KR20170022868A - 고리형 린유소브 b3을 함유하는 암 치료용 조성물 - Google Patents
고리형 린유소브 b3을 함유하는 암 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아마씨 유래의 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 LOB3가 천연물에서 유래된 것이기 때문에 인체 독성이 적고, 세포괴사가 아닌 아폽토시스에 의해 암세포 사멸을 유도하기 때문에 염증 등의 부작용이 일어나지 않는 안전하면서도 우수한 항암효과를 갖는 치료제로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 아마씨 유래의 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 화학요법(chemotherapy)은 암세포의 아폽토시스 (apoptosis)('세포자살'이라고도 함)를 유도하여 암세포가 제거되도록 할 수 있다. 암세포에 있어서, 일단 아폽토시스가 야기되면, 암세포는 파괴되어 아폽틱 바디 (apoptotic bodies)로 전환되게 되고, 이어서 아폽틱 바디는 주변의 대식세포들에 의해 소거되므로 염증반응과 같은 부작용을 수반하지 않게 된다. 따라서, 암세포의 아폽토시스 유도는 항암제 처리에 의해 악성 종양세포를 제거하는데 있어서 효과적인 기전으로 알려져 있다.
아폽토시스는 생리적인 발런스를 유지하는데 적용되는 기본적인 세포 활동일 뿐만 아니라, 손상된 세포나 비정상적인 세포의 제거를 통하여 암에 대항하는 보호 메커니즘으로도 알려져 있다. 그 과정은 많은 pro-와 anti-apoptotic molecules의 엄격한 조절에 의해 일어나며, 중요 조절 단백질들의 인산화(phosphorylation)와 탈인산화(dephosphorylation)가 세포성장과 아폽토시스의 측면에서 매우 중요한 두 가지 세포성 기작이라는 것이 밝혀졌다.
STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)은 Src를 포함하는 다양한 조절인자에 의해 인산화됨으로써 활성화되는 전사인자로서, 혈액암과 고형암을 포함하는 다양한 종류의 인간 종양에서 과도하게 활성화(인산화)되며, 과도하게 활성화된 STAT3는 암세포의 생존, 증식 및 성장과 관련된 Bcl-XL, c-myc, 사이클린 D1 등과 같은 표적 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 변이된 세포의 암세포화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 암 유발 티로신 인산화효소로 잘 알려진 Src는 STAT3의 705번 티로신을 인산화하고 STAT3 의존적으로 세포를 형질변환시킨다. 혈액종양, 림프종, 유방암, 뇌종양 환자의 조직에서 STAT3의 705번 티로신이 인산화되어 있음이 보고되었다.
한편, 아마과(Linaceae)에 속하는 식물인 아마씨(Linum usitatissimum L.)는 유럽과 아시아를 거쳐 캐나다로 전파되어 북위 55도 이상의 한랭한 지방에서만 식용으로 재배되는 까다로운 특성이 있어 많은 양이 생산되지 않는 귀한 씨앗이며, 단백질과 오메가-3 및 오메가-6와 같은 필수지방산과 리그난(lignan)과 같이 다른 씨앗에서 발견할 수 없는 항암물질 및 관상동맥, 심장질환과 같은 만성질환의 발병을 감소시켜주는 물질이 다량 함유되어 있다.
그러나, 아마씨로부터 분리 정제한 펩타이드의 면역연구는 1986년에 간세포에 콜레이트(cholate) 흡수 억제를 시작으로 폐상피 암세포에서 세포사멸을 유도 및 T 세포증식 억제와 관련된 보고 뿐이다. 아마씨(flaxseed)로부터 분리정제한 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3; LOB3)는, 7개의 소수성 아미노산(2개의 이소류신, 2개의 류신, 1개의 발린 및 2개의 페닐알라린)과 2개의 특수 아미노산(프롤린)으로 이루어진 고리형 지용형 노나펩타이드(nonapeptide)로서, 현재까지 항암효능에 관한 정확한 작용 메커니즘은 밝혀지지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 알려진 항암제들 보다 항암효과가 우수하면서 부작용이 거의 없는 생약 성분을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 천연물 유래의 LOB3가 신경교종을 포함하는 다양한 암종에서 발암유전자의 활성을 저해하고 아폽토시스를 유도함으로써 염증의 부작용 없이 우수한 항암효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, LOB3을 유효성분으로 함유하는, 암의 예방 또는 치료용 약학조성물/건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 고리형 린유소브 B3은 암세포의 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 고리형 린유소브 B3은 암유도 단백질인 Src과 STAT3의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 고리형 린유소브 B3은 암세포 내 Caspase-3 단백질의 활성을 증가시켜 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 고리형 린유소브 B3은 Bcl2 및 p53의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 고리형 린유소브 B3은 아마씨에서 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 암은 신경교종인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면 LOB3가 아마씨라는 천연물에서 유래된 것이기 때문에 인체 독성이 적고 안전하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의하면 LOB3가 유도하는 암세포 사멸이 세포괴사(necrosis)가 아닌 아폽토시스에 의한 것이기 때문에 염증 등의 부작용 문제를 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 신경교종을 포함하는 다양한 암종에 대하여 항암 효과가 우수하기 때문에 차세대 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, LOB3의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 2는, C6 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 3은, MDA-MB-231 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 4는, U251 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 5는, LOB3에 의한 C6 세포의 세포 분열 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은, LOB3에 의한 C6 세포에서 세포사멸효과를 형태적으로 확인하기 위하여 광학현미경으로 세포의 형태변화를 관찰한 결과이다.
도 7은, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 Annexin V/PI 염색어세이를 실시한 결과이다.
도 8은, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 형광현미경으로 핵 수축을 확인한 결과이다.
도 9는, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 형광현미경으로 Actin disruption을 확인한 결과이다.
도 10은, C6 세포에서 LOB3에 의한 Bcl-2 및 p53의 mRNA 발현을 확인한 결과이다.
도 11은, C6 세포에서 LOB3에 의한 카스파제(Caspase)-3 단백질의 활성 유도 효과를 확인한 결과이다.
도 12는, C6 세포에서 LOB3에 의한 p-Src 및 p-STAT3의 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
도 13은, C6 세포에서 LOB3에 의한 세포 이동성 평가(migration assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, C6 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 3은, MDA-MB-231 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 4는, U251 세포에 대한 LOB3의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 5는, LOB3에 의한 C6 세포의 세포 분열 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은, LOB3에 의한 C6 세포에서 세포사멸효과를 형태적으로 확인하기 위하여 광학현미경으로 세포의 형태변화를 관찰한 결과이다.
도 7은, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 Annexin V/PI 염색어세이를 실시한 결과이다.
도 8은, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 형광현미경으로 핵 수축을 확인한 결과이다.
도 9는, C6 세포에 대한 LOB3의 세포사멸효과가 아폽토시스에 의한 것인지 확인하기 위하여 형광현미경으로 Actin disruption을 확인한 결과이다.
도 10은, C6 세포에서 LOB3에 의한 Bcl-2 및 p53의 mRNA 발현을 확인한 결과이다.
도 11은, C6 세포에서 LOB3에 의한 카스파제(Caspase)-3 단백질의 활성 유도 효과를 확인한 결과이다.
도 12는, C6 세포에서 LOB3에 의한 p-Src 및 p-STAT3의 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
도 13은, C6 세포에서 LOB3에 의한 세포 이동성 평가(migration assay) 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)(이하, 'LOB3'라고 함)을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 LOB3은 7개의 소수성 아미노산(2개의 이소류신, 2개의 류신, 1개의 발린 및 2개의 페닐알라린)과 2개의 프롤린으로 이루어진 고리형 지용성 노나펩타이드(nonapeptide)로서, 구체적인 화학구조를 도 1에 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 조성물에 의해 예방, 개선 또는 치료될 수 있는 암종에는 제한이 없으나, 신경교종, 폐암, 전립선암, 대장암, 유방암 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 암질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서는, LOB3의 항암 효능을 알아보기 위해 C6(rat glioma cell) 암세포에서 세포독성을 평가한 결과, 암세포 사멸효과를 확인하였다.
또한, 본 발명에서는, LOB3의 암세포 사멸 원리를 파악하기 위하여 암세포에 LOB3를 처리한 후 세포형태 변화를 관찰한 결과, 아폽토시스(apoptosis)에 특이적인 형태인 세포질 수포(blebbing)과 융기(apoptotic body)가 형성됨을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는, LOB3의 암세포 사멸효과가 apoptosis에 의한 것인지 더욱 확인하기 위하여, C6 세포에 LOB3를 처리한 후 세포자살 마커인 annexin V와 세포괴사 마커인 PI를 검출하는 annexin V/PI 염색어세이를 실시한 결과, PI에는 염색되지 않으나 annexin V에 염색된 세포(annexin V+/PI-)의 수가 증가됨이 관찰되었다.
아폽토시스 어세이법인 annexin V/PI 염색법은, 세포가 죽을때 세포막에 존재하는 phosphatidic serin(PS)이 외부로 뒤집어져 돌출되는데 이때 이 PS와 Annexin V가 결합되는 것을 이용한 방법이다. PI(propidium iodide)는 핵에 결합하는 물질로서, 세포가 아폽토시스가 아닌 외부의 심한 충격으로 급속도로 사멸하게 되는 세포괴사(necrosis)의 경우에는 세포막의 PS 노출이 없게 되므로 Annexin V negative, PI positive로 나타난다. 즉, annexin V+/PI- 의 경우는 아폽토시스에 의한 사멸을 의미하며, annexin V-/PI+의 경우는 세포괴사에 의한 사멸을 의미한다.
따라서, LOB3에 의한 세포사멸은 염증 등의 추가적인 부작용이 일어나지 않는 세포자살의 형태를 띈다는 것을 의미한다. 아폽토시스와 달리 세포괴사(necrosis)는, 정상적인 세포에 위해를 줄 수 있는 물질에 의해 세포 및 세포내 소기관이 터져버리면서 세포내 물질들이 외부로 나와 이에 의해 염증반응을 일으키는 반면, 아폽토시스는 세포가 터지지 않고 대신 blebbing과 세포막으로 싸여있는 작은 apoptic body 들이 형성되고 이들이 주위의 세포들에 의해 포식(phagocytosis)되기 때문에, 염증이 일어나지 않는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서는, C6 세포에 LOB3를 처리하고 DNA를 염색하여 세포내 핵 구조를 확인한 결과, 세포자살(apoptosis)에 특징적인 형태인 염색체 응축과 핵 분획 발생이 관찰되었다. 이를 통해서 LOB3의 세포사멸 효과가 세포자살을 유도함으로써 이루어진다는 것을 구체적으로 확인하였다.
또한, 본 발명에서는, LOB3에 의한 암세포 자살 효과의 원리를 알아보기 위하여 C6 세포에 LOB3을 처리한 후 세포내 발암유전자 단백질의 활성을 확인하였다. 그 결과, 세포사멸 유도인자인 활성형 Apoptosis 마커인 Active-Caspase 3 및 Active-Caspase 9에서 단백질 발현량의 증가를 확인하였으며, 또한, 대표적인 발암 유전자인 Src kinase와 그의 기질인 STAT3의 활성이 감소됨을 알 수 있었는바, 이를 통하여 LOB3가 발암유전자인 Src kinase의 활성을 억제하여 세포자살을 유도한다는 것을 확인하였다.
더욱이, 본 발명에서는, LOB3에 의한 사이토카인의 mRNA발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, RT-PCR를 진행하였다. 그 결과, Bcl-2 및 p53의 mRNA 발현 정도가 감소하는 것을 확인하였는바, LOB3의 농도 의존적으로 세포자살 유도효과가 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는 LOB3에 의한 C6 세포에서 세포의 이동 (migratio)이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, LOB3에 의한 암세포의 전이를 효과적으로 막을 것으로 기대할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1: 세포배양 및 시약
C6, MDA-MB-231 (유방암 세포) 및 U251 (교아세포종) 세포를 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI1640 배지 또는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm 세포배양 접시에 70-80%의 밀도로 배양하였다.
LOB3는 ㈜Prairie Tide Chemicals에서 [19-NαC]-CLA 또는 Cyclolinopeptide A로 시판되는 물질(CAS No. 33302-55-5)을 구입하여 사용하였다.
실시예
2: 암세포
생존률
(cell viability) 평가
LOB3의 항암 효능을 알아보기 위하여, MTT 어세이법으로 C6 세포에서의 독성을 평가하였다.
구체적으로, 96-well 플레이트에 1 × 106 cell/ml의 C6 세포를 플레이팅하고, LOB3를 다양한 농도(0, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 μM)로 처리한 후 CO2 인큐베이터에서 48시간 37℃ 배양하였다. 이후, 10 ㎕ MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide) 용액(stock 농도:5mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 formazan crystal 용해를 위하여, 각 well에 100 ㎕ MTT 스톱용액 (10% SDS in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출한다.
또한, proliferation assay를 진행하여 세포의 생존 능력을 정량하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 30∼40 uM의 LOB3 농도범위에서 C6 세포 대부분이 사멸하는 것이 관찰되었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 세포 역시 5 ~ 10 μM에서 대부분이 사멸하는 것이 관찰되었다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, U251 세포 역시 10 ~ 20 μM에서 대부분이 사멸하는 것이 관찰되었다.
더욱이, 도 5에 나타낸 바와 같이, C6 세포에서 LOB3에 의한 세포분열이 억제됨을 확인하였다. 따라서, LOB3의 항암 효능 가능성을 확인하였다.
실시예
3: 세포의 형태변화 관찰
실시예 2의 결과를 토대로, LOB3의 암세포 사멸 원리를 조사하기 위하여 C6 세포에 LOB3를 처리한 후 세포 형태에 변화가 있는지 관찰하였다.
구체적으로, C6 세포를 24-well 플레이트에 5 × 104 cell/ml 농도로 배양한 후, LOB3을 10, 20 및 30 μM의 농도로 처리하고, 시간대별(0, 12, 24 및 48시간)로 광학현미경을 이용해서 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 처리 24시간째부터 apoptosis에 특이적인 형태인 blebbing과 apoptotic body의 형성이 확인되었다(노란색 화살표 참조).
실시예
4: 암세포의
apoptosis
관찰
실시예 3의 결과를 토대로, 아폽토시스 마커인 Annexin V와, 세포괴사(necrosis) 마커인 PI(propidium iodide) 염색법을 이용하여, 암세포 사멸이 아폽토시스에 의한 것임을 더욱 증명하였다.
구체적으로, C6 세포를 12-well 플레이트에 5 × 105 cell/ml 농도로 배양한 후, LOB3을 10 및 30 μM의 농도별로 처리하고, 24시간 뒤 PBS를 이용하여 세포를 수집하고 원심분리하여 세포 덩어리만 분리하였다. 이후, 1X FACS 버퍼에 세포를 현탁하고, Annexin V, PI 염색약을 15분간 처리한 후 flow cytometer를 이용하여 형광을 관찰하였다. 이 때, 비교 실험군으로 Staurosporin (2.5 μM)을 이용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Annexin V에는 염색되나 PI에는 염색되지 않는 세포(annexin V+/PI-)의 수가 증가됨이 확인되었는 바, 암세포 사멸이 세포괴사가 아닌 아폽토시스에 의한 것임을 알 수 있다.
실시예
5: 형광염색법을 이용한
핵구조
변화 확인
상기 실시예 4의 결과를 토대로, 아폽토시스에 특이적인 현상인 염색체 응축(condensation)과 핵분획이 관찰되는지 더욱 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, C6 세포를 12-well plate에 2.5 × 106 cell/ml 농도로 배양한 후, LOB3를 농도별로 (2.5, 25, 및 40 μM) 처리한 후, 원하는 형광염색을 하여 공초점 현미경을 이용해 이를 관찰하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, LOB3를 처리한 경우, 세포사멸(Apoptosis)의 특징인 핵 수축(도 8 노란색 화살표 참조) 및 Actin disruption이 발생하는 것을 확인하였다. 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 마커인 Caspase3의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
실시예
6:
LOB3가
세포사멸 억제 단백질의
mRNA
발현에 미치는 영향 확인
C6 세포 내에서 LOB3가 세포사멸 억제 단백질의 mRNA발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, RT-PCR을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
mRNA 발현 정도를 전사 수준에서 측정하기 위하여, 각 시료를 일정시간 동안 처리하고, TRIzol 시약을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때, 사용한 표적단백질의 센스 및 안티센스 프라이머 염기서열은 기존문헌을 참조하여 제조하였고, 대조군 유전자로는 β-actin을 사용하였다 (표 1 참조). PCR 증폭은 Hipi PCR kit (Elpis biotech)를 사용하여 각 실험군의 cDNA와 표적단백질들의 센스 및 안티센스 프라이머, 대조군 β-actin 프라이머를 dNTP 250 μM, Tris-HCl (pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, NgCl2 1.5 mM를 포함한 Hipi PCR kit 20 ㎕에서 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 45 초간 변성, 55 ℃에서 45 초간 어닐링, 및 72 ℃에서 1분간 신장하는 조건으로 수행하였으며, 총 30 주기를 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5% 아가로오스 겔에서 전기영동 하였고, 분획된 DNA 밴드의 세기를 측정하였다. 결과는 도 10에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5' -> 3') | |
| Bcl2 |
정방향 | CAC CCC TGG CAT CTT CTC CTT (서열번호 1) |
| 역방향 | CAC AAT CCT CCC CCA GTT CAC C (서열번호 2) | |
| p53 |
정방향 | CTC TGT CAT CTT CCG TCC CTT C (서열번호 3) |
| 역방향 | AGG ACA GGC ACA AAC ACG AAC (서열번호 4) | |
| β-actin |
정방향 | GTT ACC AGG GCT GCC TTC TC (서열번호 5) |
| 역방향 | GAT GGT GAT GGG TTT CCC GT (서열번호 6) |
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, C6세포 내에서 LOB3에 의해 Pro-apoptosis 마커인 Bcl-2 및 p53의 mRNA 발현 정도가 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, LOB3의 농도 의존적으로 세포사멸 유도능이 우수함을 알 수 있다.
실시예
7: 표적 단백질 및 신호전달경로 확인
LOB3에 의한 암세포 자살 효과에 대하여 구체적인 분자적 기전을 분석하기 위하여, 세포내 발암유전자 단백질의 활성을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, 페니실린 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml)과 5%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용해서 배양한 Rattus 신경교종 세포주인 C6 세포를 7 × 106 cell/ml 밀도로 60mm dish에서 전배양시켰다. 이 후, 각 분획들을 처리하고 약물에 따라 일정시간 후, 세포들을 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 파쇄하여 western 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정하였으며, 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE를 실행하고, 웨스턴 블랏팅 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting 시킨 후, membrane을 5 % non-fat dried milk (Bio-rad)를 사용해 blocking시키고, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (pro-caspase 3,9/ cleaved caspase 3,9/ Bcl-2/ p-Src, p-Stat3, β-actin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 세척 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 세척한다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하였고, 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 유도인자인 활성형 Apoptosis 마커인 Active-Caspase 3 및 Active-Caspase 9에서 단백질 발현량의 증가를 확인하였으며, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대표적인 발암 유전자인 Src kinase와 그의 기질인 STAT3의 활성형(p-Src, p-STAT3) 단백질이 감소하였는바, LOB3가 발암유전자의 활성을 억제함으로써 세포자살(아폽토시스)을 유도한다는 것을 확인하였다.
실시예
8: 세포 이동성 억제 확인
LOB3에 의해 세포의 이동 (migration)이 억제되는 것을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
C6 세포를 12-well plate에 1 × 106 cell/㎖ 농도로 배양한 후, 물리적인 방법을 이용하여 세포와 세포사이에 임의의 틈을 만들어준 후, LOB3를 농도별로 처리하고 시간대별 (9, 24 및 30 h)로 광학현미경을 이용해서 형태를 촬영하였다. 또한, 데이터 산출 프로그램을 이용하여 이를 수치로 나타내었다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, LOB3를 처리한 경우, C6 세포 내에서 세포의 이동이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Composition for treating cancer containing LOB3
<130> MP16-384
<150> KR 10-2015-0116636
<151> 2015-08-19
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of bcl2
<400> 1
cacccctggc atcttctcct t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of bcl2
<400> 2
cacaatcctc ccccagttca cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of p53
<400> 3
ctctgtcatc ttccgtccct tc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of p53
<400> 4
aggacaggca caaacacgaa c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of beta-actin
<400> 5
gttaccaggg ctgccttctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of beta-actin
<400> 6
gatggtgatg ggtttcccgt 20
Claims (8)
- 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고리형 린유소브 B3은 암세포의 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고리형 린유소브 B3은 암유도 단백질인 Src과 STAT3의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고리형 린유소브 B3은 암세포 내 Caspase-3 단백질의 활성을 증가시켜 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고리형 린유소브 B3은 Bcl2 및 p53의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고리형 린유소브 B3은 아마씨에서 유래된 것임을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 암은 신경교종인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 고리형 린유소브 B3([1-9-NαC]-linusorb B3)을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150116636 | 2015-08-19 | ||
| KR20150116636 | 2015-08-19 |
Publications (1)
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|---|---|
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Family
ID=58426608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160086090A KR20170022868A (ko) | 2015-08-19 | 2016-07-07 | 고리형 린유소브 b3을 함유하는 암 치료용 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20170022868A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190122137A (ko) | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 엔지케이 인슐레이터 엘티디 | 촉매 담체 및 그 제조 방법, 및 배기 가스 정화 장치 |
-
2016
- 2016-07-07 KR KR1020160086090A patent/KR20170022868A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190122137A (ko) | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 엔지케이 인슐레이터 엘티디 | 촉매 담체 및 그 제조 방법, 및 배기 가스 정화 장치 |
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