KR20170106084A - 사이클린(Cyclin) D1 b 를 이용한 갑상선암의 진단 방법 - Google Patents

사이클린(Cyclin) D1 b 를 이용한 갑상선암의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갑상선 암의 진단방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 사이클린(Cyclin) D1의 변형체에 해당하는 사이클린(Cyclin) D1b에 대하여 갑상선암의 진단 특히 갑상선유두암종(papillary thyroid carcinoma)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 mRNA 및 단백질 발현을 확인하는 방법에 대한 것으로 Cyclin D1과 비교하여 갑상선 암 특히 갑상선유두암종(Papillary thyroid carcinoma)의 진단에 정확도 및 민감도가 높은 효과를 가진다.

Description

사이클린(Cyclin) D1 b 를 이용한 갑상선암의 진단 방법{DIAGNOSIS FOR THYROID CANCER USING CYCLIN D1 b}
본 발명은 갑상선암의 진단 및 진행에 관한 정보를 제공하는 방법으로, 보다 구체적으로는 사이클린(Cyclin) D1의 변형체에 해당하는 사이클린(Cyclin) D1b에 대하여 갑상선암의 진단 및 림프절 전이 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 mRNA 또는 단백질(protein) 발현을 확인하여 진단 방법에 대한 정보를 제공하는 것이다.
갑상선암(thyroid cancer)의 발병률은 한국에서 가장 급격히 증가하고 있고 최근 한국 여성에게 발병하는 암 중에서 가장 빈도가 높다 [국가암정보센터. URL http://www.cancer.go.kr/mbs/cancer/subview.jsp?id=cancer_040104000000 (last accessed: January 2016)]. 한국에서 2011년 갑상선암 발생률은 1993년에 비해 15배나 증가하였다. 이러한 증가는 갑상선유두암종(papillary thyroid carcinoma, PTC)의 증가로 인한 것이며, 현재 한국에서 갑상선암의 약 97%가 유두암종이다(Ahn HS, et al., Engl J Med 2014;371:1765-7)(http://www.cancer.go.kr). 따라서, 상기 갑상선암에 대한 종양 발생 기전(tumorigenesis), 진단(Diagnosis), 암진행(Cancer progression) 및 예후(Prognosis)에 대한 관심이 높아져왔다.
수술전에 갑상선 결절(thyroid nodule)을 진단하기 위한 가장 효율적인 검사 방법은 초음파 유도하에 실시되는 세침흡인세포검사(fine needle aspiration cytology, FNAC)이다. 그러나, 전체 갑상선 FNAC의 약 20-30%는 악성인지 양성인지 판별되지 못하는 불확실한 카테고리로 진단된다. 초기 FNAC에서 불확실하게 진단될 경우 환자는 반복된 FNAC를 시행 받거나, 경우에 따라서는 불필요한 수술을 받게 될 수 있는 문제점이 있다. 따라서 갑상선 결절을 정확히 진단하기 위한 다양한 보조적인 기법들이 연구되고 있다.
갑상선 결절이 FNAC 검사에서 악성으로 판명되면 환자는 갑상선 절제술을 받게 된다. 갑상선 절제술은 암의 특성과 암환자의 위험도에 따라 수술 방법이 달라지게 되며, 일반적으로 전체를 절제하는 전적출술 혹은 암이 발견된 한쪽 엽만 절제하는 수술 방법을 선택할 수 있다. 갑상선암은 흔히 림프절 전이를 보이며, 림프절에 암 전이가 있을 경우에는 림프절 절제술을 시행 받아야 하지만 림프절을 절제하기 전에는 정확히 암 전이 유무를 파악하기는 어렵다. 따라서 림프절 전이를 예측할 수 있는 표지자 혹은 마커의 개발이 필요하다.
Cyclin D1은 CCND1 유전자의 발현에 의해 만들어지는 단백질이며 세포주기를 조절하는 기능을 한다. Cyclin D1에는 정상적인 형태의 단백질인 Cyclin D1a 이외에도 Cyclin D1의 변형체인 Cyclin D1b이 최근 발견되었다. 구체적으로 Cyclin D1a 는 CCND1 유전자로부터 엑손 1번에서 5번까지 모든 엑손이 코딩되어 만들어지는 반면, Cyclin D1b는 엑손 1번에서 4번 까지만 코딩되고, 정상적으로는 코딩되지 않는 인트론 4번이 이어서 코딩되어 만들어진다(Clin Cancer Res 2008;14:7804-7812). 따라서 Cyclin D1b는 비정상적인 단백질로서 정상조직에는 존재하지 않으며, 종양조직에서만 발견되는 것으로 추정되지만 아직까지 갑상선 조직 및 갑상선암종에서 연구된 자료는 존재하지 않는다.
현재 등록특허 10-1219979에 따르면 Cyclin D1의 발현패턴을 확인하는 방법에 의해 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단방법에 대한 특허가 존재 하지만 Cyclin D1b을 활용한 갑상선암종에 대한 정확도 및 민감도가 높은 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 존재하지 않는다.
본 발명의 일 목적은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1의 변형체인 사이클린(Cyclin) D1b를 이용하여 mRNA의 수준을 측정하여 갑상선암종의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다. 뿐만 아니라, Cyclin D1b의 특이적인 항체(antibody)를 이용하여 상기 시료로부터 cyclin D1b 단백질 발현 수준을 측정하여 갑상선암종 진단 및 갑상선암종의 림프절 전이에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1의 변형체인 사이클린(Cyclin) D1b를 이용하여 mRNA의 수준을 측정하고, 사이클린(Cyclin) D1b의 CCND1(cyclin D1) G/A 870 다형성(polymorphism) 및/또는 BRAF V600E 돌연변이를 측정하여 갑상선암 진단 및 갑상선암종의 림프절 전이에 관한 정보를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 증폭 방법을 통하여 Cyclin D1b 유전자 서열을 증폭시키는 프라이머를 포함하는 Cyclin D1b 유전자 검출 및 갑상선 암종의 진단용 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 증폭 방법(PCR)을 통하여 CCND1(CyclinD1) 유전자(DNA와 RNA) 서열을 증폭시키는 프라이머(primer) 및 유전자 발현을 확인하기 위한 프로버(probe), CCND1(CyclinD1) G/A 870 다형성(polymorphism)을 확인하기 위한 유전자 증폭 프라이머 및/또는 BRAF V600E 돌연변이를 검출하는 서열의 프라이머를 포함하는 갑상선 암종의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법 및 진단용 키트를 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명자들은 기존의 등록특허 10-1219979 및 Mod Pathol 2010;23:1201-8 논문에서 알 수 있듯이, 정상 단백질인 사이클린(Cyclin) D1 은 악성에서 정상대조군과 비교하여 높은 수준으로 발현될 뿐만 아니라 양성에서도, 악성에 비해 발현 수준의 정도는 덜하지만 사이클린(Cyclin) D1의 발현이 존재하기 때문에 악성과 양성의 감별이 명확하지 않는다는 점을 해결하기 위하여 정상 대조군과 비교하여 악성에서만 발현되는 사이클린(Cyclin) D1b 를 갑상선암종의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 대한 발명을 하게 되었다.
본 발명에 있어서, "시료"란 환자의 사이클린(Cyclin) D1b의 농도, 양, 활성 등을 측정할 수 있도록 환자로부터 분리된 사이클린(Cyclin) D1b 를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액 등일 수 있으나, 사이클린(Cyclin) D1b의 수준을 측정할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "마커” 혹은 “표지자"란 갑상선암의 진행 과정과 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 바람직하게는 사이클린(Cyclin) D1b 단백질(protein), 핵산(nucleic acid) 등 일 수 있으나, 갑상선암의 진단에 관한 정보를 제공할 수 있는 분자라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "정보를 제공하는 방법"이란 갑상선암의 진단을 나타낼 수 있는 요소들에 대한 정보를 획득하는 방법으로서, 바람직하게는 정상 대조군과 환자의 시료에서 본 발명의 단일 또는 복합 마커의 수준을 측정 및 비교하여 갑상선암이 발생하였는지 여부에 대한 정보와 갑상선암의 크기, 침투 깊이, 전이 여부 등과 관련된 정보를 예측하여 갑상선암종 발생여부에 관한 정보를 획득하는 방법을 의미하나, 생물학적 시료로부터 갑상선암종과 관련된 정보를 획득할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA의 수준을 측정하고, 정상대조군 시료와의 수준을 비교하여, 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이 외에도 갑상선암종 진단 또는 갑상선암종에 관한 정보를 제공할 수 있는 마커라면 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA발현이 정상대조군 시료의 수준과 비교하여 높은 것인 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA의 수준을 측정하고, 사이클린(Cyclin) D1b의 G/A 870 다형성(polymorphism)을 추가로 측정하여 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 사이클린(Cyclin) D1b의 G/A 870 다형성(polymorphism)을 추가로 측정은 서열목록 1의 포워드(forward) 및 서열목록 2의 리벌스(Reverse) 프라이머쌍을 이용한 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA의 수준을 측정하고, 상기 생물학적 시료의 DNA로부터 BRAF V600E 돌연변이를 측정하는 방법일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 BRAF V600E의 돌연변이의 측정은 서열목록 7의 포워드(forward) 및 서열목록 8의 리벌스(Reverse) 프라이머쌍을 이용한 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 mRNA의 측정 방법은 유전자 서열 3을 코딩(coding)하는 프라이머쌍을 포함하는 유전자 증폭방법(PCR)인 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 mRNA의 측정 방법은 유전자 서열목록 4인 포워드(forward)및 서열목록 5인 리벌스(reverse) 프라이머쌍, 유전자 서열목록 6인 프로버(probe)를 포함한 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 갑상선암은 유두암종, 여포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종 및 수질암종으로 이루어진 것인 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있고, 바람직하게는 갑상선암은 갑상선유두암종(papillary thyroid carcinoma)에서 유래된 것인 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 해당할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질(protein) 발현 수준을 측정하고, 정상대조군과 시료의 수준을 비교하여, 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있다.
본 발명의 상기 측정은 사이클린(Cyclin) D1 b의 mRNA인 서열목록 3에서 번역되는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체(antibody)를 포함하는 면역조직화학염색, 웨스턴 블롯(Western blot), 팩스(FACS)중 어느 하나의 방법을 통한 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질 발현이 정상대조군 시료의 수준과 비교하여 높은 것인 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있으나 사이클린(Cyclin) D1b의 유전자 발현 및 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA중 어느 하나의 수준을 측정하고, 정상대조군 시료와의 수준을 비교하여, 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이 외에도 갑상선암종 진단 또는 갑상선암종에 관한 정보를 제공할 수 있는 표지자 혹은 마커라면 더 포함할 수 있는 것으로 바람직하게는 상기 마커는 사이클린(Cyclin) D1b의 유전자에서 G/A870 다형성(polymorphism)을 추가로 더 확인하는 방법 또는 상기 마커는 BRAF V600E돌연변이(mutation)의 수준을 추가로 더 확인하는 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 추가적인 마커의 포함으로 인하여 갑상선암, 바람직하게는 갑상선유두암종에서의 진단에 있어서 민감도 및 정확도를 높이는 효과를 가져올 수 있다.
본 명세서에 있어서, "키트"란 갑상선암종을 진단하는데 사용할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 본 발명의 단일 또는 복합 표지자 혹은 마커의 수준을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다.
바람직하게는, 표지자 혹은 마커인 사이클린(Cyclin) D1b, CCND1(CyclinD1) G/A 870 다형성(polymorphism) 및/또는 BRAF V600E 돌연변이에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하고 있어, 상기 마커에 결합되는 물질의 양을 측정할 수 있는 형태일 수 있으며, 상기 물질은 바람직하게는 mRNA, 항체(antibody), 앱타머(aptamer) 등 일 수 있으나, 상기 마커와 특이적으로 결합하는 물질이라면 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 상기 시료는 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있으나 사이클린(Cyclin) D1b 의 수준을 측정할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 일 효과는 환자에서 추출된 시료 샘플로부터 Cyclin D1b 의 mRNA발현양을 측정하여 정상 대조군의 수준과 비교하여 갑상선암, 구체적으로 갑상선유두암종을 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 효과는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질 발현 수준을 측정하여 정상 대조군의 수준과 비교하여 갑상선암종 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 효과는 다른 효과는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA발현양을 측정하고, CCND1(CyclinD1) G/A 870 다형성(polymorphism) 및/또는 BRAF V600E돌연변이(mutation)를 추가로 측정하여 정상 대조군의 수준과 비교하여 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법 및 갑상선암종의 진단용 키트를 제공하여 갑상선암 진단의 정확도 및 민감도를 높인다.
본 발명의 또 다른 효과는 유전자 증폭 방법을 통하여 Cyclin D1b 유전자 서열 증폭시키는 프라이머를 포함하는 Cyclin D1b 유전자 검출 및 갑상선암의 진단용 키트를 제공하여 갑상선암 진단의 정확도 및 민감도를 높인다.
도 1은 CCND1유전자의 DNA를 대상으로 G/A 870 다형성(polymorphism)을 분석하기 위한 프라이머 시퀀스와 위치를 나타낸 그림이다.
도 2는 CCND1유전자에서 코딩되는 mRNA의 2가지 형태인 Cyclin D1a 및 cyclin D1b의 모식도와 이러한 mRNA를 주형으로 합성된 단백질의 아미노산 서열의 모식도이다.
도 3은 Cyclin D1a 및 Cyclin D1b의 mRNA발현 분석을 위한 프라이머의 결합 위치를 나타내었다.
도 4는 환자 샘플군에서 CCND1 G/A 870 다형성의 유형에 따른 cyclin D1b의 mRNA의 발현양상간의 관련성에 관한 그래프이다.
도 5는 환자 샘플군에서 Cyclin D1 a의 발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 6은 양성(NH, FA) 및 악성(PTC, FTC, PDC, ATC, MTC) 갑상선암 샘플군 내 병명에 따른 Cyclin D1b의 mRNA발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 7은 유두갑상선암종의 조직학적 유형에 따른 Cyclin D1b의 mRNA의 발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 8은 Cyclin D1b mRNA발현과 BRAF V600E 돌연변이와의 상관성을 분석한 그래프이다.
도 9는 LN(-), 림프절 전이가 없는 집단; LN(+), 림프절 전이가 있는 집단 에 대하여 Cyclin D1b mRNA발현과 림프절 전이와의 상관성을 분석한 그래프이다.
도 10은 Cyclin D1b 특이적 항체 제작을 위한 인트론 4번에서 기원한 아미노산 시퀀스를 나타낸 그림이다.
도 11은 갑상선유두암종 세포에서 Cyclin D1a와 Cyclin D1b의 발현에 대한 웨스턴블롯(Western blot)과 각각의 펩타이드 서열 및 분자량을 설명하는 그림이다.
도 12는 다양한 갑상선 결절 조직에서 Cyclin D1b의 면역화학염색법을 통해 염색한 대표적인 조직 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
하기 표 1에 기재된 것과 같이 총 286명의 갑상선암 환자를 병리학적 진단을 통해 분류 하여 양성 결절 49명, 악성 종양 237명의 환자를 대상으로 분석 하였다.
진단명 환자수
양성(Benign) 결절성 증식증[Nodular hyperplasia (NH)] 16
소포샘종[Follicular adenoma (FA)] 33
악성
(Malignant)		 갑상선유두암종[Papillary thyroid carcinoma (PTC)]
Classic PTC
Encapsulated follicular variant
Infiltrative follicular variant
Tall cell variant
Diffuse sclerosing variant		 179
115
17
13
33
1
갑상선여포암종[Follicular thyroid carcinoma (FTC)] 32
저분화암종[Poorly differentiated carcinoma (PDC)] 5
갑상선미분화암종[Anaplastic thyroid carcinoma (ATC)] 4
갑상선수질암종[Medullary thyroid carcinoma (MTC)] 17
총 증례 수 286
1-1 조직 절편으로부터의 DNA 샘플 획득
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 각 종양 블럭의 대표적인 부분을 함유하는 4-um-두께 파라핀 절편으로부터 유전자 DNA를 추출하였다. 상기 추출은 당업계에 공지된 조직으로부터 DNA를 분리하는 방법을 사용하여 수행하였고, 이때 종양세포 영역은 조직 절편으로부터 수작업으로 잘라냈다.
1-2 CCND1 ( cyclin D1) 유전자 G/A870 다형성(Polymorphism) 분석
일반적으로 CCND1(cyclin D1) G/A870 다형성(polymorphism)의 유형에 따라 Cyclin D1a 및 Cyclin D1b의 발현양이 달라지는 것으로 파악되고 있기 때문에, 286명의 환자의 갑상선 조직에서 추출된 DNA와 하기 표 1의 프라이머 시퀀스(primer sequence)를 이용하여 CCND1 G/A 870 다형성(polymorphism)을 염기서열 분석 방법으로 측정 하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, G/A870 다형성(polymorphism)은 CCDN1 유전자의 엑손4 염기서열의 맨 마지막에 위치하고 있으며, GG, GA, AA 유형을 보일 수 있다.
이름 시퀀스 (5'→3') PCR 증폭산물 길이
CCND1G870A Forward-AGTTCATTTCCAATCCGCCC 212 bp
Reverse-TTTCCGTGGCACTAGGTGTC
1-3 CCND1 ( CyclinD1 ) G/A 870 다형성(polymorphism) 측정 결과
상기 방법에 의해 갑상선암 환자의 진단명에 따라 분류된 군에서 추출된 DNA에 대해 CCND1 G/A 870 다형성(polymorphism)을 측정한 결과 하기 표 3 및 4 에 표기 하였다.
갑상선유두암종(Papillary thyroid carcinoma; PTC)에서 전체 다형성(polymorphism) 비율은 GG는 38로 21.2%, GA는 83으로 46.4%, AA는 58로 32.4%이었다. 표 3 에서 PTC 및 FTC의 CCND1 G/A870 다형성의 발현 높은 것을 확인 하였기 때문에 양성 결절과 PTC 및 FTC를 비교 하였다. 그 결과 표 4에서와 같이, AA 유형은 양성결절의 군에 포함되는 결절성증식증(Nodular hyperplasia; NH)과 소포샘종(Folicular adenoma; FA) 및 다른 악성 종양군에 속하는 진단명과 비교하였을 때, 높은 발생 빈도의 경향을 보였다.
진단명 GG GA AA 총 수
PTC 38 (21.2%) 83 (46.4%) 58 (32.4%) 179
FTC 9 (28.1%) 12 (37.5%) 11 (34.4%) 32
MTC 6 (35.3%) 7 (41.2%) 4 (23.5%) 17
PDC 2 (40.0%) 2 (40.0%) 1 (20.0%) 5
ATC 2 (50.0%) 1 (25.0%) 1 (25.0%) 4
FA 8 (24.2%) 19 (57.6%) 6 (18.2%) 33
NH 5 (31.3%) 9 (56.3%) 2 (12.5%) 16
총 결과 70 (24.5%) 133 (46.5%) 83 (29.0%) 286
진단명 GG GA AA P value
PTC & FTC (n=211) 47 (22.3%) 95 (45.0%) 69 (32.7%) 0.076
FA & NH (n=49) 13 (26.5%) 28 (57.1%) 8 (16.3%) 　
2-1 조직 절편으로부터의 RNA 샘플 획득
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 각 종양 블럭의 대표적인 부분을 함유하는 15-um-두께 파라핀 절편으로부터 RNA를 추출하였다. 상기 추출은 당업계에 공지된 조직으로부터 RNA를 분리하는 방법을 사용하여 수행하였고, 이때 종양세포 영역은 조직 절편으로부터 수작업으로 잘라냈다.
2-2 CCND1의 mRN 동종체 ( isoform ) 발현 분석
Cyclin D1a 는 전체 엑손 5개와 3`UTR을 모두 코딩(coding)하는 반면에 CCND1 변형체인 서열목록 3의 Cyclin D1b 는 엑손 1번에서 4번까지만 코딩(coding)하고 이어서 인트론 4번 일부 및 3'UTR을 코딩(coding)하는 것을 특징으로 한다(도2).
CCND1의 동종체인 Cyclin D1a 와 엑손 5번이 제외되고 인트론 4번을 코딩(coding)하는 변형체(variant)인 Cyclin D1b 간의 mRNA의 발현 분석을 위해, 상기 방법에 의해 목적하는 시료에서 추출된 RNA에서 역전사효소를 이용하여 PCR를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. 하기 표 5와 같이 프라이머 시퀀스(primer sequence)를 이용하여 cDNA, 프라이머/프로브 혼합물 및 일반적 중합효소 연쇄반응에 포함되는 효소 등을 첨가하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 진행 하였다. CCND1의 동종체(isoform) Cyclin D1a와 Cyclin D1b에 프라이머(primer)가 결합되는 위치는 도 3과 같다. Cyclin D1a와 Cyclin D1b의 mRNA 발현양은 GAPDH의 mRNA 발현양을 기준으로 보정하여 상대적인 발현양 수치를 통계적으로 비교 분석하였다. 통계 결과 값은 p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성 있는 것으로 인정하였고, 통계학적 분석을 위해 SPSS(version 21 SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였다.
프라이머 시퀀스 (5'→3') PCR 증폭산물 길이
Cyclin D1a Foward- GTCCTACTACCGCCTCACACG 85 bp
Rerverse- TTCGATCTGCTCCTGGCAG
Cyclin D1b Forward- TGAGGAGCCCCAACAACTTC 97 bp
Reverse- CCTGGGACATCACCCTCACTTA
Cyclin D1a/D1b
프로버		 [6FAM]TTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCC[BHQ1]
GAPDH Forward-GAGTCAACGGATTTGGTAGT
Rerverse-TTGATTTTGGAGGGATCTCG		 238 bp
2-3 CCND1 G/A870 다발현(polymorphism)과 cyclin D1b mRNA 발현 관계 분석
Cyclin D1b의 mRNA발현양과 CCND1 G/A 870 다발현(polymorphism)과의 관계를 분석한 결과 도 4과 같이 GG 및 GA 다발현(polymorphism) 유형에 비하여 AA 다발현(polymorphism)이 Cyclin D1b와 유의성(p<0.001)있는 것으로 판단되었다.
2-4 다양한 갑상선 결절에서 CCND1의 mRNA 동종체 ( isoform ) 발현 분석 결과
상기 표1의 진단명에 따른 환자군 내에서 mRNA의 발현을 비교한 결과, 도 5 에서 볼 수 있듯이 Cyclin D1a mRNA의 발현양은 양성 종양군과 악성 종양군을 비교 하였을 경우 및 악성 종양군 내 진단명에 따른 환자군 내에서도 차이의 유의성을 발견할 수 없었다.
Cyclin D1a mRNA발현과는 대조적으로 변형체인 Cyclin D1b 의 mRNA는 도 6 에서와 같이 양성 결절에 비해 갑상선유두암종(PTC) 및 갑상선수질암종(MTC)에서 유의성 있게 과발현 된 것을 확인 하였다. 따라서, Cyclin D1b의 mRNA는 특이적으로 높은 발현 양이 악성 갑상선암뿐만 아니라 갑상선암 중 유두암종(PTC) 및 수질암종(MTC)을 진단하는 방법을 제공하는 데 사용할 수 있을 것으로 판단 되었다.
2-5 갑상선유두암종(PTC)의 조직학적 유형에 따른 Cyclin D1b mRNA 발현 분석
표1에서의 갑상선유두암종(PTC)를 조직학적 하위 유형으로 분류된 Classic 115예, Encapsulated follicular variant (EFV) 17예, Infiltrative follicular variant (IFV) 13예, Tall cell variant (TCV) 33예, diffuse sclerosing variant 1예를 대상으로 Cyclin D1b의 mRNA 발현 양상을 조사 하였다. 통계학적 분석은 상기 SPSS 분석 방법을 사용하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이, 각 조직학적 하위 유형의 분류에 따라 mRNA의 발현 비율은 차이가 없었다. 따라서, Cyclin D1b mRNA발현은 갑상선유두암종 자체의 발생과 관계가 깊은 반면 갑상선유두암종의 조직학적 유형과는 상관관계가 없는 것으로 판단되었다. 이러한 상관관계를 통하여 갑상선유두암종을 진단하는 표지자 혹은 마커로 유용성이 높을 것으로 예상된다.
2-6 갑상선유두암종(PTC)에서 Cyclin D1b mRNA 발현과 BRAF V600E 돌연변이 상관성
상기 방법에 의해 목적하는 시료에서 추출된 DNA에서 갑상선유두암종(PTC)에서 일반적으로 발견되는 유전자 돌연변이로 알려져 있는(Schlumberger MJ (1998) Papillary and follicular thyroid carcinoma. N Engl J Med 338:297-306) BRAF V600E 돌연변이를 측정 하였다. 하기 표6의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 BRAF 엑손15번을 증폭한 후 직접염기서열방법으로 코돈600번의 유전자돌연변이 유무를 분석하였다.
BRAF V600E 돌연변이와 Cyclin D1b mRNA 발현 사이의 상관관계를 분석하기 위하여, Pearson's chi-squared test 또는 Fisher's exact test를 이용하였다. p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 인정하였고, 통계학적 분석은 SPSS(version 21.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였다.
그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, 갑상선암 전체 환자군에서 Cyclin D1b mRNA의 발현의 증가는 BRAF V600E 돌연변이를 가진 경우에 높은 증가를 보이는 것으로 판단되었다.
프라이머 시퀀스 (5'→3') PCR 증폭산물 길이
BRAF Forward-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA
Reverse-GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A		 224 bp
2-7 Cyclin D1b mRNA 발현과 림프절 전이와의 상관성
상기 BRAF V600E 돌연변이와 Cyclin D1b mRNA 발현 사이의 상관관계를 분석 방법과 동일한 방법으로 림프절 전이 상태와의 상관관계를 분석 하였다.
그 결과 도 9 에서 보는 바와 같이, 전체 갑상선암에서 림프절 전이 상태와의 상관관계를 확인한 결과 p 값을 0.044로 하여 림프절 전이가 되지 않은 경우에 비하여 림프절 전이가 된 경우에 Cyclin D1b의 발현양이 높은 것을 확인하였다. 나아가 전형적인 유두암종(classic PTC)만을 대상으로 하여 비교 하였을 경우에는 p 값을 0.009로 하여 cyclin D1b의 높은 발현양과 강한 관련성을 보였다. 상기 결과를 통하여 Cyclin D1b는 갑상선유두암종 진단 표지자 혹은 마커일 뿐만이 아니라 림프절 전이를 진단하는 방법에 사용될 수 있는 표지자 혹은 마커로 사용가능 할 것이라고 판단된다.
3-1 면역조직화학염색법( Immunohistochemistry )을 통한 단백질 발현량 측정
3-1-1 면역조직화학염색법( Immunohistochemistry )을 위한 항체 제작
Cyclin D1의 변형체인 Cyclin D1 b 단백질은 CCND1유전자의 엑손1, 2, 3, 4와 인트론 4의 일부에서 전사된 cyclin D1b mRNA을 주형으로 하여 생성된다(도2). Cyclin D1 b 단백질의 아미노산 서열은 서열목록 9와 같다. Cyclin D1 b 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여, Cyclin D1a과 비교 하였을 때 특징적인 부분인 추가적으로 번역된 인트론(intron) 4에서 번역되는 “VSEGDVPGSLAGAYRGRHLVPRKCRGWCQGPQG”을 대상으로 하여 항체(antibody)를 만들기에 적합한 인공 펩타이드인“RGRHLVPRKCRGWCQGPQG”를 합성하였다. 이 후 상기 인공 펩타이드를 항체 형성을 위한 실험용 토끼에 주입하고 이를 항원으로 인식한 토끼의 면역체계에서 만들어진 Cyclin D1 특이적인 항체를 분리 하였다. Cyclin D1b에 대한 특이적인 항체가 인식하는 에피톱(epitope)은 도 10 와 같다.
3-1-2 Cyclin D1b 항체 검증
Cyclin D1b의 단백질 수준의 발현을 검증하기 위하여 상기 방법에 의해 제작된 항체와 시중에 상용화되어 판매되고 있는 Cyclin D1a 항체를 구입하여 상호 비교하는 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 웨스턴 블롯(Western blot)에 사용된 단백질은 갑상선 정상 조직과 유두암종의 조직 및 갑상선암 세포주(cell line)의 세포로부터 분해 버퍼(lysis buffer)로 세포를 분해한 뒤 얻어졌다. 상기 단백질 용해물(lysate)을 단백질 크기 마커(protein size marker)와 함께 전기 영동을 수행한 후 Cyclin D1a 및 Cyclin D1b 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다.
상기 웨스턴 블롯 수행 결과 도 11 과 같이 Cyclin D1a 및 Cyclin D1b 항체는 유두암종(PTC) 용해물(lysate)에서 각기 고유의 분자량 크기로 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 결과적으로 Cyclin D1b의 발현이 유두암종(PTC)에서 특이적으로 발현되는 것뿐만 아니라 상기 항체 형성방법에 의해 만들어진 Cyclin D1b의 항체의 특이성이 있는 것으로 판단되었다.
3-2 갑상선 조직에서 Cyclin D1b의 면역화학염색( immunohistochemistry )
3-2-1 면역조직화학염색( Immunohistochemistry ) 방법
각 환자들로부터 수득한 종양조직을 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀에 포매한 다음 4 um 두께로 박절한 다음 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 60℃ 오븐에 한 시간 동안 넣고, 자일렌으로 파라핀을 제거한 후, 물에 농도별 에탄올으로 재수화하였다. 구연산염 완충물(citrate buffer[pH 6.0])에 샘플을 담군후 15분 동안 Pressure Cooker (Cell Marque, Rocklin, CA, USA)에서 샘플을 가열하여 항원을 복구하였다. 이후 10분 동안 3% 과산화수소를 처리함으로써, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 상온에서 1:500로 희석한 Cyclin D1b 항체를 30분 동안 처리하여 항원 항체반응을 유도하였다. 상기 일차 항체는 DAKO Antibody Diluent (DAKO, Carpinteria, CA, USA)로 희석하여 비특이 반응을 억제하도록 하였다. 이후, Envision Plus System (DAKO)를 이용하여 이들을 검출하였으며, 면역반응을 5분 동안 디아미노벤지딘(diaminobenzidine,DAKO)으로 발색한 후, 헤마톡실린(hematoxylin) 으로 대비 염색하였다. 이때 모든 염색과정에서 MCL(mantle celllymphoma) 절편들을 양성 대조군으로 사용하였고, 음성 대조군으로는, 슬라이드를 일차 항체 없이 염색하였다.
Cyclin D1b의 면역염색의 발현 판정은 정상조직에서는 발현되지 않는 단백질에 해당하므로 원칙적으로는 염색이 된 경우 발현된 것으로 판정하여야 하지만, 실험과정상 발생할 수 있는 오차의 가능성을 배제하기 위하여 전체 종양 세포의 5% 이상에서 발현되는 경우만 발현된 것으로 판정하였다.
3-2-2 면역조직화학염색( Immunohistochemistry ) 방법의 결과
도 12 의 결과와 같이 정상조직이나 양성 결절에서는 Cyclin D1b로의 염색이 이루어 지지 않아 발현되지 않는 것을 확인한 반면, 악성종양에서는 면역염색 결과 종양세포의 세포질 또는 핵 내부에서 발현되는 것을 확인하였다. 구체적으로 소포샘종(follicular adenoma; FA)에서는 Cyclin D1b는 발현되지 않았지만(도12 a), 소포암종(follicular carcinoma)(도 12 b), 유두암종(papillary carcinoma)(도 12 c), 전형적 유형(classic variant) (도 12 d)소포변종(Follicular variant)(도 12 e), 키큰변종(tall cell variant)(도 12 f), 수질암종(medullary carcinoma)(도 12 g), 저분화암종(poorly differentiated carcinoma) (도 12 h) 및 미분화암종(undifferentiated carcinoma) (도 12 i)인 악성 갑상선암에서는 Cyclin D1b가 발현되는 것을 확인 하였다. Cyclin D1b의 단백질 발현이 정상조직 및 양성결절에서는 일어나지 않는 반면 갑상선암의 악성 종양에서는 조직학적 구분과 관계 없이 발현되므로 갑상선암의 감별진단에 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
4-1 Cyclin D1b의 세포내 위치 및 임상병리학적 의의
4-1-1 면역조직화학염색( immunohistochemistry ) 방법을 통한 양성율
갑상선 결절 중 양성과 악성에서 각각 Cyclin D1b 단백질의 발현되는 비율을 비교하기 위하여 갑상선유두암종 179예, 여포암종 31예, 수질암종 17예, 저분화암종 4예, 미분화암종 2예, 소포샘종(여포샘종) 33예, 증식성결절 16예를 대상으로 Cyclin D1b에 대한 면역화학염색을 시행하였다. 면역염색결과는 종양세포의 핵내와 세포질내 발현으로 구분하여 분석하여 하기 표7에 표기하였다.
진단명 분석된 증례 수 핵내 발현 세포질내 발현
Papillary carcinoma 179 85 (47.5%) 136 (76.0%)
Follicular carcinoma 31 14 (45%) 15 (48%)
Medullary carcinoma 17 12 (71%) 12 (71%)
Poorly differentiated carcinoma 4 2 (50%) 4 (100%)
Anaplastic carcinoma 2 2 (100%) 2 (100%)
Follicular adenoma 33 0 0
Nodular hyperplasia 16 0 0
4-1-2 Cyclin D1b의 세포 내 위치 와 임상병리학적 특성의 관계
Cyclin D1b의 세포 핵내 및 세포질내 발현 위치와 임상병리학적 특성과의 관계를 알아보기 위하여, 하기 표8과 같이 다양한 임상병리학적 인자와 통계학적 분석을 시행하여 구체적인 결과는 표기하였다. p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성 있는 것으로 인정하였고, 통계학적 분석은 SPSS(version 21 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였다.
Cyclin D1b
Nuclear (%) Cytoplasmic (%)
Negative Positive P-value Negative Positive P-value
Average tumor size (cm) 12.9±7.4 12.5±9.3 0.723 12.8±7.5 12.7±8.6 0.954
Age at diagnosis (years) 0.750 0.063
≤45 42 (51.2) 40 (48.8) 25 (30.5) 57 (69.5)
>45 52 (53.6) 45 (46.4) 18 (18.6) 79 (81.4)
Gender 0.007 0.109
Female 80 (58.0) 58 (42.0) 37 (26.8) 101 (73.2)
Male 14 (34.1) 27 (65.9) 6 (14.6) 35 (85.4)
Variant 0.009 0.075
Classic 50 (43.5) 65 (56.5) 19 (16.5) 96 (83.5)
Follicular variant 22 (73.3) 8 (26.7) 16 (53.3) 14 (46.7)
Tall cell variant 22 (66.7) 11 (33.3) 8 (24.2) 25 (75.8)
Diffuse sclerosing variant 0 1 (100) 0 1 (100)
Multiplicity 0.937 0.629
Negative 47 (52.2) 43 (47.8) 23 (25.6) 67 (74.4)
Positive 47 (52.8) 42 (47.2) 20 (22.5) 69 (77.5)
Extrathyroidal extension 0.739 0.523
Negative 43 (51.2) 41 (48.8) 22 (26.2) 62 (73.8)
Positive 51 (53.7) 44 (46.3) 21 (22.1) 74 (77.9)
Lymphatic invasion 0.038 0.023
Negative 72 (57.6) 53 (42.4) 36 (28.8) 89 (71.2)
Positive 22 (40.7) 32 (59.3) 7 (13.0) 47 (87.0)
Vascular invasion 0.425 1.000
Negative 92 (53.2) 81 (46.8) 42 (24.3) 131 (75.7)
Positive 2 (33.3) 4 (66.7) 1 (16.7) 5 (83.3)
Lymph node metastasis 0.061 0.205
Negative 53 (59.6) 36 (40.4) 25 (28.1) 64 (71.9)
Positive 41 (45.6) 49 (54.4) 18 (20.0) 72 (80.0)
Lateral lymph node metastasis 0.061 0.205
Negative 53 (59.6) 36 (40.4) 25 (28.1) 64 (71.9)
Positive 41 (45.6) 49 (54.4) 18 (20.0) 72 (80.0)
pT stage 0.739 0.523
pT1 or pT2 43 (51.2) 41 (48.8) 22 (26.2) 62 (73.8)
pT3 or pT4 51 (53.7) 44 (46.3) 21 (22.1) 74 (77.9)
AJCC stage 0.816 0.037
I or II 58 (53.2) 51 (46.8) 32 (29.4) 77 (70.6)
III or IV 36 (51.4) 34 (48.6) 11 (15.7) 59 (84.3)
BRAF mutation 0.833 0.027
Negative 20 (54.1) 17 (45.9) 14 (37.8) 23 (62.2)
Positive 74 (52.1) 68 (47.9) 29 (20.4) 113 (79.6)
상기 표 8의 Cyclin D1b의 세포 내 위치(localization)과 다양한 병리학적 인자들간의 상관관계를 통하여 Cyclin D1b가 핵내 유의성 있게 높게 존재 하는 경우 림프관 침윤(p=0.038)가 높음을 예측할 수 있고, 세포질 내 유의성 있게 높은 양 존재하는 경우 나쁜 예후를 예측하는 데 활용될 수 있음을 판단할 수 있었다.
4-2 갑상선유두암종 내 Cyclin D1b의 세포 내 위치 및 병리학적 특성의 관계
상기 전체 암종에서의 Cyclin D1b의 세포 내 위치와 병리학적 특성의 관계를 알아보기 위한 분석방법을 Cyclin D1b의 단백질 발현양이 가장 높고, 갑상선유두암종에서 가장 흔한 유형이기 때문에 전형적 갑상선유두암종(Classic papillary carcinoma) 내에서 수행하였다.
그 결과 하기 표 9에서 알 수 있듯이 세포내 염색되는 위치와 무관하게 여성에서 유의하게 높은 발현율을 보였으며, 핵내 염색 유형은 림프관 침윤(p=0.017)과 림프절 전이(p=0.042)와 유의한 관련성이 있는 것으로 판단되었다. 따라서, 상기 결과를 통해 핵 내에 Cyclin D1b의 발현을 전형적 갑상선유두암종(Classic papillary carcinoma)의 림프절 전이 예측 인자로도 활용 가능할 수 있을 것이다.
Cyclin D1b
Nuclear (%) Cytoplasmic (%)
Negative Positive P-value Negative Positive P-value
Average tumor size (cm) 10.4±5.4 11.8±8.7 0.296 10.8±5.4 11.3±7.9 0.791
Age at diagnosis (years) 0.509 0.378
≤45 20 (40.0) 30 (60.0) 10 (20.0) 40 (80.0)
>45 30 (46.2) 35 (53.8) 9 (13.8) 56 (86.2)
Gender 0.001 0.048
Female 4 (15.4) 22 (84.6) 1 (3.8) 25 (96.2)
Male 46 (51.7) 43 (48.3) 18 (20.2) 71 (79.8)
Multiplicity 0.441 0.376
Negative 21 (39.6) 32 (60.4) 7 (13.2) 46 (86.8)
Positive 29 (46.8) 33 (53.2) 12 (19.4) 50 (80.6)
Extrathyroidal extension 0.818 0.837
Negative 22 (42.3) 30 (57.7) 9 (17.3) 43 (82.7)
Positive 28 (44.4) 35 (55.6) 10 (15.9) 53 (84.1)
Lymphatic invasion 0.017 0.150
Negative 41 (50.6) 40 (49.4) 16 (19.8) 65 (80.2)
Positive 9 (26.5) 25 (73.5) 3 (8.8) 31 (91.2)
Vascular invasion 0.631 0.519
Negative 49 (44.1) 62 (55.9) 18 (16.2) 93 (83.8)
Positive 1 (25.0) 3 (75.0) 1 (25.0) 3 (75.0)
Lymph node metastasis 0.042 0.837
Negative 28 (53.8) 24 (46.2) 9 (17.3) 43 (82.7)
Positive 22 (34.9) 41 (65.1) 10 (15.9) 53 (84.1)
Lateral lymph node metastasis 0.112 0.355
Negative 43 (47.3) 48 (52.7) 17 (18.7) 74 (81.3)
Positive 7 (29.2) 17 (70.8) 2 (8.3) 22 (91.7)
pT stage 0.818 0.837
pT1 or pT2 22 (42.3) 30 (57.7) 9 (17.3) 43 (82.7)
pT3 or pT4 28 (44.4) 35 (55.6) 10 (15.9) 53 (84.1)
AJCC stage 0.921 0.252
I or II 28 (43.1) 37 (56.9) 13 (20.0) 52 (80.0)
III or IV 22 (44.0) 28 (56.0) 6 (12.0) 44 (88.0)
BRAF mutation 0.108 1.000
Negative 4 (25.0) 12 (75.0) 2 (12.5) 14 (87.5)
Positive 46 (46.5) 53 (53.5) 17 (17.2) 82 (82.8)
5-1 갑상선암종 이외의 다른 암종과의 비교
갑상선암종 특히 유두갑상선암종에서의 사이클린(Cyclin) D1 b의 진단 특이성 및 민감도 여부를 판단하기 위하여 유방암 등과 같은 다른 암종에서 사이클린(Cyclin) D1 b의 발현 정도를 전령 알엔에이(mRNA) 및 단백질 수준에서 확인 후, 발현정도와 암종과의 관계에 대한 분석(SPSS)을 실시 하였다.
5-2 갑상선암종 이외의 다른 암종과의 비교 결과
Oncogene 논문에 게시된 결과에 따르면 (Oncogene (2009) 28, 1812-1820) 유방암에서 사이클린(Cyclin) D1b의 발현이 사이클린(Cyclin) D1 a와 비교 하였을 때 나쁜 질병 증상과 연관성이 있음이 보고되었음에도 불구하고, 갑상선암종 내에서 사이클린(Cyclin) D1 b의 발현 양이 높은 것을 확인할 수 있었다.
<110> chan kwon, jeong <120> DIAGNOSIS FOR THYROID CANCER USING CYCLIN D1 b <130> DIAGNOSIS FOR THYROID CANCER USING CYCLIN D1 b <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 agttcatttc caatccgccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 tttccgtggc actaggtgtc 20 <210> 3 <211> 1031 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 cacacggact acaggggagt tttgttgaag ttgcaaagtc ctggagcctc cagagggctg 60 tcggcgcagt agcagcgagc agcagagtcc gcacgctccg gcgaggggca gaagagcgcg 120 agggagcgcg gggcagcaga agcgagagcc gagcgcggac ccagccagga cccacagccc 180 tccccagctg cccaggaaga gccccagcca tggaacacca gctcctgtgc tgcgaagtgg 240 aaaccatccg ccgcgcgtac cccgatgcca acctcctcaa cgaccgggtg ctgcgggcca 300 tgctgaaggc ggaggagacc tgcgcgccct cggtgtccta cttcaaatgt gtgcagaagg 360 aggtcctgcc gtccatgcgg aagatcgtcg ccacctggat gctggaggtc tgcgaggaac 420 agaagtgcga ggaggaggtc ttcccgctgg ccatgaacta cctggaccgc ttcctgtcgc 480 tggagcccgt gaaaaagagc cgcctgcagc tgctgggggc cacttgcatg ttcgtggcct 540 ctaagatgaa ggagaccatc cccctgacgg ccgagaagct gtgcatctac accgacaact 600 ccatccggcc cgaggagctg ctgcaaatgg agctgctcct ggtgaacaag ctcaagtgga 660 acctggccgc aatgaccccg cacgatttca ttgaacactt cctctccaaa atgccagagg 720 cggaggagaa caaacagatc atccgcaaac acgcgcagac cttcgttgcc ctctgtgcca 780 cagatgtgaa gttcatttcc aatccgccct ccatggtggc agcggggagc gtggtggccg 840 cagtgcaagg cctgaacctg aggagcccca acaacttcct gtcctactac cgcctcacac 900 gcttcctctc cagagtgatc aagtgtgacc cggtaagtga gggtgatgtc ccaggcagcc 960 ttgccggggc ttacaggggg agacacctag tgccacggaa atgccgaggc tggtgccaag 1020 gcccccaagg g 1031 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 tgaggagccc caacaacttc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 5 cctgggacat caccctcact ta 22 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 ttcctctcca gagtgatcaa gtgtgaccc 29 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 tcataatgct tgctctgata gga 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 8 ggccaaaaat ttaatcagtg ga 22 <210> 9 <211> 274 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Met Glu His Gln Leu Leu Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Arg Ala Met Leu 20 25 30 Lys Ala Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val 35 40 45 Gln Lys Glu Val Leu Pro Ser Met Arg Lys Ile Val Ala Thr Trp Met 50 55 60 Leu Glu Val Cys Glu Glu Gln Lys Cys Glu Glu Glu Val Phe Pro Leu 65 70 75 80 Ala Met Asn Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Ser Leu Glu Pro Val Lys Lys 85 90 95 Ser Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val Ala Ser Lys 100 105 110 Met Lys Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu Cys Ile Tyr Thr 115 120 125 Asp Asn Ser Ile Arg Pro Glu Glu Leu Leu Gln Met Glu Leu Leu Leu 130 135 140 Val Asn Lys Leu Lys Trp Asn Leu Ala Ala Met Thr Pro His Asp Phe 145 150 155 160 Ile Glu His Phe Leu Ser Lys Met Pro Glu Ala Glu Glu Asn Lys Gln 165 170 175 Ile Ile Arg Lys His Ala Gln Thr Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp 180 185 190 Val Lys Phe Ile Ser Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val 195 200 205 Val Ala Ala Val Gln Gly Leu Asn Leu Arg Ser Pro Asn Asn Phe Leu 210 215 220 Ser Tyr Tyr Arg Leu Thr Arg Phe Leu Ser Arg Val Ile Lys Cys Asp 225 230 235 240 Pro Val Ser Glu Gly Asp Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Arg 245 250 255 Gly Arg His Leu Val Pro Arg Lys Cys Arg Gly Trp Cys Gln Gly Pro 260 265 270 Gln Gly <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Val Ser Glu Gly Asp Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Arg Gly 1 5 10 15 Arg His Leu Val Pro Arg Lys Cys Arg Gly Trp Cys Gln Gly Pro Gln 20 25 30 Gly

Claims (22)

  1. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 mRNA수준을 측정하고, 정상대조군 시료와의 수준을 비교하여, 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 mRNA의 측정 방법은 유전자 서열목록 3에 특이하게 결합하는 프라이머쌍을 포함하는 유전자 증폭방법(PCR)인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 서열목록 4인 정방향, 서열목록 5인 역방향 프라이머쌍과 서열목록 6인 프로버(probe)인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 갑상선암은 유두암종, 여포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종 및 수질암종으로 이루어진 것인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 갑상선암은 갑상선유두암종(papillary thyroid carcinoma)에서 유래된 것인 갑상선암 진단 및/또는 림프절 전이에 대한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1b의 발현이 정상대조군 시료의 수준과 비교하여 높은 것인 갑상선암 진단 및/또는 림프절 전이 예측에 대한 정보를 제공하는 방법.
  7. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질(protein) 발현 수준을 측정하고, 정상대조군과 시료의 수준을 비교하여, 갑상선암 진단 및/또는 림프절 전이 예측에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 측정은 사이클린(Cyclin) D1 b의 서열목록 9와 특이적으로 결합하는 서열목록 10을 포함하는 항체를 통한 면역조직화학염색(Immunocytochemistry), 웨스턴 블롯(Western blot), 팩스(FACS) 중 어느 하나의 방법인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 6항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질 발현이 정상대조군 시료의 수준과 비교하여 높은 것인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1b의 단백질 발현은 핵 내에 높은 것인 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1 b의 CCND1 G/A 870 polymorphism을 추가로 더 측정하는 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 시료로부터 BRAF V600E돌연변이(mutation)의 수준을 추가로 더 측정하는 갑상선암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 BRAF V600E돌연변이(mutation)의 수준은 서열 증폭에 적합한 서열목록 7의 정방향, 서열목록 8인 역방향 프라이머쌍을 포함하는 갑상선암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  15. 서열목록 3의 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 서열 증폭에 적합한 엡티머 또는 항체 중 어느 하나를 포함하는 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 엡티머는 서열목록 4의 정방향 엡티머 및 서열목록 5의 역방향 엡티머로 이루어진 것을 특징으로 하는 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 외에 CCND1 G/A870 polymorphism 의 증폭에 적합한 엡티머를 포함하는 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 외에 BRAF V600E돌연변이(mutation)의 증폭에 적합한 엡티머를 포함하는 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  19. 제 15항에 있어서,
    상기 엡티머는 유전자 서열목록 4인 정방향, 서열목록 5인 역방향 엡티머를 포함하는 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  20. 제 15항에 있어서,
    상기 엡티머는 BRAF V600E돌연변이(mutation)의 수준은 서열 증폭에 적합한 서열목록 7의 정방향, 서열목록 8인 역방향 엡티머를 포함하는 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  21. 제 15항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 갑상선 암종은 갑상선암은 유두암종, 여포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종 및 수질암종 것을 특징으로 하는 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 갑상선 암종은 갑상선암은 유두암종(papillary thyroid carcinoma)인 사이클린(Cyclin) D1b 유전자 검출 및 갑상선 암종 진단용 키트.
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