광학기 및 현미경 대물 렌즈를 통하여 통과하고, 하나 이상의 분석물을 함유하는 라만 활성 복합물 상에 초점을 맞춘다. 라만 방출 신호는 현미경 대물 렌즈 및 공 초점 광학기에 의해 수집되고, 스펙트럼 해리를 위한 모노크로메이터에 커플링된다. 공 촛점 광학기는 다이크로익 필터, 배리어 필터, 공 촛점 핀홀, 렌즈, 및 배경 신호를 감소시키기 위한 미러의 조합을 포함한다. 공 촛점 광학기뿐만 아니라 표준 풀 필드 광학기가 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 신호의 카운팅 및 디지털화를 위한 컴퓨터와 인터페이스되는 애벌란시 포토다이오드(avalanche photodiode)를 포함하는 라만 검출기에 의해 검출된다.
라만 검출 유닛의 또 다른 예는 미국 특허 번호 5,306,403에 기재되어 있으며, 단일-광자 계수 모드에서 작동된 갈륨-비소 광전자 증배관을 갖는 Spex Model 1403 이중-격자 분광광도계 (RCA Model C31034 또는 Burle Industries Model C3103402)를 포함한다. 여기 공급원은 SpectraPhysics, Model 166로부터의 514.5 nm 라인 아르곤-이온 레이저 및 647.1 nm 라인의 크립톤-이온 레이저 (Innova 70, Coherent)를 포함한다.
특정 구체예에서, 전형적인 입사 파장은 약 488, 약 514.5, 약 532 nm, 약 632.8, 약 785 nm 및 약 1064 nm이다.
대안적인 여기원은 337 nm에서의 질소 레이저 (Laser Science Inc.) 및 325 nm에서 헬륨-카드뮴 레이저 (Liconox) (미국 특허 번호 6,174,677), 발광 다이오드, Nd:YLF 레이저, 및/또는 다양한 이온 레이저 및/또는 염료 레이저를 포함한다. 여기 빔은 밴드패스 필터 (Corion)를 사용하여 스펙트럼으로 정제될 수 있으며, 6x 대물 렌즈(Newport, Model L6X)를 사용하여 라만 활성 복합물에 초점을 맞출 수 있다. 홀로그램 빔 스플리터 (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18)를 사용하여 여기 빔 및 방출된 라만 신호에 대한 직각 기하학적 구조를 생성시킴으로써 대물 렌즈가 분석물의 흥분 및 라만 신호 수집 둘 모두에 사용될 수 있다. 홀로그램 노치 필터 (Kaiser Optical Systems, Inc.)는 Rayleigh 산란 방사선을 감소시키는데 사용될 수 있다. 대안적인 라만 검출기는 적색-강화 증강 전하-커플링 장치 (RE-ICCD) 검출 시스템 (Princeton Instruments)이 장착된 ISA HR-320 분광사진기를 포함한다. 기타 유형의 검출기 예컨대, 퓨리에-변환 분광사진기 (Michaelson 간섭계 기반), 충전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, InGaAs 검출기, 전자-증폭 CCD, 증강 CCD 및/또는 포토트랜지스터 어레이가 사용될 수 있다.
당업계에 공지된 라만 분광법 또는 관련 기법의 임의의 적합한 형태 또는 구성은 본 발명의 복합물의 검출에 사용될 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 라만 산란법, 공명 라만 산란법, 표면 증강 라만 산란법, 표면 증강 공명 라만 산란법, 간섭성 안티-스토크 라만 분광법(CARS), 자극 라만 산란법, 역 라만 분광법, 자극된 게인 라만 분광법(stimulated gain Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 산란법, 분자 광학 레이저 검사기(molecular optical laser examiner)(MOLE) 또는 라만 미소탐침 또는 라만 현미경 또는 공초점 라만 마이크로분광계, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시분해 공명 라만, 라만 분리 분광법 또는 UV-라만 현미경법을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 현장 검사 장치 (a point of care testing apparatus) 예컨대, 휴대용 라만 검출기가 적절하게 기능하는지의 여부를 검사하기 위한 방법을 기재한다. 본 방법은 (a) 시료 수집 장치를 물, 완충액, 또는 생체 시료와 접촉시키는 단계; (b) 시료 수집 장치를 현장 검사 장치에 삽입하는 단계; 및 (c) 양성 또는 음성 대조군의 존재를 검출하는 단계로서, 양성 또는 음성 대조군의 존재가 현장 검사 장치가 적절하게 기능함을 나타내는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 보정을 위한 표준 검사 카트리지는 현장 검사 장치가 적절하게 기능하는지를 검사하는데 사용될 수 있다.
H. 기타 기법
진드기에서 B. 버그도르페리의 존재를 검출하는 현재 방법은 면역학적 방법을 사용하여 진드기 균질물에 존재하는 박테리아 단백질을 검출하는 것이다. 전형적으로, 이러한 검사는 수행하는데 있어서 시간 소모적이며, 상당한 기술적인 기법과 교육을 필요로 한다. 종종 진드기는 테스트 실험실로 보내지며, 결과를 받기까지 몇 주가 소요될 수 있다; 많은 개체는 이들이 진드기 테스트에 대한 결과를 받기 전에 이미 라임병 증상을 보였을 것이다.
인간에서 라임병을 검출하기 위해 현재 받아들여지고 있는 방법은 인간 항-B. 버그도르페리 항체의 검출을 위한 표적으로서 전세포 균질물을 사용하는 CDC-승인된 2-단계 혈청 프로토콜을 기반으로 한다. 제 1 단계 평가는 전형적으로 항-라임 IgM 또는 IgG 항체를 검출하는데 ELISA 또는 관련 검정을 이용하고, 양성 또는 모호한 결과는 B. 버그도르페리 추출물을 사용하여 제 2 평가인 IgM 또는 IgG 면역블롯의 사용을 조장하여 B. 버그도르페리에 특이적인 것으로 보이는 밴드를 검출한다. 이러한 혈청학적 검사에는 많은 문제가 존재한다: 1) 불량한 민감성; 2) 첫 번째 4-6주 감염에서 매우 낮은 수준의 항-B. 버그도르페리 항체; 3) 일부 개체에서 불량한 항-B. 버그도르페리 반응; 4) 면역블롯의 주관적 해석; 및 5) 항체 처리된 또는 재-감염된 개체에서 B. 버그도르페리 감염을 진단할 수 없는 능력. 이러한 검사는 병원체를 직접적으로 검출하지 않고 항체 생산을 검출하기 때문에, 검사는 감염 3주 내에 감염을 검출할 수 없다. 추가적으로, 평가는 80% 초과의 특이성을 가지나, 단지 50-60%의 민감성을 갖는다. 현재 미국의 추정은, 대략 300,000명의 인간 라임병 검사가 시행되었지만, 많은 임상의는 낮은 민감성으로 인해 검사를 주문하지 않음을 시사한다. 라임병이 보고되는 낮은 비율은 부분적으로 현재 임상의가 이용가능한 진단 도구의 불량한 품질로 인한 것이다.
혈정학적-기반 검정에 더하여, 몇 가지 다른 새로운 검정이 문헌 및 시장에 출현하기 시작하였다. 라임 진단에 대한 대사체학이 최근 기술되었다 (Mollins, C.R. et al. Clin Infect Dis. 2015 Mar 11.). 이러한 방법은 조기 개발 단계이며, 기구-집약적이고, 기술적으로 진보된 GC-MS 분석을 필요로 하며, 이는 현장 검사 (point-of-care)(POC) 검출을 어렵게 할 수 있다. Ceres Nanosciences는 소변으로부터 라임 항원을 농축시키고 표준 면역검정 기법을 사용하여 이들의 존재를 검출하는 나노입자-기반 검정을 개발하였다 (Douglas, T.A. et al. Biomaterials. 2011 Feb;32(4):1157-66; www.ceresnano.com). 이러한 검정은 항-B. 버그도르페리 항체 대신에 라임 항원을 직접 검출하기 때문에, 검정은 면역검정 기법을 사용하여 라임 항원을 검출하며, 수행하는데 4시간이 넘게 필요한 점이 또한, POC 검출을 어렵게 한다.
다양한 다른 라임병 진단 검정은 문헌에 기술되어 있다. 일부는 직접 DNA 증폭-기반 검정, 배양-기반 검정, 및 기타 직접 라임 항원 검출 방법 예컨대, 항체 변형된 탄소 나노튜브에 결합하는 라임 항원을 측정하는 트랜지스터-기반 검정을 포함한다 (Lerner, M.B. et al. Biosens Bioelectron. 2013 Jul 15;45:163-7). 이러한 검정 중 대부분은 초기 개발 단계이거나 현재의 CDC-승인 2-단계 면역검정보다 열악한 결과를 산출하였다.
본 발명은 상기 기술된 방법의 하기를 포함하는 여러 이점을 갖는다: 1) DNA 앱타머는 다른 검출 시스템에 사용된 항-라임 항원 항체에 대한 높은 친화성, 가요성의 용이하게 생성되고 변형된 대안을 제공하며; 2) 나노입자-기반 항원 결합은 벌크 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터의 항원의 용이하고 신속한 결합 및 분리를 허용하며; 3) SERS의 106 내지 1014배의 신호 증폭은 초-민감성 라임 항원 검출을 허용하며; 4) DNA 앱타머에 따른 자체 배치 라만 라벨(proprietary placement Raman label)은 SERS-기반 검출의 특이성 및 민감성을 극적으로 향상시키며; 5) 항원 결합으로부터 SERS 검출에 이르는 전체 검출 방법은 30분 미만이 소요되며, 이는 이러한 검출 방법을 POC 진단 적용에 매우 적합한 것으로 만든다.
상기 기재내용으로부터 자명해질 수 있는 바와 같이, 본 발명은 매우 다양한 적용을 갖는다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 단지 예시이며 본 발명의 정의 및 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실례
I. 감염성 질병을 검출하기 위한 시약 및 방법 (실시예 1-4)
실시예
1
옥시토신 (
OT
) 및 옥시토신-
gly
-
lys
-
arg
(
OT
-
GKR
)에 대한
앱타머
선택
OT 및 OT-GKR에 대한 앱타머는 훈(Hoon) 등1에 의해 기술된 선택 공정을 채택함으로써 선택되었다. 이러한 방법에서, 바이오틴-OT 및 바이오틴-OT-GKR은 자성의 바이오티닐화된 마이크로스피어에 결합되며, 이러한 마이크로스피어는 용이하게 수집된 기질로서 작용하여 펩티드 호르몬에 결합된 DNA 올리고뉴클레오티드를 비결합된 올리고로부터 분리한다. 앱타머 선택 라이브러리로서 사용된 올리고뉴클레오티드 풀은 앱타머 선택 후 앱타머 라이브러리의 PCR 증폭에 필요한 프라이머 부위로서 작용할 수 있는 불변 DNA 서열의 짧은 스트레치가 측면인접한 40개의 무작위 뉴클레오티드로 구성된다. 앱타머 라이브러리의 서열은 다음과 같다:
이러한 올리고에 대한 측면인접 영역은 Illumina MiSeq 시퀀싱 플랫폼 상의 DNA의 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 어댑터 서열에 상보적인 것으로 선택되었다.
간략하게는, 앱타머 선택 공정은 다음과 같다:
ㆍ0.1 ml의 Dynabead m270을 표적에 대한 선택의 각 라운드에 사용하고, 0.1 ml의 Dynabead를 각 음성 선택에 사용하였다.
ㆍDynabead를 PBS로 3회 세척하였다.
ㆍ양성 선택을 위한 Dynabead를 실온에서 30분 동안 PBS 중의 100 pmol 바이오틴-OT 또는 바이오틴-OT-GKR과 (일정하게 회전시키면서) 인큐베이션하였다.
ㆍ펩티드 결합된 Dynabead를 PBS로 3회 세척하였다.
ㆍ모든 Dynabead 시료 (OT, OT-OKR 및 음성 대조군에 대한 2개 시료)를 PBS + 0.1 % BSA로 2회 세척하였다.
ㆍAptamer Selection Library DNA (첫 번째 선택 라운드에서 15 nmol의 DNA를 각 선택에 사용하고; 후속 선택 라운드에서, 이전 라운드에서 수집된 앱타머 라이브러리의 90%가 사용됨)를 5분 동안 95℃, 5분 동안 0℃, 및 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
ㆍDNA를 음성 대조군 Dynabead에 첨가하고 실온에서 30분 동안 일정하게 회전하면서 인큐베이션하였다.
ㆍ음성 선택 Dynabead로부터의 상청액을 OT 또는 OT-GKR 중 어느 하나가 결합된 Dynabead에 옮겼다 - 시료를 일정하게 회전시키면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
ㆍ상청액을 Dynabead로부터 제거하고, Dynabead를 PBS + 0.1% BSA로 3회 및 PBS로 1회 세척하였다.
ㆍ결합된 앱타머 라이브러리 DNA를 갖는 Dynabead를 PCR 증폭 및 분석이 준비될 때 까지 -20℃에서 보관하였다.
ㆍPCR 분석 후, 각 시료의 대략 20%를 Illumina MiSeq 도구에서 NGS DNA 시퀀싱을 위해 전달하고, 나머지 분획을 사용하여 앱타머 선택의 다음 라운드에 사용될 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 발생시켰다.
ㆍssDNA는 비대칭 PCR 이어서 DNA의 역상보적 가닥의 람다 엑소뉴클레아제 분해를 이용하여 생성시켰다.
고처리량
DNA 시퀀싱
앱타머 선택 후, 올리고의 3'-말단에 대한 6-염기 바코드를 함유하는 TruSeq Indexed 프라이머 및 올리고의 5'-말단에 Illumina TruSeq Universal Adapter 서열을 부가하는 프라이머를 사용하여 Dynabead에 결합된 올리고뉴클레오티드를 PCR-증폭시켰다. 표 1.3은 NGS 분석을 위해 발생되는 4개 시료를 보여준다. 밑줄친 서열은 DNA 시퀀싱 절차에서 풀링된 시료를 구별하는데 필요한 6개 염기 바코드를 나타낸다.
표 1.3 TruSeq 지수 바코드를 보여주는 역 PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드
PCR 증폭 후, 시료를 시퀀싱하였다. 대략적인 등몰량의 4개 시료를 풀링시키고, 밤새 분석에서 20,000,000 DNA 가닥을 시퀀싱할 수 있는 MiSeq 시퀀서의 단일 레인에서 진행시켰다. 기구는 50 bp 이하 길이의 서열을 판독하도록 설정되어, 무작위 서열이 모든 시퀀싱 반응을 이용하여 이들 전체에서 결정되도록 허용한다. 각 시료와 관련된 서열은 시퀀싱 반응 전 PCR에 의해 앱타머에 부가된 6개 염기 바코드에 의해 동정하였다. 생물정보학
Illumina MiSeq 고처리량 DNA 시퀀서에 의해 발생된 서열 데이터를 분석하기 위해, 앱타머 분석을 위한 분석 도구를 라툴립페(Latulippe) 등4에 기술된 방법을 조정하여 개발하였다.
먼저, Illumina MiSeq DNA 시퀀서로부터의 데이터를 DNA 바코드에 의해 분류하고 아주 정확히 여과하여 인공 서열 예컨대, 호모폴리머의 긴 스트레치를 함유한 서열을 제거하였다. 이어서, 단일 시료로부터의 모든 서열을 비교하고 시료 내의 모든 정확한 일치를 계수하고 서열이 발생하는 횟수에 따라 분류하였다. 각 시료로부터 가장 일반적인 5000개 서열을 Microsoft Excel에 내보냈다. 특정 서열의 발생 수를 각 시료에 있어서 각 시료(즉, OT, OT-GKR, 또는 음성 대조군)에 대해 발생된 서열의 총 수와 비교하여 표준화시켰다. OT 선택으로부터 가장 일반적으로 발생하는 시료를 OT-GKR 선택 및 음성 대조군 선택으로부터의 서열과 비교하고, OT 선택에 고유한 서열을 하이라이트하였다. 이러한 서열을 잠재적인 OT 앱타머로서 라벨링하였다. 동일한 분석이 OT-GKR 선택을 분석하는데 이용되어 잠재적인 OT-GKR 앱타머인 앱타머를 발생시켰다.
표 1.4는 이러한 분석으로부터의 결과를 보여준다. 상위 30개 서열 중 단지 하나의 옥시토신 앱타머 서열이 모두 OT 라이브러리에 고유하고 상위 5000개 음성 대조군 서열에 부재한다 (올리고 번호 이어서 R). 2개의 추가적인 서열은 OT에 고유하며, 음성 대조군 서열 (올리고 번호 이어서, Y)에서 단지 드물게 발견되었다 (~ 5 x 106 서열 중 5회 미만). 상위 30개 OT-GKR 서열에 있어서, 2개의 고유의 서열이 발견되었으며, OT에 고유하며 음성 대조군 서열에서는 단지 드물게 발견되는 하나의 서열이 발견되었다.
표 1.4에서 제시된 결과에 기초하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 합성하고 OT 및 OT-GKR 결합에 대해 검사하였다:
옥시토신
옥시토신-
GKR
실시예
2
앱타머
-변형된 은 나노입자 (
Ag
-NP)의 합성 및 이를 이용한 옥시토신 검출
Ag NP의 합성은 레오나(Leona)5에 의해 기술된 문헌 절차를 사용하여 수행하였으며, 여기에서 NP는 글루코스 및 시트레이트의 존재하에 은 설페이트의 환원을 통해 합성되었다. 간략하게는, 합성 방법은 황산의 첨가를 통해 은 니트레이트의 수용액으로부터 은 설페이트를 침전시키는 것을 포함하였다. 새로 침전된 은 설페이트 염의 5 x 10-4 M 수용액을 제조하고, 12.5 mL의 이러한 용액을 시트레이트 (1 mL) 및 글루코스 (500 μL)의 1% 용액과 혼합하였다. 용액의 온도를 30초에 걸쳐 120℃로 증가시키고, 이 온도에서 30, 60 또는 90초 동안 유지시키는 3개의 가열 프로그램을 사용하여 용액을 마이크로웨이브 분해 시스템 (Anton Parr Multiwave 3000)으로 가열하였다. 이어서, NP를 15분 동안 원심분리에 의해 정제하고, 그 후 상청액을 제거하고 증류된 탈이온수로 대체하여 시트레이트 농도를 감소시켰다.
각 온도 프로그램은 Ag NP를 발생시켰으며, 이는 문헌에 보고된 것과 유리하게는 유사한 분광 특징을 입증하였다 (도 5, 패널 a 및 패널 b).5,6 흡수 최대치는 401 nm에서 발견되었으며, 절반에서의 총 최대치는 60 nm이며, 이는 문헌5으로부터의 56 nm 값과 유리하게 비슷하다. 플라스몬 공명이 입자 크기와 밀접한 관계가 있기 때문에, NP는 문헌7과 비교하여 이들 데이터를 토대로 20 내지 25 nm로 결정되었다.
NP의 안정성을 입증하기 위해 NP의 흡수 스펙트럼을 합성이 처음 수행된 후 3주째에 수집하였다. 원심 분리 전 높은 시트레이트 및 글루코스 농도를 갖는 반응 혼합물 중의 NP의 흡수 스펙트럼을 저장하고, 더 낮은 시트레이트 농도로 NP가 합성된 당일에 원심분리한 것들을 비교하였다 (도 5, 패널 a). 서로 각각의 흡수 스펙트럼의 유사성 및 합성 당일에 수집된 스펙트럼과의 유사성은, 마이크로웨이브-기반 합성 방법이 옥시토신 검출을 위한 견고한 방법의 기초로서 작용할 수 있는 안정한 Ag NP를 생성함을 나타낸다.
이어서, 라만 증강을 유도하는 이러한 Ag NP의 능력이 모델 SERS 활성 화합물인 메르캅토페놀 (MCP)을 사용하여 입증되었다. MCP는 2가지의 중요한 이유로 이러한 연구에 사용되었다: 이는 SERS 기질로서 NP의 효능이 결정되게 하는 시그니쳐 라만 스펙트럼을 생성하며, 이는 티올화된 앱타머로 Ag NP의 표면을 변형시키는데 사용된 것과 유사한 티올 연결을 통해 Ag NP와 상호작용한다. 100 μM의 포타슘 니트레이트 용액 및 Ag NP의 존재하에 수집된 200 μM의 MCP 용액의 스펙트럼을 NP의 부재하에 동일한 용액의 스펙트럼을 비교하였으며, 이는 NP의 존재에 의해 제공된 오십배수 증가를 입증한다 (도 2, 패널 b).
Ag NP의 성공적인 합성에 대한 설립을 레오나5에 의해 기술된 문헌 절차를 이용하여 수행하였으며, 스펙트럼 강도의 오십배수 증가를 유도하는 합성된 Ag NP의 능력의 입증인 연구의 이러한 측면은 티올화된 DNA를 갖는 Ag 및 Au NP의 변형에 주력하였다. 티올화된 DNA는 전형적으로 디설파이드 모이어티를 사용하여 합성되며, 올리고뉴클레오티드로 NP 표면을 변형시키는 예상에서 티올 또는 디티올 모이어티로의 디설파이드의 환원을 필요로 한다. 환원을 수행하기 위해, 3개의 방법이 적용되었다: 첫 번째는 염기성 조건하에서 디티오트레이톨 (DTT)8, 산성 조건하에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)9, 또는 NP에 디설파이드 종결된 DNA를 단순히 노출시켜 디설파이드의 환원을 촉진하는 것10을 포함한다.
표면 변형의 효능 조사는 모노- 또는 디티올-모이어티 중 어느 하나로 종결된 올리고뉴클레오티드로 변형된 DNA를 사용하여 수행하였다. 이러한 접근법의 효능은 흡수 분광법을 이용하여 모니터링되었다. NP의 표면 변형은 일반적으로 16-24시간 동안 티올-변형된 DNA의 존재하에 NP를 인큐베이션하고 이어서, 염을 서서히 첨가하여 NP 표면에서 DNA 농도의 증가를 촉진시키는 것을 포함한다. 300 mM의 최종 농도로 2-5일의 기간에 걸쳐 전형적으로 50 mM 증분으로 염을 천천히 첨가하는 것은 DNA 백본에서 포스페이트 모이어티의 전하를 균형잡아 반발을 줄임으로써 NP 표면에서 DNA의 농도를 증가시키고자 하는 것이다. 염 조건은 DNA-변형된 NP SERS 기질을 생성하도록 조정될 수 있다.
모노티올- 및 디티올-종결된 올리고뉴클레오티드의 비교는 디티올-종결된 올리고뉴클레오티드로의 표면 변형에서 2개 파라미터의 조사를 포함한다: 디설파이드 개질제를 활성화시키기 위해 사용된 환원제, 및 NP 표면에서 DNA 농도를 증가시키기 위한 염의 비율 및 농도. 표면 변형의 효능은 표면 플라스몬 흡수의 유지를 측정함으로써 모니터링되었다. 디설파이드 변형된 DNA가 환원되어 Ag NP 표면을 리게이팅시킬 수 있는 디티올 말단을 생성하는 초기 단계는 디티오트레톨 (DTT)9, (트리스(2-카르복시에틸)포스핀) (TCEP)8의 존재하에 및 환원제의 부재하에 NP 현탁액에 디설파이드를 직접 노출시킴으로써10 수행되었다.
도 2, 패널 c에 예시된 바와 같이, 플라스몬은 디티올-종결된 DNA 및 25 mM NaCl의 첨가 둘 모두에의 노출 후 안정적이다. 농도를 50 mM 염으로 증가시키면 플라스몬 흡수의 더 낮은 에너지로의 첫 번째 이동이 유발된다. 염의 추가 첨가는 염 농도가 총 100 mM가 되게 하여 NP 집합체를 나타내는 플라스몬의 신속한 손실을 초래한다.
각 접근법은 동시에 수행하고 흡수 분광법을 사용하여 모니터링하였다 (도 2, 패널 d). 표면 플라스몬의 강도는 각 감소 방법이 디티올-변형된 DNA의 성공적인 첨가를 유도함을 나타내는 반면, 소듐 클로라이드가 첨가되어 NP 표면에서의 DNA 농도가 증가할 경우 주지된 현저한 차이가 존재하였다. 환원제의 부재 또는 TCEP의 존재하에 변형된 Ag NP에의 25 mM 분취물 중의 소듐 클로라이드 첨가는 플라스몬 흡수 강도를 현저하게 감소시켰으며, 그러나 DTT로 감소된 디티올-변형된 DNA에 노출된 NP는 플라스몬 흡수에서 현저한 감소를 유도하였다. 다양한 디설파이드 환원 조건의 존재하에 소듐 클로라이드의 NP에의 첨가시 플라스몬 흡수 강도에서 변화 비교 (도 2, 패널 e)는 TCEP로 제조되거나 환원제의 부재하에 NP가 Ag NP 플라스몬의 최상의 보유를 유도함을 확인시켜준다.
NP의 표면 변형은 두 가지 방법으로 확인되었다: 먼저, 디티올-종결된 DNA에 노출되지 않았던 NP가 DNA 변형된 NP와 동일한 소듐 클로라이드 첨가 조건에 노출되는 대조 실험. 이는 25 mM 소듐 클로라이드의 첨가시 플라스몬 강도의 현저한 손실을 가져왔다 (도 2, 패널 e). 표면 변형의 두 번째 입증은 5'-말단에 존재하는 형광 FAM 마커의 존재를 이용하였다. 미르킨(Mirkin)과 공동 연구자에 의해 확인된 프로토콜에 따라, FAM-변형된 DNA를 DTT의 0.1 M 용액에 DNA-변형된 NP를 노출함으로써 Ag NP의 표면으로부터 제거하였다11. 시료를 원심분리하여 상청액으로부터 Ag를 분리한 후, 용액의 형광을 488 nm 광으로의 조사시 측정하였다 (도 2, 패널 f). 생성된 방출 스펙트럼은 디티올-변형된 DNA로의 NP 표면의 성공적인 변형을 입증한다. 방출 스펙트럼의 상대적 강도는 표면 변형이 환원제의 부재하에 가장 효과적임을 시사하며, 이는 흡수 연구에서 관찰된 것을 확인시켜 준다.
본원에서 개발된 방법은 모노-티올 또는 디티올-종결된 앱타머 올리고뉴클레오티드로의 라만 활성 Ag NP의 신뢰성 있는 변형을 용이하게 한다. 디티올-종결된 올리고는 모노-티올 종결된 올리고보다 더욱 안정적인 NP를 생성하며, 표면 변형 절차의 모든 후속적 최적화에서 사용될 수 있다. 디티올-변형된 DNA 앱타머 대용물은 또한 5'-말단에서 형광 마커 FAM으로 변형되었다. 디설파이드 변형제는 NP 표면에 DNA를 앵커링하는데 더욱 효과적임이 입증되었으며10, FAM-종결된 DNA는 형광 실험을 통한 NP 표면에서 DNA의 존재를 입증하는데 사용되었다11. 이러한 결과에 기초하여, 환원제의 부재하에 NP 표면에서 DNA 농도를 증가시키기 위해 첨가된 50 mM NaCl을 사용하여 제조된 Ag NP는 모든 후속 라만 연구에 사용되었다.
실시예
3
사용자 편의 및
증가된
민감성을 위한 시료 제조
통상적인 무기 염의 첨가를 통해 "핫 스폿"을 형성하도록 NP를 근접하게 이동시키는 것은 이러한 적용분야에 매우 적합하다. 염의 첨가는 용액 중 NP의 집합을 유도하도록 제안되었으며, NP의 결과적인 근접성은 NP 플라스몬의 "공유"를 유도하고, 개별 SERS-활성 NP의 존재하에 관찰된 것을 넘어서는 진동 스펙트럼의 증강을 증가시킨다.
라만 산란 증강을 일으키는 NP의 효능에 대한 염의 효과를 설명하기 위해, 2개의 통상적인 염인 포타슘 니트레이트 및 소듐 클로라이드의 100 μM 용액 첨가 효과를 조사하였다. 도 3, 패널 a에 도시된 바와 같이, 두 염 모두의 첨가는 스펙트럼 강도의 10배수 증가를 유도하며, 포타슘 니트레이트는 소듐 클로라이드 도입시 생성되는 것보다 60% 높은 스펙트럼 강도를 생성한다. 이러한 결과는 이러한 노력으로 확립된 방법을 기초로 형성되었다.
DNA 변형 방법 개발의 성공을 바탕으로, 생성 물질의 라만 호출은 632.8nm 및 785nm 입사 파장을 사용하여 호출되었으며, 구별되는 존재 즉, 본 서열의 5' 말단에 혼입된 형광 FAM과 같은 별개 분자를 시사하는 재현가능한 스펙트럼 피쳐를 드러냈다. 올리고뉴클레오티드의 존재에서 염료 마커를 나타내는 피쳐를 관찰하는 능력은 다중 염료에 대해 미르킨(Mirkin)과 공동연구가에 의해 입증되었으며, 염료와 관련된 강하고 구별되는 피쳐를 기반으로 하는 다중화에 이를 사용하였다12.
가장 큰 스펙트럼 피쳐를 제공한 스펙트럼 분석 직전에 어떤 염 첨가체가 도입되었는지를 결정하기 위해 첫 번째 연구를 수행하였다. 도 3, 패널 b에 예시된 바와 같이, KNO3의 첨가는 아마도 "핫 스팟" 형성으로 인한 것보다 높은 강도 라만 피쳐를 생성하며, 이는 스펙트럼 강도의 상승적 증가를 유도한다. 이러한 관찰을 염두해두면서, 5'-FAM 종결된 DNA로 변형된 Ag NP로 관찰된 스펙트럼 피쳐는 KNO3의 존재시 가장 강하였다.
FAM에 의해 입증된 강한 스펙트럼 피쳐는 옥시토신의 검출을 위한 방법의 개발 기회를 제공한다. 5'-FAM의 날카롭고 강한 스펙트럼 피쳐는 메르캅토페놀(MCP)의 강도에 필적하며, 분석 표적을 위한 대용물로서 사용될 수 있는 스펙트럼 피쳐를 제공한다. FAM-변형된 앱타머와 앱타머 표적의 상호작용은 FAM-유도된 스펙트럼 피쳐의 강도 변화를 유도한다.
FAM- 및 MCP-유도된 스펙트럼 피쳐 둘 모두가 관찰된 Ag NP 표면 단일층을 생성하기 위해, FAM DNA-변형된 Ag NP를 다양한 농도의 MCP에 노출하였다. 4 mM 내지 4 μM 농도 범위 MCP 및 FAM-변형물로 구성된 Ag NP 표면에서 혼합된 단일층을 연구하였으며, MCP 및 FAM 스펙트럼 피쳐 둘 모두의 존재가 4 μM MCP의 농도로 가장 효과적으로 관찰되었다 (도 3, 패널 c). NP 표면에서 혼합된 MCP/FAM DNA 단일층은 MCP 및 FAM으로부터 입증된 구별되고 용이하게 차별가능한 스펙트럼 피쳐를 드러냈다 (도 3, 패널 d). 714 cm-1 및 1050 cm-1에서의 피쳐는 디티올-변형된 DNA의 5'-말단에서 발견된 FAM 염료로부터 유래되는 반면, 613 cm-1, 1010 cm-1, 1080 cm-1 및 1175 cm-1에서의 피쳐는 MCP 단일층에 의해 기여된다. 이러한 두개의 별개의 피쳐 그룹의 존재는 방사선계측 정량화에 사용될 수 있음을 시사하며, 여기에서 FAM 변형된 DNA-유도된 피쳐는 분석물의 도입시 변화될 것인 반면, MCP 피쳐는 일정하게 유지될 것이다.
785 nm 입사광을 사용하여 시스템을 추가로 연구한 결과 유사한 스펙트럼 피쳐 세트가 나타났다. 이러한 분광 피쳐를 저에너지 입사광으로 변환하는 능력은, 이러한 입사 파장을 사용하는 계측기가 상업적으로 이용가능하고 상대적으로 저렴하며 분광법에 대한 훈련이 거의 없는 사람들이 쉽게 이용할 수 있기 때문에 중요하다. 4mM MCP 및 FAM-변형된 DNA로 구성된 표면 단일층을 갖는 Ag NP의 수집된 스펙트럼은 혼합된 단일층의 2개의 성분에 쉽게 지정될 수 있는 스펙트럼 피쳐를 다시 입증하였다. FAM-변형된 DNA는 305 cm-1, 714 cm-1 및 1050 cm-1에서의 피쳐에 기여한 반면, MCP는 393 cm-1, 636 cm-1, 1010 cm-1, 1080 cm-1 및 1175 cm-1에서의 피쳐에 기여하였다. 이러한 스펙트럼은 633 nm 조사 하에서 관찰된 것과 유사한 피쳐뿐만 아니라 785 nm 스펙트럼에 특이적인 추가 피쳐를 나타낸다 (도 3, 패널 e).
스펙트럼 최적화 공정의 두 번째 측면인 MCH 또는 MCP 중 하나와 커플링된 라만-라벨링된 DNA로 구성된 혼합 단일층의 효과 즉, 단일층의 신호 강도뿐만 아니라 표면 단일층의 추가 변형 효과를 연구하였다. 메르캅토헥산올의 첨가가 라만 분광법을 사용하여 염료-변형된 바소프레신의 라만 강도를 향상시키는 것으로 입증된 린(Lin)과 공동연구가의 연구13는 다양한 표면 변형과 새로운 기질의 연구를 위한 기초가 되었으며, 이는 이러한 적용을 위한 분광 방법에서 추가의 개선을 나타냈다.
라만 신호 강도를 증가시키는 방법으로 연구된 첫 번째 접근법은 FAM-DNA-변형된 Ag NP에 1-메르캅토헥산-6-올(MCH)을 첨가하는 것을 포함하였다. 표면 단일층으로의 이러한 분자의 첨가는 표적 인식을 위한 앱타머에 의존적인 종래의 라만-기반 검출 계획에서 증가된 신호 강도를 유발시켰다.13
세 농도 400 μM, 40 μM 및 4 μM의 MCH를 DNA-변형된 Ag NP에 첨가하였으며, 이는 모두 세 농도에서 714 cm-1 및 1050 cm-1의 2개 FAM-유도된 스펙트럼 피쳐 강도의 현저한 증가를 나타냈다. 가장 큰 증가는 가장 낮은 농도에서 관찰되었으며 (도 3, 패널 f), NP 표면에서 DNA를 대체하는 티올화된 분자의 이전의 관찰과 일관된다. 이러한 현상은 Ag NP 표면으로부터 FAM-변형된 DNA를 대체하여 NP의 성공적인 표면 변형을 입증하기 위해 이용되었다 (도 2, 패널 f).
염료-변형된 앱타머에 대한 대용물로서 FAM-DNA로 구성된 혼합된 표면 단일층과 Ag NP의 라만 강도에 대한 MHC의 효과를 연구하는 것과 유사한 연구를 옥시토신이 정량화될 수 있는 내부 표준인 MCP를 사용하여 수행하고 실행하였다. 최적의 표층 조성을 확인하기 위해 각각 1050 cm-1 및 1080 cm-1에서 MCP 및 FAM과 관련된 두 개의 가장 큰 스펙트럼 피쳐의 기준 보정된 강도를 FAM-DNA 변형된 Ag NP에 첨가된 MCH 및 MCP의 농도를 다양하게 하면서 비교하였다.
4 내지 400 μM 범위의 MCP의 세 농도와 4 및 40 μM의 MCH의 두 농도를 검사하였다. 이러한 비교는 MCP와 FAM DNA 스펙트럼 피쳐 둘 모두의 가장 큰 증강이 MCP 40 μM의 중간 농도의 첨가로 관찰되었음을 드러내었다 (도 3, 패널 f). 가장 낮은 농도의 MCP (4 μM) 첨가가 덜 강한 1080 cm-1 피쳐를 유발시키는 것은 직관적이지만, 더 적은 MCP가 표면 변형에 사용가능하기 때문에, MCP의 농도를 400 μM로 증가시킴에 따라 스펙트럼 강도가 또한 감소되며, 이는 NP 표면에서 티올화된 분자 간의 경쟁을 암시한다. 경쟁 효과는 또한 FAM-유도된 라만 강도에서 반영된다: 400 μM MCP의 첨가는 더 낮은 강도를 유발시키는 반면, 4 μM MCP의 첨가는 1050 cm-1 피쳐 강도에서 최소 변화를 유발시킨다.
요약하면, 이러한 연구는 앱타머-변형된 Ag NP가 취해진 옥시토신 수준의 SERS-기반 정량 결정을 최적화하는데 필요한 파라미터의 이해를 제공한다. 첫 번째는 FAM-DNA-변형된 Ag NP의 표면에 티올화된 분자를 첨가하는 효과를 연구하는 것을 포함한다. 2개 분자 구성요소를 검사하였다: 내부 표준 분자인 MCP 및 NP 표면 상에 비어있는 공간을 충전시키고 표면에서 분자의 조직화를 촉진할 수 있는 분자인 MCH. 이 연구는 FAM 및 MCP 피쳐에 대해 최적의 신호 강도를 제공하기 위해 두 분자 구성요소의 농도 사이의 균형의 필요성을 나타냈다.
실시예
4
앱타머
-변형된 NP-기반 옥시토신 검출의 효능
실시예 3에 확립된 조건을 사용하여, 표적뿐만 아니라 소 혈청 알부민을 함유는 완충액으로부터 식별 및 정량화 공정을 연구하였다. 옥시토신에 대한 대용물로서 바소프레신의 농도를 nM 내지 μM 용액에 걸친 농도 범위에 대해 연구하여 표준 곡선을 준비하고 제안된 접근법의 검출 한계를 결정하였다. 이 방법은 9-아미노산 옥시토신 펩티드를 사용하여 개발되었으며, 12-아미노산 프로-옥시토신과 함께 사용하기 위해 확장되었다.
옥시토신-표적화 앱타머를 검사하기 위한 준비에서, 라만-기반 호르몬 검출의 초기 연구는 문헌 [He et al. (Analytica Chimica Acta 759 (2013) 74-80)]에 보고된 바소프레신-표적화 앱타머를 사용하여 수행하였다. 바소프레신이 옥시토신과 같은 9개 아미노산 호르몬이며, 2개 아미노산이 옥시토신과 상이하기 때문에, 옥시토신에 대한 탁월한 대용물이다. 바소프레신 앱타머는 TAMRA-변형된 우라실 포르포르아미다이트로 변형되어, 표적 호르몬에 노출시 앱타머의 구조 변화가 확인되게 하였다: TAMRA는 FAM의 것과 유리하게는 필적한 강한 라만 스펙트럼 피쳐를 갖는 것으로 공지되어 있으며, 바소프레신에 대한 유사한 라만 기반 검출법에 사용되었다. TAMRA-변형된 염기를 NP 표면으로부터 가장 먼 위치인 앱타머의 22번 위치에 삽입시켰으며, 이러한 위치는 바소프레신에 앱타머 변형된 NP의 노출시 TAMRA 신호 강도에서 가장 큰 차이를 생성하는 것으로 가정되었다.
바소프레신 앱타머-변형된 NP의 반응을 두 가지 방식으로 연구하였다. 첫 번째는, 시스템이 바소프레신에 노출되었을 때 관찰된 변화와 시스템이 바소프레신과 길이, 크기 및 질량은 유사하나 서열에서는 그렇지 않은 뉴로펩티드인 물질 P 및 옥시토신에 노출되었을 때 관찰된 변화의 비교를 통하여 표적 분자를 구별하는 앱타머-기반 검정 능력을 확립하였다. 두 번째 연구는 염료-변형된 앱타머 단독으로, 및 MCP 또는 MCH와 앱타머로 구성된 단일층을 갖는 NP를 사용하여 관찰된 반응의 비교를 통한 표면 변형의 효과를 확립하였다.
3가지 단백질에 대한 반응 비교는 표적 분자에 대한 바소프레신-앱타머 기반 SERS 검정의 선택성을 드러냈다 (도 4, 패널 a). 1 nM 내지 10 μM 범위에 걸친 바소프레신 농도에 대한 앱타머-변형된 NP의 노출은 라만 스펙트럼에서 1355 cm-1 피쳐 강도의 선형 증가를 나타내었다. 이것은 반응이 유사한 농도 범위의 옥시토신에 노출된 것에 대한 반응으로 측정된 경우가 아니었으며, 여기에서 선택된 피쳐의 강도와 분석물의 농도 사이에는 상관관계가 거의 없었다. 물질 P에 시스템의 노출은 농도와 피쳐 강도 간의 일부 상관관계를 나타냈으나, 이러한 상관관계는 바소프레신으로 관찰된 것만큼 우수하지 않았다. 놀랍게도, 라만 신호의 강도가 정량화될 수 있는 내부 표준으로서 의도된 MCP의 존재는 스펙트럼 피쳐의 강도를 현저히 증가시킨다 (도 4, 패널 b). 이러한 효과 즉, 제 2 화합물을 단일층에 첨가할 때의 증강이 MCH의 첨가시 관찰되었다. 그러나, 이러한 설정에서 MCH의 첨가는 스펙트럼 피쳐의 강도를 증가시키지 않았고, VP 농도와 피쳐 강도 사이의 상관관계 없이 응답 특징을 약화시켰다.
앱타머 변형된 NP를 사용하는 옥시토신 및 바소프레신과 같은 구조적으로 유사한 호르몬 분자의 차별화를 넘어서, 본 발명자들의 노력은 라만-기반 분석 적용에 공통되는 문제인 스펙트럼 피쳐 강도의 재현성 향상에 집중하였다. 특히, 건조 시료를 사용한 재현성 문제는 종종 "핫 스팟", 또는 분석물이 2개의 라만 활성 NP의 교차점에 놓여 앱타머가 개발된 표적에서 비정상적으로 큰 신호 증강을 유도하는 영역의 존재와 관련된다.
실시예
1-
4에 대한 참조
II. 라임병을 검출하기 위한 시약 및 방법 (실시예 5-8)
라임병은 다양한 진드기-매개 병원체 예컨대, 그람-음성 스피로세테 보렐리아 버그도르페리에 의해 초래되며 익소디드(Ixodid) 진드기 종에 의해 전염된다. 이는 매년 보고된 사례 수가 꾸준히 증가하는 미국에서 독보적인 벡터-매개 감염병이다. (CDC - Cases by State - Lyme Disease <http://www.cdc.gov/lyme/stats/chartstables /reportedcases_statelocality.html> (accessed Nov 18, 2013)). 발병 지역의 고전적인 황소 눈 발진 (홍반성 이주 또는 EM 발진)의 라임병 증상 제시는 진단 검사를 수반하지 않고 즉각적인 치료를 나타내는 반면, 라이병 경우의 20% 정도는 EM 발진의 제시 또는 인식 없이 그리 잘 진단되지 않은 2차 증상으로 진행된다. (Biesiada, G. et al. Arch Med Sci 2012, 8, 978).
현재 CDC-승인된 진단 검사는 2-단계 시스템으로서, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 이은 면역블롯 (IB) 분석으로 구성된다. (Ellis, D. I. et al. Analyst 2013, 138, 3871; Wu, X. et al. Analyst 2013, 138, 3005). 검사의 두 번째 단계인 IB 분석은 비용과 시간 소모적이며 기술적으로 어렵다. 두 단계 혈청학적 라임 검사법의 내재적 결함은 결과 해석의 복잡성과 감염 후 시기에 대한 항체 생산의 의존성을 포함한다 (DeBiasi, R. L. et al. Current Infectious Disease Reports 2014, 16, 450). 검사가 너무 일찍 (감염 후 6-8 주) 또는 너무 늦은 (감염 후 4-6 개월) 경우, 항-라임 항체는 검출가능한 수준으로 존재하지 않을 수 있다. 이는 열, 관절통, 및 "뇌 안개"와 같은 증상이 비특이적이며 진단하기 어려운 라임병의 경우 특히 문제가 된다. 임상 공동체는 검사가 매우 불안정하여 1차 담당의가 처방하기를 꺼려하며, 환자와의 상호작용 및 질병에 대한 이들의 경험에 대한 많은 느낌이 더욱 신뢰할 수 있는 진단 접근법이라고 여긴다. 이는 중요한 임상적 결점이다: 라임병의 정확한 진단은 간단한 항생제의 짧은 과정으로의 치료를 허용할 것이며 치료되지 않은 경우와 관련된 비용 및 고통을 예방할 것이다. 수많은 혈청학적 라임병 검사가 최근 개발되었으며 미국에서 사용되고 있지만, 새로운 검사는 불충분한 항원 제시로 인한 유사한 수준의 위양성 및/또는 추가적인 위음성을 보인다; (Wu, X. et al. Analyst 2013, 138, 3005) 어떤 것도 CDC-승인된 2단계 검사 포맷을 대체하지 않았다.
낮은 민감도는 CDC-승인 검사를 힘들게 하고, 현재 프로토콜에 비해 개선된 것으로서 증진된 검사에서 논의되지 않았던 결함이다. 검정 시스템의 낮은 민감도가 보렐리아 스피로헤타의 면역-억제 성질, 진드기 벡터에 의해 분비된 제제, 또는 기타 비공지된 인자로 인한 것인지의 여부와 상관없이, 인간 혈액 또는 혈청에서 라임 병원체, B. 버그도르페리, 및 기타 진드기-매개 병원체를 검출하기 위한 고도로 민감성인 검정은 최전선의 의사에게 이러한 질병과 싸우는데 있어서 가치있는 도구 즉, 현재 이용가능하지 않지만 극도로 필요한 도구를 제공할 것임이 분명하다.
실시예
5
B.
버그도르페리
표면 단백질
OspA에
대한
앱타머
선택
신규한 고-친화성 라임 특이적 앱타머를 특수하게 설계되고 제작된 마이크로-칼럼을 사용함으로써 발생시켰다 (도 7, 패널 a). 이러한 칼럼을 표적 컨쥬게이팅된-아가로스 비드 또는 블랭크 아가로스 비드 (음성 선택용)로 패키징하였다. 칼럼은 직렬로 또는 병렬로 진행될 수 있으며, 이는 여러 표적에 대한 앱타머를 동시에 효율적으로 선택할 수 있게 한다. 도 7, 패널 b에 도시된 개략도는 RNA 앱타머의 선택을 보여주며, 시스템을 통해 RNA 앱타머는 단순히 역전사 및 전사 단계를 제거함으로써 단일-가닥 DNA 앱타머의 발생에 용이하게 적응가능하다.
앱타머 개발 공정은 Dual-사이클-SELEX (RAPID-SELEX)를 통한 RNA Aptamer Isolation으로 불리는 유선형의 앱타머 선택 공정을 이용하였으며, 이는 불필요한 DNA 증폭 및 정제 단계가 제거된다. (Szeto, K. et a;. PLoS ONE 2013, 8, e82667.) RAPID-SELEX는 한 세트의 칼럼으로부터 용출된 앱타머 풀이 선택 라운드 간의 DNA 증폭 없이 제 2 칼럼 세트에 첨가되게 하며, 이는 모든 홀수 라운드 후의 PCR 증폭을 제거한다. (Szeto, K. et al. PLoS ONE 2013, 8, e82667.) 모든 기타 증폭 및 정제 단계의 제거는 앱타머 선택의 각 라운드의 평균 시간을 대략 50% 감소시키며, 전체 선택 공정에 필요한 시간은 67% 내지 75% 감소시킨다.
고처리량의 Next Generation DNA Sequencing (NGS)은 생물 자원 센터 (Biotechnology Resource Center (BRC)) 및 코넬 대학의 생물정보학 센터(Bioinformatics Center)와 함께 마이크로칼럼 SELEX의 매 라운드로부터 선택된 앱타머 서열을 결정하는데 사용하였다. Illumina NGS 장비는 2 x 107 - 2 x 108 DNA 서열/진행을 발생시킬 수 있으며, 이는 SELEX 공정에 의해 DNA 서열의 풍부화에 대한 매우 정확한 통계학적 분석을 용이하게 하였다.
상기 기술된 방법을 이용하여, OspA에 결합하고 이를 검출하는 DNA 앱타머를 선택하였다: SEQ ID NO: 67-72.
표 2: OspA 앱타머
형광 이방성을 이용하여 OspA에 대해 발생된 앱타머의 민감도를 결정하였다. 도 8은 OspA 단백질에 OspA 앱타머의 결합을 입증하는 형광 이방성 실험 결과를 보여준다. 표적 단백질 농도 증가에 따른 이방성의 현저한 증가는 이러한 OspA DNA 앱타머가 OspA 단백질에 대해 Kd = 2.2 nM을 가짐을 드러냈다.
B. 버그도페리 OspC 및 BmpA에 특이적인 앱타머를 발생성시키고, 시퀀싱하고 동일한 방법을 사용하여 특징 규명하였다.
표 3: OspC 및 BmpA 앱타머
형광 이방성은 EMSA와 마이크로플레이트 포획 검정으로 보완될 수 있어 이들의 표적에 대한 DNA 앱타머의 결합 친화성을 허용한다.
실시예
6
표적 단백질에 결합하는
OspA
,
OspC
및
BmpA
앱타머의
특징 규명
특정 B. 버그도르페리 단백질에 대한 개별 앱타머의 결합 친화성을 검출하고 정량화하는데 필요한 방법을 개발하였다. 다양한 방법이 잠재적인 DNA 앱타머 올리고뉴클레오티드에 결합하는 표적을 입증하는데 이용될 수 있다. 전기영동 이동성 검정 (EMSA); 형광 이방성 측정; DNA 풀-다운 검정; 마이크로플레이트 포획 검정이 이의 표적에 대한 앱타머 친화성을 결정하는데 이용될 수 있으나, 본 발명자들은 OspA에 대해 발생된 앱타머의 민감도를 결정하는데 형광 이방성을 효과적으로 사용하였다 (도 8). 간략하게는, 형광 라벨링된 표적 단백질, 이 경우 OspA 또는 OspC를 표적 특이적 앱타머의 농도 증가에 대해 검정하였다. 앱타머 결합시 형광 단백질의 회전 속도 변화는 염료 방출의 분극가능성의 변화를 통해 검출하였으며, 이는 앱타머의 이의 표적에 대한 친화성을 결정하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 검사를 제공한다. 표적 단백질 농도 증가에 따른 이방성의 현저한 증가는 OspA 앱타머가 대략 2.2 nM의 Kd로 결합함을 나타냈다.
앱타머 결합이 복합물의 크기를 현저하게 증가시켜, 용액 중 앱타머의 회전 속도를 현저하게 감소시킬 경우, 형광 라벨링된 단백질의 이방성 측정이 가장 효과적이다. 형광 이방성이 OspA 앱타머의 표적에 대한 OspA 앱타머의 Kd를 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있지만, 모든 앱타머-표적 상호작용에 대해서 그런 것은 아니다. 형광 이방성이 효과적인 것으로 입증되지 않은 경우, DNA 앱타머의 표적에 대한 DNA 앱타머의 결합 친화성을 허용하는 EMSA 및 마이크로플레이트 포획 검정이 이용될 수 있다.
3개의 표적 단백질에 대한 가장 높은 친화성을 갖는 앱타머를 확인하기 위해, 각 B. 버그도르페리 단백질에 대한 가장 통상적인 앱타머 서열 중 최대 6개를 합성하고 스크리닝하였다. 0.1 nM 내지 100 nM 라임-특이적 앱타머 범위의 농도가 이러한 실험에 대해 이용되며; < 1 nM 내지 5 nM의 결합 친화성이 사용에 적합한 것으로 간주된다. 앱타머의 특이적 표적에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 1 또는 2개의 앱타머가 실시예 7 및 8에 사용된다.
실시예
7
SERS에
의한 B.
버그도르페리
단백질의 검출
B. 버그도르페리-특이적 OspA, OspC 및 BmpA 단백질의 포획 및 검출을 위해 실시예 5에서 최적화된 티올화된 앱타머 (ApNP)로 나노입자를 변형시켰다. Ag 나노입자를, 마이크로웨이브 조사하의 소듐 시트레이트 (Leona, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009, 106, 14757) 또는 시중 공급원으로부터 구입한 Au NP (예를 들어, Ted Pella; Redding, CA; or Nanopartz;, Loveland, CO)로의 실버 니트레이트 용액의 환원을 포함하는 간단하고 확립된 문헌의 절차를 이용하여 합성하였다.
앱타머로의 표면 변형은 표준 티올-금속 상호작용을 통해 수행되며, 표적 NP 크기에 적절한 앱타머의 농도를 식 1을 이용하여 계산하였다 (Taton, T. A. In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry; John Wiley & Sons Inc.: New York, 2002).
앱타머의 Amt = An x Cn x Do x V (1)
An = NP 표면적 (cm-2); Cn = 입자 농도 (입자 L-1); Do = Ap 밀도 (mol cm-2); V = 반응 부피 (L)
표면 변형의 효율을 결정하기 위해, 형광-변형된 라임-특이적 앱타머를 미르킨과 공동연구가에 의해 개발된 형광분석 정량화 기법에 사용하였다. (Demers, L. M. et al. Anal Chem 2000, 72, 5535).
실시예 5에 개발된 앱타머를 표적 분자에 대한 대용물로서 작용하는 라만-활성 염료로 변형시켰다. 이는 개략적으로 도 9, 패널 a에 나타냈다 (문헌 [Baker, B. R. et al. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3138]으로부터 유래된 도면). 원리를 입증하기 위해, 바소프레신을 표적으로 하기 위해 개발된 앱타머를 강한 라만 신호를 갖는 것으로 알려진 분자인 TAMRA로 변형시켰다 (도 10). (Cao, Y.C., et al. Science 2002, 297, 1536). 라만 신호의 강도는 바소프레신의 농도와 함께 증가되었으며, 이는 표적 분자에 대한 대용물로서 사용되는 라만 활성 염료의 원리를 입증한다. 이러한 TAMRA-변형된 앱타머의 유사한 폴리펩티드 (즉, 물질 P 및 옥시토신; 데이터 미도시됨)에의 노출은 라만 신호 강도의 현저한 증가를 유발시키지 않았으며, 이는 앱타머-기반 SERS-검출 접근법이 이러한 표적을 검출하고 현저한 구조적 유사성을 갖는 분자로부터 표적을 구별해낼 수 있게 한다.
도 9, 패널 b가 인식 요소로서 염료-변형된 앱타머의 원리를 입증하였지만, 서열에서의 염료의 배치 및 염료의 실체는 라임병-관련 단백질에 대한 최적의 민감성을 제공할 수 있다. 실시예 5에서 개발된 각 앱타머는 말단 위치 및 다수의 내부 위치에서 라만-활성 마커로 변형된다. 염료는 높은 신호 강도 (예를 들어, FAM, Cy3, Cy 3.5, Cy5 및 TAMRA) 및 용이하게 확인가능하게 되는 구별되는 스펙트럼 피쳐를 위해 선택되었다 (도 10). (Cao, Y. C. et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 125, 14676). 라만-활성 염료는 시중의 시약을 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성 동안 앱타머 DNA 서열로 혼입된다.
라만 연구는 분광 방법을 최적화하기 위해 연구 등급 계측을 사용하여 시작된다. 이어서, 이러한 방법들은 휴대용의 시중의 벤치 탑 (bench top) 또는 포켓용 라만 분광기에서 자주 사용되는 파장인 785 nm 입사광을 이용하여 휴대용의 상업적으로 이용 가능한 분광기를 사용하여 재-검사하였다.
B. 버그도르페리-특이적 단백질에 대해 설계되는 앱타머-변형된 NP 각각이 B. 버그도르페리-특이적 단백질 중 하나를 함유하는 용액에 노출되어, 앱타머가 표적을 포획하게 한다. 이러한 공정은 앱타머가 개발되지 않은 B. 버그도르페리 단백질의 존재하에 ApNP 각각으로 반복하여 ApNP의 표적 분자에 대한 ApNP의 특이성을 입증하였다. 표적 포획을 위한 인큐베이션 조건을 최적화하기 위해, 세가지 변수를 연구하였다: NP 표면에서의 앱타머 농도, 라만 스펙트럼 피쳐를 안정화시키고 최적화시키기 위해 의도된 첨가제의 농도 및 조성, 및 표적 대사산물과 ApNP의 인큐베이션 시간. NP 표면에서 앱타머 농도와 인큐베이션 시간의 최적의 조합을 분석물 각각에 대한 검출 한계를 결정하기 위해 조사하였다. 이러한 연구에서 확립된 검출 한계는 확립된 표준 생물학적 검정 예컨대, 시중의 라임 면역검정법 (예를 들어, ELISA)의 민감도와 비교하여, 후속 연구와 비교할 수 있는 값을 제공하였다.
기타 표면 변형이 수행될 수 있다. 예를 들어, 표면 변형은 앱타머에 의해 덮여지지 않은 나노입자 표면의 일부를 코팅하도록 PEG를 포함할 수 있다. 대안적으로, 표면 변형은 알킬 티올을 포함할 수 있다.
실시예
8
B.
버그도르페리
단백질 인간 라임병 혈청 패널의 신속한 검출
인간 라임병 혈청 패널에서 B. 버그도르페리 단백질의 신속한 검출이 웨일 코넬 의학 대학의 임상 및 번역 과학 센터 및 공동 임상 시험 사무실(Clinical and Translational Science Center and the Joint Clinical Trials Office)과 공동으로 수행된다. 인간 혈청 패널은 두 개의 분리된 공급원으로부터 수득하였다: 다양한 감염병 및 다른 질병 상태 (www.seracare.com/Products/Panels)에 대해 인간 혈청 패널을 제공하는 회사인 SeraCare의 시중에서 입수가능한 라임병 혈청 패널; 및 미국 CDC (Molins, 2014 doi : 10.1128 / JCM.01409-14)에서 입수가능한 라임병 혈청 패널. 이러한 패널은 다양한 질병 단계에서 B. 버그도르페리로 감염된 개체로부터 및 비감염된 개체로부터의 혈청을 포함한다. 이러한 패널은 임상전 검사에 이상적이다.
이러한 연구를 위해, 5-10 μL의 인간 혈청, 음성 대조군 또는 라임 양성 시료 중 어느 하나를 완충액 내로 희석시키고 실시예 6에 기술된 바와 같은 ApNP와 혼합하였다. B. 버그도르페리 표적 단백질로의 ApNP의 결합 후, 시료를 반으로 나누었다; 한 분취물은 벤치 탑 라만 분광기에서의 SERS에 대해 분석하였으며, 두 번째 분취물은 시중의 B. 버그도르페리 면역검정을 이용하는 분석에 사용하였다. 상기 언급된 패널은 비감염된 개체로부터의 혈청을 포함하며 음성 대조군으로서 사용된다. 이러한 연구에서, 하기를 포함하는 많은 변수가 직접적으로 연구되었다: 최적의 결합에 필요한 시간; 최적의 신호에 필요한 ApNP의 농도; B. 버그도르페리 단백질의 검출에 필요한 최소량의 인간 혈청; 및 OspA, OspC, 및 BmpA 검정의 상대적 민감성. SERS-기반 B. 버그도르페리 검정의 민감성 및 특이성이 결정된다. 다양한 통계학적 분석이 최상의 진단 모델을 결정하고 인간에서 B. 버그도르페리 검출 최적화에 필요한 컷-오프를 결정하는데 이용된다.
감염된
익소데스
스카풀라리스
진드기로부터의 B.
버그도르페리
단백질의 신속한 검출
실시예 5, 6 및 7에서 개발된 검정이 감염된 I. 스카풀라리스 진드기에서 B. 버그도르페리의 검출을 입증하는데 사용된다. 2개의 별개의 공급원으로부터 수득된 진드기를 사용하였다. 대조군인 비감염된 I. 스카풀라리스 진드기 약충을 오클라호마 주립 대학 진드기 양육 시설(Tick Rearing Facility)로부터 구입하였다. 진드기 양육 시설은 연구 적용을 위한 다양한 생활 주기 단계에서 비감염된 실험실 양육된 진드기를 제공하는 유료 서비스 시설이다.
야생형 B. 버그도르페리-감염된 진드기를 코넬 대학의 천연 자연부 (Department of Natural Resources)와 공동으로 수집하였다. 이들의 서식지에서 I. 스카풀라리스의 생존에 대한 환경 조건의 효과를 연구하였다. 진드기를 하기와 같이 수집하였다: 익소데스 스카풀라리스 약충을 이들의 계절 활동 피크 동안 5월 내지 7월 사이에서 들판에서 수집하였다. (Falco, R. C. et al. Am. J. Epidemiol. 1999, 149, 771) 잘 확립된 드래그 샘플링 방법을 이용하여 이들을 수집하였다: 1평방 미터 크기의 백색 천을 숲이 우거진 지역의 초목 및 떨어진 잎 위로 훑었다. (Schulze, T. L. et al. J. Med. Entomol. 1997, 34, 615.) 천은 I. 스카풀라리스 자체가 부착되는 동물 모발 섬유를 모방한다. 약충이 추가의 분석을 위해 사용될 수 있을 때까지 캐리 인스티튜트(Cary Institute)에서 -80℃에서 보관하였다. 캐리 인스티튜트로부터의 연구는 뉴욕의 허드슨 강 하곡에서 수집된 I. 스카풀라리스 약충 중 55%가 B. 버그도르페리로 감염됨을 보여준다. (Aliota, M. T. et al. Vector Borne Zoonotic Dis. Larchmt. N 2014, 14, 245)
실험실에서 양육하거나 수집한 5 내지 10마리 진드기 약충을, 마크로원심분리 튜브에 이들을 넣고 완충된 세포용해 용액에서 일회용 균질화제로 균질화시킴으로써 용해시켰다. 진드기가 파열되면, 균질물의 분취물을 간단히 원심분리하여 파편을 제거하고 추출물을 실시예 7에 기술된 바와 같이 ApNP와 혼합하였다. B. 버그도르페리 표적 단백질에의 ApNP의 결합 후, 시료를 반으로 나누었다; 한 분취물은 벤치 탑 라만 분광기에서의 SERS에 대해 분석하였으며, 두 번째 분취물은 시중의 B. 버그도르페리 면역검정을 이용하는 분석에 사용하였다. 오클라호마 주립 대학 진드기 양육 시설로부터 획득한 실험실 양육된 진드기 약충은 음성 대조군으로서 작용한다.
하기를 포함하는 많은 변수가 직접적으로 연구되었다: 최적의 결합에 필요한 시간; 최적의 신호에 필요한 ApNP의 농도; Osp 단백질의 검출에 필요한 최소 수의 감염된 약충; 및 OspA, OspB, 및 OspC 검정의 상대적 민감성. SERS-기반 B. 버그도르페리 검정의 민감성 및 특이성이 결정된다.
참조 통합
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허 및 공개된 특허 출원뿐만 아니라 도면 및 서열 목록의 내용은 각각의 개별적인 공개 또는 특허가 참조로 구체적으로 및 개별적으로 통합된 것처럼 그 전체가 참고 문헌으로 통합된다. 일치하지 않는 경우, 본 명세서에서 임의의 정의를 포함한 본 출원이 기준이 될 수 있다.
등가물
첨부된 청구 범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 당업자는 관례적인 실험만을 이용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 특정 구체예가 논의된 반면, 상기 명세서는 예시적이고 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형이 본 명세서의 숙지 시 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 그 균등물의 전체 범위와 함께 청구범위, 및 이러한 변형과 함께 명세서를 참조로 하여 결정되어야 한다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
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<223> synthetic oligonucleotide
<400> 29
attctttagc tcctagacct ttagcagcaa ggtccatat 39
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 30
attggtatca gggttaatcg tgccaagaaa agcggcatg 39
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 31
cagatattga agcagaacgc aaaaagagag atgagattg 39
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 32
aaaaacgata aaccaaccat cagcatgagc ctgtcgcat 39
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 33
cagtaggcgg aaaacgaaca agcgcaagag taaacatag 39
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 34
cctcacttaa gtggctggag acaaataatc tctttaata 39
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 35
gaagtgccag cctgcaacgt accttcaaga agtccttta 39
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 36
gcatcatctt gattaagctc attagggtta gcctcggta 39
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 37
ggatttgaga atcaaaaaga gcttactaaa atgcaactg 39
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 38
tgaccagcaa ggaagccaag atgggaaagg tcatgcggc 39
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 39
tttcctgctc ctgttgagtt tattgctgcc gtcattgct 39
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 40
ggtcagtagc aatccaaact ttgttactcg tcagaaaat 39
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 41
aaatagttgt tatagatatt caaataaccc tgaaacaaa 39
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 42
gggagggtag tcggaaccga agaagactca aagcgaacc 39
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 43
gtcatttggc gagaaagctc agtctcagga ggaagcgga 39
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 44
cggcgtacgg ggaaggacgt caatagtcac acagtcctt 39
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 45
ataatctctt taataacctg attcagcgaa accaatccg 39
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 46
attagctgta ccatactcag gcacacaaaa atactgata 39
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 47
ttgttataga tattcaaata accctgaaac aaatgctta 39
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 48
tgtagcgaac tgcgatgggc atactgtaac cataaggcc 39
<210> 49
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 49
agcttactaa aatgcaactg gacaatcaga aagagattg 39
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 50
tcaatagcag gtttaagagc ctcgatacgc tcaaagtca 39
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 51
ccgcttcggc gttataacct cacactcaat cttttatca 39
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 52
tatcagggtt aatcgtgcca agaaaagcgg catggtcaa 39
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 53
caccaaacat aaatcacctc acttaagtgg ctggagaca 39
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 54
tccatatctg actttttgtt aacgtattta gccacatag 39
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 55
aataatgttt atgttggttt catggtttgg tctaacttt 39
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 56
acgttaacaa aaagtcagat atggaccttg ctgctaaag 39
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 57
acgttggctg acgaccgatt agaggcgttt tatgataat 39
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 58
catggtggcg aataagtacg cgttcttgca aatcaccag 39
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 59
cgggcaataa tgtttatgtt ggtttcatgg tttggtcta 39
<210> 60
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 60
gcgatgggca tactgtaacc ataaggccac gtattttgc 39
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 61
aacaaaaagt cagatatgga ccttgctgct aaaggtcta 39
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 62
acgcggcaca gaatgtttat aggtctgttg aacacgacc 39
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 63
atggtggcga ataagtacgc gttcttgcaa atcaccaga 39
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 64
ccgccagtta aatagcttgc aaaatacgtg gccttatgg 39
<210> 65
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 65
ttttaaagcg ccgtggatgc ctgaccgtac cgaggctaa 39
<210> 66
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 66
taacagatac aaactcatca cgaacgtcag aagcagcctt aacagataca aactcatcac 60
gaacgtcaga agcagcct 78
<210> 67
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 67
catgacaccg tacctgctct aataagcacg ccagggacta ttagatcgga atagcacacg 60
tctgaactcc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 68
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 68
catgacaccg tacctgctct aataagcacg ccagggacta ttagatcgga agagcacacg 60
tgtgaactcc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 69
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 69
catgacaccg tacctgctct acgagattca agcactccag ggactattag atcggaagag 60
cacacgtctg aagcacgcca gggactatta 90
<210> 70
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 70
catgacaccg tacctgctct acgagattca agcacgccag ggattattag atcggaagag 60
cacacgtctg aagcacgcca gggactatta 90
<210> 71
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 71
catgacaccg tacctgctct tgcttttcgt gcgcgcataa aatactttga tactgtgccg 60
gatgaaagcg aagcacgcca gggactatta 90
<210> 72
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 72
catgacaccg tacctgctct tgcttttcgt gcgcgcataa aataccttga tactgtgccg 60
tatgaaagcg aagcacgcca gggactatta 90
<210> 73
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 73
catgacaccg tacctgctct gcggtgctgt atcgtcgttt aggctgttac cagggccacc 60
ggacagaggt aagcacgcca gggactatta 90
<210> 74
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 74
catgacaccg tacctgctct cgtatagatc ctctcgcgct tcggttttta gaagtattca 60
aggtatcatc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 75
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 75
catgacaccg tacctgctct gatcagcctg gtcaacgggt ggtcctgtgc caagctcgaa 60
aattcgccga aagcacgcca gggactatta 90
<210> 76
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 76
catgacaccg tacctgctct tggagctaga gagccggtga tcgaaattct ggatgtttct 60
gacgtttgct aagcacgcca gggactatta 90
<210> 77
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 77
catgacaccg tacctgctct accccggaaa tgattagcca ttgtggtact catctgggca 60
gtcagcacat aagcacgcca gggactatta 90
<210> 78
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 78
catgacaccg tacctgctct ttaacccctc gcggaggtgt acacgggcct acataatcct 60
ccgaggttcc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 79
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 79
catgacaccg tacctgctct ttacgtttgg gacgtctggc gaagccacca caagctagcc 60
ctccaattta aagcacgcca gggactatta 90
<210> 80
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 80
catgacaccg tacctgctct ttgatcatca cggcacactc attacggttg gatatactag 60
tccggttaga aagcacgcca gggactatta 90
<210> 81
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 81
catgacaccg tacctgctct cccttctgac tggatgccgg atctgggccg attttgttcg 60
cgccccgccc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 82
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 82
catgacaccg tacctgctct ttccgctggt tccacgtggt cccgcgtagg ttcgtgtgcg 60
cgcaaaatcc aagcacgcca gggactatta 90
<210> 83
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 83
catgacaccg tacctgctct gcccctgcgt gccgcagtca atcaccatgt tgttattacg 60
gactacctgg aagcacgcca gggactatta 90
<210> 84
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic aptamer
<400> 84
catgacaccg tacctgctct ccggtacgat aggggttgag ttggacacac tgcctggtta 60
aattgtgcag aagcacgcca gggactatta 90
Claims (20)
- (b) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (a) 하나 이상의 표면 증강된 라만 분광법(surface enhanced Raman spectroscopy: SERS)-활성 표면; 및
(c) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는, 분석물을 검출하기 위한 SERS-활성 시약. - 제 1항에 있어서, SERS-활성 표면이 금속 (비제한적으로, 은, 금, Cu, 특정한 다른 전이 금속 및 질화티탄 포함), 반도체 기판 (비제한적으로, 산화티탄, 산화아연, 셀렌화아연 포함) 또는 반금속 (비제한적으로, 그래핀 및 이황화몰리브덴 포함)으로 구성된 군으로부터 선택되는 시약.
- 제 1항에 있어서, 앱타머가 작용기화된 시약.
- 제 3항에 있어서, 앱타머가 SERS-활성 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 시약.
- 제 1항에 있어서, 앱타머가 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 및 66으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 시약.
- 제 1항에 있어서, 라만-활성 마커가 염료, 형광 마커, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 알켄, 알킨 또는 아지드를 포함하는 시약.
- 제 6항에 있어서, 라만-활성 마커가 형광 또는 비-형광 라만-민감성 마커이며, 상기 마커는 아지드, 알킨, 플루오레세인 (FAM), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA), Cy3, Texas-Red (TR), Cy3.5, Rhodamine 6G, Cy5, TRIT (테트라메틸 로다민 이소티올), NBD (7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛(cresyl fast violet), 크레실 블루 바이올렛(cresyl blue violet), 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플로우레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 석시닐플루오레세인, 아미노아크리딘 및 양자점으로 구성된 군으로부터 선택되는 시약.
- 제 1항에 있어서, 앱타머가 분석물의 결합시 입체형태 변화를 겪는 시약.
- 제 8항에 있어서, 입체형태 변화가 라만-활성 마커를 SERS-활성 표면의 표면에 근접하게 이동시켜 라만 신호의 증강을 유도하는 시약.
- 제 1항에 있어서, 라만-활성 마커가 앱타머에 공유적으로 부착된 시약.
- 제 1항에 있어서, 분석물이 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당(sugar), 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 리피드, 호르몬, 대사산물, 사이토킨, 케모킨, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약제, 영양분, 프리온, 독소(toxin), 독, 폭발물, 살충제, 화학 전쟁 약물(chemical warfare agent), 바이오해저드 제제(biohazardous agent), 방사성 동위원소, 비타민, 헤테로시클릭 방향족 화합물, 발암원, 돌연변이원, 마약(narcotic), 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 노폐물 및 오염물로 구성된 군으로부터 선택되는 시약.
- a) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약;
b) 적어도 하나의 라만-민감성 마커 대조군;
c) 적어도 하나의 양성 생체액 또는 조직 대조군; 및
d) 적어도 하나의 음성 생체액 또는 조직 대조군을 포함하는 진단 키트. - (a) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 하나 이상의 SERS-활성 시약;
및 b) 라만 검출기를 포함하는 검출 시스템. - 제 13항에 있어서, 라만 검출기가 휴대용이거나 휴대용이 아닌 시스템.
- 제 13항에 있어서, 시료 수집 장치를 추가로 포함하는 시스템.
- 생체 시료 중 하나 이상의 분석물의 존재를 결정하는 방법으로서,
방법이 a) 생체 시료를 획득하는 단계;
b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계;
c) 분석물이 앱타머와 접촉되게 하는 단계;
d) 앱타머에 분석물을 결합시키는 단계로서, 상기 결합은 앱타머가 입체형태 변화를 겪게하는 단계;
e) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사(irradiate)하는 단계;
f) 라만 신호를 검출하여 (a) 라만 스펙트럼(um)을 발생시키는 단계; 및
g) 대조군의 기준 라만 신호와 (f)에서 검출된 라만 신호를 비교하는 단계로서, (f)에서 검출된 상기 라만 신호가 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물의 존재가 결정되는 단계를 포함하는 방법. - 제 16항에 있어서, 대조군과 비교하여 (f)의 라만 스펙트럼에서 라만 신호 증가가 하나 이상의 분석물의 양과 상관관계가 있을 수 있는 방법.
- 제 17항에 있어서, 분석물의 결합시 앱타머의 입체형태 변화가 라만-활성 마커를 SERS-활성 표면에 근접하게 이동시키는 방법.
- 대상체에서 질병 또는 장애를 진단하는 방법으로서,
a) 대상체로부터 생체 시료를 획득하는 단계;
b) (ii) 하나 이상의 앱타머로 변형되거나 변형되지 않은 (i) 하나 이상의 SERS-활성 표면; 및 (iii) 하나 이상의 라만-활성 마커를 포함하는 적어도 하나의 SERS-활성 시약에 생체 시료를 접촉시키는 단계;
c) 적어도 하나의 SERS 시약이 생체 시료 중의 하나 이상의 분석물에 결합되게 하는 단계로서, 상기 결합이 SERS 시약의 하나 이상의 앱타머에 대한 입체형태 변화를 초래하는 단계;
d) 하나 이상의 분석물에 결합된 적어도 하나의 SERS-활성 시약을 조사하는 단계;
e) 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 검출하는 단계; 및
f) (e)에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 라만 신호를 실험실 유래된 음성 대조군 시료, 대조군 대상체 (건강한 대상체)로부터 받은 생체 시료, 또는 많은 대조군 대상체 (건강한 대상체)로부터의 풀링된 생체 시료에서 검출된 상기 적어도 하나의 SERS-활성 시약의 기준 라만 신호와 비교하는 단계로서, (e)에서 검출된 상기 라만 신호가 위치 및/또는 강도에 있어서 상기 기준 라만 신호와 상이한 경우 상기 질병이 진단되는 단계를 포함하는 방법. - 제 19항에 있어서, 질병 또는 장애가 감염성 질병, 증식성 질병, 신경퇴행성 질환, 암, 심리적 질환, 대사 질환, 자가면역 질환, 성매개 병, 위-장관 질환, 폐 질환, 심혈관 질환, 스트레스- 및 피로-관련 장애, 진균병, 병원성 질환, 및 비만-관련 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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