KR20170073000A - Natural disinfectant for farm using specific lactic acid bacteria strain - Google Patents
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Abstract
본 발명은 L.plantarum 6-5 의 특정 균주를 이용한 천연 소독제에 관한 것이다.The present invention relates to a natural disinfectant using a specific strain of L. plantarum 6-5.
Description
본 발명은 천연소독제에 관한 것이다.The present invention relates to natural disinfectants.
소독은 전염병의 위험성이 있는 병원체와 그 병원체를 전파시키는 해충 등을 사멸시킴으로써 질병에 의한 피해를 미연에 막는 절차이다. 국내 각 지역에서의 병원체 전이뿐 아니라 국경 검역 또한 그 중요성이 부각되고 있는 현 시점에서 구제역이나 돼지유행성설사병 등이 중국이나 일본 등 주변국에서 지속적으로 발생하고 있다는 점을 감안하면, 우리 농가를 안전하게 방어하기 위해서는 자체적으로 철저한 검역과 소독을 시행함으로써 차단방역을 행하는 것이 매우 중요하다.Disinfection is the process of preventing damage from diseases by destroying pathogens that are at risk of communicable diseases and pests that propagate those pathogens. Considering the fact that not only the pathogen transduction in each region but also the border inspection is becoming more important, considering the fact that foot-and-mouth disease and pandemic diarrhea continue to occur in neighboring countries such as China and Japan, It is very important to perform quarantine and disinfection by conducting thorough quarantine and disinfection.
그 동안 이용되어 온 소독은 물리적 소독과 화학적 소독으로 나눌 수 있다. 이 중 소독제를 사용한 화학적 소독이 편의성이 우수하며, 소독 대상을 거의 손상시키지 않고 병원체를 선별적으로 제거할 수 있는 기능이 있어 가장 널리 사용되고 있다.Disinfection that has been used in the past can be divided into physical disinfection and chemical disinfection. Of these, chemical disinfection using disinfectants is the most convenient because of its convenience and ability to selectively remove pathogens without substantially damaging the disinfected object.
화학적 소독인 소독제는 적용 대상 등에 따라 그 종류가 다양하게 공지되어 있다. 공지된 소독제는 편의상 알칼리제제(염기제제), 산성제제, 산화제 및 알데히드제로 나눌 수 있다. Disinfectants, which are chemical disinfectants, are variously known depending on the application. Known disinfectants can be conveniently divided into alkali formulations (base formulations), acid formulations, oxidants and aldehydes.
염기제제는 탄산소다, 가성소다 등이 있으며 값이 저렴하여 대단위 소독에 적합하다. 유기물이 많은 환경에서도 소독효과가 좋기 때문에 오물이 많은 축사 내외부 등의 소독에 이용한다. 다만 부식성이 강하여 차바퀴가 아닌 차체에 사용하면 도색이 벗겨질 우려가 있고, 눈과 피부에 자극적이며, 알루미늄 계통에는 사용하지 말아야 할 것으로 알려져 있다.Base formulations include sodium carbonate, caustic soda, etc., and are inexpensive and suitable for large-scale disinfection. Because the disinfection effect is good even in the environment with many organic matters, it is used for the disinfection of the inside and outside of the house with many dirt. However, it is known that if it is used on a car body instead of a wheel, it may be peeled off, it is irritating to eyes and skin, and should not be used in aluminum system.
산성제제는 구연산, 초산 용액 등으로서 보통 단일제제보다는 복합제품으로 많이 판매되고 있다. 2% 정도의 농도로 희석하여 사용하며 사람과 의복에 접촉되어도 안전하다. 다만 침투력이 약해 유기물이 있을 경우에는 소독 효과가 매우 낮아진다.Acid formulations, such as citric acid and acetic acid solution, are usually sold as a composite product rather than a single preparation. It is diluted to the concentration of 2% and it is safe to contact with people and clothes. However, if the penetration power is weak and the organism is present, the disinfection effect is very low.
알데히드제제는 글루타알데히드와 포름알데히드가 있으며, 독성이 있으므로 사람과 가축에는 직접 닿지 않도록 주의해야 한다. 본 제제는 유기물이 다소간 있더라도 소독효과가 좋다. 다만 값이 비싼 편이어서 대량으로 사용하기에는 비용적 측면에서 부담이 될 수 있다.Aldehyde formulations contain glutaraldehyde and formaldehyde, which are toxic and should be avoided from direct contact with humans and livestock. This product has good disinfection effect even if organic matter is little. However, since it is expensive, it may be costly to use in a large amount.
산화제는 산화작용으로 바이러스의 단백질 등을 파괴하는 소독제로서 주로 염소 또는 산소계 성분으로 구성된다. 염소계는 비전리형인 차아염소산(HClO)을 발생시켜 살균력을 발휘한다. 본 제제는 산성일수록 살균력이 증대되나 알칼리성에서는 살균력이 감퇴된다. 또한 유기물이 혼합된 상태에서는 소독효과가 낮아지며 15-20 °C 이상의 온도에서는 화학적으로 불안정하여 급속히 분해되기 때문에 소독약을 자주 갈아 주어야 한다.The oxidizing agent is a disinfectant which oxidizes and destroys virus proteins and the like, mainly composed of chlorine or an oxygen-based component. The chlorine system generates non-electrolytic hypochlorous acid (HClO), and it exhibits sterilizing power. The acidity of the formulation increases as the bactericidal power increases, but the alkalinity decreases the bactericidal power. In addition, the disinfection effect is lowered in the mixed state of the organic matter, and it is chemically unstable at the temperature of 15-20 ° C or higher.
이상 화학적 소독의 장점과 단점에 대해 살펴보았다. 그런데, 보듯이 화학적 소독은 일괄적으로 생체에 접촉하면 해롭기 때문에 소독시 눈, 호흡기, 피부 등에 닿지 않도록 반드시 얼굴전체를 덮는 보호구의 착용이 권장된다. 이러한 점은 당연히 가축에게도 마찬가지이다. 때문에 가축이 있는 상황과 없는 상황에서의 소독제의 선택 및 분사 방법이 상이할 필요가 있다. 또한 화학적 소독은 수생환경에 악영향을 미칠 수 있어 중화되지 않은 대량의 소독약제가 하수구로 흘러 드는 일이 없도록 각별한 주의가 요망된다.The advantages and disadvantages of chemical disinfection were discussed. As you can see, chemical disinfection is harmful if you come into contact with living organisms at once. Therefore, it is recommended to wear protective gloves covering the entire face to prevent contact with the eyes, respiratory system, and skin during disinfection. This is of course also true of livestock. Therefore, it is necessary that the method of selecting and spraying the disinfectant in a situation where there is a livestock and a situation without a livestock are different. In addition, chemical disinfection can adversely affect the aquatic environment, so special attention should be paid to ensure that large quantities of non-neutralizing disinfectant do not flow into the drain.
이에 최근 화학적 소독을 대체할 수 있는 신규의 소독제 개발에 이목이 집중되고 있다. 예컨대 대한민국 공개특허공보 제 10-2015-0121509 호는 화학적 소독으로 인한 역한 냄새 유발, 피부 접촉시 상처 유발 및 수질오염·토양오염 등의 환경오염 문제 야기를 고려해 이를 억제하면서 소독효과를 나타내는 천연 한방 소독제를 소개한다. 하지만 이는 어린이 장난감, 키보드 등 방역이 어느 정도 보장되는 사회에서 사용되는 용도에 불과한 것으로 농가 등에서 고려한 유해한 전염병 매게 병원체를 방역하기에는 그 효과가 미비하여 적합하지 않다.Recently, attention has been focused on the development of new disinfectants that can replace chemical disinfection. For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2015-0121509 discloses a natural disinfectant disinfectant which exhibits a disinfecting effect while suppressing the environmental pollution caused by a chemical odor, a wound caused by skin contact, and water and soil pollution . However, this is only used in a society where children's toys and keyboards are guaranteed a certain level of protection. Therefore, it is not suitable for preventing harmful infectious disease agents considered in farm households.
본 발명은 생체 또는 환경에 유해한 공지의 화학적 소독을 대체할 수 있는 신규의 소독 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel disinfection method which can replace known chemical disinfection which is harmful to the living body or the environment.
2014년 12월 초 구제역 발생으로 인해 국내 축산업계는 초비상 상태에 직면한 바 있다. 이후 구제역 발생 예방을 위해 백신 접종이 지역별, 농가별로 이루어졌다. 하지만 구제역 백신 접종은 감염을 완전히 막아주는 것이 아니며 감염되더라도 체내에서 바이러스 증식을 억제해 임상증상을 완화시켜주고 바이러스 배출량을 감소시켜 전파와 확산을 최소화 해주는 것에 불과하다는 인식이 퍼져 반사이익 차원에서 구연산, 염소제 등의 소독제에 대한 사용이 급격히 증대되었다.Due to the outbreak of foot-and-mouth disease in early December 2014, the domestic livestock industry faced a superficial situation. In order to prevent the outbreak of foot-and-mouth disease, vaccination was done by region and farmhouse. However, vaccination against foot-and-mouth disease does not completely prevent infection. Even if it is infected, there is a perception that it suppresses virus multiplication in the body, alleviates clinical symptoms, reduces virus emission and minimizes propagation and spread. The use of disinfectants such as chlorine was rapidly increased.
이러한 무분별한 소독제의 남용은 다양한 부작용을 유발했다.The abuse of these reckless disinfectants has caused a variety of side effects.
먼저 락스로 대표되는 차아염소산 소독제의 경우 구연산, 아세트산 등의 산성 소독제와 섞거나 뜨거운 물로 희석하는 과정에서 염소가스가 발생해 가축이나 인체의 점막에 손상을 일으켰다. 또한 포름알데히드 소독제는 발암물질로 알려진 포름알데히드를 주성분으로 하는 탓에 밀폐된 공간에서 흡입하는 경우를 자제해야 하는데 그렇지 못한 상황이 왕왕 발생했다. 무엇보다 전술한 바와 같이 과도하게 사용된 소독제가 농가 인근의 토지로 유입됨으로써 토지와 지하수를 오염시켰다. 특히 일부 농가는 음용수를 지하수에 의존하는데, 토지를 통과해 유입된 소독제가 지하수의 수질을 악화시키고 만 것이다.First, hypochlorous acid disinfectant, which is represented by Lax, was mixed with acid disinfectants such as citric acid and acetic acid, or diluted with hot water, causing chlorine gas to damage the mucous membranes of livestock and human body. In addition, formaldehyde disinfectants are made of formaldehyde, which is known as a carcinogen, and should not be inhaled in an enclosed space. Above all, as mentioned above, excessively used disinfectant contaminated land and groundwater by entering the land near farmhouse. In particular, some farmers depend on drinking water for groundwater, and the disinfectant flowing through the land will deteriorate the quality of groundwater.
분명 소독은 전염병 등의 확산과 발생을 예방하기 위하여, 농장 정문, 장화, 발판 및 축사 내에서 정기적으로 철저하게 이루어지는 것이 요망된다. 하지만 무분별한 화학적 소독의 남용으로 발생하는 문제점은 더 이상 방관할 수 없는 지경까지 다다르고 있다. 본 발명자는 이러한 상태를 개선하고자 생물학적 소독 방법을 고려하게 되었다.Obviously, disinfection is required to be thoroughly carried out regularly within the farm front door, boots, stools and housing to prevent the spread and occurrence of infectious diseases. However, the problems caused by the abuse of indiscriminate chemical disinfection are reaching to the point where it can no longer be overlooked. The present inventors have considered a biological disinfection method to improve this condition.
본 발명은 아래의 수단을 통해 전술한 과제를 해결했다.The present invention has solved the above-mentioned problems through the following means.
(1) 5 종의 공시균주인 E. coli , S . typhimurium , V . harveyi , C. perfringens, M. fortuitum 에 대해 소독 기능을 가진 유산균 균주(L. plantarum 6-5, KCCM11453P).1, five kinds of strains disclosed in E. coli, the S. typhimurium, V. harveyi , C. perfringens, M. fortuitum ( L. plantarum 6-5, KCCM11453P) with disinfection function against the plant.
(2) 상기 (1) 의 균주를 액상 발효시킨 것을 포함하는 천연 소독제.(2) A natural disinfectant comprising the fermentation of the strain of (1) above.
(3) 상기 (2) 에 있어서, 액상 발효는 과일 파쇄물과 물을 혼합한 혼합물에 흙설탕으로 당도를 8-10 brix 가 되도록 첨가한 후 25-28 ℃의 온도에서 혐기발효를 진행하는 것을 특징으로 하는 천연 소독제. (3) In the above (2), the liquid fermentation is characterized in that the sugar is added to the mixture of fruit pulp and water so that the sugar content is 8-10 brix and the anaerobic fermentation proceeds at 25-28 ° C Natural disinfectant.
본 발명에 따른 유산균은 소독력이 우수하고, 제품으로서 장기 보관하더라도 열안정성 및 저장안정성 또한 양호하다. 이러한 유산균을 이용하는 본 발명은 화학적 소독을 대체할 수 있는 친환경 소독제로 활용할 수 있다. 본 발명은 화학적 소독과 달리 인체나 가축에게 무해하고, 자극성이 덜하며, 토양오염 및 수질오염을 직접적으로 유발하지 않는다.The lactic acid bacterium according to the present invention is excellent in disinfecting power and has excellent heat stability and storage stability even when stored for a long period as a product. The present invention using such a lactic acid bacterium can be utilized as an environmentally friendly disinfectant that can replace chemical disinfection. Unlike chemical disinfection, the present invention is harmless to humans and livestock, less irritant, and does not directly cause soil pollution and water pollution.
환언하면, 본 발명은 기존 화학적 소독 대비 농가에서의 악취 및 병원성 질환을 일으키는 유해균들에 대해 대등하거나 또는 월등한 소독기능을 갖는 반면, 기존의 산성 및 염기성 소독제에 비해 인체나 동물에 대한 유해성은 전혀 없다. 따라서 본 발명에 따른 소독제는 농장에서 지속적으로 사용할 수 있고, 소독효과도 높아 소독제로서의 탁월한 효과를 기대할 수 있으며, 축산 농가의 주요 악취원인인 황화가스를 생성하는 Salmonella 균주에 대해서도 항균력을 나타내어 악취 저감효과도 충분히 기대할 수 있다.In other words, the present invention has the disinfection function equivalent to or superior to the harmful bacteria causing the odor and the pathogenic disease in the farm compared to the conventional chemical disinfection, whereas the harmfulness to the human body and the animal is not at all compared with the existing acidic and basic disinfectant none. Therefore, the disinfectant according to the present invention can be used continuously in a farm and can be highly effective as a disinfectant because of its high disinfection effect. The antimicrobial activity against Salmonella strains that produce sulfide gas, which is a major malodor of livestock farmers, Can be expected.
도 1 은 본 발명에 따른 균주의 표 3 의 액상배지 조성 별 발효효율을 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명에 따른 균주의 표 4 의 고체배지 조성 별 발효효율을 나타낸 것이다.
도 3 은 농장에서 분리한 유해균에 대한 화학 소독제와 본 발명에 따른 천연 소독제의 항균력을 비교한 도이다. 좌측부터 S. enteritidis , S. gallinaum , E. coli 배지이고, 각 배지당 좌측은 Ammonium chloride 계열의 화학소독제 처리 결과, 우측은 본 발명에 따른 천연 소독제 처리 결과를 나타낸다.
도 4 는 본 발명에 따른 천연 소독제의 항균활성 평가 결과를 나타낸 것이다. 1번은 Vibrio . harveyi, 2번은 Campylobacter jejuni, 3번은 Salmonella enteriditis, 4번은 Clostridium perfringens, 5번은 E. coli 에 관한 것이다.
도 5 는 본 발명에 따른 천연 소독제 소독 전/후 돈사 내부 낙하균의 변화를 나타낸 것이다.
도 6 은 화학 소독제 소독 전/후 돈사 내부 낙하균의 변화를 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the fermentation efficiencies of the strains according to the present invention for each liquid medium composition in Table 3.
FIG. 2 shows the fermentation efficiencies of the strains according to the present invention according to the solid medium composition in Table 4.
FIG. 3 is a view comparing antimicrobial activity of a chemical disinfectant for a harmful microorganism isolated from a farm and a natural disinfectant according to the present invention. S. enteritidis , S. gallinaum , and E. coli from the left side. The left side of each medium shows the result of treatment with the chemical disinfectant of Ammonium chloride series, and the right side shows the result of treating the natural disinfectant according to the present invention.
FIG. 4 shows the results of evaluating antimicrobial activity of a natural disinfectant according to the present invention. Number one is Vibrio . harveyi , 2 is Campylobacter jejuni, 3 times relates to a Salmonella enteriditis, 4 times Clostridium perfringens, 5 times E. coli.
FIG. 5 is a graph showing changes in the dropping bacteria inside and after the disinfection of the natural disinfectant according to the present invention.
Fig. 6 shows the change of the microorganisms in the pigs before and after disinfecting the chemical disinfectant.
본 발명은 유산균 L. plantarum 6-5 균주를 활용하는 것을 특징으로 한다. L. plantarum 6-5는 부타페스트조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁한 균주로서, 기탁기관에 등록한 명칭은 Lactobacillus plantarum GB-PLA2 이며, 부여 받은 수탁번호는 KCCM11453P이다. 본 발명자는 위 유산균 L. plantarum 6-5 균주의 소독제로서의 가능성을 확인하였으며, 이는 축산농가 내부 소독용 친환경 소독제로서 기존 화학 소독제를 대체할 수 있는 것임을 발견했다. 이에 본 발명이 실제 제품으로 유통된다면 안전한 축산물 생산 등에 막대한 기여를 할 것으로 예상된다.The present invention is characterized in that use of lactic acid bacteria L. plantarum strains 6-5. L. plantarum 6-5 was deposited with the Korean Agency for Microbiology and Biotechnology, an international depository organization under the Treaty of Buta Fest. The registered name of the plant is Lactobacillus plantarum GB-PLA2, and the accession number is KCCM11453P. The present inventors have confirmed the possibility of the disinfectant of Lactobacillus plantarum strain 6-5 as an environmental disinfectant for disinfection of livestock farms and found that it is a substitute for conventional chemical disinfectants. Therefore, if the present invention is distributed as an actual product, it is expected to contribute enormously to the production of safe livestock products.
본 발명은 과일을 특정 조건 하에서 액상발효한 성분을 포함하는 천연 소독제에 관한 것이다. 이하 본 발명에 함유된 대표 균주부터 소개한다.The present invention relates to a natural disinfectant comprising a liquid fermented ingredient under certain conditions of the fruit. Hereinafter, representative strains contained in the present invention will be introduced.
[균주 평가][Strain evaluation]
본 발명에 따른 천연 소독제에 함유되어 있는 대표 균주는 유산균 L. plantarum 6-5 균주이다. 이는 다음과 같은 우연한 절차에 따라 선발하게 되었다.The representative strain contained in the natural disinfectant according to the present invention is Lactobacillus plantarum strain 6-5. It was selected according to the following accidental procedure.
본 발명자는 과일, 채소 및 이의 발효물과 건강한 자돈 및 가금류의 장에서 채취한 분변 샘플 및 전통 발효식품에 주목했다. 여기서 채취한 각 샘플을 0.85% NaCl 이 첨가된 멸균 생리식염수에 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 으로 각각 희석하여 100 μl 씩 탄산칼슘이 함유된 MRS 한천 배치(protease peptone 10 g/L, beef extract 10 g/L, yeast extract 5 g/L, glucose 20 g/L, Tween 80 1 g/L, sodium acetate 5 g/L, ammonium citrate 1 g/L, magnesium sulfate 7H2O 0.1 g/L, man ganese sulfate 0.05 g/L, dipotassium phosphate 2 g/L, agar 15 g/L)에 도말하고, 도말된 배지를 유산균의 성장에 적합한 조건인 33~35 °C 에서 48 시간 동안 배양을 하였다. 48 시간 경과 후 배양된 배지를 관찰하여 균체 주위에 투명환이 생성된 colony 120 여종을 1 차 선발하였다.The present inventors have focused on fruits, vegetables and fermented products thereof, fecal samples taken from the field of healthy piglets and poultry, and traditional fermented foods. Each sample was diluted to 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 and 10 -5 in sterile physiological saline containing 0.85% NaCl, and 100 μl of calcium carbonate-containing MRS agar was placed (10 g / L protease peptone, 10 g / L beef extract, 5 g / L yeast extract, 20 g / L glucose, 1 g /
위 1 차 선발균주를 대상으로 일반적으로 가축에 질병을 유발하는 병원균인 대장균(E.coli), 살모넬라(S. gallinarum, S. entritidis), 클로스트리디움(C.perfringens) 균주를 대상으로 항균활성 평가를 통해 활성이 양호한 최종 15 종을 선발하였다. 선발한 15 종을 모두 16S rRNA sequencing 을 통해 균주 동정을 실시하였으며, 2차 선발균주는 in vivo 기능성 평가 및 평가 모델 확립을 통해 채택했다. 그 가운데 본 발명의 목적 효과 발현에 있어 최적화된 기능을 지닌 최종 선발된 균주가 바로 유산균 L. plantarum 6-5 균주이다.In order to investigate the antimicrobial activity of E. coli, S. gallinarum , S. entritidis and C.perfringens strains, which are generally pathogenic bacteria causing livestock diseases, The final 15 species with good activity were selected through the evaluation. All 15 isolates were identified by 16S rRNA sequencing. Secondary isolates were selected by in vivo functional evaluation and establishment of evaluation models. Among them, L. plantarum 6-5 strain is the final selected strain having the function optimized for manifesting the objective effect of the present invention.
(+: 0.5~1.0 cm, ++: 1.0~2.0 cm, +++: 2.0 cm이상)(+: 0.5 to 1.0 cm, ++: 1.0 to 2.0 cm, +++: 2.0 cm or more)
유산균 L. plantarum 6-5 균주의 정확한 동정을 위하여 균주의 genomic DNA 를 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 PCR 방법으로 증폭한 후에 염기서열을 분석하였으며, GeneBank 에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교하였다. 유산균 L. plantarum 6-5 균주는 아래의 표 2 와 같이 L. plantarum 과 높은 상동성을 나타내었다.Genomic DNA of the strain was isolated for accurate identification of L. plantarum strain 6-5. The 16S rRNA gene was amplified by PCR method and the nucleotide sequence was analyzed and compared with the nucleotide sequences of other strains registered in GeneBank. Lactobacillus L. plantarum strain 6-5 showed high homology with L. plantarum as shown in Table 2 below.
Total nts*Diff /
Total nts *
ident(%)Max
ident (%)
* nts : Nucleotide sequence* nts: Nucleotide sequence
유산균 L. plantarum 6-5 균주를 소독제로 대량생산하기 위해 최적 성장을 위한 배지조성 및 발효조건을 조사하였다. 액상배지조성은 도 1 과 같이 아래 표 3 중 C-1 이 가장 우수하였으며, 고상발효용 배지는 도 2 와 같이 아래 표 4 중 대두박/당밀, 대두박/소맥피/당밀 혼합배지가 균 성장 측면에서 우수한 결과가 도출되었다.In order to mass - produce L. plantarum strain 6-5 as a disinfectant, medium composition and fermentation conditions for optimum growth were investigated. As shown in Fig. 1, C-1 in Table 3 was the best in the composition of the liquid medium, and the medium for the solid phase fermentation was as shown in Fig. 2 in the soybean meal / molasses and soybean meal / Excellent results were obtained.
또한 유산균 L. plantarum 6-5 균주는, 아래 표 5 와 같이 최적 배양온도는 35 °C, 초기 수분함량은 50 % 에서 가장 우수한 결과가 확보되었다.As shown in Table 5 below, the optimum culture temperature was 35 ° C and the initial moisture content was 50%, which is the best result for Lactobacillus plantarum strain 6-5.
(Log cfu/g)Average number of bacteria
(Log cfu / g)
아울러 발효방식을 호기 및 혐기발효로 달리하며 48시간 발효를 통해 균수 및 pH 변화를 조사하였는데, 호기발효조건보다는 혐기발효조건에서 균수 및 pH 측면이 모두 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 균주는 혐기발효 공정이 유용물질 생산에 효과적이다.The fermentation method was changed to aerobic fermentation and anaerobic fermentation, and bacterial count and pH were investigated by fermentation for 48 hours. Therefore, the strain according to the present invention is effective for the production of useful substances by an anaerobic fermentation process.
아래의 표 7 의 조건에 따른 LC/MS/MS 를 이용하여 유기산(Lactic acid, Phenyllactic acid)에 대한 평가를 진행하였다.Evaluation of organic acids (Lactic acid, Phenyllactic acid) was carried out using LC / MS / MS according to the conditions shown in Table 7 below.
Spray voltage : Negative 4.0kV
Transfer capillary temperature : 350C
Sheath gas pressure : 40, Aux gas pressure : 20
Vaporizer Temperature : 125C
Collision energy :
- Lactic-acid 12, Phenyllactic-acid 36
SRM mode : Negative
- Lactic acid ion transitions : m/z 88.01 > 43.2
- Phenyllactic acid ion transitions : m/z 165.0 > 147.1XCALIBUR 2.0 sofrware
Spray voltage: Negative 4.0kV
Transfer capillary temperature: 350C
Sheath gas pressure: 40, Aux gas pressure: 20
Vaporizer Temperature: 125C
Collision energy:
- Lactic-acid 12, Phenyllactic-acid 36
SRM mode: Negative
- Lactic acid ion transitions: m / z 88.01 > 43.2
- Phenyllactic acid ion transitions: m / z 165.0 > 147.1
그 결과는 아래의 표 8 과 같았다.The results are shown in Table 8 below.
위 표 8 과 같이 본 발명에 따른 균주는 높은 lactic acid 및 PLA 생성을 가진다.As shown in Table 8, the strain according to the present invention has high lactic acid and PLA production.
본 발명에 따른 균주를 대상으로 발효방식에 따른 PLA 생성능을 조사하였다. 액상발효의 경우는 MRS 배지를 이용하여 33 °C, 100 rpm 의 조건에서 64 시간 배양한 후 PLA 함량을 분석하였으며, 고상발효의 경우는 대두박/소맥피 배지를 이용하여 초기 원료의 수분함량을 50 % 로 설정하고, 33 °C 의 배양온도에서 64 시간 동안 발효를 통해 PLA 함량을 조사하였다. 그 결과 아래의 표 9 와 같이 액상발효 조건에서의 PLA 함량이 고상발효 조건에서보다 5-20 배 높은 것으로 확인되었다.The PLA production according to the fermentation method was examined for the strains according to the present invention. In the case of liquid fermentation, the content of PLA was analyzed after culturing for 64 hours at 33 ° C and 100 rpm using MRS medium. In the case of solid fermentation, the moisture content of the initial raw material was measured by using soybean / %, And PLA content was investigated by fermentation at a culture temperature of 33 ° C for 64 hours. As a result, it was confirmed that PLA content in the liquid fermentation condition was 5 to 20 times higher than that in the solid phase fermentation condition, as shown in Table 9 below.
(%)Lactic acid
(%)
(mg/kg)PLA
(mg / kg)
(%)Lactic acid
(%)
(mg/kg)PLA
(mg / kg)
또한 고체발효 공정 가운데 호기 및 혐기발효 조건에 따른 PLA 생성량도 비교해보았으며, 발효조건은 대두박/소맥피 배지에 초기 원료의 수분함량을 50 % 로 설정하고, 33 °C 의 배양온도에서 호기 및 혐기발효조건으로 64 시간 동안 발효를 통해 발효조건에 따른 PLA 함량을 조사하였다. 그 결과 아래 표 10 과 같이 호기 발효보다는 혐기발효 공정 적용을 통해 2-10 배 정도 높은 PLA 함량을 확인하였다.The fermentation conditions were as follows: the moisture content of the initial raw material was set to 50% in the soybean / wheat flour culture medium and the fermentation conditions were set at the incubation temperature of 33 ° C and aerobic and anaerobic fermentation conditions The contents of PLA were investigated by fermentation conditions for 64 hours under fermentation conditions. As a result, the content of PLA was 2-10 times higher than that of aerobic fermentation through anaerobic fermentation process as shown in Table 10 below.
본 발명에 따른 균주의 고체발효 실험을 통해 확보한 샘플을 이용하여 50-80 °C 의 온도조건에서 5 분 및 10 분간 water bath 를 이용한 열처리를 통해 균주별 열안정성 평가를 실시하였다. 본 발명에 따른 균주는 열안정성이 우수하였다.The thermal stability of the strains was evaluated by heat treatment using a water bath for 5 minutes and 10 minutes at a temperature of 50-80 ° C using the samples obtained from the solid fermentation experiment according to the present invention. The strain according to the present invention was excellent in thermal stability.
본 발명에 따른 균주의 배양시간에 따른 유기산함량의 변화를 관찰하였으며, 그 결과는 표 11 과 같았다. 유기산은 lactic acid, acetic acid, phenyllactic acid(PLA) 총 3 가지 종류를 측정하였다.The changes of the organic acid content according to the incubation time of the strain according to the present invention were observed, and the results were as shown in Table 11. Three kinds of organic acids were measured: lactic acid, acetic acid, and phenyllactic acid (PLA).
[소독제 평가][Evaluation of disinfectant]
천연 유기산 및 flavonoid 함량이 높은 과일을 원료로 하여 액상발효를 통해 유산균 및 효모 균주를 접종한 뒤 90 일간의 발효 및 숙성 단계를 거치면 본 발명에 따른 항균활성이 높은 천연 소독제를 제조할 수 있다. 여기서 과일은 사과, 배, 오렌지, 바나나 등 계절과일 3 종 이상을 사용하는 것이 바람직하다. 유산균 발효는 과일 파쇄물 60 %, 물 40 % 혼합물에 흙설탕으로 당도를 8-10 brix 가 되게 첨가한 후 25-28 ℃의 온도에서 본 발명에 따른 유산균 L. plantarum 6-5 균주의 초기 균수를 1.0 X 103 cfu/mL 가 되도록 접종하고 30일간 혐기발효를 진행한다. 당도는 수시로 확인하여 발효기간 중 8 brix 이상이 항상 유지되도록 하는 것이 바람직하다. 숙성 단계에서는 온도를 20℃ 전후로 변경하여 30-60 일간 숙성을 진행한다. 숙성 후 유산균 균수는 1.0 X 106 cfu/g 이상이 된다.A natural antimicrobial activity disinfectant according to the present invention can be prepared by inoculating lactic acid bacteria and yeast strains through liquid fermentation using a natural organic acid and a fruit having a high flavonoid content as raw materials and then fermenting and aging for 90 days. Here, it is preferable to use at least three kinds of season fruits such as apples, pears, oranges and bananas. The lactic acid bacteria fermentation was carried out by adding sugar to a mixture of 60% fruit juice and 40% water to a sugar content of 8-10 brix, and then, at 25-28 ° C, the initial number of bacteria of the lactic acid bacteria L. plantarum 6-5 according to the present invention 1.0 X 10 < 3 > cfu / mL and anaerobic fermentation is carried out for 30 days. The sugar content is preferably checked at any time to ensure that at least 8 brix is maintained during the fermentation period. At the fermentation stage, the temperature is changed to around 20 ° C and the fermentation proceeds for 30-60 days. After aging, the number of lactic acid bacteria is 1.0 x 10 6 cfu / g or more.
이렇게 제조한 친환경 소독제의 유효농도 범위를 조사하였다.The effective concentration range of the environment - friendly disinfectant was investigated.
조사방법은 아래와 같다.The survey method is as follows.
a. 공시세균: Salmonella typhimurium, Clostridium perfrigens, Mycobacterium fortuitum, Escherichia coli, Vibrio harveyi a. Published bacteria: Salmonella typhimurium , Clostridium perfrigens , Mycobacterium fortuitum , Escherichia coli , Vibrio harveyi
b. 친환경 소독제 희석배율: 원액, 1/2배, 1/10배, 1/25배, 1/50배, 1/100배, 1/250배, 1/500배, 1/1,000배b. Environment-friendly disinfectant Dilution ratio: raw solution, 1/2, 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1 / 1,000 times
c. 시험방법 c. Test Methods
시험 방법은 소독제 효력시험법에 준하여 실시하며, 간략한 방법은 다음과 같다.The test method is carried out in accordance with the disinfectant efficacy test method. The brief method is as follows.
ⓐ 계대 중의 세균을 배지에 심어 활력이 인정되는 24시간 동안 배양한 세균을 사용하고, 사용 세균의 농도는 ml당 1.0X108 CFU 이상을 사용한다. Use bacterium cultured for 24 hours in which the bacteria in the passage are cultivated in the medium, and the concentration of bacteria used is 1.0 × 10 8 CFU or more per ml.
ⓑ 희석액으로 경수를 이용하며, 세균 시험균주는 공시균주와 같다.Ⓑ We use hard water as a diluent, and the bacterial test strain is the same as the published strain.
ⓒ 대조구로서 산성 및 염기성 소독제의 희석은 친환경 소독제 희석비율과 같이 희석하여 소독액 효력을 조사하였다. Ⓒ The dilution of acid and basic disinfectant as a control was diluted with the dilution ratio of environment-friendly disinfectant to investigate the effect of disinfectant.
ⓓ 37℃의 세균 4 ml를 4℃의 5% 유기물희석액 96ml에 섞은 후에, 혼합액 2.5 ml를 소독제 희석액에 넣고, 4℃에서 정확히 30분간 반응을 시킨다.
ⓔ 정확히 30분간의 반응이 끝나면 소독제의 효능을 중화하기 위하여 즉시 1.0 ml를 꺼내어 37 ℃의 9.0 ml의 중화배지에 넣고 혼합한 다음, 각 소독제 희석별로 0.1 ml씩 5개의 시험관의 영양배지가 들어있는 시험관에 넣어 혼합한 후에 37 ℃ 항온실에서 48시간 증식시킨다.Ⓔ After exactly 30 minutes of reaction, take 1.0 ml of the disinfectant immediately to neutralize the efficacy of the disinfectant, place it in 9.0 ml of neutralization medium at 37 ° C, mix it, and add 0.1 ml of each disinfectant diluted with 5 nutrient media After mixing in a test tube, the mixture is allowed to proliferate for 48 hours in a constant temperature room at 37 ° C.
ⓕ 5개의 동일 소독제 희석배수의 영양배지에서 2개 이상 증식이 인정되지 않는 최종 소독희석 단계를 소독제 및 친환경 소독제의 희석배수로 1차 결정한다.Ⓕ The final disinfection dilution step in which no more than 2 growths are recognized in the nutrient medium of five identical disinfectant dilution multiples shall be determined first by the dilution factor of disinfectant and environmentally friendly disinfectant.
이에 대한 소독 효력 시험은 아래와 같이 진행했다.The disinfection effect test was conducted as follows.
a. 공시세균: Salmonella typhimurium, Clostridium perfrigens, Mycobacterium fortuitum, Escherichia coli, Vibrio harveyi a. Published bacteria: Salmonella typhimurium , Clostridium perfrigens , Mycobacterium fortuitum , Escherichia coli , Vibrio harveyi
b. 친환경 소독제 비교평가를 위해 산성 및 염기성 소독제를 같이 평가하였으며, 산성 소독제는 알데히드 제제, 염기성 소독제는 제올라이트, 토리말린, 규사문석을 주성분으로 하는 염기성 제제를 사용하였다. b. Acid and basic disinfectants were evaluated for comparative evaluation of environment - friendly disinfectants. Basic disinfectants were used as acid disinfectants and basic disinfectants were zeolite, tallimarine and silicas.
c. 산성, 염기성 소독제 및 친환경 소독제 희석배수: 1차 소독 효과가 있는 희석배수의 123, 111, 100, 90, 80% (세균 소독효력 시험법 기준)c. Acidic, basic disinfectant and environmentally-friendly disinfectant Dilution drainage: 123, 111, 100, 90, 80% of the dilution drainage with primary disinfection effect (based on the Bactericidal Activity Test Method)
d. 시험방법 d. Test Methods
시험 방법은 소독제 효력시험법에 준하여 실시하여 최종 희석 배수를 결정한다.The test method shall be carried out in accordance with the disinfectant efficacy test method to determine the final dilution factor.
각 소독제의 유효농도를 확인하였으며, 산성 소독제의 경우 25배 희석한 것에서 소독력을 나타나는 최소 범위를 확인하였으나, 본 발명에 따른 친환경 소독제는 10배 희석한 것에서 소독력을 나타냈지만, 염기성 소독제의 경우 원액에서도 소독력이 나타나지 않았다. 위 결과를 바탕으로 소독력 실험에서 산성 소독제는 25배 희석액을 100%로 친환경 소독제는 10배 희석액을 100%로, 염기성 소독제는 원액을 100%로 하여 소독 효능 시험을 진행 하였다.The effective concentration of each disinfectant was confirmed and the minimum range of disinfecting power was confirmed by diluting 25 times with acid disinfectant. However, the disinfecting power of the environment-friendly disinfectant according to the present invention was 10 times diluted, but in the case of basic disinfectant, No disinfecting power appeared. Based on the above results, the disinfection efficacy test was carried out in the disinfection test with 100% of the 25% dilution of the acid disinfectant, 100% of the dilution of the environment-friendly disinfectant, and 100% of the basic disinfectant.
(소독력 분석법 고시 기준)(Based on the Disinfection Analysis Method Notification)
소독제 효력 시험법에 준하여 실험한 결과 기존의 산성소독제의 경우 25배 희석 후 5개 공시균주 모두에서 소독력이 나타남을 확인하였으며(효력시험법 기준 소독력 99.9% 이상), 본 발명에 따른 천연 소독제의 경우도 10배 희석 후 모든 공시균주에 대한 소독력을 입증하였다. 하지만 기존 염기성 소독제의 경우 원액을 이용하였음에도 모든 공시균주에서 소독력을 입증할 만한 기준치에 미달하는 것을 확인 하였다.As a result of the experiment based on the disinfectant efficacy test method, it was confirmed that the disinfecting power of the conventional acid disinfectant was found to be in all of the 5 disinfectant strains after 25 times dilution (the disinfecting power based on the efficacy test method was 99.9% or more) After 10-fold dilution, the disinfection ability of all the isolates was verified. However, in the case of the basic disinfectant, it was confirmed that even the undiluted solution did not meet the standard value which proved the disinfection power of all the declared strains.
농가에서의 악취 및 병원성 질환을 일으키는 유해균들을 분리하여 본 발명에 따른 제품(천연소독제)과 기존 화학소독제의 항균력을 agar well diffusion 방법으로 비교하였다. 동일한 농도에서 모두 비슷한 크기의 생육억제환을 확인하였다(도 3 참조). 따라서 본 발명에 따른 소독제의 농장 적용을 통해 지속적으로 사용함으로써 기존의 산성 및 염기성 소독제에 비해 인체나 동물에 유해성이 전혀 없을 뿐만 아니라, 소독효과도 높아 소독제로서의 탁월한 효과를 기대할 수 있으며, 본 발명에 따른 제품의 접목을 통해 축산 농가의 주요 악취원인인 황화가스를 생성하는 Salmonella 균주에 대해서도 항균력을 나타내어 지속적으로 사용 시 악취 저감효과도 충분히 기대할 수 있을 것으로 판단된다.The antimicrobial activities of the products (natural disinfectants) and the conventional chemical disinfectants according to the present invention were compared by the agar well diffusion method by isolating harmful bacteria which cause odor and pathogenic diseases at farms. Growth inhibition rings of similar size were identified at the same concentrations (see FIG. 3). Therefore, by using the disinfectant according to the present invention continuously on the farm, the disinfecting effect of the disinfecting agent can be expected as well as the harmfulness to the human body and the animal, compared with the existing acidic and basic disinfectants. It is anticipated that the antimicrobial activity against Salmonella strains that produce sulfide gas, which is a main cause of bad odor of livestock farmers, can be expected to reduce the odor when used continuously.
천연 소독제의 항균활성 평가를 위한 소독제 표준균주인 E. coli, Salmonella enteriditis, Vibrio harveyi, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni균주를 대상으로 항균활성 평가를 상기 5종의 균주가 각각 포함된 agar 배지를 제조하여 agar well diffusion 법으로 확인하였다. 확인 결과 천연소독제 10배 희석액 loading 수준 (10, 20, 30㎕)에 따라 clear zone의 생성이 확인되어 상기 5종의 균주에 대한 명확한 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).Disinfectants for evaluation of antimicrobial activity of natural disinfectants E. coli , Salmonella enteriditis , Vibrio harveyi , Clostridium perfringens , Campylobacter The antimicrobial activity of jejuni strains was evaluated by agar well diffusion method using agar medium containing 5 strains. As a result, production of clear zone was confirmed according to the loading level (10, 20, 30 μl) of 10 times dilution of natural disinfectant, and it was confirmed that there was clear antimicrobial activity against the above five strains (see FIG. 4).
친환경 소독제의 농장 소독력 확인실험은 돈사별로 소독제를 달리하여 소독력을 평가하였으며, 소독제로 사용된 친환경 소독제는 유산균 소독력이 확인된 10배 희석액을 사용하였으며, 기존 소독제는 소독제 권장 희석배수로 희석하여 2일간 소독시험을 진행하였다. 소독력 확인실험은 4개월간 진행하였으며, 소독액 분사 전/후의 암모니아 농도 및 낙하균 변화를 각각 조사하였다. 암모니아 농도 측정은 암모니아 가스측정용 검지관 (3La, Gastec korea)을 사용하였으며, 낙하균 분석은 LB agar (#244520, Difco)를 사용하였다.The disinfection power of the environment - friendly disinfectant was evaluated by the different disinfectants for each pesticide. The environment - friendly disinfectant used as the disinfectant was 10 times diluted with the disinfection power of lactic acid bacteria. The existing disinfectant was diluted to the recommended dilution rate and sterilized for 2 days The test was conducted. The disinfection test was carried out for 4 months and the changes of ammonia concentration and drop amount before and after disinfectant spraying were investigated, respectively. Ammonia concentration was measured using a detector tube (3La, Gastec korea) for ammonia gas measurement and LB agar (# 244520, Difco) was used for the analysis of the drop.
소독제로서의 소독력 비교평가 결과 본 발명에 따른 천연소독제가 기존 화학소독제 대비 초기 1일차 암모니아 가스 농도가 높았음에도 불구하고 2일간 소독을 실시한 결과 2일차 암모니아 가스 농도의 감소가 확연하게 나타났으며, 낙하균 조사하에서 소독 전 대비 소독 후의 낙하균 숫자가 현저하게 줄어든 것으로 확인되었다(도 5 및 6 참조).As a result of comparing the disinfecting power as a disinfectant, the disinfection of the natural disinfectant according to the present invention was performed for 2 days despite the high initial ammonia gas concentration compared to the conventional chemical disinfectant, It was confirmed that the number of droppings after disinfection was remarkably reduced before the disinfection (refer to FIGS. 5 and 6).
(2015.4.27~28)Farm in Chungbuk Cheongwon
(28 Apr. 27, 2015)
(2015.5.18~19)Farm in Pocheon, Gyeonggi
(2015.5.18 ~ 19)
((2015.6.15~16))Farm in Jincheon, Chungbuk
(2015.6.15-16)
(2015.7.20~21)Farm in Pocheon, Gyeonggi
(2015.7.20 ~ 21)
(%)Rate of change
(%)
(%)Rate of change
(%)
정리하면, 시중에 유통되는 균주는 많다. 하지만, 소독제로서 탁월한 제품은 존재하지 않았다. 그런데 놀랍게도 본 발명은 위에서 살펴본 바와 같이 화학소독제 대비 그 소독 효과가 대등하거나 혹은 월등하다. 아울러 균주를 이용한 제품의 경우에는 그 저장안정성이나 열안정성 등 제품으로 대량생산하여 유통했을 때 품질의 균일성이 떨어질 우려가 일반적으로 있는데, 본 발명자는 본 발명에 따른 균주가 최적으로 유용물질을 생산해낼 수 있는 발효조건 및 유통·저장 조건까지 실험을 통해 발견해냈다. 때문에 본 발명은 유해성 때문에 사용에 제한이나 머뭇거림이 있었던 화학소독제를 완연히 대체할 수 있는 유일한 제품이 될 것으로 기대된다.In summary, there are many strains distributed on the market. However, there was no excellent product as a disinfectant. Surprisingly, the present invention, as described above, is equivalent to or superior to the disinfecting effect of the chemical disinfectant. In addition, in the case of a product using a strain, there is a general fear that the uniformity of quality may be lowered when the product is mass-produced by a product such as storage stability or thermal stability. The present inventor has found that the strain according to the present invention produces The fermentation conditions and circulation and storage conditions that can be obtained were found through experiments. Therefore, the present invention is expected to be the only product that can completely replace the chemical disinfectant which has limitations or hesitation due to harmful use.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국내)Name of depository: Korea Microorganism Conservation Center (Domestic)
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