KR20170094216A

KR20170094216A - 소르타제를 사용하는 효소 매개되는 폴리펩티드 접합을 위한 신규한 방법

Info

Publication number: KR20170094216A
Application number: KR1020177016141A
Authority: KR
Inventors: 마라 뵈니츠-두라트; 페터 크라츠쉬; 마르틴 샤테
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2017-08-17
Also published as: US10190182B2; CA2966287A1; EP3233905B1; CN107001447B; JP2018500901A; EP3233905A1; RU2714963C2; RU2017122029A; RU2017122029A3; JP6618539B2; SG11201704625UA; WO2016096741A1; MX2017007503A; CN107001447A; US20170292166A1; BR112017010775A2

Abstract

본원에서 보고되는 것은 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 제 1 폴리펩티드, 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 그것의 N-말단에 갖는 제 2 폴리펩티드, 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A 에서 유래하는 소르타제 활성을 갖는 제 3 폴리펩티드를 인큐베이션하는 단계, 및 접합체를 반응 혼합물로부터 회수하고 그에 의해 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물을 생산하는 단계를 포함하는 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물의 생산 방법이다.

Description

소르타제를 사용하는 효소 매개되는 폴리펩티드 접합을 위한 신규한 방법 {NOVEL METHODS FOR ENZYME MEDIATED POLYPEPTIDE CONJUGATION USING SORTASE}

본원에서 펩티드 결합을 통한 2 개의 화합물의 효소적 접합 (enzymatic conjugation) 을 위한 개선된 방법이 보고된다.

소르타제 A (Sortase A) (SrtA) 는 단백질을 박테리아 세포 벽에 공유적으로 부착하는 막 결합된 효소이다. SrtA 기질 상의 특이적 인지 모티프 (motif) 는 LPXTG 이며, 그에 의해 효소는 아미노산 잔기 트레오닌과 글라이신 사이를 절단한다. 펩티도글리칸 상의 인지 모티프는 펜타글라이신 모티프이다. N-말단의 트리글라이신 및 심지어는 디글라이신 모티프는 SrtA 반응을 지지하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 (Clancy, K.W. 등, Peptide science 94 (2010) 385-396). 반응은 올리고글라이신으로부터 아민 친핵체의 공격에 의해 분해되는 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행하며, 펩티도글리칸을 단백질 기질에 공유적으로 연결하고 SrtA 를 재생성한다. SrtA 는 화학적으로 합성된 펩티드를 재조합적으로 발현된 단백질에 공유적으로 접합하는데 사용될 수 있다.

WO 2010087994 에서 결찰 (ligation) 방법 및 그의 용도가 보고된다. IgG-유사 이중특이적 항체에 대한 재조합적 접근이 Marvin, J.S. 등 (Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658) 에 의해 보고된다. Levary, D.A. 등 (PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6) 은 소르타제 A 에 의해 촉매작용되는 단백질-단백질 융합을 보고한다. WO 2013/003555 에서 단백질 결찰을 위한 클릭 화학 핸들 (click chemistry handle) 을 설치하는 소르타제의 용도가 보고된다.

Strijbis, K. 등 (Traffic 13 (2012) 780-789) 은 소르타제를 사용하는 살아 있는 세포에서의 단백질 결찰을 보고한다. 그들에 의해 언급된 것은 Ca²⁺-의존적 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 소르타제 A 는 세포내에서 기능적이 아니지만, Ca²⁺-비의존적 S. 피오게네스 소르타제 A 는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 포유류 HEK293T 세포 둘다의 시토졸 및 세포질 세망 (ER) 루멘에서 기능적이라는 것이다.

Levary, D.A. 등은 소르타제 A 에 의해 촉매작용되는 단백질-단백질 융합을 보고한다 (PLOS ONE 6 (2011)). 항-상피 성장 인자 수용체 항체를 단일 사슬 포맷으로 조작하고 소르타제 A-매개되는 단백질 결찰에 의해 표지하는 것이 Madej, M.P. 등 (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470) 에 의해 보고된다. Ta, H.T. 등은 심혈관 질환에서 표적화되는 분자 이미지화 및 세포 귀소 (homing) 에 대한 일반적 접근으로서 효소적 단일 사슬 항체 태깅 (tagging) 을 보고한다 (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Popp, M. 등은 펩티드 결합의 제조 및 파괴 - 소르타제를 사용하는 단백질 공학을 보고한다 (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032). WO 2010/087994 에서 결찰 방법 및 그의 용도가 보고된다. DOTA 킬레이트에 대해 높은 친화도를 갖는 조작된 단백질이 WO 2010/099536 에서 보고된다.

N-말단 막-고정 (anchoring) 모티프를 결여하는, 끝이 잘린 (truncated) SrtA 는 세포-표면 단백질 표지 (labeling), 공유적인 단백질 부동화 (immobilization) 및 단백질 내로의 신규한 관능기의 편입에 사용되어 왔다. 그러나, 등몰량의 기질을 사용하는 경우에, SrtA-매개되는 결찰의 수율은 항상 70 % 미만이며, 그 이유는 반응이 가역적이기 때문이다. 또다른 결점은 의도한 것이 아닌 LPXT 산물을 초래하는 반응 중간체의 가수분해이다. 이는 특히 SrtA 와의 긴 인큐베이션 기간에 의해 문제가 된다. 하지만 이는 최종 산물에 남은 SrtA 가 심지어 소량이라도 시간의 흐름에 따라 그것을 파괴할 수 있음을 의미한다; 이는 품질 표준이 매우 높은 생물제제에서 큰 이슈이다.

소르타제의 역 반응을 차단하려는 상이한 노력들이 보고되어 왔다. Yamamura, Y. 등 (Chem. Commun. 47 (2011) 4742-4744) 은 기질의 인지 자리 주위에 β-헤어핀을 도입하여 결찰 자리 주위에 베타-헤어핀 구조를 유도함으로써 소르타제 A-매개되는 단백질 결찰을 향상시키는 것을 보고했다.

전형적인 소르타제 A 에 의한 LPXTG 펩티드의 소팅, 효소 역학의 조정에 있어서 불변 기질 잔기의 역할 및 생산적 기질의 입체배좌 서명이 Biswas, T. 등에 의해 보고되었다 (Biochem. 53 (2014) 2515-2524).

Li, Y.M. 등은 소르타제의 사용에 의한 단백질의 비가역적 자리-특이적 히드라진분해를 보고한다 (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (2014) 2198-2202).

WO 2014/001324 에서 적어도 2 가지 상이한 결합 엔터티 (entity) 를 함유하는 맞춤형 고도 선택적 및 다중특이적 표적화 엔터티의 선별 및 생산 방법 및 그의 용도가 보고된다. Marraffini, L.A. 등 (J. Biol. Chem. 279 (2004) 37763-37770) 은 스타필로코쿠스 아우레우스의 세포 벽에 표면 단백질을 고정할 때 소르타제 A 의 효율적 촉매작용을 위해 보존된 아르기닌 잔기가 요구된다는 것을 보고한다.

그러나, 모든 이들 접근은 나중에 생체내에서 면역원성과 같은 문제를 초래할 수 있는 인공 모티프 또는 구조를 생산 또는 이용한다는 결점을 갖는다.

발명의 요약

LPXTA 는 기질로서 받아들여지지 않으므로, 친핵체로서의 올리고-알라닌과 LPXTG 소르타제 모티프 (Sortase motif) 의 조합은 반응 산물의 억제된 또는 심지어는 완전히 제거된 역반응 또는 가수분해를 초래하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물의 생산 방법이다:

- 하기를 인큐베이션하는 단계

i) (20 개 C-말단 아미노산 잔기 내에) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 제 1 폴리펩티드,

ii) 그것의 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 갖는 제 2 폴리펩티드,

iii) 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A 에서 유래하는 소르타제 활성을 갖는 제 3 폴리펩티드, 및

- 접합체 (conjugate) 를 반응 혼합물로부터 회수하고 그에 의해 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물을 생산하는 단계.

- 하기를 인큐베이션하는 단계

ii) i) 그것의 N-말단에 알라니닐 화합물을, 또는 ii) 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 을, 또는 iii) 그것의 N-말단에 시스테인 아미노산 잔기 및 그에 뒤이어 1 내지 3 개의 알라닌 아미노산 잔기를 포함하는 제 2 폴리펩티드,

- 접합체를 반응 혼합물로부터 회수하고 그에 의해 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물을 생산하는 단계.

하나의 구현예에서 제 1 폴리펩티드는 그것의 C-말단에 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함한다.

하나의 바람직한 구현예에서 제 1 폴리펩티드는 그것의 C-말단에 아미노산 서열 LPETG (SEQ ID NO: 30) 을 포함한다.

하나의 구현예에서 제 2 폴리펩티드는 그것의 N-말단에 SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27 의 올리고-알라닌을 갖는다.

하나의 구현예에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 독립적으로 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 항체 가변 도메인, 항체 중쇄 Fab-단편, 항체 Fc-영역, 태그 (tag), 및 펩티드, 링커 (linker) 및 비-소르타제 모티프 모이어티 (non-sortase motif moiety) 로부터 선택된다.

하나의 구현예에서 제 3 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 갖는다.

본원에서 보고되는 하나의 양상은 소르타제 아미노산 서열과 올리고-알라닌 포함 펩티드 사이의 소르타제 촉매작용되는 접합 반응의 수율을 증가시키기 위한, 그것의 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 조합된 소르타제 모티프 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 의 용도이다.

본원에서 보고되는 하나의 양상은 소르타제 아미노산 서열과 올리고-알라닌 포함 펩티드 사이의 소르타제 촉매작용되는 접합 반응에서 부산물 형성을 감소시키기 위한, 그것의 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 조합된 소르타제 모티프 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 의 용도이다.

본원에서 보고되는 하나의 양상은 소르타제 아미노산 서열과 올리고-알라닌 포함 펩티드 사이의 소르타제 촉매작용되는 접합 반응을 산물 쪽으로 이동시키기 위한, 그것의 N-말단에 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 조합된 소르타제 모티프 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 의 용도이다.

발명의 상세한 설명

I. 정의

본 명세서 및 청구항에서 면역글로불린 중쇄 Fc-영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 의 EU 인텍스에 따른다 (Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, 본원에 명백히 참조로 포함됨).

용어 "알라니닐 화합물 (alaninyl compound)" 은 자유 알파 아미노 기, 예를 들어 NH₂ 또는 NH₃ ⁺, 및 또다른 모이어티와 펩티드 결합하는 위치 1 에 카르복시 기를 갖는 알라닌 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 나타내며, 여기에서 모이어티는 임의의 아미노 기 함유 모이어티, 예컨대 단리된 아미노산 잔기, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 소분자, 염료, 또는 (화학적 또는 펩티드) 링커일 수 있다.

용어 "포함하는" 은 본원에서 사용될 때 용어 "로 이루어지는" 을 명백히 포함한다.

용어 "변경" 은 변이체 항체 또는 융합 폴리펩티드를 초래하는, 예를 들어, 적어도 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드의, 부모 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이, 부가, 또는 결실을 의미한다.

용어 "아미노산 돌연변이" 는 부모 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 수식을 의미한다. 예시적 수식은 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함한다. 하나의 구현예에서 아미노산 돌연변이는 치환이다. 용어 "위치에서의 아미노산 돌연변이" 는 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 의미한다. 용어 "명시된 잔기에 인접한 삽입" 은 그의 1 개 내지 2 개의 잔기 내의 삽입을 의미한다. 삽입은 명시된 잔기의 N-말단 또는 C-말단에서 이루어질 수 있다.

용어 "아미노산 치환" 은 소정의 부모 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생적 아미노산 잔기" (즉, 유전 부호에 의해 인코딩됨) 일 수 있고, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글라이신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val). 하나의 구현예에서 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 치환이 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 포함된다. "비-자연 발생적 아미노산 잔기" 는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 위에 열거된 자연 발생적 아미노산 잔기 이외의, 잔기를 의미한다. 비-자연 발생적 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 아이브 (aib) 및 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336 에 기재된 것을 포함한다. 그러한 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 생성하기 위해, Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman, et al. (상기) 의 절차가 사용될 수 있다. 간략히, 이들 절차는 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 억제자 tRNA 의 화학적 활성화 이후, RNA 의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 비-자연 발생적 아미노산은 또한 화학적 펩티드 합성 및 이들 펩티드와 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편의 후속 융합을 통해 펩티드 내로 통합될 수 있다.

용어 "아미노산 삽입" 은 소정의 부모 아미노산 서열 내로의 하나 이상의 부가적 아미노산 잔기의 통합을 의미한다. 삽입은 통상적으로 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 것이지만, 본 출원은 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어, 약 3 개 내지 약 5 개 또는 심지어는 약 10 개 이하의 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)은 위에 정의된 바와 같이 자연 발생적 또는 비-자연 발생적일 수 있다.

용어 "아미노산 결실" 은 아미노산 서열에서의 소정의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 의미한다.

이 출원에서 아미노산 변경이 언급될 때마다, 그것은 의도적 아미노산 변경이지, 무작위 아미노산 수식이 아니다.

용어 "태그 (tag)" 는 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. 하나의 구현예에서 태그는 친화도 또는 정제 태그이다. 하나의 구현예에서 태그는 Arg-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 태그는 SEQ ID NO: 01 (RRRRR), 또는 SEQ ID NO: 02 (RRRRRR), 또는 SEQ ID NO: 03 (HHHHHH), 또는 SEQ ID NO: 04 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), 또는 SEQ ID NO: 05 (DYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 06 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 07 (AWRHPQFGG), 또는 SEQ ID NO: 08 (WSHPQFEK), 또는 SEQ ID NO: 09 (MDVEAWLGAR), 또는 SEQ ID NO: 10 (MDVEAWLGARVPLVET), 또는 SEQ ID NO: 11 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), 또는 SEQ ID NO: 12 (EQKLISEEDL), 또는 SEQ ID NO: 13 (KETAAAKFERQHMDS), 또는 SEQ ID NO: 14 (KRRWKKNFIAVSAANRF KKISSSGAL), 또는 SEQ ID NO: 15 (셀룰로스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 16 (셀룰로스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 17 (TNPGVSAWQVNTA YTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), 또는 SEQ ID NO: 18 (GST-태그), 또는 SEQ ID NO: 19 (MBP-태그) 로부터 선택된다.

물질, 예를 들어, 약학적 제형의 "유효량" 은 요망되는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데, 필수적인 투여량에서 및 시간 동안, 효과적인 양을 나타낸다.

용어 "개체" 또는 "대상" 은 포유류를 나타낸다. 포유류는 사육 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 및 햅스터) 를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.

용어 "약학적 제형" 은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 수용불가능할 정도로 독성인 부가적 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.

"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 비독성인, 활성 성분 이외의, 약학적 제형 내의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.

용어 "위치" 는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 포맷, 예를 들어 항체 넘버링을 위한 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.

본원에 사용되는, "치료" (및 그의 문법적 활용형 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는") 는 치료할 개체의 자연적 과정을 변경하려는 시도의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 원하는 효과는, 이에 제한되지 않으나, 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, ?? 차도 및 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병 지연 또는 질환의 진행 둔화를 위해 이용된다.

II. 소르타제 A 를 사용하는 효소적 접합

2 개의 생체내에서 공유 결합되지 않는 엔터티를 포함하는 공유적 접합체가 효소 소르타제, 특히 소르타제 A 를 사용하여 시험관내에서 얻어질 수 있다.

소르타제 A (SrtA) 는 단백질을 박테리아 세포 벽에 공유적으로 부착하는 막 결합된 효소이다. SrtA 기질 상의 특이적 인지 모티프는 LPXTG 이며, 그에 의해 효소는 아미노산 잔기 트레오닌과 글라이신 사이를 절단한다. 펩티도글리칸 상의 인지 모티프는 펜타글라이신 모티프이다. N-말단의 트리글라이신 및 심지어는 디글라이신 모티프는 SrtA 반응을 지지하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 (Clancy, K.W. 등, Peptide science 94 (2010) 385-396). 반응은 올리고글라이신으로부터 아민 친핵체의 공격에 의해 분해되는 티오에스테르 아실-효소 중간체를 통해 진행하며, 펩티도글리칸을 단백질 기질에 공유적으로 연결하고 SrtA 를 재생성한다. SrtA 는 화학적으로 합성된 펩티드를 재조합적으로 발현된 단백질에 공유적으로 접합하는데 사용될 수 있다.

많은 그람-양성 박테리아는 그들의 세포벽 (펩티도글리칸) 에 소르타제를 사용하여 균력 인자를 포함하는 여러 가지 표면 단백질을 공유적으로 고정한다. 소르타제는 막 연합된 효소이다. 야생형 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A (SrtA) 는 N-말단 막 관통 영역을 갖는 206 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 제 1 단계에서, 소르타제 A 는 LPXTG (SEQ ID NO: 20) 아미노산 서열 모티프를 함유하는 기질 단백질을 인지하고, Thr 과 Gly 사이의 아미드 결합을 활성-자리 Cys 에 의해 절단한다. 이러한 펩티드 절단 반응은 소르타제 A-기질 티오에스테르 중간체를 초래한다. 제 2 단계에서 티오에스테르 아실-효소 중간체는 올리고글라이신 함유 제 2 기질 폴리펩티드 (스타필로코쿠스 아우레우스 내의 펩티도글리칸의 펜타글라이신 단위체에 상응함) 의 아미노 기의 친핵성 공격에 의해 분해되어, 공유적으로 연결된 세포벽 단백질 및 소르타제 A 의 재생을 초래한다. 올리고글라이신 친핵체의 부재시에, 아실-효소 중간체는 물 분자에 의해 가수분해된다.

소르타제-매개되는 결찰/접합은 여러 가지 단백질 조작 및 생물접합 목적을 위해 적용되기 시작했다. 이러한 새로운 기술은 LPXTG-태그된 재조합 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 내로 자연적 및 합성 관능기의 도입을 가능하게 해준다. 예는 올리고글라이신 유도체화된 중합체 (예를 들어, PEG), 형광단, 비타민 (예를 들어, 비오틴 및 폴레이트), 지질, 탄수화물, 핵산, 합성 펩티드 및 단백질 (예를 들어, GFP) 의 공유적 부착을 포함한다 (예를 들어 Tsukiji, S. and Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.-L. 및 Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032 참고).

효소적 접합을 위해 막 관통 영역 (SrtA; 스타필로코쿠스 아우레우스 SrtA 의 아미노산 잔기 60-206) 을 결여하는 가용성 끝이 잘린 소르타제 A 가 사용될 수 있다 (SEQ ID NO: 21; 또한 Ton-That, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061 참고).

III. 재조합적 방법

그것의 N-말단에 올리고알라닌 모티프 (AA (SEQ ID NO: 26), AAA (SEQ ID NO: 27), AAAA (SEQ ID NO: 28), AAAAA (SEQ ID NO: 29)) 를 포함하는 임의의 폴리펩티드 도메인 (예를 들어 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드 예컨대 scFv, scFab, 또는 다르핀, 또는 다중 사슬 항원 결합 폴리펩티드 예컨대 dsFv 또는 Fab) 이 진핵생물 세포 (예를 들어 HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액으로부터 발현 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드가 단리된 폴리펩티드인지 또는 다합체성 또는 헤테로머성 (heteromeric) 엔터티에 포함되는지 여부는 중요하지 않다.

폴리펩티드-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현/분비에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때, 폴리펩티드는 박테리아에서 생산될 수 있다 (예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523, 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기재하는, Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ) 참고). 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있거나, 또는 불용성 분획 소위 봉입체로부터 단리될 수 있으며 이는 가용화되어 생체활성 형태로 다시 접힐 수 있다. 그 후 폴리펩티드는 추가로 정제될 수 있다.

원핵생물 외에도, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 예를 들면 일부 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 초래하는, 글리코실화 경로가 "인간화" 된 진균 및 효모 균주이다 (예를 들어, Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, 및 Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참고).

글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큐로바이러스 균주가 식별되었다.

식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생산을 위한 PLANTIBODIES^™ 기술을 기재함) 참고).

척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 COS-7 세포주 (SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포; HEK293 세포주 (인간 배아 신장), BHK 세포주 (아기 햄스터 신장); TM4 마우스 세르톨리 세포주 (TM4 세포, 예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251 에 기재됨); CV1 세포주 (원숭이 신장 세포); VERO-76 세포주 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포); HELA 세포주 (인간 자궁경부암 세포); MDCK 세포주 (개 신장 세포); BRL-3A 세포주 (버팔로 랫트 간 세포); W138 세포주 (인간 폐 세포); HepG2 세포주 (인간 간 세포); MMT 060562 세포주 (마우스 유방암 세포); TRI 세포주 (예를 들어, Mather, et al., Anal. N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재됨); MRC5 세포주; 및 FS4 세포주이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 CHO 세포주 (중국 햄스터 난소 세포), 예를 들어 DHFR 음성 CHO 세포주 (예를 들어 Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216 참고), 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 세포주를 포함한다. 폴리펩티드 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ) 을 참고한다.

IV. 본원에서 보고되는 방법

소르타제 매개되는 폴리펩티드 접합 반응은 일반적으로는 반응 평형이 산물 쪽에 있지 않다는 결점을 갖는다. 따라서, 평형을 이동시키거나 또는 산물을 제거하는 것이 유익하다. 아래 표에서 상이한 기질에 대한 소르타제 (스타필로코쿠스 아우레우스) 의 상대적 활성이 제시된다.

표.

따라서, LPXTA 는 기질로서 받아들여지지 않으므로, 친핵체로서의 올리고-알라닌과 LPXTG 소르타제 모티프의 조합은 반응 산물의 억제된 또는 심지어는 완전히 제거된 역반응 또는 가수분해를 초래하는 것으로 밝혀졌다. (도 1, 3 및 4 참고).

이는 소르타제 매개되는 결찰 반응에서 2 개의 항체 Fc-영역 단편을 사용하여 예시되었다. 하나의 Fc-영역 단편은 C-말단 LPETG 소르타제 모티프를 포함하며, 한편 다른 Fc-영역 단편은 N-말단 올리고-알라닌 (AAA, SEQ ID NO: 27) 을 친핵체로서 포함한다. 반응 혼합물의 샘플을 16 시간 및 40 시간 후에 분석했다 (도 2 참고). 원하는 결찰 산물 (Fc-영역 이합체, 대략 60 kDa) 이 16 시간 후에 형성되는 것을 볼 수 있다. 높은 농도의 소르타제 (1:10 비 효소:기질) 에도 불구하고, 형성된 산물의 가수분해가 심지어는 40 시간 인큐베이션 시간 후에도 일어나지 않았다.

LPETG 및 올리고-글라이신 (GGG, SEQ ID NO: 23) 의 경우에, 형성된 소르타제 산물의 분해가 관찰되었다.

이러한 시약의 조합으로, 증가된 반응 시간에서 통상적으로 일어나는,

i) 산물 접합체 내의 LPXTG 아미노산 서열을 기질로서 인지하는 역 반응, 및/또는

ii) 데드-엔드 (dead-end) 가수분해 폴리펩티드 단편 (Fc-영역 친핵체 대신 물에 의한 티오아실-결합 엔터티 소르타제 A 중간체의 절단을 통해 생성되는 LPXTG 인지 서열이 없는/절단된 폴리펩티드) 의 생성

이 감소 또는 심지어는 제거될 수 있다.

비-소르타제 모티프 모이어티

소르타제 모티프 아미노산 서열 LPXTG 은, 그것이 이들 분자 중 하나에 직접 포함되지 않는 경우에, 치료제 (약물), 세포독성제 (예를 들어 독소 예컨대 독소루비신 또는 페르투시스 독소), 형광단 예컨대 형광 염료 예컨대 플루오레세인 또는 로다민, 이미지화 또는 방사선치료 금속을 위한 킬레이트제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지, 태그, 또는 소거-조정제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제 3 성분에 결합하는 펩티드, 또는 또다른 탄수화물 또는 친유성제에 접합될 수 있다. 접합은 직접적으로 또는 개입 링커를 통하여 이루어질 수 있다.

a) 치료 모이어티

약물 모이어티는 치료 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기, 예컨대 항체, 세포독성 또는 세포정지 화합물일 수 있다.

세포 표면 분자 및 이들의 리간드로 향하는 다수의 치료 항체, 예컨대 리툭산 (Rituxan)/MabThera/리툭시맙 (Rituximab), 2H7/오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 제발린 (Zevalin)/이브리주모맙 (Ibrizumomab), 아르제라 (Arzerra)/오파투무맙 (Ofatumumab) (CD20), HLL2/에프라투주맙 (Epratuzumab), 이노투조맙 (Inotuzomab) (CD22), 제나팍스 (Zenapax)/다실리주맙 (Daclizumab), 시물렉트 (Simulect)/바실리시맙 (Basiliximab) (CD25), 헤르셉틴 (Herceptin)/트라스투주맙 (Trastuzumab), 페르투주맙 (Pertuzumab) (Her2/ERBB2), 마일로타르그 (Mylotarg)/젬투주맙 (Gemtuzumab) (CD33), 랍티바 (Raptiva)/에팔리주맙 (Efalizumab) (Cd11a), 에르비툭스 (Erbitux)/세툭시맙 (Cetuximab) (EGFR, 표피 성장 인자 수용체), IMC-1121B (VEGF 수용체 2), 타이사브리 (Tysabri)/나탈리주맙 (Natalizumab) (α4ß1 및 α4ß7 인테그린의 α4-서브유닛), ReoPro/압식시맙 (Abciximab) (gpIIb-gpIIa 및 αvß3-인테그린), 오르토클론 (Orthoclone) OKT3/무로모납 (Muromonab)-CD3 (CD3), 벤리스타 (Benlysta)/벨리무맙 (Belimumab) (BAFF), 톨레륵스 (Tolerx)/오텔리시맙 (Oteliximab) (CD3), 솔리리스 (Soliris)/에쿨리주맙 (Eculizumab) (C5 보체 단백질), 악템라 (Actemra)/토실리주맙 (Tocilizumab) (IL-6R), 파노렉스 (Panorex)/에드레콜로맙 (Edrecolomab) (EpCAM, 상피 세포 부착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙 (Labetuzumab) (CD66/CEA, 암-배아 항원), CT-11 (PD-1, 프로그램된 사멸-1 T-세포 저해 수용체, CD-d279), H224G11 (c-Met 수용체), SAR3419 (CD19), IMC-A12/시숙투무맙 (Cixutumumab) (IGF-1R, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575 (PDGF-R, 혈소판-유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙 (Tremelimumab) (세포독성 T 림프구 항원 4), RO5323441 (태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙 (Mapatumumab) (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), Vedotin(SGN-35)/브렌투시맙 (Brentuximab) (CD30), 및 ARH460-16-2 (CD44) 가 알려져 있다.

본원에서 보고되는 방법으로 얻어진 접합체는 예를 들어, 종양 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 (예를 들어, 내분비성) 질환, 또는 신경학적 (예를 들어, 신경병성) 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 상기 질환의 예시적 비-제한적 예는 알츠하이머 질환, 비-호지킨 림프종, B-세포 급성 및 만성 림프구성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 모발 세포 백혈병, 급성 및 만성 골수성 백혈병, T-세포 림프종 및 백혈병, 다발성 골수종, 신경교종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 상피성 암종 (예컨대 구강, 위장관, 결장, 위, 폐의 관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 자궁, 자궁내막, 자궁경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부, 및 고환의 암종), 흑색종, 육종, 신경교종, 및 피부 암, 급성 특발 혈소판감소 자색반증, 만성 특발 혈소판감소 자색반증, 피부근염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루프스, 홍반성 신염, 류마티스성 열, 다선성 증후군, 수포성 유천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반병, 연쇄상 구균감염후 사구체 신염, 결절성 홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨 질환, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형홍반, IgA 신증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스처 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상샘항진증, 공피증, 만성 활성 간염, 다발근육염/피부근염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 콩팥병, 근위축성 측삭 경화증, 척수매독, 거세포 동맥염/다발근육통증, 악성 빈혈, 급속 진행 사구체신염, 건선, 또는 섬유성 폐렴이다.

다수의 세포 표면 마커 및 이들의 리간드가 알려져 있다. 예를 들어, 암 세포는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 하기 세포 표면 마커 및 또는 리간드 중 하나 이상을 발현하는 것으로 보고되었다: 탄산 탈수효소 IX, 알파-태아단백질, 알파-액티닌-4, A3 (A33 항체에 특이적인 항원), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1-알파, 결장-특이적 항원-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모막 성 생식선 자극 호르몬 (HCG) 및 이의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자 (HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 la, IGF-1R, IFN-감마, IFN-알파, IFN-베타, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL- 25, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 저해 인자 (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타트산 (prostatic acid) 포스파타아제, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, 서바이빈, 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신, TRAIL 수용체, TNF-알파, Tn-항원, 톰슨-프리덴라이히 (Thomson-Friedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관형성 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 종양유전자 마커 및 종양유전자 산물 (예를 들어, Sensi, et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032; Parmiani, et al, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979; Novellino, et al., Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207 참조).

따라서, 리간드를 포함하여 특이적 세포 표면 수용체를 인지하는 항체는 질환과 연관되는 다수의/복수의 세포 표면 마커에 대한 특이적 및 선택적 표적화 및 결합에 사용될 수 있다. 세포 표면 마커는 예를 들어, 신호전달 사건 또는 리간드 결합과 연관되는 세포 (예를 들어, 질환-관련 세포) 의 표면에 위치하는 폴리펩티드이다.

하나의 구현예에서, 암/종양의 치료를 위해 종양-연관 항원을 표적화하는 다중특이적 결합 분자/이중특이적 항체, 예컨대 Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher (ed.), "The Clinical Biochemistry of Cancer", 페이지 347 (American Association of Clinical Chemists (1979)) 및 US 4,150,149; US 4,361,544; 및 US 4,444,744 에 보고된 것이 생산된다.

종양 연관 항원 (TAA) 에 대한 보고는 Mizukami, et al., (Nature Med. 11 (2005) 992-997); Hatfield, et al., (Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005) 229-248); Vallbohmer, et al., (J Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544); 및 Ren, et al., (Ann. Surg. 242 (2005) 55-63) 을 포함하고, 이들은 각각 식별된 TAA 와 관련하여 본원에 참조로 인용된다.

질환이 림프종, 백혈병 또는 자가면역 장애를 수반하는 경우, 표적화되는 항원은 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 la, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, P1GF, ED-B 피브로넥틴, 종양유전자, 종양유전자 산물 (예를 들어, c-met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 항원, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) 및 TRAIL-R2 (DR5) 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

다수의 이중특이적 항체는 2 개의 상이한 표적, 예컨대 BCMA/CD3, 조합으로의 HER 패밀리의 상이한 항원 (EGFR, HER2, HER3), CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-베타/IL-8, IL-6 또는 IL 6R/ IL-21 또는 IL-21R 으로 향하는 것으로 알려져 있고, 첫번째 특이성은 Lewis x-, Lewis b- 및 Lewis y-구조, Globo H-구조, KH1, Tn-항원, TF-항원 및 뮤신 (Mucin) 의 탄수화물 구조, CD44, 당지질 및 당스핑고지질, 예컨대 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실세라마이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원의 당에피토프 (glycoepitope) 로 향하고, 두번째 특이성은 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ErbB 수용체 티로신 키나아제로 향하고, 두번째 항원 결합 부위와 조합으로의 GD2 는 T 림프구 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역학적 세포와 연관되고, 항원의 조합은 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린 및 MMP 로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 수용성 리간드는 VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

독성 약물 모이어티는 하기를 포함한다: (i) 미소관 저해제, 유사분열 저해제, 토포이소머라아제 저해제, 또는 DNA 삽입제로서 기능할 수 있는 화학치료제; (ii) 효소적으로 작용할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 방사성동위원소.

예시적 독성 약물 모이어티는 마이탄시노이드, 오우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 기타 엔다이인 (enediyne) 항생제, 탁산, 안트라사이클린, 및 이의 입체이성질체, 등배전자체, 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

단백질 독소는 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의), 리신 A 사슬 (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-5), 여주 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센 (WO 93/21232) 을 포함한다.

치료적 방사성동위원소는 ³²P, ³³P, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹³¹In, ¹⁵³Sm, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At, ²¹²B, ²¹²Pb, 및 Lu 의 방사능활성 동위원소를 포함한다.

방사성동위원소 또는 기타 표지가 알려진 방식으로 도입될 수 있다 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 복합체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적 킬레이트제이다 (WO 94/11026).

b) 표지 (label)

비-소르타제 모티프 모이어티는 표지일 수 있다. 소르타제 아미노산 서열에 공유적으로 부착될 수 있는 임의의 표지 모이어티가 사용될 수 있다 (예를 들어, Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla. 참고). 표지는 (i) 탐지가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제 2 표지와 상호작용하여 제 1 또는 제 2 표지에 의해 제공되는 탐지가능한 신호를 변형하여, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전달) 을 제공하거나; (iii) 전하, 소수성, 형상, 또는 기타 물리적 파라미터에 의해, 이동성, 예를 들어, 전기영동 이동성 또는 세포-투과성에 영향을 미치거나, 또는 (iv) 포획 모이어티를 제공하여, 예를 들어, 이온 복합체화를 조정하는 작용을 할 수 있다.

본원에서 보고되는 합텐화된 표지를 포함하는 접합체는 진단 어세이에서, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 관심의 항원의 발현을 탐지하는데 유용할 수 있다. 진단 적용을 위해, 제 1 결합 특이성은 표적에 결합하고 제 2 결합 특이성은 합텐화된 표지에 결합하는 이중특이적 항체가 사용될 것이다. 합텐은 전형적으로는 탐지가능한 모이어티로 표지될 것이다. 하기 카테고리로 일반적으로 분류될 수 있는 수많은 표지가 입수가능하다:

(a) 방사성동위원소 (방사성핵종), 예컨대 ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Gn, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁹TC, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹³³Xe, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, 또는 ¹³¹Bi. 방사성동위원소 표지된 접합체는 수용체 표적화되는 이미지화 실험에서 유용하다. 항원 (합텐) 은 Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs 에 기재된 기술을 사용하여 방사성동위원소 금속을 결합, 킬레이트 또는 그렇지 않으면 복합체화하는 리간드 시약으로 표지될 수 있다. 금속 이온과 복합체를 형성할 수 있는 킬레이트 리간드는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.) 를 포함한다. 방사성핵종은 본원에서 보고되는 복합체와 복합체화를 통해 표적화될 수 있다 (Wu et al, Nature Biotechnology 23(9) (2005) 1137-1146). 방사성핵종 표지된 복합체에 의한 수용체 표적 이미지화는 종양 조직에서 복합체 또는 상응하는 치료 항체의 진행성 축적의 탐지 및 정량화에 의하는 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다 (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210).

이미지화 실험을 위한 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).

(b) 형광 표지 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 플루오레세인 유형 - FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인 포함; 로다민 유형 - TAMRA 포함; 단실; 리사민 (Lissamine); 시아닌; 파이코에리트린; 텍사스 레드 (Texas Red); 및 이의 유사체. 형광 표지는 예를 들어, 상기 Current Protocols in Immunology 에 기재된 기술을 사용하여 항원 (합텐) 에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) and Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.) 로부터 상업적으로 입수가능한 것들을 포함한다.

탐지 표지 예컨대 형광 염료 및 화학발광 염료 (Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 는 탐지가능한 신호를 제공하고, 표지화에 일반적으로 입수가능하고, 특히 하기 특성을 갖는다: (i) 소량의 접합체가 무-세포 및 세포-기반 어세이 둘다에서 민감하게 탐지될 수 있도록, 표지된 접합체는 매우 높은 신호를 낮은 백그라운드로 생성해야 한다; (ii) 형광 신호가 상당한 광 퇴색 없이 관찰, 모니터링 및 기록될 수 있도록, 표지된 접합체는 광안정적이어야 한다. 멤브레인 또는 세포 표면, 특히 살아있는 세포에 대한 표지된 접합체의 세포 표면 결합을 수반하는 적용의 경우, 표지는 (iii) 효과적인 접합체 농도 및 탐지 민감도를 달성하도록, 양호한 물-용해도를 가져야 하고, (iv) 세포의 정상 대사 과정을 방해하거나 조기 세포 사멸을 야기하지 않도록, 살아있는 세포에 무독성이어야 한다.

(c) 다양한 효소-기질 표지가 입수가능하거나 공개되어 있다 (예를 들어, US 4,275,149 참고). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매작용한다. 예를 들어, 효소는 분광광도계로 측정될 수 있는, 기질에서의 색 변화를 촉매작용할 수 있다. 대안적으로는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고 그 후 측정될 수 있는 (예를 들어 화학발광측정기를 사용하여) 빛을 방사할 수 있거나 또는 형광 수용체에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라아제 (예를 들어, 초파리 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레에이트 데히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제 (AP), (3-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당 옥시다아제 (예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제), 헤테로시클릭 옥시다아제 (예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다. 효소를 폴리펩티드에 접합하기 위한 기술은 O'Sullivan et al "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone & IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166 에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 (US 4,275,149; US 4,318,980) 예를 들어, 하기를 포함한다:

(i) 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 와 기질로서의 수소 퍼옥시다아제, 여기에서 수소 퍼옥시다아제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)) 를 산화시킨다;

(ii) 알칼리 포스파타아제 (AP) 와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및

(iii) (3-D-갈락토시다아제) (3-D-Gal) 와 색소 기질 (예를 들어, p-니트로 페닐-(3-D-갈락토시다아제)) 또는 형광원 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다아제)).

본원에서 보고되는 표지된 접합체는 임의의 알려진 어세이 방법, 예컨대 ELISA, 경쟁적 결합 어세이, 직접 및 간접 샌드위치 어세이, 및 면역침전 어세이에서 이용될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.).

본원에서 보고되는 표지된 접합체는 다음과 같은 다양한 생물의학적 및 분자적 이미지화 방법 및 기술에 의한 이미지화 바이오마커 및 프로브로서 유용하다: (i) MRI (자기 공명 이미지화); (ii) MicroCT (컴퓨터 단층촬영); (iii) SPECT (단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297; Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; US 2010/0111856 (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파. 면역신티그래피 (Immunoscintigraphy) 는 방사능활성 성분으로 표지된 접합체가 동물 또는 인간 환자에 투여되고, 접합체가 국부화되는 신체 내 자리의 사진을 찍는 이미지화 절차이다 (US 6,528,624). 이미지화 바이오마커는 치료적 개입에 대한 정상 생물학적 과정, 병원성 과정, 또는 약물학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있다. 바이오마커는 여러 유형의 것일 수 있다: 유형 0 마커는 질환의 천연 이력 마커이고, 알려진 임상적 지표, 예를 들어, 류머티스성 관절염에서의 활막 염증의 MRI 측정과 수평적으로 연관된다; 유형 I 마커는 작용 메커니즘 (심지어 상기 메커니즘이 임상적 결과와 연관되지 않을 수 있음에도 불구하고) 에 따른 개입의 영향을 포착하고; 유형 II 마커는 CT 에 의한 류마티스 관절염에 있어서 측정된 골 침식과 같은, 바이오마커가 표적화된 반응을 "인증" 하기 위한 임상적 이득을 예측하는 것에서의 변화 또는 그로부터의 신호인 대리 종말점으로서 기능한다. 따라서 이미지화 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 대한 치료제 결합 (즉, 선택성), 및 (iii) 소거율 및 반감기 약동학적 데이터에 대한 약역학적 (PD) 치료 정보를 제공할 수 있다. 실험실-기반 바이오마커에 대한 생체내 이미지화 바이오마커의 이점은 하기를 포함한다: 비-침습적 치료, 정량가능한, 전신 평가, 반복적 투약 및 평가, 즉 다수 시점, 및 전임상 결과 (소형 동물) 로부터 임상 결과 (인간) 로 잠재적으로 이동가능한 효과. 일부 적용을 위해, 생물이미지는 전임상 연구에서의 동물 실험의 수를 대신하거나 최소화한다.

펩티드 표지 방법은 널리 알려져 있다. Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155; Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324; Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115; Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237 을 참고한다.

링커 (linker)

용어 "링커" 는 제 1 모이어티와 제 2 모이어티를 접합 (연결) 하는데 사용될 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티를 나타낸다. 연결된 접합체는 2 개의 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다.

하나의 구현예에서, 링커는 소르타제 아미노산 서열에 존재하는 친핵성 기에 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 자리를 갖는다. 유용한 친전자성 기는 또다른 티올, 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어 Klussman et al, Bioconjugate Chemistry 15(4) (2004) 765-773 의 p. 766 의 접합 방법 참고).

티올-반응 관능기의 예는 티올, 말레이미드, 알파-할로아세틸, 활성화 에스테르 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

링커는 소르타제 아미노산 서열을 비-소르타제 모티프 모이어티에 연결시키는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것들 뿐만 아니라 비-자연 발생적 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린 또는 β-아미노산, 예컨대 β-알라닌, 또는 ω-아미노산 예컨대 4-아미노-부티르산을 포함한다.

또다른 구현예에서, 링커는 소르타제 아미노산 서열에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 유용한 친전자성 기는 알데하이드 및 케톤 카르보닐기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 소르타제 아미노산 서열의 친핵성 기와 반응하고 소르타제 아미노산 서열에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항원 (합텐) 상의 친전자성 기는 링커에 대한 부착을 위한 편리한 자리를 제공한다.

통상, 펩티드-유형 링커는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성하여 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에서 널리 알려진 액체상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (E. Schroder and K. Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136).

또다른 구현예에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조장하는 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 하전된 치환기 예컨대 술포네이트 (SO₃ ^-) 또는 암모늄 또는 중합체 예컨대 PEG 는 시약의 수용해도를 증가시키고 링커 시약과 항원 (합텐) 또는 약물 모이어티와의 커플링 반응을 촉진시키거나, 이용한 합성 경로에 따른 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다.

본원에서 보고되는 바와 같은 비-소르타제 모티프 모이어티를 포함하는 접합체는 하기 링커 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰) 벤조에이트), 및 예컨대 하기 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)₃, 및 BM(PEO)₄ (이들은 Pierce Biotechnology, Inc. 사에서 시판됨) 으로 제조된 복합체를 명백히 고려하나, 이에 제한되지 않는다. 비스-말레이미드 시약은 예를 들어 티올기를 티올-함유 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체에, 순차적 또는 동시적 방식으로 부착시키는 것을 허용한다. 예를 들어 티올기와 반응성인 말레이미드 외의 다른 관능기는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다.

예시적 링커는 말레이미드 스트레쳐 (stretcher) 및 파라-아미노벤질 카르바모일 (PAB) 자가-희생 (self-immolative) 스페이서를 갖는 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약, 및 말레이미드 스트레쳐 단위 및 p-아미노 벤질 자체-희생성 스페이서를 갖는 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 시약을 포함한다.

시스테인 티올기는 친핵성이고, 링커 시약 및 비-소르타제 모티프 모이어티 또는 소르타제 아미노산 서열 상의 하기와 같은 친전자성 기와 술피드 교환을 통해 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기; 및 (iv) 디술피드, 예컨대 피리딜 디술피드. 합텐화된 화합물 상의 친핵성 기는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않고, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다: 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기.

도 1 소르타제 반응식; (1) 유리체 (educts), (2) 산물, (3) 가수분해 (부산물을 초래하는 부반응).
도 2 16 시간 및 40 시간 후에 효소적 반응 혼합물의 SDS-page 겔.
도 3 사용된 기질에 따른 최대 수율의 시간 경과; 정사각형: LPKTG+G, 다이아몬드: LPKTG+A.
도 4 사용된 기질에 따른 최대 수율의 시간 경과; 정사각형: LPKTG+G, 다이아몬드: LPKTG+A.

하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 실제 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 본 발명의 주제에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변화가 가해질 수 있다고 이해된다.

상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 설명과 예시에 의해 더욱 상세히 기술되고는 있지만, 설명과 예시가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재조합 DNA 기술

Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) 에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작했다. 분자 생물학 시약을 제조사의 지침에 따라 사용했다.

유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성

원하는 유전자 분절을 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서 화학적 합성에 의해 제조했다. 합성된 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드 내로 클로닝했다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 대안적으로는, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 또는 PCR 을 통해 짧은 합성 DNA 단편을 조립했다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에 의해 제조되었다.

기본/표준 포유류 발현 플라스미드의 설명

원하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 그의 N-말단에 올리고글라이신을 함유하는 Fc-사슬) 의 발현을 위해 하기 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용했다:

- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),

- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 발현될 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄), 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

발현될 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 외에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:

- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 원점, 및

- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.

단백질 측정

정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를, 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 확인함으로써 확인했다.

실시예 1

가용성 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A 를 위한 발현 플라스미드의 생성

소르타제 유전자는 N-말단에서 끝이 잘린 소르타제 A (60-206) 분자 (SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열) 를 인코딩한다.

HEK293 세포에서의 가용성 소르타제의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는, 가용성 소르타제 발현 카세트 외에도, 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함했다.

가용성 소르타제의 전사 단위는 하기 기능적 요소들을 포함했다:

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),

- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 정제 태그 인코딩 핵산,

- N-말단에서 끝이 잘린 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A 인코딩 핵산, 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).

성숙한 가용성 소르타제의 아미노산 서열은

이다.

정제 태그는 아미노산 서열 MRGSHHHHHHGS (SEQ ID NO: 31) 을 갖는다.

실시예 2

일시적 발현 및 분석적 특성분석

F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 재조합적 생산을 수행했다. 트랜스펙션에서 "293-Fectin" 트랜스펙션 시약 (Invitrogen) 을 사용했다. 트랜스펙션을 제조사의 지침에 명시된 바와 같이 수행했다. 트랜스펙션 후 삼 내지 칠 (3-7) 일에 세포 배양물 상청액을 수확했다. 상청액을 감소된 온도 (예를 들어 -80℃) 에서 저장했다.

예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합적 발현에 관한 일반 정보가 Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203 에 제공되어 있다.

아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 단백질 농도를 확인했다. 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하의 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 순도를 분석했다.

실시예 3

소르타제 매개되는 접합

50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ 중 100 μM 의 C-말단 LPETG 소르타제 모티프 (SEQ ID NO: 30) 를 포함하는 Fc-영역 단편, 100 μM 의 N-말단 3개(triple)-알라닌 모티프 (SEQ ID NO: 27) 를 포함하는 Fc-영역 단편 및 10 μM 의 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A 를 포함하는 반응 혼합물을 37 ℃ 에서 40 시간 동안 인큐베이션했다.

16 시간 및 40 시간 후에 취한 샘플에서 90 ℃ 로 가열하여 반응을 중단시켰다.

5 ㎕ 환원제 (Novex) 및 12.5 ㎕ 샘플 완충액 (Novex) 을 보충한 샘플 (32.5 ㎕) 을 10 분 동안 90 ℃ 에서 인큐베이션했다. 20 ㎕ 의 각각의 제제를 4-12 % Bis-Tris 그라디언트 겔 (Novex) 상에 로딩했다. 겔 전기영동을 1 x MOPS 완충액 (Novex) 에서 200 V 및 120 mA 에서 35 분 동안 수행했다.

실시예 4

소르타제 활성 어세이

아래 개요서술된 방법으로, 리포터 효소로서의 글루코스 탈수소효소를 소르타제 아미노산 모티프 (LPETG 또는 LPETA) 에 융합시키고 이것을 제 1 기질로서 사용함으로써 소르타제-매개되는 효소적 접합/커플링 반응의 활성을 광도측정으로 확인할 수 있다. 제 2 기질로서 비오틴일화된 올리고-글라이신 또는 올리고-알라닌을 사용한다 (친핵체). 제 1 및 제 2 기질을 함유하는 용액에 소르타제를 첨가할 때, 비오틴일화된 리포터 효소인 제 1 및 제 2 기질의 소르타제-매개되는 접합에 의해 접합체가 형성된다. 비오틴일화된 리포터 효소는 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 사용하여 회수될 수 있다. 리포터 효소에 관한 기질이 첨가될 때, 산물은 광학 밀도의 변화에 의해 탐지될 수 있다.

정제된 소르타제를 그것의 기질, 즉, 200 mM NaCl 을 함유하는 50 mM Tris 완충액 pH 7.5 중 LPETG 또는 LPETA 모티프를 함유하는 글루코스 탈수소효소 (20 μM) 및 N-말단 글라이신 또는 알라닌을 함유하는 비오틴 유도체 (330 μM) 와 혼합했다. 반응 혼합물을 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 반응을 10- 내지 20-배 과잉량의 저해 완충액 (50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 5 mM 요오드아세타미드) 의 첨가에 의해 중단시켰다. 중단된 반응 혼합물을 10 분 동안 5000 x g 에서 원심분리했다. 상청액 (50 ㎕) 을 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ 를 포함하는 100 ㎕ 의 50 mM Tris 완충액 (pH 7.5) 에 첨가하고, 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드를 첨가하고, 30 분 동안 30℃ 에서 200 rpm 에서 인큐베이션했다. 그 후 자기 비드를 자석 및 진공 펌프를 사용하여 V-바닥 멀티-웰 플레이트에서 매 회 300 ㎕ 세정 완충액 (50 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 5 ㎎/㎖ BSA, 0.1 % Triton X-100) 으로 5 회 세정했다. 그 뒤에 비드를 100 ㎕ 시트레이트 시험 완충액에 재현탁시키고, 그 중 10-80 ㎕ 를 새로운 웰에 옮겼다. 거기에 150 ㎕ 시험 완충액 (0.2 M 나트륨 시트레이트, pH 5.8, 0.3 g/L 4-니트로소아닐린, 1 mM CaCl₂, 30 mM 글루코스) 을 첨가했다.

리포터 효소의 동역학을 5 분의 시간에 걸쳐 620 ㎚ 에서 측정한다. 리포터 효소의 활성은 부동화된 효소의 양에 비례하고, 이는 비오틴일화된 효소의 양에 비례하고, 이는 소르타제의 활성에 비례한다.

실시예 5

소르타제 활성 어세이에 의하는 산물 형성 및 붕괴의 분석

명시된 농도의 Sa-SrtA, LPKTG 소르타제 모티프를 함유하는 글루코스 탈수소효소 및 GGGG-비오틴 또는 AAAA-비오틴을 명시된 시점 동안 인큐베이션했다. 반응을 중단시키고, 자기 비드를 사용하여 실시예 4 에 개요서술된 절차에 따라 분석했다. 10 μM 비오틴과의 반응에서 반응 혼합물을 20 배 과잉량의 저해 완충액으로 중단시키고, 100 μM 비오틴과의 반응에서 반응 혼합물을 100 배 과잉량의 저해 완충액으로 중단시켰다. 측정된 활성 (dE/분) 은 소르타제 반응의 수율에 비례한다. 각각의 반응 조건에 관해 최고 수율을 100 % 로 설정했다. 다른 시점에서의 수율을 100 % 로 정규화 (normalize) 했다.

실험 1 (도 3):

출발 물질은 120 μM LPKTG 함유 단백질, 500 μM 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A, 10 μM GGGG-비오틴/AAAA-비오틴이었다.

실험 2 (도 4):

출발 물질은 20 μM LPKTG 함유 단백질, 125 μM 스타필로코쿠스 아우레우스 소르타제 A, 100 μM GGG/AAA 이었다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Novel methods for enzyme mediated polypeptide conjugation <130> P32480-WO <150> EP14198532.5 <151> 2014-12-17 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag <400> 1 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg-tag 2 <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 3 His His His His His His 1 5 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 4 Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala 1 5 10 15 His Asn Lys <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 5 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 6 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 <210> 7 <211> 9 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Claims

하기 단계를 포함하는, 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물의 생산 방법
- 하기를 인큐베이션하는 단계
i) 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
ii) i) 그것의 N-말단에 알라니닐 화합물을, 또는 ii) 올리고-알라닌 A_m (m = 2 (SEQ ID NO: 26), 또는 3 (SEQ ID NO: 27), 또는 4 (SEQ ID NO: 28), 또는 5 (SEQ ID NO: 29)) 을, 또는 iii) 그것의 N-말단에 시스테인 아미노산 잔기 및 그에 뒤이어 1 내지 3 개의 알라닌 아미노산 잔기를 포함하는 제 2 폴리펩티드,
iii) 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 소르타제 A 에서 유래하는 소르타제 활성을 갖는 제 3 폴리펩티드, 및
- 접합체를 반응 혼합물로부터 회수하고 그에 의해 2 개의 폴리펩티드의 효소적 접합 산물을 생산하는 단계.
제 1 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 그것의 C-말단에 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 그것의 C-말단에 아미노산 서열 LPETG (SEQ ID NO: 30) 을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 그것의 N-말단에 SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27 의 올리고-알라닌을 갖는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 서로 독립적으로 아미노산 서열 LPXTG (SEQ ID NO: 20, 여기에서 X 는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 항체 가변 도메인, 항체 중쇄 Fab-단편, 항체 Fc-영역, 태그, 및 펩티드, 링커 및 비-소르타제 모티프 모이어티로부터 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 갖는 방법.