JPH06317593A

JPH06317593A - 生体特異的固相担体を使用する検定法

Info

Publication number: JPH06317593A
Application number: JP4704294A
Authority: JP
Inventors: Antti Juhana Iitiae; ユハナイーティエアンティ; Timo Nils-Erik Loevgren; ニルス−エリクロェーブグレンティモ; Kim Sverker Immanue Pettersson; スベルカーイマニュエルペターソンキム
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-17
Publication date: 1994-11-15
Also published as: FI93781B; EP0617286A2; FI931198A0; EP0617286A3; EP0617286B1; DE69422210D1; ES2139728T3; FI93781C; DE69422210T2; FI931198A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、生体特異的検定法を提供すること
を目的とする。【構成】本方法は、異なるカテゴリー中に分配され且
つ異なる分析物を表す微粒子を使用し、方法中、異なる
カテゴリーに属する微粒子が蛍光分子(1) により標識さ
れ、且つ、異なるカテゴリーに属する微粒子が異なる分
析物に結合する生体アフィニティー反応体A により被覆
されており、そして、長寿命の蛍光を放射する異なる分
子(1、2)により、上記の微粒子及び生体アフィニティー
反応体B であって蛍光分子(2) により標識されたものを
標識付けすることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体特異的検定法であ
って、同一サンプル内の複数の分析物の同時測定を可能
にするような検定法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】本発
明の背景を明らかにするために本明細書中で使用する刊
行物及び他の物、並びに特に、その実務に関する追加の
詳細を提供するためのケースを、引用により本明細書中
に取り込む。微粒子は、様々な生体アフィニティー検定
において固相として使用されてることができる。このよ
うな検定においては、それは、複数の同時検定反応を行
うために、しばしば有用又は必要であり、これにより並
行した検定段階の繰り返しを省略することができる。多
変数検定を行うための1 つの可能性は、固相担体として
の微粒子の使用により提供される(Soini, E., US 5,02
8,545) 。このような系においては、特異的なプローブ
を、上記の粒子に結合させ、その後、異なる特異性を具
現化する粒子を混合することができる。このように、こ
の混合物は、生体アフィニティー検定における固相担体
(solid phase carrier) として使用することができる。
反応の終了後に測定を行うとき、可能な限りの異なる特
異性をもつ多くの粒子カテゴリーを同定することができ
るということが不可欠である。同定の目的のために、一
定サイズの粒子としての性質(McHugh, T.M. et al., J.
Immunol. Methods 1986; 95: 57-61)を利用することが
でき、又は着色粒子(Streefkerk J.G., Kors, N., Bode
n, D. Protides Biol. Fluids 1976; 24: 811-814)又は
様々な蛍光分子により標識された粒子(Dean, K.J. et a
l., Clin. Chem. 1983; 29: 1051-1056)を使用すること
ができる。

【０００３】生体アフィニティー反応においては、2 つ
の生物学的分子が、他の分子の存在中でさえ、大きな正
確さを伴って結合することができる。互いに結合するこ
とができるこのような分子は、例えば、抗体とそれらの
対応する抗原、一本鎖DNA 分子とそれらの対応する核酸
配列、及びレセプタとそれらに特異的に結合する分子で
ある。これらの反応のすべては、生体アフィニティー(b
ioaffinity) の共通の名称を与えられることができる。
生体アフィニティー反応は、様々な用途においてそして
研究における検定において開発されている。公知の生体
分子であって、生物材料( 例えば、抗体) から精製さ
れ、又は化学的に合成される( 例えば、オリゴヌクレオ
チドDNA)ことができるものを、その生体アフィニティー
反応の終了後に検出することができるようなやり方で標
識することができる。今般、生体アフィニティー反応の
主な用途は、イムノアッセイ及び核酸ハイブリダイゼー
ション検定であって、例えば、血液からの様々な成分を
検定するために使用されるものを含んでいる。生物反応
体としてのレセプタに基づく検定は、新たな医学的な物
質についての探究において重要である。

【０００４】血液又はその成分に対して行われる検定
を、特定の疾病又は医学的操作に関連する群に分けるこ
とができる。多変数検定においては、これらの群、いわ
ゆるパネルに属する分析物を、同一サンプル内で同時に
検定することができるであろう。このことは、テストに
含まれる費用において経済性を生み出し、この経済性
は、行われることができるであろう多数のテストにおけ
る増加をもたらし、そして結果的により信頼できる診断
をもたらすであろう。多変数検定は、テストの遂行にお
いてかなり少ない仕事を必要とし、そして結果としてよ
り速く且つ信頼できる結果を生み出すであろう。上記の
生物学的反応体としてDNA を使用する検定のための自然
な目的は、ウイルス及び遺伝的疾患であって細胞DNA に
おける突然変異により引き起こされるものであろう。特
に、遺伝的疾患は、多数のDNA 突然変異を表すことがで
き、そして、同一サンプル内で同時に多数のDNA 疾患を
測定されることができることが、遺伝的疾患のための診
断において絶対に必要である。このことは、集団全体に
わたる広範な研究におけるこれらの突然変異の担体のに
ついての探索において特に有用であろう。

【０００５】分析されるべきDNA の微小量のため、その
遺伝子ドメインは、そのドメインの同定又は突然変異の
前に、そのサンプルから、しばしば増幅されなければな
らないであろう。幾つかの遺伝子ドメインを、同一反応
において同時に増幅することができる。多変数検定を、
幾つかの遺伝子ドメインを含むような反応混合物の分析
に有利に使用することができる。多変数検定において
は、標識を使用することができ、生体アフィニティー反
応の終了後、そのシグナルを、例えば、そのシグナルの
波長又は減衰時間に基づき分解することができる。この
ような検定は、異なる放射性同位体(Morgan C.R.,Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 1966; 123: 230-233; Wians,
F.H., Dev, J., Powell, M.M., Heald, J.I., Clin. Ch
em. 1986; 32: 887-890)、酵素標識(Dean, K.J., Thomp
son, S.G., Burg, J.F., Buckler, R.T., Clin. Chem.
1983; 29: 1051-1056; Bates, D.I., Bailey, W.R., In
ternational Patent Application WO89/06802)、及び短
寿命蛍光放射標識を、優先的に使用してきた。しかしな
がら、このような標識は、測定されるべきシグナルの波
長の重複( 同位体(isotope) 、蛍光分子) 、その励起(e
xcitation)及び放射(emission)波長の曖昧さ( 蛍光分
子) 、異なる最適条件( 酵素標識) 、又はその物質の背
景蛍光(短寿命蛍光放射標識) を原因とする問題を、し
ばしば表した。このような系は、最もよくても、ほんの
2 つの同時測定を可能にしていた。

【０００６】時間- 分解蛍光(time-resolved fluoresce
nce)に基づく標識技術を使用する系は、希土類金属の長
寿命を利用している( 図1; Soini, E. and Loevgren,
T., CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry 1
987; 18(2):105-154)。この金属は、その複合体の励起
の間、エネルギーを吸収することができる有機分子に複
合体形成される。他方においては、また、上記のリガン
ドは、その複合体内の金属イオンにその励起エネルギー
を放出することができる。時間- 分解標識において最も
有用な土類金属は、Eu、Sm、Tb及びDyである。この希土
類金属の電子のエネルギー・レベルは、その励起エネル
ギーを吸収するのに最もよく合っており、そして他方に
おいて、長寿命蛍光を減少させるエネルギー遷移は、こ
れらの土類金属の複合体内において僅かである。これら
の土類金属における基底状態へのエネルギー遷移は、異
なる波長の幾つかの狭いバンドから成る蛍光をもたら
す。いくつかの電子遷移は、しかしながら、その基底状
態への遷移の間、他と比較されることが好ましく、そし
て結果として、観察された蛍光の大部分が、はっきりし
た波長の成分をもっている。これらの時間- 分解標識を
含む反応体の生体アフィニティー検定における同時測定
の間、測定結果に対する微小成分の効果を、コンピュー
ターを用いた方法により容易に取り除くことができる。
時間- 分解標識を使用した多変数検定において、4 つほ
どの多くの異なる生体分子を、必要な感度を伴って同時
に測定した(Xu 、Y.Y., Pettersson, K., Blomberg,
K., Hemmilae, I., Mikola, H. and Loevgren, T., Cl
in. Chem. 1992; 38/10: 2038-2043)。

【０００７】多変数検定のための原理としての他の可能
性を、生体アフィニティー検定において特異的なプロー
ブを識別するための異なる固相担体の使用において、利
用することができる。固相担体を、決定された特異性を
有するプローブをそれぞれに含むドメインに分割するこ
とができ; 異なる固相担体を、その検定において同時に
使用することができ、又はその固相担体を、標識に基づ
く異なるカテゴリーにおいて分配することができる(Soi
ni, E., US 5,028,545) 。最後の例において、それぞれ
の固相カテゴリーは、その表面に結合する異なった特異
性を有するプローブをもっている。この他の原理の多変
数検定への利用は、幾つかの利点を提供する。なぜな
ら、その多変数系のそれぞれの成分を、別々に製造し、
そして次に組み合わせることができるからである。この
ことが、製造技術の視点から重要である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、異なるカテゴ
リー中に分配され且つ異なる分析物を表す微粒子を使用
する生体特異的多変数検定法であって、方法中、微粒子
が蛍光分子(1) により標識され、且つ、方法中、異なる
カテゴリーの微粒子が異なる分析物に結合する生体アフ
ィニティー反応体A により被覆されているものに関す
る。この方法においては、異なるカテゴリーの微粒子
を、混合し、検定されるべきサンプルを添加し、そして
最後に、蛍光分子(2) により標識された生体アフィニテ
ィー反応体Bを、上記の分析物分子と上記の生体アフィ
ニティー反応体A との間の反応の終了の丁度その時又は
その後のいずれかにおいて添加する。上記の蛍光分子
(1、2)を励起させ、そしてその蛍光放射を、その微粒子
のカテゴリーを識別するために、そして異なる分析物の
含有量の測定のために、定量する。本発明に記載の方法
は、長寿命の蛍光を放射する異なる分子(1、2)により、
上記の微粒子及び上記の生体アフィニティー反応体B を
標識付けすることを特徴とする。上記の生体特異的多変
数検定法は、同時に存在する反応成分のすべてと共に1
段階、又は生体アフィニティー反応体A と上記の分析物
分子との間の反応の終了後に、標識された生体アフィニ
ティー反応体B を添加する場合においては2 段階、のい
ずれかにおいて行われる。

【０００９】1 つの有用な変法に従えば、時間- 分解蛍
光、すなわち、長寿命の蛍光を放射する分子を、その微
粒子カテゴリーを同定するために、並びにその生体アフ
ィニティー反応体B を標識付けするために、使用する。

【００１０】本発明は、上記の粒子又は他のタイプの固
相担体を標識付けするために、時間- 分解蛍光(Soini,
E. and Loevgren, T., CRC Critical Reviews in Analy
tical Chemistry 1897; 18(2): 105-154) を使用する。
時間- 分解蛍光は、その系の異なる成分の自然蛍光を原
因とする短寿命の背景蛍光の除去を可能にする。その結
果として、その粒子がその時間- 分解標識の異なる濃度
により標識されるとき、非常に低い濃度の標識を検出す
ることができる。この時間- 分解蛍光の測定にける感度
及び良好な線型関係は、非常に広い濃度にわたりその時
間- 分解標識の測定を可能にする。図2 は、ユウロピウ
ムの投与- 反応曲線を示しており、ここでは、その標準
(EuCl ₃) が蛍光増幅溶液中で作られ、そしてその蛍光
が時間-分解蛍光計(1230 Fluorometer, LKB-Wallac, Tu
rku, Finland)により1 秒間にわたり測定された。他方
において広い濃度レンジは、その固相担体を見分けると
き、複数の異なるカテゴリーの同定を可能にする。時間
- 分解蛍光技術は、異なる波長の放射(radiation) を放
射する(emitting)標識の使用をも可能にする(Saarma,
M., Jaervekulg, L., Hemmilae, I., Siitari, H., & S
inijaerv, R., Journal of Virological Methods 1989;
23: 47-54; Xu, Y.Y., Pettersson, K., Blomberg,
K., Hemmilae, I., Mikola, H. and Loevgren, T., Cli
n. Chem. 1992;38/10: 2038-2043; Iitiae, A., Liukk
onen, L. and Siitari, H., Molecularand Cellular Pr
obes 1992; 6: 505-512) 。また、本発明は、上記の粒
子又は他のタイプの固相担体の標識付けにおいて、異な
る波長を放射するこれらの標識の濃度の組み合わせを使
用する。

【００１１】多変数検定における異なる分析物の同定に
おいて固相担体として上記の微粒子を使用するとき、1
つの又は数個の標識のみが、実際の分析物の検出のため
に必要とされる。この標識技術が、幾つかの標識の分解
を可能にする時間- 分解蛍光に基づくとき、カテゴリー
に分けられる固相担体の使用は、その固体担体のカテゴ
リーの識別における使用のための1 以上の標識を遊離す
るであろう。図3 は、PTA-キレート化Eu⁺³、Tb⁺³、Sm⁺³
及びDy⁺³の混合物からの放射の、波長、遅れ及び強度の
プロフィールを示している。本固相担体を、異なる波長
における時間- 分解標識蛍光に基づき、時間- 分解標識
の異なる濃度に基づき、時間- 分解及び短寿命蛍光標識
の同時使用に基づき、又はそれらの組み合わせに基づ
き、カテゴリーに分配することができる。例えば、固相
担体のカテゴリーの識別のために、10の異なる濃度にお
いて、異なる波長における2 つの時間分解標識を使用す
ることにより、100 の異なる固相担体を、識別すること
がきる。

【００１２】非常に多数の識別可能な固相担体カテゴリ
ーを、蛍光ランタニド・キレートを含む微粒子を使用す
ることにより、1 つの多変数(mutiparameter) 検定内に
取り込むことができる。異なる蛍光分子を、異なる微粒
子又は同一の微粒子に結合させることができる。多くの
異なる蛍光分子により同一の微粒子を標識することが有
利である。なぜなら、異なる蛍光キレートの組み合わせ
及び/ 又はそれらの濃度の組み合わせが、非常に多数の
可能な組み合わせをもたらすであろうからである。本固
相担体カテゴリーは、時間- 分解蛍光を使用することに
より、ランタニド(lanthanide)キレート/ 個々の微粒子
に含まれるキレート、の蛍光強度を測定することにより
同定される。同定後、その粒子上で行われる一般的に知
られた特異的生体アフィニティー反応の結果を、その標
識された生体アフィニティー反応体の測定のために同定
された微粒子からの蛍光ランタニド・キレート標識によ
り、測定し; その同定測定のために使用されたもと異な
るランタニドを、その時使用する。多変数検定において
は、直径<1mm をもつ粒子を、固相担体として使用す
る。

【００１３】微粒子の同定のために使用する標識は、そ
れらの製造の間、例えば、共重合反応により、その微粒
子に結合されることができる。あるいは、標識は、その
製造工程の後、その微粒子の表面に化学的に結合される
ことができる。本発明を、以下の非限定的な例により、
より詳細に記載する。

【００１４】

【実施例】例1 血液サンプル中の甲状腺刺激ホルモン(thyrotropin(TS
H))、サイロキシン(thyroxine(T3)) 、遊離サイロキシ
ン(T4) 及びサイログロブリン(thyroglobulin(TG)) 濃
度の同時検定多変数検定は、典型的には、例えば、血液サンプル中
で、甲状腺刺激ホルモン(TSH) 、サイロキシン(T3)、遊
離サイロキシン(T4)及びサイログロブリン(TG)濃度を同
時測定することによりヒトにおける甲状腺機能の評価に
適用される。本例においては、同一サイズ及び性質の4
つの粒子カテゴリーを、異なるテルビウム(terbium) キ
レート濃度(TSH検定については1 x Tb;T3 検定について
は5 x Tb;遊離T4検定については10 x Tb 、そしてTG検
定については15 x 1Tb) により、その粒子カテゴリーの
同定の目的のために標識した。製造期の間、この粒子カ
テゴリーを、それらが上記の検定において作用すること
を確認するまで別々に保ち、その時点において、それら
を多変数検定のために混合する。

【００１５】TSH 及びTG検定は、非競合的であり、一
方、T3及び遊離T4検定は、競合的である。1 x Tb粒子
を、モノクロナールTSH-特異的抗体により、5 x Tb粒子
を抗-T3 抗体により、10 x Tb 粒子を抗- 遊離T4抗体に
より、そして15 x Tb 粒子をモノクロナールTG- 特異的
抗体により、それぞれ、被覆した。この多変数検定にお
いては、蛍光Euキレートにより標識された以下の生体ア
フィニティー反応体:Eu 標識モノクロナールTSH-特異的
抗体、Eu標識T3誘導体、Eu標識T4同族体、及びEu標識モ
ノクロナールTG- 特異的抗体を使用する。この多変数検
定においては、その粒子カテゴリーの混合物; そのサン
プル、及びそのEuキレートにより標識された反応体を、
1 段階の検定において同時に反応させる。インキュベー
ション後、その粒子カテゴリーを、それらのTbキレート
の濃度に基づき同定し、そして個々の同定された粒子の
Eu濃度を、測定する。時間- 分解蛍光を、同定及び測定
の両方のために使用する。それぞれの分析物(TSH、T3、
遊離T4及びTG) の濃度を、その測定されたEu濃度から計
算する。時間- 分解蛍光測定においては、フロー・サイ
トメーター、時間- 分解顕微鏡又は時間- 分解マイクロ
蛍光計又は時間- 分解技術に基づく他の測定機器を使用
する(US 5,028,545; Xu, Y.Y. et al., Clin. Chem. 19
92; 38/10: 2038-2043; Seveus, L. et al., Cytometry
1992; 13: 329-338) 。

【００１６】例2 複数の突然変異の同時検定多変数検定を、疾患と関連する複数の突然変異をその遺
伝子レベルにおいて同時検出することにより遺伝的疾患
を診断するために使用することができる。例えば、デュ
シェーヌ筋ジストロフィー(duchenne muscular dystrop
hy(DMD))の診断においては、9 つの異なる欠失の可能性
であってすべて疾患関連のものが、その遺伝子内に正確
に同定されなければならない。本多変数検定を、以下の
やり方で行う: 検査されるべき遺伝子領域を、例えば、
PCR 法(PCR= ポリメラーゼ連鎖反応) により増幅し、そ
の後、サイズ及び性質において同一な18(9つの正常な対
立遺伝子及び9 つの突然変異対立遺伝子) の粒子カテゴ
リーを、使用し、そのカテゴリーを、それらが含む蛍光
Tbキレートの濃度(1x 、2x、4x、8x、16x 、32x、64x
、128x、256x、512x、1024x 、2048x 、4096x 、8192x
、16384x、32768x、65536x、131072xTb)に基づき同定
することができる。その製造段階において、先に述べた
18の突然変異の中の1 つを特異的に同定する核酸プロー
ブ( 生体アフィニティー反応体) を、それぞれの微粒子
カテゴリーの表面上に固定化する。本多変数検定のため
に、DMD における突然変異の検出に必要なすべて18の粒
子カテゴリーのすべて含む混合物を、その粒子カテゴリ
ーから調製する。適切な検定においては、上記の粒子混
合物、サンプル及び9 つの異なる核酸プローブであっ
て、そのすべてが蛍光Euキレートにより標識されている
ものが、必要である。インキュベーション後、個々の粒
子のカテゴリーをそれらのTb蛍光の強度に基づき同定
し、そして個々の粒子のEu濃度を、測定する。

【００１７】このように、本多変数検定は、DMD に関連
する既知の9 つの突然変異のすべての検出を可能にす
る。時間- 分解蛍光測定を、フロー・サイトメーター、
時間-分解蛍光顕微鏡又はマイクロ蛍光計のいずれかに
より行う(US 5,028,545; Xu, Y.Y. et al., Clin. Che
m. 1992; 38/10: 2038-2043; Seveus, L. et al., Cyto
metry 1992; 13: 329-338) 。上記の発明の様々な用途
が請求の範囲内で変動することができることを、当業者
は理解する。本発明の方法を、様々な態様の形態内に取
り込みことができ、これらの少しを、本明細書中に開示
した。他の態様が存在し且つ本発明の核心から外れるこ
とがないことは、当業者には明らかであろう。それ故、
記載したところの態様は、例示的なものであり、そして
限定的なものと解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】長寿命蛍光及び短寿命蛍光についての、作用時
間と蛍光を示している。

【図２】ユウロピウムの投与- 反応曲線を示しており、
ここでは、その標準(EuCl ₃)が蛍光増幅溶液中で作ら
れ、そしてその蛍光が時間- 分解蛍光計により1 秒間に
わたり測定された。

【図３】PTA-キレート化Eu⁺³、Tb⁺³、Sm⁺³及びDy⁺³の混
合物からの放射の、波長、遅れ及び強度のプロフィール
を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キムスベルカーイマニュエルペターソンフィンランド国，エフイーエン−20810 ツルク，ティーレンテキイェーンカツ 14 エー 20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】異なるカテゴリー中に分配され且つ異な
る分析物を表す微粒子を使用する生体特異的多変数検定
法であって、方法中、異なるカテゴリーに属する微粒子
が蛍光分子(1) により標識され、且つ、方法中、異なる
カテゴリーに属する微粒子が異なる分析物に結合する生
体アフィニティー反応体A により被覆されており、方法
中、 - 異なるカテゴリーに属する微粒子を混合し、そして検
定されるべきサンプルをこの混合物に添加し、そして蛍
光分子(2) により標識された生体アフィニティー反応体
B を、上記の分析物分子と上記の生体アフィニティー反
応体A との間の反応の終了の丁度その時又はその後のい
ずれかにおいて、この混合物に添加し、 - 上記の蛍光分子(1、2)を励起させ、そしてその蛍光放
射を、その微粒子のカテゴリーを識別するために、そし
て異なる分析物の含有量の測定のために、定量し、そし
て、 - 長寿命の蛍光を放射する異なる分子(1、2)により、上
記の微粒子及び上記の生体アフィニティー反応体B を標
識付けする、ことを特徴とする検定法。
【請求項２】微粒子のカテゴリーを識別するために、
異なる分子(1a 、1b、、、) が同一の微粒子又は異なる
微粒子上に配置されるようなやり方で、長寿命蛍光を放
出する2 以上の分子(1a 、1b、、、) により、蛍光分子
(1) を置き換えることを特徴とする、請求項１に記載の
検定法。
【請求項３】微粒子上、幾つかの濃度において、長寿
命蛍光を放射する分子(1、1a、1b、、、) の中の少なく
とも1 が在ることを特徴とする、請求項１に記載の検定
法。
【請求項４】短寿命蛍光(3) であって長寿命蛍光を放
射する1 以上の分子(1a 、1b、、、) により標識された
同一の微粒子上で又は異なる微粒子上で生じることがで
きるものを放射する分子により、微粒子をさらに標識付
けすることを特徴とする、請求項１に記載の検定法。
【請求項５】異なる濃度において、短寿命蛍光を放射
する分子を使用することを特徴とする、請求項４に記載
の検定法。
【請求項６】 Eu、Tb、Sm又はDyキレートが長寿命蛍光
を放射する分子(1、2)であることを特徴とする、請求項
１に記載の検定法。
【請求項７】微粒子の直径が1mm 未満であることを特
徴とする、請求項１に記載の検定法。