KR20170028938A - 자가면역 질환의 치료를 위한 조절 t 세포를 선택적으로 활성화시키는 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-2αβγ 선택적 아고니스트 단백질(IL-2 선택적 아고니스트)과 IgG Fc 단백질 간의 융합 단백질을 제공한다. IL-2 선택적 아고니스트는 수용체의 IL-2αβγ 형태를 선택적으로 활성화시키고 이로써 Treg를 선택적으로 자극함으로써 치료 활성을 제공한다. Fc 모이어티는 IL-2 또는 IL-2SA 단백질의 순환 반감기에 비해 연장된 순환 반감기를 제공한다.

Description

자가면역 질환의 치료를 위한 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 분자{MOLECULES THAT SELECTIVELY ACTIVATE REGULATORY T CELLS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES}

면역계는 자기와 비자기를 구별할 수 있어야 한다. 자기/비자기를 구별하지 못하면, 면역계는 신체의 세포와 조직을 파괴하고 그 결과 자가면역 질환을 유발한다. 조절 T 세포는 면역계의 활성화를 능동적으로 억제하여 병적인 자기 반응성을 예방하고 결과적으로 자가면역 질환을 예방한다. 자가면역 질환의 치료를 위한, 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 약물 및 방법의 개발은 집중적 연구 대상이며, 본 발명의 개발 전까지 대체로 성공적이지 못했다.

조절 T 세포(regulatory T cell; Treg)는 다른 면역 세포의 활성을 억제하는 CD4+CD25+ T 세포의 한 부류이다. Treg는 면역계 항상성에 있어서 중심적이며, 자기 항원에 대한 관용을 유지하고 외래 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 있어서 주된 역할을 한다. 1형 당뇨병(T1D), 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 비롯한 다수의 자가면역 질환 및 염증성 질환이 Treg 세포수 또는 Treg 기능에 결함이 있는 것으로 확인되었다. 그 결과, Treg 세포의 수 및/또는 기능을 부스팅하는 치료법의 개발이 큰 관심의 대상이다.

연구되고 있는 자가면역 질환의 치료 접근법 중 하나는 생체외에서 증식시킨 자가 유래의 Treg 세포를 이식하는 것이다(Tang, Q., et al., 2013, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 3:1-15). 이 접근법은 질환의 동물 모델의 치료와 몇몇 초기 인간 임상 시험에서 밝은 전망을 보였지만, 환자 자신의 T 세포를 이용한 개인 맞춤 치료를 요하고, 침습적이며, 기술적으로 복잡하다. 또 다른 접근법은, 저용량 인터루킨-2(IL-2)을 사용한 치료이다. Treg 세포는 특징적으로, 서브유닛 IL-2RA(CD25), IL-2RB(CD122) 및 IL-2RG(CD132)로 이루어진, 고친화성 IL-2 수용체인 IL-2Rαβγ를 높은 항상적 수준으로 발현하며, Treg 세포 성장은 IL-2에 의존적인 것으로 확인되었다(Malek, T. R., et al., 2010, Immunity, 33:153-65). 만성 GVHD 환자(Koreth, J., et al., 2011, N Engl J Med., 365:2055-66) 및 HCV 관련 자가면역성 혈관염 환자(Saadoum, D., et al., 2011, N Engl J Med., 365:2067-77)의 저용량 IL-2 치료의 임상 시험은 Treg 수준의 증가와 임상적 효능의 징후를 입증하였다. 다수의 다른 자가면역 질환 및 염증성 질환에 있어서의 IL-2의 효능을 연구하는 새로운 임상 시험이 시작되었다.

이들 임상 시험에서 사용되는 IL-2의 재조합 형태인 프로루킨(Proleukin)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Prometheus Laboratories에서 시판됨)은 높은 독성과 관련되어 있다. 프로루킨은 전이성 흑색종 및 전이성 신장암의 치료에 대해 승인을 받았지만, 그 부작용이 너무 심각하여, 집중 치료를 할 수 있는 병원 시설에서만 그 사용이 권고되고 있다(http:/www.proleukin.com/assets/pdf/proleukin.pdf). 보다 최근 Treg 세포가 특성화될 때까지, IL-2는 T 세포 및 다른 면역 세포를 활성화하여 암 세포를 제거하는 면역계 자극인자인 것으로 간주되었다. 자가면역 질환에 있어서의 IL-2의 임상 시험은 Treg 세포를 표적으로 하기 위해 저용량의 IL-2를 이용하였는데, 그 이유는 Treg 세포는 IL-2Rαβγ의 발현으로 인해 다수의 다른 면역 세포 유형보다 더 적은 농도의 IL-2에 반응하기 때문이다(Klatzmann D, 2015, Nat Rev Immunol. 15:283-94). 그러나, 이와 같은 저용량도 안전성 및 내약성 문제를 유발하였고, 이용된 치료법은 장기적 또는 간헐적 5일 치료 과정으로 매일의 피하 주사를 이용하였다. 따라서, Treg 세포 수 및 기능을 강화하고, IL-2보다 Treg 세포를 더 특이적으로 표적화하며, 더 안전하고 더 내약성이 좋고, 더 적은 빈도로 투여되는 자가면역 질환 치료법이 요구되고 있다.

IL-2에 기초한 치료법의 치료 지수를 개선하기 위한 한 가지 접근법은 다른 면역 세포에 비해 Treg 세포에 선택적인 IL-2의 변이체를 이용하는 것이다. IL-2 수용체는 T 세포, NK 세포, 호산구 및 단핵구를 포함한 다종 다양한 면역 세포 유형에서 발현되고, 그 광범위한 발현 패턴은 면역계 및 높은 전신 독성에 대한 다면발현 효과에 기여할 가능성이 있다. IL-2 수용체는 3가지 형태: (1) 신호전달을 하지 않는 저친화성 수용체 IL-2RA; (2) 통상적인 T 세포(Tcon), NK 세포, 호산구 및 단핵구에서 광범위하게 발현되는, IL-2RB 및 IL-2RG로 이루어진 중간 친화성 수용체(IL-2Rαβγ); 및 (3) 활성화된 T 세포에서 일시적으로 발현되고 Treg 세포에서 항상적으로 발현되는, IL-2RA, IL-2RB 및 IL-2RG로 이루어진 고친화성 수용체(IL-2Rαβγ)로 존재한다. IL-2Rβγ에 비해 IL-2Rαβγ에 선택적인 IL-2 변이체가 개발되었다(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18:1197-202; Cassell, D. J., et al., 2002, Curr Pharm Des., 8:2171-83). 이들 변이체는 IL-2RB에 대한 그들의 친화성을 감소시키는 아미노산 치환을 갖는다. IL-2는 IL-2RG에 대해 검출 불가능한 친화성을 갖기 때문에, 그 결과 이들 변이체는 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 대한 친화성 감소 및 IL-2Rβγ 발현 세포를 활성화시키는 능력 감소를 나타내지만, IL-2RA에 결합할 수 있는 능력과 IL-2Rαβγ 수용체 복합체에 결합하고 이를 활성화시키는 능력은 유지한다. 이들 변이체 중 하나인 IL-2/N88R(Bay 50-4798)은, IL-2Rβγ 발현 NK 세포가 독성의 주요 기여인자라는 가설에 기초하여, 면역계 자극인자로서 IL-2의 저독성 버전으로서 임상적으로 테스트되었다. Bay 50-4798은 NK 세포에 비해 활성화된 T 세포의 증식을 선택적으로 자극하는 것으로 확인되었고, 암 환자(Margolin, K., et al., 2007, Clin Cancer Res., 13:3312-9) 및 HIV 환자(Davey, R. T., et al., 2008, J Interferon Cytokine Res., 28:89-100)의 I/II 기 임상 시험에서 평가되었다. 이러한 임상 시험은, Bay 50-4798이 프로루킨보다 훨씬 더 안전하고 내약성이 좋다는 것을 보여주었고, 또한, 환자에서 CD4+ T 세포 및 CD4+CD25+ T 세포의 수준을 증가시켰음을 보여주었다. 그러나, CD4+ T 세포 및 CD4+CD25 + T 세포의 증가가 Treg 세포의 증가를 나타내는 것은 아니었는데, 그 이유는 Treg의 확인에는 CD4 및 CD25 이외에도 추가적인 마커가 필요하고, Treg 세포는 CD4+CD25+ 세포 중 적은 비율이기 때문이다. 이러한 시험들에 이어, 당해 기술분야의 연구는 Treg 세포의 실체를 보다 충분히 확립하였고, Treg 세포가 IL-2Rαβγ를 선택적으로 발현한다는 것을 입증하였다(문헌[Malek, T. R., et al., 2010, Immunity, 33:153-65]에서 재검토됨). 이러한 새로운 연구에 기초할 때, 이제는 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트가 Treg 세포에 대해 선택적이어야 한다는 것을 이해할 수 있다.

IL-2에 기초한 치료법의 치료 지수를 개선하기 위한 제2의 접근법은, Treg 세포를 최대한 자극하기 위해 분자의 약동학적 특성을 최적화하는 것이다. IL-2 작용에 관한 초기의 연구는, 시험관내에서의 인간 T 세포 증식의 IL-2 자극이 유효 농도의 IL-2에 최소 5∼6시간 노출될 것을 요하였음을 입증하였다(Cantrell, D. A., et al., 1984, Science, 224:1312-1316). 인간 환자에게 투여될 때, IL-2는 정맥내 투여에 대해서는 85분, 피하 투여에 대해는 3.3시간의 매우 짧은 혈장 반감기를 갖는다(Kirchncr, G. I., et al., 1998, Br J Clin Pharmacol. 46:5-10). 반감기가 짧기 때문에, 순환 IL-2를, 필요한 지속 시간 동안 T 세포 증식을 자극하는 데 필요한 수준 이상으로 유지하기 위해서는, 피크 IL-2 수준을 Treg 세포에 대한 EC50보다 현저히 높은 수준으로 만드는 고용량이 필요하거나 빈번한 투여가 필요하게 된다(도 1). 이러한 높은 IL-2 피크 수준은 IL-2Rβγ 수용체를 활성화시킬 수 있고 의도하지 않은 다른 작용 또는 부작용을 가질 수 있다. IL-2보다 더 긴 순환 반감기를 갖는 IL-2 유사체는 IL-2보다 더 적은 용량으로, 더 낮은 피크 수준으로, 지정된 기간 동안 목표 약물 농도를 달성할 수 있다. 따라서, 이러한 IL-2 유사체는, Treg 세포를 효과적으로 자극하는 데 IL-2보다 더 적은 용량 또는 더 적은 빈도의 투여를 필요로 한다. 실제로, 순환 반감기가 14시간인 IgG-IL-2 융합 단백질을 투여한 사이노몰구스 원숭이에서 등몰량의 IL-2에 비해 훨씬 더 견실한 Treg 증가가 자극되었다(Bell, et al., 2015, J Autoimmun. 56:66-80). 또한, IL-2 약물의 피하 투여 빈도가 적을수록 환자의 허용성이 더 좋아질 것이다. 이러한 특성들을 갖는 치료제는 임상적으로는 약리학적 효능의 개선, 독성 감소 및 치료에 대한 환자의 순응성 개선으로 해석된다.

치료 단백질의 반감기를 연장하기 위한 접근법 중 하나는, 순환 반감기를 증가시키기 위해 분자의 치료 활성 부분을 다른 단백질, 예컨대 IgG의 Fc 영역에 융합시키는 것이다. 치료 단백질과 IgG Fc의 융합은 단백질의 수력학적 반경을 증가시킴으로써 신장 청소율을 감소시키고, 융합 단백질의 신생아(Neonatal) Fc 수용체(FcRn) 매개 리사이클링을 통해 순환 반감기를 연장시킴으로써 이를 달성한다. 치료 단백질의, 알부민(Sleep, D., et al., 2013, Biochem Biophys Acta., 1830:5526-34) 및 비면역원성 아미노산 중합체 단백질(Schlapschy, M., et al., 2007, Protein Eng Des Sel. 20:273-84; Schellenberger, V., et al., 2009, Nat Biotechnol. 27:1186-90)에의 융합도 순환 반감기를 증가시키는 데 이용되었다. 그러나, IL-2 선택적 아고니스트 융합 파트너의 견실한 생물학적 활성을 확보하기 위한 그러한 융합 단백질의 구성은, 특히, 수용체 서브유닛 중 하나에 대한 결합이 있어서 결함이 있고 수용체를 활성화시키기 위해 3종의 수용체 서브유닛의 복합체를 어셈블링해야 하는 IL-2 선택적 아고니스트의 경우, 예측이 불가능하다(Wang, X., et al., 2005, Science 310:1159-63).

다른 연구자들은 안정성을 촉진하기 위해 야생형 IL-2 또는 C125S 치환을 갖는 IL-2를 이용하여 다양한 IL-2 융합 단백질을 생성하였다. Morrison과 그 동료들(Penichet, M. L., et al., 1997, Hum Antibodies. 8:106-18)은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 목적으로 IL-2의 순환 반감기를 증가시킴과 동시에 IL-2를 특이적 항원에 표적화하기 위해 IgG가 야생형 IL-2에 융합된 융합 단백질을 생성하였다. 이 융합 단백은, 중쇄(H) 및 경쇄(L)로 이루어진 온전한 항체 분자로 구성되었고, 여기서 N-말단의 H쇄 모이어티가 C-말단의 IL-2 단백질 모이어티에 융합되었다. 이 IgG-IL-2 융합 단백질은 Fc 이펙터 기능을 보유하였다. IgG Fc 단백질의 주요 이펙터 기능은 보체 의존적 세포독성(Complement-Dependent Cytotoxicity; CDC) 및 항체 의존적 세포독성((Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC)이다. IgG-IL-2 융합 단백질은 IL-2 바이오어세이에서 큰 활성을 보였고, CDC 활성을 보유하는 것으로 확인되었다. 따라서, Penichet 등은, 항원에 대한 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응을 증강시키기 위한 목적으로, 항체에 의해 인식되는 항원에 IL-2 활성을 표적화하기 위한 항체-IL-2 융합 단백질의 사용을 교시하였다. 유사한 방식으로, Gillies와 그 동료들은, 종양 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 종양 항원과 IL-2 부분을 표적화하기 위한 융합 단백질의 항체 부분을 이용하여, 암 면역치료를 위한 다수의 IgG-IL-2 융합 단백질을 구성하였다(문헌[Sondel, P. M., et al., 2012, Antibodies, 1:149-71]에서 재검토됨). 이러한 교시들은, 전신 노출을 증가시킬 목적으로, 면역억제성 Treg 세포의 성장 및 활성을 촉진하는 IL-2 선택적 아고니스트를 이펙터 기능 결함 Fc 단백질 모이어티에 융합시키는 본 발명의 기술과는 매우 다른 것이다.

Strom과 그 동료들은, 고친화성 IL-2 수용체를 발현하는 활성화 T 세포를 제거하기 위한 목적으로, Fc 단백질의 N-말단에 IL-2가 융합된 융합 단백질을 구성하였다(Zheng, X. X., et al., 1999, J Immunol. 1999, 163:4041-8). 이 융합 단백질은, T1D의 T 세포 이식 마우스 모델에서 자가면역성 당뇨병의 발달을 억제하는 것으로 확인되었다. IL-2-Fc 융합 단백질은, T1D 감수성이 큰 암컷 NOD 마우스 유래의 질병 촉진 T 세포가, 질병 감수성이 더 적은 수컷 NOD 마우스에게 이식되었을 때, 그 기능을 억제하는 것으로 확인되었다. 이들은 또한 IL-2-Fc 융합 단백질이 시험관내에서 고친화성 IL-2 수용체를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 이 연구자들은 추가로, 이펙터 기능 적격성 IgG2b Fc로부터 유도된 Fc로부터 구성된 IL-2-Fc 융합 단백질과 돌연변이된 이펙터 기능 결함 IgG2b Fc로부터 유도된 Fc로부터 구성된 IL-2-Fc 융합 단백질을 비교하였다. 이펙터 기능 적격성 Fc를 포함하는 IL-2-Fc 융합 단백질만이 질병 개시 예방에 있어서 효능을 나타내었다. 따라서, 이 연구자들은, 이펙터 기능을 갖는 IL-2-Fc 융합 단백질이 질병 유발 활성화 T 세포를 제거할 수 있고, Fc 이펙터 기능이 그 치료 활성에 필요하다는 것을 교시한다. 이러한 교시들은, 전신 노출을 증가시키고 Treg 증식을 최적화하기 위한 목적으로, 면역억제성 Treg 세포의 성장 및 활성을 촉진하는 IL-2 선택적 아고니스트를 이펙터 기능 결함 Fc 단백질 모이어티에 융합시키는 본 발명의 기술과는 매우 다르다. Strom과 그 동료들의 다른 연구는 이식 관용을 촉진하는 데 있어서의 IL-2-Fc 융합 단백질의 용도를 교시한다(Zheng, X. X., et al., 2003, Immunity, 19:503-14). 이 연구에서, IL-2-Fc 융합 단백질은 "삼중 치료법"으로 사용되는데, 여기서, 이것은 IL-15-Fc 수용체 안타고니스트 및 라파마이신과 병용된다. 또한, 이 연구자들은, 효능을 나타내기 위해서는 IL-2-Fc 융합 단백질이 Fc 이펙터 기능을 가져야 한다고 교시하고, 추가로, 이 IL-2-Fc 융합 단백질은, 효능을 나타내기 위해서는 2개의 다른 분자와 조합되어야 한다고 교시한다.

본 발명은, Treg 세포에 대한 IL-2 선택적 아고니스트의 높은 세포 선택성과 긴 순환 반감기를 겸비한, 신규한 치료제, 즉 IL-2 선택적 아고니스트 - Fc 융합 단백질을 제공한다. 이 분자를 개발하는 과정에서, 생물활성에 필수적이고, 원하는 치료 특성을 충족하는 몇 종의 신규 단백질의 발견으로 이끈, 단백질의 구조적 요소 및 설계 특징을 밝힌 놀랍고 예상치 못했던 발견이 있었다.

본 발명은, IL-2αβγ 선택적 아고니스트 단백질(IL-2 선택적 아고니스트)과 IgG Fc 단백질 간의 융합 단백질을 제공한다. IL-2 선택적 아고니스트 모이어티는 수용체의 IL-2αβγ 형태를 선택적으로 활성화시키고 이로써 Treg를 선택적으로 자극함으로써 치료 활성을 제공한다. Fc 모이어티는 IL-2 또는 IL-2 선택적 아고니스트 단백질의 순환 반감기에 비해 긴 순환 반감기를 제공한다. Fc 모이어티는, 융합 단백질의 분자 크기를, 신장에 의한 거대분자의 사구체 여과의 대략적인 컷오프인 60,000 달톤 초과로 증가시키고, IgG에 결합하여 리사이클링시킴으로써 그 순환 반감기를 연장시키는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 단백질을 통한 리사이클링에 의해, 순환 반감기를 증가시킨다. Fc 모이어티는 또한 Fc 이펙터 기능, 예컨대 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포독성(ADCC)에 결함이 있어서, 융합 단백질이 Treg를 선택적으로 활성화시켜 Treg 기능을 증강시키고 Treg 수를 증폭시키도록 할 수 있다. 상기 두 단백질 모이어티는, IL-2 선택적 아고니스트 모이어티의 견실한 생물활성을 유지하고 Fc 모이어티가 순환 반감기 연장을 촉진함으로써 Treg 기능과 수를 효율적으로 증강시킬 수 있도록 융합시킨다. Treg의 이러한 증강은, 지나치게 왕성한 자가면역 및 염증 반응을 억제하여, 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 유익할 것이다. 본 발명의 단백질은 단량체여도 좋고 Fc 모이어티 또는 도메인의 시스테인 잔기를 통해 이량체를 형성한 이량체여도 좋다.

더 구체적으로, 본 발명은, N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티 및 C-말단의 IgG Fc 단백질 모이어티를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 IL-2 융합 단백질은 고친화성 IL-2 수용체를 선택적으로 활성화시키고, 이로써 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 것인 융합 단백질을 제공한다. IL-2의 변이체는 인간 Il-2 단백질(서열 번호 1)에 대해 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 갖는 변이체를 포함한다. 또한, 상기 IL-2 변이체 단백질은 경우에 따라, 치환 C125S를 갖는 인간 IL-2를 포함한다. 본 발명의 단백질들은 융합되며, 이 때 IL-2 변이체 단백질과 IgG Fc 단백질은 둘 다 N-말단 및 C-말단을 가지며, 상기 인간 IL-2 변이체 단백질은 그 C-말단에서, IgG Fc 단백질의 N-말단에 융합되는 것이 바람직하다. 추가로, IL-2 변이체 도메인과 Fc 도메인이 IL-2 변이체 단백질과 IgG Fc 단백질 사이에 위치하는 링커 펩티드를 통해 연결되거나 융합되는 것이 바람직하다. IgG Fc 단백질 모이어티 또는 도메인은 Fc 이펙터 기능에 결함이 있거나, 융합 단백질의 Fc 부분의 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일례는 인간 IL-2(서열 번호 1)에 대해 아미노산 치환 N88R 및 C125S를 갖는 IL-2 변이체 단백질, 서열 번호 15에 기재된 링커 펩티드, 및 서열 번호 2에 기재된 인간 IgG1 Fc 단백질을 포함하는 단백질로서, 상기 융합 단백질은 고친화성 IL-2 수용체를 선택적으로 활성화시키고, 이로써 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 능력을 갖는 것인 단백질이다. 본 발명의 대안적인 단백질은 인간 IL-2(서열 번호 1)에 대해 아미노산 치환 N88R 및 C125S를 갖는 IL-2 변이체 단백질, 서열 번호 15에 기재된 링커 펩티드, 및 서열 번호 3에 기재된 인간 IgG2 Fc 단백질을 포함한다.

본 발명의 더 구체적인 실시형태는, 2개의 동일한 사슬을 포함하는 이량체 단백질로서, 각각의 사슬은 N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티 및 C-말단의 IgG Fc 단백질 모이어티를 포함하며, 상기 N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티는, N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 중 하나 이상에 의해 서열 번호 1에 기재된 인간 IL-2 야생형과 다르며, 서열 번호 1에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 가지고, Treg 세포 상의 IL-2Rαβγ에 결함으로써 Treg 세포를 활성화시키는 능력을 가지며, N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질은 그 C-말단에서, 6∼20개 아미노산 잔기로 된 아미노산 링커의 N-말단에 연결되고, 상기 링커는 또한 C-말단을 가지며, 상기 아미노산 링커의 C-말단은, 예를 들어 서열 번호 3(IgG2) 또는 서열 번호 2(IgGN297A)에 대해 97%의 서열 동일성을 가지고 시스테인 잔기를 포함하는 IgG Fc 단백질 모이어티의 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 사슬은 상기 IgG Fc 단백질 모이어티의 사슬간 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 통해 서로 연결되는 것인 이량체 단백질이다. 본 발명의 이량체는 IL-2 모이어티의 C125S에서 추가로 치환될 수 있다. 본 발명의 단백질은 바람직하게는 글리신 잔기, 세린 잔기, 및 글리신 잔기와 세린 잔기의 혼합물의 군으로부터 선택되는 아미노산 링커를 포함한다. 링커는 12∼17개의 세린 잔기와 글리신 잔기의 혼합물을, 바람직하게는 3:1∼5:1의 범위, 예를 들어, 4:1의 글리신 잔기와 세린 잔기의 비로 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로 상기 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은, 숙주 세포 게놈과 재조합되도록 설계되거나 독립적으로 복제하는 플라스미드 또는 염색체외 핵산에 도입될 수 있는 발현 카세트에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명은 추가로, 필요로 하는 환자에서 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 기재된 조성물을 포함하는 약학 조성물을, 인간 조절 T 세포 농도가 원하는 수준에 도달할 때까지 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 인간 혈액 세포를 1 nM∼0.01 nM 농도의 청구항 제1항의 융합 단백질과 접촉시키고, 그 후 상기 단백질에 결합하는 세포를 유세포 분석으로 검출함으로써, 인간 혈액 샘플 중의 Treg 세포의 수를 측정하는 방법을 제공한다.

도 1은, IL-2 또는 증가된 반감기를 갖는 IL-2-Fc 융합 단백질의 단회 투여 후의 순환 반감기, 피크 약물 수준, 생물학적 유효 농도, 및 Treg 세포 증식을 자극하는 데 필요한 지속 시간 사이의 관계를 보여주는 모식도이다. 점선은, 피하 주사 후의, IL-2의 시간 경과에 따른 혈액 수치를 나타내고, 실선은 IL-2-Fc 융합 단백질의 시간 경과에 따른 혈액 수치를 나타낸다. 수평 점선은 각각 IL-2Rαβγ 및 IL-2Rβγ를 발현하는 세포를 활성화시키는 데 필요한 농도(EC50 값)를 나타낸다. 양방향 화살표는 세포 증식을 자극하는 데 필요한 EC50에서의 IL-2에 대한 노출 지속 시간(5∼6 hr)을 나타낸다.
도 2는, Fc 융합 단백질의 설계 입체배치를 도시한다. 융합 파트너(X)는, Fc 단백질의 N-말단(X-Fc) 또는 C-말단(Fc-X)에서 융합될 수 있다. 링커 펩티드는 X와 Fc 사이에 삽입될 수 있다.
도 3은, 유세포 분석에 의해 측정된, CD4+ T 세포에서의 IL-2 및 N88RL9AG1 자극 STAT5 인산화의 용량 반응을 보여준다. 실시예 3에서 기재한 바와 같이, 세포를 위쪽에 표시된 농도의 IL-2 또는 N88RFc로 37℃에서 10분 동안 처리하고, 고정시키고, 투과화하고, 항체로 염색한 후, 유세포 분석을 실시하였다. CD4+로서 게이팅된 세포가 도시되며, CD25 및 pSTATS에 대하여 추가로 게이팅된 세포가 사분면 각각에 도시된다. 각각의 사분면에서의 수는 각각의 게이트 내의 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 위쪽 사분면의 세포는 Treg 세포가 많은 집단인 CD25 발현 세포의 상위 1∼2%를 나타내고, 오른쪽 사분면의 세포는 pSTAT5+이다. (3a). N88RL9AG1은 높은 선택성으로 CD25^high 세포만을 자극하는 한편, IL-2는 CD25^-/low 세포와 CD25^high 세포 둘 다를 피코몰 농도에 이르기까지 크게 자극한다. (3b). D20HL0G2는 pSTAT5 자극 활성이 없다. 2회의 독립된 실험에서 pSTAT5 활성화가 관찰되지 않았다. (3c). 대조군은, CD25^high 세포에서 D20H/IL-2가 pSTATS를 자극하지만, D20HL0G2는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 플롯은 의색 모드로 디스플레이된다. 두 단백질 모두 10^-8 M 농도로 테스트되었다.
도 4는, N88RL9AG1로 처리된 CD4+ T 세포가 FOXP3을 고발현하는 세포에서 pSTAT5 수준을 자극하였음을 도시한다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 세포를 4 x 10^-9 M의 IL-2 또는 N88RL9AG1로 처리한 후 분석하였다. N88RL9AG1로 처리된 pSTAT5+ 세포의 대부분은 역시 FOXP3+인 반면, IL-2로 처리된 pSTAT5+ 세포는 FOXP3-과 FOXP3+ 둘 다였으며, 다수는 FOXP3-였다.
도 5는, HEK293 세포에서 생성된 상이한 Fc 융합 구성체의 단백질 수율을 도시한다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 단백질들을 최적화된 일시적 발현 시스템에서 동시에 발현시키고 정제하였다. 결과는 30 ml 배양물로부터의 정제된 단백질의 최종 수율로서 표현된다. (5a). N88R/IL-2-Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 펩티드 링커 길이가 증가함에 따라 증가한다. (5b). wt IL-2-Fc 융합 단백질의 수율은 15개 잔기의 펩티드 링커에 의해서만 약간 증강된다. Fc-X 입체배치보다 X-Fc 입체배치에서 D20H/IL-2-Fc 융합 단백질의 수율이 더 높았다.
도 6은, N88R/IL-2-FC 융합 단백질의 펩티드 링커 길이에 대한 IL-2 생물활성의 의존성을 도시한다. (6a) CD25^high CD4+ T 세포(Treg)에서의 pSTAT5 신호는 펩티드 링커 길이가 증가함에 따라 증가한다. (6b) CD25^-/low 세포에서는 N88R/IL-2-Fc 단백질 어느 것에 의해서도 유의적인 pSTAT5 신호가 관찰되지 않았다. 10^-8 M의 IL-2 내부 대조군의 pSTAT5 신호는 양쪽 패널에 흑색 삼각형으로 표시된다.
도 7은, 인간 Treg에서의 D20H/IL-2-Fc 융합 단백질의 생물활성을 나타낸다. D20HL15AG1의 효능은 N88RL15AG1의 효능보다 실질적으로 적고, D20HL15AG1(X-Fc 입체배치)와 AG1L15D20H(Fc-X 입체배치)는 유사한 효능을 갖는다. 3종의 단백질 모두 15개 잔기의 펩티드 링커를 갖는다.
도 8은, 15개 잔기의 펩티드 링커를 갖거나 갖지 않을 때의 wt IL-2-Fc pSTAT5 활성의 생물활성을 보여준다. IL-2 생물활성은 Treg(8a) 및 CD25^-/low 세포(8b) 둘 다에서 단지 약간 증강된다.
도 9는, 인간 PBMC의 7종의 상이한 면역 세포 유형에 대한 IL-2 및 IL-2 선택적 아고니스트 단백질의 선택성을 도시한다. N88RL15AG1은 wt IL-2 및 WTL 15AG1에 비해 Treg에 높은 선택성을 보이며, N88R/IL-2보다 다수의 세포 유형에서 더 큰 선택성을 나타낸다.

도입

본 발명은 3종의 주요 단백질 구성요소: (1) Treg 세포에 대해 매우 선택적이 되도록 변형시킨 조작된 IL-2 사이토카인, (2) 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 이펙터 기능 결함 Fc 단백질, 및 (3) 융합 단백질의 높은 생물학적 활성에 필요한 2개의 모이어티 사이의 링커 펩티드를 포함하는 신규한 치료용 융합 단백질이다. 본 발명을 구성하는 융합 단백질은, IL-2 융합 단백질의 선행 기술에서의 가르침에 반하는 초기의 예상치 못했던 발견을 통해 찾아냈고, 이들 분자에 이르게 한 연구는 생물학적 활성과 치료 활성에 중요한 핵심적인 구조-활성 관계를 정의하였다. 본 발명에 의해 정의되는 분자는, 자가면역 및 염증성 병리를 억제하는 T 세포의 작은 아집단의 생성을 자극하는 신규한 메커니즘에 의해 자가면역 질환의 안전하고 효과적인 치료를 가능하게 할 것이다. 이러한 패러다임을 파괴하는 치료법은 다종 다양한 자가면역 질환을 잠재적으로 치료할 수 있다.

정의

본원에서 사용될 때 "서열 번호 1에 대한 ∼퍼센트(%)(예를 들어, 97%) 이상의 서열 동일성"이란 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열이 동일한 정도를 의미한다. 평가 윈도우, 예를 들어, 관심있는 서열의 길이에 대한, 관심있는 서열과 제2의 서열 간의 퍼센트 동일성은, 서열들을 정렬하고, 평가 윈도우 내에서 동일한 잔기에 반하는 잔기(뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 확인하여 동일성을 최대화하기 위한 갭을 도입하고, 윈도우 내에 속하는 관심있는 서열 또는 제2 서열(둘 중 더 긴 것)을 총 잔기수로 나누고, 100을 곱함으로써 산정할 수 있다. 특정 퍼센트 동일성을 얻는 데 필요한 동일한 잔기의 수를 산정할 때, 분수는 가장 가까운 정수로 반올림해야 한다. 퍼센트 동일성은 다양한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, BLAST2, BLASTN, BLASTP, 갭트(Gapped) BLAST 등의 컴퓨터 프로그램은 관심있는 서열들을 정렬하여 그들 간의 퍼센트 동일성을 제공한다. 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:5873-5877, 1993]에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:22264-2268, 1990)이 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)으로 도입된다. 비교 목적으로 갭트 정렬을 얻기 위해서는, Altschul 등의 문헌[Altschul, et al., Necleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 갭트 BLAST를 이용한다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다. PAM250 또는 BLOSUM62 행렬이 이용될 수 있다. BLAST 분석의 수행을 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이들 프로그램에 대해, URL 월드 와이드 웹 주소가 "ncbi.nlm.nih.gov"인 웹 사이트를 참고할 수 있다. 특정 실시형태에서, 퍼센트 동일성은 NCBI가 제공하는 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST2를 이용하여 계산한다.

"N-말단"은 카복실산 기를 갖는 카복시 말단에 대조적으로 아미노 기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드의 말단을 말한다.

"C-말단"은 아미노 기를 갖는 아미노 말단에 대조적으로 카복실산 기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드의 말단을 말한다.

"C-말단의 IgG Fc 단백질 모이어티"는 2개의 동일한 단백질 단편으로부터 유도된 융합 단백질의 일부를 말하며, 상기 단백질 단편은 각각은 IgG 분자의 2개의 중쇄의 힌지 영역, 제2 불변 도메인 및 제3 불변 도메인을 가지고, 힌지 영역을 통해 서로 결합되는 카복시 말단의 중쇄 디설파이드로 이루어진다. 이것은 보체 단백질 Clq 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)와 상호작용하여 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포독성(ADCC) 이펙터 기능을 매개하는 IgG 분자의 일부로서 기능적으로 정의된다. 서열은 이펙터 기능을 감소시키고 순환 반감기를 증가시키고 글리코실화 부위가 제거되도록 변형될 수 있다.

IL-2 변이체

본 발명의 IL-2 변이체 단백질은 IL-2αβγ 선택적 아고니스트이다. 기능적으로 이들은 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 비해 IL-2αβγ 수용체 복합체를 선택적으로 활성화시킨다. 이것은 서열 번호 1의 야생형 IL-2에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것으로 구조적으로 정의되고 Treg 세포를 우선적으로 활성화시키는 능력에 의해 기능적으로 정의되며, 야생형 IL-2 단백질로부터 유도된다. 이 단백질은 또한, CD4+CD25-/low T 세포 또는 NK 세포에 대비한 Treg 세포에서의 인산화된 STAT5 단백질 수준에 의해, 또는 NK 세포에 대비한 파이토헤마글루티닌 자극 T 세포의 선택적 활성화에 의해 측정되는 바와 같이, Treg에서의 IL-2 수용체 신호전달을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.

"N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티"는 상기에 구조적 및 기능적으로 정의된 야생형 IL-2 단백질로부터 유도된 융합 단백질의 N-말단 도메인을 의미한다.

"C-말단"은 아미노기를 갖는 아미노 말단에 대조적으로 카복실산 기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드의 말단을 의미한다.

Treg

"Treg" 또는 "Treg 세포"는 조절 T 세포를 말한다. 조절 T 세포는 다른 면역 세포의 활성을 억제하는 T 세포의 한 부류이며, 세포 마커 표현형 CD4+CD25+FOXP3+에 의해 유세포 분석을 이용하여 정의된다. FOXP3은 세포내 단백질이고 염색을 위해서는 세포 고정 및 투과화를 필요로 하기 때문에, 살아있는 Treg를 규정하기 위해 세포 표면 표현형 CD4+CD25+CD127-이 이용될 수 있다. Treg는 또한 다양한 Treg 아류, 예컨대 tTreg(흉선 유래) 및 pTreg(말초 유래이고 말초의 나이브 T 세포로부터 분화됨)를 포함한다. 모든 Treg가 IL-2Rαβγ 수용체를 발현하고, 그 자신의 IL-2는 생산하지 않으며, 성장을 위해 IL-2에 의존적이고, 일부 당업자는 두 부류가 모두 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트에 의해 선택적으로 활성화된다는 것을 알 것이다.

펩티드 링커

"펩티드 링커"는, 링커 펩티드 서열이 어느 한쪽 파트너 단백질로부터 유래되지 않도록, 융합 단백질을 포함하는 2개의 단백질 사이에 위치하는 아미노산 서열로서 정의된다. 펩티드 링커는 성분 단백질 모이어티의 적절한 단백질 폴딩과 안정성을 촉진하여 단백질 발현을 개선하거나 두 융합 파트너의 생물활성을 더 좋게 할 수 있도록 하기 위해 스페이서로서 융합 단백질에 도입된다(Chen, et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-69). 펩티드 링커는 비구조화된 가요성 펩티드 또는 강성의 구조화된 펩티드의 카테고리로 나뉘어질 수 있다.

Fc 융합 단백질

"Fc 융합 단백질"은 포유동물 IgG 단백질의 Fc 도메인의 번역 리딩 프레임을 다른 단백질("Fc 융합 파트너")에 융합시켜 새로운 단일 재조합 폴리펩티드를 생성하는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 단백질이다. Fc 융합 단백질은 일반적으로, 힌지 영역에 위치하는 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되는 디설파이드 연결 이량체로서 생성된다.

기능적 활성화

"생물활성"은 세포 기반의 정량적 시험관내 어세이로 생물학적 활성을 측정하는 것을 말한다.

"Treg 세포의 기능적 활성화"는 Treg에서의 IL-2 매개 반응으로 정의된다. Treg 세포의 기능적 활성화를 위한 어세이 판독은 pSTAT5의 자극, Treg 세포 증식 및 Treg 이펙터 단백질 수준의 자극을 포함한다.

설계 및 구성

Fc 융합 단백질의 설계와 구성을 위한 다양한 옵션이 존재하고, 이들 설계 옵션 중, 원하는 생물학적 활성 및 약학적 특성을 갖는 분자를 생성할 수 있는 선택을 이하에 제시한다. 주요 설계 옵션은 다음과 같다: (1) IL-2 선택적 아고니스트의 성질, (2) Fc 단백질 모이어티의 선택, (3) 융합 단백질에서의 융합 단백질의 입체배치(configuration) 및 (4) Fc 단백질과 융합 파트너 단백질 사이의 접합부에 있는 아미노산 서열.

일반적 방법

일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 제조는, 본원에 개시된 절차에 의해, 그리고, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 준비, 제한 효소를 이용한 DNA의 절단, 올리고뉴클레오티드의 제조, DNA의 결찰, mRNA의 단리, 적절한 세포로의 DNA의 도입, 숙주의 형질전환 또는 형질감염, 숙주의 배양을 포함하는, 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 융합 분자는 카오트로픽제와 잘 알려진 전기영동법, 원심분리법 및 크로마토그래피법을 이용하여 단리하고 정제할 수 있다. 이러한 방법에 관한 개시에 대해서는, 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 유전자는, 원하는 융합체를 코딩하는 DNA를 생성하는 데 이용되는 기본 단계로서 제한 효소 분해 및 결찰을 이용한다. DNA 단편의 말단은 결찰 전에 변형을 요할 수 있고, 변형은 돌출부를 채우거나, 단편(들)의 말단부를 뉴클레아제(예를 들어, ExoIII)로 결실시키거나, 부위 특이적 돌연변이를 유발하거나, PCR로 새로운 염기쌍을 부가함으로써 행할 수 있다. 선택된 단편들의 연결을 용이하게 하기 위해 폴리링커 및 어댑터가 이용될 수 있다. 발현 구성체는 일반적으로 제한, 결찰, 및 이. 콜라이(E. coli)의 형질전환의 라운드를 이용하여 단계적으로 어셈블링한다. 발현 구성체를 구성하는 데 적합한 다수의 클로닝 벡터가 당업계에 공지되어 있고(lambda.ZAP 및 pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, LaJolla, Calif, pET, Novagen Inc., Madison, Wis.-cited in Ausubel et al., 1999), 구체적인 선택은 본 발명에 있어서 중요하지 않다. 클로닝 벡터의 선택은 숙주 세포로 발현 구성체를 도입하기 위해 선택되는 유전자 전달 시스템에 의해 영향을 받는다. 각 단계 종료 시, 생성된 구성체를 제한, DNA 서열, 하이브리드화 및 PCR 분석으로 분석할 수 있다.

부위 특이적 돌연변이 유발은 통상적으로, 당업계에 공지된 방법으로 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 유전자로 특이적 돌연변이를 도입하는 데 이용된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19:773-776]; 문헌[Kren et al., 1998, Nat. Med. 4:285-290]; 및 문헌[Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43:15-16]를 참조할 수 있다. 임의의 부위 특이적 돌연변이 유발 절차가 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명의 변이체를 제조하는 데 이용될 수 있는, 입수 가능한 상업용 키트가 다수 존재한다.

다양한 프로모터(전사 개시 조절 영역)가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 적절한 프로모터의 선택은 제안된 발현 숙주에 따라 달라진다. 이종 공급원으로부터의 프로모터는 선택된 숙주에서 기능을 나타내는 한 이용될 수 있다.

본원에 기재된 단백질의 발현을 촉진하기 위해 다양한 신호 서열이 이용될 수 있다. 신호 서열은 효율적인 분비를 위해 선택되거나 설계되며, 발현 숙주에서의 프로세싱도 이용될 수 있다. TCR 코딩 서열 또는 마우스 IL-2 코딩 서열에 상동성인 신호 서열이 포유동물 세포에 이용될 수 있다. 다른 적절한 신호 서열/숙주 세포 쌍으로는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에서의 분비를 위한 바실러스 서브틸리스 sacB 신호 서열 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) α-접합 인자 또는 피키아 파스토리스(P. pastoris) 분비를 위한 피키아 파스토리스 산 phoI 포스파타제 신호 서열을 들 수 있다. 신호 서열은 신호 펩티다제 절단 부위를 코딩하는 서열을 통해 단백질 코딩 서열에 직접, 또는 짧은 뉴클레오티드 브릿지를 통해 연결될 수 있다.

진핵생물 단백질 발현 시스템에 대해 전사 및 번역을 증강시키기 위한 요소들이 동정되었다. 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV) 프로모터 1,000 bp를 이종성 프로모터의 어느 한 측에 위치시키면, 식물 세포에서 전사 수준이 10∼400배 증가할 수 있다. 발현 구성체는 또한 적절한 번역 개시 서열을 포함해야 한다. 적절한 번역 개시를 위해 코작(Kozak) 컨센서스 서열을 포함하도록 발현 구성체를 변형시키는 것은 번역 수준을 10배 증가시킬 수 있다.

발현 카세트는 이용되는 숙주와 양립할 수 있는 적절한 벡터에 연결한다. 벡터는 발현시키고자 하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 받아들일 수 있어야 한다. 적절한 숙주 세포로는 진핵생물 및 원핵생물 세포, 바람직하게는 쉽게 형질전환되어 배양 배지에서 빠른 성장을 나타낼 수 있는 세포를 포함한다. 구체적으로, 바람직한 숙주 세포로는 원핵생물, 예컨대 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스 등과, 진핵생물, 예컨대 동물 세포 및 효모 균주, 예를 들어 에스. 세레비지에를 들 수 있다. 포유동물 세포, 특히 HEK, J558, NSO, SP2-O 또는 CHO가 일반적으로 바람직하다. 다른 적절한 숙주로는, 예를 들어, Sf9와 같은 곤충 세포를 들 수 있다. 종래의 배양 조건이 이용된다. 이와 관련하여 상기 Sambrook의 문헌을 참조할 수 있다. 그 후, 안정한 형질전환 또는 형질감염 세포주를 선택할 수 있다. 시험관 내 전사-번역 시스템도 발현 시스템으로서 이용될 수 있다.

원하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 세포의 형질감염을 위한 표준 기법으로 숙주 세포로 도입할 수 있다. 용어 "형질감염시키는" 또는 "형질감염"은, 인산칼슘 공침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 바이러스 형질도입 및/또는 인테그레이션을 비롯한, 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위한 통상적인 모든 기법을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포의 적절한 형질감염법은 상기 Sambrook 등의 문헌과 다른 실험실 교본에서 찾아볼 수 있다.

대안으로, 본원에 기재된 단백질 구성의 전부 또는 일부를 위해 합성 유전자 구성을 이용할 수 있다. 이것은, 관심있는 폴리펩티드 분자를 코딩하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 Tian 등의 문헌[Tian, et al., Nature 432:1050-1054]에 기재된 멀티플렉스 마이크로칩 기반의 기법 및 올리고뉴클레오티드를 합성하여 광 프로그래밍 가능한 마이크로유체 칩 상에 어셈블링하는 유사한 기법 등의 다수의 기법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 회수된 숙주 세포로부터 단리하거나 배양 배지로부터 단리한다. 배지로부터 또는 회수된 세포로부터 관심있는 단백질을 단리하기 위해 표준 단백질 정제 기법이 이용된다. 특히, 롤러 병, 스피너 플라스크, 조직 배양 플레이트, 바이오리액터, 또는 퍼멘터를 비롯한 다양한 방법으로부터 대규모로(즉, 밀리그램 이상의 양으로) 원하는 융합 단백질을 발현시키고 정제하기 위해 정제 기법을 이용할 수 있다.

IL-2 선택적 아고니스트 모이어티

치환 N88R을 갖는 IL-2는 IL-2Rαβγ 수용체에 대한 IL-2 선택적 아고니스트의 예시적인 사례이다(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18: 1197-202). IL-2/N88R은, IL-2Rβ 수용체 서브유닛 및 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 대한 결합에 결함이 있지만, IL-2Rαβγ 수용체 복합체에 결합하여 IL-2Rαβγ 발현 PHA 활성화 T 세포의 증식을 wt IL-2만큼 효과적으로 자극할 수 있는 한편, IL-2RPβγ 발현 NK 세포의 증식을 자극할 수 있는 능력은 3,000배 감소되어 있다. 유사한 활성 프로파일을 갖는 다른 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트는 치환 N88I, N88G 및 D20H를 갖는 IL-2를 포함하며, 치환 Q126L 및 Q126F(IL-2RG 서브유닛과의 접촉 잔기)를 갖는 다른 IL-2 변이체 또한 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트 활성을 보유한다(Cassell, D. J., et al., 2002, Curr Pharm Des., 8:2171-83). 당업자라면, Fc 융합 단백질이 유사한 활성을 가질 것이라고 예측하면서, 이들 IL-2 선택적 아고니스트 분자 중 어느 것으로 IL-2/N88R 모이어티를 치환할 수 있음을 알 것이다. 상기에 언급한 모든 돌연변이가, wt IL-2의 백그라운드, 또는 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 제거함으로써 IL-2 안정성을 촉진하는 치환인 치환 C125S를 갖는 wt IL-2에 이루어질 수 있다. 본 발명은 또한 IL-2 수용체의 활성화 작용을 유의적으로 손상시키지 않으면서 생산성 또는 안정성을 개선하는 다른 돌연변이 또는 절두(truncation)와 함께 이용될 수 있다.

본 발명의 변이체는 경우에 따라, 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용되는 보존적 치환 변이체를 포함한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적 변형 변이체란, 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 얻을 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 유전자 코드의 퇴화로 인해, 기능적으로 동일한 수많은 핵산이 임의의 특정 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 그 코돈은, 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서, 기재된 해당 코돈 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 한 종류인 침묵 변이이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 모든 핵산 서열은 또한 그 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 기재한다. 당업자라면, 핵산 내의 각각의 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와 일반적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외함)을 기능적으로 동일한 분자가 생성되도록 변형시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 명시된 서열 내에 내포되어 있다.

아미노산 서열의 보존적 치환과 관련하여, 당업자는, 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경하거나 부가하거나 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가 보존적으로 변형된 변이체이고, 상기 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킨다는 것을 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환의 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자에 부가된 것으로, 이들을 배제하지는 않는다.

하기 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 세린(S), 트레오닌(T);

3) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

4) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

5) 시스테인(C), 메티오닌(M);

6) 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H);

7) 이소루신(I), 루신(L), 발린(V); 및

8) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W).

FC 단백질 모이어티

주요 설계 선택은 Fc 단백질 모이어티의 성질이다. Fc 융합 단백질의 주요 치료 용도는 (1) 융합 파트너 단백질에 면역글로불린 Fc 이펙터 기능을 부여하는 것; 또는 (2) 융합 파트너 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 것이다(Czajkowsky, et al., 2012, EMBO Mol Med. 4:1015-28). IgG 단백질의 주요 이펙터 기능은, 각각 보체 단백질 Clq 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대한 Fc 결합에 의해 매개되는 기능인, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포독성(ADCC)이다. 이러한 이펙터 기능은 치료 단백질이 특정 항원 표적 또는 세포에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 데 사용될 때 중요하다. 본 발명의 융합 단백질은 단지 IL-2 선택적 아고니스트 모이어티의 순환 반감기를 증가시키도록 설계되며, 이펙터 기능은 필요하지 않고, 심지어 독성이어도 되므로, 명백히 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 이펙터 기능 적격성 Fc를 갖는 IL-2 선택적 아고니스트-Fc 융합 단백질은, 자가면역 질환에 대한 치료 목표와 정반대로, 본 발명의 융합 단백질은이 활성화 및 증식시키고자 하는 Treg 세포를 잠재적으로 사멸시킬 가능성이 있다. 이펙터 기능(CDC, ADCC), 순환 반감기 및 안정성이 서로 다른 4종의 인간 IgG 서브클래스가 존재한다(Salfeld, J. G., 2007, Nature Biotechnology 25:1369-72). IgG1은 Fc 이펙터 기능을 보유하며, 가장 많이 존재하는 IgG 서브클래스로서, 미국 FDA 승인을 받은 치료 단백질 중 가장 널리 사용되는 서브클래스이다. IgG2는 Fc 이펙터 기능에 결함이 있지만, 다른 IgG2 분자와 이량체화되기 쉽고, 또한 힌지 영역의 디설파이드 결합의 스크램블링으로 인해 불안정하게 되기 쉽다. IgG3은 Fc 이펙터 기능을 보유하며, 매우 길고 강성인 힌지 영역을 갖는다. IgG4는 Fc 이펙터 기능에 결함이 있고, 다른 서브클래스보다 순환 반감기가 짧으며, IgG4 이량체는 힌지 영역에 단 하나의 디설파이드 결합이 존재함으로써 인해 생화학적으로 불안정하여, 서로 다른 IgG4 분자 간의 H 사슬의 교환을 초래한다. 당업자는 IgG2 및 IgG4로부터의 Fc 단백질 모이어티가 이펙터 기능을 갖고 있지 않으며 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 당업자라면 또한 IgG2 Fc의 힌지 영역이 응집을 방지하도록 변형될 수 있거나 IgG4 Fc의 힌지 영역이 이량체를 안정화시키도록 변형될 수 있는 것과 같이 Fc 서열 변형이 당업계에 개시되어 있다는 것을 알 것이다. 대안으로, IgG1의 이펙터 기능 결함 변이체를 생성하였다. 그러한 변이체 중 하나는 N-결합 글리코실화 부위의 위치인 위치 N297에 아미노산 치환을 갖는다. 이러한 아스파라긴 잔기의 치환은 글리코실화 부위를 제거하며 ADCC 및 CDC 활성을 현저히 감소시킨다(Tao, M. II., et al., 1989, J Immunol. 143: 2595-2601). 이 변이체가 본 발명에서 예시적인 사례로서 사용된다. 또 다른 이펙터 기능 결함 IgG1 변이체는 IgG1(L234F/L235E/P331S)(Oganesyan, et al., 2008, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64:700-4)이며, 이것은 Clq 및 FcγR 결합 부위에 있는 아미노산을 돌연변이시키며, 당업자라면 이펙터에 결함이 있고 안정한 IL-2SA-Fc 융합 단백질을 생성하기 위해 이들 또는 유사한 Fc 변이체를 이용하는 것을 고려할 것이다. 당업자라면 또한 이량체보다 안정한 단량체가 되도록 조작된 Fc 단백질 모이어티의 형태(Dumont, J. A., et al., 2006, BioDrugs 20:151-60; Liu Z, et al., J Biol Chem. 2015 20; 290:7535-62)가 또한 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트와 병용될 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 당업자라면, Fc H쇄 폴리펩티드와 조합된 IL-2-Fc H쇄 폴리펩티드로 이루어지고 이중 특이적 항체 기술을 이용하여 어셈블링된 기능적으로 단량체인 헤테로이량체(Zhu Z, et al., 1997 Protein Sci. 6:781-8)가 또한 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트와 병용될 수 있다는 것을 알 것이다. 몇몇 IL-2 Fc 융합 단백질은, IgG 모이어티에 항원 특이성을 갖거나(Penichet, M. L., et al., 1997, Hum Antibodies. 8:106-18) 갖지 않는(Bell, et al., 2015, J Autoimmun. 56:66-80) 온전한 IgG 항체 분자로 제조되었다. 뿐만 아니라, 당업자라면, 힌지 영역의 일부 또는 전부가 결여된 Fc 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.

Fc 융합 단백질은, 여기서 X-Fc 및 Fc-X로 나타내는 2 가지의 입체배치로 제조될 수 있으며, X-Fc에서, 융합 파트너 단백질인 X는 N-말단에 있고 Fc는 C-말단에 있으며, Fc-X에서, Fc는 N-말단에 있고, 융합 파트너 단백질은 C-말단에 있다(도 2). 문헌에는, 상이한 융합 파트너는 N-말단 또는 C-말단 Fc 융합체에 대해 상이한 선호도를 가질 수 있다는 것을 보여주는 예가 있다. 예를 들어, FGF21은 Fc-X 입체배치에 대해 강한 선호도를 나타내었다. Fc-FGF21은 FGF21 자체와 실질적으로 동일한 수용체 활성화 생물활성을 갖는 한편, FGF21-Fc는 1,000배 감소된 생물활성을 갖는다(Hecht, et al., 2012, PLoS One. 7(11):c49345). 다양한 용도를 위해 다수의 IL-2 Fc 융합 단백질이 만들어졌고, 이들은 Fc-X(Gillies, et al., 1992, Proc Natl Acad Sci, 89:1428-32; Bell, et al., 2015, J Autoimmun. 56:66-80) 및 X-Fc(Zheng, X. X., et al., 1999, J Immunol. 163:4041-8) 입체배치 둘 다의 Fc에 직접 융합될 때 우수한 IL-2 생물활성을 갖는다는 것이 보고되었다. Gavin 등(US 20140286898 A1)은, Fc-X 입체배치로 IL-2 및 특정 IL-2 변이체를 포함하는 Fc 융합 단백질이 유리 IL-2 사이토카인과 비슷한 생물활성을 갖는다고 기재하였지만, Zheng 등(Zheng, X. X., et al., 1999, J Immunol. 1999, 163:4041-8)의 결과와는 대조적으로, X-Fc 입체배치의 IL-2 변이체 융합 단백질은 감소된 생물활성을 갖거나 생물활성을 갖지 않는다는 것을 확인하였다. 따라서, Gavin 등은, 대체로, N-말단 IL-2 Fc 융합 단백질을 부정적으로 교시한다. 융합 단백질 입체배치의 선택에 영향을 주는 또 다른 인자는 순환 반감기에 대한 영향이다. Fc-X 입체배치의 IL-2 융합 단백질은, 인체에서의 인간 IgG1의 21일 반감기 또는 현존하는 FDA 승인을 받은 Fc 융합 단백질의 반감기보다 훨씬 더 짧은, 비교적 짧은 순환 반감기를 갖는다는 것이 문헌에 거듭 나온다(표 I). Fc-X 입체배치의 IgG-IL-2 융합 단백질은 마우스에서 대략 몇 시간(Gillies S. D., 2002 Clin Cancer Res., 8:210-6; Gillies, S. D., US 2007/0036752 A2; Bell C. J., 2015 J Autoimmun. 56:66-80) 및 인체에서 대략 3.3시간(Ribas A., J 2009 Transl Med. 7:68) 및 3.7시간(King D. M, 2004 J Clin Oncol., 22:4463-73)의 비교적 짧은 순환 반감기를 갖는 것으로 보고되어 있고, Fc-IL-2 융합 단백질은 마우스에서 12.5시간의 순환 반감기를 갖는 것(Zhu E. F., Cancer Cell. 2015, 13; 27(4):489-501)으로 보고되어 있다. Fc 모이어티의 C-말단과 IL-2 모이어티 사이의 단백질 분해가 짧은 순환 반감기에 기여한다(Gillies S. D., 2002 Clin Cancer Res., 8:210-6; Zhu E, F., 2015 Cancer Cell. 27:489-501). 이들의 상대적으로 짧은 반감기로 인해, 본 발명자들은 X-Fc 입체배치의 IL-2 선택적 아고니스트 Fc 융합 단백질에 포커스를 맞추게 되었다.

링커

Fc와 융합 파트너 단백질 사이의 접합부에 있는 아미노산 서열은 (1) 2개의 단백질 서열의 직접 융합 또는 (2) 링커 펩티드가 개재된 융합체일 수 있다. 임상 사용에 대해 현재 미국 FDA 승인을 받은 10종의 Fc 융합 단백질(표 I), 8종이 융합 파트너 단백질과 Fc의 직접 융합체이고, 2종이 링커 펩티드를 갖는 것이어서, 다수의 Fc 융합 단백질이 링커 펩티드 없이 기능을 할 수 있다. 링커 펩티드는 2개의 단백질 모이어티 사이에 스페이서로서 포함된다. 링커 펩티드는 적절한 단백질 폴딩과 성분 단백질 모이어티의 안정성을 촉진하고, 단백질 발현을 개선하며, 성분 단백질 모이어티의 생물활성을 더 좋게 할 수 있다(Chen, et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65:1357-69). 다수의 융합 단백질에 사용되는 펩티드 링커는 비구조화된 가요성 펩티드가 되도록 설계된다. 천연 단백질에서의 독립적인 구조 도메인 사이의 링커 펩티드의 길이, 서열 및 입체구조(conformation)가 가요성 펩티드 링커의 설계를 위한 이론적 토대를 제공하였다(Argos, 1990, J Mol Biol. 211:943-58). Argos는 글리신과 같은 작은 비극성 잔기와 세린 및 트레오닌과 같은 작은 극성 잔기로 이루어진 긴 가요성 링커 펩티드에 있어서, 복수의 글리신 잔기는 매우 유연한 입체구조를 가능하게 하고, 세린 또는 트레오닌은 펩티드 내에서의, 그리고 성분 융합 단백질 모이어티와의 소수성 상호작용을 제한하는 극성 표면 부위를 제공한다는 지침을 제공하였다. 문헌에 기재된 다수의 펩티드 링커는 서열 GGGGS의 반복체와 같이 글리신 및 세린이 풍부하지만, 당업자라면 Argos의 일반적인 권고(Argos, 1990, J Mol Biol. 20; 211(4):943-58)에 따라 다른 서열도 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 단백질 중 하나는 글리신 및 알라닌으로 이루어진 링커 펩티드(서열 번호 15)를 포함한다. 완전히 펼쳐진 베타 가닥의 입체구조를 갖는 가요성 링커 펩티드는 말단에서 말단까지의 길이가 잔기당 약 3.5 Å이다. 따라서, 5개, 10개, 15개, 또는 20개 잔기로 이루어진 링커 펩티드는 완전히 펼쳐진 최대 길이가 각각 17.5 Å, 35 Å, 52.5 Å, 또는 70 Å이다. 펩티드 링커의 말단에서 말단까지의 최대 길이는 또한 본 발명의 펩티드 링커의 특징을 정의하기 위한 지침이 될 수 있다. 본 발명 내에서의 링커 펩티드의 목표는 IL-2 선택적 아고니스트 모이어티와 이의 동족 수용체와의 계합을 가능하게 하고 Fc 모이어티가 FcRn에 결합할 수 있게 하여 융합 단백질 리사이클링 및 순환 반감기 연장을 가능하게 하기 위해 개개의 융합 단백질 모이어티의 적절한 입체구조 및 배향을 달성하는 것이다. 이러한 상호작용에 영향을 주는 인자들은 예측이 어렵기 때문에, 링커 펩티드에 대한 요건 및 그 적절한 길이는 실험적으로 테스트하고 결정해야 한다. 다수의 Fc 융합 단백질이 링커 펩티드를 필요로 하지 않는데, 이것은 하기 표 I에 열거된, 미국 FDA 승인을 받은 10종의 Fc 융합 단백질 중 8종 그러한 펩티드를 갖지 않는 것에 의해 입증된다. 이와는 대조적으로, GLP-1과 Fc의 융합체인 둘라글루타이드(Dulaglutide)는 생물활성에 큰 영향을 미치는 15개 잔기의 펩티드 링커를 포함한다(Glaesner, 미국 특허 제7,452,966호 B2). 당업계에서의 IL-2-Fc 융합 단백질에 대한 선행 연구는 링커 펩티드가 생물활성에 필수적인 것은 아님을 나타낸다. wt IL-2, 또는 치환 C125S를 갖는 IL-2를 포함하는 Fc-X 배향의 IL-2 융합 단백질은, 펩티드 링커를 갖지 않거나(Gillies, et al., 1992, Proc Natl Acad Sci, 89:1428-32; Gavin, et al., 미국 특허 출원 제2014-0286898호 A1), 또는 갖는(Bell, et al., 2015, J Autoimmun. 56:66-80) 유리 IL-2 사이토카인의 것과 유사한 IL-2 생물활성을 갖는 것으로 보고되었다. X-Fc 배향에 대해, Zheng 등은, X-Fc 입체배치의 IL-2 융합 단백질의 IL-2 생물활성은 IL-2 자체의 생물활성과 실질적으로 구별될 수 없다고 보고하였다(Zheng, X. X., et al., 1999, J Immunol. 1999, 163:4041-8). 이러한 광범위한 선행 기술은, IL-2 단백질과 Fc의 융합이, 높은 IL-2 생물활성을 갖기 위해 링커 펩티드를 필요로 하지 않다는 것을 교시한다. 그러나, Gavin 등은, 변경된 수용체 특이성을 갖는 특정 IL-2 변이체를 포함하는 X-Fc 입체배치의 Fc 융합 단백질이 펩티드 링커를 갖지 않거나 5개 잔기의 펩티드 링커를 가질 경우 감소된 생물활성을 나타내거나 생물활성을 나타내지 않는다고 보고하였다(Gavin, et al., 미국 특허 출원 제2014-0286898호 A1).

바이오어세이(bioassay)

후보 단백질의 생물학적 활성을 특성화하기 위한 견실한 정량적 바이오어세이가 필요하다. 이러한 어세이는 IL-2 수용체의 활성화를 측정하고, Treg에 있어서의 활성화의 다운스트림 기능적 결과를 측정하고, 활성화된 Treg의 치료와 관련된 성과 및 기능을 측정해야 한다. 이러한 어세이는 IL-2 선택적 아고니스트 분자의 치료 활성과 효능을 측정하는 데 이용될 수 있고, 또한 동물 또는 인간에서의 IL-2 선택적 아고니스트의 약력학적 특성을 측정하는 데 이용될 수 있다. 한 어세이는, 인산화된 단백질(pSTAT5)에 특이적인 항체를 사용한 유세포 분석에 의해 측정되는, 신호 전달 단백질 STAT5의 인산화를 측정한다. STAT5의 인산화는 IL-2 신호 전달 경로에서 필수적 단계이다. STAT5는 Treg 발달에 있어서 중요하고, CD4+CD25+ 세포에서 발현된 STAT5의 항상적 활성화 형태가 IL-2 부재 하에서의 Treg 세포의 생성에 충분하다(Mahmud, S. A., et al., 2013, JAKSTAT 2:e23154). 따라서, 일부 당업자들은, Treg 세포에서의 인산화된 STAT5(pSTAT5)의 측정이 이들 세포에서의 IL-2 활성화를 반영하는 것이며, 적절한 노출 시간 및 조건이 주어진다면, IL-2 처리의 다른 생물학적 결과를 예측하는 것이 됨을 알 것이다. 기능적 활성화에 대한 또 다른 어세이는 IL-2에 의해 자극된 Treg 세포의 증식을 측정한다. 일부 당업자들은 Treg 증식이, 정제된 Treg 세포로의 3중 수소화 티미딘 도입에 의해, CD4+CD25+FOXP3+ 또는 CD4+CD25+CD127- 마커 표현형의 빈도 및 유세포 분석에 의해 측정되는 혼합 세포 집단 내의 Treg 세포수의 증가에 의해, Treg 세포에서의 증식 관련 세포 주기 단백질, 예컨대 Ki-67의 발현 증가에 의해, 또는 Treg 세포에서의 유세포 분석에 의한, 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 같은 바이탈 형광 염료의 세포 분열 관련 희석의 측정에 의해 측정할 수 있다는 것을 알 것이다. IL-2에 의한 Treg의 기능적 활성화에 대한 또 다른 어세이는 Treg의 안정성 증가를 측정한다. pTreg 세포는 약간 불안정하여, Th1 및 Th17 이펙터 T 세포로 분화할 수 있는 잠재성을 갖는다고 여겨지고 있다. Treg의 IL-2 활성화는 Treg를 안정화시켜 이러한 분화를 방지할 수 있다(Chen, Q., et al., 2011, J Immunol. 186:6329-37). Treg의 IL-2 자극의 또 다른 결과는 Treg의 면역억제 활성에 기여하는 Treg 기능성 이펙터 분자, 예컨대 CTLA4, GITR, LAG3, TIGIT, IL-10, CD39 및 CD73의 수준의 자극이다.

IL-2 선택적 아고니스트 Fc 단백질을 개발하기 위해, 본 발명자들은 초기에는, Fc-X 입체배치의 IL-2 융합 단백질에 대해 보고된 짧은 순환 반감기 때문에, X-Fc 입체배치의 단백질에 초점을 맞추었다. 최초의 2종의 단백질을 제조하여 테스트하였는데, 하나는 펩티드 링커를 갖는 것, 다른 하나는 펩티드 링커를 갖지 않는 것이었으며, 놀랍게도 펩티드 링커를 갖는 단백질이 IL-2 생물활성을 가졌고, 펩티드 링커를 갖지 않는 단백질은 검출 가능한 생물활성을 갖지 않는다는 것이 밝혀졌다. 두 단백질 모두 IL-2RA에 대해 높은 결합 친화성을 나타내었는데, 이는 두 단백질이 적절히 폴딩되었음을 의미한다. 이러한 결과들은, 링커 펩티드가 IL-2 수용체 활성화 및 생물활성에 필수적이었음을 시사하였다. 그 후, 다른 변수들을 제거하고 이 가설을 시험하기 위해 일련의 추가적인 유사체를 제조하였다. 이러한 연구들로부터 얻은 결과는, 이러한 치료 단백질에 대한 주요한 구조-활성 관계의 발견으로 이어졌고, 원하는 활성 및 약학적 속성을 갖는 신규한 분자들을 창출하였다.

제제

본 발명의 융합 단백질의 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 비경구(특히, 정맥내 또는 피하) 전달용으로 제제화되는 것으로 정의된다. 일반적으로, 약학 제제는 약학적으로 허용되는 비이클, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 5% 덱스트로스 수용액 등과 함께 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. 제제는 1종 이상의 부형제, 방부제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면에서의 단백질 손실을 막기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다. 제제화 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19^th ed., 1995]에 개시되어 있다.

예시로서, 약학 제제는 본 발명의 융합 단백질을 함유하는 용기를 포함하는 키트로서 제공될 수 있다. 치료 단백질은 단회 또는 다회 투여를 위한 주사액의 형태로, 주사 전에 재구성되는 멸균 분말로서, 또는 프리필드 시린지로서 제공될 수 있다. 그러한 키트는 적응증에 대한 서면 정보 및 약학 조성물의 용법을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 그러한 정보는 본 발명의 융합 단백질이 본 발명의 융합 단백질에 대한 알려진 과민성을 갖는 환자에게 금기되어야 한다는 설명을 포함할 수 있다.

본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질은 약학 조성물을 비롯한 조성물에 도입될 수 있다. 그러한 조성물은 일반적으로 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는, 약학적 투여에 적합한, 식염수, 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제)도 조성물에 도입될 수 있다.

약학 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질은 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로의 예로는, 예를 들어, 정맥내 투여, 피내 투여 및 피하 투여를 포함한다. 비경구 적용을 위한 용액 또는 현탁액은 하기 성분들: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수액, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 일염기 및/또는 이염기 인산나트륨, 염산 또는 수산화나트륨을 사용하여 (예를 들어, pH 약 7.2∼7.8, 예를 들어 7.5로) 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱제의 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.

주사에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 또는 수분산액과 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위하 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 주사에 있어서, 적절한 담체는 생리 식염수, 정균수 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균되어야 하고 주사가 용이한 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고 박테리아 및 진균 등의 미생물의 오염 작용을 막도록 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지는 계면활성제, 예를 들어, 폴리솔베이트 또는 트윈(Tween)을 사용하여 용이하게 할 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등으로 방지할 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어, 설탕, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.

멸균 주사액은 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을, 상기에 열거한 성분들 중 1종 또는 조합과 함께 도입하고, 그 후 필요에 따라, 여과 멸균을 행하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매와 상기에 열거한 것 이외의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비이클로 활성 화합물을 도입함으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 소정의 성분과 함께 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

일 실시형태에서, IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질은, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출형 제제와 같이, IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질이 체내로부터 빨리 제거되는 것을 막는 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성의 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제는 표준 기법을 이용하여 제조할 수 있다.

약학 조성물은 투여에 관한 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

투여

본 발명의 융합 단백질은 비경구 경로에 의해 투여되는 것이 바람직하다. 피하 경로가 바람직한 경로이지만, 정맥내, 근육내, 진피하 투여도 이용될 수 있다. 피하 또는 근육내 투여를 위해서는, 데포 또는 데포 제제가 이용될 수 있다. 특정 질환에 대해 전문화된 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 염증성 안질환의 경우, 안내 투여가 이용될 수 있다. 융합 단백질은 총 부피의 약 0.1∼10 mcg/ml의 농도로 사용될 수 있지만, 0.01 mcg/ml∼100 mcg/ml 범위의 농도도 이용되어도 좋다.

투여량 결정은 당업계의 통상적인 기술 수준 내이다. 투여는 치료 기간 동안 매일 또는 매주 행하거나 또 다른 간헐적 빈도로 행할 수 있다. 정맥내 투여는 1시간 내지 몇 시간의 통상적인 시간에 걸쳐 볼루스 주사 또는 주입에 의해 이루어진다. 서방출형 제제도 이용될 수 있다. 일반적으로, 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질은 치료되는 상태에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 예컨대 순환 Treg 세포에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 질병 조직 내에 존재하는 Treg 세포에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 또는 질병 증상에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 유발하는 데 충분한 양이다.

세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 얻은 데이터가 인체 사용을 위한 투여량 범위를 정하는 데 이용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은, 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서, 최대 유효 농도의 절반(EC50; 즉, Treg 세포의 최대 자극의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 일련의 순환 농도 내에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은, 상기 범위 내에서, 이용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량을 세포 배양 어세이로부터 초기에 추정할 수 있다. 투여량은, 동물 모델에서, 세포 배양으로 측정된 EC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 정할 수 있다. 그러한 정보는 인체에 유용한 투여량을 정확히 결정하는 데 이용될 수 있다. 혈장 수치는, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 어세이로 측정할 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같이, 치료 유효량의 IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질(즉, 유효 투여량)은 선택된 폴리펩티드 및 투여 빈도에 따라 달라진다. 예를 들어, 환자 체중 1 kg당 약 0.001∼0.1 mg 범위의 단회 투여량이 투여될 수 있으며, 몇몇 실시형태에서는, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 조성물은 매일 1회에서부터 매주 1회 이상, 또는 매달 1회 이상 투여될 수 있으며, 격일에 한번도 투여하는 것도 포함된다. 당업자라면 질병 또는 질환의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적인 건강 및/또는 나이, 환자에게 존재하는 Treg 세포의 수준 및 존재하는 다른 질병을 포함하나 이들에 한정되지 않는 특정한 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량과 타이밍에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 치료 유효량의 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 융합 단백질을 사용한 대상체의 치료는 일련의 치료가 될 가능성이 있다.

자가면역 질환

본 발명의 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환들 중 일부를 언급하였다. 그러나, 자가면역 질환에 있어서의 Treg 세포의 역할은 매우 활발한 연구 분야라서, 본 발명으로 치료할 수 있는 추가적인 질환들이 밝혀질 가능성이 있다. 자가면역 질환은, 면역계가 그 자신의 단백질, 세포 및 조직을 공격하는 인간의 질환으로서 정의된다. 자가면역 질환에 대한 종합적인 리스트와 리뷰는 문헌[The Autoimmune Diseases (Rose and Mackay, 2014, Academic Press)]에서 찾아볼 수 있다.

다른 융합 단백질

본 발명에 있어서 Fc 단백질 모이어티의 목적은 단지 순환 반감기를 증가시키는 것이기 때문에, 당업자라면 분자 크기를 증가시키고 신장 청소율을 감소시키는 동일한 목적을 달성하기 위해 본 발명에서 발견한 구조-활성 관계를 이용하여, IL-2 선택적 아고니스트 모이어티를 다른 단백질의 N-말단에 융합시킬 수 있다는 것을 알 것이다. IL-2 선택적 아고니스트는 혈청 알부민의 N-말단에 융합시킬 수 있었고(Sleep, D., et al., 2013, Biochim Biophys Acta. 1830:5526-34), 이들은 둘 다 IL-2 모이어티에 비해 융합 단백질의 수력학적 반경을 증가시키고 또한 FcRN에 의해 리사이클링된다. 당업자라면 또한 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 모이어티를 재조합 비면역원성 아미노산 중합체의 N-말단에 융합시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 이 목적을 위해 개발된 비면역원성 아미노산 중합체의 두 가지 예는 A, E, G, P, S 및 T 아미노산의 사슬인 XTEN 중합체(Schellenberger, V., et al., 2009, Nat Biotechnol. 27:1186-90) 및 P, A 및 S 아미노산 잔기의 사슬인 PAS 중합체(Schlapschy, M., et al., 2007, Protein Eng Des Sel. 20:273-84)이다.

본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 본원에 포함되는 것으로 나타낸 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

전술한 발명은 명확한 이해를 위해 실례와 예시로써 어느 정도 상세히 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 본 발명에 특정한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다.

실시예

하기 실시예는 단지 예시를 위해 제시된 것으로 한정적인 것이 아니다. 당업자라면 실질적으로 유사한 결과를 산출하도록 수정 또는 변경될 수 있는 결정적이지 않은 다양한 파라미터를 쉽게 알 수 있을 것이다.

실시예 1. IL-2 선택적 아고니스트-IgG Fc 융합 단백질의 클로닝, 발현 및 정제

N88RL9AG1을 코딩하는 cDNA(서열 번호 4)를 DNA 합성과 PGR 어셈블리로 구성하였다. N88RL9AG1 구성체는 마우스 IgG1 신호 서열, 치환 N88R 및 CI25S를 갖는 성숙 인간 IL-2(서열 번호 1) 서열, 9개 아미노산의 링커 펩티드 서열(서열 번호 15) 및 치환 N297A를 포함하는 인간 IgG1의 Fc 영역(서열 번호 2)으로 이루어졌다. N88R/IL-2는 IL-2RB에 대해 감소된 결합력과, IL-2Rαβγ 수용체 발현 세포에 대한 선택적 아고니스트 활성을 갖는 Il-2 선택적 아고니스트이다(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18:1197-202). IgG1 Fc 상의 N297에서의 N-결합 글리코실화 부위의 제거는 Fc 이펙터 기능을 감소시킨다(Tao, M. H., et al., 1989, J Immunol. 143:2595-2601). D20HL0G2는 마우스 IgG1 신호 서열, 치환 D20H 및 C125S를 갖는 IL-2(서열 번호 1), 및 인간 IgG2로부터 유도된 Fc 단백질 모이어티(서열 번호 3)로 이루어졌다. D20H IL-2 변이체는 N88R과 유사한 선택적 아고니스트 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Cassell, D. J., et al., 2002, Curr Pharm Des., 8:2171-83).

이러한 cDNA를, 제한 부위 HindIII 및 NotI을 이용하여, pcDNA3.1(+)(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 클로닝하였다. 구성체를 포함하는 정제된 발현 벡터 플라스미드를 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 쉐이크 플라스크에 시딩하여, 무혈청의 화학적 규정 배지에서 증식시켰다. DNA 발현 카세트를 0.1 L의 현탁 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 생존율과 생존 세포수를 얻기 위해 세포를 카운팅하였다. 5일째, 배양물을 회수하고, 3,000 x g로 15분 동안 원심분리하여 컨디셔닝된 배지 상청액을 맑게 하였다. 0.25% 아세트산(pH 3.5)으로 용리시키면서 프로틴 A 컬럼(GE Healthcare)으로 상청액을 흘려 보내고, 용리된 단백질을 1 M Tris(pH 8.0)로 중화시킨 후 30 mM HEPES, pH 7, 150 mM NaCl로 투석함으로써 단백질을 정제하였다. 그 후, 샘플들을 0.2 μm 멤브레인 필터에 통과시켜 멸균 여과하고 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS PAGE로 분석하였다. 단백질은 디설파이드 결합 이량체로서 이동하였다. 1.11 mg/ml cm^-1의 계산된 흡광 계수를 이용하여 흡광도로 단백질 농도를 측정하고, 분액을 -80℃에 저장하였다.

사이토카인 N88R/IL-2 및 D20H/IL-2는 서열 번호 1의 변이체이며, 안정성 개선을 위해 추가적인 돌연변이 C125S를 부가한 것을 제외하고는, 미국 특허제6,955,807호 B1에 기재된 것과 실질적으로 동일하게 이. 콜라이에서 제조하였다.

실시예 2. N88RL9AG1 및 D20HL0G2의 수용체 결합 활성의 측정

N88RL9AG1 및 D20HL0G2가 적절히 폴딩되는지를 확인하기 위해, IL-2 수용체 서브유닛 IL-2RA 및 IL-2RB에 대한 이들의 친화성을, 바이아코어(Biacore) T-200 인스트러먼트(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 측정하였다. IL-2RA 및 IL-2RB 세포외 도메인 단백질 및 IL-2 단백질(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스)을, 각각 30 및 484의 최종 RU(공명 단위) 값이 되도록 NHS/EDC 커플링에 의해, CM-5 바이아코어 칩 상에 고정화시켰다. IL-2RA에 대한 결합의 키네틱(운동역학)은, 50 ㎕/min의 유속으로 0.6 nM∼45 nM 범위의 5 가지 농도의 IL-2 및 N88RL9AG1에서 측정하였다. IL-2RB에 대한 결합의 키네틱은, 10 ㎕/min의 유속으로, IL-2에 대해서는 16.7 nM∼450 nM, Fc 융합 단백질에 대해서는 14 nM∼372 nM 범위의 5 가지 농도에서 측정하였다. IL-2에 대해 1:1 피트, N88RL9AG1 및 D20HL0G2에 대해 2가 피트를 가정하여, 바이아코어 평가 소프트웨어 버전 2.0을 이용하여 운동 상수로부터 해리 상수(Kd)를 계산하였다. 평형 Kd 값은, 정상 상태 결합 값을 이용하여 바이아코어 평가 소프트웨어로 계산하였다.

IL-2 및 N88RL9AG1 둘 다에 대해 IL-2RA에 대한 결합을 검출하였다. N88RL9AG1에 대한 Rmax 값은 14.43으로서, IL-2에 대한 값보다 5.5배 더 높았으며, 이는 N88RL9AG1(82,916 g/M)이 IL-2(15,444 g/M)보다 분자량이 크다는 사실과 일치한다. IL-2에 대한 kon, koff 및 Kd 값은 공개된 SPR 값(Table II)으로부터 예측되는 범위에 있었다. 운동역학법과 평형법 둘 다로 측정할 때 N88RL9AG1의 친화성은 IL-2에 대한 친화성보다 2배 더 높았다. IL-2RB에 대한 IL-2의 결합은 6.19의 Rmax로 검출되었다. kon, koff 및 Kd의 측정값은 문헌에 보고된 범위 내에 있다. 기록된 값은 3.1 x 10^-8 M(IL-2RA) 및 5.0 x 10^-7 M(IL-2RB)(Myszka, D. G., et al., 1996, Protein Sci. 5:2468-78); 5.4 x 10^-8 M(IL-2RA) 및 4.5 x 10^-7(IL-2RB)(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18:1197-202); 및 6.6 x 10^-9 M(IL-2RA) 및 2.8 x 10^-7 M(IL-2RB)(Ring, A. M., et al., 2012, Nat Immunol. 13:1187-95)이다. N88RL9AG1은 IL-2RB에 실질적으로 결합하지 않는 것으로 검출되었고, 테스트된 최고 농도에서 약간의 결합만 검출되었으며(Rmax = 0.06), IL-2와 N88RL9AG1의 분자량 차이와 IL-2RA 결합 결과에 기초한 예측치보다 훨씬 낮았다. D20HL0G2 단백질도 IL-2RA에 대한 결합에 대해 테스트하였으며, N88RL9AG1의 Kd와 유사하게, Kd가 8.3 x 10^-9 M인 것으로 확인되었다. 따라서, SPR 결합 연구는, N88RL9AG1 단백질과 D20HL0G2 단백질 둘 다 IL-2RA에 결합함을 나타내었고, 이는 단백질이 적절히 폴딩되었음을 의미한다.

실시예 3. T 세포에 대한 N88RL9AG1 및 D20HL0G2의 생물활성

T 세포에 대한 N88RL9AG1 및 D20HL0G2의 생물활성을, 특이적 T 세포 아집단에서 인산화된 STATS(pSTAT5) 수준을 측정함으로써 확인하였다. pSTAT5의 수준은, 인산화된 STAT5 펩티드에 대한 항체를 사용하여, 고정 및 투과화된 세포에서 유세포 분석으로 측정하였다. Treg 세포는 CD25를 항상적으로 발현하며, CD25 발현 수준이 상위 1%인 세포들은 Treg 세포에 매우 집중되어 있다(Jailwala, P., et al., 2009, PLoS One. 2009; 4:e6527; Long, S. A., et al., 2010, Diabetes 59:407-15). 따라서, 유세포 분석 데이터를, 각각 Treg 및 CD4 이펙터 T 세포 아집단에 대해 CD25^high(CD25 발현 세포의 상위 1∼2%) 및 CD25^-/low 그룹으로 게이팅하였다.

냉동보존된 CD4+ T 세포(Astarte Biologies, 미국 워싱턴주 시애틀)를 해동시키고, 1% 인간 AB 혈청(Mediatech, 미국 버지니아주 매너사스)을 함유하는 X-VIVO 15(Lonza, 미국 뉴저지 앨런데일) 배지로 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 회복시켰다. 그 후, 세포를 5 x 10⁶개 세포/ml의 농도로, 15 x 75 mm 튜브에 0.1 ml씩 분배하였다. 세포를 다양한 농도의 IL-2 또는 Fc 융합 단백질로 37℃에서 10분 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 사이토픽스 픽세이션 버퍼(Cytofix Fixation Buffer)로 37℃에서 10분 동안 고정시키고, 펌 버퍼 III(Perm Buffer III(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)로 얼음 위에서 30분 동안 투과화시킨 후 세척하였다. 그 후, 세포를, 제조업체에서 권장하는 농도의, 항-CD4-퍼시픽 블루(Pacific Blue)(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산타 클라라), 항-CD25-AF488(eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌 디에이고) 및 항-pSTAT5-AF547(BD Biosciences) 항체의 혼합물로 20℃에서 30분 동안 염색하고, 세척한 후, LSRII 인스트러먼트(BD Biosciences)에서 유세포 분석 데이터를 얻었다. 데이터는 Flowjo 분석 소프트웨어(Flowjo, 미국 오레곤주 애쉬랜드)를 이용하여 분석하였다.

이 어세이에서 N88RL9AG1을 사용한 결과는, IL-2에 비해 N88RL9AG1이 Treg 집단에 대한 현저한 선택성을 가졌음을 나타내었다(도 3a). N88RL9AG1은 CD4+ 세포의 1% 미만을 활성화시켰으며, CD25^high 세포에 대해 매우 강한 선택성을 가졌다. 이와는 대조적으로, IL-2는 40 nM의 농도에서 CD4+ T 세포의 80% 초과를 활성화시켰으며, pSTAT5+ 세포의 큰 비율이 낮은 수준으로 CD25를 발현하거나 발현하지 않았다. 심지어 테스트한 최저 농도인 4 pM에서도, IL-2는, CD25^-/low 세포 및 CD25^high 세포 둘 다에서, 여전히 pSTAT5를 유의적인 수준으로 자극하였다.

그 후, CD4+ T 세포 pSTATS 어세이에서 D20HL0G2의 활성을 테스트하였다. 놀랍게도, 이 어세이에서 D20HL0G2는 활성을 나타내지 않았다(도 3b). 10^-8 M D20H/IL-2 사이토카인(Fc에 융합되지 않은 변이체 IL-2 사이토카인)을 사용한 추가적인 대조군은, CD25^high 세포의 견실하고 선택적인 pSTAT5 활성화를 나타내었다(도 3c). D20HL0G2에 의한 활성의 결여는, IL-2RA에 결합된 D20HL0G2가 IL-2 및 N88RL9AG1의 Kd와 유사한 Kd를 갖는다는 것을 감안할 때 특히 놀라운 것이었으며, 이는 이것이 적절히 폴딩되었음을 의미한다.

N88RL9AG1에 의해 선택적으로 활성화된 CD25^high 세포가 Treg임을 확인하기 위해, 활성화된 세포를 Treg 세포에 대한 또 다른 분자 마커인 pSTAT5 및 FOXP3 둘 다에 대해 공염색하였다. CD4+ 세포를, pSTAT5 염색에 대해 상기에 기재한 바와 같이, 4 nM의 IL-2 또는 N88RL9AG1로 처리하고, 고정시키고, 투과화시키고, 계속해서 1 ml FOXP3 펌 버퍼(BioLegend, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로 실온에서 30분 동안 처리한 후, 세척하고 FOXP3 펌 버퍼에 재현탁시켰다. 투과화된 세포를 항-FOXP3-eFluor450, 항-CD25-AF488(eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌 디에고) 및 항-pSTAT5-AF547(BD Biosciences) 항체의 혼합물로 20℃에서 30분 동안 염색하고, 세척하고, 유세포 분석으로 분석하였다. 이 실험의 결과는, 활성화 STAT5에 의한 N88RL9AG1 처리 세포의 큰 비율(pSTAT5+ 세포)이 또한 FOXP3을 높은 수준으로 발현하였음을 나타내었다. 이 결과는 추가로, 활성화된 세포가 Treg 세포에 크게 집중되어 있다는 증거를 제공한다. 이와는 대조적으로, IL-2 처리 pSTAT5+ 세포는 FOXP3+ 및 FOXP3- 둘 다였으며, 대부분은 FOXP3- 세포였다.

실시예 4. 생물활성에 중요한 구조-활성 관계의 확인

실시예 3에 기재된 놀라운 결과는, N88RL9AG1에 의해서는 검출되지만 D20HL0G2에 의해서는 검출되지 않는 IL-2 생물활성이 링커 펩티드의 존재에 의한 것이었음을 시사하였다. 이러한 발견을 검증하고, Fc 모이어티의 아이소타입 및 IL-2 모이어티의 선택성 돌연변이와 같은 다른 변수의 기여를 제거하기 위해, 모두 IgG1 N297A Fc를 사용하는 한 패널의 유사체를 설계하고 제조하였다(표 III).

모든 구성체에서 Fc의 C-말단 라이신 잔기를 결실시키고, 생산 세포 배양물의 부피가 100 ml가 아니라 30 ml인 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 대로 cDNA를 구성하고 단백질을 발현 및 정제하였다. 모든 단백질은 높은 수율로 회수되었다. 실제로, N88R/IL-2 시리즈의 분자의 수율 비교는, 펩티드 링커 길이가 증가할수록 단백질 수율이 증가하는 분명한 경향을 나타내었으며, N88RL20AG1(가장 긴 펩티드 링커)의 경우 N88RL0AG1(펩티드 링커 없음)보다 6.8배 회수율이 높았다(도 5a). 링커 펩티드 함유 단백질의 수율 증가에 대한 기초는 아직 명확하지 않지만, 발현 수준 증가, 분비율 증가, 단백질 안정성 증가, 또는 정제 효율 증가에 기인하는 것일 수 있다. 흥미로운 점은, N88RL0AG1에 비해 N88RL15AG1의 수율이 4.5배 더 높은 것에 비해, WTL15AG1의 수율은 WTL0AG1의 수율보다 약간 더 높았다(1.8배)는 것이다. D20HL15AG1 수율은 N88RL15AG1 수율과 비슷했는데, 이는 IL-2 선택성 돌연변이가 수율에 유의적인 영향을 주지 못했음을 의미하며, 이들 단백질 둘 다 AG1L15D20H보다 유의적으로 더 높은 수율(각각 4.3배 및 3.4배)을 나타내었다(도 5b). 종합적으로, 이러한 결과들은, 펩티드 링커 길이를 증가시키는 것이 N88R/TL2 함유 Fc 융합 단백질의 더 높은 단백질 수율과 연관되어 있다는 것과, wt IL-2 함유 Fc 융합 단백질의 수율은 링커 펩티드의 존재에 훨씬 덜 민감하고, X-Fc 입체배치의 IL-2-Fc 융합 단백질이 생성된다는 것을 나타내었다.

이러한 정제된 단백질을, 인간 CD3+ T 세포(음성 선별)를 CD4+ 세포 대신에 사용하고 세포를 10분이 아니라 20분 동안 테스트 단백질과 인큐베이트한 것을 제외하고는, 실질적으로 실시예 3에 기재된 대로 인간 T 세포 pSTAT5 바이오어세이로 테스트하였다.

N88R/IL-2 시리즈의 분자로부터 얻은 결과는, Treg 농축 집단에서의 생물활성이 펩티드 링커 길이에 의해 크게 영향을 받았음을 보여주었다(도 6a). Treg 집단에서의 pSTAT5 신호(% pSTAT5+ 세포)는 펩티드 링커 길이가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였다. 이러한 생물활성 증가는 10^-8 M 테스트 단백질에서의 최대 pSTAT5 신호 및 EC50 값 둘 다에 반영되었다(표 IV). 가장 긴 펩티드 링커를 갖는 단백질인 N88RL20AG1은, N88RL0AG1에 비해 최대 pSTAT5 신호에 있어서 4.2배 증가를 보였다. N88RL0AG1 pSTAT5 신호는 최고 농도(10^-8 M)에서 IL-2 활성화의 50%에 도달하지 못하였기 때문에, N88RL0AG1에 비해 링커 펩티드를 포함하는 단백질의 EC50에 있어서 배수 개선을 확인할 수 없었다. 그러나, N88RL20AG1 EC50 및 테스트된 N88RL0AG1의 최고 농도에 기초할 때, N88RL20AG1이 N88RL0AG1보다 100배 넘게 더 낮은 EC50을 나타낸다는 것을 추정할 수 있다.

예상한 대로, CD25^-/low 집단에서 N88R/IL-2 분자 중 어느 것도 실질적으로 검출 가능한 활성을 보이지 않은 한편, 10^-8 M IL-2는 CD25^-/low 집단의 54.2%에서 pSTAT5 활성을 자극하였다(도 6b).

WTL0AG1과 WTL1SAG1의 비교는, 링커 펩티드가 N88R/IL-2-Fc 융합 단백질에 비해 wt IL-2-Fc 융합 단백질에 대해 훨씬 덜 유의적인 효과를 나타냄을 보여주었다(도 7). Treg 아집단에서, WTL0AG1과 WTL15AG1은 둘 다 유의적인 생물활성을 나타내었으며, 실제로, IL-2보다 pSTAT5 인산화를 약 2배 더 높은 최고 수준으로 자극하였다. 그러나, WTL0AG1 및 WTL15AG1은 또한 약 10배 더 높은 농도에서 CD25^-/low 세포에서 pSTAT5 신호를 크게 자극하였다. WTL1SAG1 및 WTL0AG1은, Treg 세포 집단과 CD25^-/low 세포 집단 둘 다에서 EC50 값에 있어서 약 10배의 차이를 보였다.

Treg에서의 D20HL15AG1의 최고 pSTATS 신호는 N88RL15AG1의 것보다 현저히 더 낮았다(도 8). 이는, D20HL0G2에 의한 실시예 3에서의 검출 가능한 활성의 결여가, 부분적으로는, N88R/IL-2 모이어티에 비해 Fc 융합 단백질의 상황에 있어서 D20H/IL-2 모이어티의 더 낮은 활성에 기인하는 것이었음을 시사한다. AG1L15D20H의 활성은 D20HL15AG1의 활성보다 약간 더 높았는데, 이는 Fc 융합 단백질에서의 IL-2 모이어티의 입체배치(즉, X-Fc 대 Fc-X)가 Treg 생물활성에 주된 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.

종합적으로, 이러한 결과들은 최적 생물활성에 필요한 N88R/IL-2-Fc 융합 단백질의 주요 특징들을 정의한다. N88R/IL-2-Fc 단백질은 최적의 Treg 생물활성을 위해 링커 펩티드를 필요로 하며, 링커 펩티드 길이가 증가함에 따라 생물활성이 증가하는 경향을 갖는다. 둘째, 다른 연구자들의 연구와 일관되게, 링커 펩티드는 wt IL-2를 포함하는 Fc 융합 단백질의 생물활성에 보다 크지 않은 영향을 나타낸다. 링커 펩티드에 대한 이러한 다양한 요건들은, N88R/IL-2가 IL-2RB에의 결합에 결함이 있다는 사실의 결과일 수 있고, 이는 수용체 계합에 대한 보다 엄격한 요건 및 Fc 융합 단백질 파트너로부터의 입체 장애에 대한 민감성 증가로 이어질 가능성이 있다. 이러한 결과들은 또한 가장 강력한 IL-2 선택적 아고니스트-Fc 융합 단백질을 정의한다.

실시예 5. 인간 PBMC에서의 IL-2 선택적 아고니스트-Fc 융합 단백질의 선택성

보다 광범위한 생물학적 상황에서의 N88R/IL-2-Fc 융합 단백질의 선택성을 확인하기 위해, 미정제 비분별 인간 PBMC 중의 주요한 모든 면역 세포 유형에 대하여 STAT5 활성화를 측정하기 위한 어세이를 개발하였다. 정상 상태의 지원자로부터 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 원심분리로 인간 PBMC를 단리하였다. 10⁶개 PBMC를, 글루코스(Lonza) 및 10% FBS(Omega)를 함유하는 X-VIVO15 배지에 현탁시키고, 10^-8 M의 테스트 단백질로 37℃에서 20분 동안 처리하였다. 그 후, 제조업체 설명서에 따라 세포를 Foxp3/트랜스크립션 팩터 스테이닝 버퍼 세트(Transcription Factor Staining Buffer Set)(EBIO)로 염색하였다. 계속해서, 실시예 3에 기재된 것과 같이 세포를 사이토픽스 버퍼로 고정시키고 펌 버퍼 III으로 투과화시켰다. 그 후, 고정 및 투과화된 세포를 1% FBS/PBS로 세척하고, 실온의 암소에서 60분 동안 항체 혼합물로 염색하였다. 그 후, 염색된 세포를 1% FBS/PBS로 세척하고, PBS에 재현탁시키고, 포테사(Fortessa) 유세포 분석기(BD Biosciences)로 분석하였다. 항체 혼합물은 항-CD4-PerCP-Cy5.5(BD, #560650), 항-pSTAT5-AF-488(BD, #612598), 항-CD25-PE(BD, #560989), 항-CD56-PE-CF594(BD, #562328), 항-FOXP3-AF647(BD, #560889), 항-CD3-V450(BD, 560366) 및 항-CD8-BV650(Biolegend, #301041)으로 이루어졌다. 이 염색 절차는 7종의 주요 면역 세포 유형에서 pSTAT5 수준의 모니터링을 가능하게 하였다.

세포 표현형은 다음과 같이 정의되었다: Treg 세포: CD3+, CD4+, Foxp3+, CD25^high, CD8-, CD56-; 활성화 CD4 Teff 세포: CD3+, CD4+, Foxp3-, CD25^high, CD8-, CD56-; CD4 Teff 세포: CD3+, CD4+, Foxp3-, CD25^low, CD8-, CD56-; NKT 세포: CD3+, CD4-, Foxp3-, CD25^low, CD8-, CD56+; NK 세포: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25^low, CD8-, CD56+; B 세포: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25^low, CD8-, CD56-.

이 어세이에서는 단백질을 10^-8 M의 농도로 테스트하였다. 도 9에 도시되고 표 V에 요약된 결과는, N88RL15AG1이, 모든 세포 집단의 큰 비율에서 pSTAT5를 활성화시킨 wt IL-2 및 WTL15AG1에 비해 현저한 선택성을 나타내었음을 보여 주었다. N88RL15AG1은 Treg 집단에서 wt IL-2의 수준에 가깝게 pSTAT5 신호를 자극하였고, NK 세포를 제외한 다른 세포 유형에서는 유의적이지 않은 활성화가 있었다. 추가 분석(기재하지 않음)은, pSTAT5+ NK 세포가, 역시 면역조절 활성을 갖는 NK 세포 아집단인 NK-CD56^bright 세포의 특징인 CD25^high였음을 보여 주었다(Poli, A, et al., 2009 Immunology. 126(4):458-65). N88R/IL-2에 의해 낮은 수준의 pSTAT5 신호를 나타낸 몇 종의 세포 유형(활성화된 CD4 Teff 세포, CD4 Teff 세포, NK T 세포 및 NK 세포)은, N88RL15AG1에 의해서는 pSTAT5 신호를 전혀 나타내지 않거나 더 적게 나타내었다. 이러한 결과들은, 복잡한 생물학적 환경에 있어서의, Treg에 대한 N88RL15AG1의 활성 및 높은 선택성을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> Delinia, Inc. 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310 315 320 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 325 330 335 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 340 345 350 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 355 360 365 Gly <210> 9 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 9 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 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Pro Ser Val Phe Leu Phe 165 170 175 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 180 185 190 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 195 200 205 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 225 230 235 240 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 245 250 255 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 260 265 270 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 275 280 285 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 290 295 300 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 305 310 315 320 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 340 345 350 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 355 360 365 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 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185 190 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 195 200 205 Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 210 215 220 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 245 250 255 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 260 265 270 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 275 280 285 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 290 295 300 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 325 330 335 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 340 345 350 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 355 <210> 12 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 12 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 145 150 155 160 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 165 170 175 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 180 185 190 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 195 200 205 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 210 215 220 Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 225 230 235 240 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 245 250 255 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 260 265 270 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 275 280 285 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 290 295 300 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 305 310 315 320 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 325 330 335 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 340 345 350 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 355 360 365 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 370 <210> 13 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 13 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu His Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 145 150 155 160 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 165 170 175 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 180 185 190 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 195 200 205 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 210 215 220 Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 225 230 235 240 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 245 250 255 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 260 265 270 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 275 280 285 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 290 295 300 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 305 310 315 320 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 325 330 335 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 340 345 350 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 355 360 365 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 370 <210> 14 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr 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<210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide linker <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (19)

1. a. N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티; 및
   b. C-말단의 IgG Fc 단백질 모이어티
   를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 IL-2 융합 단백질은 고친화성 IL-2 수용체를 선택적으로 활성화시키고 이로써 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 능력을 갖는 것인 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, IL-2 변이체 단백질이 인간 IL-2 단백질(서열 번호 1)에 대해 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L, Q126F, D84G, 또는 D84I로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 갖는 인간 IL-2를 포함하는 것인 융합 단백질.
3. 제1항에 있어서, IL-2 변이체 단백질이 치환 C125S를 갖는 인간 IL-2를 포함하는 것인 융합 단백질.
4. 제1항에 있어서, IL-2 변이체 단백질과 IgG Fc 단백질이 둘 다 N-말단 및 C-말단을 가지며, 상기 인간 IL-2 변이체 단백질은 그 C-말단에서, IgG Fc 단백질의 N-말단에 융합되는 것인 융합 단백질.
5. 제1항에 있어서, IL-2 변이체 단백질과 IgG Fc 단백질 모이어티 사이에 위치하는 링커 펩티드를 더 포함하는 융합 단백질.
6. 제1항에 있어서, IgG Fc 단백질이, 융합 단백질의 Fc 부분의 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 융합 단백질.
7. a. 인간 IL-2(서열 번호 1)에 대해 아미노산 치환 N88R 및 C125S를 갖는 IL-2 변이체 단백질;
   b. 서열 번호 15에 기재된 링커 펩티드; 및
   c. 서열 번호 2에 기재된 인간 IgG1 Fc 단백질
   을 포함하는 융합 단백질로서, 고친화성 IL-2 수용체를 선택적으로 활성화시키고 이로써 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 능력을 갖는 융합 단백질.
8. a. 인간 IL-2(서열 번호 1)에 대해 아미노산 치환 N88R 및 C125S를 갖는 IL-2 변이체 단백질;
   b. 서열 번호 2에 기재된 링커 펩티드; 및
   c. 서열 번호 3에 기재된 인간 IgG2 Fc 단백질
   을 포함하는 융합 단백질.
9. 제1항의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
10. 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 인간 IL-2(서열 번호 1)에 대해 아미노산 치환 N88R 및 C125S를 갖는 IL-2 변이체 단백질, 서열 번호 15에 기재된 링커 펩티드, 및 서열 번호 3에 기재된 인간 IgG1 Fc 단백질을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 약학 조성물을 인간 조절 T 세포 농도가 원하는 수준에 도달할 때까지 치료 유효량으로 투여하는 것인 방법.
11. 인간 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법으로서, 제2항에 기재된 IL-2 변이체 단백질; 및
    a. 서열 번호 2에 기재된 인간 IgG1 Fc 단백질; 또는
    b. 서열 번호 3에 기재된 인간 IgG2 Fc 단백질
    로부터 선택되는 인간 IgG Fc 단백질
    을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 약학 조성물을 인간 조절 T 세포 농도가 원하는 수준에 도달할 때까지 치료 유효량으로 투여하는 것인 방법.
12. 인간 혈액 세포를 1 nM∼0.01 nM 농도의 제1항의 융합 단백질과 접촉시키고, 그 후 상기 단백질에 결합하는 세포를 유세포 분석으로 검출함으로써, 인간 혈액 샘플 중의 Treg 세포의 수를 측정하는 방법.
13. 2개의 동일한 사슬을 포함하는 이량체 단백질로서, 각각의 사슬은 N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티 및 C-말단의 IgG Fc 단백질 모이어티를 포함하며,
    상기 N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질 모이어티는
    a. N-말단 및 C-말단을 가지고;
    b. N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 서열 번호 1에 기재된 인간 IL-2 야생형과 다르며;
    c. 서열 번호 1에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 가지고;
    d. Treg 세포 상의 IL-2Rαβγ에 결함으로써 Treg 세포를 활성화시키는 능력을 가지며;
    N-말단의 인간 IL-2 변이체 단백질은 그 C-말단에서, 6∼20개 아미노산 잔기로 된 아미노산 링커의 N-말단에 연결되고, 상기 링커는 또한 C-말단을 가지며;
    상기 아미노산 링커의 C-말단은, 서열 번호 3에 대해 97%의 서열 동일성을 가지고 시스테인 잔기를 포함하는 IgG Fc 단백질 모이어티의 N-말단에 연결되며;
    상기 2개의 사슬은 상기 IgG Fc 단백질 모이어티의 시스테인 잔기를 통해 서로 연결되는 것인 이량체 단백질.
14. 제13항에 있어서, IL-2 변이체 단백질이 치환 C125S를 갖는 인간 IL-2를 더 포함하는 것인 이량체 단백질.
15. 제13항에 있어서, 아미노산 링커가 글리신 잔기, 세린 잔기, 및 글리신 잔기와 세린 잔기의 혼합물의 군으로부터 선택되는 링커로 이루어지는 것인 이량체 단백질.
16. 제13항에 있어서, IL-2 변이체 단백질 모이어티가 치환 N88R을 갖는 것인 이량체 단백질.
17. 제13항에 있어서, 링커가 12∼17개의 세린 잔기와 글리신 잔기의 혼합물을 포함하는 것인 이량체 단백질.
18. 제13항에 있어서, 링커가 4:1 비의 글리신 잔기와 세린 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
19. 제1항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.

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