JP6491701B2 - 新規モジュレーターと使用の方法 - Google Patents
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- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
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Description
本出願は、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号:61/421,157(2010年12月8日出願)及び特許協力条約(PCT)番号:PCT/US2011/050451(2011年9月2日出願)に対する優先権を主張する。
本出願は、EFS−WebよりASCII形式で提出されて、その全体において参照により本明細書に組み込まれる「配列表」を含有する。2011年11月22日に作成された前記ASCIIコピーは、11200PCT.txtと指定されて、サイズは80,102バイトである。
本出願は、新規組成物と、過剰増殖性障害とその拡張、再発(recurrence)、再燃(relapse)、又は転移を予防、治療、又は改善することにおけるそれらの使用の方法に概し
て関する。広い側面において、本発明は、新生物障害の治療又は予防のためのエフリンAリガンド(EFNA)モジュレーター(抗EFNA抗体及び融合構築体が含まれる)の使用に関する。特に、本発明の好ましい態様は、腫瘍始原細胞頻度の低下を含んでなる、悪性腫瘍の免疫療法的治療への、そのようなEFNAモジュレーターの使用を提供する。
及び転移を防ぐことができないために、多くの固形腫瘍で全生存率はほとんど変化していない。従って、より標的化されて強力な療法を開発することが依然として挑戦課題なのである。
ても知られる)が従来の化学療法剤又は放射線に対してより抵抗性であって、それにより標準的な臨床治療法の後にも存続して、後に難治性腫瘍、続発性腫瘍の増殖を促して転移を助長する可能性があることがより明白になっている。さらに、ますます増える証拠は、器官形成及び/又は正常な組織常在型幹細胞の自己再生を調節する経路がCSCでは調節解除又は改変されていて、自己再生する癌細胞の不断の拡張と腫瘍形成がもたらされることを示唆する。一般論としては、Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087;及びDalerba et. al, 2007, PMID: 17548814 を参照のこと(このそれぞれは、その全体において参照
により本明細書に組み込まれる)。このように、従来の治療法だけでなくより最近の標的化治療法の有効性も、これらの多様な治療法に直面しても癌を永続化することが可能である抵抗性癌細胞の存在及び/又は出現によって制限されているようである。Huff et. al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) 及び Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)(このそれぞれは、その全体において参照により
本明細書に組み込まれる)。このような観察事実は、従来の腫瘍減量剤(debulking agent)では、固形腫瘍に罹患している場合の患者生存を実質的に高めることが常にできない
ことによって、そして腫瘍が増殖、再発、及び転移する方法についてのますます洗練された理解が進展するにつれて確実になっている。従って、新生物障害を治療するための最新の戦略では、腫瘍再発、転移、又は患者再燃の可能性を減らすように、腫瘍永続化細胞を消失させる、枯渇する、沈静化する、又はその分化を促進することの重要性が認められてきた。
抗性であるらしいことが確認され、臨床応答率と全生存率の間の不一致を潜在的に説明している。さらに、CSC研究におけるNTXモデルの利用は、腫瘍の再発及び転移に重大な影響を及ぼすことによって患者生存率を改善するCSC標的化療法をもたらし得る医薬候補物質の医薬探索及び前臨床評価における根本的な変革の火付けになってきた。進展が見られた一方で、原発性及び/又は異種移植片腫瘍組織を取り扱うことに付随する固有の技術上の難題は、CSCの同一性及び分化能を特徴付けるための実験基盤の不足と相俟っ
て、重大な挑戦課題を提起する。それで、癌幹細胞に選択的に標的指向して、過剰増殖性障害の治療、予防、及び/又は管理に使用し得る、診断、予防、又は治療用の化合物又は方法を開発するという実質的なニーズが依然として存在するのである。
るEFNAモジュレーターを含む。好ましくは、頻度の低下は、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される。特に好ましい態様において、そのような分析は、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を
使用して実施してよい。あるいは、限界希釈分析は、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件(colony supporting condition)中への限界希釈沈着(limiting dilution deposition)を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して実施してよい。いずれ
の場合でも、頻度の低下の分析、計算、又は定量は、好ましくは、正確な数的処理を提供するポアソン分布統計の使用を含むであろう。そのような定量法が好ましい一方で、望まれる数値を提供するには、フローサイトメトリー又は免疫組織化学のような、他のさほど労働集約的ではない方法論も使用してよく、従って、それも本発明の範囲内にあるものと明白に考慮されると理解されよう。そのような場合、頻度の低下は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析又は免疫組織化学検出を使用して決定してよい。
は in vivo の限界希釈分析を使用して決定されるように、腫瘍始原細胞頻度の低下を特
異的にもたらして、それによって、同時に又はその後に生じる腫瘍減量のために腫瘍を増感させる。
a.前記被検者より組織試料を入手する工程;
b.該組織試料を少なくとも1つのEFNAモジュレーターと接触させる工程;及び
c.該試料と会合したEFNAモジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる。
る、EFNA関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品を提供する。
本発明は、多くの異なる形態で具現化され得るが、本明細書に開示するのは、本発明の諸原理を具体化する、本発明の例示の具体的態様である。本発明が例証される具体的態様に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用するどのセクション見出しも、編成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。
とが発見された。従って、本発明の好ましい態様について、特に癌幹細胞と開示モジュレーターとのその相互作用の文脈で、以下に広汎に考察するが、当業者は、本発明の範囲がそのような例示態様によって限定されないことを理解されよう。むしろ、本発明と付帯の特許請求項は、どの特別な作用機序にも、特異的に標的化される腫瘍成分にも拘ることなく、EFNAモジュレーターと、新生物障害又は過剰増殖性障害が含まれる、多様なEFNA関連障害又はEFNA媒介障害の診断、セラグノーシス、治療、又は予防におけるそれらの使用へ概括的かつ明白に向けられる。
見した。この点に関して言えば、選択したTICでは、正常組織及び非腫瘍形成細胞(NTG)(一緒に固形腫瘍の多くを含む)と比べるときに、上昇レベルのエフリンAリガンドが発現されていることが見出された。このように、エフリンAリガンドは、腫瘍関連マーカー(又は抗原)を含んで、細胞表面上又は腫瘍微小環境中のこのタンパク質の上昇レベルの故に、TICと関連新生物との検出及び抑制に有効な薬剤を提供することが見出された。より具体的には、EFNAモジュレーターは、このタンパク質と会合又は反応する免疫反応性のアンタゴニスト及び抗体を含めて、腫瘍始原細胞の頻度を有効に低下させて、それ故に、腫瘍始原細胞を消失させ、無能化し、低下させ、その分化を促進し、あるいは他の方法で、これらの腫瘍始原細胞の患者の中での潜伏能力、及び/又は腫瘍の増殖、転移、又は再発を促すことを続ける能力を排除するか又は制限するのに有用であることがさらに発見された。下記により詳しく考察するように、TIC腫瘍細胞の亜集団は、腫瘍永続化細胞(TPC)と高増殖性腫瘍始原細胞(TProg)からなる。
I型膜貫通タンパク質であるエフリン受容体チロシンキナーゼ(EPH)は、動物ゲノム内で最大の受容体チロシンキナーゼのファミリーを含み、やはり細胞表面に会合しているエフリンリガンド(EFN)と相互作用する。EPHサブファミリー中の受容体は、典型的には、単一のキナーゼドメイン、並びにCysリッチドメイン及び2つのフィブロネクチンIII型リピートを含有する細胞外領域を有する。慣例によれば、エフリン受容体は、その細胞外ドメイン配列とエフリンAリガンド及びエフリンBリガンドへ結合するそれらの親和性の類似性に基づいて、2つの群へ分けられる。これまでの研究は、EPH媒
介性シグナル伝達事象が、特に神経系において、胚発生の多重の側面を制御して、細胞の付着、形状、及び移動性を調節する細胞間連絡の重要なメディエーターであることを示した。さらに、エフリン受容体ファミリーの多くのメンバーは、エフリンリガンドとは対照的に、癌の発症及び進行の重要なマーカー及び/又は制御因子として同定されてきた。今日まで、9種のエフリンA受容体と6種のエフリンB受容体が知られている。
対してずっと高いレベルで、胚発生の間に見出されるが、成体にあっても低レベルの発現が継続していることは、成体の腸管(分化途上の細胞が腸陰窩中の組織幹細胞でのその供給源から腸管腔に対面する柔突起の表面にあるその最終位置へ移動することより生じる、明確化された構造を有する)のような組織の正常な機能におけるこれら分子の役割を反映するのかもしれない。エフリン受容体は、最初に、肝細胞癌において確認されて、EPH及びEFNの発現は、典型的には成体に限られているので、ヒト癌におけるエフリンリガンド及び/又はエフリン受容体の発現の再活性化は、癌細胞の脱分化、及び/又は周囲の正常組織に浸潤して原発性腫瘍の部位から離れた場所へ移動するこれら癌細胞の能力に関連する可能性がある。他の研究成果は、EPH−EFN相互作用が血管新生にも何らかの役割があることを示唆している。
先行技術の教示とは対照的に、本発明は、腫瘍始原細胞、そして特に腫瘍永続化細胞に標的指向して、それによって新生物障害の治療、管理、又は予防を促進するのに特に有用であるEFNAモジュレーターを提供する。より具体的には、先に示したように、驚くべきことに、特定の腫瘍細胞亜集団は、EFNAを発現して、癌幹細胞の自己再生と細胞の生存に重要なモルフォゲンシグナル伝達の局在化調整を変化させる可能性があることが見出された。このように、好ましい態様では、EFNAのモジュレーターを本教示に従って使用して、腫瘍始原細胞頻度を低下させて、それによって過剰増殖性疾患の治療又は管理を促進することができる。
ogとは異なる。下記により詳しく考察するように、適正な細胞表面マーカーを使用する蛍光活性化細胞選別(FACS)は、少なくとも一部は、単一の細胞と細胞の塊(即ち、ダブレット等)を識別するその能力の故に、高度に濃縮した細胞亜集団(99.5%より高い純度)を単離するのに信頼し得る方法である。そのような技術を使用して、少ない細胞数の高度精製TProg細胞が免疫不全マウスへ移植されるときに、それらが一次移植体中の腫瘍増殖を促すことができることが示された。しかしながら、精製されたTPC亜集団とは異なり、TProg産生腫瘍は、表現型の細胞異種性において親腫瘍を完全には反映せず、後続の移植体において連続した腫瘍形成を再始動させることが明らかに非効率である。対照的に、TPC亜集団は、親腫瘍の細胞異種性を完全に再構成して、連続的に単離及び移植されるときに、腫瘍を効率的に始動させることができる。このように、当業者は、いずれも一次移植体において腫瘍を産生し得ても、TPCとTProgの間には明確な違いがあって、それは、少ない細胞数での連続移植時に異種な腫瘍増殖を永続的に促進するTPC独自の能力であることを認められよう。TPCの特性決定をするための他の通常のアプローチは、形態学と、細胞表面マーカー、転写プロフィール、及び薬物応答の検証に関連するが、マーカーの発現は、培養条件と in vitro での継代細胞株で変化する場合がある。
化学療法抵抗性にする、多剤耐性輸送体の発現増加、DNA修復機序の増強、及び抗アポトーシスタンパク質といった他の特徴をしばしば発現する。そのそれぞれがTPCによる薬剤耐性に寄与するこれらの特性は、標準腫瘍学の治療レジメンが進行期の新生物を担うほとんどの患者に長期の利益を保証することができないこと、即ち、継続した腫瘍の増殖及び再発を促すそれらの細胞(即ち、TPC又はCSC)に充分に標的指向してそれらを根絶することができないことの主要な理由を構成する。
又は in vivo のいずれかの限界希釈分析があり、好ましくは、ポアソン分布統計を使用する計数、又は in vivo で腫瘍を産生する能力の有無といった、既定義の決定的な事象
の頻度を評価することをそれに続ける。そのような限界希釈分析は、腫瘍始原細胞頻度の低下を計算する好ましい方法であるが、他のさほど厳密でない方法も、やや正確ではないとしても、所望の数値を有効に決定するために使用し得て、本明細書の教示と全く適合可能である。このように、当業者によって理解されるように、頻度値の低下をよく知られたフローサイトメトリー又は免疫組織化学の手段により決定することも可能である。上述のすべての方法に関しては、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 及び Hoey et al. 2009, PMID: 19664991 を参
照のこと。
順を含む。直前に記載した限界希釈分析技術ほど正確ではないが、これらの手順は、ずっと労働集約的ではなくて、妥当な数値を相対的に短い時間枠で提供する。このように、当業者は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている、当該技術分野で認められた細胞表面タンパク質(例えば、下記の実施例1で説明するような、潜在的に適合可能なマーカー)と結合する1以上の抗体又は試薬を利用して、それによって様々な試料由来のTICレベルを測定する、フローサイトメトリー細胞表面マーカープロフィール決定法を使用し得ることが理解されよう。なお別の適合可能な方法において、当業者は、これらの細胞を区別すると考えられる細胞表面タンパク質へ結合することが可能である1以上の抗体又は試薬を使用する免疫組織化学によって、TIC頻度を in situ で(例えば、組織切
片において)計数することができよう。
いずれにしても、本発明は、いくつかのEFNA関連悪性腫瘍のいずれもの診断、治療及び/又は予防のためのEFNAモジュレーター(EFNAアンタゴニストが含まれる)の使用へ向けられる。開示モジュレーターは、単独で使用しても、化学療法剤又は免疫療法剤又は生物学的応答調節物質のような多種多様な抗癌化合物と一緒に使用してもよい。他の選択された態様では、2以上の別々のEFNAモジュレーターを組み合わせて使用して増強された抗新生物効果をもたらす場合もあれば、それを使用して多重特異性の構築体を作製する場合もある。
RNA、マイクロRNA、等といった化合物を含んでよい。
会合する抗体を含んでよい。
a.概説
先に述べたように、本発明の特に好ましい態様は、EFNAモジュレーターを抗体の形態で含む。抗体という用語は最も広義に使用されて、具体的には、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、霊長類化抗体、Fab断片、F(ab’)断片、単鎖FvFcs(scFvFc)、単鎖Fvs(scFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び(所望される生理活性、即ち、EFNAとの会合又は結合を示す限りにおいて)他のあらゆる免疫学的に活性な抗体断片を網羅する。より広義において、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片(即ち、抗原結合部位を含有する分子)が含まれて、ここでこれらの断片は、限定されないが、Fc領域又はその断片が含まれる、別の免疫グロブリンドメインへ融合してもしなくてもよい。さらに、本明細書においてより詳しく概説されるように、抗体及び抗体(複数)という用語には、具体的には、下記に記載のようなFc変異体が含まれ、完全長の抗体と、Fc領域又はその断片を含んでなり、少なくとも1つのアミノ酸残基修飾を含んでもよく、そして免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片へ融合してもよい、変異体Fc融合体が含まれる。
な抗体を提供するために、標準の組換え及び発現技術を使用して、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部又は一部を再結合又は工学処理してよい。即ち、第一抗体(又はそのあらゆる部分)由来の重鎖又は軽鎖可変領域を、第二抗体由来の重鎖又は軽鎖可変領域のどの選択される部分とも混合して適合させてよい。例えば、1つの態様では、第一抗体の3つの軽鎖CDRを含んでなる軽鎖可変領域全体を、第二抗体の3つの重鎖CDRを含んでなる重鎖可変領域全体と対合させて、作動可能な(operative)抗体を提供することができる。さ
らに、他の態様では、様々な抗体に由来する個々の重鎖及び軽鎖CDRを混合して適合させて、最適化された特徴を有する所望の抗体を提供することができる。このように、例示の抗体は、第一抗体由来の3つの軽鎖CDR、第二抗体由来の2つの重鎖CDR、及び第三抗体由来の第三の重鎖CDRを含んでよい。
を示さない)ことに留意されたい。フレームワーク残基の最大の並置には、しばしば、Fv領域に使用するために、スペーサー残基をこの番号付けシステムに挿入することが求められる。加えて、ある個別残基の同一性は、どの所与のカバット部位番号でも、種間又は対立遺伝子の多様性により、抗体鎖ごとに変動する場合がある。Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp.877-883 (1989) 及び MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) も参照のこと。ここでその定義には、互いに対して比較するときのアミノ酸残基の重なり又は亜集合が含まれる。上述した参考文献のそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれて、上記に引用した参考文献のそれぞれによって定義されるようなCDRが含まれるアミノ酸残基を比較のために示す。
s)又はヘテロ(heterogeneous)の多量体構築体、Fc変異体、及びコンジュゲートされたか又はグリコシル化により改変された抗体を含んでよい。さらに、そのような配置が相互に排他的ではないこと、そして適合可能な個々の抗体が本明細書に開示する機能的な側面の1以上を含んでよいことが理解されよう。例えば、適合可能な抗体は、ヒト化可変領域がある一本鎖の二重特異性抗体(diabody)、又はグリコシル化パターンを変化させて
血清半減期を調節するFc修飾がある、完全にヒトの完全長IgG3抗体を含んでよい。当業者には、他の例示態様が容易に明らかであって、本発明の範囲内にあるものとして容易に識別可能であり得る。
よく知られているように、本明細書の教示に従った抗体を提供するには、ウサギ、マウス、ラット、等が含まれる様々な宿主動物に接種して、これを使用してよい。免疫学的応答を高めるために使用し得る、当該技術分野で知られたアジュバントには、接種される種に依存して、限定されないが、フロイント(完全及び不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル剤、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性物質、並びにBCG(カルメット・ゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)のような、潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、抗原を局所の貯蔵部位(deposit)へ隔離することによってその速やかな
拡散を防ぐ場合もあれば、マクロファージにとって走化性である因子や免疫系の他の成分を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合もある。好ましくは、ポリペプチドを投与するならば、免疫化のスケジュールは、該ポリペプチドの2回以上の投与が数週にわたって行われることを伴う。
本発明のある側面と併せてポリクローナル抗体を使用してよいが、好ましい態様は、EFNA反応性モノクローナル抗体の使用を含む。本明細書に使用するように、「モノクローナル抗体」又は「mAb」という用語は、実質的に同種の抗体の集団より得られる抗体を意味し、即ち、この集団を含んでなる個々の抗体は、微量に存在し得る可能な突然変異(例、天然に存在する突然変異)以外は、同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示して、どの種類の抗体と併せて使用してもよい。ある態様において、そのようなモノクローナル抗体には、EFNAと結合又は会合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれて、ここでEFNA結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択が含まれる方法によって入手される。
融合すること、及び腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが含まれる。骨髄腫細胞との融合を使用する場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。エフリンAリガンド(選択されるアイソフォームが含まれる)又はその免疫反応性部分を使用して、不死化細胞をスクリーニングする。好ましい態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)又はラジオイムノアッセイを使用して実施する。
験マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」(コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー出版局、第2版、1988);「モノクローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)」(エルセヴィエ、ニューヨーク、1981)中、Hammerling, et al., 563-681(このそれぞれは、本明細書に組み込まれる)におい
てより詳しく教示されるようなハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を製造することができる。開示されるプロトコールを使用して、好ましくは、関連の抗原とアジュバントの多数の皮下又は腹腔内注射によって、抗体を哺乳動物中で産生する。先に考察したように、この免疫化は、活性化された脾臓細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体(免疫化動物がトランスジェニックであれば、完全にヒトのものであり得る)の産生を含む免疫応答を概ね誘発する。生じる抗体は、この動物の血清より採取してポリクローナル調製物を提供し得るが、一般的には、脾臓、リンパ節、又は末梢血より個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体の同種調製物を提供することがより望ましい。最も典型的には、脾臓よりリンパ球を入手して不死化して、ハイブリドーマを提供する。
異性抗体を創出する、等のために選択したEFNA結合配列をさらに改変することができること、そしてその改変した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基(エピトープ)に対して指向された別々の抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、交差反応性であり得る他の免疫グロブリンがそこに混在していない点で有利である。
別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも2つの異なる種又は種類の抗体からの共有結合したタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含んでよい。本明細書に使用するように、「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特別な種に由来するか又は特別な抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である一方で、この鎖(複数)の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片(それらが所望される生理活性を示す限りにおいて)の中の対応配列と同一又は相同である構築体へ向けられると理解されよう(米国特許第4,816,567号;Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984))。1つの例示態様において、本明細書の教示に従うキメラ抗体は
、マウスのVH及びVLアミノ酸配列とヒトの供給源に由来する定常領域を含んでよい。他の適合可能な態様において、本発明のキメラ抗体は、下記に記載のようなCDR移植抗
体又はヒト化抗体を含んでよい。
CDR移植抗体に似ているのがヒト化抗体である。一般的に言えば、ヒト化抗体は、初めは非ヒト動物において作製されたモノクローナル抗体より産生する。本明細書に使用するように、非ヒト(例、マウス)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。1つの態様において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体のCDRからの残基が、所望される特異性、親和性、及び/又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト霊長動物のような非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基に置き換わっている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。
1994);及び、米国特許第6,982,321号及び7,087,409号を参照のこと
。なお別の方法は、ヒューマニアリング(humaneering)と呼ばれて、例えば、U.S.
2005/0008625に記載されている。本出願の目的では、「ヒト化抗体」という用語には、フレームワーク置換が無いかほとんど無いCDR移植抗体(即ち、1以上の移植非ヒトCDRを含んでなるヒト抗体)が明白に含まれるものとする。
O98/52976及びWO00/34317に記載のように、VH及びVL配列に存在するモチーフを求めて、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、18の主要MHCクラスII DRアロタイプのいずれへも結合して、それにより潜在的なT細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なT細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を置換することによるか又は単一アミノ酸置換によって消失させることができる。可能な限り、保守的な置換がなされる。しばしば、絶対的ではないが、ヒト生殖細胞系抗体配列中のある位置に共通のアミノ酸が使用され得る。脱免疫化の変化を確認した後で、突然変異誘発又は他の合成法(例、de novo 合成、カセット置換、等)によって、VH及びVLをコードする核酸を構築することができる。突然変異誘発した可変配列をヒト定常領域へ融合させてもよい。
配列の包括的なディレクトリを提供する(Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674 を参照のこと)。これらの配列は、ヒト配列の(例えば、フレームワーク領域及び
CDRのための)供給源として使用することができる。本明細書に説明するように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も、例えば、米国特許第6,300,064号に記載のように、使用することができる。
上述した抗体に加えて、当業者は、本発明の抗体が完全ヒト抗体を含み得ることを理解されよう。本出願の目的では、「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された、及び/又は本明細書に開示するようなヒト抗体を作製するための技術のいずれも使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を含む。このヒト抗体の定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を排除する。
次いでこの大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用するファージは、典型的には、fd及びM13が含まれる繊維状ファージであって、VH及びVLドメインは、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIの一方へ組換え的に融合される。
二次ライブラリーより構築して再選択することによって、親和性成熟も in vitro で模倣することができる。例えば、Hawkins et. al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) の方法において、又は Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)
の方法において、エラーを起こしやすい(error-prone)ポリメラーゼ(Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) に報告されている)を使用することによって、突然変異を in vitro で無作為に導入することができる。追加的に言えば、例えば、選択した個々の
Fvクローンにおいて、対象のCDRが含まれるランダム配列を担うプライマーでPCRを使用して1以上のCDRを無作為に突然変異させて、より高親和性のクローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を実施することができる。WO9607754は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中に突然変異誘発を引き起こして、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効なアプローチは、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992) に記載のように、ファージディスプレイによって選択されるVH又はVLドメインを、非免疫化ドナーより得られる天然に存在するVドメイン変異体のレパートリーと組換えて、数回の鎖リシャッフリング(chain reshuffling)においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術により、解離
定数:Kd(koff/kon)が約10−9M以下である抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
Biol, 222:581 (1991))。他の態様では、酵母のような真核細胞において産生されるコ
ンビナトリアル抗体ライブラリーよりヒト結合対を単離してよい。例えば、米国特許第7,700,302号を参照のこと。このような技術は、有利にも、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能にして、候補配列の相対的に容易な操作(例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリング(recombinant shuffling)による)を提供する。
10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向された抗体を
産生するヒトBリンパ球の不死化により産生してよい(このようなBリンパ球は、新生物障害に罹患している個体より回収してもよく、in vitro で免疫化してもよい)。例えば
、Cole et al.「モノクローナル抗体と癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy)」Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); 及び米国特許第5,750,373号を参照のこと。
当該抗体モジュレーターをどのように入手したとしても、またそれが上述した形態(例、ヒト化、ヒト、等)のいずれを採るとしても、開示モジュレーターの好ましい態様は、様々な特徴を示す可能性がある。この点に関して言えば、抗EFNA抗体産生細胞(例、ハイブリドーマ又は酵母コロニー)を、例えば、活発な増殖、高い抗体産生、及び(下記により詳しく考察するような)望ましい抗体特徴が含まれる望ましい特徴について選択し、クローン化して、さらにスクリーニングしてよい。ハイブリドーマは、同系遺伝子の動物、免疫系を欠損している動物(例、ヌードマウス)において in vivo で、又は細胞培
養において in vitro で拡充させることができる。そのそれぞれが別々の抗体種を産生するハイブリドーマ及び/又はコロニーを選択する、クローン化する、及び拡充させる方法は、当業者に周知である。
特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「中和抗体」又は「中和アンタゴニスト」という用語は、エフリンAリガンドへ結合するか又はそれと相互作用してリガンドのその結合相手(例、EPHA受容体)への結合又は会合を防ぐことによって、これら分子の相互作用より生じるはずの生体応答を妨害する抗体又はアンタゴニストを意味する。抗体又はその免疫学的に機能的な断片若しくは誘導体の結合と特異性について評価する場合、抗体又は断片がリガンドのその結合相手又は基質への結合を実質的に阻害するのは、例えば、in vitro 競合結合アッセ
イ(例えば、本明細書の実施例9〜12を参照のこと)で測定されるように、過剰の抗体が標的分子へ結合する結合相手の量を少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%以上低下させるときである。例えば、EFNA4に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは、EphA4へ結合するEFNA4の能力を少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%以上減少させる。この減少した活性は、当該技術分野で認められた技術を使用して直接測定しても、そのような低下がEPH(例、EPHA4)受容体活性に及ぼす影響によって測定してもよいと理解されよう。
選択されるエフリンAリガンド又はそれらのアイソフォームが可溶型で存在する場合があることを示す証拠はあるが、少なくともある種のEFNA(例、EFNA1及びEFNA4)は、細胞表面と会合した状態にあるようであり、それにより開示モジュレーターの内在化を可能にしている。従って、本発明の抗EFNA抗体は、エフリンAリガンドを発現する細胞によって、少なくともある程度は、内在化され得る。例えば、腫瘍始原細胞の表面上のEFNA4へ結合する抗EFNA4抗体は、腫瘍始原細胞によって内在化され得る。特に好ましい態様では、そのような抗EFNA抗体を、内在化と同時に細胞を殺傷する細胞傷害性部分のような抗癌剤と会合させるか又はそれへコンジュゲートさせてよい。
。内在化される抗体分子の数は、EFNA発現細胞、特にEFNA発現腫瘍始原細胞を殺傷するのに十分又は充分であり得る。抗体又は抗体コンジュゲートの効力に依っては、いくつかの事例において、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに、該細胞への単一の抗体
分子の取込みで十分である。例えば、ある毒素は、殺傷においてきわめて強力であるので、腫瘍細胞を殺傷するには、抗体へコンジュゲートした毒素の1分子の内在化で十分である。抗EFNA抗体が哺乳動物細胞上のEFNAへの結合時に内在化されるかどうかは、下記の実施例(例、実施例15及び16)に記載されるものが含まれる様々なアッセイによって決定することができる。抗体が細胞中へ内在化されるかどうかを検出する方法については、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,619,068号にも記載されている。
他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、枯渇性抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「枯渇性抗体」という用語は、細胞表面の上又は近くにあるEFNAへ結合するか又はそれと会合して、該細胞の死滅又は消失を(例えば、補体依存性細胞傷害又は抗体依存性細胞傷害によって)誘発する、促進する、又は引き起こす抗体又は断片を意味する。下記により詳しく考察するいくつかの態様において、選択した枯渇性抗体は、細胞傷害剤へ会合又はコンジュゲートされる。好ましくは、枯渇性抗体は、ある一定の細胞集団において、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%の腫瘍永続化細胞を枯渇する、消失させる、又は殺傷する。いくつかの態様において、この細胞集団は、濃縮、分画、精製、又は単離された腫瘍永続化細胞を含んでよい。他の態様において、この細胞集団は、腫瘍永続化細胞を含む腫瘍試料全体又は異種の腫瘍抽出物を含んでよい。当業者は、下記の実施例(例、実施例16)に記載のような標準の生化学技術を本明細書の教示に従って使用して、腫瘍形成細胞又は腫瘍永続化細胞の枯渇をモニターして定量し得ることを理解されよう。
開示される抗EFNA抗体は、選択された標的(複数)によって提示される別々のエピトープ又は決定基と会合するか又はそれへ結合するとさらに理解されよう。本明細書に使用するように、エピトープという用語は、特別の抗体によって認識されて特異的に結合されることが可能な標的抗原のその部分を意味する。抗原がEFNAのようなポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸からも、タンパク質の三次元フォールディングによって並列される不連続アミノ酸からも形成され得る。連続したアミノ酸より形成されるエピトープがタンパク質の変性時に典型的には保持されるのに対し、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質の変性時に典型的には失われる。エピトープには、典型的には、少なくとも3個、そしてより通常は、少なくとも5又は8個〜10個のアミノ酸が独自の空間コンホメーションに含まれる。より具体的には、当業者は、エピトープという用語には、免疫グロブリン又はT細胞受容体へ特異結合するか又は他の方法で分子と相互作用することが可能などのタンパク質決定基も含まれると理解されよう。エピトープの決定基は、一般的には、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置からなり、一般的には、特異的な三次元構造上の特性、並びに特異的な荷電特性を有する。追加的に言えば、エピトープは、線状でも高次構造状でもよい。線状エピトープでは、該タンパク質と相互作用分子(抗体のような)の間の相互作用点のすべてが該タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる。高次構造状エピトープでは、相互反応の点が、直線的には互いに分離しているタンパク質上のアミノ酸残基の全体で生じる。
リーニングすることが可能である。このことを達成するアプローチは、競合試験を実施して、互いに競合的に結合する抗体(即ち、この抗体は、抗原への結合に関して競合する)を見出すことである。WO03/48731には、それらの交差競合性に基づいて抗体をビニングする(binning)ためのハイスループット法が記載されている。
合特性に基づいて抗体を群分けするための方法を意味する。ビンの割当ては、試験した抗体の観測された結合パターンがどのくらい異なるかに依存して、やや恣意的である。このように、この技術は、本発明の抗体を分類するのに有用なツールであるが、そのビンは、必ずしも直にエピトープと相関するものではないので、そのような初めの決定は、他の当該技術分野で認められた方法論によってさらに確かめるべきである。
er(即ち、バイオレイヤー干渉法−ForteBio 社)、又はフローサイトメトリー法を使
用して入手することができる。本明細書に使用する「表面プラズモン共鳴法」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象に関連する。特に好ましい態様において、この分析は、下記の実施例において証明されるように、Biacore又はForteBio機器を使用して実施する。
e.結合親和性
この点に関して言えば、本発明には、選択されるEFNAに対して(又は、汎抗体の場合は、1種より多いエフリンAリガンドに対して)高い結合親和性を有する抗体の使用がさらに含まれる。本発明の抗体がその標的抗原へ特異的に結合すると言われるのは、解離定数:Kd(koff/kon)が≦10−8Mであるときである。この抗体は、Kdが≦5x10−9Mであるときには高い親和性で、そしてKdが≦5x10−10Mであるときはきわめて高い親和性で抗原へ特異的に結合する。本発明の1つの態様において、該抗体は、10−9M以下のKdと約1x10−4/秒のオフ速度を有する。本発明の1つの態様において、オフ速度は、<1x10−5/秒である。本発明の他の態様において、該抗体は、EFNAへ約10−8Mと10−10Mの間のKdで結合して、なお別の態様において、それは、2x10−10M以下のKdで結合する。本発明のなお他の選択される態様は、10−2M未満、5x10−2M未満、10−3M未満、5x10−3M未満、10−4M未満、5x10−4M未満、10−5M未満、5x10−5M未満、10−6M未満、5x10−6M未満、10−7M未満、5x10−7M未満、10−8M未満、5x10−8M未満、10−9M未満、5x10−9M未満、10−10M未満、5x10−10M未満、10−11M未満、5x10−11M未満、10−12M未満、5x10−12M未満、10−13M未満、5x10−13M未満、10−14M未満、5x10−14M未満、10−15M、又は5x10−15M未満の解離定数又はKd(koff/kon)を有する抗体を含む。
上述した結合特性に加えて、抗EFNA抗体とその断片は、すべてのポリペプチドのように、一般的にはポリペプチドが実効電荷を担わないときのpHとして定義される、等電点(pI)を有する。当該技術分野では、溶液のpHがタンパク質の等電点(pI)に等
しい場合、典型的には該タンパク質の溶解度が最低になることが知られている。故に、抗体中のイオン化可能な残基の数と位置を改変してpIを調整することによって溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのpIは、適正なアミノ酸置換を施すことによって(例えば、アラニンのような非電荷残基にリジンのような荷電アミノ酸を代用することによって)操作することができる。どの特別な理論にも束縛されることを望まずに言えば、抗体のpIの変化をもたらす前記抗体のアミノ酸置換は、該抗体の溶解度及び/又は安定性を改善する場合がある。当業者は、ある特別な抗体が所望のpIを達成するのにどのアミノ酸置換が最も適正であるかを理解されよう。
1993, Electrophoresis 14: 1023 を参照のこと)。1つの態様において、本発明の抗EFNA抗体のpIは、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、又は約9.0の間かそれより高い。別の態様において、本発明の抗EFNA抗体のpIは、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、又は9.0の間かそれより高い。なお別の態様において、本発明の抗体のpIの改変をもたらす置換は、EFNAへのその結合親和性を有意には減少させない。下記により詳しく考察するように、具体的には、FcγRへの結合の改変をもたらすFc領域の置換(複数)は、pIの変化ももたらす場合があると考慮される。好ましい態様では、所望されるFcγR結合の改変とpIの所望されるあらゆる変化をともに有効にするように、Fc領域の置換(複数)が具体的に選択される。本明細書に使用するように、pI値は、優勢な荷電形状のpIとして定義される。
抗体のFabドメインのTmは、抗体の熱安定性の良好な指標であり得、さらに貯蔵寿命の目安となり得ることがさらに理解されよう。Tmは、所与のドメイン又は配列の50%アンフォールディングの温度に他ならない。Tmが低いほどより多くの凝集/より少ない安定性を示すのに対し、Tmが高いほど、より少ない凝集/より大きな安定性を示す。従って、より高いTmを有する抗体又はその断片若しくは誘導体が好ましい。さらに、当該技術分野で認められた技術を使用して、抗EFNA抗体又はそのドメインの組成を改変して、分子安定性を高めるか又は最適化することが可能である。例えば、米国特許第7,960,142号を参照のこと。このように、1つの態様において、選択した抗体のFabドメインは、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、又は120℃より高いTm値を有する。別の態様において、抗体のFabドメインは、少なくとも約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、約100℃、約105℃、約110℃、約115℃又は約120℃より高いTm値を有する。当該技術分野で公知の標準法を使用して、例えば、示差走査熱量測定(例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Vermeer et al., 2000, Biophys.
J. 78: 394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154 を参照のこと)
によって、タンパク質ドメイン(例、Fabドメイン)の熱融解温度(Tm)を測定することができる。
本発明の薬剤が、インタクト融合構築体、抗体、断片、又は誘導体のいずれを含むとしても、選択したモジュレーターは、EFNAと反応する、結合する、組み合わさる、複合する、接続する、付着する、一緒になる、相互作用する、又は他の方法で会合して、それによって所望の抗新生物効果をもたらす。当業者は、抗EFNA抗体を含んでなるモジュレーターが該抗体上で発現される1以上の結合部位を介してEFNAと相互作用するか又は会合することを理解されよう。より具体的には、本明細書に使用するように、「結合部位」という用語は、対象の標的分子(例、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質、又は阻
害剤)へ選択的に結合することの原因となるポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位を含む(例えば、インタクトIgG抗体は、2つの結合ドメインと2つの結合部位を有するものである)。例示の結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインが含まれる。本発明の目的では、EFNAの典型的な活性領域は、(例えば、Fc−EFNA融合構築体の一部として)基質(例、Eph受容体)の結合部位を含み得る。
本発明を実施するのに、どの形態のモジュレーター(例、キメラ、ヒト化、等)を選択しても、その免疫反応性断片は、本明細書の教示に従って使用し得ると理解されよう。最も広義において、「抗体断片」という用語は、インタクト抗体(例、天然に存在する免疫グロブリン)の少なくとも一部を含む。より具体的には、「断片」という用語は、インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含んでなる抗体又は抗体鎖(又は、Fc融合の場合はEFNA分子)の一部又は部分を意味する。「抗原結合断片」という用語は、抗原と結合するか又はインタクト抗体と(即ち、それらが導かれたインタクト抗体と)抗原結合(即ち、特異結合)について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書に使用するように、「抗体分子の断片」という用語には、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖(VL)、抗体重鎖(VH)、単鎖抗体(scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単ドメイン抗体断片、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片より生成される多重特異性抗体が含まれる。同様に、EFNAの活性断片は、EFNA基質又は受容体と相互作用してインタクトEFNAのそれと似た様式でそれらを修飾する(やや低い効率であるかもしれないが)その能力を保持するEFNA分子の一部を含む。
語には、抗体全体の修飾によって産生されるか又は組換えDNAの方法論を使用して de novo 合成される抗体又はその断片若しくは誘導体が明白に含まれる。
ューヨーク(1999)を参照のこと。
結合部位を規定するのは、この配置においてである。この6つのCDR又はその亜集合は、集合的に、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなる、FVの半分)でも、通常は完全な結合部位より低い親和性であるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
。例えば、そのような抗体断片は、その断片へin vivo 安定性を付与することが可能なFc配列へ連結した抗原結合アームを含む場合がある。
別の態様では、本発明のモジュレーターが一価でも多価(例、二価、三価、等)でもよいことがさらに理解されよう。本明細書に使用するように、「結合価」という用語は、抗体と会合する潜在的な標的(即ち、EFNA)結合部位の数を意味する。それぞれの標的結合部位は、1つの標的分子、又は標的分子上の特定の位置又は座へ特異的に結合する。本発明の抗体が1より多い標的結合部位を含む(多価)とき、それぞれの標的結合部位は、同じ分子か又は異なる分子へ特異的に結合し得る(例えば、異なるリガンド又は異なる抗原へ、又は同じ抗原上の異なるエピトープ又は位置へ結合し得る)。本発明の目的では、主題の抗体は、好ましくは、ヒトEFNAに特異的な少なくとも1つの結合部位を有する。1つの態様において、本発明の抗体は、その分子のそれぞれの結合部位が単一のEFNAの位置又はエピトープへ特異的に結合するという点で一価であろう。他の態様において、該抗体は、それらが1より多い結合部位と、単一より多い位置又はエピトープと特異的に会合する異なる結合部位を含むという点で多価であろう。そのような場合は、選択したEFNAポリペプチド又はスプライス変異体に多重エピトープが存在し得るか、又はEFNA上に単一エピトープが存在し得る一方で、別の分子又は表面上に第二の異なるエピトープが存在し得る。例えば、米国特許第2009/0130105号を参照のこと。
の3つのポリペプチド断片の相互比率を調整するのに大きな柔軟性が得られる。しかしながら、等しい割合の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、又はこの割合が特に重要でないときは、2個又は全3個のポリペプチド鎖のコーディング配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。
に記載される別のアプローチによれば、抗体分子の対を工学処理して、組換え細胞培養より回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にすることができる。好ましいインターフェイスは、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子のインターフェイス由来の1以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(例、チロシン又はトリプトファン)に置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例、アラニン又はスレオニン)に置き換えることによって、第二抗体分子のインターフェイス上に、大きな側鎖(複数)と同一又は類似の大きさの代償性空洞(compensatory cavities)が創出される。これにより、ホモ二量体のような他の望まれない最終産物に優って
ヘテロ二量体の収量を高めるための機序が提供される。
a.Fc領域及びFc受容体
上記に示した、開示モジュレーター(例、Fc−EFNA又は抗EFNA抗体)の可変又は結合領域に対する様々な修飾、置換、付加、又は削除に加えて、当業者は、本発明の選択態様が定常領域(即ち、Fc領域)の置換又は修飾も含み得ることを理解されよう。より具体的には、本発明のEFNAモジュレーターは、限定されないが、改変した薬物動態、増加した血清半減期、増加した結合親和性、低下した免疫原性、増加した産生、改変したFcリガンド結合、増強又は低下したADCC又はCDC活性、改変したグリコシル化及び/又はジスルフィド結合、及び変化した結合特異性が含まれる、好ましい特徴のある化合物をもたらす1以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異及び/又は修飾をとりわけ含有してよいと考慮される。この点に関して言えば、これらのFc変異体を有利にも使用して、開示モジュレーターの有効な抗新生物特性を高めることができると理解されよう。
うに定義される。Fc領域のC末端リジン(EU番号方式によれば残基447)は、例えば、抗体の産生又は精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に工学処理することによって除去してよい。従って、インタクト抗体の組成物は、すべてのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団、及びK447残基が有る抗体と無い抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。機能的なFc領域は、ネイティブ配列Fc領域のエフェクター機能を保有する。例示のエフェクター機能には、C1q結合;CDC;Fc受容体結合;ADCC;食作用;細胞表面受容体(例、B細胞受容体;BCR)の下方調節、等が含まれる。そのようなエフェクター機能には、概して、Fc領域が結合ドメイン(例、抗体可変ドメイン)と結びつくことが求められて、例えば、本明細書の諸定義において開示されるような様々なアッセイを使用して、評価することができる。
参照のこと)。FcRsについては、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991);Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994);及び de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。他のFcRも、将来同
定されるものを含めて、本明細書のFcRという用語に含まれる。Fc受容体又はFcRという用語には、ある事例では、母体IgGの胎児への輸送(Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 及び Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994))と免疫グロブリン
のホメオスタシスの調節の原因となる新生児受容体、FcRnも含まれる。FcRnへの結合を測定する方法が知られている(例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12) :592-598 (1997);Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997);Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004);WO2004/92219
(Hinton et al. を参照のこと)。
本明細書に使用するように、補体依存性細胞傷害及びCDCは、補体の存在下での標的細胞の溶解に関連する。この補体活性化経路は、補体系の第一成分(C1q)が、例えば、コグネイト抗原と複合した分子、抗体へ結合することによって始動される。補体活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202: 163 に記載のようなCDCアッセイを実施することができる。
親抗体又は非修飾抗体と、又はネイティブ配列のFc領域を含んでなるモジュレーターと比較して増強又は減少したFcR結合活性及び/又はADCC活性を有するものである。FcRへの増加した結合を示すモジュレーター変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のFc領域を含んでなるモジュレーターに優る親和性で少なくとも1つのFcRへ結合する。FcRへの減少した結合を示す変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のFc領域を含んでなるモジュレーターに劣る親和性で少なくとも1つのFcRへ結合する。FcRへの減少した結合を示すそのような変異体は、FcRに対する結合性をほとんど又は認められるほどに保有しない。例えば、当該技術分野で周知の技術によって決定されるように、ネイティブ配列のIgG Fc領域に比較して、例えば、FcRへの0〜20%の結合を保有する。
体は、当業者に公知の技術によって産生することができる。例えば、in vivo 半減期が増加した抗体は、FcドメインとFcRn受容体の間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を修飾すること(例えば、置換すること、欠失させること、又は付加すること)によって産生することができる(例えば、国際特許公開公報番号:WO97/34631;WO04/029207;米国特許第6,737,056号及び米国特許第2003/0190311号を参照のこと)。ヒトFcRnへの in vivo での結合とヒ
トFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期については、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株において、又は変異体Fc領域があるポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイすることができる。WO2000/42072は、FcRnへの結合が改善又は減少した抗体変異体について記載する。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
なお他の態様では、本発明の抗体のグリコシル化の様式又は組成が修飾される。より具体的には、本発明の好ましい態様は、1以上の工学処理された糖型、即ち、Fc領域を含んでなる分子へ共有結合的に付加される、改変したグリコシル化様式又は改変した炭水化物組成を含んでよい。工学処理された糖型は、限定されないが、エフェクター機能を増強又は低下させること、抗体の標的抗原への親和性を高めること、又は抗体の産生を高めることが含まれる、多様な目的に有用であり得る。低下したエフェクター機能が所望される事例では、その分子が非グリコシル化型で発現されるように工学処理し得ることが理解されよう。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の1以上の部位を改変することによって達成することができる。即ち、1以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失をもたらすことによってその部位でのグリコシル化を消失させる、1以上のアミノ酸置換を行うことができる(例えば、米国特許第5,714,350号及び6,350,861号を参照のこと)。逆に、1以上の追加のグリコシル化部位において工学処理することによって、Fc含有分子へエフェクター機能の増強又は結合の改善を付与することができる。
GlcNAc構造が増加した抗体といった、改変したグリコシル化組成を有するFc変異体も作製することができる。これらの、そして同様の改変したグリコシル化様式は、抗体のADCC能力を高めることが証明されてきた。工学処理される糖型は、当業者に公知の如何なる方法によっても、例えば、工学処理されたか又は変異体の発現株を使用することによって、1以上の酵素(例えばN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTI11))での同時発現によって、Fc領域を含んでなる分子を様々な生物又は様々な生物由来の細胞株において発現させることによって、又はFc領域を含んでなる分子が発現された後で炭水化物(複数)を修飾することによって産生してよい。例えば、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1、並びに欧州特許番号:EP1,176,195;PCT公開公
報:WO03/035835;WO99/54342、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)、米国特許第6,602,684号;米国仮特許出願シリアル番号:10/27
7,370;10/113,929;PCT WO00/61739A1;PCT WO01/292246A1;PCT WO02/311140A1;PCT WO02/30954A1;PotillegentTM技術(Biowa 社);GlycoMAbTMグリコシル化工学技術(GLYCART biotechnology AG);WO00061739;EA01229125;米国特許第2003/0115614号;Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 を参照のこと。
a.概論
慣用の手順を使用して(例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、所望のEFNAモジュレーターをコードするDNAを容易に単離して配列決定することができる。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞(又はファージ若しくは酵母由来のコロニー)は、そのモジュレーターが抗体であれば、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ場合がある。所望されるならば、この核酸を本明細書に記載のようにさらに操作して、融合タンパク質、又はキメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体が含まれる薬剤を創出することができる。より具体的には、単離DNA(修飾されている場合がある)を使用して、米国特許第7,709,611号に記載のような製造抗体のために、定常及び可変領域の配列をクローン化することができる。
抗体又はその抗原結合断片若しくは誘導体が含まれるEFNAモジュレーターをコードする核酸分子及び配列が明白に含まれると理解されるべきである。さらに本発明には、高いストリンジェンシーの下で、またあるいは、中間的又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(例えば、下記に定義するような)の下で、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸へ相補的なポリヌクレオチドへハイブリダイズする核酸又は核酸分子(例、ポリヌクレオチド)が含まれる。本明細書に使用する「核酸分子」又は「単離(された)核酸分子」という用語には、少なくともDNA分子とRNA分子が含まれると企図される。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。さらに、本発明は、そのようなモジュレーターコード化ポリヌクレオチドを取り込むどの担体又は構築体も含み、限定なしに、ベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド、又はウイルス構築体が含まれる。
示したように、本発明は、他の核酸へ特別なハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする核酸をさらに提供する。当該技術分野では、核酸をハイブリダイズさせる方法が周知である。例えば、「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク(1989)、6.3.1-6.3.6 を参照のこと。本出願の目的では、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、5x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)を含有するプレ洗浄溶液、約50%ホルムアミド、6xSSCのハイブリダイゼーション緩衝液と55℃のハイブリダイゼーション温度(又は、約50%ホルムアミドを含有するもののような他の同様のハイブリダイゼーション溶液を42℃のハイブリダイゼーション温度で)と、0.5xSSC、0.1% SDS中で60℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、6xSSC中45℃でハイブリダイズさせることに、0.1xSSC、0.2% SDS中68℃での1回以上の洗浄を続ける。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98、又は99%同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸が典型的には互い
にハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。より一般的には、本開示の目的では、「核酸配列に関して実質的に同一である」という用語は、参照の核酸配列に対して少なくとも約85%、又は90%、又は95%、又は97%の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈され得る。
分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」:コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、第9章及び11章;及び「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(1995)Ausubel et al.(監修)ジョン・ウィリー・アンド・サン
ズ社、セクション2.10 及び 6.3-6.4)に示されて、例えば、核酸の長さ及び/又は塩基
組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
RNA及び/又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸のような核酸と発現制御配列は、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるような様式でそれらが互いに共有結合的に連結しているならば、互いに機能的に連結している。その核酸が機能的なタンパク質へ翻訳されるならば、発現制御配列機能はコーディング配列へ機能的に連結していて、前記発現制御配列の誘導は、コーディング配列のフレームシフトを引き起こすことも、前記コーディング配列が所望のタンパク質又はペプチドへ翻訳されることが可能でないことも無く、前記核酸の転写をもたらす。
する。このことは、概して、特定の転写因子の結合によって媒介される。
分子クローニング技術の手引き(Guide to Molecular Cloning Techniques)」、アカデ
ミックプレス社(カリフォルニア州サンディエゴ);Sambrook et al.「分子クローニン
グ:実験マニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)」第3版、1-3 巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(2000)、及び「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」F. M. Ausubel et al.(監修)上掲、に説明されている。例えば、細胞の単離及び培養のために(例えば、後続の核酸又はタンパク質の単離のために)有用な他の参考文献には、Freshney(1994)「動物細胞の培養、基本技術マニュアル(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)」第3版、Wiley-Liss,ニューヨークとその中の参
考文献;Payne et al.(1992)「植物細胞及び組織の液体系培養(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク
州ニューヨーク;Gamborg and Phillips(監修)(1995)「植物細胞、組織、及び器官の培養;基礎的な方法のスプリンガー・ラボ・マニュアル(Plant Cell and Tissue Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual)」Springer-Verlag(ベルリン−ハイデ
ルベルグ−ニューヨーク)、及び Atlas and Parks(監修)「微生物培地ハンドブック(The Handbook of Microbiological Media)」(1993)CRCプレス(フロリダ州ボカラ
トン)が含まれる。核酸を作製する方法(例えば、in vitro 増幅、細胞からの精製、又
は化学合成によって)、核酸を操作する方法(例えば、制限酵素消化、ライゲーション、等による部位特異的突然変異誘発)、及び核酸を操作して作製するのに有用な様々なベクター、細胞株、等についても、上記の参考文献に記載されている。加えて、本質的には、どのポリヌクレオチド(例えば、標識化又はビオチニル化ポリヌクレオチドが含まれる)も、多様な市販供給源のいずれかより、カスタム又は標準注文することができる。
当該技術分野で認められた分子生物学技術と現行のタンパク質発現の方法論を使用して、所望のモジュレーターの実質的な量を産生することができる。より具体的には、上記に記載のように入手されて工学処理される抗体のようなモジュレーターをコードする核酸分子を、様々な種類の宿主細胞を含んでなる、周知の市販されているタンパク質産生系へ導入して、所望の医薬品の前臨床量、臨床量、又は市販量を提供することができる。好ましい態様において、モジュレーターをコードする核酸分子は、選択した宿主細胞中への効率的な組込みと所望されるEFNAモジュレーターの後続の高い発現レベルをもたらすベクター又は発現ベクターの中へ工学処理されると理解されよう。
細胞への導入の方法が周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド(複数)のリポソーム被包化、及びDNAの核中への直接的なマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子を哺乳動物細胞中へウイルスベクターによって導入してよい。当該技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、米国特許第4,399,216号、4,912,040号、4,740,461号、及び4,959,455号を参照のこと。さらに、当該技術分野では、植物細胞を形質転換する方法が周知であり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、生物銃(biolistic)形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、及びウイルス形
質転換が含まれる。当該技術分野では、細菌細胞や酵母細胞を形質転換する方法も周知である。
多くが市販されている、多様な宿主発現ベクター系は、本明細書の教示に適合可能であって、本発明のモジュレーターを発現するために使用し得る。そのような宿主発現系は、対象のコーディング配列が発現されて後に精製される媒体を意味するが、適正なヌクレオチドコーディング配列で形質転換されるか又はトランスフェクトされる場合は、本発明の分子を in situ で発現する細胞も意味する。そのような系には、限定されないが、モジ
ュレーターコーディング配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス)のような微生物;モジュレーターコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母(例、サッカロミセス属、ピキア属);モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染されたか又はそれを含有する組換えプラスミド発現ベクター(例、Tiプラスミド)でトランスフェクトされた植物細胞系(例、タバコ属、アラビドプシス属、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、等);又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例、メタロチオネインプロモーター)又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築体を収容する哺乳動物細胞系(例、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)が含まれる。
: 1791 (1983))[ここでは、融合タンパク質を産生するように、コーディング配列を該
ベクターの中へlacZコーディング領域と正しいフレームで個別にライゲート(ligate)し得る];pINベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (19
85);Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989))、等が含まれる。pGEXベクターも、グルタチオン5−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するのに使用してよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であって、溶解した細胞より、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合に続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位が含まれるように設計されているので、クローン化された標的遺伝子産物は、GST部分より放出され得る。
の非本質的な領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)へ個別にクローン化して、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置してよい。
のこと)。挿入されたコーディング配列の効率的な翻訳には、特定の始動シグナルが求められる場合もある。これらのシグナルには、ATG開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これら外因性の翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然と合成ともに、多様な起源のものであり得る。発現の効率は、適正な転写促進剤要素、転写ターミネーター、等の包含によって増強することができる(例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987) を参照のこと)。このように、当該技術分野では、発現用の宿主として利用し得る適合可能な哺乳動物細胞株が周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)より入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK−293T細胞、293 Freestyle 細胞(Life Technologies)、NIH−3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(B
HK)細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例、Hep G2)、A549細胞、及びいくつかの他の細胞株が含まれる。
おいて特に有用であり得る。
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 48:202 (1992))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et
al., Cell 22:8 17 (1980))の遺伝子がそれぞれtk−、hgprt−、又はaprt
−の細胞中で利用され得る系を含めて、使用することができる。また、代謝拮抗薬への抵抗性を以下の遺伝子の選択についての基礎として使用することができる:メトトレキセートに対する抵抗性を付与する、dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357
(1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981));ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する、gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981));アミノグリコシドG−418に対する抵抗性を付与する、neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 及び Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH
11(5):155-2 15 (May, 1993));並びに、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する、
hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984))。所望の組換えクローンを選択す
るには、当該技術分野で一般に公知の組換えDNA技術の方法を定型的に適用してよくて、そのような方法については、例えば、Ausubel et al. (監修)「分子生物学の最新プロ
トコール(Current Protocols in Molecular Biology)」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(1993);Kriegler,「遺伝子の移入及び発現:実験マニュアル(Gene Transfer and
Expression, A Laboratory Manual)」ストックトン・プレス、ニューヨーク(1990);及び、Dracopoli et al.(監修)「ヒト遺伝学の最新プロトコール(Current Protocols in Human Genetics)」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク(1994)中12及び13章;Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981) に記載されている。安定した高収量細胞株を確立する1つの特に好ましい方法は、ある条件の下で発現を高めるのに効率的なアプローチを提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)を含むと理解されよう。このGS系については、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、EP特許:0216846、0256055、0323997、及び0338841に関連して、その全体又は一部が考察されている。
上述した宿主細胞株以外に、本発明のモジュレーターは、当該技術分野で公知の技術を使用して、化学的に合成し得ることが理解されよう(例えば、Creighton (1983)「タンパ
ク質:構造及び分子の諸原理(Proteins: Structures and Molecular Principles)」W. H. フリーマン社、ニューヨーク、及び Hunkapiller, M., et al.(1984)Nature 310: 105-111 を参照のこと)。例えば、本発明のポリペプチド断片に対応するペプチドをペプ
チド合成機の使用によって合成することができる。さらに、所望されるならば、ポリペプチド配列中への代用物又は付加物として非典型型アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を導入することができる。非典型型アミノ酸には、限定されないが、通常のアミノ酸のD−異性体、2,4−ジアミノ酪酸、a−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、g−Abu、e−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b−アラニン、フルオロ−アミノ酸、b−メチルアミノ酸、Ca−メチルアミノ酸、Na−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、並びにアミノ酸類似体全般が含まれる。さらに、アミノ酸は、D(右旋性)でもL(左旋性)でもよい。
本発明のEFNAモジュレーターはまた、対象の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖配列(又は、その断片若しくは誘導体若しくは変異体)についてトランスジェニックである哺乳動物又は植物の産生と、所望の化合物の回収可能形態での産生により、トランスジェニックに産生することができる。哺乳動物中でのトランスジェニック産生に関連して、抗EFNA抗体は、例えば、ヤギ、ウシ、又は他の哺乳動物において産生されて、その乳より回収することができる。例えば、米国特許第5,827,690号、5,756,687号、5,750,172号、及び5,741,957号を参照のこと。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を上記に記載のようにEFNA又はその免疫原性部分で免疫化する。抗体を植物中で作製する方法については、例えば、米国特許第6,046,037号及び5,959,177号に記載されている。
Embryo: A Laboratory Manual)」第2版、コールドスプリングハーバー出版局(1999)
;Jackson et al.「マウスの遺伝学とトランスジェニック技術:実践アプローチ(Mouse Genetics and Transgencs: A Practical Approach)」オックスフォード大学出版局(2000);及び Pinkert「トランスジェニック動物技術:実験手引き(Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook)」アカデミックプレス(1999)を参照のこと。いくつかの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、対象の重鎖及び/又は軽鎖をコードする標的化構築体による、標的指向された破壊及び置換を有する。1つの態様において、トランスジェニック動物は、EFNAへ特異的に結合する重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含んで発現する。抗EFNA抗体は、どのトランスジェニック動物でも作製してよいが、特に好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマである。さらなる態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、所望の医薬品を血液、乳、尿、唾液、涙液、粘液、及び他の体液において発現して、それは、当該技術分野で認められた精製技術を使用して、容易に入手することができる。
本明細書に開示する組換え発現技術又は他の技術のいずれによっても本発明のモジュレーターを産生したならば、それは、免疫グロブリンの精製について当該技術分野で公知の如何なる方法によって精製してもよく、又はより一般的には、タンパク質の精製についての如何なる他の標準技術によって精製してもよい。この点に関して言えば、モジュレーターは、単離することができる。本明細書に使用するように、単離EFNAモジュレーターとは、同定されて、その本来の環境の成分より分離及び/又は回収されたものである。その本来の環境の混在成分は、該ポリペプチドの診断又は療法上の使用に干渉し得る物質であって、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性の溶質が含まれる場合がある。単離モジュレーターには、該ポリペプチドの本来環境の少なくとも1つの成分も存在していないという理由から、組換え細胞内の in situ モジュレーターが含ま
れる。
周辺腔へ分泌される抗体を単離する手順について説明する。簡潔に言えば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分にわたり融解する。遠心分離によって細胞残滓を取り除くことができる。抗体が培地中へ分泌される場合、一般的には、そのような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン(Amicon)又はミリポア(Millipore)ペリコン(Pellicon)限外濾過ユニットを使用して初めに濃縮する。上記工程
のいずれでも、タンパク質加水分解を防ぐためにPMSFのようなプロテアーゼ阻害剤を含めてよくて、偶発的な汚染体の増殖を防ぐために抗生物質を含めてよい。
築体に存在するあらゆる免疫グロブリンFcドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインAを使用して、ヒトのIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖に基づいた抗体を精製することができる(Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983))。すべてのマウスアイソタイプとヒトIgG3には、プロテインGが推奨されている(Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986))。親和性リガンドが付着するマトリックスは、多くの場合、ほぼアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るものより速い流速とより短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合は、Bakerbond ABXTM樹脂(J. T. Baker;ニュージャージ
ー州フィリップスバーグ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画化、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン樹脂でのセファロースクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラムのような)、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿といった、タンパク質精製用の他の技術も、回収すべき抗体に依って利用可能である。特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、少なくとも一部は、プロテインA若しくはプロテインG親和性クロマトグラフィーを使用して精製される。
本明細書の教示に従って本発明のモジュレーターを精製したならば、それらは、医薬活性部分又は診断部分、又は生体適合性の修飾剤と連結、融合、コンジュゲートさせる(例えば、共有結合的又は非共有結合的に)、又は他の方法で会合させることができる。本明細書に使用するように、「コンジュゲート(conjugate)」という用語は概括的に使用さ
れて、会合の方法に拘らず、開示モジュレーターと会合したあらゆる分子を意味するものとする。この点に関して言えば、そのようなコンジュゲートは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、低分子、模倣薬剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性同位体を含んでよいと理解されよう。さらに、上記に示したように、選択したコンジュゲートは、モジュレーターへ共有結合的又は非共有結合的に連結してよく、少なくとも一部は、このコンジュゲーションを有効にするために使用される方法に依存して、様々なモル比を示し得る。
ることができる。さらに、異種ポリペプチドへ融合又はコンジュゲートしたモジュレーターはまた、in vitro イムノアッセイに使用し得て、当該技術分野で公知の精製の方法論
と適合可能であり得る。例えば、国際特許公開公報番号:WO93/21232;欧州特許番号:EP439,095;Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99;米
国特許第5,474,981号;Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432;及び Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452 を参照のこと。
好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、モジュレーター特徴を所望のように調整、改変、改善、又は加減するために使用し得る、生体適合性の修飾剤とコンジュゲートさせるか又は他の方法で会合させることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール(PEG)又は同様の生体適合性ポリマーといった、相対的に分子量が高いポリマー分子を付着させることによって、in vivo 半減期が増加した抗体又は融合構築体を産生することができる。当業者は、該抗体へ特異的な特性を付与する(例えば、半減期を設計することができる)ように選択することが可能である、多くの異なる分子量及び分子配置でPEGを入手し得ることを理解されよう。PEGは、多機能性リンカーを伴うか又は伴わずに、前記抗体又は抗体断片のN若しくはC末端へのPEGの部位特異的なコンジュゲーションによるか、又はリジン残基上に存在するε−アミノ基を介して、モジュレーター又は抗体断片若しくは誘導体へ付着させることができる。生理活性の損失をほとんどもたらさない、線状又は分岐鎖ポリマーの誘導体化を使用してよい。コンジュゲーションの度合いは、SDS−PAGE及び質量分析法によって密接にモニターして、PEG分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のPEGは、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−PEGコンジュゲートより分離することができる。同様の方法で、開示モジュレーターをアルブミンへコンジュゲートさせて、抗体又は抗体断片を in vivo でより安定にするか又はより長い in vivo 半減期を持たせることができる。この技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、国際特許公開公報番号:WO93/15199、WO93/15200、及びWO01/77137;及び欧州特許第0413,622号を参照のこと。当業者には、他の生体適合性コンジュゲートが明らかであって、本明細書の教示に従って容易に確定することができる。
他の好ましい態様では、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは誘導体を、診断又は検出可能な薬剤、生体分子であり得るマーカー又はレポーター(例、ペプチド又はヌクレオチド)、低分子、フルオロフォア、又は放射性同位体へコンジュゲートする。標識化モジュレーターは、過剰増殖性障害の発症又は進行をモニターするのに、又は開示モジュレーターが含まれる特別な療法の効力を決定するための臨床検査手技(即ち、診断・治療)の一部として有用であり得る。そのようなマーカー又はレポーターは、選択したモジュレーターを精製すること、TICを分離又は単離すること、又は前臨床手順又は毒性試験においても有用であり得る。
又は特定の放射性同位体へコンジュゲートした分子が含まれる、検出可能な物質へ当該モジュレーターをカップリングすることによって達成することができる。そのような態様において、当該技術分野では、適正な検出の方法論が周知であり、数多くの市販供給源より容易に入手可能である。
al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 に記載されるように、例えば、
ヘキサヒスチジン(配列番号166)は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザへマグルチニンタンパク質(Wilson et al., 1984, Cell 37:767)に由来するエピトープに対応する、へマグルチニン「HA」タグと「flag(フラッグ)」タグ(米国特許第4,703,004号)が含まれる。
先に述べたように、当該モジュレーター又はその断片若しくは誘導体はまた、抗癌剤、細胞毒素又は細胞傷害剤(例、細胞増殖抑制剤又は細胞致死剤)、治療薬剤、又は放射活性金属イオン(例、α又はβ−放出体)のような治療薬部分へコンジュゲート、連結、又は融合させるか又は他の方法でそれと会合させてよい。本明細書に使用するように、細胞毒素又は細胞傷害剤には、細胞に有害であって、細胞の増殖又は生存を阻害し得るあらゆる薬剤又は治療薬部分が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、DM−1a及びDM−4(Immunogen 社)のようなメイタンシノイド類、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミドとこれらの類似体又は相同体が含まれる。追加の細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)及びモノメチルアウリスタチンF(MMAF)(Seattle Genetics 社)が含まれるアウリ
スタチン類、α−アマンチン、β−アマンチン、γ−アマンチン又はε−アマンチン(Heidelberg Pharma AG)のようなアマンチン類、デュオカマイシン誘導体(Syntarga, B. V.)のようなDNA副溝結合剤、及び修飾されたピロロベンゾジアピン二量体(PBD、Spirogen 社)を含む。さらに、1つの態様において、本発明のEFNAモジュレーターは、抗CD3結合分子と会合して細胞傷害性T細胞を動員して、それらを腫瘍始原細胞へ標的指向させることができる(BiTE技術;例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Fuhrmann, S. et. al. AACR年次会合抄録番号:5625(2010)を参照のこと)。
照により本明細書に組み込まれる、PCT公開公報:WO03/075957及び米国特許第2009/0155255号に見出すことができる。
開公報:WO96/04388及びWO91/06570;Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535;Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590;及び Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337 を参照のこと。ある部分とモジュレーターの会合は、必ずしも直
接的である必要はなくて、リンカー配列を介して生じてよい。当該技術分野では、そのようなリンカー分子が一般に公知であり、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4 :2483;Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553;Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26: 943;Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 に記載されている。
た薬物送達(Controlled Drug Delivery)第2版」Robinson et al.(監修)中、Hellstrom et al.「薬物送達用の抗体(Antibodies For Drug Delivery)」623-53頁(マーセル・デッカー社、1987);「モノクローナル抗体 '84:生物学及び臨床上の応用(Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications)」Pinchera et al.(監修)中、Thorpe「癌療法における細胞傷害剤の抗体担体:概説(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)」475-506頁 (1985);「癌の検出及び療
法用のモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies For Cancer Detaction and Therapy)」Baldwin et al.(監修)中、「放射標識化抗体の癌療法における療法上の使用の分析、結果、及び将来展望(Analysis, Results And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)」 303-16頁(アカデミック・プ
レス、1985)、及び Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119 を参照のこと。好ましい態様では、治療薬部分又は細胞傷害剤へコンジュゲートしたEFNAモジュレーターを細胞表面と会合したEFNA分子への結合時に細胞によって内在化させて、それによって治療薬ペイロードを送達することができる。
a.診断
示したように、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、診断する、又はモニターするための in vitro 又は in vivo の方法と、TPCが含まれる腫瘍形成細胞を同定するため
に患者由来の細胞についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法には、患者又は患者より入手した試料を本明細書に記載のような選択したEFNAモジュレーターと接触させて、試料中の結合型又は遊離エフリンAリガンドへの該モジュレーターの会合の存在又は非存在、又はそのレベルを検出することを含んでなる、癌の治療又はその進行のモニタリングのために癌を有する個体を同定することが含まれる。該モジュレーターが抗体又はその免疫学的に活性な断片を含む場合、試料中の特別なEFNAとの会合は、該試料が腫瘍永続化細胞(例、癌幹細胞)を含有し得る可能性があることを示し、癌を有する個体が本明細書に記載のようなEFNAモジュレーターで効果的に治療され得ることを示唆する。この方法は、対照への結合のレベルを比較する工程をさらに含んでよい。逆に、選択したモジュレーターがFc−EFNAである場合、試料との接触時に、選択したエフリンAリガンドの結合特性を(in vivo 又は in vitro で直接的又は間接的に)利用してモニターして、所望の情報を得ることができる。当該技術分野では、本明細書の教示と適合可能な他の診断又はセラグノーシスの方法が周知であり、専用のレポーティング系の
ような市販の材料を使用して、実践することができる。
セラグノーシス又は診断は、当該技術分野で認められた、磁気共鳴造影法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(例、CATスキャン)、ポジトロン断層撮影法(例、PETスキャン)、X線撮影法、超音波法、等のような造影又はモニタリング技術を含んでよい。当業者には、障害の病因、病理学的症状、又は臨床進行に基づいて、適正な検出、モニタリング、又は造影技術(他の市販の供給源を含んでなる)を認識して実行することが容易に可能であろう。
提供する。別の態様において、癌の進行及び/又は発病の in vivo 分析は、腫瘍進行の
程度を決定することを含む。別の態様において、分析は、腫瘍の同定を含む。別の態様では、腫瘍進行の分析を原発性腫瘍について実施する。別の態様では、当業者に公知のような癌の種類に依存して、分析を経時的に実施する。別の態様では、原発性腫瘍の転移細胞を起源とする続発性腫瘍のさらなる分析を in vivo で分析する。別の態様では、続発性
腫瘍の大きさと形状を分析する。いくつかの態様では、さらなる体外(ex vivo)分析を
実施する。
、原発性腫瘍から断続している部位での細胞の進行性増殖の決定を含む。別の態様において、細胞転移分析の部位は、新生物拡散の経路を含む。いくつかの態様では、細胞が血管系構造、リンパ管を介して、体腔内で、又はこれらの組合せで分散することができる。別の態様では、細胞遊走、播種、滲出、増殖、又はこれらの組合せの観点で細胞転移分析を実施する。
な治療を確定する、又は患者における障害の進行(又は退縮)をモニターするためのキットを提供し、ここで該キットは、本明細書に記載のようなモジュレーターと、試料に対する該モジュレーターの影響を検出するための試薬を含む。
当該EFNAモジュレーターとそれを含んでなる細胞、培養物、集団、並びに組成物(それらの子孫が含まれる)はまた、エフリンAリガンド(例えば、そのポリペプチド又は遺伝成分)と相互作用することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼす化合物又は薬剤(例、薬物)をスクリーニングするか又は同定するために使用することができる。故に、本発明は、EFNA又はその基質と会合することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼし得る化合物又は薬剤の評価又は同定のためのシステム及び方法をさらに提供する。そのような化合物及び薬剤は、例えば、過剰増殖性障害の治療についてスクリーニングされる薬物候補であり得る。1つの態様において、システム又は方法には、EFNAを明示する腫瘍始原細胞と化合物又は薬剤(例、薬物)が含まれ、ここで該細胞と化合物又は薬剤(例、薬物)は、互いに接触している。
用の特別な例は、物理的な相互作用である。間接的な相互作用の特別な例は、組成物が中間分子に作用して、次いでそれが参照実体(例、細胞又は細胞培養物)と相互作用する。
、情報をごく高速で処理する自動分析を利用する技術が開発されてきた(例えば、Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 133 (2004) を参照のこと)。例
えば、特定遺伝子の情報を提供する一方で、何千もの遺伝子の相互作用を同時に精査するためのマイクロアレイ技術が広汎に利用されてきた(例えば、Mocellin and Rossi, Adv.
Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007) を参照のこと)。
アデノウイルストランスフェクションベクターが含まれる。
a.製剤と投与経路
モジュレーターの形態、並びに任意選択のコンジュゲート、企図される送達形式、治療又はモニターされる疾患、及び他の数多くの変数に依存して、本発明の組成物は、当該技術分野で認められた技術を使用して、所望されるように製剤化してよい。即ち、本発明の様々な態様では、EFNAモジュレーターを含んでなる組成物を多種多様な医薬的に許容される担体とともに製剤化する(例えば、Gennaro「レミントン:調剤の科学と実践:事
実と比較(Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons)」Drugfacts Plus, 第20版 (2003); Ansel et al.「医薬剤形と薬物送達系(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)」第7版、Lippencott Williams and Wilkins(監修)(2004); Kibbe et al.「医薬賦形剤の手引き(Handbook of Pharmaceutical Excipients)」第3版、Pharmaceutcal Press (2000) を参照のこと)。媒体、ア
ジュバント、及び希釈剤が含まれる、様々な医薬的に許容される担体が数多くの市販供給源より容易に利用可能である。さらに、pH調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤、等のような、医薬的に許容される補助物質の取り合わせも利用可能である。ある非限定的な例示の担体には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれる。
マック・パブリッシング(2000)に説明されている。非経口投与に適した製剤には、水溶型の活性化合物、例えば、水溶性塩の水溶液剤が含まれる。加えて、油性の注射懸濁液剤
に適正のような活性化合物の懸濁液剤も投与し得る。好適な脂溶性の溶媒又は媒体には、脂肪油剤、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル類、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドが含まれる。水性注射懸濁液剤は、該懸濁液剤の粘度を高める物質を含有してよくて、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び/又はデキストランが含まれる。懸濁液剤は、安定化剤を含有してもよい。また、リポソーム剤を使用して、細胞中への送達のために薬剤を被包化することができる。
る。主題の組成物は、調製物へ固体、半固体、液体、又は気体の形態で製剤化し得て;限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、及びエアゾール剤が含まれる。企図される適用と療法レジメンに従って、適正な製剤と投与経路を選択してよい。
同様に、特別な投与レジメン(即ち、用量、時機、及び反復)は、特別な個体とその個体の治療歴に依存するものである。投与量の決定には、薬物動態(例、半減期、クリアランス速度、等)のような経験的な考慮事項が寄与する。投与の頻度は、療法の経過にわたって決定して調整してよくて、腫瘍始原細胞が含まれる過剰増殖性細胞又は新生物細胞の数を低下させること、そのような新生物細胞の低下を維持すること、新生物細胞の増殖を低下させること、又は転移の発現を遅らせることに基づく。あるいは、主題の治療組成物の持続した連続放出製剤が適正であり得る。上記に述べたように、当該技術分野では、持続放出を達成するための様々な製剤及びデバイスが公知である。
SAを使用する、本発明の選択された態様において、モジュレーターは、10mg/m2〜800mg/m2の投与量で投与してよい。他の好ましい態様において、該モジュレーターは、50mg/m2〜500mg/m2の投与量で、そしてなおより好ましくは、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、又は450mg/m2の投与量で投与される。当然ながら、投与量をどのように計算するかに拘らず、選択された時間帯にわたって多数の投与量を投与して、個々の投与より実質的に高い絶対的な投与量を提供してよい。
本発明によって考慮される組合せ療法は、望まれない新生物細胞増殖(例、内皮細胞)を減少させるか又は阻害すること、癌の発生を減少させること、癌の再発を減少させるか又は予防すること、又は癌の広がり又は転移を減少させるか又は予防することに特に有用であり得る。そのような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊(例、NTG細胞)を支援して永続化させるTPCを除去することによって増感剤又は化学増感剤として機能し得て、現行の標準治療の腫瘍減量剤又は抗癌剤のより有効な使用を可能にし得る。即ち、EFNAモジュレーターと1以上の抗癌剤を含んでなる組合せ療法を使用して、定着した癌を減衰させる(例えば、存在する癌細胞の数を減少させる、及び/又は腫瘍負荷を減少させる)、又は癌の少なくとも1つの徴候又は副作用を改善することができる。このように、組合せ療法は、EFNAモジュレーターと1以上の抗癌剤(限定されないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制薬剤、化学療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、免疫療法剤、癌ワクチン、抗血管新生剤、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、及び抗転移剤が含まれる)の投与に関連する。
である。さらに、本発明は、組合せ治療が相乗効果を明示することを求めない。しかしながら、当業者は、好ましい態様を含むある選択した組合せでは、相乗作用が観測され得ることを理解されよう。
に続く腫瘍再発の見込みを低下又は消失させるために、維持療法で使用されてよい。好ましくは、該障害は、治療が済んで、患者が無症候性又は寛解状態にあるように、最初の腫瘍塊は、消失、低下、又は他の様式で改善している。このような時間に、標準の診断手順を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くないとしても、被検者へ開示モジュレーターの医薬有効量を1回以上投与してよい。いくつかの態様において、エフェクターは、ある時間帯にわたり規則的なスケジュールで投与される。例えば、EFNAモジュレーターは、毎週、毎2週、毎月、毎6週、毎2ヶ月、毎3ヶ月、毎6ヶ月、又は毎年で投与することができる。本明細書の教示があれば、当業者は、疾患再発の潜在可能性を低下するのに好ましい投与量及び投薬レジメンを容易に決定することができよう。さらに、そのような治療は、患者の応答と臨床及び診断の諸変数に依って、数週、数ヶ月、数年の期間、又は無期限でも続けることができる。
示に使用されるように、腫瘍減量術は概括的に定義されて、腫瘍又は腫瘍増殖を消失、低下、治療、又は改善するあらゆる手順、技術、又は方法を意味する。例示の腫瘍減量術には、限定されないが、外科手術、放射線治療(即ち、ビーム放射線)、化学療法、又は除去が含まれる。本開示に照らして当業者によって容易に決定される適正な時間で、臨床及び診断、又はセラグノーシスの手順によって示唆されるように、腫瘍転移を抑えるためにEFNAモジュレーターを投与してよい。当該モジュレーターは、標準的な技術を使用して決定されるように、医薬的に有効な投与量で1回以上投与してよい。好ましくは、投薬レジメンには、それを必要に応じて変更することを可能にする、適正な診断又はモニタリング技術が付随するものである。
本明細書に使用するように、「抗癌剤」という用語は、癌のような細胞増殖性障害を治療するために使用し得るあらゆる薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制薬剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法と放射線療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、抗体、及び免疫療法剤が含まれる。上記に考察したような選択態様では、抗癌剤がコンジュゲートを含む場合があって、投与に先立ってモジュレーターと会合させてよいと理解されよう。
ナリス(saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、
フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン類)、又は動物(例、細胞外膵臓RNアーゼのような細胞傷害性RNアーゼ;DNアーゼI)に由来する、低分子毒素又は酵素活性毒素が含まれて、これらの断片及び/又は変異体が含まれる。
、概して速やかに増殖及び***する癌性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合させて、それにより細胞が有糸***に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、癌性細胞、又は癌性になるか又は腫瘍形成性の子孫(例、TIC)を産生する可能性がある細胞を阻害するか又は阻害するように設計されたあらゆる化学薬剤を含めることができる。そのような薬剤は、多くの場合、組合せて(例えば、CHOP処方において)投与され、そして多くの場合、最も効果的である。
GF発現阻害剤及びHER2発現阻害剤のようなリボザイム;ワクチン類、プロロイキン(PROLEUKIN)(登録商標)rIL−2;ラルトテカン(LURTOTECAN)(登録商標)トポイソメラーゼ1阻害剤;アバレリクス(ABARELIX)(登録商標)rmRH;ビノレルビン及びエスペラマイシン類、及び上記のいずれもの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。他の態様は、限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、及びブレンツキシマブ・ベドチンが含まれる、癌療法について承認された抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合可能である追加の抗癌剤を容易に同定することができよう。
本発明はまた、放射線療法(即ち、γ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、等といった、DNA損傷を腫瘍細胞内で局所的に誘発するあらゆる機序)とEFNAモジュレーターの組合せを提供する。腫瘍細胞へ指向された放射性同位体の送達を使用する組合せ療法も考慮されて、標的指向された抗癌剤又は他の標的化手段と共に使用してよい。典型的には、放射線療法は、約1〜約2週の時間帯にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部癌を有する被検者へ約6〜7週の間投与することができる。放射線療法は、単一用量として投与してもよく、多数回の連続用量として投与してもよい。
単独、又は抗癌剤又は放射線療法との組合せのいずれで投与しても、本発明のEFNAモジュレーターは、一般的には、良性又は悪性の腫瘍(例、腎癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝細胞癌;肉腫;膠芽腫;及び様々な頭頚部腫瘍);白血病とリンパ系悪性腫瘍;神経細胞、神経膠細胞、星状細胞、視床下部、及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質、及び割腔の障害のような他の障害;並びに、炎症性障害、血管新生障害、免疫障害、及び病原体によって引き起こされる障害が含まれ得る、患者又は被検者の新生物状態を全般的に治療するのに特に有用である。本発明の治療組成物及び方法での治療に特に好ましい標的は、固形腫瘍を含んでなる新生物状態である。他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、血液悪性腫瘍の診断、予防、又は治療に使用してよい。本明細書に使用するように、この用語は、明白に、あらゆる哺乳動物種を含むとみなされるが、好ましくは、治療される被検者又は患者はヒトであろう。
imperfecta ossium)、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管癌、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頚部癌、島細胞腫瘍、カポシ肉腫、腎臓癌(腎芽腫、乳頭状腎細胞癌)、白血病、脂肪腫/良性脂肪様腫瘍、脂肪肉腫/悪性脂肪様腫瘍、肝臓癌(肝芽腫、肝細胞癌)、リンパ腫、肺癌(小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、等)、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、多発性内分泌新生物、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後ブドウ膜黒色腫、稀な血液系障害、腎転移癌、横紋筋肉腫様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、及び子宮癌(子宮頚癌、子宮内膜癌、及び平滑筋腫)が含まれる群より選択され得る。ある好ましい態様において、癌性細胞は、限定さ
れないが、乳癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、肉腫、腎転移癌、甲状腺転移癌、及び淡明細胞癌が含まれる固形腫瘍の群より選択される。
ONCOLOGY)」第2巻:2131-2145(DeVita et al(監修)、第5版、1997)中 Gaidono et al.「リンパ腫(Lymphomas)」を参照のこと。当業者には、上記のリンパ腫が、多くの場合、分類体系の変更によって異なる名称を有するであろうことと、異なる名称下に分類されるリンパ腫を有する患者も本発明の組合せ療法レジメンより利益を得る可能性があることとが明らかなはずである。
結直腸癌患者のほぼ85%でAPC遺伝子に突然変異があって(Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361: 2449-60)、家族性大腸腺腫症と結直腸癌の患者では、800より多いAPC突然変異が特性決定されてきた。これら突然変異の大多数が、β−カテニンの破壊に媒介する機能能力が低下した、末端切断型のAPCタンパク質をもたらす。β−カテニン遺伝子、CTNNB1中の突然変異はまた、該タンパク質の増加した安定化をもたらし得て、いくつかの発癌転写プログラムの細胞核輸入と後続の活性化をもたらすが、これは、突然変異したAPCがβ−カテニン破壊に適正に媒介し得ないこと(正常な細胞増殖及び分化のプログラムを阻止するために必要とされる)より生じる発癌の機序でもある。
)。EFNAリガンドへ結合してEph受容体結合と作動するか又はそれに拮抗するモジュレーターを使用することは、発癌促進プロセスを変化させる、妨害する、又は逆転させる可能性がある。あるいは、EFNAモジュレーターは、EFNAモジュレーターの結合選好性に基づいて、Eph/エフリン相互作用が異常な腫瘍細胞へ選好的に結合する可能性がある。従って、上記に言及した遺伝形質を担う担癌患者は、上述したEFNAモジュレーターでの治療より利益を得る可能性がある。
EFNAモジュレーターの1以上の用量を含んでなる1以上の容器を含んでなる、医薬パック及びキットも提供される。ある態様では、単位投与量が提供され、ここで該単位投与量は、例えば、抗EFNA抗体を1以上の追加薬剤の有り無しで含んでなる所定量の組成物を含有する。他の態様では、そのような単位投与量が単回使用の注射用充填済みシリンジにおいて供給される。なお他の態様において、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖、等;リン酸塩、等のような緩衝液を含んでよい;及び/又は、安定して有効なpH範囲内で製剤化してよい。あるいは、ある態様において、当該組成物は、適正な液体、例えば、無菌水の添加時に復元され得る凍結乾燥散剤として提供してよい。ある好ましい態様において、当該組成物は、タンパク質凝集を阻害する1以上の物質(限定されないが、ショ糖及びアルギニンが含まれる)を含む。その容器(複数)上にあるか又はそれに付随したどのラベルも、開示組成物が第一選択の疾患状態を診断又は治療するために使用されることを示す。
な多様な材料より生成され得る。容器は、該状態を治療するのに有効である組成物を保持して、無菌のアクセスポートを有してよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。そのようなキットは、一般に、好適な容器中に、EFNAモジュレーターの医薬的に許容される製剤を含有して、同じか又は異なる容器に1以上の抗癌剤を含有してもよい。当該キットは、診断又は組合せ療法のいずれかのために、他の医薬的に許容される製剤を含有してよい。例えば、本発明のEFNAモジュレーターに加えて、そのようなキットは、化学療法薬又は放射線療法薬;抗血管新生薬剤;抗転移剤;標的化抗癌剤;細胞傷害剤;及び/又は他の抗癌剤といった幅広い抗癌剤のどの1以上も含有してよい。そのようなキットはまた、抗癌剤又は診断剤とEFNAモジュレーターをコンジュゲートするのに適正な試薬を提供する(例えば、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,422,379号を参照のこと)。
本発明の他の好ましい態様はまた、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)、又はレーザー媒介分画法のような方法を介して腫瘍始原細胞の集団又は亜集団を同定、単離、分画、又は濃縮するのに有用な道具としての開示モジュレーターの特性を利用する。当業者は、癌幹細胞が含まれるTICの特性決定及び操作に適合可能ないくつかの技術において当該モジュレーターが使用し得ることを理解されよう(例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号:12/686,359、12/669,136、及び12/757,649を参照のこと)。
本明細書において他に定義されなければ、本発明に関連して使用される科学及び技術用
語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に求められなければ、単数形の用語には複数が含まれて、複数形の用語には単数が含まれる。より具体的には、本明細書と付帯の特許請求項において使用されるように、単数形の冠詞(「a」「an」及び「the」)には、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の指示語が含まれる。このように、例えば、「タンパク質(a protein)」への言及
には、複数のタンパク質が含まれ;「細胞(a cell)」への言及には、細胞の混合物が含まれる、といった具合である。加えて、本明細書と付帯の特許請求項において提供される範囲には、両方の終点とその終点間のすべての点が含まれる。故に、2.0〜3.0の範囲には、2.0、3.0と2.0と3.0の間のすべての点が含まれる。
ングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(2000);Ausubel et al.「分子生物学の簡略プロトコール:分子生物学の最新プロトコールからの方法の要約(A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology)」Wiley, John & Sons 社(2002);Harlow and Lane「抗体の使用法:実験マニュア
ル(Using Antibodies: A Laboratory Manual)」コールドスプリングハーバーラボラト
リー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1998);及び、Coligan et al.「タンパク質科学の簡略プロトコール(Short Protocols in Protein Science)」Wiley, John & Sons 社(2003)を参照のこと。酵素反応と精製技術は、当該技術分野で通常
実施されているか又は本明細書に記載のように、製造業者の仕様に従って実施する。本明細書に記載のような分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び製薬化学に関連して使用される命名法とその実験手順及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。
腫瘍始原細胞集団の濃縮
癌患者の中に存在するような固形腫瘍の細胞異種性について特性決定し、特別な表現型マーカーを使用して腫瘍永続化細胞(TPC;即ち、癌幹細胞:CSC)の同一性を解明して、臨床意義のある療法標的を同定するために、当該技術分野で認められた技術を使用して大きな非従来型の異種移植片(NTX)腫瘍バンクを開発して維持した。多数の別個の腫瘍細胞株を含んでなるNTX腫瘍バンクを、免疫不全マウスにおいて、当初は多様な
固形悪性腫瘍に罹患している数多くの癌患者より得られた異種の腫瘍細胞を多数回にわたって継代することを通じて、増殖させた。明確に定義された系統を有する多数の個別の初期継代NTX腫瘍細胞株が継続して利用可能であることで、この細胞株より精製された細胞の再現可能で反復性の特性決定を可能にするようなTPCの同定及び単離が大いに促進される。より具体的には、単離又は精製されたTPCは、その細胞の起源となった患者腫瘍試料を反復するマウスにおいて、表現型でも形態学的にも異種の腫瘍を産生するそれらの能力に従って、レトロスペクティブに極めて正確に特徴付けられる。このように、単離細胞の小集団を使用して完全に異種の腫瘍をマウスにおいて産生する能力は、その単離細胞がTPCを含むという事実を強く示唆する。そのような研究において、最小限に継代されたNTX細胞系の使用は、in vivo 実験を大いに単純化して、容易に証明可能な結果を提供する。さらに、初期継代NTX腫瘍はまた、イリノテカン(即ち、Camptosar(登録商標))のような治療薬剤に反応して、腫瘍増殖、現行療法への抵抗性、及び腫瘍再発を推進する根源的な機序への臨床的に関連性のある見識を提供する。
に配置された、数百もの別々の結合分子を含んでなる専用のプロテオミックプラットフォームであって、ここで各ウェルは、フィコエリトリン蛍光チャネル中の別個の抗体とプレート全体で各ウェルに配置された異なる蛍光色素の多数の追加抗体を含有する。これにより、非フィコエリトリンチャネルを介して関連細胞を迅速に包含させ、又は非関連細胞を除外することを通じて、選択した腫瘍細胞の亜集団における対象の抗原の発現レベルの決定が可能になる。この PhenoPrint Array を当該技術分野で周知の組織解離、移植、及び幹細胞の技術(Al-Hajj et al., 2004, Dalerba et al., 2007 及び Dylla et al., 2008, いずれも上掲、このそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる)と組み合わせて使用した場合、関連マーカーを効果的に同定した後で、特異的なヒト腫瘍細胞亜集団をきわめて効率的に単離及び移植することが可能であった。
細胞及び腫瘍間質よりTIC又はTPCをあらかじめ識別するタンパク質又はマーカーの迅速な同定を可能にして、NTX腫瘍モデルから分離されるときに、特異的な細胞表面タンパク質の異なるレベルを発現する腫瘍細胞亜集団の相対的に迅速な特性決定を提供した。特に、腫瘍細胞集団全体で異種に発現されるタンパク質により、ある特別なタンパク質又はマーカーの発現レベルが高いか又は低い、独自の高度精製された腫瘍細胞亜集団の単離と免疫不全マウスへの移植が可能になり、それによって、ある亜集団又は別の亜集団においてTPCが濃縮されたかどうかの評価が促進される。
増加していることを意味する。好ましくは、「濃縮すること」は、ある細胞集団中の1種類の細胞の百分率を、出発の細胞集団と比較して、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、又は50%より多く高めることを意味する。
ンパク質、耐性遺伝子、等である。
UC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP−4、β−カテニン、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、CD74、CD90、CXCR4、デコリン、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b、及びCD49fを含む。例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburg et al., 2010, PMID:20185329、米国特許第7,632,678号、及び米国特許公開公報番号:2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416、及び2011/0020221を参照のこと。上記に記載の PhenoPrint Array には、これらマーカーのいくつかが含まれていたことを理解されたい。
濃縮された腫瘍始原細胞集団からのRNA試料の単離と分析
実施例1に記載のように産生して継代したいくつかの確立された結直腸NTX細胞株(SCRX−CR4、CR11、CR33、PA3、PA6、及びPA14)を使用して、免疫不全マウスにおいて腫瘍を始動させた。SCRX−CR4、PA3、又はPA6腫瘍を担うマウスでは、平均腫瘍負荷が約300mm3に達したならば、このマウスを無作為化して、15mg/kgのイリノテカン、25mg/kgのゲムシタビン、又は媒体対照(PBS)で週2回、安楽死に先立つ少なくとも20日の期間の間、処理した。全6種のNTX系より生じる腫瘍(化学療法の処理を受けているマウス由来のものも含まれる)を取り出して、切除したばかりの結直腸NTX腫瘍より、TPC、TProg、及びNTG細胞をそれぞれ単離して、同様に、実施例1で説明した技術を概ね使用して、膵臓NTX腫瘍よりTG細胞とNTG細胞を単離した。より具体的には、FACSによって細胞集団を単離して、すぐにペレット状にして、Qiagen RLTplus RNA溶解緩衝液(Qiagen 社)に溶解させた。次いで、この溶解物を使用するまで−80℃で保存した。融解させてすぐに、Qiagen RNeasy 単離キット(Qiagen 社)をベンダーの説明書に従って使用して、全
RNAを抽出して、ベンダーのプロトコールと推奨される機器設定を再び使用して、Nanodrop(Thermo Scientific)と Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)で定量した。生じる全RNA調製物は、遺伝子の配列決定及び解析に適していた。
胞集団より入手した全RNA試料を、Applied Biosystems SOLiD 3.0(オリゴライゲーション/検出による配列決定法)次世代配列決定プラットフォーム(Life Technologies)
を使用する全トランスクリプトーム配列決定用に、各試料につき5ngの全RNAから開始して、調製した。SOLiD プラットフォームによって作成されたデータより、ヒトゲノム由来の34,609の遺伝子へマッピングして、EFNA4が含まれるエフリンAリガンドを検出することができて、ほとんどの試料中のENFAレベルの実証可能な測定値を得た。
増幅RNA/DNA断片の並列した配列決定を可能にする。次いで、色素標識化オリゴヌクレオチドでのライゲーションによる配列決定を使用して、試料中に存在する各断片の50塩基読み取りを5000万より多い読み取りの全数で作成し、ゲノム中のタンパク質のmRNA転写物レベル発現のずっとより正確な表示を作成する。SOLiD3 プラットフォー
ムは、読み取りカバー率(ゲノム位置へ独自にマッピングされる読み取り)だけに基づいて、発現だけでなく、SNP、既知及び未知の選択的スプライシング事象、及び潜在的に新しいエクソンの発見を捉えることができる。このように、この次世代プラットフォームの使用は、転写物レベルでの発現の差異だけでなく、発現されるmRNA転写物の特定のスプライス変異体の差異又は選好性の決定を可能にした。さらに、Applied Biosystems
からの改良された全トランスクリプトームプロトコールを使用する SOLiD3 プラットフォームでの分析には、増幅前にほぼ5ngの出発材料だけを必要とした。このことが重要であるのは、選別された細胞集団では、例えば、TPC細胞の亜集合がNTG又はバルク腫瘍よりごくわずかな数しかないので、全RNAの抽出がごく少量の使用可能な出発材料しかもたらさないからである。
、標準的な業界手法のように倍率比を計算した。図面2に示すように、腫瘍由来のEFNA1、EFNA3、及びEFNA4のレベル、並びにEph受容体:EPHA1、EPHA2、及びEPHA10のレベルを測定した。このデータの解析は、媒体(図面2A)又は15mg/kgのイリノテカン(図面2B)で処理されたマウスより細胞を入手したかに拘らず、EFNA4がSCRx−CR4 NTX腫瘍TPCにおいてNTG集団に対して転写物レベルで1.9〜3倍、そしてTPCにおいてTProg集団に対して1.2〜1.4倍上方調節されていることを示した。さらに、EFNA1も、TProg及びNTGそれぞれの細胞に対して、TPCにおいて上昇していたことが理解されよう(但し、EFNA4より低い程度で)。さらに、追加の結直腸(SCRx−CR11及びCR33)及び膵臓(SCRx−PA3、PA6、及びPA14)の腫瘍試料について、SOLiD3 全
トランスクリプトーム配列決定法によって分析すると、EFNA4遺伝子発現は、同様に、結直腸癌(図面3A)ではTProg及びNTG細胞に対してTPCにおいて、そして膵臓腫瘍(図面3B)由来の細胞のTIC(又はTG)亜集団において上昇して、上記に例証したように発見された独自の細胞表面マーカーのパネルを使用して明確化された(膵臓腫瘍中のTIC集団を構成するTPC及びTProg細胞の亜集合は、まだ明確化されていない)。
えば、TPCを化学療法剤に対して増感させるか又は分化するように強制することができるかもしれない。さらに、EFNA1及び/又はEFNA4−内在化抗体を使用してTPCを標的化することによって、裸のモジュレーターによって直接的に、又は毒素又は抗体−薬物コンジュゲートの使用を介して、TPCを殺傷することができるかもしれない。
濃縮された腫瘍始原細胞集団中のエフリンAリガンドのリアルタイムPCR分析
結直腸癌ではTProg及びNTG細胞に対してTPC集団において、そして膵臓癌ではNTG細胞に対してTGにおいて、全トランスクリプトーム配列決定によって観測された、エフリンAリガンドの差示的な発現を検証するために、TaqMan(登録商標)定量的リアルタイムPCRを使用して、上記に示したような様々なNTX系より単離したそれぞれの細胞集団中の遺伝子発現レベルを測定した。そのようなリアルタイムPCR分析は、特別な対象の遺伝子に特異的なプライマー及びプローブのセットを使用する別々の標的の遺伝子発現レベルのより直接的で迅速な測定を可能にする。TaqMan(登録商標)リアルタイム定量的PCRを Applied Biosystems 7900HT Machine(Life Technologies)で実施して、これを使用して多数の患者由来NTX系細胞集団と対応する対照におけ
るEFNA4遺伝子発現を測定した。さらに、この分析は、TaqMan System と共に供給される説明書において特定されるように、そして市販のEFNA4プライマー/プローブセット(Life Technologies)を使用して行った。
遺伝子発現がNTG細胞に対してTIC亜集団(TPC及び/又はTProg)において1.4倍より多く上昇していることを示した。EFNA4はまた、イリノテカンでの処理を受けているマウスのTIC集団や膵臓腫瘍のTG細胞集団(例、SCRx−PA3)においてもほぼ1.8倍上昇していた。リアルタイム定量的PCRのより広く認められた方法論を使用する、結直腸と膵臓の両方の患者由来NTX腫瘍からのNTG細胞対照と比較した、NTX TIC細胞調製物における上昇したEFNA4発現の観測事実は、先の実施例の SOLiD3 全トランスクリプトーム配列決定データがより高感度であることを確認して、腫瘍形成性、治療への抵抗性、及び再発の根底にあるEFNA4と細胞の間で観測される関連性を裏付ける。
未分画結直腸腫瘍標本におけるエフリンAリガンドの発現
エフリンAリガンド遺伝子発現が結直腸腫瘍由来のTPC集団において同じ腫瘍由来のTProg及びNTG細胞と比較するときに上昇していることがわかったという事実に照らして、上昇したエフリンAリガンド(即ち、EFNA4)発現が未分画結直腸腫瘍試料においても正常隣接組織(NAT)に対して検出可能であるかどうかを判定する実験を行った。同様に、エフリンAリガンドの腫瘍中の発現が正常組織試料中のレベルといかに比較されるかを判定するための測定も行った。当該技術分野で公知の技術を使用して、110の結直腸患者腫瘍標本、正常隣接組織、及び48の正常組織を含有する Custom TumorScan qPCR(Origene Technologies)384ウェルアレイを設計して製作した。実施例3において詳述した手順と、同一のEFNA4特異プライマー/プローブセットを使用して、カスタムプレートのウェルにおいて TaqMan リアルタイム定量的PCRを実施した。
例示の腫瘍試料におけるエフリンAリガンドの差示的な発現
追加の結直腸癌患者の腫瘍試料と17の他の異なる固形腫瘍型のうち1つを診断された患者からの腫瘍標本におけるエフリンAリガンド遺伝子発現についてさらに評価するために、実施例4に記載のようにカスタム製作されたTissueScanTMqPCR(Origene Technologies)384ウェルアレイを使用して、Taqman qRT−PCRを実施した。この測定の結果は、図面6に提示されて、EFNA4の遺伝子発現がいくつかの腫瘍試料において有意に上昇又は抑制されていることを示す。
、上記のデータは、選択した過剰増殖性障害を示す患者の腫瘍形成性又は永続性に関して、差示的なEFNA4発現(高いか又は低い)がその指標になって、手掛かりとなる(dispositive)可能性があることを示唆する。
のプロトコールに従って使用して、NTX及び細胞株(293のナイーブ細胞と293のEFNA4過剰発現細胞)の細胞溶解物を産生して、市販の正常組織溶解物(Novus Biologicals)とマッチさせた。BCAタンパク質アッセイ(Pierce/Thermo Fisher #23225
)を使用して、溶解物のタンパク質濃度を定量した。等量の細胞溶解物を還元条件下にMES緩衝液中の NuPAGE Novex 4−12% Bis-Tris ゲル剤(Life Technologies)に泳
動させた。ヒトEFNA4に対する市販抗体(R&D Systems-AF369)を使用して、EFN
A4タンパク質発現を検出した。図面6Eのトップパネルでは、EFNA4を過剰発現するように工学処理された293細胞が、ナイーブ293細胞に比較して高い発現を示す。追加的に言えば、このトップパネルでは、いくつかの乳癌、結腸癌、及び非小細胞肺癌のNTXが相対的に高いEFNA4の発現を示した。同様の条件の下で、図面6Eの最下部のパネル中のウェスタンブロットは、NTX細胞株のCR11中の高いEFNA4発現と比較したときに、正常組織が低いか又は検出不能なレベルのEFNA4を発現することを示す。両方のパネルで細胞溶解物のローディングが等しいことを証明するために、抗GAPDH対照抗体を使用する。
EFNA免疫原を使用する、抗EFNA抗体の産生
本明細書の教示に従って、EFNA4−ECD−Fc、hEFNA4−ECD−His、hEFNA1−ECD−His、EFNA4を過剰発現するBALB/c 3T3細胞の全細胞、又は本明細書で説明したように調製した血漿調製物での接種により、マウスの抗体の形態でのEFNAモジュレーターを産生した(ECD−細胞外ドメイン)。免疫原は、いずれも市販の出発材料(例、組換えヒトエフリンA4 Fcキメラ、CF R&D systems # 369-EA-200)及び/又は当業者に周知の技術を使用して調製した。
)の経路よりマウスを免疫化した。免疫化には、10μgのEFNA4若しくはEFNA1免疫原、又は1X106個の細胞、又は等量のTITERMAXTM又はアルムアジュバントで乳化した細胞同等物を使用した。免疫化の後でマウスを安楽死させて、漏出するリンパ節(拡げれば、膝窩及び鼠蹊部)を切り出して、抗体産生細胞の供給源として使用した。組織グラインダーを使用する、リンパ節の機械的な破壊によってリンパ球を放出した。
バイスでの電気細胞融合を実施して、プレーティングを続けて、ポリクローナルハイブリドーマを後続のサブクローニングでスクリーニングして、モノクローナルハイブリドーマを産生した。第二のプロトコールでは、BTX機器での電気細胞融合を実施し、ハイブリドーマライブラリーのバルクでの増殖とこのハイブリドーマの単一細胞沈着を続けて、後にこのクローンをスクリーニングした。
合ジェネレーター、モデルECM2001(Genetronic 社)を使用して、電気細胞融合
を実施した。
に室温で1時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをTMB基質(Thermo Scientific 34028)で発色させて、分光光度計によってOD450で分析した。
選択した抗原陽性ウェルについて、限界希釈プレーティングを使用して、サブクローニングを実施した。プレートについて、単一コロニー増殖の存在を外観的に検査してから、単一コロニーウェル由来の上清を上記に記載の抗原特異的ELISAと下記に記載のようなFACS確認によってスクリーニングした。生じるクローン集団を増やして凍結培地(90% FBS,10% DMSO)中で凍結保存して、液体窒素に保存した。EFNA4で免疫化したマウスからのこの融合より、上記に記載のELISAプロトコールを使用して、EFNA4に反応性の159のマウスモノクローナル抗体を得た。
た細胞を、アザセリン(Azaserine)(シグマ #A9666)を補充したハイブリドーマ選択培地[15%胎仔クローンI血清(Hyclone)、10% BM Condimed(Roche Applied
Sciences)、1mMピルビン酸ナトリウム、4mM L−グルタミン、100IUペニ
シリン−ストレプトマイシン、50μM 2−メルカプトエタノール、及び100μMヒポキサンチンを含有するDMEM(Cellgro カタログ番号:15-017-CM)培地]に再懸濁
させてから、4つのT225フラスコにおいてフラスコあたり90mlの選択培地でプレート培養した。次いで、このフラスコを、5% CO2と95%空気を含有する加湿37℃インキュベーターに6〜7日間入れた。
につき1細胞で入れて、10〜11日間培養して、その上清について、FACS又はELISAによってEFNA4又はEFNA1に反応性の抗体をアッセイする。
μg/mLのマウスEFNA4−Hisで、4℃で一晩被覆した。このプレートを2% FCS−PBSで、37℃で1時間洗浄してブロックして、すぐに使用するか又は4℃で保存した。非希釈ハイブリドーマ上清をプレート上にて室温で1時間インキュベートした。このプレートを洗浄して、1% BSA−PBSで10,000倍希釈したHRP標識化ヤギ抗マウスIgGで、室温で1時間プローブする。次いで、このプレートを上記に記載のような基質溶液とともにインキュベートして、OD450で読み取る。
1で免疫化したマウスからのこの融合より、FACS分析を使用して決定されるような、EFNA4と反応する1つのハイブリドーマを得た。さらに、FACS分析により、これらハイブリドーマのほとんど又はすべてに由来する精製抗体が濃度依存的な様式でEFNA4又はEFNA1へ結合することを確認した。
エフリンAリガンドモジュレーターの配列決定及びヒト化
7(a)配列決定:
上述したことに基づいて、固定化したヒトEFNA4又はEFNA1へ見かけ上高い親和性で結合する、いくつかの例示の別個のモノクローナル抗体を選択した。図面7A中の表形式に示すように、実施例6からのmAbをコードするDNAの配列分析により、その多くが独自のVDJ再配列を有して新規の相補性決定領域を示すことが確認された。図面7Aに示す相補性決定領域(配列番号8〜59及び70〜95)は、VBASE2分析に由来していることに留意されたい。
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies より購入した。
実施例6からのマウスの抗体のうち4つを、相補性決定領域(CDR)移植法を使用してヒト化した。機能性ヒト生殖細胞系遺伝子に関する配列及び構造の類似性に基づいて、重鎖及び軽鎖のヒトフレームワークを選択した。この点に関して言えば、VBASE2分析に由来しているように、マウスカノニカルCDR構造を同じカノニカル構造のあるヒト候補物と比較することによって、構造類似性を評価した。
ト化抗体を産生するためにいくつかのヒト化抗体変異体を作製したが、このヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域に関連する、マウスハイブリドーマ由来の抗原結合性の相補性決定領域(CDR)を概して保持していた。ヒト化SC4.15、SC4.22、及びSC4.471のmAbがそのマウス対照物と同様の親和性でEFNA4抗原へ結合するのに対し、hSC1.5は、Biacoreシステムを使用して測定されるように、やや弱い親和性で結合した。
Technologies)に従って、先のハイブリドーマより全mRNAを抽出した。完全なマウ
スレパートリーに標的指向するように設計された、32種のマウス特異的5’リーダー配列プライマーを含んでなるプライマーミックスを3’マウスCγ1プライマーと組み合わせて使用して、抗体重鎖の可変領域を増幅して配列決定した。同様に、Vkマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計された32種の5’Vkリーダー配列プライマーミックスをマウスκ定常領域へ特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅して配列決定した。このVH及びVL転写物は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して、100ngの全RNAより増幅した。
T−PCRキット(Qiagen 社)を使用した。特異的なV領域プライマーを使用して、抽
出したPCR産物を直接的に配列決定した。IMGTを使用してヌクレオチド配列を解析して、最高の配列相同性がある生殖細胞系V、D、及びJ遺伝子メンバーを同定した。V−BASE2(Retter et al., 上掲)を使用して、そしてVH及びVL遺伝子のマウス
生殖細胞系データベースへの並置によって、この導いた配列をIgV及びJ領域の既知の生殖細胞系DNA配列と比較した。
重鎖遺伝子をIGHV5−6(V)、DSP2.9(D)及びJH3と同定した。SC4.22の重鎖遺伝子をVHJ558(V)と同定し、DセグメントをDFL16.1e及びJH4(J)と同定した。SC4.47の重鎖遺伝子をIGHV1−26(V)、P1inv(D)及びJH2(J)と同定した。4種の軽鎖は、いずれもKクラスであった。軽鎖遺伝子は、SC4.5 mAbではIGKV6−15、JK2として、SC4.15
mAbではIGKV6−b及びJK5として、SC4.22 mAbではIGKV1−110及びJK1生殖細胞系配列として、そしてSC4.47κ軽鎖ではIGKV21−7、JK1生殖細胞系配列として同定した。これらの結果をすぐ下の表2に要約する。
ヒトC−κ発現ベクター中へクローン化した。この重鎖と軽鎖のCHO細胞への同時トランスフェクションによって、抗体を発現させた。
、AgeIとXhoI(IgH)、XmaIとDraIII(IgK)のそれぞれでの消化を続けた。発現ベクターへのライゲーションに先立って、消化されたPCR産物を精製した。全量10μLにおいて、200U T4−DNAリガーゼ(NewEngland Biolabs)、7.5μLの消化及び精製済み遺伝子特異的PCR産物、及び25ngの線状化ベクターDNAでライゲーション反応を実施した。コンピテント大腸菌:DH10B細菌(Life
Technologies)を42℃での熱ショックにより3μLのライゲーション産物で形質転換
させて、アンピシリンプレート(100μg/mL)上へ播いた。次いで、VH領域のAgeI−EcoRI断片をpEE6.4HuIgG1発現ベクターの同じ部位へ挿入する一方、合成のXmaI−DraIII VK挿入物をそれぞれのpEE12.4Hu−κ発現ベクターのXmaI−DraIII部位へクローン化した。
標準条件下で150mmプレート(Falcon, Becton Dickinson)においてヒト胚性腎(HEK)293T(ATCC番号:CRL−11268)細胞を培養した。
クターDNAの12.5μg)を加えた。この混合物を室温で30分間インキュベートして、培養プレートへ均等に分配した。トランスフェクションの3日後に上清を採取し、10% FBSを補充した20mLの新鮮なDMEMに置き換えて、トランスフェクション後6日目に再び採取した。800xgで10分間の遠心分離によって培養上清から細胞残滓を除いて、4℃で保存した。組換えキメラ抗体とヒト化抗体をプロテインGビーズ(GE
Healthcare)で精製した。
EFNAモジュレーターの特性
8(a) 全般的なモジュレーター特性
様々な方法を使用して、上記に説明したように産生した、選択したエフリンA4モジュレーターの結合特性を分析した。具体的には、いくつかのEFNA4抗体について、親和性、動態、ビニング(binning)、並びにカニクイザル及びマウスの相同体(内製)との
交差反応性に関する特性をForteBIO(登録商標)によって決定した。ウェスタン反応性も測定して、還元条件下で結合する2つの抗体(SC4.22及びSC4.91)についてエピトープを決定した。加えて、この抗体について、中和する(即ち、受容体リガンド相互作用をブロックする)、内在化する能力を試験して、これらの実施例(例えば、実施例12及び16を参照のこと)に示す手順を使用する in vitro 細胞傷害性アッセイによって、それらの相対的な殺傷のEC50を比較評価(benchmark)した。この特性
決定の結果を図面8Aにおいて表形式で示す。
親和性及び運動定数(kon及びkoff)を測定した。最後に、選択したモジュレーターの親和性を表面プラズモン共鳴法(Biacore System, GE Healthcare)によって測定し
た。標準抗原濃度系列に基づいて、そして1:1ラングミュア結合モデルを使用して、抗原への抗体結合のKdと運動定数(kon及びkoff)を決定した。全般に、選択したモジュレーターは、相対的に高い親和性をナノモル濃度範囲で明示した。
モジュレーターは、ジスルフィド結合がインタクトである(NR)抗原とのみ実質的に反応したが、2つのモジュレーターは、非還元抗原と還元抗原(NR/R)の両方と反応した。これらの抗体について、Pepspot(JPT)膜を使用して、ペプチドによる抗体認識の限界を決定した。SC4.22とSC4.91は、配列QRFTPFSLGFE(配列番号164)とRLLRGDAVVE(配列番号165)をそれぞれ認識することがわかった。対象のペプチドへ結合するこれらペプチドの能力のELISAによる再試験により、これらの抗体が実際に上記エピトープに特異的であることを確かめた。
本実施例において上記に説明した技術を使用して、ヒト化構築体のshSC4.15、hSC4.22、及びhSC4.47について分析して、それらの結合特性を決定した。さらに、ヒト化抗体の結合性を親マウスの抗体と直接比較して、両方の抗体について、ヒト化の方法によって生じた速度定数の微妙な変化を同定した。
エフリンAリガンドモジュレーターは、細胞表面結合を証明する
上記に説明したようにhEFNA4−Fcに対して産生した抗体を産生するハイブリドーマからの上清について、フローサイトメトリーアッセイで測定するように、細胞表面結合をスクリーニングした。この抗体の結合特性を証明するために、2種の細胞株、JurkatE6細胞とZ138細胞(このいずれも、高レベルの表面エフリンA4を発現することが知られている)を利用した。より具体的には、細胞標識色素のCFSE(簡易同定用)で染色した600万個のJurkat E6細胞と400万個の非標識化Z138細胞を20μg/mlのFcブロッキング試薬(Trueblock,Biolegend 社)とともにイン
キュベートして混合して、100万個の細胞/mLの最終濃度とした。この細胞混合物の50μLを各ウェル中50μLの抗体含有上清へ加えて、4℃で60分間インキュベートした。この細胞を、2% FBS、2mM EDTA、及び0.05%アジ化ナトリウムを含有するPBS(洗浄緩衝液)で1回洗浄してから、DyLight649へコンジュ
ゲートしたヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Immuno Research)のFc
領域特異的F(ab)2断片で、暗所において4℃で60分間染色した。細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄して、2μg/ml DAPIで対比染色した。陰性対照試料は、マウスIgG1アイソタイプ抗体(10μg/ml,Biolegend 社)と、マウスIgGを分泌しないことが知られているハイブリドーマ(H13.2)由来の上清であった。EFNA4特異的であることがELISAによってすでに同定された、10μg/mlの精製抗体(E76.2としても知られるSC4.76.2)(図面9の左側)を使用して、陽性対照試料を調製した。標準条件下に、そしてHTS付属装置を使用して、試料をFACS Canto II(BD Biosciences)で採取した。114個のクローンのうち84個のクローンが、両方の細胞株を陰性対照試料より高く有意に染色することによるフローサイトメトリーによって実証されるような有意な細胞表面結合を示すと判定された。この点に関して、図面9は、50の例示ハイブリドーマ上清の相対的な結合能力を示す。
選択したEFNA4モジュレーターは、エフリンA4リガンド結合を中和する
ENFA4発現細胞へ結合することが知られた抗体を産生するハイブリドーマ由来の上清(実施例9)について、HEK293Td細胞の表面にあるその受容体(EphA)へ結合する可溶性hEFNA4−Fcの結合をブロックするその能力を試験した。初めに、図面10Aに見られるように、HEK293Td細胞は、陰性対照抗体と比較するときに、EFNA4−Fcへ用量依存的な様式で結合することが示される。この結合の中和を証明するために、60μlの抗EFNA4ハイブリドーマ上清を、洗浄緩衝液に希釈した200ng/ml hEFNA4−Fcとともに4℃で2時間インキュベートした。次いで、この混合物を50,000個のHEK293Td細胞へ加えて、4℃で1時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液に1回洗浄してから、DyLight649へコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Immuno Research)で、暗所
において4℃で45分間染色した。次いで、細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄して、2μg/mlのDAPIで対比染色した。陰性対照試料は、非染色細胞、非IgG産生ハイブリドーマ(H13.2)由来上清で染色した細胞、及びヒトIgGFcγ1断片で染色した細胞であった。陽性対照試料は、ハイブリドーマ上清の非存在下でのhEFNA4−Fc染色細胞と、非IgG産生ハイブリドーマ上清の存在下でのhEFNA4−Fc染色試料であった(図面10Bの左側)。先に考察したように、FACS Canto IIで試料を測定した。図面10Bによって裏付けられるように、フローサイトメトリーを使用して測定するとき、試験した83個のうち62個のクローンがhEFNA4−Fcのその細胞表面受容体への結合を中和するいくらかの能力を証明した。
EFNAモジュレーターは、細胞表面EFNA結合を濃度依存的な様式でブロックする
EFNA活性を中和する、本発明のエフリンAリガンドモジュレーターの能力をさらに測定するために、選択したハイブリドーマ由来の抗EFNA4抗体を精製して、PBS緩衝液中の無菌試薬として使用した。初めに、ヒト及びマウスのEFNA4−Fc(組換えマウスエフリンA4Fcキメラ、CF R&D Systems)単独の全用量応答曲線を同時に設定
して、EFNA4−FcのHEK293Td細胞への用量制限的な結合を証明した(図面11A)。この対照を確定したならば、3種の例示ハイブリドーマ(即ち、SC4.15.3、SC4.47.3、及びSC4.76.2)より入手した抗EFNA4抗体の系列希釈液を、洗浄緩衝液中のこの限界濃度(0.1μg/ml及び1.0μg/ml)のhEFNA4−Fc及びmEFNA4−Fcのそれぞれと4℃で1時間インキュベートした。次いで、得られた試薬混合物を50,000個のHEK293Td細胞へ移して、4℃で1時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液に1回洗浄してから、DyLight649へコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Immuno Research)のFc領域特異的F(ab)2断片で、暗所において4℃で45分間染色した。
細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄して、2μg/ml DAPIで対比染色した。陰性対照試料は、非染色と、ヒトIgGFcγ1断片で染色した細胞であった。上記ですでに述べたように、試料をFACS Canto IIで採取した。図面11Bは、ヒト及びマウスのEFNA4−Fcの細胞への結合を相対的に高い濃度で一部阻害する、mAb SC4.15.3の活性を示す。図面11Cは、細胞へ結合するhEFNA4−Fcの能力をほぼ完全にブロックするが、mEFNA4−Fcの能力はブロックしない、mAb SC4.47.3の活性を例証する。同様に、図面11Dは、細胞へ結合するhEFNA4−Fcの能力を実質的に阻害する一方で、その細胞へ結合するmEFNA4−Fcの能力に劇的に影響を及ぼさない、エフリンAリガンドモジュレーターのmAb SC4.76.2の能力を証明する。これらの結果は、エフリンAリガンドの細胞表面受容体への結合を阻害することにより、付随した腫瘍形成活性を阻害する、本発明の選択したモジュレーターの能力を強く示唆する。
EFNAモジュレーターは、EFNAのEphA受容体への結合を濃度依存的な様式でブロックする
上記に考察したように、EphA2は、EFNA4について知られた結合相手である。この既知の関係を利用するために、標準的な技術を使用してEphA2の細胞外ドメインをヒトIgGのFc部分へ融合させ、HEK293Td細胞において一過的に発現させて、培養物の上清より、タンパク質A親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。図面12Aに見られるように、EphA2−Fcホモ二量体は、Jurkat細胞(EFNAを発現することが知られている)へ用量依存的な形式で結合するが、ヒトIgGのFc部分単独では、結合を全く示さない。このEphA2−FcのJurkat細胞への結合は、本発明のエフリンAモジュレーターを使用して、そして特に、エフリンA4に対するモノクローナル抗体の使用を介して阻害することができる。このために、ウェルあたり50,000個のJurkat細胞を、洗浄緩衝液中10μg/mlの4種の選択した抗ENFA4抗体(即ち、SC4.22、SC4.31.3、SC4.47.3、及びSC4.73、いずれも上記に記載のように調製した)とともに4℃で1時間インキュベートした。マウスIgGと無抗体(データ示さず)を陰性対照として役立てる。洗浄後、洗浄緩衝液中のこの細胞へEphA2−Fcの系列希釈液を4℃で1時間加えて、図面12Bにグラフ表示される結果を得た。図面12Bの検討により、モジュレーターのSC4.31.3とSC4.47.3がEphA2−FcのEFNA4への結合を実質的に阻害するのに対し、モジュレーターのSC4.22とSC4.73は、相対的により少ない阻害を示すことが示される。この受容体との相互作用を阻害する開示モジュレーターの能力をさらに例証するために、最初にJurkat細胞を抗体の系列希釈液とともにインキュベートして、10μg/ml EphA2−Fcとのインキュベーションを続けた。次いで、この細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄し、2μg/ml DAPIで対比染色して、HTS付属装置を使用する標準条件下にFACS Canto II(BD Biosciences)で分析して、図面12Cに表示するデータを得た。図面12Bと同様に、図面12Cは、モジュレーターのmAb SC4.47.3が相対的に強力な阻害剤であって、Jurkat細胞上で発現されるEFNA4へのEphA2−Fcの結合を効率的にブロックすることを証明する。比較すると、他のモジュレーターは、やや小さい活性を示して、SC4.31.3は、中等度の阻害をより高い濃度でもたらす。
データは、SC4.2、SC4.31、及びSC4.47が、試験したすべてのEphA受容体結合相手のエフリンA4リガンド(即ち、EphA2、EphA3、EphA4、EphA6、EphA7、EphA8、及びEphA10)への結合をブロックすることができることを示す。加えて、EFNA1に対する免疫化活動(campaign)(実施例6による)において作製したEFNA4モジュレーターのSC9.65が、EphA1、EphA2、EphA4、及びEphA7のエフリンA1リガンドへの結合に干渉する能力を有することが確認された。これらのデータは、本明細書の他の実施例の結果と組み合わせると、様々な受容体の結合に拮抗するこのモジュレーターの能力には、本発明の観測された治療効果をもたらすのに意義深い可能性があることを示唆する。
ヒトエフリンAに対するモジュレーターは、マウス相同分子種と交差反応する
ヒト及びマウスのエフリンA4リガンドの細胞外ドメインがタンパク質レベルで80%の配列同一性を共有するという事実に照らして、ヒトEFNA4に対する開示モジュレーターについて、それらがマウス相同体と会合するかどうかを見るために試験した。より具体的には、抗体サンドイッチELISAを使用して、EFNA4特異的モノクローナル抗体のそのマウス相同体との交差反応性のレベルを定量した。高タンパク質結合性96ウェルアッセイプレートをIgG分子のFc部分に特異的なロバ抗ヒトIgGポリクローナル抗体の0.5μg/mlで被覆した。このプレートのタンパク質コーティングは、50mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)を16時間のインキュベーションの間に4℃で使用して、ウェルあたり100μlの容量で行った。ヒトIgG分子のFcγ1部分へ融合したヒト及びマウスのEFNA4分子(EFNA4−Fc)を2%(w/v)ウシ血清アルブミン含有PBS緩衝液(PBSA)で系列希釈した。この被覆プレートを0.05%
Tween20含有PBS緩衝液(PBST)中で洗浄後、PBSAで希釈されたマウス及びヒトEFNA4−Fcの100μl/ウェルを3時間の間周囲温度でウェルへ加えた。次いで、このプレートをPBSTで再び洗浄して、このプレートへ10%使用済ハイブリドーマ上清含有PBSA又は1μg/mlの精製モノクローナル抗体(陽性対照として)の100μl/ウェルを周囲温度で1時間の間に加えた。このプレートをPBSTで洗浄後、マウスIgGのFc部分に特異的で、西洋ワサビペルオキシダーゼへコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Immuno Research)の500
0倍希釈液を含有する100μl/ウェルのPBSAをこのプレートへ周囲温度で30分間加えた。このプレートをPBSTで十分に洗浄した後で、このウェルへウェルあたり100μlのTMB基質(Thermo Fisher)を15分間加えた。100μl/ウェルの2M
硫酸を添加することによって、この酵素反応を止めた。この比色分析法の吸光度は、Victor プレートリーダー(パーキンエルマー)を使用して、450nmで測定した。データ
は、2つの反復値を使用して、吸光度読取り値の平均+標準偏差として提示する。図面13Aは、hEFNA4を認識するがmEFNA4は認識しない、例示のモノクローナル抗体SC4.31.3を示す。逆に、図面13Bは、ヒトとマウスの両方のEFNA4を認識する、例示のモノクローナル抗体SC4.91.4の結合を示す。
、hSC4.15モジュレーターがヒトとマウスの両方のエフリンA4リガンドを十分に等しく認識することを示し、開示されたヒト化モジュレーターが本明細書の教示と完全に適合可能であることを示唆する。
例示の腫瘍試料、腫瘍細胞亜集団、及び造血系細胞におけるエフリンAリガンドの発現
先の実施例において、上昇した遺伝子発現レベルを報告してEFNA4に対する抗体を作製した後で、選択した細胞集団における対応するEFNA4タンパク質の発現についての証拠を探求した。この点に関して言えば、11の腫瘍型からの432の組織溶解物、又はそのそれぞれの正常隣接組織の4つの希釈液を含んでなる逆相癌タンパク質溶解物アレイ(ProteoScan Arrays;OriGene Technologies)を、外因性プロモーターによって推進
されるTP53過剰発現の有り無しのHEK293細胞からなる対照と共に提供した。EFNA4タンパク質を認識する本発明のマウスモノクローナルEFNA4抗体(例えば、SC4.47.3としても知られるクローンE47.3)を使用して、ウェスタンブロットによって、このアレイ上の溶解物中のEFNA4タンパク質発現を検出した。比色検出試薬とプロトコールは、ProteoScan Arrays の製造業者によって提供されて、製作したアレイ上のスポットは、BZScan2 Java(登録商標) Software(INSERM-TAGC)を使用する平底型スキャナーを使用してデジタル画像へ変換して、スポット強度を定量した。
レベルのEFNA4を発現することが見出せず(図面14D)、後に抗EFNA抗体で殺傷されなかった。
エフリンAリガンドモジュレーターは、K562細胞によって内在化される
先の実施例において確定されたエフリンAリガンドの発現プロフィールを前提として、本発明のモジュレーターが細胞表面抗原への結合時に内在化されるかどうかを見るためのアッセイを実施した。この点に関して言えば、実施例においてEFNA4−Fcに対して産生した抗体を産生するハイブリドーマ由来の上清について、(EFNA4を細胞表面上で低いレベルで発現する)K562細胞に内在化されるその能力をスクリーニングした。106個/ml(単一細胞懸濁液)の出発濃度でのK562細胞を Human TruStain(BioLegend 社)で、室温で10分間ブロックしてから、ウェルあたり5x104個の細胞へ
希釈した。次いで、同一2検体の試料を、最終容量50μlの抗EFNA抗体含有上清で、氷上にて30分間染色した。次いで、細胞をFACS染色培地(FSM;2%胎仔ウシ血清/ハンクス緩衝化生理食塩水溶液/25mM HEPES[pH7.4])で洗浄して、非結合抗体を除去した。これに、ロバ抗マウスAlexa647(Life Technologies)での氷上で30分間の第二染色を続けた。試料を再び洗浄して未結合抗体を除去して
から、内在化培地(2%胎仔ウシ血清/イスコブ(Iscove's)改良ダルベッコ培地)に再懸濁させた。内在化を可能にするために、試料を5% CO2において37℃で(又は、対照では4℃で)1時間インキュベートした。試料を氷へ移して過剰の氷冷FSMを加えることによって、内在化を停止させた。内在化せずに細胞表面に残ったあらゆる抗体を除去するために、試料を低pHのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS[pH2.0])で、氷上で10分間処理した。この「酸ストリップ」手順に続いて、試料をFSMで十分洗浄し、2μg/mlのDAPIを含有する150μlのFSMに再懸濁させて、フローサイトメトリー(HTS付属装置を使用する標準条件下にFACS Canto II(BD Biosciences)を再び使用する)によって分析した。バックグラウンドを超えて検出されたどのシグナルも、抗体内在化[酸ストリップ法の間に蛍光コンジュゲートを細胞表面からの除去から護るプロセス]より生じるものである。すべてのインキュベーションは、他に述
べない限り、FSMにおいて実施した。
標的化部分としてのEFNA4モジュレーター
抗体へ安定的に連結した細胞傷害薬の標的化は、固形腫瘍のある患者へ大きな治療利益を与える可能性がある、強化された抗体アプローチを代表する。上記に記載のEFNA4特異抗体が細胞傷害剤の生細胞への送達に媒介することができるかどうかを判定するために、リボソーム不活性化タンパク質、サポリン(Advanced Targeting Systems)へコンジュゲートしたストレプトアビジンをビオチニル化EFNA4抗体へ結合させる in vitro 細胞殺傷アッセイを実施して、これらのサポリン複合体が内在化して細胞を殺傷する能力を、細胞生存度を測定することによって72時間後に測定した。
て、生存細胞数を計数した。
ち、これら内在化モジュレーターのいくつかは、細胞死をもたらすサポリン毒素内在化を媒介することができた。図面16Aは、例示の内在化モジュレーターSC4.5.3の細胞殺傷能力を例証するが、ここでは、この曲線の下方の傾きが対照と比較される濃度依存的な様式での細胞死を表す。これらのデータは、エフリンAリガンドを発現する腫瘍形成細胞における細胞傷害性ペイロードの選択的内在化のためのベクターとして作用する場合の開示モジュレーターの有効性を明らかに証明する。
てのカウントをそれに従って計算した(「正規化RLU」として言及する)。
ついての50%有効濃度(通常「EC50」と呼ばれる)を収載する。上述の細胞株に加えて、ヒト腺癌由来の細胞株であるPC3細胞(ATCC CRL−1435)を標的細胞として使用した。
胞傷害性ペイロードを内在化して送達するその能力を試験した。このアッセイは、わずか500個の細胞/ウェルをプレート培養して、サポリン(Advanced Targeting Systems, #IT−51)へ共有結合した抗ヒトIgG Fab断片をこの培養物へ加えること以外は、上記に記載の通りに行った。図面16Eは、実施例7に記載のヒト化(図面16E中のHz)EFNAモジュレーターが、標的細胞の表面上で発現されるエフリンA4リガンドへ結合して、結合した抗体と細胞傷害性ペイロードと一緒にEFNAの内在化を引き起こすことができることを例証する。
十分に結合することが示されたヒト化EFNAモジュレーター、hSC4.15(図面13Cを参照のこと)について、ヒト又はマウスのEFNAを過剰発現するHEK293T細胞に内在化して細胞傷害性ペイロードを送達するその能力を試験した。直接的な比較可能性を確実にするために、レンチウイルスで形質導入した細胞をhSC4.15で染色して、ヒト又はマウスのいずれかのエフリンA4の適度な発現についてのFACSによって選別した(データ示さず)。殺傷アッセイは、上記の記載通りに行った。図面16Fは、マウス又はヒトのEFNAを等しく十分に発現する細胞をヒト化SC4.15モジュレーターが殺傷することを例証する。
EFNAモジュレーターは、分泌されたエフリンAリガンドを検出する
上記でやや詳しく考察したように、EFNA4は、細胞膜と会合したGPI連結分子として、又は分泌された末端切断(truncated)リガンド若しくはアイソフォームとして存
在することができる。これらの分泌された化合物の、体液又は細胞培養基のような生体材料中の検出は、診断目的に、又は患者管理における補助手段として有用であり得る(バイオマーカーとしての有用性)。例えば、その分泌されたEFNA4は、B細胞慢性リンパ
球性白血病(B−CLL)患者において濃度が上昇して見られる場合があることが示唆されてきた(Alonso-C LM et al., 2009, Leukemia Research 33: 395-406)。本発明のそ
のような好ましい側面を証明するために、精製EFNA4の非重複エピトープを認識する開示モジュレーターを使用して、選択した腫瘍形成性の試料に分泌されたEFNAリガンドを概して検出して定量した。本発明のこの後者の特徴に関して、EFNAモジュレーターを使用して、ヒト血清(データ示さず)とB−CLL患者より入手したヒト血漿、及びヒト腫瘍異種移植体(例、上記の実施例1に記載のような)を担うマウスの血清からの分泌エフリンAリガンドを検出して定量した。いずれの場合も、このモジュレーターは、すぐ下記に記載のようなリガンドレベルを有効に測定することができた。
PBSTにおいて再び洗浄して、TMB基質溶液(例、Thermo Fisher)を30分間加え
た。等量の2M硫酸を加えることによってこの発色反応を止めた後で、450nmの吸光度読取りを標準プレートリーダーで使用して、このプレートを読み取った。この実験の結果を図面17A〜Cに示す。
有用であり得ることを示唆した。より一般的には、これらの結果は、治療と診断の両方の状況における本発明の応用可能性について強く示唆するものである。
EFNA4モジュレーターは、関連するEFNAリガンドを発現する細胞に標的指向することができる
EFNA4モジュレーターのリガンド特異性について関連するEFNAリガンドに対して試験して、交差反応性の度合いを評価した。1例として、SC4.2.1とSC9.65について、EFNA4(図面17A)、EFNA3(図面17B)、及びEFNA1(図面17C)を過剰発現しているHEK293T細胞を使用する in vitro 殺傷アッセイで試験した。モジュレーターのSC9.65は、マウスをEFNA1免疫原で免疫化することによって産生した(実施例6による)ことに留意されたい。この殺傷アッセイは、実施例16に記載の通りに行った。図面17は、SC4.2.1がEFNA4発現細胞に加えてEFNA3発現細胞も殺傷することができることと、SC9.65がEFNA1発現細胞とEFNA4発現細胞を殺傷することができることを証明する。これらのデータは、特定のEFNAファミリーメンバーに対して産生した選択モジュレーターが他のファミリーメンバーへ十分によく結合し、内在化を引き起こして、細胞傷害性ペイロードをリガンド発現細胞へ送達することができることを例証する。この発見は、EFNAファミリーメンバー間の相同性の低い度合い(ヒトEFNA1、2、3、及び4の間でほぼ34〜45%のアミノ酸配列同一性)からすればやや予測外であって、本明細書に記載のように、診断又は治療の目的のために汎EFNAモジュレーターを産生することが可能であることを例示する。
EFNAリガンドは、多数のEphA受容体と選択的に相互作用する
上記に考察したように、エフリンAリガンドは、数多くのEphA受容体へ結合することが知られている。どのEphA受容体がEFNA4と相互作用するポテンシャルを有するかを探究するために、実施例9の記載に類似したフローサイトメトリー結合アッセイを開発した。より具体的には、ヒトIgG1 Fc融合構築体として発現される可溶性EphA受容体を、ウェルあたり50,000個のHEK293T細胞(図面19A)、又はレトロウイルス形質導入の手段によってEFNA4を過剰発現しているHEK293T細胞(HEK293T.hEFNA4細胞と称する)(図面19B)へ染色緩衝液において4℃で1時間加えた。洗浄後、Dylight649へコンジュゲートした抗ヒトIgGポリクローナル二次抗体(Jackson Immuno Research)を1時間加えた。2回洗浄後、2
μg/ml DAPIを含有する染色緩衝液に試料を再懸濁させて、HTS付属装置を使用する標準条件下にFACS Canto II(BD Biosciences)で分析した。図面1
9A及び19Bは、EphA1を除いて、EphA2、EphA3、EphA4、EphA6、EphA7、及びEphA10がエフリンA4リガンドへ結合することを証明する。このことはまた、本発明のモジュレーターに固有の作用の利点と潜在的に多面的な要素を指摘する。
EFNA4は、EphB2受容体へ結合するが、EphB3及びEphB4受容体へ結合しない
実施例20に示された知見を拡げて、種々のEphB受容体へ結合するエフリンA4リガンドの能力を探究した。EFNA4は、当初、上記の実施例2〜4で証明したように、CSC関連標的として同定された。正常なマウス結腸陰窩の組織階層構造において、EphB2及びEphB3受容体は、結腸陰窩底部に存在する細胞によって高度に発現されて陰窩の上に位置する細胞によっては発現されないので、EphB発現とEphB受容体を介した前向き又は逆向きのシグナル伝達が組織構築と個々の細胞運命の決定に重要であることを示唆している(Batlle et al.; 2002 PMID: 12408869)。より最近になって、結直腸癌細胞によるEphB2発現は、腫瘍の始動及び長期増殖の能力に関連付けられて、EphB2が結腸の癌幹細胞の表現型マーカーとして役立ち得ることが示唆された(Merlos-Suarez et al., 2011 PMID: 21419747)。従って、差示的に発現されるEphB受容体
のいずれかへ結合するエフリンA4リガンドの能力は、結直腸癌幹細胞にとって生物学的に重要である可能性がある。
間加えた。2回洗浄後、2μg/ml DAPIを含有する染色緩衝液に試料を再懸濁させて、HTS付属装置を使用する標準条件下にFACS Canto II(BD Biosciences)で分析した。図面20A及び20Bは、EphB3やEphB4でなく、EphB2がEFNA4リガンドへ結合することを証明して、開示モジュレーターによって有利に影響を及ぼすことが可能である、治療経路の潜在的な多様性を再び強調する。
なお、本願発明は、以下のものにも関する。
(請求項1)
単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項2)
EFNAモジュレーターがEFNAアンタゴニストを含む、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項3)
EFNAモジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項4)
抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項3に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項5)
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項4に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項6)
前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項4に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項7)
前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、請求項4に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項8)
前記モノクローナル抗体が枯渇性抗体を含む、請求項4に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項9)
前記モノクローナル抗体がEFNA4と会合する抗体を含む、請求項4に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項10)
前記モノクローナル抗体が3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、ここで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域は、図面7Aに示す相補性決定領域を含む、請求項9に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項11)
前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号99、配列番号103、配列番号107、配列番号111、配列番号115、配列番号119、配列番号123、配列番号127、配列番号131、配列番号135、配列番号139、配列番号143、配列番号147、配列番号151、配列番号155、配列番号159、及び配列番号163に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号97、配列番号101、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号121、配列番号125、配列番号129、配列番号133、配列番号137、配列番号141、配列番号145、配列番号149、配列番号153、配列番号157、及び配列番号161に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項12)
細胞傷害剤をさらに含んでなる、請求項9、10又は11に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項13)
請求項11に記載のアミノ酸重鎖可変領域又はアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
(請求項14)
請求項13に記載の核酸を含んでなるベクター。
(請求項15)
請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
(請求項16)
配列番号2に示されるアミノ酸配列又はその断片を含んでなる、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項17)
EFNAモジュレーターが免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項16に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項18)
モジュレーターが、腫瘍始原細胞の頻度を低下させることの必要な被検者への投与時に腫瘍始原細胞の頻度を低下させる、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項19)
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を使用して決定される、請求項18に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項20)
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項18に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項21)
前記腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項18に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項22)
細胞傷害剤をさらに含んでなる、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項23)
前記EFNAモジュレーターが汎EFNAモジュレーターを含む、請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーター。
(請求項24)
請求項1に記載の単離されたEFNAモジュレーターを含んでなる、医薬組成物。
(請求項25)
単離されたEFNA4モジュレーター。
(請求項26)
前記EFNA4モジュレーターが汎EFNA4モジュレーターを含む、請求項25に記載の単離されたEFNA4モジュレーター。
(請求項27)
請求項25に記載の単離されたEFNA4モジュレーターを含んでなる、医薬組成物。
(請求項28)
治療有効量のEFNAモジュレーターを、EFNA関連障害の治療が必要な被検者へ投与することを含んでなる、EFNA関連障害を治療する方法。
(請求項29)
前記EFNAモジュレーターがEFNAアンタゴニストを含む、請求項28に記載の方法。
(請求項30)
前記EFNAモジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項28に記載の方法。
(請求項31)
抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項30に記載の方法。
(請求項32)
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
(請求項33)
前記モノクローナル抗体が3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、ここで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域は、図面7Aに示す相補性決定領域を含む、請求項32に記載の方法。
(請求項34)
前記モノクローナル抗体がEFNA4と会合する、請求項31に記載の方法。
(請求項35)
前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項31に記載の方法。
(請求項36)
前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、請求項31に記載の方法。
(請求項37)
前記内在化抗体が細胞傷害剤を含む、請求項36に記載の方法。
(請求項38)
前記EFNA関連障害が過剰増殖性障害を含む、請求項28に記載の方法。
(請求項39)
前記過剰増殖性障害が新生物障害を含む、請求項38に記載の方法。
(請求項40)
前記新生物障害が固形腫瘍を含む、請求項39に記載の方法。
(請求項41)
新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、又は乳癌を含む、請求項40に記載の方法。
(請求項42)
前記新生物障害が血液系腫瘍を含む、請求項39に記載の方法。
(請求項43)
前記血液系腫瘍が白血病又はリンパ腫を含む、請求項42に記載の方法。
(請求項44)
前記新生物障害に罹患している被検者が、腫瘍始原細胞を含んでなる腫瘍を明示する、請求項39に記載の方法。
(請求項45)
腫瘍始原細胞の頻度を前記被検者において低下させる工程をさらに含んでなる、請求項44に記載の方法。
(請求項46)
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項45に記載の方法。
(請求項47)
頻度の低下が、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される、請求項45に記載の方法。
(請求項48)
頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を使用して決定される、請求項47に記載の方法。
(請求項49)
in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、請求項48に記載の方法。
(請求項50)
頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件中への限界希釈沈着を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して決定される、請求項47に記載の方法。
(請求項51)
in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、請求項50に記載の方法。
(請求項52)
抗癌剤を投与する工程をさらに含んでなる、請求項28に記載の方法。
(請求項53)
前記EFNAモジュレーターが配列番号2に示されるアミノ酸配列又はその断片を含む、請求項28に記載の方法。
(請求項54)
前記EFNAモジュレーターが汎EFNAモジュレーターを含む、請求項28に記載の方法。
(請求項55)
腫瘍始原細胞の頻度を低下させることの必要な被検者において腫瘍始原細胞の頻度を低下させる方法であって、前記被検者へEFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記方法。
(請求項56)
腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項55に記載の方法。
(請求項57)
前記腫瘍永続化細胞がCD44+細胞又はCD133+細胞である、請求項56に記載の方法。
(請求項58)
前記EFNAモジュレーターが抗体を含む、請求項55に記載の方法。
(請求項59)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項58に記載の方法。
(請求項60)
前記EFNAモジュレーターが抗EFNA4抗体を含む、請求項59に記載の方法。
(請求項61)
被検者が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される新生物障害に罹患している、請求項55に記載の方法。
(請求項62)
被検者が血液系腫瘍に罹患している、請求項55に記載の方法。
(請求項63)
腫瘍始原細胞の頻度が少なくとも10%低下する、請求項55に記載の方法。
(請求項64)
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項55に記載の方法。
(請求項65)
頻度の低下が、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される、請求項55に記載の方法。
(請求項66)
血液系腫瘍に罹患している被検者を治療する方法であって、前記被検者へEFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記方法。
(請求項67)
前記EFNAモジュレーターがEFNA4モジュレーターである、請求項66に記載の方法。
(請求項68)
EFNAモジュレーターを被検者へ投与する工程を含んでなる、被検者における腫瘍を抗癌剤での治療のために増感させる方法。
(請求項69)
前記EFNAモジュレーターが抗体を含む、請求項68に記載の方法。
(請求項70)
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項68に記載の方法。
(請求項71)
前記抗癌剤が化学療法剤を含む、請求項68に記載の方法。
(請求項72)
前記抗癌剤が免疫療法剤を含む、請求項68に記載の方法。
(請求項73)
過剰増殖性障害を診断することの必要な被検者において過剰増殖性障害を診断する方法であって:
a)前記被検者より組織試料を入手する工程;
b)該組織試料を少なくとも1つのEFNAモジュレーターと接触させる工程;及び
c)該試料と会合したEFNAモジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる、前記方法。
(請求項74)
EFNAモジュレーターがモノクローナル抗体を含む、請求項73に記載の方法。
(請求項75)
抗体がレポーターと作動可能に会合している、請求項74に記載の方法。
(請求項76)
EFNAモジュレーターを含んでなる容器(receptacle)とEFNA関連障害を治療又は診断するのに前記EFNAモジュレーターを使用するための指示物(instructional materials)とを含んでなる、EFNA関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品。
(請求項77)
前記EFNAモジュレーターがモノクローナル抗体である、請求項76に記載の製造品。
(請求項78)
容器が読取り可能プレートを含む、請求項76に記載の製造品。
(請求項79)
少なくとも1つの内在化EFNAモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
(請求項80)
前記EFNAモジュレーターが抗体を含む、請求項79に記載の方法。
(請求項81)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項80に記載の方法。
(請求項82)
モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項81に記載の方法。
(請求項83)
モノクローナル抗体がEFNA4と会合する、請求項81に記載の方法。
(請求項84)
少なくとも1つの中和EFNAモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
(請求項85)
前記EFNAモジュレーターが抗体を含む、請求項84に記載の方法。
(請求項86)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項85に記載の方法。
(請求項87)
前記モノクローナル抗体が抗EFNA4抗体を含む、請求項86に記載の方法。
(請求項88)
前記EFNA4抗体が汎EFNA抗体を含む、請求項87に記載の方法。
(請求項89)
新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される、請求項84に記載の方法。
(請求項90)
腫瘍始原細胞をEFNAモジュレーターと接触させる工程を含んでなる、腫瘍始原細胞の集団を同定する、単離する、分画する、又は濃縮する方法。
(請求項91)
前記EFNAモジュレーターが抗体を含む、請求項90に記載の方法。
(請求項92)
hSC4.5、hSC4.15、hSC4.22、及びhSC4.47からなる群より選択される抗体上に見出されるヒト化可変領域に実質的に類似したヒト化抗体可変領域と医薬的に許容される担体とを含んでなる、組成物。
(請求項93)
軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなる抗EFNA4抗体であって、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号151、配列番号155、配列番号159、及び配列番号163に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号149、配列番号153、配列番号157、及び配列番号161に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記抗EFNA4抗体。
(請求項94)
医薬有効量のEFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、転移を阻害するか又は予防することの必要な被検者において転移を阻害又は予防する方法。
(請求項95)
被検者がEFNAモジュレーターの投与の前又は後に腫瘍減量術を受ける、請求項94に記載の方法。
(請求項96)
前記腫瘍減量術が少なくとも1つの抗癌剤の投与を含む、請求項94に記載の方法。
(請求項97)
医薬有効量のEFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、維持療法の必要な被検者に維持療法を実施する方法。
(請求項98)
前記被検者がEFNAモジュレーターの投与に先立って新生物障害について治療された、請求項97に記載の方法。
(請求項99)
EFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、過剰増殖性障害に罹患している被検者において腫瘍細胞を枯渇する方法。
(請求項100)
前記腫瘍細胞が腫瘍始原細胞を含む、請求項99に記載の方法。
(請求項101)
EFNAモジュレーターを投与する工程を含んでなる、EFNA関連障害を in vivo で診断する、検出する、又はモニターすることの必要な被検者において、EFNA関連障害を in vivo で診断する、検出する、又はモニターする方法。
Claims (19)
- キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号157の残基31−35、CDR−H2について配列番号157の残基50−65、及びCDR−H3について配列番号157の残基95−102として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号159の残基24−34、CDR−L2について配列番号159の残基50−56、及びCDR−L3について配列番号159の残基89−97として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がKabatに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号157の残基26−32、CDR−H2について配列番号157の残基53−55、及びCDR−H3について配列番号157の残基96−101として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号159の残基26−32、CDR−L2について配列番号159の残基50−52、及びCDR−L3について配列番号159の残基91−96として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がChothiaに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号157の残基30−35、CDR−H2について配列番号157の残基47−58、及びCDR−H3について配列番号157の残基93−101として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号159の残基30−36、CDR−L2について配列番号159の残基46−55、及びCDR−L3について配列番号159の残基89−96として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がMacCallumに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号12、CDR−H2について配列番号25、及びCDR−H3について配列番号38として示される3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号51、CDR−L2について配列番号74,及びCDR−L3について配列番号87として示される3つのCDRを含む、
前記キット。 - 抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号157として示される重鎖可変領域及び配列番号159として示される軽鎖可変領域を含む、請求項1−4のいずれかに記載のキット。
- キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号161の残基31−35、CDR−H2について配列番号161の残基50−65、及びCDR−H3について配列番号161の残基95−102として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号163の残基24−34、CDR−L2について配列番号163の残基50−56、及びCDR−L3について配列番号163の残基89−97として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がKabatに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号161の残基26−32、CDR−H2について配列番号161の残基53−55、及びCDR−H3について配列番号161の残基96−101として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号163の残基26−32、CDR−L2について配列番号163の残基50−52、及びCDR−L3について配列番号163の残基91−96として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がChothiaに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号161の残基30−35、CDR−H2について配列番号161の残基47−58、及びCDR−H3について配列番号161の残基93−101として示される重鎖可変領域の3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号163の残基30−36、CDR−L2について配列番号163の残基46−55、及びCDR−L3について配列番号163の残基89−96として示される軽鎖可変領域の3つのCDRを含み、当該残基がMacCallumに従って番号付けされる、
前記キット。 - キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトEFNA4(エフリンA4リガンド)に結合し、抗体又はその抗原結合性断片が、CDR−H1について配列番号14、CDR−H2について配列番号27、及びCDR−H3について配列番号40として示される3つのCDRを含み、CDR−L1について配列番号53、CDR−L2について配列番号76,及びCDR−L3について配列番号89として示される3つのCDRを含む、
前記キット。 - 抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号161として示される重鎖可変領域及び配列番号163として示される軽鎖可変領域を含む、請求項1〜9のいずれかに記載のキット。
- キメラ抗体、CDR移植抗体、又はヒト化抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む1以上の容器を含むキットであって、 抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号137として示される重鎖可変領域及び配列番号139として示される軽鎖可変領域を含む、請求項1記載のキット。
- 抗体又はその抗原結合性断片が、中和抗体、枯渇性抗体、及び/又は内在化抗体である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のキット。
- 過剰増殖性障害の治療にキットを用いるための指示書を含む、請求項1〜12のいずれかに記載のキット。
- 過剰増殖性障害が新生物障害である、請求項13記載のキット。
- 新生物障害が固形腫瘍を含む、請求項14に記載のキット。
- 新生物障害が、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肝臓癌、又は肺癌である、請求項15に記載のキット。
- 新生物障害が血液系腫瘍である、請求項14に記載のキット。
- 血液系腫瘍が白血病である、請求項17に記載のキット。
- 腫瘍始原細胞のターゲッティングにキットを用いるための指示書を含む、請求項1〜12のいずれかに記載のキット。
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