CN115707784A - Usp10在非小细胞肺癌患者的诊断和预后评估中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及USP10在非小细胞肺癌患者的诊断和预后评估中的应用。具体地，本发明提供了一种USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，本发明首次发现，USP10在非小细胞肺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，USP10高表达的非小细胞肺癌患者生存期明显短于USP10低表达的非小细胞肺癌患者，因此，USP10基因或其蛋白可(i)用作检测非小细胞肺癌的标志物；(ii)用作判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的标志物。

Description

USP10在非小细胞肺癌患者的诊断和预后评估中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及USP10在非小细胞肺癌患者的诊断和预后评估中的应用。

背景技术

蛋白质泛素化修饰有多种形式，其多样性在细胞生理功能调节中发挥着重要作用。泛素链的延长主要由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3来完成。多聚泛素化修饰(Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48和Lys63)中，K48多聚泛素链是丰度最高的多聚泛素链，主要起到蛋白质降解标签的作用。当底物蛋白质与K48泛素链结合后，就会被蛋白酶体识别并降解；抑制蛋白酶体其水平会迅速升高。同时，泛素链的长短决定了蛋白质底物同蛋白酶体的亲和性。泛素链越长，蛋白质底物就越容易被蛋白酶体识别并降解。常见的另外一种泛素链形式为K63，被认为参与许多重要的细胞信号通路。当底物蛋白质与K63泛素链结合后，就会被特异的调控因子识别，从而启动相应的信号通路，参与DNA损伤修复、细胞周期、氧化应激和信号转导等调控。

泛素化调节是一个可逆过程。去泛素化酶DUB(Deubiquitylase，DUB)可介导底物蛋白质去泛素化，参与泛素分子回收利用、加工泛素前体和编辑泛素链等过程。细胞中去泛素化酶的功能是受到严格调控的。去泛素化酶可以被磷酸化、泛素化和类泛素化(sumoylation)等修饰调节，进而影响自身催化活性、细胞定位或蛋白质丰度等。人类基因组编码近100种去泛素化酶。一个去泛素化酶可以调控多个底物,一个底物也将受多个去泛素化酶共同调节。根据去泛素化酶活性位点的不同，分为半胱氨酸依赖的蛋白酶和锌离子依赖的金属酶，共六个家族，其中泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific proteases，USPs)是研究最多，功能最为多样的一个家族。

非小细胞肺癌占肺癌发生率的80％～85％左右，目前虽然开发了一些新的检测方法和靶向治疗药物，但是临床上仍然缺乏针对非小细胞肺癌患者的特异性早期诊断指标、预后评估指标和有效治疗靶点。

因此，本领域迫切需要开发针对非小细胞肺癌的早期诊断指标、预后评估指标和治疗靶点。

发明内容

本发明的目的就是提供针对非小细胞肺癌的早期诊断指标、预后评估指标。

本发明第一方面提供了一种USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测非小细胞肺癌的标志物；(ii)用作判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的标志物；和/或(iii)用于制备检测非小细胞肺癌的诊断试剂或试剂盒；和/或(iv)用于制备判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述非小细胞肺癌选自下组：肺腺癌、肺鳞癌、肺大细胞癌、或其组合。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有非小细胞肺癌的患者或非小细胞肺癌疑似患者。

在另一优选例中，所述USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于非小细胞肺癌患者。

在另一优选例中，所述USP10基因的登录号为Gene ID:9100。

在另一优选例中，所述USP10 mRNA的登录号为NM_005153.3。

在另一优选例中，所述USP10蛋白的登录号为NP_005144.2。

在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。

在另一优选例中，所述的检测包括免疫组化、免疫印迹和荧光定量PCR方法检测。

在另一优选例中，所述的检测是测定非小细胞肺癌组织、一般肺组织样品。

在另一优选例中，所述的一般肺组织包括癌旁组织。

在另一优选例中，所述检测试剂包括USP10的特异性抗体、USP10的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。

在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述的USP10蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述USP10的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述USP10蛋白还包括USP10蛋白的衍生物。

在另一优选例中，所述USP10蛋白的衍生物包括经修饰的USP10蛋白、氨基酸序列与天然USP10蛋白同源且具有天然USP10蛋白活性的蛋白分子、含有USP10蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

在另一优选例中，所述经修饰的USP10蛋白是PEG化的USP10蛋白。

在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然USP10蛋白同源且具有天然USP10蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与USP10蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然USP10蛋白活性的蛋白分子。

本发明第二方面提供了一种用于(i)检测非小细胞肺癌和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(i)检测非小细胞肺癌；和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期。

在另一优选例中，所述的检测非小细胞肺癌指判断发生非小细胞肺癌的可能性大小。

在另一优选例中，所述的检测非小细胞肺癌指判断发生非小细胞肺癌的风险。

在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。

在另一优选例中，所述的检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂包括：

(a).抗USP10蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增USP10的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。

在另一优选例中，所述检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂可作为对照品或参照品。

在另一优选例中，所述的标签或说明书注明所述试剂盒用于：

(a)当检测对象的肺细胞或组织中USP10表达量E1大于参比值E2(E2为20)，则提示该检测对象患有非小细胞肺癌的几率高于一般人群(正常对照人群)；

其中，所述的参比值E2是一般人群(正常对照人群)的一般肺细胞或组织的USP10的表达量的平均值；

(b)当检测对象的肺细胞或组织中USP10表达量E1小于参比值E2(E2为20)，则提示该检测对象患有非小细胞肺癌的几率低于一般人群(正常对照人群)；

其中，所述的参比值E2是一般人群(正常对照人群)的一般肺细胞或组织的USP10的表达量的平均值；

(c)当检测对象被诊断为非小细胞肺癌患者时，在检测对象的非小细胞肺癌细胞或组织中USP10表达量E3大于参比值E4(E4为30)时，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；

(d)当检测对象被诊断为非小细胞肺癌患者时，在检测对象的非小细胞肺癌细胞或组织中USP10表达量E3小于参比值E4(E4为30)时，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率低于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；

其中，所述的参比值E4是用X-tile软件设置的肺癌细胞或组织的USP10的表达量截断值。

在另一优选例中，所述的一般肺细胞或组织包括癌旁或正常的肺细胞或组织。

在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。

本发明第三方面提供了一种检测非小细胞肺癌的方法，所述方法包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

b)检测测试样品中USP10蛋白的表达量E5；和

c)将步骤b)中所测定的USP10蛋白的表达量与对照进行比较，

其中与所述对照相比，所述样品中USP10蛋白的表达量E5高于参比值E2，表明受试者患有非小细胞肺癌的几率高于一般人群(正常对照人群)；和/或USP10蛋白的表达量E5低于参比值E2，表明受试者患有非小细胞肺癌的几率低于一般人群(正常对照人群)；和/或

与所述对照相比，所述样品中USP10蛋白的表达量E5高于参比值E4，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；和/或USP10蛋白的表达量E5低于参比值E4，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率低于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)。

在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述测试样品为非小细胞肺癌疑似患者或非小细胞肺癌患者的细胞或组织。

在另一优选例中，所述参比值E2为是一般人群(正常对照人群)的一般肺细胞或组织的USP10的表达量的平均值。

在另一优选例中，所述的一般肺细胞或组织包括癌旁或正常的肺细胞或组织。

在另一优选例中，所述参比值E4为用X-tile软件设置的肺癌细胞或组织的USP10的表达量截断值(cut-off值)。

在另一优选例中，所述参比值E2为20。

在另一优选例中，所述参比值E4为30。

在另一优选例中，通过RT-PCR或转录组测序检测样品中USP10 RNA的表达水平，免疫印迹或免疫组织化学检测样品中的USP10蛋白的表达水平。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了肺腺癌肿瘤组织与对应癌旁组织中USP10表达情况。(单数列为癌组织，双图数列为癌旁组织；从倒数第二行的第三列开始，都为癌组织；最后一个为定位点)。

图2显示了肺磷癌肿瘤组织与对应癌旁组织中USP10表达情况。(单数列为癌组织，双图数列为癌旁组织；从倒数第二行的第三列开始，都为癌组织；最后一个为定位点)

图3显示了肿瘤组织与对应癌旁组织中USP10表达量的H-score平均值分别为40.1和20.0(***P<0.001)。

图4显示了非小细胞肺癌患者肿瘤组织中USP10表达量与患者生存期的关系。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在非小细胞肺癌细胞或组织中的USP10的基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的USP10的基因或其蛋白的表达，并且本发明首次发现，USP10高表达的非小细胞肺癌患者生存期明显短于USP10低表达的非小细胞肺癌患者，因此，USP10基因或其蛋白可(i)用作检测非小细胞肺癌的标志物；(ii)用作判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的标志物。在此基础上，本发明人完成了本发明。

非小细胞肺癌

据统计，肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤首位。肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类。非小细胞肺癌根据病理类型可分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％。其中只有15-25％的非小细胞肺癌有手术治疗的机会，而即使接受根治性手术治疗，仍然有50％的NSCLC患者会复发。现在传统的治疗手段(手术及放化疗)在提高非小细胞肺癌的五年生存率方面遇到了瓶颈，而随着近几年转化医学的研究推进，研究了一些肿瘤检测方法和靶点，开发出了一些靶向性药物，但由于对NSCLC的疾病机制还不清楚，临床上仍然缺乏有效的早期检测指标和治疗靶点。因此，针对非小细胞肺癌的早期诊断指标和治疗靶点的转化医学基础研究具有重要意义。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品由来自受试者的肺部组织、肺部肿瘤组织或癌旁组织构成。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较USP10蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

在本发明中，所述参比值E2，指正常肺细胞或组织中的USP10的相对表达水平均值，优选相对表达水平为20。具体地，本发明用3D Histech扫描仪对免疫组化染色切片进行扫描(图1，图2)，然后用对应的分析软件(Quant center)对其进行阳性染色深浅和多少进行打分(H-Score)。H-score＝∑(PI×I)＝(弱阳性细胞数量的百分比×1)+(中阳性细胞数量的百分比×2)+(强阳性细胞数量的百分比×3)。经计算分析，正常肺组织中USP10表达量的H-score平均值为20，肿瘤组织中USP10表达量的H-score平均值分别为40.1(图3)，由此看出，USP10表达量高于平均值20时，则可诊断患有非小细胞肺癌的风险高，USP10表达量低于平均值20时，则可诊断患有非小细胞肺癌的风险低，并且，USP10表达量越高，则表明患有非小细胞肺癌的风险越高，由此可用来检测或诊断非小细胞肺癌细胞。

此外，所述参比值E4指截断值(cut-off值)，经H-Score评分分析后，我们用Kaplan-Meier曲线来评估USP10对非小细胞肺癌患者预后的影响，检验方法采用log-rank检验。用X-tile软件设置了截断值为30，他可以将USP10的表达情况分为高表达和低表达：当H-Score<30时,我们认为USP10是低表达；当H-Score≥30时,我们认为它是高表达。当相对表达水平为高于30时，患者的五年生存率40％(95％CI:31％-51％)要低于低表达的患者的61％(95％CI:51％-73％)。可用于判断非小细胞肺癌患者预后和生存期。

肺癌的样品

如本文所用，术语“非小细胞肺癌样品”包括但不限于未患有非小细胞肺癌的人群，非小细胞肺癌患者的非肺细胞癌组织。

USP10蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“USP10蛋白”、“USP10多肽”可互换使用，都指具有USP10氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的USP10蛋白。此外，该术语还包括全长的USP10及其片段。本发明所指的USP10蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

细胞质定位的去泛素化酶USP10，基因位于第16号染色体长臂24区1带，其编码的USP10蛋白含有798个氨基酸，相对分子质量约为93kD。其分子功能结构主要是半胱氨酸型内肽酶和泛素巯基酯酶，通过对翻译后转移至细胞质中的多种蛋白质去泛素化，起到调控细胞的增殖、细胞周期、凋亡与自噬等的作用。

人的USP10蛋白全长为798个氨基酸(登录号为NP005144.2)。鼠的USP10蛋白全长为793个氨基酸(登录号为NP033488.1)。在本发明中，术语“USP10基因”、“USP10多核苷酸”可互换使用，都指具有USP10核苷酸序列的核酸序列。

人USP10基因的基因组全长79946bp(NCBI GenBank登录号为Gene ID:9100)，其转录产物mRNA序列全长3328bp(NCBI GenBank登录号为NM005153.3)。

鼠USP10基因的基因组全长47201bp(NCBI GenBank登录号Gene ID:22224)，其转录产物mRNA序列全长3742bp(NCBI GenBank登录号为NM001310630.1)。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了USP10的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的USP10核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的USP10多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人USP10多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，USP10多核苷酸序列可***到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含USP10编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗USP10的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人USP10多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人USP10基因产物或片段。较佳地，指那些能与人USP10基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人USP10蛋白的分子，也包括那些并不影响人USP10蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人USP10基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人USP10基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人USP10蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人USP10蛋白功能的抗体以及不影响人USP10蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人USP10基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人USP10基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人USP10蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人USP10蛋白。由于USP10蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的USP10胞外区就可成为血清检测的靶对象。

检测方法

利用USP10在非小细胞肺癌的细胞或组织中高表达的这一特点，本发明还提供了检测非小细胞肺癌的方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测USP10的高通量二代测序法以及Sanger测序、荧光定量PCR(qPCR)、原位免疫荧光法(FISH)和免疫组化等。

检测试剂盒

基于USP10与非小细胞肺癌的相关性，即USP10存在于非小细胞肺癌组织中，因此USP10可以作为非小细胞肺癌的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种(i)检测非小细胞肺癌和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的诊断试剂盒，它含有检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(i)检测非小细胞肺癌和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期。

其中，所述标签或说明书注明以下内容：

(a)当检测对象的肺细胞或组织中USP10表达量E1大于参比值E2(E2为20)，则提示该检测对象患有非小细胞肺癌的几率高于一般人群(正常对照人群)；

其中，所述的参比值E2是一般人群(正常对照人群)的一般肺细胞或组织的USP10的表达量的平均值；

(b)当检测对象的肺细胞或组织中USP10表达量E1小于参比值E2(E2为20)，则提示该检测对象患有非小细胞肺癌的几率低于一般人群(正常对照人群)；

其中，所述的参比值E2是一般人群(正常对照人群)的一般肺细胞或组织的USP10的表达量的平均值；

(c)当检测对象被诊断为非小细胞肺癌患者时，在检测对象的非小细胞肺癌细胞或组织中USP10表达量E3大于参比值E4(E4为30)时，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；

(d)当检测对象被诊断为非小细胞肺癌患者时，在检测对象的非小细胞肺癌细胞或组织中USP10表达量E3小于参比值E4(E4为30)时，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率低于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；

其中，所述的参比值E4是用X-tile软件设置的肺癌细胞或组织的USP10的表达量截断值。在另一优选例中，所述的一般肺细胞或组织包括癌旁或正常的肺细胞或组织。

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人USP10蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人USP10蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)肺癌和/或断肺癌患者预后和生存期。

一种检测样品中是否存在USP10蛋白的方法是利用USP10蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与USP10蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在USP10蛋白。

USP10蛋白或其多核苷酸可用于USP10蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗USP10的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的USP10蛋白。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，在非小细胞肺癌细胞或组织中的USP10基因或其蛋白的表达显著高于正常细胞或组织中的USP10基因或其蛋白的表达，因此，USP10基因或其蛋白可用作(i)检测非小细胞肺癌的标志物和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的标志物。

(2)本发明首次发现，USP10在非小细胞肺癌患者的细胞或组织样品中高表达。

(3)本发明首次发现，相比于正常组织，USP10在大部分非小细胞肺癌病人肿瘤组织中高表达，同时高表达与患者预后差密切相关，USP10有望成为非小细胞肺癌的临床诊断和预后评估指标。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

通用方法

一、石蜡切片和免疫组化

石蜡免疫组化的方法可根据本领域常规技术进行，优选的，可采用以下步骤进行：

1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。

2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)。

3.PBS洗2次各5min，蒸馏水冲洗1次5min。

4.抗原修复：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，中火加热4次各6分钟，从微波炉中取出后自然冷却至室温。

5.蒸馏水洗1次5min，PBS洗2次各5min。

6.加3％H2O2孵育10min(室温)。

7.PBS洗3次各5min。

8.加封闭液(5％BSA)，室温孵育1小时，倾去，勿洗。

9.滴加一抗，4℃过夜。

10.PBS冲洗3次各5min。

11.加即用型MaxVisionTM试剂，室温孵育15分钟。

12.PBS洗3次各5min。

13.加新鲜配制DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，自来水充分冲洗。

14.苏木素复染2～3min，自来水充分冲洗。

15.盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗。

16.脱水、透明80％(5min)→95％(5min)→95％(5min)→100％(5min)→100％(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)。

17.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干.

其中，即用型MaxVisionTM试剂购买于迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂盒购买于迈新生物技术开发有限公司。

实施例1肿瘤组织与对应癌旁组织中USP10表达量的H-score分析

我们分别收集非小细胞肺癌(肺鳞癌和肺腺癌)组织标本共180例，对肿瘤组织和癌旁组织中USP10的表达情况进行了定量分析(H-score)。我们用3D Histech扫描仪对免疫组化染色切片进行扫描(图1，图2)，然后用对应的分析软件(Quant center)对其进行阳性染色深浅和多少进行打分(H-Score)。H-score＝∑(PI×I)＝(弱阳性细胞数量的百分比×1)+(中阳性细胞数量的百分比×2)+(强阳性细胞数量的百分比×3)。经计算分析，肿瘤组织与对应癌旁组织中USP10表达量的H-score平均值分别为40.1和20.0(图3)。通过配对t检验发现，USP10在肿瘤组织中的表达量高于癌旁组织，P<0.001，差异有统计学意义，并且由此看出，USP10表达量高于平均值20时，则可诊断患有非小细胞肺癌的风险高，USP10表达量低于平均值20时，则可诊断患有非小细胞肺癌的风险低，并且，USP10表达量越高，则表明患有非小细胞肺癌的风险越高。以上结果表明，在非小细胞肺癌发生与进展中，USP10也可能发挥了促进作用，USP10有望成为非小细胞肺癌的临床诊断指标。

实施例2USP10表达量与患者预后的关系

经H-Score评分分析后，我们用Kaplan-Meier曲线来评估USP10对非小细胞肺癌患者预后的影响，检验方法采用log-rank检验。我们用X-tile软件设置了截断值为30，他可以将USP10的表达情况分为高表达和低表达：当H-Score<30时,我们认为USP10是低表达；当H-Score≥30时,我们认为它是高表达。根据USP10的表达量将患者分为2组，分别为：USP10高表达组(USP10high)和低表达组(USP10 low)。Kaplan-Meier曲线评估结果显示：USP10高表达患者的五年生存率(40％，95％CI:31％-51％)要低于低表达的患者(61％，95％CI:51％-73％)。P值＝0.001，差异有统计学意义(图4)。以上分析结果表明，在非小细胞肺癌的发生与进展过程中，USP10的高表达发挥了重要促进作用，USP10高表达与患者预后差密切相关。USP10有望成为非小细胞肺癌患者的预后评估指标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，(i)用作检测非小细胞肺癌的标志物；(ii)用作判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的标志物；和/或(iii)用于制备检测非小细胞肺癌的诊断试剂或试剂盒；和/或(iv)用于制备判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的诊断试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非小细胞肺癌选自下组：肺腺癌、肺鳞癌、肺大细胞癌、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测是组织样本检测。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括USP10的特异性抗体、USP10的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

7.一种用于(i)检测非小细胞肺癌和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(i)检测非小细胞肺癌；和/或(ii)判断非小细胞肺癌患者预后和生存期。

8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的检测非小细胞肺癌指判断发生非小细胞肺癌的风险。

9.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的检测USP10基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂包括：

(a).抗USP10蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增USP10的mRNA或cDNA的特异性引物。

10.一种检测非小细胞肺癌的方法，其特征在于，所述方法包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

b)检测测试样品中USP10蛋白的表达量E5；和

c)将步骤b)中所测定的USP10蛋白的表达量与对照进行比较，

其中与所述对照相比，所述样品中USP10蛋白的表达量E5高于参比值E2，表明受试者患有非小细胞肺癌的几率高于一般人群(正常对照人群)；和/或USP10蛋白的表达量E5低于参比值E2，表明受试者患有非小细胞肺癌的几率低于一般人群(正常对照人群)；和/或

与所述对照相比，所述样品中USP10蛋白的表达量E5高于参比值E4，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)；和/或USP10蛋白的表达量E5低于参比值E4，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率低于一般人群(非小细胞肺癌患者对照人群)。

Images