KR20170085531A - 항-cldn 키메라 항원 수용체 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20170085531A
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폴 앤써니 에스카르프
스코트 제이. 딜라
로버트 에이. 스털
데이비드 리우
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애브비 스템센트알엑스 엘엘씨
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Abstract

신규한 항-CLDN 키메라 항원 수용체 및 증식성 장애를 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

항-CLDN 키메라 항원 수용체 및 사용 방법{ANTI-CLDN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE}
상호 참조 출원
본 출원은 2014년 11월 5일에 출원된 특허 협력 조약(PCT) 출원 제PCT/US2014/064165호, 2015년 5월 6일에 출원된 U.S. 가특허 출원 제62/157,928호 및 2015년 10월 27일에 출원된 U.S. 가특허 출원 제62/247,108호의 이익을 주장하고, 상기 문헌의 각각은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열목록을 포함하고, 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 2015년 11월 3일에 생성된 상기 ASCII 사본은 sc2703pct_S69697_1270WO_SEQL_110315.txt라고 명명하고, 크기는 247,510 바이트이다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 클라우딘(CLDN) 결합 도메인을 포함하는 신규한 키메라 항원 수용체의 사용을 포함하는 입양 면역치료요법(adoptive immunotherapy)에 관한 것이다. 바람직한 실시형태들에서, 개시되는 키메라 항원 수용체는 증식성 장애 및 이들의 임의의 재발 또는 전이의 치료 또는 예방에 유용하다.
줄기 세포 및 전구 세포의 분화 및 세포 증식은 기관형성 동안의 조직 성장, 세포 수복(repair) 및 세포 교체를 지지하기 위해 협력해서 작용하는 정상적으로 계속 진행되는 과정들이다. 당해 시스템은 단단히 조절되어 유기체의 필요에 따라 적절한 신호들만이 생성됨을 확실히 한다. 세포 증식과 분화는 손상되었거나 죽어가는 세포들의 교체에 또는 성장에 필요할 때에만 정상적으로 일어난다. 그러나, 이들 프로세스의 중단(disruption)은, 각종 신호전달 화학물질들의 과소 또는 과다, 변경된 미세환경의 존재, 유전자 돌연변이들 또는 이들의 몇몇의 조합을 포함하는 다수의 인자들에 의해 유발될 수 있다. 정상 세포 증식 및/또는 분화의 중단은 암과 같은 증식성 질환을 포함하는 각종 장애를 유도할 수 있다.
암의 종래 치료학적 처치들로는 화학 치료요법, 방사선 치료요법 및 면역 치료요법이 포함된다. 보통 이들 처치는 효과적이지 않고 외과적 절제술은 실행가능한 임상학적 대안을 제공하지 않을 수 있다. 현재 기준의 치유의 한계는 환자들이 일선의 치료를 경험하고 후속적으로 재발한 경우에 특히 명백하다. 이러한 경우, 흔히 공격적이고 치유불가능한 난치성 종양이 주로 발생한다. 많은 고형 종양들의 전체적인 생존율은 기존 치료요법들이 도짐(relapse), 종양 재발(recurrence) 및 전이를 예방하는데 실패하고 있기 때문에 여러 해에 걸쳐 크게 변화하지 않은 상태로 유지되어 왔다. 따라서, 증식성 장애의 더욱 표적화된 그리고 강력한 치료요법들을 개발하는 것에 대한 큰 요구가 남아 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해소한다.
본 발명의 요약
광범위한 양상에서, 본 발명은 클라우딘(CLDN) 계열의 적어도 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 CLDN 결합 도메인을 포함하는 신규한 키메라 항원 수용체(CAR)(CLDN CAR)를 제공한다. 선택된 실시형태들에서, 본 발명의 CLDN CAR는 CLDN6에 특이적으로 또는 CLDN6 및 CLDN9에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태들에서, 본 발명은 CLDN6 및 CLDN9에 실질적으로 동일한 겉보기 결합 친화도로 결합한다. 다른 실시형태들에서, 개시되는 CAR은 CLDN4와 교차-반응할 수 있다. 또한, 다른 바람직한 실시형태들에서, CLDN 표적 단백질(들)은 종양 개시 세포 상에 발현된다.
유전적 변형(예를 들면, 형질도입)을 통해 CLDN CAR가 세포독성 림프구(바람직하게는 자가(autologous)) 상에 발현되어, CLDN 양성 종양 세포를 표적화하고 사멸시키는데 사용되는 CLDN 민감성 림프구를 제공한다. 본원에 광범위하게 논의될 것인 바와 같이, 본 발명의 CAR은 일반적으로 CLDN 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 소정 림프구를 활성화시키고 CLDN 양성 종양 세포(즉, CLDN6+ 및/또는 CLDN9+ 및/또는 CLDN4+인 것들)에 대해 지시된 면역 반응을 생성시키는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 발명의 선택된 실시형태들은 개시된 CAR 및 본 발명의 CLDN CAR을 암호화하는 각종 폴리뉴클레오타이드 서열 및 벡터를 발현하는 면역활성(immunoactive) 숙주 세포를 포함한다. 또 다른 양상은 개체에서의 T 림프구 또는 자연 살해(NK: natural killer) 세포 활성을 강화시키고, CLDN CAR 분자를 발현하는 개별 숙주 세포에 도입함으로써 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 양상은 구체적으로 폐암(예를 들면, 소세포 폐암), 흑색종, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소암, 신경모세포종, 횡문근육종, 백혈병 및 림프종의 치료를 포함한다.
하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 본원에 사용되는 용어 "항체"는 온전한 항체(예를 들면, IgG 또는 IgM) 및 임의의 면역활성 단편(예를 들면, Fab 단편) 또는 이들의 면역활성 작제물 또는 유도체(예를 들면, scFv)를 의미하는 것으로 간주되어야만 한다. 소정 실시형태들에서, 본 발명의 CLDN 결합 도메인(및 CLDN CAR)은 scFv 작제물을 포함할 것이고, 바람직한 실시형태에서는 본원에 개시되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 scFv 작제물을 포함할 것이다. 다른 바람직한 실시형태들에서, 본 발명의 CLDN 결합 도메인(및 CLDN CAR)은 본원에 개시되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 작제물 또는 이의 단편을 포함할 것이다. 이와 같이, 본 개시의 목적을 위해, 용어 "항체"는 일반적으로 사용될 것이고, 문맥에 달리 나타내지 않는 한 분명히 이의 면역반응성 단편, 작제물 또는 유도체를 포함하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명의 특정 양상에서, CAR 결합 도메인은 CLDN 계열(예를 들면, CLDN4, CLDN6 및/또는 CLDN9)의 적어도 하나의 구성원에 결합하고, 서열번호 21의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열번호 23의 중쇄 가변 영역(VH); 또는 서열번호 25의 VL 및 서열번호 27의 VH; 또는 서열번호 29의 VL 및 서열번호 31의 VH; 또는 서열번호 33의 VL 및 서열번호 35의 VH; 또는 서열번호 37의 VL 및 서열번호 39의 VH; 또는 서열번호 41의 VL 및 서열번호 43의 VH; 또는 서열번호 45의 VL 및 서열번호 47의 VH; 또는 서열번호 49의 VL 및 서열번호 51의 VH; 또는 서열번호 53의 VL 및 서열번호 55의 VH; 또는 서열번호 57의 VL 및 서열번호 59의 VH을 포함하는 항체 또는 항체 단편으로부터 유도되거나, 상기 언급된 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하거나, 또는 결합에 대해 상기 언급된 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 단편과 경쟁할 것이다. 특히 바람직한 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 상기 언급된 VL 및 VH 서열을 포함하는 scFv 작제물 또는 이의 단편을 포함할 것이다. 본 발명의 몇몇의 양상에서, CAR 결합 도메인은 키메라, CDR 절편이식된, 사람화된 또는 사람 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 상기 언급된 서열을 포함하는 CAR 결합 도메인은 내재화(internalizing) 항체이다.
또 다른 실시형태들에서, CAR 결합 도메인은 CLND6에 특이적으로 결합하거나; CLDN6 및 CLDN9에 특이적으로 결합하고 결합에 대해 서열번호 21의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열번호 23의 중쇄 가변 영역(VH); 또는 서열번호 25의 VL 및 서열번호 27의 VH; 또는 서열번호 29의 VL 및 서열번호 31의 VH; 또는 서열번호 33의 VL 및 서열번호 35의 VH; 또는 서열번호 37의 VL 및 서열번호 39의 VH; 또는 서열번호 41의 VL 및 서열번호 43의 VH; 또는 서열번호 45의 VL 및 서열번호 47의 VH; 또는 서열번호 49의 VL 및 서열번호 51의 VH; 또는 서열번호 53의 VL 및 서열번호 55의 VH; 또는 서열번호 57의 VL 및 서열번호 59의 VH을 포함하는 항체와 경쟁한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 CAR은 도 3a 또는 도 3b에 제시되는 1개 이상의 중쇄(CDRH1, CDRH2, CDRH3) 또는 경쇄(CDRL1, CDRL2, CDRL3) CDR들을 포함하는 CDR 절편이식된 또는 사람화된 CAR 결합 도메인을 포함할 것이고, 여기서, 상기 CDR들은 카바트 등(Kabat et al.)에 따라 유도된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, CLDN 계열의 적어도 하나의 단백질에 결합하고 결합에 대해 서열번호 61에 제시되는 3개의 가변 경쇄 CDR(CDRL); 및 서열번호 63에 제시되는 3개의 가변 중쇄 CDR(CDRH); 또는 서열번호 65에 제시되는 3개의 CDRL; 및 서열번호 67에 제시되는 3개의 CDRH; 또는 서열번호 69에 제시되는 3개의 CDRL; 및 서열번호 71에 제시되는 3개의 CDRH; 또는 서열번호 73에 제시되는 3개의 CDRL; 및 서열번호 87에 제시되는 3개의 CDRH를 포함하는 항체와 경쟁하는 결합 도메인을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, CLDN 계열의 적어도 하나의 단백질에 결합하고, 결합에 대해, VH 및 서열번호 151의 CDRL1, 서열번호 152의 CDRL2 및 서열번호 153의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL; 또는 서열번호 157의 CDRL1, 서열번호 158의 CDRL2 및 서열번호 159의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL; 또는 서열번호 163의 CDRL1, 서열번호 164의 CDRL2 및 서열번호 165의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL; 또는 서열번호 169의 CDRL1, 서열번호 170의 CDRL2 및 서열번호 171의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL을 포함하는 항체와 경쟁하는, 사람화된 또는 CDR 절편이식된 결합 도메인을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, CLDN 계열의 적어도 하나의 단백질에 결합하고, 결합에 대해, VL 및 서열번호 154의 CDRH1, 서열번호 155의 CDRH2 및 서열번호 156의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDR(CDRH)을 갖는 VH; 또는 서열번호 160의 CDRH1, 서열번호 161의 CDRH2 및 서열번호 162의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH; 또는 서열번호 166의 CDRH1, 서열번호 167의 CDRH2 및 서열번호 168의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH; 또는 서열번호 172의 CDRH1, 서열번호 173의 CDRH2 및 서열번호 174의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH을 갖는 VH; 또는 서열번호 172의 CDRH1, 서열번호 176의 CDRH2 및 서열번호 174의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체와 경쟁하는, 사람화된 또는 CDR 절편이식된 결합 도메인을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, CLDN 계열의 적어도 하나의 단백질에 결합하고, 결합에 대해, 서열번호 151의 CDRL1, 서열번호 152의 CDRL2 및 서열번호 153의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL 및 서열번호 154의 CDRH1, 서열번호 155의 CDRH2 및 서열번호 156의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체; 또는 서열번호 157의 CDRL1, 서열번호 158의 CDRL2 및 서열번호 159의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL 및 서열번호 160의 CDRH1, 서열번호 161의 CDRH2 및 서열번호 162의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체; 또는 서열번호 163의 CDRL1, 서열번호 164의 CDRL2 및 서열번호 165의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL 및 서열번호 166의 CDRH1, 서열번호 167의 CDRH2 및 서열번호 168의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체; 또는 서열번호 169의 CDRL1, 서열번호 170의 CDRL2 및 서열번호 171의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL 및 서열번호 172의 CDRH1, 서열번호 173의 CDRH2 및 서열번호 174의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체; 또는 서열번호 169의 CDRL1, 서열번호 170의 CDRL2 및 서열번호 171의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는 VL 및 서열번호 172의 CDRH1, 서열번호 176의 CDRH2 및 서열번호 174의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 VH를 포함하는 항체와 경쟁하는, 사람화된 또는 CDR 절편이식된 결합 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 실시형태들에서, CAR 결합 도메인은 서열번호 69의 VL 및 서열번호 71의 VH를 포함하는 항체와 경쟁할 것이다. 다른 실시형태들에서, CAR 작제물은 서열번호 69의 VL 및 서열변호 71의 VH를 포함하는 결합 도메인을 포함할 것이다. 바람직하게, 상기 결합 도메인은 scFv를 포함할 것이다.
다른 특히 바람직한 실시형태들에서, CAR 결합 도메인은 서열번호 73의 VL 및 서열번호 87의 VH를 포함하는 항체와 경쟁할 것이다. 다른 실시형태들에서, CAR 작제물은 서열번호 73의 VL 및 서열번호 87의 VH를 포함하는 결합 도메인을 포함할 것이다. 바람직하게, 상기 결합 도메인은 scFv를 포함할 것이다. 소정의 바람직한 실시형태들에서, 각각의 상기 언급된 키메라 항원 수용체들은 사람화된 또는 CDR 절편이식된 결합 도메인을 포함한다.
개시되는 결합 도메인과 관련하여 사용되는 경우 용어 "경쟁한다" 또는 "경쟁 항체"는, 표준 항체(reference antibody) 또는 면역학적 기능성 단편이 공동(common) 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 실질적으로 (예를 들면, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과로) 방지하거나 억제하는, 검정에 의해 측정된 항체들 사이의 결합 경쟁을 의미한다. 이러한 경쟁을 측정하기에 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있는 기술, 예를 들면, 바이오-층 간섭법, 표면 플라스몬 공명, 유동 세포측정법, 경쟁적 ELISA 등을 포함한다.
소정 실시형태들에서, 본 발명은 본원에 개시되는 항-CLDN 결합 도메인들 중 임의의 하나의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 이와 관련하여, 이러한 예시의 사람화된 또는 CDR 절편이식된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 첨부된 도 3c 및 서열목록에 제시된다. 바람직한 실시형태들에서, 결합 도메인 또는 CAR을 암호화하는 핵산은 플라스미드 또는 벡터 내에 포함된다. 또 다른 실시형태들에서, 벡터는 바이러스 벡터를 포함할 것이다.
다른 실시형태들에서, 본 발명은 본원에 개시되는 항-CLDN CAR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 췌장암, 난소암, 결장직장암, 소세포 및 비-소세포 폐암 및 위암과 같은 암의 치료 방법을 제공한다.
몇몇의 실시형태들에서, 본 발명은, 본원에 개시되는 항-CLDN CAR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 대상체에게 적어도 1개의 추가의 치료학적 모이어티를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태들에서, 상기 숙주 세포는 감작화된 림프구를 포함할 것이다.
또한, 본 발명은 종양 세포 집단 내의 종양 개시 세포를 감소시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은, 종양 개시 세포 및 종양 개시 세포 이외의 종양 세포를 포함하는 종양 세포 집단을 항-CLDN CAR을 발현하는 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함하고; 이에 의해 종양 개시 세포의 출현빈도가 감소된다.
또 다른 바람직한 실시형태들에서, 본 발명은 또한 암과 같은 CLDN 관련 장애의 치료에 유용한 키트 또는 디바이스 및 관련된 방법도 제공한다. 이를 위해, 본 발명은 바람직하게는 예를 들면, 개시되는 CAR을 암호화하는 벡터(예를 들면, 바이러스 벡터)를 함유하는 리셉터클(receptacle) 및 CLDN 감작화된 림프구를 생성하기 위한 지침용 재료를 포함하는, CLDN 관련 장애를 치료하기 위한 CLDN 감작화된 림프구를 생성하는데 유용한 제조 물품을 제공한다. 선택된 실시형태들에서, 상기 키트는 상기 림프구를 효과적으로 형질도입하기 위한 추가의 시약 및 리셉터클을 포함할 것이다. 소정의 선택된 실시형태들에서, 상기 키트는 치료되는 환자로부터 수득된 자가 림프구를 형질도입하는데 사용될 것이다. 다른 선택된 실시형태들에서, 이러한 키트는, 상기 환자에게 직접 투여되어 원하는 면역 반응을 생성시킬 수 있는 동종이계(allogeneic) CLDN 감작화된 림프구를 포함한다.
상기는 요약이므로, 필요에 따라 세부사항의 단순화, 일반화 및 생략을 포함하고; 결론적으로, 당해 분야 숙련가들은 본 요약이 단지 예시적인 것이고 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도되는 것이 아님을 이해할 것이다. 본원에 기술된 방법, 조성물 및/또는 디바이스 및/또는 다른 대상물(subject matter)의 다른 양상, 특성 및 이점은 본원에 제시되는 교시에서 명백해질 것이다. 본 요약은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 추가로 기술되는 단순화된 형태의 다양한 개념들을 도입하기 위해 제공된다. 이러한 요약은 청구된 대상물의 주요 특성 또는 필수적인 기능을 확인하기 위한 것으로 의도되는 것은 아니고, 또한, 청구된 대상물의 범위를 결정하는데 보조로서 사용되는 것으로 의도되는 것도 아니다.
도 1은 선택된 환자-유도된 이종이식편(PDX) 종양에서 전체 전사체(SOLiD) 서열분석(sequencing)에 의해 측정된 CDLN4, CLDN6, 및 CLDN9의 상대적 mRNA 발현 수준을 보여주고, 여기서, 종양 유형은 하기 표 3에 열거된 약어에 따라 표시된다;
도 2a 내지 도 2c는 CLDN 계열 구성원들 사이의 관계를 도해하고, 여기서, 도 2a는 23개의 사람 CLDN 유전자들에 의해 암호화된 30개의 CLDN 단백질들 사이의 상대적인 유사성 정도를 보여주는 계통도(dendrogram)이고, 도 2b는 CLDN4, CLDN6 및 CLDN9의 세포외 도메인(ECD) 1 또는 ECD2에서의 아미노산 잔기의 동일성 백분율의 통계적 표시이고, 도 2c는 CLDN4, CLDN6 및 CLDN9의 사람, 래트, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이 오솔로그의 세트를 포함하는 16개 단백질들 사이의 ECD1 및 ECD2 루프에서의 아미노산 잔기의 동일성 백분율의 통계적 표시이다;
도 3a 내지 도 3c는 예시의 마우스 및 사람화된 항-CLDN 항체 및 hSC27.22, hSC27.108 및 hSC27.204의 변이체의 경쇄(도 3a) 및 중쇄(도 3b) 연속한 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 21 내지 서열번호 75, 홀수)을 표 형태로 제공하고, 한편, 도 3c는 이러한 예시의 마우스 및 사람화된 항-CLDN 항체의 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 핵산 서열(서열번호 20 내지 서열번호 74, 짝수)을 항체 hSC27.22, hSC27.108 및 hSC27.204와 함께 보여준다;
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 소정 결합 도메인의 교차 반응성을 입증하고, 여기서, 도 4a는 사람 CLDN4, CLDN6 및 CLDN9를 과발현하는 HEK-293T 세포에 결합하는 항-CLDN 결합 도메인 SC27.1 및 SC27.22의 능력을 보여주고, 도 4b는 CLDN4, CLDN6 및 CLDN9를 과발현하는 HEK-293T 세포에 결합하는 항-CLDN 항체의 능력을 보여주고, 도 4c는 목적하는 항원을 발현하는 세포의 고정된 수에 대한 항체의 양의 적정에 의해 측정시 CLDN6 및 CLDN9에 대한 예시의 항-CLDN 항체의 겉보기 결합 친화도를 도표로 설명한다;
도 5는 본원의 교시에 적합한 예시의 CLDN CAR 작제물의 도식적 표현을 제공한다;
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 2개의 신규한 키메라 항원 수용체 SCT1-SC27.108 및 SCT1-SC27.204v2의 핵산(도 6a 및 도 6c) 및 아미노산(도 6b 및 도 6d) 서열을 도시한다;
도 7은 CLDN 감작화된 림프구를 생산하기 위한 프로세스 및 CLDN 양성 종양 세포에 대해 지시되는 면역 반응을 생성하기 위한 이들의 후속적 사용을 도해하는 도식적 표현을 제공한다;
도 8a 및 도 8b는 각각 유동 세포측정법을 이용하여 측정된, 형질도입된 Jurkat 세포 상의 예시의 CLDN CAR의 발현(도 8a) 및 조작된 HEK-293T 대조군 세포 상의 hCLDN의 발현(도 8b)을 입증한다;
도 9a 및 도 9b는 예시의 CLDN CAR 세포의 활성을 측정하는데 사용되는 CLDN 발현 대조군 세포에 대한 CLDN CAR Jurkat 세포의 비(도 9a) 및 IL-2 생산에 의한 측정시 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 형질도입된 Jurkat 세포에서의 면역 반응의 유도(도 9b)를 도시한다;
도 10은 2명의 개체 유래의 사람 림프구를 본원의 교시에 따라 항-CLDN CAR(SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2)을 효과적으로 발현하도록 조작할 수 있음을 입증한다;
도 11a 및 도 11b는 유동 세포측정법에 의해 입증되는, CLDN6을 발현하도록 조작된 293T 세포주(도 11a) 및 난소암 환자 유도된 이종이식편("PDX") 세포주(도 11b)에 관한 CLDN 표면 발현 프로파일을 제공한다.;
도 12a 및 도 12b는 조작된 293T 세포(도 12a) 또는 PDX 종양 세포(도 12b)에 노출될 때에 (IFNγ의 유도에 의한 측정시) 면역 반응을 유발하는 2명의 개체 유래의 숙주 세포를 포함하는 CLDN 감작화된 림프구의 능력을 입증한다;
도 13a 및 도 13b는 조작된 293T 세포(도 13a) 또는 PDX 종양 세포(도 13b)에 노출될 때에 (TNFα의 유도에 의한 측정시) 면역 반응을 유발하는 2명의 개체 유래의 숙주 세포를 포함하는 CLDN 감작화된 림프구의 능력을 입증한다; 그리고
도 14a 및 도 14b는 노출시 조작된 293T 세포(도 14a) 또는 PDX 종양 세포(도 14b)를 제거하는 2명의 개체 유래의 숙주 세포를 포함하는 CLDN 감작화된 림프구의 능력을 보여준다.
본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있다. 본원에는 이의 원리를 예시하는 본 발명의 비제한적이고 예시적인 실시형태들이 개시되어 있다. 본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 조직적 목적만을 위한 것이고, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 개시의 목적을 위해, 모든 식별 서열 수탁 번호는 달리 나타내지 않는 한 NCBI 참조 서열(RefSeq) 데이터베이스 및/또는 NCBI GenBank® 문서보존 서열 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
입양 전이 면역치료요법의 최근 발전은 각종 신생물형성증의 치료를 위한 유망한 접근법 및 특히 고형 종양과 관련하여 환자의 경험을 향상시킬 기회를 제공하여 왔다. 이와 관련하여, 본 발명은, 적어도 하나의 클라우딘 계열 구성원("CLDN")과 회합하거나 반응하는 세포외 결합 또는 표적화 도메인을 포함하는 신규한 키메라 항원 수용체("CAR")의 사용에 관한 것이다. 바람직하게, CAR은 적어도 하나의 CLDN6, CLDN4 및/또는 CLDN9와 면역특이적으로 회합할 것이다. 본원에 광범위하게 논의될 것인 바와 같이, CLDN(예를 들면, CLDN6)은 다수의 상이한 암에 대해 발현되는 특히 효과적인 종양 마커이고, 중요하게도 암 줄기 세포와 관련된 것으로 발견되어 왔다. 따라서, 본 발명의 항-CLDN 결합 도메인이 림프구 상에 발현된 키메라 항원 수용체 내에 포함되는 경우, 얻어진 "CLDN 감작화된(sensitized) 림프구"(예를 들면, CLDN을 면역특이적으로 인식하는 자연 살해 세포 또는 T 세포)는 암 줄기 세포를 포함하는 비정상(aberrant) CLDN 양성 세포에 대해 지시된 면역 반응을 효과적으로 시작할 수 있다. 종양원성 "씨드(seed)" 세포를 효과적으로 제거하는 이러한 능력은 보통 종양 재발 또는 전이의 가능성을 감소시키는데 중요하다. 이를 위해, 본 발명의 항-CLDN CAR T 세포는 다른 치료학적 제제(항-CLDN 항체 약물 접합체 포함)와 병용하여 또는 표준 관리 치료(standard of care treatment) 후 유지 용법의 일부로서 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
보다 일반적으로, 키메라 항원 수용체는, 신호전달 도메인(예를 들면, T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인)에 링크된 항체의 항원 결합 도메인을 함유하거나 이를 포함하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단배질 또는 폴리펩타이드이다. CAR은, 모노클로날 항체의 항원-결합 특성을 활용하여, CLDN 양성 표적 세포에 대한 이러한 감작화된 림프구(예를 들면, T-세포) 특이성 및 반응성을 비-MHC-제한된 방식으로 재지시하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은, CAR을 발현하는 T-세포에 항원 프로세싱과 독립적인 CLDN을 인식하는 능력을 제공하고, 따라서, 종양 도피(tumor escape)의 주요 메커니즘이 우회된다. 또한, T-세포에서 발현되는 경우, CAR은 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화되지 않고, 이는 TCR 조작 기술을 적용하는 경우에 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 표적 세포 상의 CLDN과 면역특이적으로 회합하여 면역 반응을 자극하는 CLDN 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다. 바람직한 실시형태들에서, CAR의 CLDN 결합 도메인은 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 항체 가변 영역으로부터 유도된 scFv를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 "항-CLDN CAR" 또는 간략하게 "CLDN CAR"은 세포외 CLDN 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 포함할 것이다(도 5 참조). 전형적으로, 원하는 CLDN CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 합성되거나 조작되어 발현 벡터 또는 시스템(예를 들면, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 등)에 삽입될 것이다. 바람직한 실시형태들에서, 이어서, 환자 또는 공여자로부터 수득된 T-림프구 및 자연 살해 세포("NK 세포")를 포함하는 림프구를 선택된 CLDN CAR 벡터에 노출시켜(예를 들면, 형질도입하여) 세포외 CLDN 결합 도메인으로 CAR 단백질을 발현하는 조작된 림프구(즉, "CLDN 감작화된 림프구")를 제공한다. 다른 실시형태들에서, 개시된 CAR을 발현하도록 동종이계 세포를 조작하여 CLDN 감작화된 림프구를 제공할 수 있다. 선택적 확장 후, 이들 CLDN 감작화된 림프구를 환자에게 주입하여 CLDN 양성 종양 세포에 대한 면역특이적 반응을 개시할 수 있다(일반적으로 도 7 참조). 이와 관련하여, CLDN 감작화된 림프구는 CLDN 결정인자를 발현하는 표적 세포와 접촉시 활성화될 것이다. 감작화된 림프구(예를 들면, T 세포 및 NK 세포)를 활성화시키는 것은, 이들의 생물학적 상태의 변화에 의해 세포가 활성화 마커를 발현하고/하거나, 사이토카인을 생산하고/하거나, 증식하고/하거나, 표적 세포에 대해 세포독성이 되는 감작화된 림프구의 생물학적 상태의 변화를 유도하는 것을 의미한다. 이들 변화는 모두 1차 자극 신호, 바람직하게는 1차 신호의 크기를 증폭시키고 초기 자극 후 세포 사멸을 억제하는 공동-자극(co-stimulatory) 신호와 함께 생성되어, 보다 내구성인 활성화 상태 및 이에 따른 보다 높은 세포독성 용량을 초래할 수 있다.
CLDN 결합 도메인 이외에도 본 발명의 CAR은 1차 세포질 신호전달 서열(예를 들면, T-세포 수용체 복합체를 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하기 위한 서열)을 개시하는 세포내 또는 세포질 도메인을 포함할 것임이 추가로 이해될 것이다. 적합한 세포내 도메인은 예를 들면, CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유도될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태들에서, 본 발명의 CAR은 2차 또는 공동-자극 신호를 개시하는 세포내 도메인을 포함할 것이다. 적합한 공동-자극 도메인은 예를 들면, CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD28, CD134, CD137, ICOS, CD154, 4-1BB 및 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체로부터 유도된 세포내 도메인을 포함할 수 있다(U.S.P.N. US/2014/0242701 참조). 추가로, 바람직한 실시형태들에서, 개시된 CAR은 세포외 CLDN 결합 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 개재된(interposed) 막관통(및 선택적으로 스페이서(spacer)) 도메인을 포함할 것이다. 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 막관통 도메인은 예를 들면, 항체 불변 (Fc) 영역의 부분, 사람 CD8a 또는 당해 분야에 공지되어 있는 인공적으로 생산된 스페이서를 포함할 수 있다. 근본적으로, 세포막에 CAR을 앵커링하고(anchor) CLDN 결합 도메인의 효과적인 회합 및 세포내 도메인으로부터의 적절한 신호전달의 전송(transmission)을 가능하게 하는 임의의 아미노산 서열은 본 발명에 적합할 수 있다.
본 발명의 신규한 CLDN CAR에 관해서, 종양 표적으로서의 CLDN의 선택은 효과적인 면역 반응을 생성하는데 필수적임이 이해될 것이다. 보다 구체적으로, CLDN 표현형 결정인자들은 몇몇 유형의 암을 포함하는 각종 증식성 장애와 임상학적으로 관련되어 있다는 것, 그리고 CLDN 단백질 및 이의 변이체 또는 이소형(isoform)은 관련 질환의 치료에 활용될 수 있는 유용한 종양 마커를 제공한다는 것이 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명은 임의의 신호전달 구성성분에 추가하여 항-CLDN 결합 도메인을 포함하는 다수의 키메라 항원 수용체를 제공한다. 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 개시된 CLDN CAR은 종양원성 세포를 제거하는데 특히 효과적이므로, 소정의 증식성 장애 또는 이의 진행 또는 재발의 치료 및 예방에 유용하다.
또한, 본 출원에 제시되는 바와 같이, CLDN 마커 또는 결정인자, 예를 들면, 세포 표면 CLDN 단백질은 암 줄기 세포(종양 영속화 세포(tumor perpetuating cell)로서도 공지되어 있음)와 치료학적으로 관련되어 있고, 이를 제거하거나 침묵시키는데(silence) 효과적인 영향을 미칠 수 있음이 발견되었다. 본원에 개시된 CLDN CAR의 사용을 통해 암 줄기 세포를 선택적으로 감소시키거나 제거하는 능력은 이러한 세포가 일반적으로 다수의 종래 치료에 대해 내성인 것으로 공지되어 있다는 점에서 놀라운 것이다. 즉, 보다 최근의 표적화된 치료 방법뿐만 아니라 전통적 치료 방법의 유효성은 보통 다양한 치료 방법에도 불구하고 종양 성장을 영속화할 수 있는 내성 암 줄기 세포의 존재 및/또는 출현에 의해 제한된다. 또한, 암 줄기 세포와 관련된 결정인자는 낮거나 비일관적인(inconsistent) 발현, 종양원성 세포와 회합된 상태를 유지하는 것에 대한 실패, 또는 세포 표면에 존재하는 것에 대한 실패로 인하여 좋지 않은 치료학적 표적이 된다. 선행 기술의 교시와는 매우 대조적으로, 본 발명의 개시되는 CLDN CAR 및 관련된 방법은 이러한 암 줄기 세포의 분화를 특이적으로 제거하거나, 고갈시키거나, 침묵시키거나 또는 촉진시키는 내재적 내성을 효과적으로 극복하고, 이에 의해 근본적인 종양 성장을 지속하거나 유의하게 재-유도하는 이들의 능력을 무효화한다.
따라서, 본원에 개시된 것들과 같은 CLDN CAR이 선택된 증식성 (예를 들면, 신생물성) 장애 또는 이의 진행 또는 재발의 치료 및/또는 예방에 유리하게 사용될 수 있다는 것이 특히 주목할 만하다. 본 발명의 바람직한 실시형태는, 특히 예시적인 신호전달 또는 공동-자극 도메인 또는 영역의 관점에서 또는 선택된 특성 및 개시된 CLDN CAR과 이들의 상호작용을 포함하는 암 줄기 세포 또는 종양과 관련하여 하기에 광범위하게 논의될 것이지만, 당해 분야 숙련가들은 본 발명의 범위가 이러한 예시적 실시형태들에 의해 한정되지 않음을 이해할 것임이 이해될 것이다. 오히려, 본 발명의 가장 광범위한 실시형태들 및 첨부된 청구범위는 광범위하게 그리고 분명하게 적어도 하나의 클라우딘 계열 구성원과 면역 특이적으로 회합하거나 결합하는 결합 도메인을 포함하는 임의의 키메라 항원 수용체, 및 임의의 특정 작용 메커니즘, CAR 작제물 또는 특이적으로 표적화된 종양, 세포 또는 분자 구성성분에 관계없이 신생물 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 각종 CLDN 관련된 또는 매개된 장애의 치료 및/또는 예방에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시형태들에서, 본 발명의 CAR은 CLDN6에 면역특이적으로 결합하거나, CLDN6과 회힙할 것이다.
이를 위해 그리고 본 출원에서 입증되는 바와 같이, 개시된 CLDN CAR이 증식 성 또는 종양원성 세포를 표적화하여 제거하거나 그렇지 않으면 무능화시켜 CLDN 관련 장애(예를 들면, 신생물형성증)를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있음이 예상외로 발견되었다. 본원에서 사용되는 "CLDN 관련 장애"는 질환 또는 장애의 과정 또는 병인 동안의 CLDN 유전자 구성성분 또는 발현("CLDN 결정인자")의 표현형 이상에 의해 표시되거나, 진단되거나, 검출되거나 또는 확인되는 임의의 장애 또는 질환(증식성 장애 포함)을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 이와 관련하여, CLDN 표현형 이상 또는 결정인자는 예를 들면, CLDN 단백질 발현(예: CLDN6)의 상승된 수준 또는 저하된 수준, 소정의 정의가능한 세포 집단의 비정상적인 CLDN 단백질 발현 또는 세포 생명주기(lifecycle)의 부적절한 페이즈(phase) 또는 단계에서의 비정상적인 CLDN 단백질 발현을 포함할 수 있다. 물론, CLDN의 유전자형 결정인자(예를 들면, mRNA 전사 수준)의 유사한 발현 패턴도 또한 CLDN 장애를 분류하거나, 검출하거나 또는 치료하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
I. 클라우딘( CLDN ) 생리학
CLDN 표현형 결정인자들은 신생물형성증을 포함하는 각종 증식성 장애와 임상학적으로 관련되어 있다는 것, 그리고 CLDN 계열 단백질(CLDN6 포함) 및 이의 변이체 또는 이소형은 관련 질환의 치료에 활용될 수 있는 유용한 종양 마커를 제공한다는 것이 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명은 림프구에서 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 신호전달 도메인(들)과 작동가능하게 회합된 조작된 항-CLDN 결합제 또는 표적화제를 포함하는 다수의 CLDN CAR 작제물을 제공한다. 하기에 보다 상세하게 논의되고 첨부된 실시예에 제시되는 바와 같이, 개시된 항-CLDN CAR은 종양원성 세포를 제거하는데 특히 효과적이므로, 소정의 증식성 장애 또는 이의 진행 또는 재발의 치료 및 예방에 유용하다.
또한, CLDN 마커 또는 결정인자, 예를 들면, 세포 표면 CLDN 단백질(예를 들면, CLDN6)은 암 줄기 세포(종양 영속화 세포로서도 공지되어 있음)와 치료학적으로 관련되어 있고, 이를 제거하거나 침묵시키는데 효과적으로 활용될 수 있음이 발견되었다. 본원에 개시된 CLDN CAR의 사용을 통해 암 줄기 세포를 선택적으로 감소시키거나 제거하는 능력은 이러한 세포가 일반적으로 다수의 종래 치료에 대해 내성인 것으로 공지되어 있다는 점에서 놀라운 것이다. 즉, 보다 최근의 표적화된 치료 방법뿐만 아니라 전통적 치료 방법의 유효성은 보통 이들 다양한 치료 방법에도 불구하고 종양 성장을 영속화할 수 있는 내성 암 줄기 세포의 존재 및/또는 출현에 의해 제한된다. 또한, 암 줄기 세포와 관련된 결정인자는 낮거나 비일관적인 발현, 종양원성 세포와 회합된 상태를 유지하는 것에 대한 실패, 또는 세포 표면에 존재하는 것에 대한 실패로 인하여 좋지 않은 치료학적 표적이 된다. 선행 기술의 교시와는 매우 대조적으로, 본 발명의 개시되는 CAR 및 방법은 이러한 암 줄기 세포의 분화를 특이적으로 제거하거나, 고갈시키거나, 침묵시키거나 또는 촉진시키는 내재적 내성을 효과적으로 극복하고, 이에 의해 근본적인 종양 성장을 지속하거나 재-유도하는 이들의 능력을 무효화한다.
클라우딘은 상피 또는 내피 세포 시트(sheet)에서 발견되는 것들과 같은 분극화된 세포 유형에서 가장 선단의(apical) 세포-세포 부착 연접(junction)인 밀착 연접의 주요 구조적 단백질을 포함하는 내재 막 단백질이다. 밀착 연접은 세포주위에 연속적 밀봉(continuous seal)을 형성하여 세포간극(paracellular) 공간에서 용질과 물의 수송에 대한 물리적이지만 조정가능한 장벽(barrier)을 제공하는 망상구조(networked) 단백질의 가닥으로 이루어진다. 사람에서 클라우딘 계열의 단백질은 크기가 22 내지 34kDa 범위인 적어도 23개의 구성원들로 이루어진다. 모든 클라우딘은 단백질 말단 둘 다가 막의 세포내 면 상에 위치하는 테트라스패닌 토폴로지(tetraspanin topology)를 가져, 2개의 세포외(EC) 루프, EC1 및 EC2의 형성을 초래한다. EC 루프는 밀착 연접의 형성을 유도하는 헤드-투-헤드(head-to-head) 동종친화성 상호작용, 및 클라우딘의 소정 조합의 경우, 이종친화성 상호작용을 매개한다. 특정 클라우딘-클라우딘 상호작용 및 클라우딘 EC 서열이 이온 선택성 및 밀착 연접 강도의 주요 결정인자이다(예를 들면, 문헌[Nakano et al., 2009, PMID: 19696885]을 참조한다). 전형적으로, EC1은 약 50 내지 60개의 아미노산 크기이고, 이온 채널 형성에 참여하는 다수의 하전된 잔기, 및 보다 큰 W-X(17-22)-W-X(2)-C-X(8-10)-C 모티프 내의 보존된 디설파이드 결합을 함유한다(Turksen and Troy, 2004, PMID: 15159449). EC2는 EC1보다 작으며, 대략 25개 아미노산이다. 이의 나선 대 나선(helix-turn-helix) 입체구조(conformation)로 인해, 루프 둘 다에서의 돌연변이가 복합체 형성을 교란할 수 있지만, EC2가 대향 세포 막에서 클라우딘의 이량체 또는 다량체 형성에 기여하는 것으로 시사되었다. 시험관내 클라우딘-클라우딘 복합체는, 포함된 특정 클라우딘에 따라, 이량체 내지 육량체 크기의 범위일 수 있다(Krause et al., 2008, PMID: 18036336). 개별 클라우딘은 광범위한 조직 특이적 발현 패턴뿐만 아니라 PCR 분석에 측정되는 발달 조절된 발현(developmentally regulated expression)을 보여준다(Krause et al., 2008, PMID:18036336; Turksen, 2011, PMID:21526417).
서열 분석을 사용하여 클라우딘 계열 구성원에 대한 계통수를 작성할 수 있고, 이 계통수는 단백질 서열의 관계 및 관련의 정도를 나타낸다(도 2a). 예를 들면, CLDN6 및 CLDN9 단백질은 밀접한 관계가 있고, 이것은, 염색체 위치 16p3.3에서의 이들의 유전자의 인접한 헤드-투-헤드 위치를 고려하면, 조상의 유전자 중복(ancestral gene duplication)을 시사한다는 것을 알 수 있다. 이들 유사성은 이들 계열 구성원들이 이형 상호작용할 수 있는 능력으로 번역될 수 있다. 유사하게, CLDN3 및 CLDN4 단백질은 서열 분석에 밀접한 관련되어 있고, 이들의 유전자는 염색체 위치 7r11.23에서 나란히 발견될 수 있다. 소정 계열 구성원들 사이의 EC1 또는 EC2 루프에서의 높은 상동성(예를 들면, 도 2b)은 각종 클라우딘 계열 구성원들과 다중-반응성인 항체를 개발할 수 있는 기회를 제공하고, 한편, 다양한 종의 ECD 루프 1과 ECD 루프 2 사이의 실질적 상동성(도 2c)은 선택된 오솔로그에 결합하는 교차-반응성 항체의 발달을 가능하게 한다.
스쿨린(skullin)으로서도 공지되어 있는 CLDN6은 발달 조절된 클라우딘이다. 대표적인 CLDN6 단백질 오솔로그로는 사람(NP_067018), 침팬지(XP_523276), 레서스(rhesus) 원숭이(NP_001180762), 마우스(NP_061247) 및 래트(NP_001095834)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 사람에서, CLDN6 유전자는 염색체 위치 16p13.3에서 대략 3.5kBp에 이르는 2개의 엑손으로 이루어진다. CLDN6 유전자좌의 전사는 219개 아미노산 단백질(NP_061247)을 암호화하는 성숙 1.4kB mRNA 전사체(NM_021195)를 생산한다. CLDN6은 상피 운명에 전념하는 ES 세포 유도체에서(Turksen and Troy, 2001, PMID: 11668606), 주피(periderm)에서(Morita et al., 2002, PMID: 12060405), 그리고 표피의 초기저 수준에서(Turkson and Troy, 2002, PMID: 11923212) 발현된다. 이것은 또한 발달중인 마우스 신장에서도 발현되지만(Abuazza et al., 2006, PMID: 16774906), 성인 신장에서는 발현이 검출되지 않는다(Reyes et al., 2002, PMID: 12110008). 또한, CLDN6은 CLDN1 및 CLDN9와 함께, C형 간염 바이러스에 대한 공동수용체(coreceptor)이다(Zheng et al., 2007, PMID: 17804490).
CLDN9는 CLDN6에 가장 밀접하게 관련되어 있는 계열 구성원이다. 대표적인 CLDN9 단백질 오솔로그로는 사람(NP_066192), 침팬지(XP_003314989), 레서스 원숭이(NP_001180758), 마우스(NP_064689), 및 래트(NP_001011889)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 사람에서, CLDN9 유전자는 염색체 유전자좌 16p13.3에서 대략 2.1kBp에 이르는 단일 엑손으로 이루어진다. 인트론이 없는(intronless) CLDN9 유전자좌의 전사는 217개 아미노산 단백질(NP_0066192)을 암호화하는 2.1kB mRNA 전사체(NM_020982)를 생산한다. CLDN9는 내이(inner ear)(Kitarjiri et al., 2004, PMID:14698084; Nankano et al., 2009, PMID: 19696885), 각막(Ban et al., 2003, PMID:12742348), 간(Zheng et al., 2007, PMID:17804490) 및 발달중인 신장(Abuazza et al., 2006, PMID:16774906)의 다양한 구조에서 발현된다. 달팽이관에서의 이의 발현과 마찬가지로, 미스센스(missense) 돌연변이를 갖는 CLDN9 단백질을 발현하는 동물은 변경된 세포간극 K+ 투과성과 음향 탐지에 관여하는 모(hair) 세포의 탈분극에 중요한 이온 전류의 후속적 교란으로 인해 청력에 결함을 나타낸다. 내이의 세포에서의 CLDN9의 발현은 다른 클라우딘에 의해 형성된 보다 선단의 밀착-연접 가닥 아래의 서브도메인에 특이적으로 편재되고, 이는 정상 조직에서 모든 클라우딘이 가장 선단의 접근 가능한 밀착 연접에서 발견되는 것은 아님을 나타낸다(Nankano et al., 2009, PMID: 19696885). 달팽이관에서의 결과와는 대조적으로, 미스센스 CLDN9를 발현하는 마우스는 간 또는 신장 결함의 징후를 나타내지 않았다(Nankano et al., 2009, PMID: 19696885).
CLDN4는 또한 식중독 및 기타의 위장 질병에 관여하는 독소의 높은 친화력 결합으로 인해, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens ) 장독소 수용체로서도 공지되어 있다. 대표적인 CLDN4 단백질 오솔로그로는 사람(NP_001296), 침팬지(XP_519142), 레서스 원숭이(NP_001181493), 마우스(NP_034033), 및 래트(NP_001012022)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 사람에서, 인트론이 없는 CLDN4 유전자는 염색체 위치 17q11.23에서 대략 1.82kBp에 이른다. CLDN4 유전자좌의 전사는 209개 아미노산 단백질(NP_001296)을 암호화하는 1.82kB mRNA 전사체(NM_001305)를 생산한다. CLDN4가 위장 병원체에 의해 생산되는 독소에 결합하는 능력과 마찬가지로, CDLN4 발현은 GI관 전반에 걸쳐서 뿐만 아니라 전립선, 방광, 유방, 및 폐에서도 검출될 수 있다(Rahner et al., 2001, PMID:11159882; Tamagawa et al., 2003, PMID:12861044; Wang et al., 2003, PMID:12600828; Nichols et al., 2004, PMID:14983936).
클라우딘은 정상 조직의 기능 및 항상성에 중요하지만, 종양 세포는 비정상적인 밀착 연접 기능을 빈번하게 나타낸다. 이것은 종양 세포의 탈분화의 결과로서의 클라우딘의 조절되지 않는 발현 및/또는 편재화, 또는 급속하게 성장하는 암성 조직이 비정상적인 혈관신생(vascularization)을 갖는 종양 덩어리 내에서 영양분을 효과적으로 흡수하는 요건과 연계될 수 있다(Morin, 2005, PMID: 16266975). 개별 클라우딘 계열 구성원은 소정의 암 유형에서는 상향-조절될 수 있지만, 그 외에서는 하향-조절될 수 있다. 예를 들면, CLDN3 및 CLDN4 발현은 소정 췌장암, 유방암 및 난소암에서 상승되지만, 다른 유방(예를 들면, "클라우딘-저(low)") 암종에서는 보다 낮을 수 있다. 클라우딘은 엔도사이토시스(endocytosis)를 경험하고, 몇몇 클라우딘의 턴오버 시간은 다른 막 단백질에 비해 짧고(Van Itallie et al., 2004, PMID: 15366421), 클라우딘 발현은 암 세포에서 조절되지 않고, 종양 세포들 사이의 밀착 연접 구조가 암 세포에서 방해되는 것으로 알려져 있기 때문에, 클라우딘 단백질은 CAR에 대한 특히 양호한 표적일 수 있다. 이들 특성들은 활성화된 림프구가 정상 조직에서가 아니라 신생물성 조직에서 클라우딘 단백질과 결합하도록 하는 기회를 더 많이 제공할 수 있다. 개별 클라우딘에 대해 특이적인 결합 도메인이 유용할 수 있지만, 또한 다중반응성 클라우딘 CAR이 보다 넓은 환자 집단으로의 페이로드의 전달을 가능하게 하는 경향이 있을 수 있다. 구체적으로, 다중반응성 클라우딘 CAR은 보다 높은 응집체 항원 밀도로 인해 다중 클라우딘 단백질을 발현하는 세포의 보다 효율적인 표적화를 가능하게 하고, 임의의 개별 클라우딘의 낮은 수준의 항원 발현으로 종양 세포의 탈출 가능성을 감소시키고, 하기 발현 예에서 알 수 있는 바와 같이, 단일 CLDN CAR에 대한 치료학적 소견의 수를 확장시킬 수 있다.
II. 암 줄기 세포
상기에서 언급한 바와 같이, 놀랍게도 비정상 CLDN 발현(유전자형 및/또는 표현형)이 다양한 종양원성 세포 서브집단과 관련되어 있음이 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명은 이러한 세포(예를 들면, 암 줄기 세포)를 표적화하는데 특히 유용할 수 있는 CLDN CAR 매개된 치료학적 용법을 제공하고, 이에 의해 신생물성 장애의 치료, 관리 또는 예방이 가능해진다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 개시된 CLDN CAR은 본 발명의 교시에 따라 종양 개시 세포 출현빈도를 감소시키고 증식성 장애의 치료 또는 관리를 가능하게 하는데 유리하게 사용될 수 있다.
최근 모델에 따르면, 종양은 비-종양원성 세포와 종양원성 세포를 포함한다. 비-종양원성 세포는 자기-재생하는 능력을 갖지 않고, 면역손상된(immunocompromised) 마우스에 과도한 세포 수로 이식되는 경우라도 종양을 재생가능하게 형성할 수 없다. 종양의 세포 집단의 0.1 내지 40%(보다 전형적으로는 0.1 내지 10%)를 차지하는, 본원에서 "종양 개시 세포"(TIC)로서도 나타내는 종양원성 세포는 종양을 형성하는 능력을 갖는다. 종양원성 세포는 암 줄기 세포(CSC)로서 상호교환 가능하게 언급되는 종양 영속화 세포(TPC) 및 종양 전구 세포(TProg) 둘 다를 포함한다.
정상 조직에서 세포 분류계급을 지지는 정상 줄기 세포와 같은 CSC는 다중계통 분화에 관한 능력을 유지하면서 무한정으로 자기-복제할 수 있다. CSC는 종양원성 후손 및 비-종양원성 후손 둘 다를 생성할 수 있고, 일련의 단리 및 면역손상된 마우스에의 적은 수의 단리된 CSC의 이식에 의해 입증되는 바와 같이 모(parental) 종양의 이종성 세포 조성물을 완전하게 재현할 수 있다.
CSC와 같은 TProg는 초기 이식물에서 종양 성장을 자극할 수 있는 능력을 갖는다. 그러나, CSC와는 달리, 이들은 모 종양의 세포 이종성을 재현할 수 없고, TProg는 전형적으로 면역손상된 마우스에의 적은 수의 고도로 정제된 TProg의 일련의 이식에 의해 입증되는 바와 같이 제한 수의 세포 분할만을 할 수 있으므로 후속적 이식물에서의 종양원성을 재개시하는데 덜 효과적이다. TProg는 초기 TProg 및 후기 TProg로 더 나뉠 수 있고, 이는 표현형(예를 들면, 세포 표면 마커) 및 종양 세포 구조를 재현하는 이들의 상이한 능력에 의해 구별될 수 있다. 어느 것도 CSC와 동일한 정도로 종양을 재현할 수 없지만, 초기 TProg는 후기 TProg보다 더 큰 모 종양의 특징을 재현하는 능력을 갖는다. 상기 차이에도 불구하고, 몇몇의 TProg 집단은 드물게 CSC에 정상적으로 기여된 자기-재생 능력을 얻을 수 있고, 이들 자체가 CSC가 될 수 있다.
CSC는 보다 높은 종양원성을 나타내고 (i) TProg(초기 및 후기 TProg 둘 다); 및 (ii) 비-종양원성 세포, 예를 들면, 종양-침윤성 세포, 예를 들면, CSC로부터 유도될 수 있고 전형적으로 대부분의 종양을 포함하는 섬유아세포/기질(stroma), 내피 및 조혈 세포보다 상대적으로 더 잠잠하다. 종래 치료요법 및 용법은 대부분 종양을 체적감축시키고 신속하게 증식하는 세포를 공격하도록 고안되었음을 고려하면, CSC는 더 빠른 증식성 TProg 및 다른 벌크의 종양 세포 집단, 예를 들면, 비-종양원성 세포보다 종래 치료요법 및 용법에 더 내성이다. CSC가 종래 치료요법에 대해 상대적으로 화합물내성(chemoresistant)이 되도록 할 수 있는 다른 특징들은 다중-약물 내성 수송체의 증가된 발현, 향상된 DNA 수복 메커니즘 및 항-아폽토시스성 유전자 발현이다. CSC에서의 이들 특성은, 표준 화학 치료요법은 실제로 연속적 종양 성장 및 재발을 자극하는 CSC를 표적으로 하지 않으므로 진행된 병기의 신생물형성증을 지닌 대부분의 환자에 대해 장기 이점을 확보하기 위한 표준 종양 치료 용법의 실패에 대한 주요 원인을 구성한다.
놀랍게도 CLDN 발현은 각종 종양원성 세포 집단과 관련되어 있는 것으로 발견되었다. 본 발명은, 종양원성 세포를 표적화하는데 특히 유용할 수 있고 종양원성 세포를 침묵시키거나, 감작화하거나, 중화시키거나, 출현빈도를 감소시키거나, 차단하거나, 폐기하거나, 간섭하거나, 감소시키거나, 저해하거나, 저지하거나, 제어하거나, 고갈시키거나, 완화시키거나, 매개하거나, 저감시키거나, 재프로그래밍하거나, 제거하거나, 그렇지 않으면 억제하고(총체적으로 "억제하고"), 이에 의해 증식성 장애(예를 들면, 암)의 치료, 관리 및/또는 예방을 가능하게 하는, CLDN CAR을 제공한다. 유리하게, 본 발명의 신규한 CLDN CAR은, 이들이 CLDN 결정인자의 형태(예를 들면, 이소타입 a 또는 b)에 관계없이 대상체에게 투여시 바람직하게는 종양원성 세포의 출현빈도 또는 종양원성을 감소시키도록 선택될 수 있다. 종양원성 세포 출현빈도의 감소는 (i) 종양원성 세포의 억제 또는 근절; (ii) 종양원성 세포의 성장, 확대 또는 재발의 제어; (iii) 종양원성 세포의 개시, 번식, 유지, 또는 증식의 방해, 또는 (iv) 그렇지 않으면 종양원성 세포의 생존, 재생 및/또는 전이의 저해의 결과로서 발생할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 종양원성 세포의 억제는 하나 이상의 생리학적 경로에서의 변화의 결과로서 발생할 수 있다. 종양원성 세포의 억제, 이들의 잠재력의 변형에 의한(예를 들면, 유도된 분화 또는 니치 분열(niche disruption)에 의한) 또는 그렇지 않으면 종양 환경 또는 다른 세포에 영향을 미치는 종양원성 세포의 능력에의 간섭에 의한 경로에서의 변화는 종양 생성, 종양 유지 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 CLDN 관련 장애의 보다 효과적인 치료를 가능하게 한다.
종양원성 세포의 출현빈도의 감소를 평가하는데 사용될 수 있는 방법으로는 바람직하게는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석에 의한 세포측정 또는 면역조직화학적 분석(Dylla et al. 2008, PMID: PMC2413402 및 Hoey et al. 2009, PMID: 19664991)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
유동 세포측정법 및 면역조직화학은 또한 종양원성 세포 출현빈도를 측정하는데 사용할 수 있다. 상기 기술 둘 다는 당해 분야 인지되어 있는 세포 표면 단백질 또는 종양원성 세포를 농축시키는 것으로 공지되어 있는 마커에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용한다(WO 2012/031280 참조). 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 유동 세포측정법(예를 들면, 형광 활성화된 세포 분류(FACS))은 또한 종양원성 세포를 포함하는 각종 세포 집단을 특성확인하거나, 단리하거나, 정제하거나, 농축하거나, 또는 분류하는데 사용할 수 있다. 유동 세포측정법은, 초당 수천개 이하의 입자의 물리적 및/또는 화학적 특성들을 측정할 수 있는 전자 검출 디바이스를 통해, 세포의 혼합된 집단이 현탁되어 있는 체액의 스트림을 통과시킴으로써 종양원성 세포 수준을 측정한다. 면역조직화학은 종양원성 세포 마커에 결합하는 표지된 항체 또는 시약으로 조직 샘플을 염색시킴으로써 동일반응계내(예를 들면, 조직 절편에서의) 종양원성 세포의 가시화를 가능하게 한다는 점에서 추가의 정보를 제공한다.
CSC 집단과 관련되었고, 몇몇의 경우에 CSC를 단리하거나 특성확인하는데 사용되었던 마커들은 하기에 열거된다: ABCA1, ABCA3, ABCG2, ADCY9, ADORA2A, AFP, AXIN1, B7H3, BCL9, Bmi-1, BMP-4, C20orf52, C4.4A, 카르복시펩티다제 M, CAV1, CAV2, CD105, CD133, CD14, CD16, CD166, CD16a, CD16b, CD2, CD20, CD24, CD29, CD3, CD31, CD324, CD325, CD34, CD38, CD44, CD45, CD46, CD49b, CD49f, CD56, CD64, CD74, CD9, CD90, CEACAM6, CELSR1, CPD, CRIM1, CX3CL1, CXCR4, DAF, 데코린, easyh1, easyh2, EDG3, eed, EGFR, ENPP1, EPCAM, EPHA1, EPHA2, FLJ10052, FLVCR, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, GD2, GJA1, GLI1, GLI2, GPNMB, GPR54, GPRC5B, IL1R1, IL1RAP, JAM3, Lgr5, Lgr6, LRP3, LY6E, MCP, mf2, mllt3, MPZL1, MUC1, MUC16, MYC, N33, Nanog, NB84, 네스틴, NID2, NMA, NPC1, 온코스타틴 M, OCT4, OPN3, PCDH7, PCDHA10, PCDHB2, PPAP2C, PTPN3, PTS, RARRES1, SEMA4B, SLC19A2, SLC1A1, SLC39A1, SLC4A11, SLC6A14, SLC7A8, smarcA3, smarcD3, smarcE1, smarcA5, Sox1, STAT3, STEAP, TCF4, TEM8, TGFBR3, TMEPAI, TMPRSS4, 트랜스페린 수용체, TrkA, WNT10B, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, YY1 및 β-카테닌. 예를 들면, 문헌[Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 및 U.S.P.N. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 및 2011/0020221]을 참조한다.
유사하게, 소정 종양 유형의 CSC와 관련된 세포 표면 표현형의 비-제한적 예로는 CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD46hiCD324+CD66c+, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2β1 hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+ 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 CSC 표면 표현형이 포함된다. 예를 들면, 문헌[Schulenburg et al., 2010, 상기, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 및 U.S.P.N. 2008/0138313]을 참조한다. 본 발명과 관련하여 특히 흥미로운 것은 CD46hiCD324+ 표현형을 포함하는 CSC 조제이다.
마커 또는 마커 표현형에 적용되는 "양성", "저" 및 "음성" 발현 수준은 하기와 같이 정의된다. 음성 발현(즉, "-")을 갖는 세포는, 본원에 형광성 방출의 추가 채널의 목적하는 다른 단백질에 대해 표지된 완전 항체 염색 칵테일(cocktail)의 존재 하에 형광성 채널에서 이소타입 대조군 항체로 관찰된 발현의 95% 미만으로 또는 95%와 동일하게 발현하는 세포로서 정의된다. 당해 분야 숙련가들은 음성 사건을 정의하기 위한 이러한 절차를 "형광성 마이너스 1" 또는 "FMO" 염색으로서 나타냄을 이해할 것이다. 상기 기술된 FMO 염색 절차를 이용한 이소타입 대조군 항체로 관찰된 발현의 95%보다 더 큰 발현을 갖는 세포는 본원에 "양성"(즉, "+")으로서 정의된다. 본원에 정의되는 바와 같이, "양성"으로서 광범위하게 정의되는 각종 집단의 세포들이 존재한다. 세포는 항원의 평균 관찰된 발현이 상기 기술된 이소타입 대조군 항체로의 FMO 염색을 이용하여 측정시 95% 초과인 경우에 양성으로서 정의된다. 양성 세포는 평균 관찰된 발현이 FMO 염색에 의해 측정시 95% 초과이고 95%의 1 표준 편차 이내인 경우에 저 발현을 갖는 세포(즉, "lo")라고 칭할 수 있다. 대안으로, 양성 세포는 평균 관찰된 발현이 FMO 염색에 의해 측정시 95% 초과이고 95% 초과 1 표준 편차보다 더 큰 경우에 고 발현을 갖는 세포(즉, "hi")라고 칭할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 99%는 음성과 양성 FMO 염색 사이의 경계점으로서 바람직하게 사용될 수 있고, 특히 바람직한 실시형태들에서는 백분율이 99% 초과일 수 있다.
CD46hiCD324+ 마커 표현형 및 직전에 예시된 것들은 표준 유동 세포측정 분석 및 세포 분류 기술과 함께 추가의 분석을 위한 TIC 및/또는 TPC 세포 또는 세포 집단을 특성확인하거나, 단리하거나, 정제하거나, 또는 농축시키기 위해 사용할 수 있다.
따라서, 종양원성 세포의 출현빈도를 감소시키는 본 발명의 항체의 능력은 상기 기술되어 있는 기술 및 마커를 이용하여 측정할 수 있다. 몇몇의 예에서, CLDN CAR은 종양원성 세포의 출현빈도를 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 만큼 또는 심지어 35% 만큼 감소시킬 수 있다. 다른 실시형태들에서, 종양원성 세포의 출현빈도의 감소는 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%의 순서일 수 있다. 소정 실시형태들에서, 개시되어 있는 입양 면역치료요법은 종양원성 세포의 출현빈도를 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 심지어 95% 만큼 감소시킬 수 있다. 종양원성 세포의 출현빈도의 임의의 감소는 신생물형성증의 종양원성, 지속성, 재발 및 침해성(aggressiveness)의 상응하는 감소를 초래하는 경향이 있다.
III. 키메라 항원 수용체 치료요법
암 면역치료요법은 세포독성 림프구(T-림프구 및 NK 세포 둘 다를 포함함)의 활성을 통해 종양을 근절시키기 위해 사람 면역 시스템의 힘을 이용하는 것을 목표로 한다. 잔여 종양 세포의 근절을 유도할 수 있는 상기 세포독성 림프구-매개된 면역 반응은 각종 유형의 이식을 경험한 백혈병 환자에서의 재발률을 비교한 연구로부터 추론하였다: 동계 이식물을 받은 환자들에 비하여 HLA 동일 자매종(sibling)으로부터 동종이계 이식물의 비-T-세포 고갈된 골수를 받은 환자에 대해 재발률의 상당한 감소가 관찰되었고, 이러한 효과는 이식편-대-숙주 질환 반응을 넘어선 다른 T-세포 매개된 작용에 기여될 수 있다. 그러나, 항-종양 T-세포의 임상학적으로 유효한 입양 전이는 대부분의 종양 항원이 자기-항원(self-antigen)이므로 면역원성이 약하다는 사실에 의해 방해되어 왔다. 자기-항원을 인식하는 고-친화성 T-세포 수용체(TCR)를 갖는 T-세포의 음성 선택은 발달 동안 흉선에서 일어나고, 종양/자기-항원의 저-결합활성(avidity) 인식을 갖는 T-세포에 대한 중추성 면역 내성(central tolerance) 및 선택을 초래한다. 이어서, 이들 보다 낮은 결합활성 T-세포는 결과로 항-종양 T-세포 기능의 약한 활성화 및 제한된 지속성을 갖는다. 유전적으로 조작된 세포독성 림프구는 강력한 항-종양 T-세포 활성화에 대한 내성/저 결합활성 차단을 회피하기 위한 2개의 주요 접근법으로 전개되고 있다. 제1 접근법에서, 종양 항원을 인식하는 친화성-향상된 TCR을 분자 유전자 조작 기술을 이용하여 인공적으로 T-세포에 도입한다. 이러한 접근법은, 야생형 TCR 발현에 근접한 수준에서 친화도-향상된 TCR을 발현하는 것의 어려움, 추가의 세트의 TCR 유전자를 천연(native) T-세포에 도입할 때 발생하는 TCR 쇄의 페어링 오류(mispairing)에 대한 잠재성 및 MHC 분자를 하향-조절함으로써 MHC-제한된 TCR 인식을 회피하는 종양 세포의 능력을 포함하는 몇몇의 인자들에 의해 제한된다.
세포독성 림프구의 유전자 조작에 대한 제2 접근법은 각종 림프구 집단에의 인공적 비-MHC-제한된 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입이다. 이는 가장 전형적으로는 CAR 분자를 암호화하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터로의 형질도입 전에 생체 외에서 배양되고, 자극되고 그리고 확장된 벌크(bulk) 림프구 집단을 수확함으로써 달성된다. 본래의 TCR과 마찬가지로, CAR은, 표적 항원을 특이적으로 그리고 선택적으로 인식하고, 이어서, 이러한 항원에 결합시 적절한 신호를 림프구에 전달하여 이펙터(effector) 기능 및/또는 지속적인 항-종양 면역학적 반응에 필요한 사이토카인 생산을 자극하는 능력을 가져야만 한다. CAR-변형된 T-세포의 개념은, CD3ζ 쇄의 세포질 ITAM 도메인이 TCR:CD3 단백질 복합체와 독립적으로 발현될 때, 특히 CD3ζ ITAM 도메인이 이종성 세포외 및 막관통 도메인에 융합되었을 때 T-세포를 활성화시킬 수 있음이 관찰된 연구로부터 발생하였다. 제1 세대 CD4-CD3ζ CAR은 T-세포로 형질도입되어 HIV 환자에서 시험되었다. 후속 연구는 이들 조작된 CAR-T 세포가 주입 후 10년까지 지속되었고, 이는 조작된 세포의 증식 및 지속성의 지표임을 보여주었다. 후속적으로, 단일 재조합체 분자에서 scFv 도메인 및 막관통 도메인을 CD3ζ 쇄의 세포질 도메인과 결합시킴으로써 항-종양 CAR을 작제하였고, 이들 조작된 CAR-T 세포의 항원 인식은 scFv의 특이성을 반형하도록 재지시되었음이 밝혀질 수 있다(USPN 7,446,179). 이들 제1 세대 scFv-지시된 CAR-T 세포는 비-MHC 제한된 세포독성 림프구로서 작용하고, 프로세싱된 펩타이드보다는 천연 종양 항원을 인식하고, 천연 항원을 발현하는 종양 세포의 용해를 촉진할 수 있었다.
다수의 제1 세대 scFv-지시된 CAR-T 세포가 시험관내에서 예상되는 효과를 나타냈지만, 암 환자에서의 생체내 연구는 이들의 항-종양 효과의 결여 및 CAR-T 지속성의 결여로 인해 실망스러웠다. T-세포 생물학이 더 잘 이해됨에 따라, T-세포 집단은 짧은 수명의 이펙터 세포, 보다 긴-수명의 중추 및 말초 기억 T-세포, 및 다른 T-세포 서브집단과 상호작용하는 조절성 T-세포(Treg)로 구성된다는 것이 명백해졌다. 사이토카인 생산을 통해 휴면(resting) 나이브 또는 기억 T-세포의 지속적인 활성화의 유도시 공동자극성 신호의 역할은 이들 집단의 기능에 중심이 되고, 또한 공동-자극 역할은 공동-자극성 신호의 부재시에 잠재적으로 배타적인 TCR:CD3ζ 신호전달로부터 발생할 수 있는 T-세포 비-반응성 상태인 아네르기(anergy) 방지를 제공한다. 특히, CD28, OX40, CD27, CD137/4-1BB, CD2, CD3, CD11a/CD18, CD54 및 CD58과 같은 단백질 유래의 각종 공동-자극성 신호는 최적 수준의 사이토카인 생산, 증식 및 클론 확장 및 세포용해 활성의 유도에 유리할 수 있다. 이들 중에서도, CD28은 아마 가장 잘 이해되는 공동-자극성 신호일 것이고, CD28 공동-자극은 항원 활성화된 CAR-T 세포에 의해 사이토카인 방출을 증강시키는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, CD137/4-1BB를 통한 공동-자극성 신호전달은 본래 T-세포 증식을 향상시키는 것으로 밝혀졌고, 생체내 CAR-T의 보다 긴 지속성에 기여할 수 있다. 따라서, 소위 제2 세대 CAR 작제물이 고안되었고, 여기서, 이들 분자 유래의 각종 추가의 신호전달 도메인이 CD3ζ 도메인에 나란히 추가되었다(U.S.P.N. 5,686,281 및 8,399,645). 3개 이상의 신호전달 도메인(예를 들면, CD3ζ 및 2개의 공동-자극성 신호전달 도메인)을 포함하는 소위 제3 세대 CAR 분자도 보고되는 바에 의하면 개발 중이다.
CD19 항원에 대해 지시된 몇몇의 제2 세대 CAR-T 세포는 혈액학적 악성 종양을 지닌 환자에서의 강한 항종양 효과 및 실질적 지속성을 갖는 것으로 밝혀졌다. CAR-T 치료요법의 주요 경계는 고형 종양의 치료에의 적용이다. 본 발명과 관련하여, 놀랍게도 항-CLDN 결합 도메인이 상기 언급된 키메라 항원 수용체 및 입양 면역 치료요법의 각각과 유리하게 통합되어 이전의 제한사항 중 일부를 극복하는 효과적인 항신생물성 치료를 제공할 수 있음이 발견되었다.
IV. 키메라 항원 수용체
상기에 시사된 바와 같이, 본 발명의 CAR은 일반적으로 CLDN 결합 도메인, 막관통 도메인 및 소정의 림프구를 활성화시켜 CLDN 양성 종양 세포에 대해 지시된 면역 반응을 생성시키는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 보다 일반적으로, 개시된 키메라 항원 수용체는 숙주 세포벽에 의해 정의되는 엑토도메인 및 엔도도메인을 각각 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "엑토도메인" 또는 "세포외 도메인"은 세포 외부 또는 막성 지질 이중층의 외부의 CAR 폴리펩타이드의 부분을 나타낼 것이고, 이는 항원 인식(예를 들면, CLDN) 결합 도메인, 최적 힌지 영역, 및 물리적으로 막에 걸친 아미노산 잔기들의 외부에 임의의 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 역으로, 용어 "엔도도메인" 또는 "세포내 도메인"은 세포 내부 또는 막성 지질 이중층의 내부의 CAR 폴리펩타이드의 부분을 나타낼 것이고, 이는 물리적으로 막에 걸친 아미노산 잔기들의 내부에 임의의 스페이서 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
A. CLDN 결합 도메인
1. 결합 도메인 구조
본 개시 전반에 걸쳐 광범위하게 논의되는 바와 같이, 항-CLDN 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체는 다양한 증식성 장애에 대한 표적화된 치료요법을 제공하는데 유리하게 사용될 수 있다. 적합한 항-CLDN 결합 도메인은 항 -CLDN 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 소정 실시형태들에서, 온전한 항체 또는 fc 또는 불변 도메인의 적어도 몇몇 일부분을 포함하는 항체는 CLDN 결합 도메인을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제2015/0139943호를 참조한다). 특히 바람직한 실시형태들에서, 그리고 본원에 첨부된 실시예에서 입증되는 바와 같이, 항-CLDN 결합 도메인은 CLDN에 결합하는 모노클로날 항체(사람화된 또는 CDR 절편이식된 모노클로날 항체 포함)로부터 유도된 scFv를 포함할 수 있다. 본 발명과 일치하는 CLDN 결합 도메인을 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 항체는 바로 아래에 보다 상세하게 논의된다. 본 출원의 목적을 위해, 용어 "결합 도메인" 및 "항체" 또는 "항체 단편"은 문맥에 달리 나타내지 않는 한 상호교환적으로 사용될 수 있다.
허용된 명명법 및 번호매김 시스템을 포함하여, 항체 및 이의 변이체 및 유도체는, 예를 들면, 문헌[Abbas et al. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6th Ed.), W.B. Saunders Company; 또는 Murphey et al. (2011), Janeway's Immunobiology (8th Ed.), Garland Science]에 광범위하게 기술되어 있다.
"온전한 항체"는 전형적으로 공유결합적 디설파이드 결합 및 비-공유결합적 상호작용에 의해 함께 유지되는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 Y-형태의 사량체 단백질을 포함한다. 각각의 경쇄는 하나의 가변 도메인(VL)과 하나의 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH)과 불변 영역을 포함하고, 이는 IgG, IgA, 및 IgD 항체의 경우, CH1, CH2, 및 CH3으로 지칭되는 3개의 도메인을 포함한다(IgM 및 IgE는 제4 도메인, CH4를 갖는다). IgG, IgA, 및 IgD 부류에서, CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지 영역에 의해 분리되고, 상기 영역은 가변성 길이(각종 IgG 아부류(subclass)에서 일반적으로 약 10개 내지 약 60개의 아미노산)의 프롤린 및 시스테인 풍부 단편이다. 경쇄 및 중쇄 둘 다에서의 가변성 도메인은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 불변 도메인에 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개의 추가의 아미노산의 "D" 영역을 갖는다. 각 부류의 항체는 쌍을 이룬 시스테인 잔기에 의해 형성된 쇄간 및 쇄내 디설파이드 결합을 추가로 포함한다.
상기에 시사된 바와 같이 용어 "항체"는 일반적으로 이해되어야만 하고, 이로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 및 영장류화된 항체, CDR 절편이식된 항체, 사람 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 인트라바디, 다특이적 항체, 이특이적 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체, 뮤테인 및 이의 변이체를 포함하는 합성 항체, 면역특이적 항체 단편, 예를 들면, Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') 단편, 단일-쇄 단편(예를 들면, ScFv 및 ScFvFc); 및 Fc 융합 및 기타 변형을 포함하는 이들의 유도체, 및 CLDN 결정인자와의 우선적인 회합 또는 결합을 나타내는 한, 임의의 다른 면역반응성 면역글로불린 분자가 포함된다. 게다가, 문맥상 제약에 의해 달리 지시되지 않는 한, 상기 용어는 모든 부류의 항체(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 모든 아부류(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 및 이들의 모든 면역반응성 단편을 추가로 포함한다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 전형적으로 각각 상응하는 소문자 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시된다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)라고 칭하는 2개의 명확히 별개인 유형들 중 하나에 할당될 수 있다. 요컨대, 사람 CLDN에 결합하거나 사람 CLDN과 회합하는 임의의 이러한 항체는 본원의 교시에 적합하고, 개시된 키메라 항원 수용체를 위한 결합 도메인 구성성분으로서 사용될 수 있다.
항체의 가변 도메인은 항체마다 아미노산 조성의 상당한 차이를 보이고, 주로 항원 인식 및 결합에 관여한다. 각각의 경/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 IgG 항체가 2개의 결합 부위를 갖도록(즉, 이것은 2가이다) 항체 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 도메인은 골격 영역(FR)으로서 공지되어 있는 4개의 덜 가변성인 영역에 의해 프레이밍되고(framed) 분리되는, 초가변성 영역, 또는 보다 통상적으로는 상보성-결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 극단적 가변성 영역을 포함한다. VH와 VL 영역 사이의 비-공유결합적 회합은 항체의 2개의 항원-결합 부위 중 하나를 함유하는 Fv 단편("가변성 단편"에 대해)을 형성한다. 특히, 하기에 보다 광범위하게 논의되는 유전자 조작에 의해 수득될 수 있는 목적하는 ScFv 작제물(단일 쇄 가변성 단편에 대해)은 펩타이드 링커를 통해 (바람직하게는 동일한 항체로부터) VH 및 VL 영역을 연결시킨다. 원하는 입체구조에 의존하여, 펩타이드 링커는 각종 길이로 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 각각의 도메인, 프레임워크 영역 및 CDR에의 아미노산의 할당은 달리 나타내지 않는 한 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th 　Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650; 또는 Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co.]에 의해 제공된 번호매김 스킴(scheme) 또는 AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia) 중 하나에 따를 수 있다. Abysis 웹사이트 데이터베이스로부터 입수된 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 맥캘럼(MacCallum)(Contact로서도 공지되어 있음) 및 AbM 스킴에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 하기에 제시된다.
Figure pct00001
항체 서열에서 가변 영역 및 CDR은 당해 분야에서 개발된 일반적인 규칙(상기 제시된 바와 같음, 예를 들면, 카바트 번호매김 시스템)에 따라 또는 해당 서열을 공지의 가변 영역의 데이터베이스에 대해 정렬시킴으로써 확인할 수 있다. 이들 영역을 확인하는 방법은 문헌[Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 및 Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]에 기술되어 있다. 항체 서열의 예시적인 데이터베이스는 "Abysis" 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs(영국 런던 소재의 유니버시티 컬리지 런던 생화학 & 분자 생물학부의 A.C. Martin에 의해 유지됨) 및 문헌[Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)]에 기술된 바와 같은 VBASE2 웹사이트 www.vbase2.org에 기술되어 있고, 이를 통해 접근할 수 있다. 바람직하게는 서열은 카바트, IMGT 및 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터의 서열 데이터와 PDB로부터의 구조적 데이터를 통합한 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석한다. 문헌[Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 또한 웹사이트 bioinforg.uk/abs 상에서 이용가능함]을 참조한다. Abysis 데이터베이스 웹사이트는 본원의 교시에 따라 사용될 수 있는 CDR을 확인하기 위해 개발된 일반적인 규칙을 추가로 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 제시된 모든 CDR들은 카바트 등에 따른 Abysis 데이터베이스에 따라 유도된다.
본 발명에 논의된 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 관해, 번호매김은 보고된 바에 의하면 처음으로 사람 IgG1이 서열분석된 골수종 단백질 Eu의 아미노산 서열을 기술하는 문헌[Edelman et al., 1969, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85]에 처음으로 기술된 Eu 지수에 따른 것이다. 에델만(Edelman)의 Eu 지수는 카바트 등, 1991(상기)에 또한 제시되어 있다. 따라서, 중쇄의 맥락에서 용어 "카바트에 제시된 바와 같은 Eu 지수" 또는 "카바트의 Eu 지수" 또는 "Eu 지수"는 카바트 등, 1991(상기)에 제시된 에델만 등의 사람 IgG1 Eu 항체에 기초하는 잔기 번호매김 시스템을 말한다. 경쇄 불변 영역 아미노산 서열에 사용된 번호매김 시스템은 유사하게 카바트 등(상기)에 제시되어 있다. 본 발명에 적합한 예시적인 카파 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 바로 아래에 제시된다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1)
유사하게, 본 발명에 적합한 예시적인 IgG1 중쇄 불변 영역 아미노산 서열이 바로 아래에 제시된다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 2)
개시된 불변 영역 서열, 또는 이의 변이체 또는 유도체는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 작동가능하게 회합되어, 자체로 사용될 수 있거나 본 발명의 CLDN CAR에 (바람직하게는 막관통 도메인의 부분으로서) 포함될 수 있는 항체(전장 또는 부분적 fc 영역을 포함하는 면역반응성 단편)를 제공할 수 있다.
보다 일반적으로, 적합한 CAR의 항-CLDN 결합 도메인 구성성분은 적어도 하나의 CLDN 결정인자(예를 들면, CLDN4, CLDN6, CLDN9) 또는 이들의 몇몇의 조합을 특이적으로 인식하거나 이와 회합하는 임의의 항체로부터 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "결정인자" 또는 "표적"은 특정 세포, 세포 집단 또는 조직과 식별가능하게 회합되거나 이들에서 또는 이들 상에서 특이적으로 발견되는 임의의 검출가능한 특징, 성질, 마커 또는 인자를 의미한다. 결정인자 또는 표적은 성질상 형태적, 기능적 또는 생화학적일 수 있고 바람직하게는 표현형이다. 소정의 바람직한 실시형태들에서, 결정인자는 특정 세포 유형에 의해 또는 특정 조건 하의 세포(예를 들면, 세포 주기의 특정 시점 동안 또는 특정 적소에서의 세포)에 의해 상이하게 발현된(과발현 또는 저발현된(underexpressed)) 단백질이다. 본 발명의 목적을 위해, 결정인자는 바람직하게는 비정상 암 세포에서 상이하게 발현되고 CLDN 계열 구성원 단백질, 또는 이의 스플라이스 변이체, 이소형, 상동체 또는 계열 구성원 중 어느 것, 또는 특정 도메인, 이들의 영역 또는 에피토프를 포함할 수 있다. "항원", "면역원성 결정인자", "항원성 결정인자" 또는 "면역원"은 면역적격(immunocompetent) 동물에 도입될 때 면역 반응을 자극할 수 있고 면역 반응으로부터 생성된 항체에 의해 인식되는 임의의 단백질 또는 이의 임의의 단편, 영역 또는 도메인을 의미한다. 본원에서 고려되는 CLDN 결정인자의 존재 또는 부재는 세포, 세포 아집단 또는 조직(예를 들면, 종양, 종양원성 세포 또는 CSC)을 동정하는데 사용될 수 있다.
2. 항체 생성 및 생산
본 발명에 적합한 항체는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법을 이용하여 생산될 수 있고, 임의의 이러한 항체를 추가로 변형하여 본 발명의 항-CLDN 키메라 항원 수용체의 결합 도메인을 제공할 수 있다.
a. 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생성
다양한 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생산은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane (Eds.) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; and Harlow et al. (1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press]을 참조한다). 폴리클로날 항체를 생성하기 위해, 면역적격 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 비-사람 영장류 등)을 항원성 단백질 또는 항원성 단백질을 포함하는 세포 또는 제제로 면역접종한다. 일정 기간 후, 동물을 채혈하거나 희생시킴으로써 폴리클로날 항체-함유 혈청을 수득한다. 혈청은 동물로부터 입수된 형태로 사용할 수 있거나, 항체는 면역글로불린 분획 또는 단리된 항체 제제를 제공하도록 일부 또는 전부 정제될 수 있다.
임의의 형태의 항원, 또는 항원을 함유하는 세포 또는 제제를 사용하여, 결정인자에 대해 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 용어 "항원"은 광범위한 의미로 사용되며, 단일 에피토프, 다중 에피토프, 단일 또는 다중 도메인 또는 전체 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 선택된 표적의 임의의 면역원성 단편 또는 결정인자를 포함할 수 있다. 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들면, 이들의 표면 상에 항원의 적어도 일부를 발현하는 세포로 면역화됨), 또는 가용성 단백질(예를 들면, 단백질의 ECD 부분으로만 면역화함)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 상기 언급된 항원들 중의 임의의 것은 단독으로 사용되거나, 당해 분야에 공지되어 있는 하나 이상의 면역원성 증진 애쥬번트(adjuvant)와 조합하여 사용될 수 있다. 항원을 암호화하는 DNA는 게놈성이거나 비-게놈성(예를 들면, cDNA)일 수 있고, 면역원성 반응을 발휘하기에 충분한 ECD의 적어도 일부를 암호화할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스 벡터, 예를 들면, 양이온 지질을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아닌 임의의 벡터들을 항원이 발현되는 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있다.
b. 모노클로날 항체
선택된 실시형태들에서, 본 발명은 모노클로날 항체의 사용을 고려한다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 동종성인 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 말하고, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이(예를 들면, 천연 발생 돌연변이)를 제외하고는 동일하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 유전자전이 동물(예를 들면, XenoMouse®) 또는 이들의 몇몇의 조합을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시형태들에서 모노클로날 항체는 문헌[An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridoma 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 보다 상세하게 기술된 바와 같은 하이브리도마 및 생화학 및 유전자 조작 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 결정인자에 특이적으로 결합하는 다수의 모노클로날 항체의 생성 후, 특히 적합한 항체는 예를 들면, 결정인자에 대한 친화도 또는 내재화율에 기초하여, 각종 스크리닝 프로세스를 통해 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태들에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 모노클로날 항체는 "공급원" 항체로서 사용될 수 있고, 개시된 CAR과 회합될 수 있는 효과적인 CLDN 결합 도메인을 제공하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들면, 공급원 항체는 scFv 또는 기타 단편을 제공하고, 표적에 대한 친화도를 향상시키고, 세포 배양물에서의 이의 생산을 향상시기고, 생체내 면역원성을 감소시키고, 다특이적 작제물을 생성하도록 처리될 수 있다. 모노클로날 항체 생산 및 스크리닝에 대한 보다 상세한 설명은 하기에 그리고 첨부된 실시예에 제시된다.
c. 사람 항체
본 발명에 적합한 항체는 완전 사람 항체를 포함할 수 있다. 용어 "사람 항체"는 사람에 의해 생산되고/되거나 하기에 기술된 사람 항체의 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체(바람직하게는 모노클로날 항체)를 나타낸다.
한 실시형태에서, 재조합 사람 항체는 파지 디스플레이를 사용하여 제조된 재조합 조합적 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 한 실시형태에서, 라이브러리는 B-세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성된, scFv 파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리이다.
또한, 사람 항체는 사람 면역글로불린 유전자좌를 유전자이식 동물, 예를 들면, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되었고 사람 면역글로불린 유전자가 도입된 마우스에게 도입함으로써 제조할 수 있다. 챌린지(challenge)시, 유전자 재배열, 어셈블리 및 완전 사람 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 양상에서 사람에서 보여지는 것과 밀접하게 닮은 항체 생성이 관찰된다. 이러한 접근법은 예를 들면, U.S.P.N. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 XenoMouse® 기술에 관한 U.S.P.N. 6,075,181 및 6,150,584; 및 문헌[Lonberg and Huszar, 1995, PMID: 7494109]에 기술된다. 대안으로, 사람 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 사람 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 신생물성 장애를 앓고 있는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화되었을 수 있다). 예를 들면, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, PMID: 2051030; 및 U.S.P.N. 5,750,373]을 참조한다. 기타 모노클로날 항체에 관해서, 이러한 사람 항체를 공급원 항체로서 사용할 수 있다.
d. 항체 생산 및 조작
항체 및 이의 단편은 항체 생산성 세포로부터 수득된 유전적 물질 및 재조합 기술을 사용하여 생산되고 변형될 수 있다(예를 들면, 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.; 및 U.S.P.N. 7,709,611]을 참조한다).
하기에 보다 상세하게 논의될 것인 바와 같이, 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 CLDN 결합 도메인 및 CAR을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 익히 공지되어 있는 다른 기술을 포함하는 표준 기술에 의해 기타 세포 구성성분 또는 기타 오염물질, 예를 들면, 기타 세포성 핵산 또는 단백질로부터 분리되는 경우 "단리되거나" 또는 실질적으로 순수한 상태가 된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들면, DNA(예를 들면, 게놈성 DNA, cDNA), RNA 및 이들의 인공적 변이체(예를 들면, 펩타이드 핵산)일 수 있고, 단일-가닥이거나 이중-가닥인지에 관계없이 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득되고 조작될 수 있다. 하이브리도마(예를 들면, 하기 실시예에 제시되는 바와 같이 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. (예를 들면, 파지 디스플레이 기술을 사용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여 예를 들면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 바람직하게는 CLDN 특이적 scFv를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 다른 단백질, 예를 들면, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동적으로(operatively) 링크된다. 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "작동적으로 링크된" 또는 "작동가능하게 링크된"은 2개의 DNA 단편이 연결되어 상기 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임내에(in-frame) 유지됨을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는, VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 링크시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들면, 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991)(상기)]을 참조한다), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 예시의 IgG1 불변 영역은 서열번호 2에 제시된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 링크될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 링크시킴으로써 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들면, 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991) (상기)]을 참조한다), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다. 이러한 양상에서, 예시의 적합한 카파 경쇄 불변 영역은 서열번호 1에 제시된다.
본원에서는 본 발명의 폴리펩타이드들에 대해 "서열 동일성", "서열 유사성" 또는 "서열 상동성"을 나타내는 소정의 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 가변 영역)들이 고려된다. "상동성" 폴리펩타이드는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 다른 실시형태들에서, "상동성" 폴리펩타이드는 93%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 아미노산 서열들 사이의 상동성 백분율은 2개의 서열 사이의 동일성 백분율과 동등하다. 2개의 서열들 사이의 동일성 백분율은 2개의 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열들의 비교 및 2개의 서열들 사이의 동일성 백분율의 측정은 하기 비-제한적 실시예에 기술되는 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 백분율은 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 이용하여 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 통합된, 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988))]의 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 입수가능함)의 GAP 프로그램에 통합된, 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))]의 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
추가로 또는 대안으로, 본 발명의 단백질 서열은 추가로 "쿼리(query) 서열"로서 사용하여, 예를 들면, 관련 서열을 동정하기 위해 공공의 데이터베이스에 대한 서치(search)를 수행할 수 있다. 이러한 서치는 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 서치를 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3으로 수행하여 본 발명의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 포함된(gapped) 정렬을 수득하기 위해, 갭이 포함된 BLAST은 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭이 포함된 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라미터를 사용할 수 있다.
동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 또는 비-보존적 아미노산 치환만큼 차이가 있을 수 있다. "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은, 아미노산 잔기가 화학적 성질들(예를 들면, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질들을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열들이 보존적 치환만큼 서로 차이가 나는 경우에, 서열 동일성 백분율 또는 유사성의 정도를 상향 조정하여 치환의 보존적 성질을 보정할 수 있다. 비-보존적 아미노산으로의 치환이 존재하는 경우에, 바람직한 실시형태들에서, 서열 동일성을 나타나내는 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)의 원하는 기능 또는 활성을 보유할 것이다.
또한, 본원에서는 본 발명의 핵산들에 대해 "서열 동일성", "서열 유사성" 또는 "서열 상동성"을 나타내는 핵산들이 고려된다. "상동성 서열"은 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성을 나타내는 핵산 분자들의 서열을 의미한다. 다른 실시형태들에서, 핵산의 "상동성 서열"은 참조 핵산 세포(또는 CSC)에 대해 93%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
3. CLDN 결합 도메인으로서의 유도된 항체
일단 상기 기술된 바와 같이 공급원 항체가 생성되고, 선택되고, 단리되었으면, 이들은 본원의 교시에 적합한 항-CLDN CAR 결합 도메인 구성성분을 제공하도록 추가로 변경될 수 있다. 바람직하게, 공급원 항체는 공지의 분자 조작 기술을 이용하여 변형하거나 변경하여 원하는 치료학적 특성을 갖는 유도된 결합 도메인 구성성분을 제공한다.
a. 키메라 및 사람화된 항체
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 선택된 실시형태들은 본 개시의 목적을 위해 CLDN 결합 도메인에 대한 "공급원" 항체로 간주될 수 있는, CLDN에 면역특이적으로 결합하는 뮤린 모노클로날 항체를 포함한다. 선택된 실시형태들에서, 본 발명에 적합한 CLDN 결합 도메인은 이러한 공급원 항체로부터 공급원 항체의 불변 영역 및/또는 항원 결합 아미노산 서열의 임의적 변형을 통해 유도될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 항체는 공급원 항체에서의 선택된 아미노산이 결실, 돌연변이, 치환, 통합 또는 조합을 통해 변경되는 경우 공급원 항체로부터 유도된다. 다른 실시형태에서, "유도된" 항체는, 공급원 항체의 단편(예를 들면, 하나 이상의 CDR 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역)이 억셉터 결합 도메인 작제물과 조합되거나 이에 도입되어 유도 CLDN 결합 도메인(예를 들면, 키메라 또는 사람화된 결합 도메인)을 제공하는 항체이다. 이들 유도된 항체는 예를 들면, scFv를 제공하기 위해; 결정인자에 대한 친화도를 개선하기 위해; 항체 안정성을 향상시키기 위해, 발현을 개선시키기 위해; 생체내 면역원성을 감소시키기 위해; 독성을 감소시키기 위해; 또는 신호의 전송을 가능하게 하기 위해 하기 기술되는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 항체는 또한 화학적 수단 또는 번역-후 변형에 의한 성숙 분자의 변형(예를 들면, 글리코실화 패턴 또는 페길화)을 통해 공급원 항체로부터 유도될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 키메라 결합 영역은, 공유결합적으로 연결된 적어도 2개의 상이한 종 또는 부류의 항체들로부터의 단백질 분절들로부터 유도된다. 용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 유래의 항체 또는 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 한편, 쇄(들)의 나머지는 다른 종 유래의 항체 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체, 및 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(U.S.P.N. 4,816,567; Morrison et al., 1984, PMID: 6436822). 몇몇의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항체는 사람 경쇄 및 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부에 작동가능하게 링크된 선택된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 전부 또는 대부분을 포함할 수 있다. 다른 특히 바람직한 실시형태에서, CLDN 결합 도메인은 본원에 개시된 마우스 항체로부터 "유도될" 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 결합 도메인은 CDR(카바트, 초티아, 맥칼럼 등을 이용하여 정의됨)이 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 "CDR 절편이식"되고, 한편, 나머지 결합 영역은 다른 종 유래의 항체 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체로부터 유도된다. 사람에서 사용하기 위해, 하나 이상의 선택된 설치류 CDR들(예를 들면, 마우스 CDR들)을, 사람 항체의 천연 발생 CDR들 중 하나 이상을 대체하여 사람 억셉터 결합 도메인에(즉, 사람 프레임워크 영역으로) 절편이식할 수 있다. 이들 작제물은 일반적으로 효과적인 결합을 제공하는 한편 대상체에 의한 결합 도메인에 대한 원치 않는 면역 반응을 감소시키는 이점을 갖는다. 특히 바람직한 실시형태에서, CDR 절편이식된 결합 도메인은 사람 프레임워크 서열에 포함된 마우스로부터 얻어진 하나 이상의 CDR들을 포함할 것이다.
CDR-절편이식된 결합 도메인과 유사하게 "사람화된" 결합 도메인이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "사람화된" 결합 도메인은 하나 이상의 비-사람 항체(공여자 또는 공급원 항체)로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들면, CDR 서열)을 포함하는 사람 결합 도메인(일반적으로 사람 프레임워크 영역을 포함하는 억셉터 도메인)이다. 소정 실시형태들에서, 상기 사람화된 결합 도메인에 "역 돌연변이"를 도입할 수 있고, 여기서, 수용자 사람 결합 도메인의 가변 영역의 하나 이상의 FR 내의 잔기들이 비-사람 종 공여자 항체 유래의 상응하는 잔기에 의해 대체된다. 이러한 역 돌연변이는 절편이식된 CDR(들)의 적절한 3차원 입체배치(configuration)의 유지를 보조할 수 있고, 이에 의해 친화도 및 결합 도메인 안정성이 개선된다. 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-사람 영장류를 제한없이 포함하는 각종 공여자 종 유래의 항체를 사용할 수 있다. 추가로, 사람화된 항체 또는 단편은, 예를 들면, 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 새로운 잔기들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 적합하고 하기 실시예에 제시되는 공급원 뮤린 항체를 포함하는 CDR 절편이식된 및 사람화된 항체(및 관련 CLDN 결합 도메인)는 본원에 제시되는 당해 분야 기술을 이용하여 지나친 실험 없이 쉽게 제공할 수 있다.
각종 당해 분야 인지되어 있는 기술들을 추가로 이용하여 본 발명에 따른 사람화된 작제물을 제공하기 위한 억셉터 항체로서 사용할 사람 서열을 결정할 수 있다. 적합한 사람 생식선 서열 및 억셉터 서열로서의 이들의 적합성을 측정하는 방법의 편집물은 예를 들면, 각각 그 전문이 본원에 참조에 의해 포함되는 문헌들[Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638]에 개시되어 있다. 또한, 사람 면역글로불린 가변 영역 서열들의 종합 목록(Tomlinson, I. A. 등에 의해 자료수집. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)을 제공하는 V-BASE 디렉토리(VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005)를 이용하여 적합한 억셉터 서열을 동정할 수 있다. 추가로, 예를 들면, U.S.P.N. 제6,300,064호에 기술된 컨센서스 사람 프레임워크 서열도 적합한 억셉터 서열인 것으로 증명될 수 있고, 본 발명의 교시에 따라 사용할 수 있다. 일반적으로, 사람 프레임워크 억셉터 서열은 공급원 및 억셉터 항체의 CDR 정규 구조의 분석에 따른 뮤린 공급원 프레임워크 서열과의 상동성에 기초하여 선택된다. 이어서, 유도된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유도된 서열을 당해 분야 인지되어 있는 기술을 이용하여 합성할 수 있다.
CDR 절편이식된 및 사람화된 항체 및 관련 방법의 예는 문헌[U.S.P.N. 6,180,370 및 5,693,762]에 기술되어 있다. 추가의 상세설명을 위해서, 예를 들면, 문헌[Jones et al., 1986, PMID: 3713831; 및 U.S.P.N. 6,982,321 및 7,087,409]을 참조한다.
사람 억셉터 가변 영역에 대한 CDR 절편이식된 또는 사람화된 항체 가변 영역의 서열 동일성 또는 상동성은 본원에 논의된 바와 같이 측정할 수 있고, 이와 같이 측정하는 경우 바람직하게는 적어도 60% 또는 65%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 95%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 지닌 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성 정도는 상향 조정되어 치환의 보존적 특성에 대해 교정될 수 있다.
첨부된 도 3a 및 도 3b에 제공되는 주석이 달린 CDR 및 프레임워크 서열은 적절한 Absys 데이터베이스를 이용하여 카바트 등에 따라 정의됨이 이해될 것이다. 그러나, 본원에 논의되는 바와 같이 당해 분야 숙련가는 초티아 등 또는 맥칼럼 등 및 카바트 등에 의해 제공된 정의에 따라 CDR을 쉽게 동정할 수 있다. 이와 같이, 상기 언급된 시스템들 중 하나에 따라 유도된 하나 이상의 CDR들을 포함하는 항-CLDN 사람화된 항체는 명확히 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다.
b. 항체 단편, 유도체 또는 작제물
특히 바람직한 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 항체 단편, 유도체 또는 작제물을 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명을 실시하기 위해 선택되는 항체의 형태(예를 들면, 키메라, 사람화된 항체 등)와는 관계없이, 본원의 교시에 따라, 이의 면역반응성 단편들은 CLDN CAR의 일부로서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 광범위한 의미에서, "항체 단편"은 온전한 항체의 적어도 항원-결합 단편 또는 부분을 포함하고, 용어 "항원-결합 단편"은 CLDN의 면역원성 결정인자와 면역특이적으로 결합하거나 또는 반응하거나 특이적 항원 결합을 위해 단편이 유도된 온전한 항체와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 말한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "항체 작제물" 또는 "항체 유도체"는 항체 단편을 포함하는 임의의 분자 구조를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 바람직하게, 이러한 유도체 또는 작제물은 비-천연일 것이고, 항체의 면역반응성(또는 면역특이적) 특성을 유지하면서 이로운 분자 특성을 부여하도록 제조될 것이다.
예시의 적합한 항체 단편, 작제물 또는 유도체로는 가변 경쇄 단편(VL), 가변 중쇄 단편(VH), scFv, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성되거나 유도된 다특이적 항체가 포함된다. 다른 실시형태들에서, 본 발명의 CLDN 결합 도메인은 온전한 항체, scFv-Fc 작제물, 미니바디, 디아바디, scFv 작제물, Fab-scFv2 작제물, Fab-scFv 작제물 또는 펩티바디를 포함할 수 있다. 소정 양상들에서, CLDN 결합 도메인은 CAR의 막관통 및 세포내 도메인에 (예를 들면, 당해 분야에 인지되어 있는 유전자 조작 기술을 이용함으로써) 공유결합적으로 링크될 것이다. 다른 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 CAR의 막관통 및 세포내 도메인에 (예를 들면, U.S.P.N. 2015/0139943에 제시되는 결합 도메인의 Fc 부분을 통해) 비-공유결합적으로 링크될 수 있다. 각각의 형태의 결합 도메인 부착은 감작화된 림프구가 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 한 본 발명에 적합하다.
특히 바람직한 실시형태들에서, 그리고 첨부된 실시예에 나타내는 바와 같이, CLDN 결합 도메인은 scFv 작제물을 포함할 것이다. 사용되는 바와 같은 "단일 쇄 가변 단편(scFv)"은 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체로부터 유도된 단일 쇄 폴리펩타이드를 의미한다. scFv의 예로는 재조합 DNA 기술에 의해 형성되는 항체 폴리펩타이드 및 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편의 Fv 영역이 스페이서 서열을 통해 링크되는 항체 폴리펩타이드가 포함된다. scFv를 제조하기 위한 각종 방법이 공지되어 있고, 이로는 U.S.P.N. 4,694,778에 기술되어 있는 방법이 포함된다. 본 발명에 적합한 항-CLDN scFv 작제물은 본원에 첨부된 실시예에 보다 상세하게 기술된다.
다른 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 Fc 영역을 포함하는 것 및 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은 온전한 항체에 존재할 때에 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능 중 적어도 하나를 보유하는 것이다. 한 실시형태에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가의 항체이다. 예를 들면, 이러한 결합 도메인은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 Fc 서열에 링크된 면역반응성 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태들에서, Fc 영역은 당해 분야-인지되어 있는 기술을 사용하여 개시된 CAR 및 감작화된 림프구의 약동학 또는 약력학을 변형시켜 변형시킬 수 있다.
CLDN 결합 도메인이 Fc 부분을 포함하는 경우, 막관통 및 세포내 도메인과 작동가능하게 회합되는 세포외 Fc 수용체 또는 결합 분자("Fc 결합제")를 통해 CAR의 나머지 부분과 비-공유결합적으로 링크되거나 연결될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "Fc 결합제"는 항체의 Fc 부분(예를 들면, Fc 수용체)에 결합하거나 이와 회합하는 임의의 분자 또는 이의 부분을 의미하는 것으로 간주된다. 이러한 작제물(즉, Fc 결합제, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 "프로토(proto)-CAR")은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조되고, 본원에 기술된 선택된 림프구(자가 또는 동종이계)와 회합되어 "프라이밍된(primed) 림프구"를 생성할 수 있다. 적절한 시점에, 환자에의 도입 전에, 프라이밍된 림프구는 프로토-CAR과 CLDN 결합 도메인(들)의 회합을 가능하게 하는 조건 하에 적어도 Fc 부분을 포함하는 선택된 CLDN 결합 도메인(들)에 노출될 수 있다. 프로토-CAR과 결합 도메인의 비-공유결합적 회합은 본 발명의 CLDN 감작화된 림프구를 제공하고, 본원에 기술된 종양원성 세포 증식을 억제하는데 사용될 수 있다(일반적으로 본원에 그 전문이 포함되는 U.S.P.N. 2015/0139943을 참조한다).
프로토-CAR을 포함하는 이들 실시형태들에서, Fc 결합제는 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체 또는 Fc-엡실론 수용체와 같은 Fc 수용체를 포함할 수 있다. 소정의 선택된 실시형태들에서, Fc 수용체는 CD16의 리간드 결합 도메인(예를 들면, CD16A 또는 CD16B), CD32의 리간드 결합 도메인(예를 들면, CD32A 또는 CD32B) 또는 CD64의 리간드 결합 도메인(예를 들면, CD64A, CD64B 또는 CD64C)을 포함할 수 있다. 소정의 다른 실시형태들에서, Fc 결합제는 Fc 수용체가 아닐 것이다. 예를 들면, Fc 결합제는 프로토-CAR이 CLDN 결합 도메인과 회합하는 능력을 갖는 한 단백질 A 또는 단백질 G의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 실시형태들에서, Fc 결합제는 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 면역반응성 항체 또는 이의 단편 또는 작제물 또는 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태들에 관해서, Fc 결합제는 예를 들면, scFv, 나노바디 또는 미니바디를 포함할 수 있다. 유사하게, 이러한 실시형태들에 적합한 CLDN 결합 도메인은, Fc 결합제에 의해 결합될 수 있고 CLDN과 면역특이적으로 반응할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 몇몇의 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 온전한 CLDN 모노클로날 항체 또는 온전한 CLDN 모노클로날 항체들의 혼합물을 포함할 것이다. 다른 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 온전한 폴리클로날 CLDN 항체(바람직하게는 완전 사람)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태들에서, CLDN 결합 도메인은 scFv-Fc 작제물을 포함할 수 있다. 보다 일반적으로, 당해 분야 숙련가들은 본 발명의 개시의 교시에 기초하여 프로토-CAR 적합성 CLDN 결합 영역을 쉽게 동정할 수 있을 것이다.
또한, 당해 분야 숙련가들에 의해 쉽게 인지될 것인 바와 같이, 개시된 단편, 작제물 또는 유도체는 온전한 또는 완전 항체 또는 항체 쇄의 분자 조작에 의해 또는 화학적 또는 효소적 처리를 통해(예를 들면, 파파인 또는 펩신) 또는 재조합적 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편의 보다 상세한 설명을 위해 문헌[Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참조한다.
c. 생산-후 선택
수득된 방법에 관계없이, 항체-생산성 세포(예를 들면, 하이브리도마, 효모 콜로니 등)가 선택되고, 클로닝되고, 예를 들면, CLDN에 대한 높은 친화도를 포함하는 바람직한 특성들에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다. 하이브리도마는 세포 배양물의 시험관내에서 또는 동계(syngeneic) 면역손상된 동물의 생체내에서 확대될 수 있다. 하이브리도마 및/또는 콜로니를 선택하고, 클로닝하고, 확대시키는 방법은 당해 분야 숙련가들에게 익히 공지되어 있다. 일단 바람직한 항체가 식별되면, 관련 유전적 물질은 통상의 당해 분야-인지되어 있는 분자 생물학 및 생화학 기술을 이용하여 단리되고, 조작되고, 발현될 수 있다.
나이브 라이브러리에 의해 생성된 항체(천연 또는 합성 중 하나)는 중간 정도의 친화도(약 106 내지 107M-1의 Ka)일 수 있다. 친화도를 향상시키기 위해서, 친화성 성숙은 (예를 들면, 오류-경향성(error-prone) 폴리머라제를 이용하여 시험관내 무작위 돌연변이를 도입함으로써) 항체 라이브러리를 작제하고 (예를 들면, 파지 또는 효모 디스플레이를 이용함으로써) 이들 2차 라이브러리들로부터 항원에 대한 높은 친화도를 갖는 항체를 재선택함으로써 시험관내에서 모방될 수 있다. WO 9607754는 면역글로불린 경쇄의 CDR에 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위한 방법을 기술한다.
사람 조합적 항체 또는 scFv 단편의 라이브러리가 파지 또는 효모 상에서 합성되고, 라이브러리는 목적하는 항원 또는 이의 항체-결합부로 스크리닝하고, 항원에 결합하는 파지 또는 효모가 단리되며, 이로부터 당업자는 항체 또는 면역반응성 단편을 수득할 수 있는 파지 또는 효모 디스플레이(Vaughan et al., 1996, PMID: 9630891; Sheets et al., 1998, PMID: 9600934; Boder et al., 1997, PMID: 9181578; Pepper et al., 2008, PMID: 18336206)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 기술을 사용하여 항체를 선택할 수 있다. 파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약도 존재한다(U.S.P.N. 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 및 문헌[Barbas et al., 1991, PMID: 1896445]를 참조한다). 이러한 기술은 이롭게도 많은 수의 후보 항체를 스크리닝할 수 있게 하고, (예를 들면, 재조합 셔플링(shuffling)에 의해) 상대적으로 용이한 서열의 조작을 제공한다.
4. CLDN 결합 도메인의 특성
선택된 실시형태들에서, 항체-생산성 세포(예를 들면, 하이브리도마 또는 효모 콜로니)를 선택하고, 클로닝하고, 예를 들면, 강한 성장, 높은 항체 생산 및 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 원하는 결합 도메인 특성을 포함하는 바람직한 특성에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다. 다른 경우에, 항체의 특성은 동물의 접종을 위해 특정 항원(예를 들면, 특이적 CLDN 도메인) 또는 표적 항원의 면역반응성 단편을 선택함으로써 부여될 수 있다. 또 다른 실시형태들에서, 선택된 항체는 상기 기술된 바와 같이 조작하여 면역화학적 특성, 예를 들면, 친화도 또는 약동학적 단편을 향상시키거나 개선시킬 수 있다.
a. 결합 도메인 친화도
본원에는 특이적 결정인자, 예를 들면, CLDN6에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 개시된다. 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수 또는 겉보기 친화도를 말한다. 본 발명의 항체는 해리 상수 KD(koff/kon)가 10-7M 이하일 때 이의 표적 항원과 면역특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 KD가 5x10-9M 이하일 때 높은 친화도로, 그리고 KD가 5x10-10M 이하일 때 매우 높은 친화도로 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 항체는 10-9M 이하의 KD 및 약 1x10-4/초의 오프-속도(off-rate)를 갖는다. 본 발명의 한 실시형태에서, 오프-속도는 1x10-5/초 미만이다. 본 발명의 다른 실시형태들에서, 항체는 약 10-7M 내지 10-10M의 KD로 결정인자에 결합할 것이고, 또 다른 실시형태에서, 항체는 2x10-10M 이하의 KD로 결합할 것이다. 본 발명의 또 다른 선택된 실시형태는 10-6M 미만, 5x10-6M 미만, 10-7M 미만, 5x10-7M 미만, 10-8M 미만, 5x10-8M 미만, 10-9M 미만, 5x10-9M 미만, 10-10M 미만, 5x10-10M 미만, 10-11M 미만, 5x10-11M 미만, 10-12M 미만, 5x10-12M 미만, 10-13M 미만, 5x10-13M 미만, 10-14M 미만, 5x10-14M 미만, 10-15M 미만 또는 5x10-15M 미만의 KD(koff/kon)를 갖는 항체를 포함한다.
소정 실시형태에서, 결정인자, 예를 들면, CLDN에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 적어도 105M-1s-1, 적어도 2x105M-1s-1, 적어도 5x105M-1s-1, 적어도 106M-1s-1, 적어도 5x106M-1s-1, 적어도 107M-1s-1, 적어도 5x107M-1s-1 또는 적어도 108M-1s-1의 회합 속도 상수 또는 k on (또는 k a ) 속도 (항체 + 항원 (Ag)k on←항체-Ag)를 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 결정인자, 예를 들면, CLDN에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 10-1s-1 미만, 5x10-1s-1 미만, 10-2s-1 미만, 5x10-2s-1 미만, 10-3s-1 미만, 5x10-3s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5x10-4s-1 미만, 10-5s-1 미만, 5x10-5s-1 미만, 10-6s-1 미만, 5x10-6s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5x10-7s-1 미만, 10-8s-1 미만, 5x10-8s-1 미만, 10-9s-1 미만, 5x10-9s-1 미만 또는 10-10s-1 미만의 해리 속도 상수 또는 k off (또는 k d ) 속도 (항체 + 항원 (Ag)k off←항체-Ag)를 가질 수 있다.
결합 친화도는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 바이오-층 간섭측정법(bio-layer interferometry), 이중 편파 간섭측정법(dual polarization interferometry), 정적 광 산란법, 동적 광 산란법, 등온 적정 열량측정법, ELISA, 분석적 초원심분리, 및 유동 세포측정법을 이용하여 측정할 수 있다.
b. 빈닝(binning) 및 에피토프 맵핑(mapping)
본원에 사용되는 용어 "빈닝"은 이들의 항원 결합 특성 및 이들이 서로 경쟁하는지의 여부에 기초하여 항체를 "빈(bin)"들로 그룹핑하는데 사용되는 방법을 말한다. 빈의 초기 결정은 에피토프 맵핑 및 본원에 기술된 기타 기술에 의해 추가로 개선 및 확인될 수 있다. 그러나, 개별적 빈에 대한 항체의 경험적 할당은 개시된 항체의 치료학적 잠재력의 지표가 될 수 있는 정보를 제공한다는 것이 이해될 것이다.
보다 구체적으로는, 당업자는 당해 분야에 공지되어 있고 본원의 실시예에 제시되어 있는 방법을 사용함으로써, 선택된 참조 항체(또는 이의 단편)가 결합에 대해 2차 시험 항체(즉, 동일한 빈에 존재함)와 경쟁하는지를 측정할 수 있다. 한 실시형태에서, 참조 항체는 포화 조건 하에 CLDN 항원과 회합되고, 이어서, CLDN에 결합하는 2차 또는 시험 항체의 능력은 표준 면역화학적 기술들을 사용하여 측정된다. 시험 항체가 참조 항-CLDN 항체와 동시에 CLDN에 실질적으로 결합할 수 있는 경우, 2차 또는 시험 항체는 1차 또는 참조 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 CLDN에 실질적으로 동시에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 동일한 에피토프, 오버랩핑 에피토프, 또는 1차 항체에 의해 결합된 에피토프에 (적어도 입체구조적으로) 매우 가까운 에피토프에 결합한다. 즉, 시험 항체는 항원 결합을 위해 경쟁하고, 참조 항체와 동일한 빈에 존재한다.
용어 "경쟁하다" 또는 "경쟁 항체"는 개시된 항체의 맥락에서 사용될 때, 시험 항체 또는 시험되는 면역학적 기능성 단편이 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 측정되는 항체들 사이의 경쟁을 의미한다. 전형적으로, 이러한 검정은 비표지된 시험 항체 및 표지된 참조 항체 중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포들에 결합된 정제된 항원(예를 들면, CLDN 또는 이의 도메인 또는 단편)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포들에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 결정된다. 일반적으로, 시험 항체는 과량으로 존재하고/하거나 먼저 결합하게 된다. 경쟁적 결합을 측정하기 위한 방법에 관한 추가의 상세한 설명들은 본원의 실시예에 제공된다. 보통, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%만큼 억제할 것이다. 몇몇 예에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97%, 또는 그 이상만큼 억제된다.
역으로, 참조 항체가 결합될 때, 이는 후속적으로 첨가된 시험 항체(즉, 항-CLDN 항체)의 결합을 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%만큼 억제할 것이다. 몇몇 예에서, 시험 항체의 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97%, 또는 그 이상만큼 억제된다.
일반적으로, 빈닝 또는 경쟁적 결합은 각종 당해 분야에 인지되어 있는 기술들, 예를 들면, 면역검정, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 방사성 면역검정, 효소 링크된 면역흡착 검정(ELISA), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사계측 검정, 형광성 면역검정 및 단백질 A 면역검정을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 면역검정은 일상적이고 당해 분야에 익히 공지되어 있다(문헌[Ausubel et al, eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참조한다). 추가로, 교차-차단 검정을 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌[WO 2003/48731; 및 Harlow et al. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane]을 참조한다).
경쟁적 억제(및 이에 따른 "빈")를 측정하기 위해 사용되는 다른 기술로는 예를 들면, BIAcore™ 2000 시스템(GE Healthcare)을 이용한 표면 플라스몬 공명; 예를 들면, ForteBio® Octet RED(ForteBio)를 이용한 바이오-층 간섭측정법; 또는 예를 들면, FACSCanto II(BD Biosciences) 또는 멀티플렉스 LUMINEX™ 검출 검정(Luminex)을 이용한 유동 세포측정법이 포함된다.
Luminex는 대규모 멀티플렉스 항체 페어링(pairing)을 가능하게 하는 비드-기반 면역검정 플랫폼이다. 상기 검정은 표적 항원에 대한 항체 쌍들의 동시적 결합 패턴들을 비교한다. 쌍의 한 항체(포획 mAb)는 Luminex 비드에 결합되고, 여기서, 각각의 포획 mAb는 상이한 색의 비드에 결합된다. 다른 항체(검출 mAb)는 형광성 신호(예를 들면, 피코에리트린(PE))에 결합된다. 상기 검정은 항원에의 항체들의 동시적 결합(페어링)을 분석하고 유사한 페어링 프로파일을 갖는 항체들과 함께 그룹핑한다. 검출 mAb 및 포획 mAb의 유사한 프로파일은 2개의 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 한 실시형태에서, 페어링 프로파일은 피어슨(Pearson) 상관관계 계수를 이용하여 측정하여, 시험되는 항체의 패널 상의 임의의 특정 항체와 가장 밀접하게 상관관계를 갖는 항체를 동정할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 쌍의 피어슨 상관관계 계수가 적어도 0.9인 경우 시험/검출 mAb는 참조/포획 mAb와 동일한 빈 내에 존재하는 것으로 측정될 것이다. 다른 실시형태들에서, 피어슨 상관관계 계수는 적어도 0.8, 0.85, 0.87, 또는 0.89이다. 추가의 실시형태에서, 피어슨 상관관계 계수는 적어도 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 또는 1이다. Luminex 검정으로부터 얻어진 데이터를 분석하는 다른 방법은 U.S.P.N. 8,568,992에 기술되어 있다. 100개(또는 그 이상)의 상이한 유형의 비드들을 동시에 분석하는 Luminex의 능력은 거의 한정되지 않는 항원 및/또는 항체 표면 제공하고, 이는 바이오센서 검정에 비하여 항체 에피토프 프로파일링에 있어서 향상된 처리율(throughput) 및 해상도를 초래한다(Miller, et al., 2011, PMID: 21223970).
"표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의한 실시간 특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학적 현상을 말한다.
다른 실시형태들에서, 시험 항체가 결합에 대해 참조 항체와 "경쟁하는"지를 측정하는데 사용될 수 있는 기술은, 2개의 표면: 바이오센서 팁 상에 고정화된 단백질의 층, 및 내부 간섭층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학적 분석 기술인 "바이오-층 간섭측정법"이다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 임의의 변화는 실시간으로 측정될 수 있는 간섭 패턴에서의 시프트(shift)를 야기한다. 이러한 바이오층 간섭측정 검정은 ForteBio® Octet RED 기기를 이용하여 하기와 같이 수행할 수 있다. 참조 항체(Ab1)는 항-마우스 포획 칩 상에 포획되고, 이어서, 고농도의 비-결합 항체가 칩을 차단하는데 사용되고 기저선이 수집된다. 이어서, 단량체성 재조합 표적 단백질이 특이적 항체(Ab1)에 의해 포획되고, 팁은 대조군으로서의 동일한 항체(Ab1)를 갖는 웰에 또는 상이한 시험 항체(Ab2)를 갖는 웰에 침지된다. 대조군 Ab1과의 결합 수준의 비교에 의해 측정시 추가의 결합이 발생하지 않는 경우, 이어서, Ab1 및 Ab2는 "경쟁하는" 항체인 것으로 측정된다. Ab2와의 추가의 결합이 관찰되는 경우, 이어서, Ab1 및 Ab2는 서로 경쟁하지 않는 것으로 측정된다. 이러한 프로세스는 고유한 빈을 제시하는 96-웰 플레이트에서의 항체의 전체 열을 이용하여 고유한 항체의 대형 라이브러리를 스크리닝하도록 확대될 수 있다. 바람직한 실시형태들에서, 참조 항체가 공통 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%만큼 억제하는 경우 시험 항체는 참조 항체와 경쟁할 것이다. 다른 실시형태에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 또는 그 이상만큼 억제된다.
일단 경쟁 항체의 그룹을 포함하는 빈이 결정되었으면, 추가의 특성확인을 수행하여 빈 내의 항체가 결합하는 항원 상의 특정 도메인 또는 에피토프를 결정할 수 있다. 도메인-수준 에피토프 맵핑은 문헌[Cochran et al., 2004, PMID: 15099763]에 기술되어 있는 프로토콜의 변형을 이용하여 수행할 수 있다. 미세 에피토프 맵핑은, 항체가 결합하는 결정인자의 에피토프를 포함하는 항원 상의 특정 아미노산을 측정하는 프로세스이다. 용어 "에피토프"는 일반적인 생화학적 의미로 사용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 표적 항원의 부분을 말한다. 소정 실시형태에서, 에피토프 또는 면역원성 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹 또는 설포닐 그룹과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑을 포함하고, 소정 실시형태에서, 특정 3차원 구조적 특징들 및/또는 특정 전하 특징들을 가질 수 있다. 소정 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원과 특이적으로 결합한다고 한다.
항원이 CLDN과 같은 폴리펩타이드일 때, 에피토프는 일반적으로 연속성는(contiguous) 아미노산 및 단백질의 삼차 폴딩(folding)에 의해 병치된 비연속성 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다("입체구조적 에피토프"). 이러한 입체구조적 에피토프에서, 상호작용의 지점은 서로로부터 선형으로 분리된 단백질 상에 아미노산 잔기를 가로질러 일어난다. (때로는 "선형" 또는 "연속성" 에피토프라고도 하는) 연속성 아미노산으로부터 형성된 에피토프들은 전형적으로 단백질 변성시에 보유되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프들은 전형적으로 단백질 변성시에 손실된다. 항체 에피토프는 전형적으로 특별한 공간적인 구조 내에 적어도 3개, 및 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프 결정 방법 또는 "에피토프 맵핑"은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 본 발명의 개시와 함께 이용하여 개시되어 있는 항체에 의해 결합된 CLDN 상의 에피토프를 동정할 수 있다.
적합한 에피토프 맵핑 기술로는 알라닌 스캐닝 돌연변이체, 펩타이드 블롯(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), 또는 펩타이드 절단 분석이 포함된다. 또한, 에피토프 절개, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법을 사용할 수 있다(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). 다른 적합한 방법으로는 효모 디스플레이 방법이 포함된다. 다른 실시형태들에서, 항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)으로서도 공지되어 있는 변형-보조된 프로파일링(Modification-Assisted Profiling)(MAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각각의 항체의 결합 프로파일링의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 다수의 모노클로날 항체를 범주분류하는 방법을 제공한다(U.S.P.N. 2004/0101920). 이러한 기술은 특성확인이 유전학적으로 구별되는 항체에 집중될 수 있도록 유전학적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 한다. MAP가 본 발명의 CLDN 항체를 상이한 에피토프들을 결합시키는 항체의 그룹들로 분류하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들면, 본 발명에 기술되어 있는 기술을 이용하여 에피토프를 포함하는 펩타이드로 면역접종함으로써, 해당 에피토프에 항체를 생성시킬 수 있다. 대안으로, 발견 프로세스 동안, 항체의 생성 및 특성확인이 특정 도메인 또는 모티프 내에 위치된 바람직한 에피토프들에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대해 결합하기 위한 항체들을 경쟁적으로 선별할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체들을 발견하기 위한 경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁에 기초하여 항체를 빈닝(binning)하기 위한 고출력(high throughput) 프로세스는 제WO 03/48731호에 기술되어 있다. 효모 상의 항원 단편 발현 또는 항체 경쟁을 포함하는 에피토프 맵핑 또는 빈닝 또는 도메인 수준의 다른 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
B. 선택적 힌지 영역
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "힌지 영역"은, 플랭킹(flanking) 폴리펩타이드 영역에 구조적 가요성을 제공하는 CAR 엑토도메인 내에 포함될 수 있는 가요성 폴리펩타이드 커넥터(connector) 영역("힌지"로서도 언급됨)을 말한다. 힌지 영역은 천연 또는 합성 폴리펩타이드들로 이루어질 수 있다. 힌지 영역은 항원 인식 도메인에 의해 인식되는 항원의 부분과 관련하여 항원 인식 도메인의 최적 위치선정을 촉진시킴으로써 CAR의 기능을 향상시킬 수 있음이 당해 분야 숙련가들에게 이해될 것이다. 몇몇의 실시형태들에서, 힌지 영역은 최적의 CAR 활성에 요구되지 않을 수 있음이 이해될 것이다. 다른 실시형태들에서, 짧은 서열의 아미노산을 포함하는 이로운 힌지 영역은 항원 결합 도메인 또는 항체의 가요성을 촉진시킴으로써 CAR 활성을 증진시킨다. 힌지 영역을 암호화하는 서열은 항원 인식 모이어티(예를 들면, 항-CLDN scFv)와 막관통 도메인 사이에 위치될 수 있다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자로부터 유도되거나 수득된 임의의 모이어티 또는 서열일 수 있다. 한 실시형태에서, 예를 들면, 힌지 서열은 사람 CD8α 분자 또는 CD28 분자로부터 유도된다. 면역글로불린(예를 들면, IgG1)으로부터 유도된 "힌지 영역"은 일반적으로 사람 IgG1의 Glu216 내지 Pro230의 연신(stretching)으로서 정의된다. 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치에 중쇄간 디설파이드(S-S) 결합을 형성하는 처음 및 마지막 시스테인을 위치시킴으로써 IgG 서열과 정렬될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 힌지 영역은 천연 발생 또는 비-천연 발생일 수 있고, U.S. Pat. No. 5,677,425에 기술된 바와 같은 변경된 힌지 영역을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 물론, 소정 결합 도메인, 예를 들면, (Fab')2 또는 온전한 항체를 CAR에 사용하는 경우, 상응하는 힌지 영역이 포함될 것임은 자연스럽게 따라 올 것이다.
다른 선택된 실시형태들에서, 힌지 영역은 CH1 도메인의 것 유래의 상이한 부류 또는 아부류의 항체로부터 유도된 완전 힌지 영역을 포함할 수 있다. 용어 "힌지 영역"은 또한 사람 CD8α 분자 또는 CD28 분자 및 플랭킹 영역에 가요성을 제공하는데 유사한 기능을 제공하는 임의의 다른 수용체로부터 유도된 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산 길이, 예를 들면, 약 4 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa 내지 약 50 aa의 길이를 가질 수 있다. 적합한 힌지 영역은 쉽게 선택될 수 있고 다수의 적합한 길이들 중 어느 하나, 예를 들면, 1개 아미노산(예를 들면, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산(4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산 포함)으로 이루어질 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 아미노산일 수 있다.
당해 분야 숙련가들은 적합한 힌지 영역이 익히 공지되어 있고, 이와 같이 사용할 수 있는 실시형태들은 쉽게 선택될 수 있고 본 발명의 CLDN CAR에 포함될 수 있음을 이해할 것이다.
C. 막관통/스페이서 도메인
상기에 시사된 바와 같이, 본 발명의 CLDN CAR은 바람직하게는 세포외 CLDN 결합 도메인 및/또는 힌지 영역과 세포내 또는 세포질 신호전달 도메인 사이에 개재된 막관통 도메인을 포함한다. 본 발명의 논의의 목적을 위해, 용어 "막관통 도메인"은, 세포 막의 지질 이중층에 물리적으로 묻힌 아미노산 잔기를 항상 포함하지만 세포 막의 면을 넘어 연장할 수 있는 지지 또는 "스페이서 도메인"을 포함할 수 있음을 이해하면서 사용할 것이다. 당해 분야 숙련가들은 CAR 구성성분의 기능적 양상들 사이를 쉽게 구별할 수 있고, 본 개시의 관점에서 적합한 막관통 도메인을 구성하는 것을 쉽게 결정할 수 있다.
막관통 도메인은 천연 폴리펩타이드로부터 유도될 수 있거나, 인공적으로 고안될 수 있음이 이해될 것이다. 적합한 막관통 도메인은 필요에 따라 변형되거나 절단될 수 있는 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, T 세포 수용체 α 또는 β 쇄, IgG(예를 들면, IgG4)의 Fc 영역, CD3ζ 쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 GITR로부터 유도된 막관통 도메인은 개시된 CLDN CAR 작제물의 각종 실시형태들에 모두 적합하다. 소정 실시형태들에서, 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 물리적 회합을 유지하기 위해서, CD8ζ, FcRη, FcεR1-γ 및 -β, MB1(Igα), B29 또는 CD3-γ, ζ, 또는 ε의 막관통 도메인을 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 인공적 막관통 도메인은 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기의 높은 수준을 도입하는 각종 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태들에서, 막관통 도메인은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에 위치하는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항(triplet)을 포함할 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태들은 스페이서를 갖는 막관통 도메인을 포함할 것이다. 본 발명의 CLDN CAR에서, "스페이서 도메인" 또는 "스페이서 영역"은 세포외 기능성 도메인(예를 들면, 항원 결합 도메인 또는 포함되는 경우 힌지 영역)과 막관통 도메인 사이 또는 세포내 신호전달 도메인과 막관통 도메인 사이에 정렬될 수 있는 아미노산 서열이다. 스페이서 도메인은, 효율적인 CAR 기능을 위해 CAR 폴리펩타이드 내에 이들 요소를 최적으로 위치시킬 의도로, 막관통 도메인을 세포외 도메인에 링크하고/하거나 막관통 도메인을 세포내 도메인에 링크하도록 작용하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 스페이서 도메인은 300개 이하의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산, 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50개 아미노산을 포함한다. 스페이서 도메인은 바람직하게는 CLDN과 CLDN CAR의 결합을 촉진시키고 세포에의 막관통 신호전달을 향상시키는 서열을 갖는다. 상기 결합을 촉진시키는 것으로 예측되는 아미노산의 예로는 하전된 아미노산인 시스테인, 및 잠재적 글리코실화 부위에서의 세린 및 트레오닌이 포함되고, 이들 아미노산은 스페이서 도메인을 구성하는 아미노산으로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태들에서, 스페이서는 최적으로 이량체화될 수 있는 항체 불변 영역(예를 들면, IgG1 CH 또는 CL)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
다른 적합한 스페이서로는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당해 분야에 공지되어 있는 기타 가요성 스페이서가 포함된다. 글리신 및 글리신-세린 중합체를 사용할 수 있고; Gly 및 Ser 둘 다는 상대적으로 구조적이지 않고(unstructured), 따라서 구성성분들 사이의 중성 테더(tether)로서 작용할 수 있다. 글리신 중합체를 사용할 수 있고, 글리신은 심지어 알라닌보다 더 phi-psi 공간에 유의하게 접근하고, 보다 긴 쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다.
당해 분야 숙련가들은 적합한 막관통 도메인이 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 이와 같이 사용할 수 있는 실시형태들은 쉽게 선택할 수 있고 본 발명의 CLDN CAR에 도입될 수 있음을 이해할 것이다.
D. 세포내 신호전달 도메인
세포외 CLDN 결합 도메인 및 막관통 도메인에 추가하여, 본 발명의 CLDN CAR은 적어도 하나의 신호전달 및/또는 T 세포 활성화 모이어티를 포함하는 세포내 또는 세포질 도메인을 포함할 것이다. 본 발명에 사용된 세포내 신호전달 도메인은 동일한 분자 내에 존재하는(또는 비-공유결합적으로 회합된) 세포외 도메인이 CLDN에 결합하는(CLDN과 상호작용하는) 경우에 세포에 하나 이상의 신호를 전송할 수 있는 분자이다. CLDN의 결합은 CAR을 따라 통과하고 세포내로 전송되어 감작화된 림프구를 활성화시키는 신호를 유발한다. 이러한 림프구 활성화는 표적 세포의 제거를 초래하는 원하는 면역 반응을 유발한다.
T-림프구 활성화의 2개의 신호 이론은 T-세포를 효율적으로 활성화시키기 위해 2개의 신호가 요구됨을 제안한다: 첫째로, MHC 분자와 관련하여 제시되는 항원성 펩타이드는 TCR의 알파:베타 쇄 이종이량체와 상호작용하여, TCR 복합체의 단백질 구성성분에서 발견되는 세포질 도메인 유래의 신호를 활성화시키는 입체구조적 변화를 유도한다; 두번째로, 펩타이드:MHC 복합체를 제시하는 세포 상의 이들의 동족(cognate) 리간드와 상호작용함에 따른 단일 또는 몇몇의 공동자극성 분자의 세포질 도메인 유래의 신호의 전송. 보다 구체적으로, TCR 복합체를 통해서만 생성된 신호는 세포를 활성화시키는데 불충분할 수 있고, T-아네르기(anergy)로서 공지되어 있는 세포 불활성화 상태를 회피하기 위해 2차 또는 공동자극 신호 또한 요구될 수 있음이 공지되어 있다. 천연 T-세포 활성화는 2개의 상이한 종류의 세포질 신호전달 서열, 즉, TCR 복합체를 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하기 위한 서열(1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-독립적으로 작용하여 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위한 서열(2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 전송된다. 바람직한 양상에서, 본 발명의 CLDN CAR은 CAR 엔도도메인으로서 1차 세포질 신호전달 서열 및/또는 2차 세포질 신호전달 서열을 포함한다.
일반적으로, 면역 시스템 수용체의 세포질 도메인에서 발견되는 신호전달 모티프는 활성화 또는 억제성일 수 있다. 활성화를 자극하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로서 공지되어 있는 신호 변환(transduction) 모티프를 포함할 수 있다[Nature, vol. 338, pp. 383-384 (1989)]. 한편, 억제성 방법으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)로서 공지되어 있는 신호 변환 모티프를 포함한다. 본 발명에서, ITAM 또는 ITIM을 갖는 세포내 도메인을 사용할 수 있다.
천연 TCR 복합체 유래의 T-세포 활성화를 위한 제1 자극성 신호를 전송하는 1차 세포질 신호전달 서열은 CD3ζ 쇄에서 발견되는 ITAM이지만, 다른 ITAM를 사용하여 양성 1차 활성화 신호를 전송할 수 있음이 공지되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 ITAM을 갖는 세포내 도메인의 예로는 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3 δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유도된 ITAM을 갖는 세포내 도메인이 포함된다. 구체적으로, ITAM의 예로는 CD3ζ의 아미노산 번호 51 내지 164(NCBI RefSeq: NP-932170.1), FcεRIγ의 아미노산 번호 45 내지 86(NCBI RefSeq: NP-004097.1), FcεRIβ의 아미노산 번호 201 내지 244(NCBI RefSeq: NP-000130.1), CD3γ의 아미노산 번호 139 내지 182(NCBI RefSeq: NP-000064.1), CD3δ의 아미노산 번호 128 내지 171(NCBI RefSeq: NP-000723.1), CD3ε의 아미노산 번호 153 내지 207(NCBI RefSeq: NP-000724.1), CD5의 아미노산 번호 402 내지 495(NCBI RefSeq: NP-055022.2), 0022의 아미노산 번호 707 내지 847(NCBI RefSeq: NP-001762.2), CD79a의 아미노산 번호 166 내지 226(NCBI RefSeq: NP-001774.1), CD79b의 아미노산 번호 182 내지 229(NCBI RefSeq: NP-000617.1), 및 CD66d의 아미노산 번호 177 내지 252(NCBI RefSeq: NP-001806.2)의 서열을 갖는 펩타이드, 및 이들 펩타이드가 갖는 것과 동일한 기능을 갖는 이들의 변이체가 포함된다. 본원에 기술된 NCBI RefSeq ID 또는 GenBank의 아미노산 서열 정보에 기초한 아미노산 번호는 각각의 단백질의 전구체의 전장(신호 펩타이드 서열 등을 포함함)에 기초하여 번호매김된다.
2차 공동자극 신호는 각종 공동-자극 분자의 세포질 도메인으로부터 유래할 수 있고 가장 특징적인 것은 CD28이다. CD28은 T-세포 상에서 발현되고, CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 수용체이다. 그러나, 다른 공동자극 분자로는 CD27 분자, CD137/4-1BB 분자, CD134/OX40 분자, 및 당해 분야에 공지되어 있는 기타 세포내 신호전달 분자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. CD134/OX40은 아폽토시스(apoptosis)를 억제함으로써 T-세포 클로날 확장을 향상시키는 것으로 공지되어 있고, 기억 세포를 확립시키는 역할을 할 수 있다. CD137로서도 공지되어 있는 4-1BB는 T-세포에 잠재적 공동자극 신호를 전송시키고, 이는 T 림프구의 분화를 촉진시키고 장기 생존을 향상시킨다. 이들 공동자극 분자의 각각은 상이한 세포내 신호전달 경로를 활성화시키고 상이한 T-림프구 집단에서 상이한 효과를 가질 수 있기 때문에, T-세포 활성화 및 CAR의 다른 원하는 특성을 최대화하기 위해 CAR의 엔도도메인에 포함될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, CD28, CD27, 4-1BB 및 OX40 분자는 사람이다. 본 발명에 사용될 수 있는 2차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 세포내 도메인의 예로는 CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD28, CD134, CD137, ICOS, 및 CD154로부터 유도된 서열이 포함된다. 이들의 구체예로는 CD2의 아미노산 번호 236 내지 351(NCBI RefSeq: NP-001758.2), CD4의 아미노산 번호 421 내지 458(NCBI RefSeq: NP-000607.1), CD5의 아미노산 번호 402 내지 495(NCBI RefSeq: NP-055022.2), CD8α의 아미노산 번호 207 내지 235(NCBI RefSeq: NP-001759.3), CD83의 아미노산 번호 196 내지 210(GenBank: AAA35664.1), CD28의 아미노산 번호 181 내지 220(서열번호 25)(NCBI RefSeq: NP-006130.1), CD137의 아미노산 번호 214 내지 255(4-1BB, NCBI RefSeq: NP-001552.2), CD134의 아미노산 번호 241 내지 277(OX40, NCBI RefSeq: NP-003318.1), 및 ICOS의 아미노산 번호 166 내지 199(NCBI RefSeq: NP-036224.1)의 서열을 갖는 펩타이드, 및 이들 펩타이드가 갖는 것과 동일한 기능을 갖는 이들의 변이체가 포함된다.
개시된 핵산 서열에 의해 암호화되는 CLDN CAR의 신호전달/활성화 도메인(들)은 상기 언급된 신호전달 도메인들 중 임의의 하나 및 상기 언급된 세포간 T-t세포 활성화 도메인들 중 임의의 하나를 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열은 CD28 신호전달 도메인 및 CD28 및 CD3ζ의 세포내 T-세포 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 암호화할 수 있다. 대안으로, 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열은 CD8α 신호전달 도메인 및 CD28, CD3ζ, Fc 수용체 감마(FcRγ) 쇄 및/또는 4-1BB의 T-세포 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 암호화할 수 있다.
당해 분야 숙련가들은 상기 언급된 신호전달/자극 도메인의 각각은 본 발명에 적합하고 개시된 CLDN CAR과 (단독으로 또는 바람직하게는 조합하여) 효과적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 언급된 모이어티들의 각각은 임의의 조합 또는 입체배치로 세포내/세포질 도메인의 구성성분으로서 본 발명의 범위 내인 것으로 명확히 고려된다.
V. CAR 핵산 및 벡터
본 발명은 항-CLDN 키메라 항원 수용체를 암호화하는 단리된 또는 정제된 핵산 서열을 제공하고, 여기서, CAR은 바람직하게는 세포외 결합 도메인(예를 들면, scFv), 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들면, T-세포 활성화 모이어티)을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 의도되고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 이는 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의, 리보뉴클레오타이드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 중 어느 하나의 중합체 형태를 말한다. 이들 용어는 분자는 1차 구조를 말하고, 따라서, 이중- 및 단일-가닥의 DNA, 및 이중- 및 단일-가닥의 RNA를 포함한다. 상기 용어는 등가물로서, 예를 들면, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 메틸화된 및/또는 캡핑된 폴리뉴클레오타이드와 같은 변형된 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체를 포함한다.
"단리된"은 천연 환경으로부터의 핵산의 제거를 의미한다. "정제된"은 주어진 핵산이 자연으로부터 제거된 것(게놈성 DNA 및 mRNA 포함)이거나 실험실 조건 하에 합성(cDNA 포함) 및/또는 증폭된 것인지에 관계없이 순도가 증가되었음을 의미하고, 여기서 "순도"는 "절대 순도"가 아닌 상대적인 용어이다. 그러나, 핵산 및 단백질은 희석제 또는 애쥬번트와 함께 제형화되고, 또한 실행 목적을 위해 단리될 수 있음이 이해되어야만 한다. 예를 들면, 핵산은 세포에의 도입에 사용되는 경우 전형적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합한다.
본원에 기술되고 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 적합한 핵산 서열은 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열, 폴리펩타이드 및 단백질은 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001]을 참조한다). 또한, CLDN CAR을 암호화하는 합성으로 생산된 핵산 서열은 공급원, 예를 들면, CHO 세포, 식물, 박테리아, 곤충 또는 포유동물, 예를 들면, 래트, 사람 등으로부터 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 대안으로, 본원에 기술되는 핵산 서열은 상업적으로 합성될 수 있다. 이러한 양상에서, 본 발명의 핵산 서열은 합성이고/이거나, 재조합체이고/이거나, 단리되고/되거나, 정제될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 임의의 길이의 CLDN CAR을 암호화할 수 있고, 즉, CAR은 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있고, 단, 상기 CAR은 이의 생물학적 활성, 예를 들면, 항원에 특이적으로 결합하여 포유동물에서의 질환을 치료하거나 예방하는 능력 등을 유지한다. 예를 들면, 상기 CAR은 50개 이상, 60개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 또는 500개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 CAR은 약 50개 내지 약 700개 아미노산(예를 들면 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 150개, 약 200개, 약 300개, 약 400개, 약 550개, 또는 약 650개 아미노산), 약 100개 내지 약 500개 아미노산(예를 들면, 약 125개, 약 175개, 약 225개, 약 250개, 약 275개, 약 325개, 약 350개, 약 375개, 약 425개, 약 450개, 또는 약 475개 아미노산) 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이다.
본원에 기술된 CLDN CAR의 기능성 부분을 암호화하는 핵산 서열은 본 발명의 범위에 포함된다. CAR과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "기능성 부분"은 본 발명의 CAR의 임의의 부분 또는 단편을 말하고, 이 부분 또는 단편은 이의 부분인 CAR(모 CAR)의 생물학적 활성을 유지한다. 기능성 부분은 예를 들면, 표적 세포를 인식하거나 면역조정 신호를 제공하거나, 모 CAR과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 보다 높은 정도로 질환을 치료하는 능력을 유지하는 CAR의 이들 부분을 포함한다. 모 CLDN CAR을 암호화하는 핵산 서열과 관련하여, CAR의 기능성 부분을 암호화하는 핵산 서열은 모 CAR의 예를 들면, 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있다. 이와 관련하여, 적합한 핵산 서열은, 모 CAR의 아미노산 서열에서는 추가의 아미노산이 발견되지 않는 해당 부분의 아미노 또는 카복시 말단에 또는 양쪽 말단에 추가의 아미노산을 함유하는 CAR의 기능성 부분을 암호화할 수 있다. 바람직하게, 추가의 아미노산은 기능성 부분의 생물학적 기능을 간섭하지 않고, 예를 들면, 표적 세포를 인식하거나, 암을 검출하거나, 암을 치료하거나 예방하지 않는다. 보다 바람직하게, 추가의 아미노산은 모 CAR의 생물학적 활성에 비하여 CAR의 생물학적 활성을 향상시킨다.
본 발명은 또한 CLDN CAR의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "기능성 변이체"는 개시된 핵산 서열에 의해 암호화되는 CAR과 실질적으로 또는 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CAR, 폴리펩타이드 또는 단백질을 말하고, 이 기능성 변이체는 변이체인 CAR의 CLDN 결합능(binding capacity)을 유지한다. 기능성 변이체는 예를 들면, CLDN 양성 표적 세포를 모 CAR과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 보다 높은 정도로 인식하는 능력을 유지하는 본원에 기술된 CAR(모 CAR)의 이들 변이체를 포함한다. 모 CAR을 암호화하는 핵산 서열과 관련하여, CAR의 기능성 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 모 CAR을 암호화하는 핵산 서열과 약 10% 동일하거나, 약 25% 동일하거나, 약 30% 동일하거나, 약 50% 동일하거나, 약 65% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 또는 약 99% 동일할 수 있다.
CLDN CAR의 정확한 형태에 관계없이, 본 발명의 핵산은 선택된 숙주 세포(예를 들면, 림프구)의 생체외 형질전환에 사용되거나 생체내 유전자 치료요법을 위해 대상체에게 직접 도입될 수 있음이 이해될 것이다. 각각의 경우에, 개시된 핵산은 본원에 개시된 기타 부형제들에 추가하여, 세포에의 핵산의 전이(transference)를 촉진시키는 물질, 예를 들면, 리포솜 또는 양이온성 지질과 같은 핵산을 도입하기 위한 시약과 조합될 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 생체내 유전자 치료요법에 적합한 벡터와 조합되거나 벡터에 통합될 것이다.
따라서, 상기와 관련하여, 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 활성 성분으로서 사용될 수 있거나 감작화된 림프구를 생성시킬 수 있는 CLDN CAR 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 첨가제는 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 부형제의 예로는 포스페이트 완충된 염수(예를 들면, 0.01M 포스페이트, 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, pH 7.4), 염화수소, 브롬화수소, 포스페이트 또는 설페이트와 같은 무기산염을 함유하는 수용액, 글리콜 또는 에탄올 용액, 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트와 같은 유기산의 염이 포함된다. 습윤제 또는 유화제와 같은 애쥬번트, 및 pH 완충제도 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여, 예를 들면, 주사 또는 주입에 적합한 공지의 형태로 제형화될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 제형 첨가제, 예를 들면, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제, 및 보관 동안 유효 기간을 연장시키기 위한 방부제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 사용하기 전에 적절한 멸균 액체와의 재구성(reconstitution)을 위해 건조 형태로 존재할 수 있다.
CLDN CAR을 암호화하는 핵산 서열에 추가하여, 적합한 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 핵산 서열의 발현을 제공하는 발현 제어 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결인자, 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 등을 포함한다. 이와 관련하여, 각종 상이한 공급원 유래의 구성적, 유도가능하고 억제가능한 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 프로모터의 대표적 공급원으로는 예를 들면, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모 및 박테리아가 포함되고, 이들 공급원 유래의 적합한 프로모터는 쉽게 입수가능하거나, 예를 들면, ATCC 및 기타 상업적 또는 개별적 공급원과 같은 기탁기관으로부터의 공공의 이용가능한 서열에 기초하여 합성적으로 제조될 수 있다. 프로모터는 단일방향성(unidirectional)(즉, 한 방향으로 전사를 개시함) 또는 양방향성(즉, 3' 또는 5' 방향에서 전사를 개시함)일 수 있다. 프로모터의 비-제한적 예로는 예를 들면, T7 박테리아 발현 시스템, pBAD(araA) 박테리아 발현 시스템, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 및 RSV 프로모터가 포함된다. 유도가능한 프로모터로는 예를 들면, Tet 시스템, Ecdysone 유도가능한 시스템, T-REX™ 시스템(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) LACSWITCH™ 시스템(Stratagene, San Die해, Calif.), 및 Cre-ERT 타목시펜 유도가능한 재조합효소 시스템이 포함된다. 또한, CLDN CAR은 핵산의 발현을 확인하기 위한 마커일 수 있는 유전자(예를 들면, 약물 내성 유전자, 리포터 효소를 암호화하는 유전자, 또는 형광성 단백질을 암호화하는 유전자)와 회합될 수 있다.
소정의 실시형태들에서, CLDN CAR을 암호화하는 핵산은 임의의 제어 요소들과 함께, 바람직하게는 이어서, 선택된 세포에 도입되어 개시된 CLDN 감작화된 림프구를 제공할 수 있는 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시형태들에서, 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 트랜스포손(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 파지, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스)일 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(온코레트로바이러스(oncoretrovirus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 슈도 타입 벡터 포함), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAC) 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인-바아(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 벡터, 및 HSV 벡터를 사용할 수 있다.
보다 일반적으로, 용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는, 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들면, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해, 비히클에 의해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들면, CLDN CAR을 암호화하는 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입될 수 있는 비히클을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 조절 또는 제어 서열, 예를 들면, 세포의 유전자 기구(genetic machinery)에 의해 사용되는 개시, 정지, 프로모터, 신호, 분비 또는 기타 서열을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 본원에 사용되는 바와 같은 적합한 벡터는 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 플라스미드, 트랜스포손, 파지, 바이러스 등이 포함된다. 이어서, 벡터를 사용하여 선택된 림프구(자가 또는 동종이계)를 형질전환시켜 개시된 감작화된 림프구를 제공할 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 용어 "형질전환시키다" 또는 "형질전환"은 이의 가장 일반적인 범위로 사용될 것이고, 숙주 세포(원핵생물 또는 진핵생물)에의 이종성 유전자, DNA E또는 RNA의 도입을 의미하는 것으로 간주될 것이고, 따라서 숙주 세포는 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 암호화된 단백질 또는 효소를 생산하기 위해, 도입된 유전자 또는 서열을 발현할 것이다. 본 발명에 적합한 세포 형질전환의 예시적 방법은 형질감염 및 형질도입을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "형질감염"은 물리적 또는 화학적 수단을 이용한 세포(원핵생물 또는 진핵생물)에의 외래 핵산 또는 유전자의 도입을 의미하고, 한편, 용어 "형질도입"은 바이러스 벡터의 사용을 통한 세포(원핵생물 또는 진핵생물)에의 외래 핵산 또는 유전자의 도입을 의미한다.
형질도입의 관점에서, 파지 또는 바이러스 벡터는 바람직하게는 다수가 상업적으로 입수가능한 적합한 패키징(packaging) 세포에서의 감염성 입자의 성장 후에 숙주 세포에 도입될 수 있다. 적합한 형질도입 방법 및 패키징 세포는 하기 실시예에 제시되고, 본 개시의 관점에서 당해 분야 숙련가에게 쉽게 식별될 것이다.
예로서, 레트로바이러스 벡터가 사용되는 경우, 본원의 교시에 적합한 조성물은 LTR 서열 및 벡터가 갖는 패키징 신호 서열에 기초하여 적합한 패키징 세포를 선택하고 상기 패키징 세포를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조함으로써 생성될 수 있다. 패키징 세포의 예로는 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86 및 GP+envAm-12 및 Psi-Crip이 포함된다. 레트로바이러스 입자는 또한 높은 형질감염 효율을 갖는 293 세포 또는 293T 세포를 이용하여 제조될 수 있다. 레트로바이러스에 기초하여 생산된 많은 종류의 레트로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터의 패키징에 사용될 수 있는 패키징 세포는 다수의 회사로부터 널리 상업적으로 입수가능하다. 본원의 교시에 따라 적합한 렌티바이러스 벡터의 제조를 위해 유사한 시스템도 상업적으로 입수가능하다. 이러한 벡터는 선택된 림프구 집단을 형질도입시켜 원하는 CLDN 감작화된 림프구를 제공하는데 사용될 수 있다.
또한, 비-바이러스성 패키징 벡터 시스템도 문헌[WO 96/10038, WO 97/18185, WO 97/25329, WO 97/30170 및 WO 97/31934](본원에 인용에 의해 포함됨)에 기술된 바와 같은 리포솜 및 축합제, 예를 들면, 양이온성 지질과 함께 본 발명에서 사용될 수 있다.
유사하게, 다수의 형질감염 방법은 본 발명에 적합하고, 본원의 교시와 함께 사용하여 원하는 조성물을 제공할 수 있다. 논의된 바와 같이, 형질감염은 전형적으로 물리적 또는 화학적 방법의 이용에 의한 숙주 세포에의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 말한다. 다수의 형질감염 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 DNA 공동-침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포솜-매개된 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미립자 충격(bombardment); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동-침전이 포함된다. 추가로, 전기천공, 초음파천공(sonoporation), 천공감염(impalefection), 광학적 형질감염 및 유체 역학적 전달(hydro dynamic delivery)은 본 발명에 적합한 몇몇의 비-화학적 기반 유전자 형질감염 방법을 포함한다.
어떠한 방법이 형질전환을 유효화하기 위해 선택되는지에 관계없이, CLDN CAR 핵산 작제물 및 벡터는 개시된 감작화된 림프구를 생성하기 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
VI. 숙주 세포
CLDN CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는, 임의의 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함하는, CAR 단백질을 갖고/갖거나 발현할 수 있는 임의의 숙주 세포에 도입될 수 있다. 적합한 형질전환 방법은 트랜스포손 및 네이키드(naked) RNA와 함께 렌티바이러스 및 레트로바이러스 시스템의 사용을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 쉽게 그리고 확실하게 성장될 수 있고, 상당히 신속한 성장 속도를 갖고, 잘 특성확인된 발현 시스템을 갖고, 쉽게 그리고 효과적으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 것들이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 말한다. 숙주 세포는 진핵생물 세포(예를 들면, 식물, 동물, 진균 또는 조류(algae)), 원핵생물 세포(예를 들면, 박테리아 또는 원생동물) 또는 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 또는 "기성 제품(off-the-shelf)" 세포 또는 1차 세포(즉, 대상체로부터 직접 단리됨)일 수 있다. 숙주 세포는 부착성 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액 중에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, DH5α 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, 및 HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키거나 복제할 목적을 위해, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들면, DH5α 세포일 수 있다. 재조합체 CAR을 생산할 목적을 위해, 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 사람 세포이다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직으로부터 유래할 수 있고, 임의의 발단 단계의 것일 수 있다. 예를 들면, 체액, 조직 또는 기관, 예를 들면, 혈액(말초혈, 제대혈 등) 또는 곳루로부터 수집되거나, 단리되거나, 정제되거나, 또는 유도된 세포를 사용할 수 있다. 말초혈 단핵구(PBMC), 면역 세포[수지상 세포, B 세포, 조혈 줄기 세포, 대식세포, 단핵구, NK 세포 또는 조혈 세포(호중구, 호염구)], 제대혈 단핵구 세포, 섬유아세포, 전구체 지방세포, 간세포, 피부 각질세포, 간엽성 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 각종 암 세포 스트레인, 또는 신경 줄기 세포를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 실시형태들에서, 숙주 세포는 말초혈 림프구(PBL), 말초혈 단핵구 세포(PBMC) 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태들에서, 숙주 세포는 T-세포일 것이고, 선택된 실시형태들에서는 세포독성 T-세포일 것이다. 적합한 포유동물 숙주 세포를 선택하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 및 정제를 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명은 본원에 기술된 CLDN CAR을 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단리된 숙주 세포 및 이의 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 실시형태들에서, 숙주 세포는, 개시된 CAR의 발현시 CLDN 감작화된 림프구에 형질전환되는 림프구를 포함한다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 T-세포이다. 본 발명의 T-세포는 임의의 T-세포, 예를 들면, 배양된 T-세포(예를 들면, 1차 T-세포, 또는 배양된 T-세포주 유래의 T-세포, 또는 포유동물로부터 수득된 T-세포)일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T-세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직 또는 체액을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. T-세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. T-세포는 바람직하게는 사람 T-세포(예를 들면, 사람으로부터 단리됨)이다. T-세포는 CD4+/CD8+ 이중 양성 T-세포, CD4+ 헬퍼(helper) T-세포, 예를 들면, Th1 및 Th2 세포, CD8+ T-세포(예를 들면, 세포독성 T-세포), 종양 침윤성 세포, 기억 T-세포, 및 나이브 T-세포 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 임의의 발단 단계의 것일 수 있다. 한 실시형태에서, T-세포는 CD8+ T-세포 또는 CD4+ T-세포이다. T-세포주는 상업적 공급원(예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(the American Type Culture Collection) 및 저먼 컬렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)으로부터 입수가능하고, 예를 들면, Jurkat 세포(ATCC TIB-152), Sup-T1 세포(ATCC CRL-1942), RPMI 8402 세포(DSMZ ACC-290), Karpas 45 세포(DSMZ ACC-545), 및 이들의 유도체가 포함된다.
다른 실시형태에서, 숙주 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. NK 세포는 선천적 면역 시스템에서의 역할을 하는 한 유형의 세포독성 림프구이다. NK 세포는 대형 과립형 림프구로서 정의되고, B 및 T 림프구도 발생시키는 흔한 림프구 전구체로부터 분하된 제3 종류의 세포를 구성한다(예를 들면, 문헌[Immunobiology, 5th ed., Janeway et al., eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (2001)]을 참조한다). NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도 및 흉선에서 분화하고 성숙한다. 성숙 후, NK 세포는 독특한 세포독성 과립을 갖는 대형 림프구로서 순환계로 진입한다. NK 세포는 몇몇의 비정상 세포, 예를 들면, 몇몇의 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있고, 세포내 병원체에 대한 선천적 면역 방어에 중요한 것으로 생각된다. T-세포에 관해서 상기 기술된 바와 같이, NK 세포는 임의의 NK 세포, 예를 들면, 배양된 NK 세포, 예를 들면, 1차 NK 세포, 또는 배양된 NK 세포주 유래의 NK 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 NK 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, NK 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. NK 세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. NK 세포는 바람직하게는 사람 NK 세포(예를 들면, 사람으로부터 단리됨)이다. NK 세포주는 상업적 공급원(예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)으로부터 입수가능하고, 예를 들면, NK-92 세포(ATCC CRL-2407), NK92MI 세포(ATCC CRL-2408), 및 이들의 유도체가 포함된다.
자가 입양 면역치료요법에서, 환자의 순환성 림프구 또는 종양 침윤된 림프구는 (예를 들면, 분리반출법(apheresis)에 의해) 시험관내에서 단리되고, 바람직하게는 IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되거나 자극되고, 이어서, CLDN CAR 작제물을 암호화하는 핵산을 이용하여 형질도입된다. 형질도입 후, 자가 감작화된 림프구는 바람직하게는 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 사이토카인 지지체를 이용하여 증대되어 환자에게 재투여된다. 이를 달성하기 위해, 당업자는 동물에게, 또는 사람 환자에게, 본원에 기술된 바와 같은 CLDN CAR 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 활성화된 림프구의 면역학적 유효량을 투여할 것이다. 이러한 자가 절차에서, 활성화된 림프구(즉, CLDN 감작화된 림프구)는 가장 바람직하게는 이전에 혈액 또는 종양 샘플로부터 단리되어 시험관내에서 활성화되고 증대된 환자 자신의 세포이다. 본 발명의 몇몇의 양상에서, 암을 갖는 환자 유래의 T 림프구 또는 NK 세포는 단리되어 SCT-1h27.xx 폴리뉴클레오타이드(하기 실시예 9)를 이용하여 형질도입되어 CLDN CAR이 T 세포 또는 NK 세포의 세포 표면 상에 발현되도록 한다. 이어서, 변형된 세포는 환자에게 재투여되어 종양 세포를 표적화하여 사멸시킬 것이다(일반적으로 도 7을 참조한다).
본 발명의 다른 바람직한 양상들은 CLDN 감작화된 림프구의 동종이계 이식물을 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 개시된 CLDN CAR은 (예를 들면, 형질도입을 통해) 치료되는 대상체 이외의 공급원으로부터 수득된 림프구에 도입될 수 있다. 본 발명의 몇몇의 양상들은 거부 기회를 감소시키기 위해 수용자에 대해 면역학적으로 매칭된(immunologically matched) 공여자로부터 수득된 동종이계 림프구의 사용을 포함한다. 다른 양상들에서, 개시된 CAR은 이식을 가능하게 하고 표적 세포와 접촉시 적절한 면역 반응을 생성하도록 변형된 "기성 제품" 동종이계 림프구에 도입될 것이다(본원에 인용에 의해 포함되는 PMID: 26183927을 참조한다). 이러한 사전제조된 동종이계 림프구 조제(preparation)의 사용은 약제학적으로 활성인 감작화된 림프구를 조제하고 환자 거부 기회를 감소시키는 관점에서 몇몇의 이점을 제공할 수 있음이 이해될 것이다.
또한, CLDN 감작화된 림프구 세포는 CLDN CAR로의 형질전환 전에 또는 후에 시험관내에서 증대될 수 있음이 이해될 것이다. 선택된 세포 집단을 증대하기 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 본 발명에 적합한 몇몇의 상업적 키트가 이용가능하다. 이와 관련하여 T 세포 및 또는 NK 세포는 시험관내에서 증대되어 보다 강한 투약 옵션을 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르면, NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 I 및/또는 II 분자가 결여되어 있거나 이를 저조하게 발현하는 세포 및 막 결합된 IL-15 및 4-1BB 리간드(CDI37L)를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포에의 노출에 의해 우선적으로 증대될 수 있다. 이러한 세포주로는 K562(ATCC, CCL 243), 및 빌름스 종양 세포주 HFWT, 자궁 내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간모세포종 세포주 HuH-6, 폐 소세포 암종 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경모세포종 세포주 NB 19 및 N1369, 고환 유래의 배아 암종 세포주 NEC 14, 자궁 경부 암종 세포주 TCO-2, 및 골수-전이된 신경모세포종 세포주 TNB 1이 포함되지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 사용된 세포주, 예를 들면, K562 및HFWT 세포주는 MHC I 및 II 분자 둘 다가 결여되어 있거나 이들을 저조하게 발현한다. 유사한 기술은 선택된 T 세포 집단의 증대를 가능하게 한다. 이와 관련하여 몇몇의 프로세스들은 항-CD3 + 자가 또는 동종이계 피더(feeder) 세포 및 고용량의 IL-2를 사용한다. 다른 프로세스들은 T 세포의 증대 및 자극을 위해 IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합을 사용한다. 상기 언급된 프로세스들의 각각은 원하는 수의 CLDN 감작화된 림프구를 제공하는 임의의 프로세스와 함께 본 발명에 적합하다.
VII. CLDN 감작화된 림프구의 제형화 및 투여
본원에 제시되는 바와 같이, CLDN 감작화된 림프구는 자가 또는 동종이계 림프구를 포함하는 입양 세포 면역치료요법에 사용하기 위해 시험관내에서 증대될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직하게는 암의 치료, 및 예로서 소세포 폐암을 포함하는 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소암, 신경모세포종, 횡문근육종, 백혈병 및 림프종의 치료에 사용하기 위한 1차 및 공동자극 신호 둘 다를 전달하는 감작화된 림프구의 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물 및 방법은 다른 유형의 암 치료요법, 예를 들면, 화학 치료요법, 외과술, 방사선, 및 유전자 치료요법 등과 함께 사용할 수 있다.
CLDN 감작화된 림프구 또는 숙주 세포는 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 대상체에게 투여된다. 특히 바람직한 실시형태들에서, 개시된 약제학적 조성물은 CLDN CAR을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포(자가 또는 동종이계)의 집단을 포함할 것이다. 이러한 숙주 세포 이외에도, 본 발명의 약제학적 조성물은 다른 약제학적 활성제 또는 약물, 예를 들면, 화학치료학적 제제(예를 들면, 아스파라긴, 부설판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등), 또는 면역 반응을 추가로 자극하는 애쥬번트 치료요법을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 개시된 CLDN CAR을 발현하는 단리된 T 세포 또는 NK 세포, 및 보다 바람직하게는 개시된 CLDN CAR을 발현하는 감작화된 T 세포 또는 NK 세포의 집단을 포함한다. 또한, 이러한 조성물은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 완충제, 보존제, 부형제 등을 포함할 수 있다.
대안으로, CLDN CAR을 암호화하는 핵산 서열 또는 CLDN CAR-암호화 핵산 서열을 포함하는 벡터를 약제학적 조성물로 제형화하여 림프구에 생체외 형질도입시키는데 사용하거나 환자에게 직접 투여할 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 바이러스 벡터 숙주 세포를 포함하는 벡터 시스템(예를 들면, 렌티바이러스 시스템 또는 레트로바이러스 시스템) 또는 명시된 인공 바이러스 외피(envelope)가 바람직하다. 이러한 벡터는 CLDN 감작화된 림프구의 생체내 생성을 가능하게 하고, 이는 이어서 원하는 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있다.
임의의 경우에, 본 발명의 CLDN CAR 숙주 세포 및 임의의 공동-시약은 당해 분야 인지되어 있는 기술을 이용한 각종 방식으로 제형화될 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 순수하게 또는 최소량의 추가의 구성성분들과 함께 투여될 수 있고, 한편, 다른 것들은 선택적으로 적합한 약제학적으로 허용되는 담체들을 함유하도록 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 부형제, 비히클, 애쥬번트 및 희석제를 포함하고, 약제학적 조제에 사용하기 위한 상업적 공급원으로부터 입수가능할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gennaro (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed., Mack Publishing; Ansel et al. (2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins; Kibbe et al.(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press.]을 참조한다).
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 전형적으로, 비교적 불활성이고 감작화된 림프구 또는 숙주 세포의 투여를 용이하게 할 수 있거나 작용 부위에의 전달을 위해 약제학적으로 최적화된 조제로의 이의 프로세싱을 보조할 수 있는 물질을 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체로는 제형의 형태, 조도(consistency), 점도, pH, 등장성, 안정성, 삼투압, 약동학, 단백질 응집 또는 용해도를 변경시킬 수 있는 제제가 포함되고, 완충제, 습윤제, 유화제, 희석제, 캡슐화제 및 피부 침투 향상제가 포함된다. 담체의 소정의 비-제한적 예로는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 아르기닌, 슈크로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 소르비톨, 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 및 이들의 조합물이 포함된다. 전신 투여를 위한 감작화된 림프구는 장내, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 실제로, 3개의 유형의 제형 모두를 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 부형제뿐만 아니라 비경구 및 비비경구 약물 전달을 위한 제형도 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
(예를 들면, 주사에 의한) CLDN 감작화된 림프구의 비경구 투여에 적합한 제형으로는 수성 또는 비-수성, 등장성, 발열원-불포함, 멸균 액체(예를 들면, 용액, 현탁액)가 포함되고, 여기서, 활성 성분은 용해되거나, 현탁되거나, 그렇지 않으면 (예를 들면, 리포솜 또는 다른 미립자로) 제공된다. 이러한 액체는 추가로 다른 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 세균증식 정지제, 현탁제, 증점제, 및 제형이 의도된 수용체의 혈액(또는 다른 관련 체액)과 등장성이 되게 하는 용질을 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 예를 들면, 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 포함된다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성의 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 염화 나트륨 주사, 링거액, 또는 락테이트 링거 주사액이 포함된다.
세포 구성성분들을 도입하는 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있고, U.S.P N. 4,844,893 및 4,690,915에 예시되는 것들과 같은 절차가 포함된다. 사용된 CLDN 감작화된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)의 양은 시험관내 및 생체내 사용 사이에 또한 표적 세포의 양 및 유형에 따라 다를 수 있다. 투여되는 양은 또한 환자의 병태에 따라 다를 것이고, 모든 적절한 인자들을 고려한 후 의사에 의해 결정되어야만 한다.
CLDN 감작화된 림프구의 특정 투약 용법, 즉, 용량, 시점 및 반복은 특정 개체뿐만 아니라 약동학(예를 들면, 반감기, 제거율 등)과 같은 경험적 고찰에 의존할 것이다. 예를 들면, 개체는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 감작화된 림프구의 증분 용량(incremental dosage)이 주어질 수 있다. 선택된 실시형태들에서, 용량은 각각 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점차적으로 증가되거나 감소되거나 약화될 수 있다. 투여 빈도의 결정은 당해 분야 숙련가, 예를 들면, 주치의에 의해 치료되는 병태 및 치료되는 병태의 중증도, 및 치료되는 대상체의 연령 및 일반적 건강 상태 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 투여 빈도는 치료요법의 과정에 걸쳐 선택된 조성물의 효능 및 투약 용법의 평가에 기초하여 조정될 수 있다. 이러한 평가는 특정 질환, 장애 또는 병태의 마커에 기초하여 이루어질 수 있다. 개체가 암을 갖는 실시형태에서, 이들은 촉진(palpation) 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접 측정값; x-선 또는 다른 화상 기술에 의한 종양 크기의 간접 측정값; 직접적인 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 본원에서 확인된 간접적 종양 마커(예를 들면, PSMA) 또는 CLDN 항원의 측정값; 증식성 또는 종양원성 세포의 수의 감소, 이러한 신생물성 세포 감소의 유지; 신생물성 세포 증식의 감소; 또는 전이 발생의 지연을 포함한다.
본 개시의 관점에서 CLDN CAR은 특정 스케쥴로 투여될 수 있다. 일반적으로, 유효 용량의 감작화된 림프구는 대상체에게 1회 이상 투여된다. 보다 구체적으로, 유효 용량의 CLDN CAR은 대상체에게 1개월에 1회, 1개월에 1회 이상 또는 1개월에 1회 미만으로 투여된다. 소정 실시형태에서, 유효 용량의 CLDN 감작화된 림프구는 적어도 1개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년 또는 수년의 기간을 포함하는 다수 횟수로 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태들에서, CLDN 감작화된 림프구의 투여들 사이에, 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7), 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 수개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 심지어 1년 또는 수년이 경과될 수 있다.
소정의 바람직한 실시형태들에서, CLDN CAR을 포함하는 치료의 과정은 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 다중 용량의 선택된 감작화된 림프구를 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 CLDN 감작화된 림프구는 1일마다, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 1개월마다, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 1회 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 환자 반응 및 임상 실습에 기초하여, 용량이 변경되거나, 간격이 조정될 수 있음이 이해될 것이다.
포유동물(예를 들면, 사람)에게 투여되는 숙주 세포의 전형적인 양은 예를 들면, 100만 내지 1000억개의 세포의 범위 내일 수 있지만; 이러한 예시적 범위 미만 또는 초과의 양은 본 발명의 범위 내이다. 예를 들면, 본 발명의 숙주 세포의 1일 용량은 약 1백만 내지 약 500억개의 세포(예를 들면, 약 5백만개의 세포, 약 25백만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 바람직하게는 약 1,000만 내지 약 1000억개의 세포(예를 들면, 약 2,000만개의 세포, 약 3,000만개의 세포, 약 4,000만개의 세포, 약 6,000만개의 세포, 약 7,000만개의 세포, 약 8,000만개의 세포, 약 9,000만개의 세포, 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억개의 세포, 약 900억개의 세포 또는 상기 값들 중 임의의 2개로 정의되는 범위), 보다 바람직하게는 약 1억 내지 약 500억개의 세포(예를 들면, 약 1억 2천만개의 세포, 약 2억 5천만개의 세포, 약 3억 5천만개의 세포, 약 4억 5천만개의 세포, 약 6억 5천만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약 5억, 10억, 15억, 20억, 25억, 30억, 35억, 40억, 45억, 50억, 55억, 60억, 65억, 70억, 75억, 80억, 85억, 90억, 95억 또는 100억개의 세포가 하나 이상의 용량으로 환자에게 투여된다.
치료학적 또는 예방학적 효능은 치료된 환자의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 병태에 따라, 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투약 용법이 유용할 수 있고, 본 발명의 범위 내이다. 원하는 용량은 조성물의 단일 볼루스(bolus) 투여에 의해, 조성물의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 조성물의 연속적 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
상기 논의되는 바와 같이, CLDN CAR을 발현하는 감작화된 숙주 세포를 포함하는 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내 또는 비강내를 포함하는 표준 투여 기술을 이용하여 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 적합하다. 본원에 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 조성물은 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 포유동물에게 투여된다.
또한, CLDN CAR 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포 또는 CAR-암호화 핵산 서열을 포함하는 벡터는 하나 이상의 추가의 치료학적 제제와 함께 투여될 수 있고, 이는 포유동물에게 공동투여될 수 있다. "공통투여"는 CLDN CAR이 하나 이상의 추가의 치료학적 제제의 효과 또는 그 반대를 향상시킬 수 있도록 하나 이상의 추가의 치료학적 제제 및 본 발명의 숙주 세포 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 시점상 충분히 가깝게 투여함을 의미한다. 이와 관련하여, 감작화된 림프구를 포함하는 조성물이 첫번째로 투여될 수 있고, 하나 이상의 추가의 치료학적 제제가 두번째로 투여될 수 있거나, 그 반대이다. 대안으로, CLDN 감작화된 림프구를 포함하는 조성물 및 하나 이상의 추가의 치료학적 제제는 동시에 투여될 수 있다.
선택된 바람직한 실시형태들에서, CLDN 감작화된 림프구는 항상성 사이토카인(예를 들면, IL-7, IL-15 등)의 이용가능성(availability)을 증가시켜 T 세포 증대를 지지하기 위해서 림프독성(lymphotoxic) 치료요법과 함께 투여될 것이다. 이러한 프로토콜에서, 림프독성 치료요법은 바람직하게는 감작화된 림프구의 투여 전에 수행될 것이다. 보다 구체적으로, 림프고갈성 예비 용법(lymphodepleting preparative regimen) 은 내인성 림프구를 감소시켜 투여된 감작화된 림프구의 증대 및 지속성을 지지하는 항상성 사이토카인의 축적을 초래함으로써 입양 세포 치료요법의 효능을 향상시킬 수 있다. 또한, 이러한 예비 치료는 Treg의 수 및 출현빈도의 일시적 감소를 유도하여 선천적 면역 시스템을 활성화시키는 박테리아 부산물(예를 들면, 리포폴리사카라이드)의 전신 방출을 유도할 수 있는 내장 손상(gut damage)의 유도 및 림프구 억제를 감소시킬 수 있다. 종합하면, 이러한 메커니즘은 실질적으로 이식된 CLDN 감작화된 림프구에 대한 면역 환경의 수용성(receptiveness)을 향상시키고, 이에 의해 이의 증대 및 지속성을 촉진시킬 수 있다.
VIII. 징후
본 발명은 신생물성, 염증성, 혈관신생 및 면역학적 CLDN 관련 장애를 포함하는 각종 장애의 치료, 유지 및/또는 예방을 위한 본 발명의 CLDN 감작화된 림프구의 용도를 제공한다. 치료를 위한 바람직한 표적은 고형 종양 및 혈액학적 악성종양을 포함하는 신생물성 병태이다. 소정 실시형태들에서, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 CLDN을 발현하는 종양 또는 종양원성 세포를 억제하거나, 감소시키거나 또는 제거하는데 사용될 것이다. 치료되는 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 사용된 바와 같이, 임의의 포유동물 종들을 포함하는 것으로 명확히 간주되지만, 바람직하게는 사람일 것이다.
본 발명에 따라서 치료되는 신생물성 병태들은 양성 또는 악성일 수 있고; 고형 종양 또는 다른 혈액 신생물형성증일 수 있고; 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 자율 신경절 종양, 방광암(편평 세포 암종 및 이행세포 암종), 배반포 장애, 골암(법랑질종, 동맥류성 골낭종, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수암, 전이성 뇌 종양, 삼중 음성 유방암을 포함하는 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 비염색성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피하 양성 섬유성 조직구종, 결합조직형성 소규모 원형 세포 종양, 상의세포종, 상피 장애, 유잉(Ewing) 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유생성증, 뼈의 섬유성 골 이형성증, 담낭암 및 담도암, 위암, 위장 질환, 임신성 영양아층 질환, 생식 세포 종양, 선상 장애, 두경부암, 시상하부, 장암, 섬세포 종양, 카포시(Kaposi) 육종, 신장암(신아세포종, 유두상 신세포암), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간아세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암종, 편평 세포 암종, 거대 세포 암종 등), 대식세포 장애, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다중 내분비선 신생물, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아과 암, 말초 신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종(posterious unveal melanoma), 희귀 혈액학적 장애, 전이성 신암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연질-조직 육종, 편평세포암, 위암, 기질 장애, 활막육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암(자궁경부의 암종, 자궁내막 암종 및 평활근종)을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 그룹으로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태들에서, 대상체는 난소암, 췌장암, 결장직장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 및 위암을 앓고 있을 것이다. 바람직한 실시형태들에서, 대상체는 난소암, 췌장암, 결장직장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 및 위암에 관해 난치성일 것이다.
다른 바람직한 실시형태들에서, 개시된 CLDN CAR 치료는 하기 아형: 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암(예를 들면, 편평 세포 비-소세포 폐암 또는 편평 세포 소세포 폐암)을 포함하는 폐암을 치료하는데 특히 효과적이다. 선택된 실시형태에서, CLDN 민감성 림프구는 제한 병기(limited stage) 질환 또는 확장 병기(extensive stage) 질환을 나타내는 환자에게 투여될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 개시되는 세포 조성물은 난치성 환자(즉, 초기 치료요법의 과정 동안 또는 초기 치료요법의 과정을 완료한 직후 환자의 질환이 재발한 환자들); 민감성 환자(환자의 재발이 초기 치료요법 후 2 내지 3개월보다 긴 환자들); 또는 백금계 제제(예를 들면, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴) 및/또는 탁산(예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 내성을 나타내는 환자에게 투여될 것이다.
다른 특히 바람직한 실시형태에서, 개시된 CLDN CAR 치료는 난소-혈청 암종 및 난소-유두상 혈청 암종을 포함하는 난소암을 치료하는데 효과적이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 질환의 초기 제시 후 종양 재발의 기회를 감소시키거나 제거하기 위해 유지 치료요법에 사용할 수 있다. 바람직하게, 장애는 치료될 것이고, 초기 종양 질량은 제거되거나, 감소되거나, 또는 그렇지 않으면 완화되어 환자가 무증상이거나 관해(remission)되게 된다. 이 시점에, 대상체에, 표준 진단학적 절차를 이용하여 질환의 징후가 거의 없거나 전혀 없는 경우라도 개시된 CLDN CAR 치료의 약제학적 유효량을 1회 이상 투여할 수 있다. 몇몇의 실시형태들에서, 조정인자는 매주, 2주마다, 매달, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다 또는 매년과 같은 기간에 걸쳐 규칙적인 스케쥴로 투여될 것이다. 본원의 교시에 따르면, 당해 분야 숙련가는 질환 재발의 잠재력을 감소시키기 위한 바람직한 용량 및 투약 용법을 쉽게 결정할 것이다. 또한, 이러한 치료는 환자 반응 및 임상학적 및 진단학적 파라미터에 따라 수주, 수개월, 수년 또는 심지어 무제한의 기간 동안 지속될 것이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 체적감축(debulking) 절차 후 종양 전이의 가능성을 예방하거나 감소시키기 위해 애쥬번트 치료요법으로서 또는 예방학적으로 사용할 수 있다. 본 개시에서 사용되는 바와 같은 "체적감축 절차"는 광범위하게 정의되고, 종양 또는 종양 증식을 제거하거나, 감소시키거나, 치료하거나 또는 완화시키는 임의의 절차,기술 또는 방법을 의미할 것이다. 예시의 체적감축 절차로는 외과술, 방사선 치료(즉, 빔 방사선), 화학 치료요법, 면역치료요법 또는 절제(ablation)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 개시의 관점에서 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정되는 적절한 시점에, 개시된 CLDN CAR 치료는 임상학적, 진단학적 또는 진단치료학적(theragnostic) 절차에 의해 제안되는 바와 같이 투여하여 종양 전이를 감소시킬 수 있다. CLDN 감작화된 림프구는 표준 기술을 이용하여 측정시 약제학적 유효 용량으로 1회 이상 투여될 수 있다. 바람직하게, 투약 용법은 변형되는 것을 허용하는 적절한 진단학적 또는 모니터링 기술에 의해 동반될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태들은 무증상이지만 증식성 장애를 발병할 위험이 있는 대상체에게 개시된 CLDN CAR 치료를 투여함을 포함한다. 즉, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 진정한 예방학적 의미로 사용될 수 있고, 검사되었거나 시험된 환자들에게 제공될 수 있고, 하나 이상의 유명한 위험 인자들(예를 들면, 게놈성 징후, 가족력, 생체내 또는 시험관내 시험 결과 등)을 가질 수 있지만, 발병된 신생물혀성증은 갖지 않는다. 이러한 경우, 당해 분야 숙련가들은 경험적 관찰을 통해 또는 허용되는 임상학적 실습을 통해 유효 투약 용법을 결정할 수 있을 것이다.
IX. 병용 치료요법
이전에 논의된 바와 같이, 본원에 기술된 CLDN CAR 치료가 다른 임상학적 종양학 치료와 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 치료는 세포독성제, 세포분열억제제, 항-혈관신생제, 체적감축제, 화학치료학적 제제, 방사선 치료학적 제제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 변형제, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 치료요법, 항-전이성 제제, 및 면역치료학적 제제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 치료학적 모이어티 또는 약물, 예를 들면, 항암제와 함께 사용할 수 있다.
병용 치료요법은 암을 예방하거나 치료하는데 그리고 암의 전이 또는 재발을 예방하는데 유용할 수 있다. 본원에서 사용되는 "병용 치료요법"은 적어도 하나의 CLDN CAR 치료 및 적어도 하나의 치료학적 모이어티(예를 들면, 항암제)를 포함하는 조합의 투여를 의미하고, 여기서, 상기 조합은 바람직하게는 (i) 단독으로 사용된 CLDN CAR 치료, 또는 (ii) 단독으로 사용된 치료학적 모이어티, 또는 (iii) CLDN CAR 치료의 부가의 부재 하에 다른 치료학적 모이어티와 병용한 치료학적 모이어티의 사용에 비하여 암의 치료에 있어서 치료학적 상승작용(synergy)을 갖거나 측정가능한 치료학적 효과를 향상시킨다. 본원에서 사용되는 용어 "치료학적 상승작용"은 CLDN CAR 치료 및 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)의 조합의 부가적 효과보다 더 큰 치료학적 효과를 갖는 CLDN CAR 치료 및 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)의 조합을 의미한다.
개시되어 있는 조합의 원하는 결과는 대조군 또는 기저선 측정에 대한 비교에 의해 정량된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 상대적 용어들, 예를 들면, "향상시킨다", "증가시킨다" 또는 "감소시킨다"는 본원에 기술된 치료의 개시 전에 동일한 개체에서의 측정값 또는 본원에 기술되어 있는 CLDN CAR 치료의 부재 하, 그러나 양호 치료의 표준(standard of care treatment)과 같은 다른 치료학적 모이어티(들)의 존재 하의 대조군 개체(또는 다중 대조군 개체)에서의 측정값과 같은 대조군에 대해 상대적인 값을 나타낸다. 대표적인 대조군 개체는 (치료된 개체 및 대조군 개체에서의 질환의 병기들이 비교할만함을 확실히 하기 위해) 치료되는 개체와 동일한 형태의 암에 걸린, 치료되는 개체와 대략 동일한 연령인 개체이다.
치료요법에 대한 반응으로의 변화 또는 향상은 일반적으로 통계학적으로 유의하다. 본원에서 사용되는 용어 "유의성" 또는 "유의한"은 2개 이상의 실체들 사이의 비-무작위 회합이 존재할 가능성의 통계학적 분석에 관한 것이다. 관계가 "유의하거나" "유의성"을 갖거나 갖지 않는지의 여부를 결정하기 위해, "p-값"을 계산할 수 있다. 사용자-정의된 컷-오프점(user-defined cut-off point) 미만인 P-값이 유의한 것으로 간주된다. 0.1 미만이거나 동일한, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만, 또는 0.001 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주될 수 있다.
상승작용적 치료학적 효과는 단일 치료학적 모이어티 또는 CLDN CAR 치료에 의해 유발된 치료학적 효과, 또는 주어진 조합의 CLDN CAR 치료 또는 단일 치료학적 모이어티(들)에 의해 유발된 치료학적 효과들의 총합보다 적어도 약 2배 더 크거나, 적어도 약 5배 더 크거나, 적어도 약 10배 더 크거나, 적어도 약 20배 더 크거나, 적어도 약 50배 더 크거나, 적어도 약 100배 더 큰 효과일 수 있다. 상승작용적 치료학적 효과는 또한 단일 치료학적 모이어티 또는 CLDN CAR 치료에 의해 유발된 치료학적 효과, 또는 주어진 조합의 CLDN CAR 치료 또는 단일 치료학적 모이어티(들)에 의해 유발된 치료학적 효과들의 총합과 비교하여 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 그 이상의 치료학적 효과의 증가로서 관찰될 수 있다. 상승작용적 효과는 또한 치료학적 제제들이 병용되는 경우에 치료학적 제제들의 감소된 투약을 가능하게 하는 효과이다.
병용 치료요법 실행시, CLDN CAR 치료 및 치료학적 모이어티(들)는 대상체에게 동일하거나 상이한 투여 경로를 이용하여 단일 조성물로 또는 2개 이상의 별개의 조성물로 동시에 투여할 수 있다. 대안으로, CLDN CAR 치료로의 치료는 치료학적 모이어티 치료에 예를 들면, 수분 내지 수주 범위의 간격으로 선행하거나 후행할 수 있다. 한 실시형태에서, 치료학적 모이어티 및 CAR 둘 다는 서로 약 5분 내지 약 2주 내에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR과 치료학적 모이어티의 투여 사이는 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7), 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 수개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이 경과할 수 있다.
병용 치료요법은 병태가 치료되거나 일시적으로 완화되거나 치유될 때까지 매일 1회, 2회 또는 3회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회와 같은 각종 스케쥴로 투여될 수 있거나, 연속적으로 투여될 수 있다. CAR 및 치료학적 모이어티(들)는 격일 또는 격주로 투여될 수 있거나; CLDN CAR 치료의 순서로 제공될 수 있고, 이어서, 추가의 치료학적 모이어티로의 하나 이상의 치료제가 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, CLDN CAR은 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)과 병용하여 짧은 치료 주기 동안 투여된다. 다른 실시형태에서, 병용 치료는 긴 치료 주기 동안 투여된다. 병용 치료요법은 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다.
몇몇의 실시형태들에서, CLDN CAR 치료(즉, CLDN 감작화된 림프구의 투여)는 각종 일선의 암 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 이포스파미드, 미토마이신 C, 빈데신, 빈블라스틴, 에토포시드, 이리노테칸, 겜시타빈, 탁산, 비노렐빈, 메토트렉세이트 및 페메트렉세드, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)와 같은 세포독성제의 사용을 포함한다.
PD-1은 이의 리간드 PD-L1과 함께 항종양 T 림프구 반응의 다른 음성 조절인자이다. 한 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료를 항-PD-L1 항체(예를 들면, 람브롤리주맙, 니볼루맙) 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)와 함께 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료를 항-PD-L1 항체(예를 들면, MPDL3280A, MEDI4736) 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)와 함께 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료를, 다른 항-PD-1로의 치료 및/또는 표적화된 BRAF 병용 치료요법(예를 들면, 이필리무맙 및 베무라페닙 또는 다브라피닙) 후 진행을 계속하는 환자들에게 투여되는 항 PD-1 항체(예를 들면, 펨브롤리주맙)와 함께 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 비노렐빈; 겜시타빈; 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 또는 파클리탁셀; 이리노테칸; 또는 페메트렉세드)의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 예를 들면, BR-ERPR, BR-ER 또는 BR-PR 암의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 "호르몬 치료요법"으로서 기술되는 하나 이상의 치료학적 모이어티들의 사용을 포함한다. 본원에 사용되는 "호르몬 치료요법"은 예를 들면, 타목시펜; 고나도트로핀 또는 루테인 방출 호르몬(GnRH 또는 LHRH); 에베롤리무스 및 엑세메스탄; 토레미펜; 또는 아로마타제 억제제(예를 들면, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 또는 풀베스트란트)를 말한다.
다른 실시형태에서, 예를 들면, BR-HER2의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 트라스투주맙 또는 아도-트라스투주맙 엠탄신 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 페르투주맙 및/또는 도세탁셀)의 사용을 포함한다.
몇몇의 실시형태에서, 예를 들면, 전이성 유방암의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 탁산(예를 들면, 도세탁셀 또는 파클리탁셀) 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 안트라사이클린(예를 들면, 독소루비신 또는 에피루비신) 및/또는 에리불린)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 예를 들면, 전이성 또는 재발성 유방암 또는 BRCA-돌연변이체 유방암의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 메게스트롤 및 선택적으로 추가의 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 예를 들면, BR-TNBC의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 폴리 ADP 리보스 폴리머라제(PARP) 억제제(예를 들면, BMN-673, 올라파립, 루카파립 및 벨리파립) 및 선택적으로 추가의 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 예를 들면, 유방암의 치료시, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 사이클로포스파미드 및 선택적으로 추가의 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 독소루비신, 탁산, 에피루비신, 5-FU 및/또는 메토트렉세이트)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, EGFR-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 아파티닙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 에를로티닙 및/또는 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, EGFR-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 에를로티닙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, ALK-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 세리티닙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, ALK-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 크리조티닙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 베바시주맙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 또는 파클리탁셀; 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 베바시주맙 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 겜시타빈 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 유사체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 및 파클리탁셀)의 사용을 포함한다.
한 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 유사체 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예를 들면, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 및 파클리탁셀 및/또는 겜시타빈 및/또는 독소루비신)의 사용을 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 백금-내성 종양의 치료를 위한 병용 치료요법은
CLDN CAR 치료 및 독소루비신 및/또는 에토포시드 및/또는 겜시타빈 및/또는 비노렐빈 및/또는 이포스파미드 및/또는 류코보린-조정된 5-플루오로우라실 및/또는 베바시주맙 및/또는 타목시펜; 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 PARP 억제제 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 병용 치료요법은 CLDN CAR 치료 및 베바시주맙 및 선택적으로 사이클로포스파미드의 사용을 포함한다.
병용 치료요법은 CLDN CAR 치료, 및 돌연변이된 또는 비정상적으로 발현된 유전자 또는 단백질(예를 들면, BRCA1)을 포함하는 종양에 효과적인 화학치료학적 모이어티를 포함할 수 있다.
보다 일반적으로, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 다수의 항암제와 함께 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항암제" 또는 "화학치료학적 제제"는 결국 "약제학적 활성 모이어티"로서 기술되는 제제의 서브세트인 "치료학적 모이어티"의 하나의 서브세트이다. 보다 구체적으로, "항암제"는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 제제를 의미하고, 세포독성제, 세포분열억제제, 항-혈관신생제, 체적감축제, 화학치료학적 제제, 방사선 치료요법 및 방사선 치료학적 제제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 변형제, 치료학적 항체, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 치료요법, 항-전이제 및 면역치료학적 제제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 논의된 바와 같은 선택된 실시형태에서 이러한 항암제는 항체 약물 접합체를 포함할 수 있고 투여 전에 항체와 회합될 수 있음이 이해될 것이다.
또한, 항암제일 수도 있는 용어 "세포독성제"는 세포에 대해 독성이고 세포의 기능을 감소시키거나 억제하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 전형적으로, 당해 물질은 살아있는 유기체로부터 유도된 천연 발생 분자(또는 합성적으로 제조된 천연 생성물)이다. 세포독성제의 예로는 박테리아(예를 들면, 디프테리아 독소, 슈도모나스 내독소 및 외독소, 스태필로코커스 장내독소 A), 진균(예를 들면, α-사크린, 레스트릭토신), 식물(예를 들면, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 미국자리공 항-바이러스성 단백질, 사포린, 겔로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis) 억제제, 미테겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신, 및 트리코테센), 또는 동물(예를 들면, 세포독성 RNase, 예를 들면, 세포외 췌장 RNase; DNase I, 이들의 단편 및/또는 변이체 포함)의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
항암제는 암성 세포 또는 암성이 되거나 종양원성 후손을 생성하는 경향이 있는 세포(예를 들면, 종양원성 세포)를 억제하거나 억제하도록 고안된 임의의 화학작용제(chemical agent)를 포함할 수 있다. 이러한 화학작용제는 보통 세포 성장 또는 분할에 필요한 세포내 프로세스에 지정되고, 따라서 일반적으로 신속하게 성장하고 분할하는 암성 세포에 대해 특히 효과적이다. 예를 들면, 빈크리스틴은 미세소관을 해중합시키고(depolymerize), 따라서 세포가 유사분열에 진입하는 것을 억제한다. 이러한 제제는 흔히 투여되고, 보통 조합물로, 예를 들면, 제형 CHOP로 가장 효과적이다.
본 발명의 CLDN CAR 치료와 병용하여 사용될 수 있는 항암제의 예로는 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아나스트로졸, 아마니틴, 아지리딘, 에틸렌이민, 및 메틸라멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, BEZ-235, 보르테조밉, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 세리티닙, 크리조티닙, 크립토파이신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 에를로티닙, 판크라티스타틴, 사르코딕티인, 스폰기스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 엔다이인, 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 색소 단백질 엔다이인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칸포스파미드, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 사이클로포스파미드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 엑세메스탄, 플루오로우라실, 풀베스트란트, 게피티닙, 이다루비신, 라파티닙, 레트로졸, 로나파르닙, 마르셀로마이신, 메게스트롤 아세테이트, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 파조파닙, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 라파마이신, 로도루비신, 소라페닙, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 타목시펜, 타목시펜 시트레이트, 테모졸로미드, 테포디나, 티피파르닙, 투베르시딘, 우베니멕스, 반데타닙, 보로졸, XL-147, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항-부신제, 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코사이드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트렉세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 엘리프티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 갈륨 니트레이트, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 메이탄시노이드, 미토구아존, 미토크산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로소크산트론, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카르바진, 폴리사카라이드 복합체, 라족산; 리족신; SF-1126, 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드; 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로란부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드; 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸, 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; XL158; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제, 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들면, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 항체, 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제(이는 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절한다), 및 항-부신제; 및 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 예를 들면, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체도 포함된다.
특히 바람직한 항암제는 시판의 또는 임상학적으로 이용가능한 화합물, 예를 들면, 에를로티닙(TARCEVA® Genentech/OSI Pharm.), 도세탁셀(TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 겜시타빈(GEMZAR®, Lilly), PD-0325901(CAS No. 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴(시스-디아민, 디클로로백금(II), CAS No. 15663-27-1), 카르보플라틴(CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 테모졸로마이드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타아자비시클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카르복스아미드, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®)을 포함한다. 추가의 시판 또는 임상학적으로 이용가능한 항암제는 옥살리플라틴(ELOXATIN®, Sanofi), 보르테조밉(VELCADE®, Millennium Pharm.), 수텐트(SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA®, Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, Novartis), XL-518(Mek 억제제, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886(Mek 억제제, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126(PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235(PI3K 억제제, Novartis), XL-147(PI3K 억제제, Exelixis), PTK787/ZK 222584(Novartis), 풀베스트란트(FASLODEX®, AstraZeneca), 류코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®, Wyeth), 라파티닙(TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파르닙(SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), 소라페닙(NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), 게피티닙(IRESSA®, AstraZeneca), 이리노테칸(CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), 티피파르닙(ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™(크레모포어-불포함), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), 반데타닙(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; Sugen), 템시롤리무스(TORISEL®, Wyeth), 파조파닙(GlaxoSmithKline), 칸포스파미드(TELCYTA®, Telik), 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN®, NEOSAR®); 비노렐빈(NAVELBINE®); 카페시타빈(XELODA®, Roche), 타목시펜(NOLVADEX® 포함; 타목시펜 시트레이트, FARESTON®(토레미핀 시트레이트) MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스탄; Pfizer), 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; Novartis) 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; AstraZeneca)을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용는 염" 또는 "염"은 분자 또는 거대분자의 유기 또는 무기 염을 의미한다. 산 부가염은 아미노 그룹으로 이루어질 수 있다. 예시의 염으로는 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌 비스-(2-하이드록시 3-나프토에이트)) 염이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 다른 카운터이온(counterion)과 같은 다른 분자의 포함을 수반할 수 있다. 카운터이온은 모 화합물에 대한 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염은 이의 구조에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다중 하전된 원자가 약제학적 허용되는 염의 일부인 경우, 상기 염은 다중 카운터 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 카운터이온을 가질 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 용매화물" 또는 "용매화물"은 하나 이상의 용매 분자 및 분자 또는 거대분자의 회합을 말한다. 약제학적으로 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예로는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 CLDN CAR 치료는 임상 시험에 존재하거나 상업적으로 입수가능한 다수의 항체(또는 면역치료학적 제제)들 중 임의의 하나와 병용하여 사용할 수 있다. 개시되어 있는 CLDN 감작화된 림프구는, 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시주맙, 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 에크로멕시맙, 엘로투주맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 파를레투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 이마가투주맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 나프투모맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올라파립, 오나르투주맙, 오포르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파라사투주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 피딜리주맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라무시루맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 셀루메티닙, 시브로투주맙, 실툭시맙, 심투주맙, 솔리토맙, 타카투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 투코투주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙, 보르세투주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 3F8, MDX-1105 및 MEDI4736 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체와 병용하여 사용할 수 있다.
다른 특히 바람직한 실시형태는 리툭시맙, 겜투주맙, 오조가마이신, 알렘투주마, 이브리투모맙, 티욱세탄, 토시투모맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 파티투무맙, 오파투무맙, 이필리무맙 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 암 치료요법에 대해 승인된 항체의 사용을 포함한다. 당해 분야 숙련가들은 본원의 교시에 적합한 추가의 항암제를 쉽게 확인할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 방사선 치료요법(즉, 감마-방사선, X-선, UV-조사, 마이크로파, 및 전자 방출(electronic emission) 등과 같은 종양 세포 내의 DNA 손상을 국부적으로 유도하기 위한 임의의 메커니즘)과 CLDN CAR 치료의 병용을 제공한다. 종양 세포에의 방사선 동위원소의 지정된 전달을 이용한 병용 치료요법도 고려되고, 개시되어 있는 CLDN CAR 치료는 표적화된 항암제 또는 다른 표적화 수단과 병용하여 사용할 수 있다. 전형적으로, 방사선 치료요법은 약 1 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스에 투여된다. 방사선 치료요법은 약 6 내지 7주 동안 두경부암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선 치료요법은 단일 용량으로서 또는 다중의 순차적 용량들로서 투여될 수 있다.
X. 진단학
본 발명은 종양원성 세포를 포함하는 종양 세포에 대한 임의의 CLDN 감작화된 림프구의 효과 또는 임의의 림프구 형질도입의 효능을 검출하거나, 진단하거나, 또는 모니터링하기 위한 시험관내 및 생체내 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 암의 진행을 치료하거나 모니터링하기 위해 암(예를 들면, CLDN 양성 종양)을 갖는 개체를 동정하는 단계, CLDN 감작화된 림프구로의 치료 전에, 치료 동안 또는 치료 후에 환자 또는 환자로부터 수득된 샘플을 본원에 기술된 항체와 접촉시키는 단계(즉, 생체내 또는 시험관내) 및 상기 샘플 중의 결합된 또는 유리된 표적 분자들에 대한 항체의 존재 또는 부재, 또는 회합 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태(예를 들면, 동일반응계내 하이브리드화 또는 ISH)에서, 게놈성 CLDN 결정인자와 반응하는 핵산 프로브는 증식성 장애의 검출, 진단 또는 모니터링에 사용될 것이다.
보다 일반적으로, CLDN 결정인자의 존재 및/또는 수준은 단백질 또는 핵산 분석에 관해 당해 분야 숙련가에게 입수가능한 다수의 기술 중 어느 것, 예를 들면, 직접적인 물리적 측정(예를 들면, 질량 분광측정법), 결합 검정(예를 들면, 면역검정, 응집 검정, 및 면역크로마토그래피 검정), 폴리머라제 연쇄 반응(PCR, RT-PCR; RT-qPCR) 기술, 분기쇄 올리고뉴클레오타이드 기술, 노던 블롯 기술, 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 기술 및 동일반응계내 하이브리드화 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 당해 방법은 화학적 반응, 예를 들면, 광학적 흡광도의 변화, 형광성의 변화, 화학발광성의 생성 또는 전기 화학 발광성, 반사율의 변화, 굴절률 또는 광 산란, 표면으로부터의 검출가능한 표지의 축적 또는 방출, 산화 또는 환원 또는 산화환원 종, 전류 또는 전위, 자기장의 변화 등으로부터 초래되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 적합한 검출 기술은 이들의 발광성을 통한(예를 들면, 형광성, 시간-분해 형광성, 에바네센트파 형광성, 상향-전환성 인, 다중-광자 형광성 등의 측정을 통한), 화학발광성, 전기화학발광성, 광 산란, 광학적 흡광도, 방사성, 자기장, 효소 활성(예를 들면, 광학적 흡광도 또는 형광성의 변화를 야기하거나 화학발광성의 방출을 야기하는 효소적 반응을 통해 효소 활성을 측정함으로써)을 통한 표지의 측정을 통해 표지된 결합 시약의 참여를 측정함으로써 결합 사건을 검출할 수 있다. 대안으로, 표지의 사용을 요구하지 않는 검출 기술, 예를 들면, 질량(예를 들면, 표면 음파 측정), 굴절률(예를 들면, 표면 플라스몬 공명 측정), 또는 분석물의 내재적 발광성의 측정에 기초한 기술을 사용할 수 있다.
몇몇의 실시형태들에서, 샘플 중의 특정 세포 또는 세포 구성성분과의 검출제의 회합은 샘플이 종양원성 세포를 함유할 수 있음을 나타내고, 이에 의해 암을 갖는 개체는 본원에 기술된 조성물로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타낸다.
소정의 바람직한 실시형태들에서, 검정은 면역조직화학(IHC) 검정 또는 이의 변형(예를 들면, 형광성, 발색성, 표준 ABC, 표준 LSAB 등), 면역세포화학 또는 이의 변형(예를 들면, 직접, 간접, 형광성, 발색성 등) 또는 동일반응계내 하이브리드화(ISH) 또는 이의 변형(예를 들면, 발색성 동일반응계내 하이브리드화(CISH) 또는 형광성 동일반응계내 하이브리드화(DNA-FISH 또는 RNA-FISH))을 포함할 수 있다.
이와 관련하여 본 발명의 소정 양상들은 면역조직화학(IHC)을 위해 표지된 CLDN의 사용을 포함한다. 보다 구체적으로, CLDN IHC는 각종 증식성 장애의 진단을 보조하기 위한 그리고 CLDN 항체 치료요법을 포함하는 치료에 대한 잠재적 반응을 모니터링하기 위한 진단학적 도구로서 사용할 수 있다. 본원에 논의되고 하기 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 화학적으로 고정되거나(포름알데하이드, 글루테르알데하이드, 오스뮴 테트록시드, 칼륨 디크로메이트, 아세트산, 알콜, 아연염, 염화 수은, 크로뮴 테트록시드 및 피크린산을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아님), 포매되거나(글리콜 메타크릴레이트, 파라핀 및 레신을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아님), 동결을 통해 보존된 조직에 대해 적합한 진단학적 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정을 이용하여 치료 결정을 안내하고 투약 용법 및 시점을 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 특히 적합한 양상들은 CLDN 결정인자를 검출하거나 모니터링하기 위한 동일반응계내 하이브리드화의 사용을 포함한다. 동일반응계내 하이브리드화 기술 또는 ISH는 당해 분야 숙련가들에게 익히 공지되어 있다. 간략하게, 세포를 고정화하고 특이적 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 검출가능한 프로브를 상기 고정화된 세포에 부가한다. 세포가 상보성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 경우, 검출될 수 있는 프로브는 이들에 하이브리드화될 것이다. 본원에 제시되는 서열 정보를 이용하여, 프로브는 유전자형 CLDN 결정인자를 발현하는 세포를 확인하도록 고안될 수 있다. 프로브는 바람직하게는 이러한 결정인자에 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화된다. 바람직하게는 프로브는 선택된 CLDN 결정인자에 대해 완전 상보성인 것이 바람직하지만, 비-완전 상보성 하이브리드화에 의한 배경(background) 신호를 최소화하도록 하이브리드화 조건을 일상적으로 최적화할 수 있다. 선택된 실시형태들에서, 프로브는 표준 형광성 방법에 의해 쉽게 검출가능한 프로브에 부착된 형광성 염료로 라벨링된다.
적합한 생체내 진단치료 또는 진단 검정은 예를 들면, 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영법(예를 들면, CAT 스캔), 양전자 단층 촬영법(예를 들면, PET 스캔), 방사선 촬영법, 초음파 등과 같은 당해 분야에 인지되어 있는 영상화 기술 또는 모니터링 기술을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 환자 샘플(예를 들면, 혈장 또는 혈액) 중의 특정 결정인자(예를 들면, CLDN)의 수준을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있고, 이는 결국 CLDN 감작화된 림프구를 이용한 치료 전 또는 이를 이용한 치료 후 둘 다 증식성 장애를 검출하거나, 진단하거나, 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다. 관련 실시형태들에서, 본원에 개시된 항체들은 CLDN 감작화된 림프구에 의해 개시된 치료와 병용하여, 생체내에서 또는 시험관내에서 순환하는 종양 세포들을 검출하고/하거나, 모니터링하고/하거나, 정량하는데 사용될 수 있다(예를 들면, WO 2012/0128801). 또 다른 실시형태들에서, 순환하는 종양 세포들은 종양원성 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태들에서, 대상체 또는 대상체 유래의 샘플 중의 종양원성 세포를 CLDN CAR 치료요법 또는 용법 전에 개시되어 있는 항체를 이용하여 평가하거나 특성확인하여 기저선을 확립할 수 있다. 다른 예에서, 치료된 대상체로부터 유도되는 샘플로부터 종양원성 세포를 평가할 수 있다.
XI. 제조 물품
본 발명은, 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 및 키트를 추가로 포함하고, 여기서, 컨테이너는 본 발명의 CLDN CAR 플라스미드 또는 벡터의 1회 이상 형질전환 용량을 포함한다. 소정 실시형태에서, 상기 팩 또는 키트는 하나 이상의 추가의 시약 및 선택적으로 형질도입을 유효화하는 수단의 존재 또는 부재 하에 CLDN CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 조제(예를 들면, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스)를 함유한다. 바람직하게는 상기 키트는 투여 전에 CLDN 민감성 림프구의 조제를 모니터링하고 특성확인하기 위한 수단을 추가로 포함할 것이다.
선택된 실시형태들에서, 본 발명에 적합한 키트는, 사용자가 투여 전에 품질을 확실히 하기 위해 얻어지는 CLDN 민감성 림프구를 생산하고, 형질도입률을 모니터링하고, CLDN 민감성 림프구 집단을 특성확인하는 것을 가능하게 할 것이다. 따라서, 본 발명의 키트는 일반적으로 동일하거나 상이한 컨테이너들에 CAR 핵산의 약제학적으로 허용되는 제형(또는 벡터) 및 하나 이상의 시약을 함유할 것이다. 바람직한 실시형태들에서, CLDN CAR 벡터는, 선택된 숙주 세포의 형질도입을 가능하게 하여 개시된 감작화된 림프구를 제공하는 바이러스 벡터(예를 들면, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스)를 포함할 것이다. 소정의 실시형태들에서, 선택된 숙주 세포는 자가일 수 있고(즉, 치료되는 환자로부터 유도될 수 있고), 한편, 다른 실시형태들에서 선택된 숙주 세포는 동종이계일 것이다. 본 발명의 몇몇의 양상은 CLDN CAR 벡터와 함께 동종이계 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또 다른 실시형태들은 동종이계 CLDN 감작화된 림프구를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트 또는 컨테이너를 포함한다. 이러한 키트에서, 컨테이너는 CLDN 감작화된 림프구가 환자에게 직접투여되는 것을 가능하게 하는 주입 백(bag)을 포함할 수 있다.
키트는 또한 진단 또는 병용 치료요법을 위한 다른 약제학적으로 허용되는 제형 또는 디바이스를 함유할 수 있다. 진단학적 디바이스 또는 기구의 예로는 CLDN 민감성 림프구, 형질전환 효율 또는 치료되는 증식성 장애와 관련된 세포 또는 마커를 검출하거나, 모니터링하거나, 정량하거나 또는 프로파일링하는데 사용될 수 있는 것들이 포함된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 디바이스는 생체내에서 또는 시험관내에서 순환성 종양 세포를 검출하고/하거나, 모니터링하고/하거나, 정량하는데 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 순환성 종양 세포는 종양원성 세포를 포함할 수 있다.
키트의 선택된 구성성분들이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 비-수성일 수 있지만, 수성 용액이 바람직하고, 멸균 수성 용액인 것이 특히 바람직하다. 키트의 제형(예를 들면, 바이러스 벡터)은 또한 건조된 분말(들)로서 또는 적절한 액체의 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조된 형태로 제공될 수도 있다. 재구성에 사용되는 액체는 별도의 컨테이너에 함유될 수 있다. 이러한 액체는 멸균의 약제학적으로 허용되는 완충제(들) 또는 기타 희석제(들), 예를 들면, 세균증식 정지성 주사용수, 포스페이트-완충된 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함할 수 있다. 키트가 본 발명의 CAR 플라스미드 또는 벡터를 추가의 시약과 조합하여 포함하는 경우, 용액은 몰 등가의 조합으로 또는 과량의 다른 구성성분 중의 하나의 구성성분으로 사전-혼합될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 플라스미드 및 임의의 선택적 공동-시약은 림프구의 형질전환 전에 별개의 컨테이너 내에 별도로 유지될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태들에서, 키트의 컨테이너(들)는 동종이계 CLDN 감작화된 림프구의 액체 제형을 포함할 수 있다.
키트는 하나 또는 다중 컨테이너 및 컨테이너(들) 내에, 컨테이너(들) 상에 또는 컨테이너(들)와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있고, 이는 동봉된 조성물이 선택된 질환 병태를 치료하기 위한 세포를 제조하는데 사용되는 것임을 나타낸다. 적합한 컨테이너로는 예를 들면, 병, 바이알, 시린지 등이 포함된다. 컨테이너는 다양한 재료, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있다. 컨테이너(들)는 멸균 접근 포트를 포함할 수 있고, 예를 들면, 컨테이너는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 바이알일 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 키트는 제형을 대상체 내로 주사하거나 도입시킬 수 있거나 신체의 이환 부위에 적용시킬 수 있는, 감작화된 림프구 및 임의의 선택적 구성성분들을 환자에게 투여하기 위한 수단, 예를 들면, 하나 이상의 니들 또는 (사전-충전된 또는 빈) 시린지, 점안기, 피펫, 또는 다른 이러한 유사 기구를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로, 예를 들면, 바이알 등을 함유하기 위한 수단, 및 목적하는 바이알 및 기타 기구를 배치하고 보유하는 취입-성형된 플라스틱 컨테이너와 같은 상업적 판매를 위한 밀폐된 곳에 다른 구성성분들을 포함할 것이다.
XIII. 기타 사항들
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당해 분야 숙련가들에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 달리 문맥에 의해 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이며 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위들은 양쪽 종점 및 종점들 사이의 모든 점들을 포함한다. 따라서, 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점들을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 화학의 기술은 당해 분야에 익히 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 또한, 이러한 기술과 관련하여 본원에서 사용되는 명명법도 당해 분야에서 통상적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 분야에 익히 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라서 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 다양한 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행된다.
XIV. 참조
어구 "인용에 의해 포함됨"이 특정 참조문헌과 관련하여 사용되거나 사용되지 않는지의 여부와 관계없이, 본원에 인용된 모든 특허들, 특허 출원들 및 공보들 및 전자적으로 이용가능한 자료(예를 들면, GenBank 및 RefSeq에서의 뉴클레오타이드 서열 제출물, 및 예를 들면, SwissProt, PIR, PRF, 및 GenBank와 RefSeq에서 주해가 달린 암호화 영역으로부터의 번역물에서의 아미노산 서열 제출물)의 완전한 개시내용은 인용에 의해 포함된다. 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 이어지는 실시예는 단지 명료한 이해를 위해 제공되었다. 이로부터 불필요하게 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 본 발명은 도시되고 기술된 정확한 상세설명에 제한되지 않는다. 당해 분야 숙련가에게 명백한 변형은 청구범위에 의해 정의된 본 발명에 포함된다. 본원에 사용된 임의의 섹션 표제는 단지 조직상 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
XV. 서열
다수의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 도면 및 서열목록이 본 출원에 첨부된다. 하기 표 2는 포함된 서열들의 요약을 제공한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
하기 실시예 4에 논의되는 바와 같이, 상기 표 2는 또한 도 3a 및 도 3b에 기술되는 예시의 카바트 CDR들에 대한 서열번호를 지정하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 도 3a 및 도 3b는 각각의 중쇄(CDRH) 및 경쇄(CDRL) 가변 영역 서열의 3개의 카바트 CDR들을 나타내고, 상기 표 2는 경쇄의 각각 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 각각 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3에 적용될 수 있는 서열번호 지정의 배정을 제공한다. 이러한 방법을 이용하여, 도 3a 및 도 3b에 제시되는 각각의 고유한 CDR 세트는 순차적 서열번호로 배정될 수 있고, 본 발명의 유도된 항체를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
XVI. 종양 목록
PDX 종양 세포 유형은 특정 종양 세포주를 나타내는 약어에 이은 숫자로 나타낸다. 시험된 샘플의 계대수는 샘플 명칭에 첨부된 p0-p#에 의해 나타내어지고, 여기서, p0은 환자 종양으로부터 직접 얻어진 계대되지 않은 샘플을 나타내고, p#은 시험 전에 종양이 마우스를 통해 계대된 횟수를 나타낸다. 본원에서 사용되는 종양 유형 및 아형의 약어는 하기와 같이 표 3에 나타낸다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예
따라서 상기 일반적으로 기술된 본 발명은, 하기 실시예를 참조하여 더욱 쉽게 이해될 것이고, 이는 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실시예는 하기 실험이 모든 또는 유일하게 수행되는 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 ℃이고, 압력은 대기압이거나 대기압 부근이다.
실시예 1
종양에 대한 CLDN4 , CLDN6 및 CLDN9 발현의 확인
고형 종양의 세포 이질성을 특성확인하기 위해서, 이들은 암 환자에 존재하고, 특정 표현형 마커를 이용하여 CSC의 확인을 보조하고, 임상학적으로 관련되어 있는 치료학적 표적을 식별하므로, 당해 분야에 인지되어 있는 기술을 이용하여 거대 PDX 종양 뱅크(bank)를 발달시켜 유지하였다. 다수의 별개의 종양 세포주를 포함하는 PDX 종양 뱅크는, 면역손상된 마우스에서, 각종 악성 고형 종양에 걸린 다수의 암 환자로부터 본래 수득된 이종성 종양 세포의 다중 계대를 통해 증식되었다. 익히 정의된 계통을 갖는 다수의 별개의 조기 계대 PDX 종양 세포주의 지속적 이용가능성은, PDX 종양이 CSC의 재현가능하고 반복된 특성확인을 가능하게 하므로 CSC의 확인 및 단리를 용이하게 한다. 최소 계대된 PDX 종양 세포주의 사용은 생체내 실험을 간략화하고, 쉽게 입증할 수 있는 결과를 제공한다. 또한, 조기 계대 PDX 종양은 치료학적 제제, 예를 들면, 이리노테칸(즉, Camptosar®)에 반응하고, 이는 종양 성장을 구동하는 기본 메커니즘, 현재 치료요법에 대한 내성 및 종양 재발에 대한 임상학적으로 관련된 이해를 제공한다.
PDX 종양 세포주로부터 RNA를 생성하기 위해, 종양은 이들이 800 내지 2000㎣에 도달한 후에 마우스로부터 절제하였고, 상기 종양을 당해 분야-인지되어 있는 효소적 분해 기술(예를 들면, U.S.P.N. 2007/0292414를 참조한다)을 이용하여 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 선택된 해리된 PDX 종양 세포 조제는 마우스 세포를 고갈시켰고, CD46hi 및/또는 CD324의 발현, CSC 아집단의 마커에 기초하여 분류하였다(CD46hi의 정의에 대해 U.S.P.N 2013/0260385를 참조한다). 사람 EpCAM, CD46hi 및/또는 CD324를 발현하였거나(즉, CSC) 또는 CD46hi 및/또는 CD324을 제외한 EpCAM을 발현한 세포(즉, NTG 세포)를, BD FACSAria 세포 분류기를 이용한 FACS에 의해 단리하였고, 제조업자의 지침에 따라 RLT플러스 RNA 용해 완충액(Qiagen)에 용해시켰다. 이어서, 용해물을 -80℃에 보관하였고, RNA 추출을 위해 해동시켰다. 해동시, 총 RNA는 판매자의 지침에 따라 RNeasy 단리 키트(Qiagen, GmbH)를 이용하여 추출하였고, 이어서, 또한 제조업자의 프로토콜 및 권고된 기기 설정을 이용하여 Nanodrop 분광측정기(Thermo Scientific) 및/또는 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)를 이용하여 정량하였다. 얻어진 총 RNA 조제를 유전적 서열분석 및 유전자 발현 분석에 의해 평가하였다.
Oligo Ligation/Detection(SOLiD) 4.5 또는 SOLiD 5500xl 차세대 서열분석 시스템(Life Technologies)에 의한 Applied Biosystems(ABI) 서열분석을 이용하여 정성된 고품질 RNA의 전체 전사체 서열분석을 수행하였다. 저 투입(input) 총 RNA에 대해 고안된 ABI 또는 Ovation RNA-Seq System V2™(NuGEN Technologies)로부터 변형된 전체 전사체 프로토콜을 이용하여 1ng의 총 RNA 샘플로부터 cDNA를 생성하였다. 얻어진 cDNA 라이브러리를 단편화하였고, 바코드 어댑터를 부가하여 서열분석 실행 동안 상이한 샘플들로부터의 단편 라이브러리의 풀링을 가능하게 하였다. 공개된 사람 게놈의 NCBI 버젼 hg19.2를 이용하여 RefSeq 버젼 47에 의해 주해된 바와 같은 34,609 유전자에 대해 맵핑된 SOLiD 플랫폼에 의해 데이터가 생성되었고, 대부분의 샘플에서 RNA 수준의 입증가능한 측정값을 제공하였다. SOLiD 플랫폼으로부터의 서열분석 데이터는 명목상 유전자의 엑손 영역에 대해 맵핑된 측정법 RPM(100만당 판독) 또는 RPKM(100만당 킬로베이스당 판독)을 이용한 전사물 발현 값으로서 나타내고, 이는 기본 유전자 발현 분석이 정규화되어 RPM_전사물 또는 RPKM_전사물로서 열거되는 것을 가능하게 한다.
SOLiD를 사용한 전체 전사체 서열분석의 결과는 BR13, BR22, OV100, PA20 및 PA3의 PDX 세포주에서 NTG에 비해 분류된 CSC에서 CLDN4 mRNA의 상승된 발현뿐만 아니라 BR36, OV106MET, OV72MET, 및 OV91MET를 포함하는 추가의 CSC 집단에서의 높은 발현도 보여주었다(도 1). CLDN6 mRNA는 BR36, OV106MET, OV72MET, 및 OV91MET를 포함하는 분류된 CSC 집단에서 상승되었다(도 1). CLDN4 또는 CLDN6의 경우와는 달리, 관련된 계열 구성원, CLDN9는 모든 분류된 종양 집단에서 낮은 발현을 갖는 것으로 관찰되었다. 종양 샘플과는 대조적으로, 정상 난소 및 췌장 조직은 모든 3개의 계열 구성원, CLDN4, CLDN6 및 CLDN9의 mRNA 발현을 전혀 나타내지 않거나 매우 낮은 발현을 나타내었다.
상이한 유형의 사람 종양에서의 증가된 CLDN4 및 CLDN6 mRNA 발현의 확인은 이들 항원이 강력한 진단학적 및/또는 면역치료학적 표적으로서 추가로 평가하는데 유익함을 나타내었다.
실시예 2
재조합 CLDN 단백질의 클로닝 및 발현
클라우딘 단백질 서열들 간의 관계를 추론하기 위해, 벡터 NTI 소프트웨어 패키지의 AlignX 프로그램이 23개 사람 CLDN 유전자로부터의 30개 클라우딘 단백질 서열을 정렬하는데 사용되었다. 이러한 정렬의 결과가 도 2a에 계통수로서 도시되어 있다. 도면의 검토는, CLDN6 및 CLDN9가 계통수의 동일한 가지에 서로 인접하게 보여서 서열에 있어서 매우 밀접하게 관련되어 있음을 보여준다. 도 2a는 또한 CLDN4가 CLDN6에 다음으로 가장 밀접하게 관련된 계열 구성원임을 보여준다. 데이터의 보다 상세한 검토는 사람 CLDN6 단백질이 ECD1에서는 >98% 동일성으로 그리고 ECD2에서 >91% 동일성으로 세포외 도메인(ECD)에서 사람 CLDN9 단백질 서열에 매우 밀접하게 관련됨을 보여준다(도 2b). 사람 CLDN4는 또한 ECD1에서는 >84% 동일성으로 그리고 ECD2에서는 >78% 동일성으로 ECD 서열에서 인간 CLDN6에 매우 밀접하게 관련된 것으로 밝혀졌다(도 2b). 이러한 단백질 서열 관계에 기초하여, 사람 CLDN6 항원으로의 면역화가 사람 CLDN9와 또한 교차-반응성이고 아마도 또한 사람 CLDN4와 교차-반응성일 사람 CLDN6을 인지하는 항체를 생산할 것으로 가정하였다.
CLDN6, CLDN9 및 CLDN4의 종 오솔로그가 이들 다중반응성 클라우딘 항체를 스크리닝하기 위해 필요한지를 결정하기 위해, CLDN4, CLDN6 및 CLDN9의 ECD 서열을 하기 종들의 각각으로부터 분석하였다: 사람, 사이노몰거스 원숭이, 마우스 및 래트. 분석은 이용가능한 경우 AlignX 및 NCBI 데이터베이스 단백질 서열을 사용하여 수행하였다(사람, 마우스 및 래트 단백질의 NP 수탁 번호는 도 2c에 나타낸다). 대안으로, 단백질 서열은 사람 CLDN 개방 판독 프레임 서열의 BLAST에 의해 조립된 사이노몰거스 원숭이 CLDN 유전자 대 사이노몰거스 원숭이 전체 게놈 샷건(shotgun) 서열분석 콘틱(contig)의 번역으로부터 추론되었다. 이들 정렬의 검는 하기를 밝혔다: (1) CLDN4, CLDN6, 및 CLDN9 단백질에 대해 추론된 사이노몰거스 원숭이 단백질 ECD 서열은 각각의 사람 ECD 서열과 100% 동일하고; (2) 마우스 및 래트 CLDN9 ECD 서열은 사람 오솔로그 서열과 100% 동일하며; (3) 마우스 및 래트 CLDN4 및 CLDN6 ECD 서열은 서로 상이하고 각각의 사람 오솔로그와도 상이하다. 따라서, 사람 CLDN4, 사람 CLDN6, 사람 CLDN9, 마우스 CLDN4, 마우스 CLDN6, 래트 CLDN4 및 래트 CLDN6을 포함하는 7개의 작제물 세트의 생성은 모든 가능한 12개 오솔로그를 갖는 임의의 결합 도메인에 대한 교차-반응성의 결정을 가능하게 해야만 한다.
사람 CLDN6 , CLDN4 , 및 CLDN9 단백질을 암호화하는 DNA 단편.
사람 CLDN6(hCLDN6) 단백질에 속하는 본 발명에 유용한 분자 및 세포 물질을 생성하기 위해, NCBI 단백질 수탁 NP_067018과 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 합성하였다(IDT). 이러한 DNA 클론을 성숙 hCLDN6 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다. 유사하게, 사람 CLDN4(hCLDN4)에 대한 NCBI 단백질 수탁 NP_001296, 또는 사람 CLDN9(hCLDN9)에 대한 NCBI 단백질 수탁 NP_066192와 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 구입하였고 hCLDN4 또는 hCLDN9 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다.
마우스 CLDN6 및 CLDN4 단백질을 암호화하는 DNA 단편.
마우스 CLDN6(mCLDN6) 단백질에 속하는 본 발명에 유용한 분자 및 세포 물질을 생성하기 위해, NCBI 단백질 수탁 NP_061247과 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 합성하였다(IDT). 이러한 DNA 클론을 성숙 mCLDN6 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다. 유사하게, 마우스 CLDN4(mCLDN4)에 대한 NCBI 단백질 수탁 NP_034033과 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 구입하였고 성숙 mCLDN4 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다.
래트 CLDN6 및 CLDN4 단백질을 암호화하는 DNA 단편.
래트 CLDN6(rCLDN6) 단백질에 속하는 본 발명에 유용한 분자 및 세포 물질을 생성하기 위해, NCBI 단백질 수탁 NP_001095834와 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 합성하였다(IDT). 이러한 DNA 클론을 성숙 rCLDN6 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다. 유사하게, 래트 CLDN4(rCLDN4)에 대한 NCBI 단백질 수탁 NP_001012022와 동일한 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 단편을 구입하였고 성숙 rCLDN4 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적인 조작을 위해 사용하였다.
세포주 조작
상기 열거된 다양한 CLDN 단백질을 과발현하는 조작된 세포주를 당해 분야에 인지되어 있는 기술을 사용하여 HEK-293T 또는 3T3 세포주를 형질도입하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 작제하였다. 우선, 주형(template)으로서 상기 기술된 상업적으로 합성된 DNA 단편을 사용하여 목적하는 단백질(예를 들면, hCLDN6, mCLDN6, rCLDN6, hCLDN9, hCLDN4, mCLDN4, 또는 rCLDN4)을 암호화하는 DNA 단편을 증폭시키기 위해 PCR을 사용하였다. 이어서, 개별 PCR 생성물을 렌티바이러스 발현 벡터, pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(System Biosciences)의 다중 클로닝 부위(MCS)로 서브클로닝하여, 렌티바이러스 벡터의 묶음(suite)을 생성하였다. 생성된 pCDH-EF1-CLDN-T2A-GFP 벡터에서의 T2A 서열이 펩타이드 결합 축합의 리보솜 스킵핑(ribosomal skipping)을 촉진시켜, 2개의 독립적인 단백질의 발현을 초래한다: T2A 펩타이드의 특이적 CLDN 단백질 암호화된 업스트림의 고 수준 발현과 T2A 펩타이드의 GFP 마터 단백질 암호화된 다운스트림의 공동-발현. 이러한 묶음의 렌티바이러스 벡터를, 당해 분야의 숙련가들에게 익히 공지되어 있는 표준 렌티바이러스 형질도입 기술을 사용하여 개별 CLDN 단백질을 과발현하는 별도의 안정한 HEK-293T 또는 3T3 세포주를 생성하는데 사용하였다. CLDN-양성 세포는 고-발현 HEK-293T 서브클론을 사용한 FACS로 선택되었고, 이는 또한 GFP에 대해 강한 양성이었다.
실시예 3
항- CLDN 항체의 생성
CLDN6은 CLDN4 및 CLDN9와 가장 상동성이기 때문에(도 2a 및 상기 실시예 2에 기술된 바와 같은 분석을 참조한다), CLDN6을 다중반응성 항-CLDN 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하였다. 항체-생성 하이브리도마를 생산하기 위해, 마우스에 (실시예 4에 기술된 바와 같이 생성된) hCLDN6을 과발현하는 HEK-293T 세포 또는 3T3 세포를 접종하였다. 6마리의 마우스(하기 스트레인의 각각 2마리: Balb/c, CD-1, FVB)에 동등한 체적의 TiterMax® 애쥬번트로 유화된 1백만개의 hCLDN6-HEK-293T 세포를 접종하였다. 6마리 마우스(하기 스트레인의 각각 2마리: Balb/c, CD-1, FVB)의 별도의 2차 접종은 CLDN6을 과발현하는 3T3 세포를 사용하여 수행하였다. 초기 접종 후, 마우스를 동등한 체적의 명반 애쥬번트로 유화된 CLDN6을 과발현하는 세포로 4주 동안 매주 2회 주사하였다.
마우스를 희생시켰고, 배수 림프절(draining lymph node)(슬와, 서혜부, 및 내측 장골)을 절개하였고, 항체 생산성 세포용 공급원으로서 사용하였다. B 세포(305x106개 세포)의 단일 세포 현탁액을 모델 BTX Hybrimmune 시스템(BTX Harvard Apparatus)을 사용한 전기 세포 융합에 의해 1:1의 비로 비-분비성 P3x63Ag8.653 골수종 세포(ATCC #CRL-1580)과 융합시켰다. 세포를 하이브리도마 선택 배지: 아자세린(Sigma), 15% 태아 클론 I 혈청(Hyclone), 10% BM 콘디메드(Roche Applied Sciences), 1mM 나트륨 피루베이트, 4mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신, 50μM 2-머캅토에탄올 및 100μM 하이포크산틴이 보충된 DMEM 배지(Cellgro)에 재현탁시켰고, 3개의 T225 플라스크에서 플라스크당 90mL 선택 배지 중에서 배양하였다. 상기 플라스크를 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 습윤화된 37℃ 인큐베이터에 6일 동안 두었다. 라이브러리를 CryoStor CS10 완충액(BioLife Solutions)의 6개 바이알에서 바이알당 대략 15x106개 생존 세포로 동결시키고, 액체 질소 내에 보관하였다.
라이브러리로부터의 하나의 바이알을 37℃에서 해동시켰고, 동결된 하이브리도마 세포를 상기 기술된 90mL 하이브리도마 선택 배지에 가하였고, T150 플라스크에 넣었다. 세포를 5% CO2 및 95% 공기를 갖는 습윤화된 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 다음날 하이브리도마 세포를 플라스크로부터 수집하였고, 웰당 1개의 세포를 (FACSAria I 세포 분류기를 사용하여) 200㎕의 보충된 하이브리도마 선택 배지에 48개 Falcon 96-웰 U-저면 플레이트에 플레이팅하였다. 하이브리도마를 10일 동안 배양하였고, 상청액을 유동 세포측정법을 사용하여 hCLDN6, hCLDN4 또는 hCLDN9 단백질에 특이적인 항체에 대해 스크리닝하였다. 유동 세포측정법을 하기와 같이 수행하였다: hCLDN6, hCLDN4 또는 hCLDN9를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 안정하게 형질도입된, 웰당 1x105개의 HEK-293T 세포를 100㎕ 하이브리도마 상청액과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/2% FCS로 세척하였고, 이어서, 샘플당 50㎕의 PBS/2% FCS 중에 1:200로 희석된 DyeLight 649 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 15분 후, 인큐베이션 세포를 PBS/2% FCS로 2회 세척하였고, (죽은 세포를 검출하기 위해) PBS/2% FCS 중에 DAPI와 함께 재현탁시켰고, 이소타입 대조군 항체로 염색된 세포의 형광성을 초과하는 형광성에 대해 유동 세포측정법으로 분석하였다. CLDN 항원 중의 하나 이상에 대해 지시된 항체에 대해 양성인 것으로 시험된 선택된 하이브리도마를 추가의 특성확인을 위해 확보해 두었다. 나머지 미사용 하이브리도마 라이브러리 세포를 추가의 라이브러리 시험 및 스크리닝을 위해 액체 질소에서 동결시켰다.
실시예 4
항- CLDN 항체의 서열분석
항-CLDN 항체를 상기 기술된 바와 같이 생성하였고, 이어서, 하기와 같이 서열분석하였다. 총 RNA를 RNeasy Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 선택된 하이브리도마 세포로부터 정제하였다. 샘플당 104 내지 105개의 세포를 사용하였다. 단리된 RNA 샘플을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 각각의 하이브리도마의 Ig 중쇄의 가변 영역을 모든 마우스 Ig 이소타입에 대해 특이적인 3' 마우스 Cγ 프라이머와 함께 완전 마우스 VH 레퍼토리를 표적화하도록 고안된 86개 마우스 특이적 선도 서열 프라이머를 포함하는 5' 프라이머 믹스를 사용하여 증폭시켰다. 유사하게, 카파 경쇄를 증폭시키고 서열분석하기 위해, 각각의 VK 마우스 계열을 증폭시키도록 고안된 64개의 5' VK 선도 서열을 함유하는 2개의 프라이머 믹스를 마우스 카파 불변 영역에 대해 특이적인 단일 역방향 프라이머와 함께 사용하였다. VH 및 VL 전사체를 하기와 같이 Qiagen One Step RT-PCR 키트를 사용하여 100ng의 총 RNA로부터 증폭시켰다. VK 경쇄에 대해 2개, VH 중쇄에 대해 2개로 하여 각각의 하이브리도마에 대해 총 4개의 RT-PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 혼합물은 1.5㎕의 RNA, 0.4㎕의 100μM 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머(IDT에 의해 주문 합성됨), 5㎕의 5x RT-PCR 완충액, 1㎕ dNTPs, 및 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 효소 믹스 0.6㎕를 포함하였다. 유전자 증폭기(thermal cycler) 프로그램은 하기 단계들을 포함하였다: RT 단계 50℃에서 60분, 95℃에서 15분에 이어서 (94.5℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분)의 35회 사이클, 및 72℃에서 10분의 최종 인큐베이션. 추출된 PCR 생성물을 상기 기술된 바와 동일한 특이적 가변 영역 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 및 서열분석 서비스를 위해 외부 서열분석 판매처(MCLAB)로 보내었다.
도 3a는 항-CLDN 항체로부터의 몇몇의 신규한 마우스 경쇄 가변 영역의 연속한 아미노산 서열들을 도시한다(서열번호 21 내지 서열번호 57, 홀수). 도 3b는 동일한 항-CLDN 항체로부터의 신규한 마우스 중쇄 가변 영역의 연속한 아미노산 서열들을 도시한다(서열번호 23 내지 서열번호 59, 홀수). 마우스 경쇄 및 중쇄 가변 영역 핵산 서열이 도 3c에 제공된다(서열번호 20 내지 서열번호 58, 짝수). 종합하면, 도 3a 및 도 3b는 SC27.1, SC27.22, SC27.103, SC27.104, SC27.105, SC27.106, SC27.108(SC27.109와 동일함), SC27.201, SC27.203 및 SC27.204라고 명명되는 10개의 마우스 항-CLDN 항체의 주해가 달린 서열을 제공한다. 아미노산 서열에, 카바트에 따라 정의된 프레임워크 영역(즉, FR1 내지 FR4) 및 상보성 결정 영역(즉, 도 3a의 CDRL1 내지 CDRL3 또는 도 3b의 CDRH1 내지 CDRH3)을 확인하기 위해 주해를 달았다. 가변 영역 서열을 Abysis 데이터베이스의 전매특허 버젼을 사용하여 분석하여 CDR 및 FR 명칭을 제공하였다. CDR이 카바트에 따라 번호매겨져 있지만, 당해 분야 숙련가들은 CDR 및 FR 명칭은 또한 초티아, 맥칼럼 또는 기타의 다른 허용되는 명명법 시스템에 따라 정의될 수 있음을 이해할 것이다.
각각의 특정 항체의 서열번호는 순차적인 홀수이다. 따라서, 모노클로날 항-CLDN 항체, SC27.1은 각각 VL 및 VH에 대해 아미노산 서열번호 21 및 서열번호 23을 포함하고; SC27.22는 서열번호 25 및 서열번호 27 등을 포함한다. 각각의 항체 아미노산 서열에 대한 상응하는 핵산 서열은 도 3c에 포함되어 있고, 상응하는 아미노산 서열번호 바로 앞의 서열번호를 갖는다. 따라서, 예를 들면, SC27.1 항체의 VL 및 VH의 핵산 서열의 서열번호는 각각 서열번호 20 및 서열번호 22이다.
실시예 5
키메라 및 사람화된 항- CLDN 항체의 생성
키메라 항-CLDN 항체는 하기와 같이 당해 분야에 인지되어 있는 기술들을 사용하여 생성하였다. 표준 생화학적 기술을 이용하여 항-CLDN 항체-생산성 하이브리도마로부터 총 RNA를 추출하였고, RNA를 PCR 증폭시켰다. 마우스 항체의 VH 및 VL 쇄의 V, D 및 J 유전자 분절에 관한 데이터를 본 발명의 항-CLDN 항체의 핵산 서열로부터 수득하였다(핵산 서열에 대해 도 3c를 참조한다). 항체의 VH 및 VL 쇄의 프레임워크 서열에 대해 특이적인 프라이머 세트를 하기의 제한 부위들을 사용하여 고안하였다: VH 단편에 대해 AgeI 및 XhoI, 및 VL 단편에 대해 XmaI 및 DraIII. PCR 생성물을 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하였고, 이어서, VH 단편에 대해 제한 효소 AgeI 및 XhoI 그리고 VL 단편에 대해 XmaI 및 DraIII로 분해시켰다. VH 및 VL 분해된 PCR 생성물을 정제하였고, 각각 IgH 또는 IgK 발현 벡터로 라이게이션하였다(ligated). 라이게이션(ligation) 반응은 200U T4-DNA 리가제(New England Biolabs), 7.5㎕의 분해되고 정제된 유전자-특이적 PCR 생성물 및 25ng 선형화된 벡터 DNA를 합하여 총 10㎕ 체적으로 수행하였다. 적격(competent) 이. 콜라이 DH10B 박테리아(Life Technologies)를 42℃에서 가열 충격(heat shock)을 통해 3㎕ 라이게이션 생성물로 형질전환시켰고, 100㎍/mL의 농도로 암피실린 플레이트에 플레이팅하였다. 증폭된 라이게이션 생성물의 정제 및 분해 후, VH 단편을 HuIgG1(pEE6.4HuIgG1)을 포함하는 pEE6.4 발현 벡터(Lonza)의 AgeI-XhoI 제한 부위에 클로닝하였고, VL 단편을 사람 카파 경쇄 불변 영역(pEE12.4Hu-카파)을 포함하는 pEE12.4 발현 벡터(Lonza)의 XmaI-DraIII 제한 부위에 클로닝하였다.
키메라 항체를 HEK-293T 또는 CHO-S 세포를 pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터로 공동-형질감염시킴으로써 발현시켰다. 형질감염 전에 10% 가열 불활성화된 FCS, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 100U/mL 페니실린 G가 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 표준 조건 하에 150mm 플레이트에서 HEK-293T 세포를 배양하였다. 일시적인 형질감염을 위해, 세포를 80% 컨플루언시(confluency)로 성장시켰다. pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 벡터 DNA의 각각 2.5㎍을 1.5mL Opti-MEM 중의 10㎕ HEK-293T 형질감염 시약에 가하였다. 상기 믹스를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였고 세포에 가하였다. 형질감염 후 3일 내지 6일째에 상청액을 수거하였다. CHO-S 세포의 경우, pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 벡터 DNA의 각각 2.5㎍을 400㎕ Opti-MEM 중의 15㎍ PEI 형질감염 시약에 가하였다. 상기 믹스를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였고 세포에 가하였다. 형질감염 후 3일 내지 6일째에 상청액을 수거하였다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 배양 상청액은 800xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해로부터 제거하였고 4℃에서 보관하였다. 재조합 키메라 항체를 단백질 A 비드로 정제하였다.
마우스 항-CLDN 항체를 전매 컴퓨터-보조된 CDR-절편이식 방법(Abysis Database, UCL Business) 및 표준 분자 조작 기술을 사용하여 하기와 같이 사람화하였다. 가변 영역의 사람 프레임워크 영역을 프레임워크 서열과 사람 생식선 항체 서열의 CDR 정규 구조 사이, 및 프레임워크 서열과 관련 마우스 항체의 CDR 사이의 가장 높은 상동성에 기초하여 고안하였다. 분석의 목적을 위해, 각각의 CDR 도메인에 대한 아미노산의 할당은 카바드 번호매김에 따라 이루어졌다. 일단 가변 영역이 선택되면, 이들을 합성 유전자 분절(Integrated DNA Technologies)로부터 생성하였다. 사람화된 항체를 키메라 항체에 대해 상기 기술된 분자적 방법을 사용하여 클로닝 및 발현시켰다.
사람화된 항체의 VL 및 VH 아미노산 서열은 상응하는 마우스 항체의 VL 및 VH 서열로부터 유도되었다(예를 들면, hSC27.1은 마우스 SC27.1로부터 유도된다). 생성된 4개의 사람화된 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 만들어진 프레임워크 변화 또는 역 돌연변이는 존재하지 않았다: hSC27.1, hSC27.22, hSC17.108 및 hSC27.204.
안정성 문제를 해결하기 위해, hSC27.22의 3개의 변이체를 동일한 VH1 계열에서 상이한 VH 프레임워크를 사용하여 생산하였다. 변이체들은 hSC27.22-VH1-8; hSC27.22-VH1-46; hSC27.22-VH1-69라고 명명하였다. 또한, hSC27.108의 하나의 변이체를 작제하여 hSC27.108v1이라고 명명하였고, 이는 hSC27.108(서열번호 119)과 동일한 중쇄를 공유하지만 hSC27.108과 비교하여 경쇄가 다르다. 또한, hSC27.204의 몇몇의 변이체를 hSC27.204v15를 통해 생성하여 hSC27.204v1이라고 명명하였고, 이들 모두는 동일한 경쇄(서열번호 120)를 공유하지만 중쇄가 다르다. hSC27.204 및 hSC27.204v4의 중쇄는 단일 프레임워크 영역 돌연변이, T28D에 있어서 상이하다. 안정성 문제를 해결하기 위해, hSC27.204v1 내지 hSC27.204v3 및 hSC27.204v5 내지 hSC27.204v7은 CDR에 보존적 돌연변이를 도입한다. 구체적으로, hSC27.204v1, hSC27.204v2, 및 hSC27.204v3은 hSC27.204 중쇄 배경에 각각 변형 N58K, N58Q, 및 T60N을 함유한다. 유사하게, hSC27.204v5, hSC27.204v6, 및 hSC27.204v7은 hSC27.204v4 배경에 각각 변형 N58K, N58Q, 및 T60N을 함유한다. 마지막으로, 변이체 hSC27.204v8 및 hSC27.204v9는 면역원성을 최소화하기 위해 중쇄의 위치 93에 역 돌연변이를 포함하지 않는다. 구체적으로, 변이체 8-15에 A93T 역 돌연변이가 결여되어 있음을 제외하고는 변이체 hSC27.204v8, hSC27.204v9, hSC27.204v10, hSC27.204v11, hSC27.204v12, hSC27.204v13, hSC27.204v14, 및 hSC27.204v15는 각각 변이체 hSC27.204, hSC27.204v1, hSC27.204v2, hSC27.204v3, hSC27.204v4, hSC27.204v5, hSC27.204 6, 및 hSC27.204v7에 상응한다.
또한, hSC27.22 사람화된 항체 불변 영역의 9개의 변이체를 작제하였다. 제1 변이체, hSC27.22ss1은 부위 특이적 변이체이고, 하기 실시예 8에 보다 상세하게 기술되어 있다. 다른 변이체는 IgG 이소타입을 IgG2("hSC27.22 IgG2"라고 함) 또는 IgG4의 돌연변이된 형태("hSC27.22 IgG4 R409K"; "hSC27.22 IgG4 S228P"; "hSC27.22 IgG4 S228P K370E R409K"; "hSC27.22 IgG4 K370E"; "hSC27.22 IgG4 S228P K370E"; "hSC27.22 IgG4 C127S S228P"; "hSC27.22 IgG4 C127S K370E"; 및 "hSC27.22 IgG4 C127S S228P K370E"라고 명명함)로 치환함으로써 작제하였다. 하기 표 4는 카바트 등에 따라 번호매김된 잔기 변화를 갖는 사람화된 항 CLDN 항체 및 이들의 변이체의 요약을 보여준다.
각각의 경우에, 사람화된 항체의 결합 친화도는 상응하는 마우스 항체와 실질적으로 동등하였음을 확실히 하기 위해 사람화된 항체의 결합 친화도를 확인하였다. 도 3a는 예시적인 사람화된 항체 및 이들의 변이체의 VL의 연속한 아미노산 서열을 도시한다. 도 3b는 예시적인 사람화된 항체 및 이들의 변이체의 VH의 연속한 아미노산 서열을 도시한다. 항-CLDN 사람화된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 도 3c에 제공된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
상기 언급된 항체 또는 이의 면역반응성 단편의 각각은 본 개시에 따라 CLDN CAR 결합 도메인을 제공하기 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 6
항- CLDN 항체의 특이성
실시예 3에 기술된 바와 같이 생성된 마우스 항체를 특성확인하여 이들이 CLDN 계열 구성원 및 CLDN 계열 구성원의 오솔로그와 교차 반응하였는지를 결정하였다.
유동 세포측정 분석을 하기와 같이 수행하였다: HEK-293T 세포를 (i) hCLDN6, mCLDN6, 및 rCLDN6을 암호화하는 렌티바이러스 벡터; (ii) hCLDN9; 또는 (iii) 상기 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조된 hCLDN4, mCLDN4 및 rCLDN4로 안정하게 형질도입하였다. 상기 언급된 발현 작제물로 안정하게 형질도입된 1x105개의 HEK-293T 세포를 50㎕ 최종 체적의 PBS/2% FCS에 10㎍/ml로 희석한 hSC27.1 또는 hSC27.22 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 200㎕ PBS/2% FCS로 세척하였고, 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 상청액은 버리고, 세포 펠렛을 샘플당 50㎕의 PBS/2% FCS 중에 1:200로 희석된 DyeLight 649 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 2차 항체에 재현탁시켰다. 4℃에서 15분의 인큐베이션 후, 세포를 이전에 기술한 바와 같이 PBS/2% FCS로 세척하였고, 2회 펠렛화하였고, 2㎍/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)를 갖는 100㎕ PBS/2% FCS 중에 재현탁시켰다. 샘플을 유동 세포측정법으로 분석하였고, 살아있는 세포를 이소타입 대조군 항체로 염색된 세포의 형광도를 초과하는 형광도에 대해 DyeLight 649로 평가하였다.
상기 기술된 유동 세포측정 검정은 다수의 항-CLDN 항체의 동정을 초래하였다. 교차 반응성은 명시된 CLDN 계열 구성원을 특이적으로 과발현하는 세포주에 대한 항체의 결합 대 FMO(fluorescence minus one) 이소타입-대조군(회색으로 채워짐)을 사용하여 측정된 신호에 대한 기하 평균 형광 강도의 변화(ΔMFI)에 기초하여 측정하였다(도 4a). 따라서, 2개의 hCLDN6-결합 항체 SC27.1 및 SC27.22가 클라우딘 다중반응성 항체로서 기술될 수 있고, 그 이유는 이들이 이러한 검정에서 사람 CLDN 계열의 3개의 구성원: hCLDN6, hCLDN4 및 hCLDN9. SC27.1 및 CLDN4 및 CLDN9의 마우스 및 래트 오솔로그에 또한 결합된 SC27.22 항체와 교차 반응하기 때문이다(데이터는 나타내지 않음).
다양한 추가의 마우스 항체가 CLDN 계열 구성원에 결합하는 능력을 시험하기 위해, 10㎍/mL의 정제된 1차 항-CLDN 항체, 또는 마우스 IgG2b 대조군 항체와 인큐베이션하였고, 이어서, Alexa 647 항-마우스 2차 항체와 인큐베이션한 사람 CLDN4, CLDN6 또는 CLND9를 과발현하는 세포주를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 모든 항체가 CLDN6에 결합되었지만, 일부는 CLDN6-특이적이고(예를 들면, SC27.102, SC27.105, 및 SC27.108), 나머지는 다중반응성이며 CLDN6와 CLDN9 둘 다에 결합하거나(예를 들면, SC27.103 및 SC27.204), CLDN6와 CLDN4에 결합하였다(예를 들면, SC27.104). 따라서, 광범위한 다중반응성 결합 프로파일이 본 발명의 항체에 대해 수득되었다.
CLDN6 및 CLDN9에 대한 다중반응성 항-CLDN 항체의 겉보기 결합 친화도를 비교하기 위해, 유동 세포측정법을 사람화된 항-CLDN 항체 hSC27.22의 일련의 희석물로 수행하였다. 항체를 50pg/ml 내지 100㎍/ml 범위의 농도로 일련 희석시켰고, CLDN6 또는 CLDN9를 과발현하는 HEK-293T 세포를 함유하는 96웰 플레이트에 가하였고, 빙상에서 1시간 동안 유지하였다. 2차 항-사람 항체(Jackson ImmunoResearch Cat. # 109-605-098)를 가하였고, 암소에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS에서 2회 세척하였고, 그 후 Fixable Viability 염료(eBioscience Cat # 65-0863-14)를 10분 동안 가하였다. PBS로의 추가 세척 후, 세포를 파라포름알데하이드(PFA)로 고정화하였고, 제조업자의 지침에 따라 BD FACS Canto II 유동 세포측정기에서 판독하였다. MFI 값을 제조업자의 지침에 따라 형광 미소구체(Bangs Laboratories)를 사용하여 정규화하였다. CLDN6 또는 CLDN9 발현 세포에 대한 항체의 결합에 대해 관찰된 정규화된 최대 MFI 값을, 다음 방정식을 사용하여 데이터를 각각의 과발현 세포에 대한 분획 최대 결합으로 변환시키는데 사용하였다: 분획 최대 결합 = (관찰된 정규화된 MFI / 최대 정규화된 MFI). 이어서, 각각의 세포주에 대한 hSC27.22의 결합에 대한 겉보기 EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어 패키지(La Jolla, CA)에서 공급된 log (억제제) 대 반응 모델에 대해 피팅(fitting)된 4개 파라미터 변수 기울기 곡선을 사용하여 계산하였다. 도 4c는 사람화된 다중반응성 항-CLDN6 항체, hSC27.22가 CLDN9에 대한 것과 실질적으로 동일한 CLDN6에 대한 겉보기 EC50을 가짐을 보여준다. (겉보기 EC50 CLDN6 - 3.45㎍/mL (적합도에 대한 r2 = 0.9987, 99% 신뢰 구간: 2.51 - 4.75㎍/mL); 겉보기 EC50 CLDN9 - 4.66㎍/mL (적합도에 대한 r2 = 0.9998, 99% 신뢰 구간: 4.09 - 5.31㎍/mL)).
따라서, 개시된 CAR의 결합 도메인은 원하는 치료학적 지수에 따라 선택된 CLDN 단백질(예를 들면, CLDN6)과 또는 CLDN 단백질들의 조합(예를 들면, CLDN6 및 CLDN9)과 회합하도록 조정될 수 있다.
실시예 7
항- CLDN 키메라 항원 수용체의 생성
항- CD19 CAR의 제조
양성 대조군 CAR 작제물을 생성하기 위해, 사람 CD19(US2014/021635 참조)에 대해 지시된 제2 세대 CAR을 암호화하는 합성 개방 판독 프레임을 합성하였고(Life Technologies), 렌티바이러스 발현 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(System Biosciences, Mountain View CA)의 다중 클로닝 부위(MCS)에 서브클로닝하였다. 이어서, CD19 CAR 작제물의 발현은 CMV 프로모터에 의해 유도되고, 한편, 바이시스트로닉(bicistronic) GFP-T2A-Puro 개방 판독 프레임은 GFP 발현의 분석(예를 들면, 현미경 또는 FACS) 및 항생제 퓨로 마이신을 이용한 세포의 선택에 의해 형질 도입된 세포의 검출을 허용한다. 항-CD19 CAR 개방 판독 프레임은 사람 CD8 알파 쇄(아미노산 1 내지 21, UniProt 수탁 P01732-1)로부터의 신호 리더 서열을 암호화하는 5'에서 3'까지의 뉴클레오타이드, 사람 CD19를 인식하는 마우스 모노클로날 항체로부터 유도된 scFv(Nicholson et al, 1997; PMID 9566763), 사람 CD8 알파 힌지, 막관통 도메인 및 근위 영역(아미노산 138 내지 206, UniProt 수탁 P01732-1), 사람 4-1BB 단백질로부터의 세포내 공동-자극 신호전달 영역(아미노산 214 내지 255, UniProt 수탁 Q07011-1) 및 사람 CD3ζ 쇄 세포내 신호전달 영역(아미노산 52 내지 164, UniProt 수탁 P20963-1)을 포함한다. 양성 대조군을 제공하는 것 이외에, 항-CD19 CAR/렌티바이러스 발현 벡터는 항-CD19 scFv 구성성분이 임의의 선택된 결정인자에 대한 대안의 결합 영역 구성성분으로 쉽게 제거되고 치환될 수 있는 방식으로 제한 효소로 고안되었다. 하기 기술되는 바와 같이, 도 5에 나타낸 이러한 카세트(cassette) 시스템(SCT1-XX, 여기서, XX는 특정 CLDN 결합 도메인 구성성분을 나타낸다)을 사용하여 본 발명의 다양한 실시형태를 검증하였다. SCT 명명법은 문맥에 따라, 발현된 항-CLDN CAR 단백질, CAR 단백질을 발현하는 세포독성 림프구, 항-CLDN CAR ORF 또는 문맥에 따라 동일한 ORF를 포함하는 발현 벡터(예를 들면, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 등)를 나타낼 수 있음에 주의한다.
SCT1 - h27 .108의 제조
신규한 항-CLDN CAR 작제물(SCT1-h27.108)을 생성하기 위해, 오량체성 다량체 GlyGlyGlyGlySer (G4S)3 (GGGGSGGGGSGGGGS; 서열번호 3) 링커를 통해 항-hSCh27.108 VL(서열번호 68) 및 VH(서열번호 70) 뉴클레오타이드 서열을 함께 작동가능하게 링크시킴으로써 우선 scFv 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성하여 hSC27.108-scFv 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하였고:
GAAATCGTGCTTACACAATCCCCTGCCACTCTGAGCCTTTCTCCAGGCGAGCGAGCAACCCTTTCCTGCAGTGTTTCCTCTTCAATCAGTTCCAGCAATTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGTCAGGCACCCCGATTGTTGATCTATGGCACATCTAACCTGGCCAGCGGCATCCCTGCTCGGTTCAGTGGATCTGGCTCCGGAACAGATTTCACTCTCACTATCAGCTCCCTTGAGCCTGAAGATTTTGCCGTGTACTACTGTCAGCAATGGAGTTCCTACCCCCACACCTTTGGCGGCGGGACAAAGGTCGAGATAAAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTCAGGTACAGCTGGTCCAGTCCGGCGCTGAGGTTAAGAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAGGTATCTTGTAAGGCCTCAGGTTACACCTTTACAAATTATCTGATCGAATGGGTGAGACAGGCCCCAGGTCAGGGTCTGGAATGGATGGGACTCATCAACCCTGGGAGTGGCGGGACCAACTACAACGAAAAGTTTAAGGGGAGAGTGACAATGACCACAGATACCAGTACCTCCACCGCATATATGGAGCTGCGAAGCTTGAGGTCCGATGACACTGCTGTGTACTATTGCGCCCGTAGAAGCCCACTCGGGTCTTGGATCTATTACGCATACGATGGTGTGGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCCTCG (서열번호 4)
이는 바로 아래에 제시되는 아미노산 서열을 암호화하고:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPHTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRSPLGSWIYYAYDGVAYWGQGTLVTVSS (서열번호 5)
여기서, scFv는 서열번호 69에 제시되는 VL 아미노산 서열 및 서열번호 71에 제시되는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
표준 분자 조작 기술을 이용하여, hSC27.108-scFv 뉴클레오타이드 서열을 SCT1 카세트에 후속적으로 클로닝하여 항-CLDN CAR을 포함하는 SCT1-h27.108 렌티바이러스 발현 벡터를 제공하였다. 이와 관련하여, SCT1-27.108 CAR은 5'에서 3'까지 하기 요소들을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함한다: CD8 알파 쇄 리더 영역(아미노산 1 내지 21, UniProt P01732-1), h27.108 VL 도메인(실시예 5에 따름), (G4S)3 합성 링커 서열(아미노산 1 내지 15, Huston et al., 1988), h27.108 VH 도메인(실시예 5에 따름), 사람 CD8 알파 힌지 및 막관통 도메인(아미노산 138 내지 206, UniProt 수탁 P01732-1), 사람 4-1BB 단백질로부터의 세포내 공동-자극 신호전달 영역(아미노산 214 내지 255, UniProt 수탁 Q07011-1) 및 사람 CD3ζ 쇄 세포내 신호전달 영역(아미노산 52 내지 164, UniProt 수탁 P20963-1). CAR 개방 판독 프레임은 확인된 서열이었다. SCT1-h27.108 CAR 개방 판독 프레임의 도식적 다이아그램은 도 5에 제시되고, 상응하는 핵산 서열은 도 6a(서열번호 8)에 제시되고 얻어진 아미노산 서열은 도 6b(서열번호 9)에 제시된다.
SCT1 - h27 .204 v2 의 제조
신규한 항-CLDN CAR 작제물(SCT1-h27.204v2)을 생성하기 위해, 오량체성 다량체 GlyGlyGlyGlySer (G4S)3 (GGGGSGGGGSGGGGS; 서열번호 3) 링커를 통해 항-hSCh27.204 VL(서열번호 72) 및 VH(서열번호 86) 뉴클레오타이드 서열을 함께 작동가능하게 링크시킴으로써 우선 scFv 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성하여 hSC27.204v2-scFv 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하였고:
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCTTCCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCGGCCAGAACGTGGGCACCTCTGTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGTCCCTGATCTACTCCGCCTCCTACAGATACTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACATCACCTACCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCCGGTACTGGATGTCCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGAGATCAACCCCGACTCCTCCACCATCCAGTACACCCCCAGCCTGAAGGCCCGGTTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTACCGGCCCTGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCT (서열번호 6)
이는 바로 아래에 제시되는 아미노산 서열을 암호화하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVGTSVAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYITYPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVSEINPDSSTIQYTPSLKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTGPAYWGQGTLVTVSS (서열번호 7)
여기서, scFv는 서열번호 73에 제시되는 VL 아미노산 서열 및 서열번호 87에 제시되는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
표준 분자 조작 기술을 이용하여, hSC27.204v2-scFv 뉴클레오타이드 서열을 SCT1 카세트에 후속적으로 클로닝하여 항-CLDN CAR을 포함하는 SCT1-h27.204v2 렌티바이러스 발현 벡터를 제공하였다. 이와 관련하여, SCT1-27.204v2 CAR은 5'에서 3'까지 하기 요소들을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함한다: CD8 알파 쇄 리더 영역(아미노산 1 내지 21, UniProt P01732-1), h27.204 VL 도메인(실시예 5에 따름), (G4S)3 합성 링커 서열(아미노산 1 내지 15, Huston et al., 1988), h27.204v2 VH 도메인(실시예 5에 따름), 사람 CD8 알파 힌지 및 막관통 도메인(아미노산 138 내지 206, UniProt 수탁 P01732-1), 사람 4-1BB 단백질로부터의 세포내 공동-자극 신호전달 영역(아미노산 214 내지 255, UniProt 수탁 Q07011-1) 및 사람 CD3ζ 쇄 세포내 신호전달 영역(아미노산 52 내지 164, UniProt 수탁 P20963-1). CAR 개방 판독 프레임은 확인된 서열이었다. SCT1-h27.204v2 CAR 개방 판독 프레임의 도식적 다이아그램은 도 5에 제시되고, 상응하는 핵산 서열은 도 6c(서열번호 10)에 제시되고 얻어진 아미노산 서열은 도 6d(서열번호 11)에 제시된다.
실시예 8
렌티바이러스 벡터 입자의 생성 및 특성확인
SCT1-h27.108 및 SCT1-h27.204v2의 렌티바이러스 벡터 패키징(packaging)을 하기와 같이 수행하였다: 10ug의 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 플라스미드, 7ug의 pΔR8.74, 및 4ug의 pMD2.G를 1:4의 DNA:PEI 비로 폴리에틸레네민(Polysciences)의 존재 하에 1000만개의 HEK-293T 세포(ATCC)에 공동-형질감염시켰다. 공동-형질감염된 세포를 37℃(5% CO2)에서 밤새 인큐베이션하였고, 이어서, 다음날 배지 교환하였다. 형질감염 48시간 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배양 배지를 수거하였고, 4℃에서 1200rpm로 5분 동안 원심분리함으로써 청징화하여 세포 잔해를 제거하였다. 렌티바이러스 벡터 입자를 펠렛화하기 위해, 청징화된 배양 배지를 4℃에서 19500rpm으로 2시간 동안 초원심분리하였다. 초원심분리 후, 상청액을 버렸고, 바이러스 펠렛을 멸균 PBS에 재현탁시켰고, -80℃에서 보관하였다. 회수된 렌티바이러스 벡터 스톡(stock)의 정량화는 p24 ELISA(Cell Biolabs)에 의해 평가하였고, 유전자-전이 효율(기능적 역가)은 표준 렌티바이러스 벡터 적정 방법에 의해 평가하였다. 렌티바이러스 벡터 스톡의 전형적인 수율은 p24 항원의 7 내지 15ug/ml 범위였고, 기능적 역가는 1 내지 3 x 10e8 TU/ml의 범위였다. SCT1-h27.108 및 SCT1-27.204v2 렌티바이러스 벡터 스톡을 사용하기 전까지 동결시켜 보관하였다.
후속적 실시예에 제시되는 바와 같이, 벡터 스톡은, 본 출원에 걸쳐 상세하게 논의되고 본원에 첨부된 도 7에 도식적으로 나타낸 바와 같이 감작화된 림프구를 생성하여 원하는 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.
실시예 9
SCT1 - h27 .108 및 SCT1 - h27 .204 v2 CAR 작제물을 발현하는 T 림프구의 생성
효과적인 바이러스 형질도입을 확실히 하기 위해, 10ug/ml의 폴리브렌(EMD Millipore)의 존재 하에 약 4의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)로 이전의 실시예로부터의 SCT1-h27.108 또는 SCT1h27.204v2 렌티바이러스 벡터를 이용하여 100만개의 Jurkat E6-1(ATCC) T 림프구 세포를 형질도입함으로써 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2를 발현하는 CLDN 표적-특이적 Jurkat 림프구를 생성하였다. 상기 세포를 렌티바이러스 입자의 존재 하에 37℃(5% CO2)에서 72시간 동안 인큐베이션하도록 하였다. 그 후, SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2-발현 세포에 대해 양성적으로 선택하기 위해, 소비된 배지를 2ug/ml 퓨로마이신(Life Technologies)을 함유하는 신선한 배지로 교환하였다. 유동 세포측정법에 의한 세포 표면 상의 항-CLDN scFv의 존재를 추론(도 8a)하기 전에 세포를 퓨로마이신의 존재 하에 추가의 5일 동안 인큐베이션하도록 하였다. 보다 구체적으로는, 이어서, SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2를 발현하는 형질도입된 Jurkat 세포 및 비-형질도입된 대조군 세포를 펠렛화하였고, 세척하였고, 본원에 기술된 바와 같은 완충액에 재현탁시켰다. 이어서, 상기 조제는 제조업자의 지침에 따라 BD FACS Canto II 유동 세포측정기 상에서 분석하여 GFP의 존재를 검출하였고, 이에 따라 도 8a에서 입증되는 바와 같이, SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204의 발현이 추론되었다.
또한, 유동 세포측정법을 이용하여, 본 발명의 CAR 작제물을 특성확인하는데 사용되는 hCLDN6(도 8b)을 과발현하는 조작된 HEK-293T 세포주의 표면 상의 hCLDN6 단백질의 존재를 검출하였다. 이와 관련하여, HEK-293T 모 세포 또는 hCLDN6을 과발현하는 HEK-293T 세포를 수거하였고, Versene(Life Technologies)를 이용하여 단일 세포 현탁액으로 단리하였다. 단리된 세포를 상기 기술된 바와 같이 세척하였고, PBS/2% FCS 중에서 3회 세척하기 전에 1마이크로그램의 항-CLDN6 항체와 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 세포를 샘플당 50㎕의 PBS/2% FCS 중에 1:200 희석된 AlexaFluor-647 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 2차 항체(Life Technologies)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였고, PBS/2% FCS로 3회 세척하였고, (살아있는 세포를 검출하기 위해) PBS/2% FCS 중에 DAPI와 함께 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포를 제조업자의 지침에 따라 BD FACS Canto II 유동 세포측정기 상에서 분석하여 도 8b에 제시되는 데이터를 제공하였다.
도 8a 및 도 8b는 각각 형질도입된 Jurkat T 림프구 상에 SCT1-27.108 및 SCT1-h27.204v2가 발현되지만 비-형질도입된 Jurkat 세포 상에서는 발현되지 않음을 입증하고, 조작된 HEK-293T 세포 상에서는 사람 CLDN6 단백질이 발현되지만 HEK-293T-나이브 세포 상에서는 발현되지 않음을 입증한다.
실시예 10
Jurkat - SCT1 - h27 .108 또는 SCT1 - h27 .204 v2 T 림프구는 hCLDN 발현 세포와의 접촉시 IL-2 생산을 유도한다
형질도입된 Jurkat-SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 림프구를, IL-2 유도를 측정함으로써 표적-특이적 활성에 대해 평가하였고, 이는 CAR 매개된 T-세포 활성화를 나타낸다. 보다 구체적으로, 이전 실시예로부터의 hCLDN6을 발현하는 형질도입된 Jurkat 림프구 및 조작된 293T 세포를 이용하여, CAR 발현 림프구가 활성화되고 hCLDN6을 발현하는 세포와의 접촉시 면역 반응을 나타냄을 입증하기 위해 IL-2 수준을 모니터링하였다.
이와 관련하여, 실시예 9로부터의 Jurkat-SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 림프구를, 유동 세포측정법에 의해 입증되는 바와 같이 세포 표면 상에 hCLDN6 항원을 과-발현시키도록 조작된 HEK-293T 세포와 함께 공동-배양하였다. 림프구와 표적 HEK-293T-hCLDN 세포와의 공동-배양은 도 9a에 제시되는 기술된 림프구 대 표적 세포(L:T) 비율로 수행하여 용량 반응을 평가하고 최대 IL-2 생산 조건을 결정하였다. 공동-배양물을 37℃(5% CO2)에서 48시간 동안 인큐베이션하였고, 그 후, 배지를 수거하였고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 잔해를 청징화하였다. 이어서, 청징화된 상청액을 제조업자의 지침에 따라 ELISA(Thermo Scientific)에 의해 IL-2 생산에 대해 평가하였다. 배경 IL-2 생산을 평가하기 위해, 비-형질도입된 Jurkat 세포(Jurkat-나이브)를 HEK-293T-hCLDN 세포와 함께 공동-배양하였다.
도 9b에 제시되는 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, Jurkat-SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 림프구는 hCLDN6를 발현하는 세포에의 노출시 농도 의존적 방식으로 IL-2를 생산하도록 촉발되었다. 이러한 IL-2 생산은 hCLDN6 발현 세포(hCLDN 발현 종양원성 세포 포함) 상의 CLDN 항원의 인식시 SCT1 CAR에 의한 T-세포 활성화를 나타낸다. Jurkat 세포의 특이적 CAR-매개된 활성화는, HEK-293T-CLDN 및 비-형질도입된 Jurkat 세포를 함유하는 공동-배양물 중의 관찰가능한 IL-2 생산의 결여에 의해 추가로 설명된다(도 9b).
본 출원 전반에 걸쳐 상세하게 논의된 바와 같이, 상기 원하는 면역 반응을 생성하기 위한 프로세스에 대해 이전에 언급된 바는 본원에 첨부된 도 7에 개략적으로 나타낸다.
실시예 11
SCT1 - h27 .108 또는 SCT1 - h27 .204 v2 CAR 작제물을 발현하는 T 림프구의 생성
개시된 CAR이 감작화된 림프구를 제공하는데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 사람 CD3 양성 선택 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 상업적으로 입수가능한 말초 혈액 단핵구 세포 조제(PBMC:AllCell)로부터 1차 사람 CD3+ T 림프구를 단리하였다. PBMC는 두 상이한 공여자(공여자 1과 공여자 2)로부터 수득되었다.
단리 후, CD3+ T 세포를, 10% 가열-불활성화된 태아 소 혈청(Hyclone), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Corning), 1%의 l-글루타민(Corning) 및 10mM HEPES(Corning)를 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. T 림프구는, 활성화를 위해 1:5의 비율로 CD3/CD28 활성화 비드(Dynabeads)의 존재 하에 37℃(5% CO2)에서 인큐베이션하였다. IL-2(Peprotech)를 50IU/ml의 최종 농도로 격일 첨가하였다. 초기 활성화 24시간 후, 효과적인 바이러스 형질도입을 확실히 하기 위해, 10ug/ml의 폴리브렌(EMD Millipore)의 존재 하에 1백만개의 T 세포를 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 렌티바이러스 벡터(실질적으로 실시예 8에 제시된 바와 같이 생성됨)를 이용하여 약 5의 감염 다중도(MOI)로 형질도입함으로써 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2를 발현하는 CLDN 표적-특이적 T 림프구를 생성하였다. 세포를 유동 세포측정법에 의해 항-CLDN CAR 표면 발현을 평가하기 전에 37℃(5% CO2)에서 72시간 동안 렌티바이러스 입자의 존재 하에 인큐베이션하도록 하였다(도 10).
SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2를 발현하는 형질도입된 T 림프구의 유동 세포측정 분석은 비-CAR-보유 T 림프구 대조군 세포와 함께 하기와 같이 수행하였다: 각각의 샘플의 106개의 세포를 수거하였고, 1200rpm에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하였고; 상청액을 제거하였고, 펠렛을 차가운 PBS/2% FCS에서 2회 세척하였다. 최종 세척으로부터 상청액을 제거한 후, 세포의 표면에의 CAR의 존재를 직접 검출하기 위해, 세포 펠렛을, 1마이크로그램의 Alexa Fluor® 647-접합된 Affinipure 염소 항-사람 IgG, F(ab') 항체(Jackson ImmunoResearch)를 함유하는 100마이크로리터의 PBS/2% FCS에 재현탁시켰다. 상기 세포를 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, (살아있는 세포를 검출하기 위해) PBS/2% FCS 중에 DAPI와 함께 재현탁시키기 전에 PBS/2% FCS로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 세포를 제조업자의 지침에 따라 BD FACS Canto II 유동 세포측정기 상에서 분석하여 도 8b에 제시되는 데이터를 제공하였다.
도 10은 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2는 둘 다 형질도입된 1차 T 림프구(즉, 감작화된 림프구) 상에서 발현되지만, 비-형질도입된 림프구 상에서는 발현되지 않음을 명확하게 보여준다.
실시예 12
CLDN 표적 항원을 발현하는 세포의 생성 및 특성확인
실시예 9에 제시되는 바와 같이, 사람 CLDN6을 과발현하는 조작된 HEK-293T 세포주의 표면 상의 CLDN 단백질의 존재를 검출하기 위해 유동 세포측정법을 사용하였다. 마찬가지로, 유동 세포측정법을 사용하여 환자-유도된 제노그래프(xenograph)(PDX) 종양 세포주(OV78)에서의 사람 CLDN의 발현을 확인하였다. 인공적으로 조작된 293T 세포주 및 유도된 난소암 세포주 둘 다는 본 발명의 감작화된 림프구를 특성확인하는데 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 사람 CLDN6(293T-CLDN)을 과발현하는 HEK-293T 세포를 수거하였고 Versene(Life Technologies)를 이용하여 단일 세포 현탁액으로 단리하였다. 마찬가지로, 새로 수거한 OV78 PDX 종양을 종양 해리 키트(Mylteni Biotec)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 프로세싱하였다. 단리된 세포를 본원에 기술된 바와 같이 세척하였고, PBS/2% FCS에서 3회 세척하기 전에 1μg의 항-CLDN 항체(SC27.22) 또는 이소타입 대조군과 함께 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 세포를 샘플당 50㎕의 PBS/2% FCS 중에 1:200 희석된 AlexaFluor-647 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 2차 항체(Life Technologies)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였고, PBS/2% FCS로 3회 세척하였고, (살아있는 세포를 검출하기 위해) PBS/2% FCS 중에 DAPI와 함께 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포를 제조업자의 지침에 따라 BD FACS Canto II 유동 세포측정기 상에서 분석하여 도 11a 및 도 11b에 제시되는 데이터를 제공하였다.
얻어진 데이터는 사람 CLDN 단백질이 조작된 HEK-293T 세포(도 11a) 및 OV78 PDX 종양 세포(도 11b) 둘 다에서 발현됨을 보여준다.
실시예 13
T-림프구- SCT1 - h27 .108 또는 SCT1 - h27 .204 v2 는 CLDN -발현 세포와의 접촉시 사이토카인 생산을 유도한다
CLDN-발현 표적 세포와의 접촉시 IFN-γ 및 TNF-α 유도를 측정함으로써 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2를 포함하는 감작화된 림프구를 표적-특이적 활성화에 대해 평가하였다. 사이토카인 생산(예를 들면, TNF-α 및 IFN-γ 유도)은 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있는 활성 키메라 항원 수용체의 지표임이 이해될 것이다.
표적-특이적(즉, CLDN) 활성화를 평가하기 위해, 2개의 상이한 공여자로부터의 숙주 세포를 포함하는 감작화된 림프구를 CLDN + 293T 세포 및 CLDN을 발현하는 난소암 세포(둘 다 실시예 11 유래)에 노출시켰다. 보다 구체적으로, 2개의 상이한 공여자(공여자 1 및 공여자 2)로부터의 PMBC 조제를 사용하여 실질적으로 상기 제시된 바와 같은 CD3+ T 림프구 조제를 제공하였다. 이어서, 각각의 림프구 조제를 실질적으로 실시예 11에 제시된 바와 같이 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2로 형질도입시켜 공여자 1 및 공여자 2 CLDN 감작화된 림프구 조제(대조군으로서의 비-형질도입된 림프구와 함께)를 제공하였다. 이어서, 각각의 감작화된 림프구 조제를 (대조군과 함께) 3:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 293T-CLDN 또는 OV78 PDX 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 공동-배양물은 37℃(5% CO2)에서 48시간 동안 인큐베이션하였고, 이 시점에 배지를 수거하였고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 청징화하였다. 이어서, 청징화된 상청액은 제조업자의 지침에 따라 ELISA(Thermo Fisher)에 의해 TNFα 생산 및 ELISA(Invitrogen)에 의해 IFNγ에 대해 평가하였다. IFNγ 및 TNFα의 수준에 대해 얻어진 측정값은 각각 도 12a 및 도 12b(IFNγ) 그리고 도 13a 및 도 13b(TNFα)에 나타낸다. 예 둘 다에서, 보다 높은 사이토카인 생산은 보다 강한 CAR+ 집단의 활성화의 지표이다.
도 12a(293 세포) 및 도 12b(종양 세포) 그리고 도 13a(293 세포) 및 도 13b(종양 세포)에 제시되는 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2-보유 T 림프구는 사람 CLDN을 발현하는 종양-유도된 세포 및 조작된 세포 둘 다에의 노출시 TNFα 및 IFNγ를 생산하도록 촉발되었고, 반면, 비-CAR-보유 T 림프구는 동일한 표적 세포와 공동-배양한 경우 최소 TNFα 및 IFNγ 유도를 나타냈다. 이는 본 발명의 CLDN 감작화된 림프구는 활성이고 CLDN+ 종양 세포에의 노출시 면역자극성 신호를 생성할 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 14
SCT1 - h27 .108 또는 SCT1 - h27 .204 v2 -T 림프구에 의한 시험관내 CLDN -발현 세포의 표적화된 사멸
표적-특이적 방식으로 세포를 사멸시키는 CLDN 감작화된 림프구의 능력을 입증하기 위해, 본 발명의 CAR 형질도입된 세포를 조작된 293 세포 및 CLDN을 발현하는 종양 세포(각각 실시예 12 유래)에 노출시켰다. 노출 후, 잔존하는 살아있는 표적 세포의 수는 도 14a(293 세포) 및 도 14b(종양 세포)에 제시되어 있는 결과로 계산되었다.
보다 구체적으로 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 감작화된 림프구(2명의 공여자로부터의 숙주 세포를 갖는 실시예 11에 따라 제조됨)를 293T-CLDN 또는 OV78 PDX 세포 중 어느 하나와 함께 3:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 공동-배양하였다(검정 조건으로 인하여 OV78 세포에 노출된 공여자 1 림프구의 활성의 측정값은 결정적이지 않았음에 주의한다). 나머지 살아있는 CLDN-보유 세포를 측정하기 전에 공동-배양물을 37℃(5% CO2)에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
살아있는 세포의 백분율은 하기와 같이 계산하였다: 공동-배양물을 수거하였고, 본원에 제시되는 바와 같이 세척하였고, 그 후 1마이크로그램의 항-CLDN 항체 또는 이소타입 대조군과 함께 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였고, 이어서, PBS/2% FCS로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 세포를 샘플당 50㎕의 PBS/2% FCS 중에 1:200 희석된 AlexaFluor-647 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편-특이적 2차 항체(Life Technologies)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/2% FCS로 3회 세척하였고, 이어서, 세포 생존력 판별을 위해 DAPI(Life Technologies)를 함유하는 200㎕의 PBS/2% FCS 및 세포 수를 정규화하기 위한 10000개의 절대 계수 비드(Life Technologies)에 재현탁시켰다. 수집된 7500 절대 계수 비드당 생존 CLDN-보유 세포의 각각의 수를 정량함으로써 BD FACS Canto II 유동 세포측정기에서 나머지 생존가능한 CLDN-보유 표적 세포의 분석 및 열거를 수행하였다. 비-CAR-보유 T 림프구의 존재 하에 남아있는 생존가능한 표적 세포의 수를 SCT1-h27.108 또는 SCT1-h27.204v2 감작화된 림프구에 의한 CLDN-보유 세포의 표적-특이적 사멸을 비교하기 위한 벤치마크로서 사용하였다.
도 14a(293 세포) 및 도 14b(종양 세포)에 나타낸 바와 같이, SCT1-h27.108-T 림프구 또는 SCT1-h27.204-T 림프구에 의해 293T-CLDN6 세포가 표적 세포의 70% 이상이 제거된 세포용해에 상당한 감수성을 나타냈다. 중요하게도, 항-CLDN6 CAR-보유-T 림프구가 OV78 PDX 종양 세포의 존재 하에 배양되었을 때 유사한 결과가 입증되었고, 여기서, 약 50%의 OV78 세포가 제거되었다. 전반적으로, 이들 데이터는 SCT1-h27.108 및 SCT-h27.204 CAR에 의한 CLDN6-특이적 인식을 통해 CLDN6-발현 세포의 활성화 및 사멸을 입증한다.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 본 발명의 취지 또는 중심적 속성들로부터 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태들로 구현될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 본 발명의 상기 설명은 단지 발명의 예시적인 실시형태들만을 개시한다는 점에서, 다른 변형 실시형태들도 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 상세히 기술된 특정 실시형태들로 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 내용을 나타내는 첨부된 참조문헌들을 참고하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE STEMCENTRX, LLC <120> ANTI-CLDN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODS OF USE <130> sc2703.p2 // S69697 1270US.P2 <150> PCT/US2014/064165 <151> 2014-11-05 <150> US 62/157,928 <151> 2015-05-06 <150> US 62/247,108 <151> 2015-10-27 <160> 178 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Kappa light chain (LC) constant region protein <400> 1 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> IgGI heavy chain (HC) constant region protein <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 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Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp 165 170 175 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 180 185 190 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 210 215 220 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 225 230 235 240 Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 260 265 270 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 290 295 300 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 305 310 315 320 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 325 330 335 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 340 345 350 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 355 360 365 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 370 375 380 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 385 390 395 400 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 405 410 415 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 420 425 430 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 435 440 445 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 450 455 460 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 475 480 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Arg Glu Ser Glu Arg Val Glu Asp 1 5 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.1 Light Chain Variable Region <400> 20 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga agacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ccaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg gactccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gtattaccag tcttcggact 240 gaagatgctg ctacttatta ctgtcaacaa tattggagta ctccactcac gttcggtact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.1 Light Chain Variable Region <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Arg Thr 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.1 Heavy Chain Variable Region <400> 22 gaggtccagc tgcaagagtc tagacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacct tgcactgggt gaagcagagt 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtga tactatctac 180 aaccagaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaatat tctgcagtct attactgtgc aagaagggcg 300 attacggtct atgctatgga ctactggggt caaggtacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.1 Heavy Chain Variable Region <400> 23 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Tyr Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ile Thr Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.22 Light Chain Variable Region <400> 24 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca gactgtcagt acatctagct atagttatat gcactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt ttgcatccaa cgtagaatct 180 ggggtccctg ccagattcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatat ttcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.22 Light Chain Variable Region <400> 25 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ile Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.22 Heavy Chain Variable Region <400> 26 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgaatg gattgccatg attcatcctt ccgatagtga aattaggtta 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca gatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaattgat 300 agttattatg gttacctgtt ttactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctca 366 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.22 Heavy Chain Variable Region <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.103 Light Chain Variable Region <400> 28 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccacact ctggatttat aggacatccg acctggcttc tggagtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca ggctggaaat caaa 324 <210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.103 Light Chain Variable Region <400> 29 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Thr Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.103 Heavy Chain Variable Region <400> 30 gaggtccacc tgcaacagtc tggacctgag ctagtgaagc ctggaggttc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgagtg gattggactt tttaatcctt acaatggtgg tactagttat 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240 atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatgctat 300 aggtacgacg gtcttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.103 Heavy Chain Variable Region <400> 31 Glu Val His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Cys Tyr Arg Tyr Asp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.104 Light Chain Variable Region <400> 32 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ccaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta atcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.104 Light Chain Variable Region <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.104 Heavy Chain Variable Region <400> 34 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacaccg tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gtttatccta agaatggtga tactacctac 180 aaccagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctat 240 atggaactcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtac aggaaaggat 300 gggtacgacg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.104 Heavy Chain Variable Region <400> 35 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Tyr Pro Lys Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Lys Asp Gly Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 36 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.105 Light Chain Variable Region <400> 36 gatgttcaaa tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctttgggaga gagagtctcc 60 ctgacttgcc aggcaagtca gagtgttagc aataatttaa actggtatca gcaaacacca 120 gggaaagctc ctaggctctt gatctatggt gcaagcaaat tggaagatgg ggtctcttca 180 aggttcagtg gcactggata tgggacagat ttcactttca ccatcagcag cctggaggaa 240 gaagatgtgg caacttattt ttgtctacag cataggtatc tgtggacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aaatcaaa 318 <210> 37 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.105 Light Chain Variable Region <400> 37 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Arg Tyr Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.105 Heavy Chain Variable Region <400> 38 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgaactgggt gaagcaaagt 120 cctgaaaaga gccttgagtg gattggagag attaatccta gcactggtag tactacttac 180 aaccagaagt tcaaggccaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca agagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaagggat 300 tattactacg gtagtggttt ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 39 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.105 Heavy Chain Variable Region <400> 39 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.106 Light Chain Variable Region <400> 40 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatgtggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaaac tggagctgaa a 321 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.106 Light Chain Variable Region <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Cys Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 42 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.106 Heavy Chain Variable Region <400> 42 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactaactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagaaggctt 300 attacttact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 43 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.106 Heavy Chain Variable Region <400> 43 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Leu Ile Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.108 Light Chain Variable Region <400> 44 gaaattgtgc tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagcaact tgcactggta ccagcagaag 120 tcaggaacct cccccaaact ctggatttat ggcacatcca acctggcttc tggagtccct 180 gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag caacatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccaca cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat aaaa 324 <210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.108 Light Chain Variable Region <400> 45 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 378 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.108 Heavy Chain Variable Region <400> 46 caggtccaaa tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggactg attaatcctg gaagtggtgg tactaattac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccac cactgcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggttt atttctgtgc aagacggtcc 300 cctctaggga gttggatcta ctatgcttac gacggtgttg cttactgggg ccaagggact 360 ctggtcactg tctctgca 378 <210> 47 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.108 Heavy Chain Variable Region <400> 47 Gln Val Gln Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Pro Leu Gly Ser Trp Ile Tyr Tyr Ala Tyr Asp Gly 100 105 110 Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.201 Light Chain Variable Region <400> 48 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtct ctctgggaga cagagtcact 60 attacttgca aggcaagtga ggacatctat aatcggttag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaagctgg ggttccttca 180 ggattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaactcaa g 321 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.201 Light Chain Variable Region <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Gly Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 50 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.201 Heavy Chain Variable Region <400> 50 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaaaacatca gacactgggt gaagcagagc 120 cgaggaaaga gccttgagtg gattggtact attaatccta ataatggtga gactaggtac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtac aagggggatt 300 acaaagtccc cttatggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcaatcac cgtctcctca 360 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.201 Heavy Chain Variable Region <400> 51 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Asn 20 25 30 Ile Arg His Trp Val Lys Gln Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ile Thr Lys Ser Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Ile Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.203 Light Chain Variable Region <400> 52 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaatcca 120 ggaaatactc ctaggctctt aatgtctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagatt 240 gaagatgttt ctacttatta ctgtcaacaa tattggagta ctcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaggc tggaaatcaa a 321 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.203 Light Chain Variable Region <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Asn Thr Pro Arg Leu Leu Met 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Ile 65 70 75 80 Glu Asp Val Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 54 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.203 Heavy Chain Variable Region <400> 54 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaaaacatca tacactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta tcaatggtgg tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gtagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagggggatt 300 actacgtccc cttatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 55 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.203 Heavy Chain Variable Region <400> 55 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Asn 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ile Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Thr Thr Ser Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.204 Light Chain Variable Region <400> 56 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 gtcgcctgca aggccggtca gaatgtgggt actagtgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacattctc ctaaatcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctaat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tatatcacct atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataat a 321 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.204 Light Chain Variable Region <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Ala Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile 100 105 <210> 58 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC27.204 Heavy Chain Variable Region <400> 58 gaggtgaagg ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag gcctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 180 acgccatctc taaaggctaa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtac aggaccagct 300 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca 336 <210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC27.204 Heavy Chain Variable Region <400> 59 Glu Val Lys Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 Light Chain Variable Region <400> 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgta aggcgagtga ggatatttac aaccggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcaaccagtt tggaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag tattggagta ctccactcac gttcggtcaa 300 gggaccaagc tggagattaa a 321 <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 Light Chain Variable Region <400> 61 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 62 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 Heavy Chain Variable Region <400> 62 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gagtatactc tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggacaaa ggcttgagtg gatgggaggg atcaacccta acaatggtga cacaatatat 180 aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagaagggcg 300 attacggtct atgctatgga ctactggggt caaggtaccc tagtcaccgt ctcgagc 357 <210> 63 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 Heavy Chain Variable Region <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ile Thr Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 Light Chain Variable Region <400> 64 gacattgtca tgacccagtc ccctgacagt ttggccgtta gcttggggga gcgtgccacc 60 atcaactgta gggctagtca aactgtttct acatcctcct actcttacat gcattggtat 120 cagcagaaac ctggtcagcc tccaaaactg ctgatttatt tcgcatctaa cgtcgagtcc 180 ggagttcctg accggttcag cggatcagga agcggtacag attttacact taccatctca 240 tctctgcaag cagaagatgt ggccgtgtac tattgtcagc attcctggga gatcccctgg 300 accttcgggc agggaaccaa gctcgagatt aaa 333 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 Light Chain Variable Region <400> 65 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 Heavy Chain Variable Region <400> 66 caggtgcagt tggtgcagag cggcgccgaa gtcaagaaac caggagcttc tgtcaaagtc 60 tcctgtaaag cctccggata taccttcacc agctactgga tgaattgggt aagacaggcc 120 cccggacaga ggcttgagtg gatgggaatg atccatccct ctgacagcga gattcggctc 180 aaccagaagt ttaaagaccg agtgactatc acacgcgata ccagtgctag cacagcctac 240 atggagttga gttctcttcg tagcgaggac actgccgtgt attattgcgc ccgcatcgac 300 tcatattatg gttatctgtt ctacttcgac tattggggcc aggggaccac cgtgactgtg 360 tcttcc 366 <210> 67 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 Heavy Chain Variable Region <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 Light Chain Variable Region <400> 68 gaaatcgtgc ttacacaatc ccctgccact ctgagccttt ctccaggcga gcgagcaacc 60 ctttcctgca gtgtttcctc ttcaatcagt tccagcaatt tgcactggta ccagcagaag 120 cctggtcagg caccccgatt gttgatctat ggcacatcta acctggccag cggcatccct 180 gctcggttca gtggatctgg ctccggaaca gatttcactc tcactatcag ctcccttgag 240 cctgaagatt ttgccgtgta ctactgtcag caatggagtt cctaccccca cacctttggc 300 ggcgggacaa aggtcgagat aaaa 324 <210> 69 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 Light Chain Variable Region <400> 69 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 Heavy Chain Variable Region <400> 70 caggtacagc tggtccagtc cggcgctgag gttaagaagc ccggtgcctc cgtgaaggta 60 tcttgtaagg cctcaggtta cacctttaca aattatctga tcgaatgggt gagacaggcc 120 ccaggtcagg gtctggaatg gatgggactc atcaaccctg ggagtggcgg gaccaactac 180 aacgaaaagt ttaaggggag agtgacaatg accacagata ccagtacctc caccgcatat 240 atggagctgc gaagcttgag gtccgatgac actgctgtgt actattgcgc ccgtagaagc 300 ccactcgggt cttggatcta ttacgcatac gatggtgtgg cctattgggg ccagggcacc 360 ctggtgacag tcagctcc 378 <210> 71 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 Heavy Chain Variable Region <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Pro Leu Gly Ser Trp Ile Tyr Tyr Ala Tyr Asp Gly 100 105 110 Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 Light Chain Variable Region <400> 72 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccggcca gaacgtgggc acctctgtgg cctggttcca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagtccct gatctactcc gcctcctaca gatactccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacatcacct acccctacac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 Light Chain Variable Region <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 74 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 Heavy Chain Variable Region <400> 74 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 Heavy Chain Variable Region <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 76 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108v1 Light Chain Variable Region <400> 76 gaaatcgtgc tgactcagtc tcccgatttc cagtccgtca cacccaagga gaaagtcacc 60 atcacttgtt ctgtctcctc aagcatctct tctagtaacc tgcactggta tcagcagaag 120 cctgatcagt cccctaagct ttggatatac ggcacctcaa acctcgcctc cggagttcct 180 tcaaggtttt caggtagtgg atctggaacc gatttcaccc ttacaataaa cagtcttgag 240 gccgaggacg ccgccactta ctactgccag cagtggagtt cttaccccca cacatttggg 300 ggcggcacca aagtggagat caaa 324 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108v1 Light Chain Variable Region <400> 77 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-8 Heavy Chain Variable Region <400> 78 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcta cacctttacc agctactgga tgaactgggt gcgacaggct 120 accggccagg gcctggaatg gatgggcatg atccacccct ccgactccga gatccggctg 180 aaccagaaat tcaaggacag agtgaccatg acccggaaca cctccatctc caccgcctac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcgac 300 tcctactacg gctacctgtt ctacttcgac tactggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 360 tcatct 366 <210> 79 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-8 Heavy Chain Variable Region <400> 79 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-46 Heavy Chain Variable Region <400> 80 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcta cacctttacc agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcatg atccacccct ccgactccga gatccggctg 180 aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatg accagagaca cctccaccag caccgtgtac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcgac 300 tcctactacg gctacctgtt ctacttcgac tactggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 360 tcatct 366 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-46 Heavy Chain Variable Region <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-69 Heavy Chain Variable Region <400> 82 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggctcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttccggcgg caccttctcc agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcatg atccacccct ccgactccga gatccggctg 180 aaccagaaat tcaaggacag agtgaccatc accgccgacg agtccacctc caccgcctac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcgac 300 tcctactacg gctacctgtt ctacttcgac tactggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 360 tcatct 366 <210> 83 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22-VH1-69 Heavy Chain Variable Region <400> 83 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v1 Heavy Chain Variable Region <400> 84 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 85 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v1 Heavy Chain Variable Region <400> 85 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 86 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v2 Heavy Chain Variable Region <400> 86 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catccagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v2 Heavy Chain Variable Region <400> 87 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 88 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v3 Heavy Chain Variable Region <400> 88 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 aaccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 89 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v3 Heavy Chain Variable Region <400> 89 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 90 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v4 Heavy Chain Variable Region <400> 90 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v4 Heavy Chain Variable Region <400> 91 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 92 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v5 Heavy Chain Variable Region <400> 92 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v5 Heavy Chain Variable Region <400> 93 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 94 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v6 Heavy Chain Variable Region <400> 94 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catccagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v6 Heavy Chain Variable Region <400> 95 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 96 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v7 Heavy Chain Variable Region <400> 96 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 aaccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtac cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v7 Heavy Chain Variable Region <400> 97 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 98 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v8 Heavy Chain Variable Region <400> 98 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 99 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v8 Heavy Chain Variable Region <400> 99 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 100 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v9 Heavy Chain Variable Region <400> 100 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v9 Heavy Chain Variable Region <400> 101 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 102 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v10 Heavy Chain Variable Region <400> 102 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catccagtac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 103 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v10 Heavy Chain Variable Region <400> 103 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 104 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v11 Heavy Chain Variable Region <400> 104 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 aaccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 105 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v11 Heavy Chain Variable Region <400> 105 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 106 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v12 Heavy Chain Variable Region <400> 106 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 acccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 107 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v12 Heavy Chain Variable Region <400> 107 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 108 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v13 Heavy Chain Variable Region <400> 108 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaagtac 180 acccccagcc 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v15 Heavy Chain Variable Region <400> 112 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt cgacttctcc cggtactgga tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgag atcaaccccg actcctccac catcaactac 180 aaccccagcc tgaaggcccg gttcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggccctgct 300 tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 336 <210> 113 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v15 Heavy Chain Variable Region <400> 113 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu 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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr 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Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 149 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v14 Heavy Chain <400> 149 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 150 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v15 Heavy Chain <400> 150 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRL1 <400> 151 Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRL2 <400> 152 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRL3 <400> 153 Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 154 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRH1 <400> 154 Glu Tyr Thr Leu His 1 5 <210> 155 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRH2 <400> 155 Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.1 CDRH3 <400> 156 Arg Ala Ile Thr Val Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRL1 <400> 157 Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRL2 <400> 158 Phe Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRL3 <400> 159 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 160 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRH1 <400> 160 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 161 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRH2 <400> 161 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Ile Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 162 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.22 CDRH3 <400> 162 Ile Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 163 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRL1 <400> 163 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His 1 5 10 <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRL2 <400> 164 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRL3 <400> 165 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro His Thr 1 5 <210> 166 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRH1 <400> 166 Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 <210> 167 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRH2 <400> 167 Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 168 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.108 CDRH3 <400> 168 Arg Ser Pro Leu Gly Ser Trp Ile Tyr Tyr Ala Tyr Asp Gly Val Ala 1 5 10 15 Tyr <210> 169 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRL1 <400> 169 Lys Ala Gly Gln Asn Val Gly Thr Ser Val Ala 1 5 10 <210> 170 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRL2 <400> 170 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRL3 <400> 171 Gln Gln Tyr Ile Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRH1 <400> 172 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 173 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRH2 <400> 173 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ala <210> 174 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204 CDRH3 <400> 174 Pro Ala Tyr 1 <210> 175 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v1, hSC27.204v5 and hSC27.405v13 CDRH2 <400> 175 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ala <210> 176 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v2, hSC27.204v6 and hSC27.405v14 CDRH2 <400> 176 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Gln Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ala <210> 177 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC27.204v3, hSC27.204v7 and hSC27.405v15 CDRH2 <400> 177 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ala <210> 178 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized hSC27.22ss1 full length HC DNA <400> 178 caagtgcagc tcgtccagtc cggtgccgaa gtcaagaagc cgggcgcatc agtgaaagtg 60 tcgtgcaaag cctccgggta caccttcacc tcatactgga tgaactgggt ccgccaagcc 120 ccgggacaga gactggagtg gatgggcatg attcacccat ccgattccga gatccggctg 180 aaccagaagt tcaaggaccg cgtgaccatc acccgggaca ccagcgccag cactgcctac 240 atggaattga gctcgctgcg gtccgaggat accgctgtgt actattgcgc gaggatcgac 300 tcctactacg gctacctttt ctacttcgac tactggggac aagggacgac cgtgactgtg 360 tcgagc 366

Claims (28)

  1. 항-CLDN 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-CLDN 결합 도메인이 scFv 항-CLDN 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 scFv 항-CLDN 결합 도메인이, 서열번호 21의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열번호 23의 중쇄 가변 영역(VH); 또는 서열번호 25의 VL 및 서열번호 27의 VH; 또는 서열번호 29의 VL 및 서열번호 31의 VH; 또는 서열번호 33의 VL 및 서열번호 35의 VH; 또는 서열번호 37의 VL 및 서열번호 39의 VH; 또는 서열번호 41의 VL 및 서열번호 43의 VH; 또는 서열번호 45의 VL 및 서열번호 47의 VH; 또는 서열번호 49의 VL 및 서열번호 51의 VH; 또는 서열번호 53의 VL 및 서열번호 55의 VH; 또는 서열번호 57의 VL 및 서열번호 59의 VH를 포함하거나, 상기를 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 scFv 항-CLDN 결합 도메인이
    (a) 서열번호 69의 경쇄 가변 영역(VL)의 3개의 상보성 결정 영역들 및 서열번호 71의 중쇄 가변 영역(VH)의 3개의 상보성 결정 영역들; 또는
    (b) 서열번호 73의 VL의 3개의 상보성 결정 영역들 및 서열번호 87의 VH의 3개의 상보성 영역들
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인이 CLDN6에 면역특이적으로 결합하는, 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 결합 도메인이 CLDN4 또는 CLDN9와 교차-반응성이 아닌, 키메라 항원 수용체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 결합 도메인이 CLDN4 또는 CLDN9와 교차-반응성인, 키메라 항원 수용체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 4-1BB 신호전달 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  9. 제8항에 있어서, 사람 CD8 알파 힌지(hinge)를 포함하는 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는, 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 벡터.
  14. 제10항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항의 약제학적 조성물을 포함하는 CLDN 감작화된(sensitized) 림프구의 조제를 위한 키트.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CLDN 감작화된 림프구를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CLDN 감작화된 림프구가 환자로부터 수득된, 단리된 숙주 세포.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 CLDN 감작화된 림프구가 T 세포 또는 NK 세포인, 단리된 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 T 세포가 CD8+ T 세포인, 단리된 숙주 세포.
  21. 제19항에 있어서, 상기 CLDN 감작화된 림프구가 NK 세포인, 단리된 숙주 세포.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제22항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 환자가 폐암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소암, 신경모세포종, 횡문근육종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암을 앓고 있는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암이 폐암이고 상기 폐암이 소세포 폐암인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 암이 난소암인, 방법
  27. 종양 세포 집단에서의 암 줄기 세포의 출현빈도를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 종양 세포 집단을 제22항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 세포 집단에서의 암 줄기 세포의 출현빈도를 감소시키는 방법.
  28. CLDN-감작화된 림프구를 생산하는 방법으로서, 숙주 세포를 제10항의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계를 포함하는, CLDN-감작화된 림프구를 생산하는 방법.
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