KR20170018485A - 올리고펩타이드 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

올리고펩타이드 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 치료에 사용하기 위한, PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기에서 상기 PCNA 상호작용 모티프는 X1X2X3X3'X1 ' (서열번호 1)이고, X1 및 X1'은 독립적으로 염기성 아미노산 그룹으로부터 선택되며, X2는 친지성 아미노산이고, X3 및 X3'은 독립적으로 비하전된 아미노산 그룹으로부터 선택되며, 상기 올리고펩타이드 화합물은 추가로 (i) 상기 올리고펩타이드 화합물은 1개 이상의 신호 서열을 포함함; (ii) 상기 PCNA 상호작용 모티프는 [K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R] (서열번호 27)임 중 한가지 이상으로 특정된다. 특히, 상기 치료는, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환이나 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료, 또는 세포증식 억제 요법, 예컨대 골수 말소를 수반하는 치료일 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 화합물은 그 자체를 세포증식 억제제로 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기한 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물은 세포증식 억제제나 방사선치료와 함께 사용할 수 있다.

Description

올리고펩타이드 화합물 및 이의 용도{OLIGOPEPTIDIC COMPOUNDS AND USES THEREOF}
본 발명은 신규한 제제, 약학 조성물 및 이의 치료학적 용도, 특히 세포증식 억제 요법이 필요하거나 또는 세포증식 억제 요법에 반응하는 임의의 질환 또는 과증식성 질환의 치료 등의, 증식 또는 생장을 감소 또는 예방하는 것이 바람직하거나 유익한, 임의의 치료법에 관한 것이다. 본 발명은, 증식성 세포 핵 항원(PCNA)과, DNA 복구, 유지 및 세포 주기 조절에 관여하는 다양한 단백질 간의 신규한 상호작용의 동정, 및 그로 인한, 그러한 상호작용을 담당하는 APIM으로 지칭되는 신규 펜타펩타이드 모티프의 동정을 기초로 한다. 즉, 보다 상세하게는, 본 발명은, PCNA와 상호작용할 수 있는 그러한 모티프를 포함하는, 펩타이드 또는 그것의 모방체, 상기 제제를 포함하는 약학 조성물, 및 치료법, 특히 전술한 바와 같이, 세포 생장의 감소 또는 예방을 포함하는 치료에 있어서의 이러한 제제의 사용에 관한 것이다. 또한, PCNA 상호작용성 모티프를 포함하는 제제를, 바람직하게는 세포증식 억제제와 조합하여 사용하는 것을 포함하는, 치료 방법을 제공한다.
인간과 동물의 세포는 반응성 산소 종, UV 광, X-레이 및 내인성 또는 외인성 세포증식 억제제 등의 다양한 DNA 손상 요인에 노출되고 있다.
세포증식 억제제들은, 예컨대 DNA를 손상시켜, 또는 세포의 복제 머신을 방해함으로써, 세포 생장 및/또는 배가(증식/복제)를 저해 또는 억제하는 제제이다. 알킬화제는, 일부 연구 목적으로 또는 임상적으로 사용되고 있는, 세포증식 억제제의 일종이다.
알킬화제는 N 또는 O 원자 위치에서 베이스를 변형시켜 DNA 손상을 일으킨다. 손상의 유형은 제제의 종류에 따라 결정되는데, 대부분의 제제들은 특이적인 DNA 변형을 야기시킨다. DNA 손상은, 복제과정에서 잘못된 코딩 및/또는 복제 차단부를 유발하여 이중 가닥 파괴 또는 트랜스병변(translesion) 합성을 일으킬 수 있는, 알킬화 부가물과 가닥간의 가교를 포함한다.
인간과 동물의 세포는, 염기 절제의 복구, 뉴클레오티드 절제의 복구 및 미스매치 복구 등의 다양한 DNA 복구 시스템을 가지고 있다. 그 예로, 인간 DNA 산화성 탈메틸효소인 hABH2가 있는데, 이것은 산화성 탈메틸화에 의해, 3-메틸시토신(3meC)을 시토신으로, 1-메틸아데닌(1meA)을 아데닌으로 다시 변환시킨다.
DNA 복구와 세포 주기 조절성 DNA 복제 사이의 긴밀한 조정은 게놈 완전성에 필수적이다. 손상이 존재하면, 손상이 복구되거나 또는 돌연변이가 발생하여 증식될 때까지, DNA 복제는 정지된다. DNA 복제와 DNA 복구 둘다에 관여하는 것으로 알려진 단백질은 증식성 세포 핵 항원(PCNA)이다.
PCNA는 박테리아에서부터 고등 진핵 생물에 이르기까지 기능적으로 잘 보존되어 있는 슬라이딩 클램프 단백질 패밀리에 속하며, 주된 기능은 게놈 복제에 요구되는 우수한 진행성을 갖춘 복제가능한 중합효소를 제공하는 것이다. 살아있는 S기의 세포에서, 그린 형광 단백질(GFP) 테그가 달린 PCNA는 별개의 복제소(replication focus)를 제시하는 부위를 형성한다. 따라서, 이것은 S기 마커로서 사용할 수 있다.
DNA 복구, 염색질 어셈블린, 후생유전성(epigenetic) 및 염색질 리모델링, 딸-염색 분체의 유착, 세포 주기 조절 및 생존 등의 세포 과정에 관여하는 수많은 단백질들은, 12개 이상의 복제 분기점(replication fork)을 포함하는, 이른바 복제 팩토리에 위치한다. 이들 단백질들 중 다수는, x가 임의의 아미노산일 수 있는, PIP-박스(QxxL/I/MxxF/DF/Y)라고 하는 펩타이드 서열과 상호작용하는 보존된 PCNA를 통해 PCNA와 상호작용한다. KAx 박스라고 하는 다른 PCNA 결합 모티프가 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 이용하여 동정되었지만, 이 모티프는 생체내 PCNA 상호작용에 중요한 것으로 확인되지는 않았다.
다양한 단백질들은 PCNA와 상호작용하며, 이들 중 hABH2 등의 일부 단백질들은 복제소에서 PCNA와 함께 위치되는 것을 확인되었다. 그러나, 공동-위치화 자체는 공동-위치성 단백질들 간에 임의의 직접 또는 간접 상호작용이 있다는 것을 암시하는 것은 아니다. 실제, PIP-박스 또는 KAx 박스 등의 PCNA-결합 모티프에서 hABH2가 없다는 것은, hABH2가 PCNA와 상호작용하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명은 신규한 제제, 약학 조성물 및 이의 치료학적 용도, 특히 세포증식 억제 요법이 필요하거나 또는 세포증식 억제 요법에 반응하는 임의의 질환 또는 과증식성 질환의 치료 등의, 증식 또는 생장을 감소 또는 예방하는 것이 바람직하거나 유익한, 임의의 치료법에 관한 것이다. 본 발명은, 증식성 세포 핵 항원(PCNA)과, DNA 복구, 유지 및 세포 주기 조절에 관여하는 다양한 단백질 간의 신규한 상호작용의 동정, 및 그로 인한, 그러한 상호작용을 담당하는 APIM으로 지칭되는 신규 펜타펩타이드 모티프의 동정을 기초로 한다. 즉, 보다 상세하게는, 본 발명은, PCNA와 상호작용할 수 있는 그러한 모티프를 포함하는, 펩타이드 또는 그것의 모방체, 상기 제제를 포함하는 약학 조성물, 및 치료법, 특히 전술한 바와 같이, 세포 생장의 감소 또는 예방을 포함하는 치료에 있어서의 이러한 제제의 사용에 관한 것이다. 또한, PCNA 상호작용성 모티프를 포함하는 제제를, 바람직하게는 세포증식 억제제와 조합하여 사용하는 것을 포함하는, 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 이르는 연구를 통해, 본 발명자들은 놀랍게도 다양한 단백질들이 신규한 PCNA 상호작용 모티프를 통해 PCNA와 상호작용한다는 것을 확인하였다. 이러한 단백질들 중 하나인 hABH2의 경우, 이 모티프는 N-말단에 위치되어 있다. 본 발명자들은, 이 모티프가 PCNA와의 상호작용에 필수적이고 충분한 것으로 확인하였다(실시예 1 참조).
하기 실시예들에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 알킬화로 인한 손상에 대한 DNA 복구에 있어서, 이러한 PCNA 상호작용 모티프의 기능을 조사하기 위해, 상기 모티프를 포함하는 재조합 단백질을 발현하는 세포주를, 3-메틸시토신 및 1-메틸아데닌이 생성되게 하는 SN2 알킬화제인 MMS(메틸 메탄설포네이트)에 다양한 농도에서 노출시켰다. 상기 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드의 발현은 MMS로 인한 DNA 손상에 대해 세포를 민감화시키는 것으로 나타났는데, 이는, 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드가 PCNA와 hABH2 상의 상호작용을 경쟁적으로 저해한다는 것을 나타낸다.
또한, 다른 종류의 DNA 손상을 유발하는, BCNU, 테모졸로미드(TZM) 및 마이토마이신 C(MMC) 등의 다른 제제도 테스트하였으며, 놀랍게도, 본 발명자들은, 상기 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드들 역시 세포가 이들 제제에 의한 손상에 민감하게 되게 한다는 것을 발견하였다. 이는 전혀 예상하지 못했던 것인데, 그 이유는 BCNU는 주로 가닥간의 가교물과 일부 모노-베이스 사이클릭 부산물(1,N(6)에타노아데닌)을 형성시키는 O6-클로로에틸화제이고, TZM은 06G 메틸화제인 것으로 보고되어 있고, MMC는 CpG에서 구아닌의 N-알킬화를 통해 가닥간 가교를 야기하고, hABH2는 이러한 타입의 DNA 손상을 복구하지 못하기 때문이다. 실제, 이러한 타입의 손상을 복구하는 다른 효소가 있으며, 예컨대 TZM에 의한 손상은 O6-메틸구아닌-DNA 트랜스퍼라제 (MGMT)에 의해 직접 복구된다. 이러한 사실은, 이 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드가 대체적으로 hABH2와 PCNA 간의 상호작용을 저해하지 않으며, 다른 단백질들이 관여될 수 있으며, 즉, 다른 단백질들이 새로운 모티프를 통해 PCNA와 상호작용할 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명자들은, 상기 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드의 발현이, ABH2 넉-아웃 마우스, 즉, ABH2를 가지고 있지 않은 마우스 유래의 세포주에서 관찰된 것 이상으로 세포증식 억제제(특이적으로 MMS)의 세포독성 효과를 증가시키는 것으로 확인하였는데, 이는, 상기 모티프를 포함하는 재조합 펩타이드가 광범위한 범위의 효과를 가지고 있으며, hABH2 이외의 다른 단백질도 저해할 수 있음을 의미한다.
이러한 놀라운 사실은, 본 발명자들로 하여금 PCNA 결합 모티프를 포함하는 펩타이드를 치료학적 용도로 제안하도록 하였다.
본 발명의 신규한 PCNA 결합 모티프, 통칭 APIM으로 특정화되었으며, 다음과 같이 정의될 수 있다:
X1X2X3X3'X1' (서열번호 1),
상기 서열에서,
X1 및 X1'은 독립적으로 염기성 아미노산 그룹으로부터 선택되며, X2는 친지성 아미노산이고, X3 및 X3'은 독립적으로 비하전된, 바람직하게는 비극성 아미노산들의 그룹으로부터 선택된다.
PCNA와 상호작용할 수 있는 펩타이드(또는 올리고펩타이드 화합물)는 이러한 펩타이드 (또는 서열) 모티프를 함유하거나 포함할 수 있다. 따라서, PCNA와 상호작용할 수 있으며 이러한 모티프를 포함할 수 있는 올리고펩타이드 화합물은 본원에 기술되어 있으며, 본 발명의 일부 측면을 나타낼 수 있다.
예컨대, 일 구현예에서, 본 발명은, PCNA와 상호작용하며, X1 및 X1'가 독립적으로 염기성 아미노산 그룹으로부터 선택되고 X2가 친지성 아미노산이고, X3 및 X3'이 독립적으로 비하전된, 바람직하게는 비극성 아미노산 그룹으로부터 선택되는, 모티프 X1X2X3X3'X1 ' (서열번호 1)를 포함하는, 올리고펩타이드 화합물을 제공할 수 있으며, 상기 올리고펩타이드 화합물은 하기 사항 중 하나 이상으로 추가적으로 특정화된다:
(i) 올리고펩타이드 화합물은 11개 이상의 아미노산 또는 등가의 서브유닛을 포함함;
(ii) X2는 페닐알라닌이 아님;
(iii) 올리고펩타이드 화합물은 1개 이상의 D-아미노산을 포함함;
(iv) 올리고펩타이드 화합물은 1개 이상의 신호 서열, 즉 올리고펩타이드 화합물이 특정 위치, 예컨대 세포(예, 올리고펩타이드 화합물을 세포로 향하게 하는 세포 통과 서열) 및/또는 특정한 세포내 구획(예, 올리고펩타이드 화합물을 핵으로 향하게 하는 핵 위치화 신호)으로 향하게 지시하는 서열을 포함함; 및
(iv) 올리고펩타이드 화합물은 모티프 [K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](서열번호 27)를 포함함.
특히, 이러한 일 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물은 핵 위치화 신호 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물은 세포 통과 서열(세포 통과 펩타이드)를 포함한다. 또다른 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물은 세포 통과 서열과 핵 위치화 서열을 포함한다.
따라서, 이러한 구현예에서, 본 발명의 화합물은, 위에서 명시된 바와 같은, PCNA 상호작용 모티프를 하나 이상의 신호 서열과 함께 포함하는, 올리고펩타이드 화합물을 함유(즉, 포함)하는 구조체의 형태를 취할 수 있을 것으로 보인다. 이러한 측면에서, 본 발명은, PCNA와 상호작용하며, X1 및 X1'가 독립적으로 염기성 아미노산 그룹으로부터 선택되고 X2가 친지성 아미노산이고, X3 및 X3'이 독립적으로 비하전된, 바람직하게는 비극성 아미노산 그룹으로부터 선택되는, 모티프 X1X2X3X3'X1 ' (서열번호 1)와, 하나 이상의 신호 서열을 포함하는, 올리고펩타이드 화합물을 포함하는, 구조체를 제공할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 신규한 모티프는 올리고펩타이드 화합물(예, 펩타이드) 또는 이러한 모티프를 함유하는 단백질과 PCNA의 상호작용을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
상호작용은 직접 또는 간접적일 수 있으며, 모티프의 PCNA로의 직접 결합을 포함하거나, 또는 모티프는 간접적으로 결합할 수 있으며, 예컨대 결합은 다른 분자에 의해 매개될 수 있다. "PCNA 상호작용" 또는 "PCNA-결합"은 따라서 모든 상호작용 형태를 포함하며, 직접 및 간접 결합 모두를 포함할 수 있다.
본원에서, "모티프"는 본원에서 정의된 X1X2X3X3'X1 '을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직하게는, X1 및 X1'는 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 오르니틴(Orn), 메틸라이신(MeK) 및 아세틸라이신(AcK) 중에서 선택되며, 더 바람직하게는 K, R 및 H, 또는 K 및 R이며;
X2는 바람직하게는 방향족 아미노산, 더 바람직하게는 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 타이로신(Y), tert .-부틸글리신, 사이클로헥실알라닌, tert .-부틸페닐알라닌, 바이페닐알라닌 및 트리 tert .-부틸트립토판(특정 구현예에서, 이 리스트에서 F를 제외할 수 있음) 중에서 선택되며, 특히 F, W 및 Y, 또는 W 및 Y, F 및 Y, 또는 F 및 W이고, 또는 특정 구현예에서 X2는 F, 또는 W 또는 Y일 수 있으며;
X3 및 X3'는 바람직하게는 지방족 아미노산이고, 예컨대 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 발린(V), 알라닌(A), 메티오닌(M) 및 노르루신(Nor) 중에서 선택될 수 있으며;
바람직하게는, X3 및 X3'는 둘다 A가 아니며, 더 바람직하게는 X3 및 X3'는 L, I, V 및 M으로부터 선택되며, 보다 더 바람직하게는 L, I 및 V로부터 선택된다.
PCNA에 대한 모티프의 결합은, 특정 구현예에서, X2가 W 또는 Y일 때, 향상될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, X2는 F가 아니다. 그러나, 전술한 바와 같이, 다른 구현예에서, X2는 F일 수 있다.
따라서, 본 발명은, 모티프 [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (서열번호 28)를 포함하며, PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물을 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](서열번호 29)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (서열번호 30)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (서열번호 31)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (서열번호 32)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (서열번호 33)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (서열번호 34)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (서열번호 35)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](서열번호 36)로 정의될 수 있다.
다른 구현예에서, 모티프는 [K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](서열번호 37)로 정의될 수 있다.
올리고펩타이드 화합물은 바람직하게는 분리된 화합물이다.
바람직한 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물은 서열 RFLVK (서열번호 2)를 가지거나 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물은 KFLLR (서열번호 3), KYLLR (서열번호 4), KWLLR(서열번호 5), KYILR (서열번호 6), KYVLR (서열번호 7), RFLLR (서열번호 8), RYLLR (서열번호 9), RWLLR (서열번호 10), RYILR (서열번호 11), RYVLR (서열번호 12), RFLIR (서열번호 13), RYLVR (서열번호 14) RWLMR (서열번호 15), RYVLR (서열번호 16), RYVIR (서열번호 17), RWLVK (서열번호 18), RYLVK (서열번호 19), RWLIK (서열번호 20), RWIVK (서열번호 21), RWVVK (서열번호 22), RWAVK (서열번호 23), RYVVK (서열번호 24), RYLIK (서열번호 25) 또는 RYLMK (서열번호 26)로부터 선택되는 서열을 가지거나 포함한다. 이러한 특이 서열들은 예시적으로 열거된 것이며, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물은 또한 상기 모티프를 특이적인 세포 타입으로 타겟화시키고, 상기 화합물의 세포로의 도입을 용이하게 하고, 및/또는 상기 화합물의 특정 세포내 구획, 바람직하게는 핵으로 위치화시키는, 신호 서열을 포함한다.
따라서, 상기 신호 서열은, 상기 올리고펩타이드 화합물을 임의의 원하는 위치, 예컨대 임의의 원하는 세포내 또는 서브세포내 위치로 위치화시키거나 또는 있게 하거나, 또는 향하게 하거나, 전위시키거나 또는 이동시키도록 작용하는 임의의 서열로서 볼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 원하는 위치는 세포(즉, 세포의 내부) 및/또 세포의 핵이다.
따라서, 신호 서열은 올리고펩타이드 화합물을 세포내로 또는 세포막을 통과하여(즉, 세포의 내부로) 이동시키도록 작용하는 서열일 수 있다. 따라서, 이른바 "세포 통과" 서열(또는 보다 상세하게는 "세포 통과 펩타이드") 역시 단백질 전이 도메인(PTD) 또는 단백질 전이 서열로 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구현예는, (i) 전술한 APIM 모티프(즉, PCNA-상호작용 모티프)를 포함하는 올리고펩타이드 화합물, 및 (ii) 세포 통과 서열(보다 상세하게는, 세포 통과 펩타이드)를 포함하는 구조체이다.
세포 통과 펩타이드(CPP) 기법은 최근 크게 발전하여, 다양한 세포 통과 펩타이드가 당해 기술 분야에 공지 및 공개되어 있으며, 실제 여러가지 이러한 펩타이드를 상업적으로 이용할 수 있다. 세포 통과 펩타이드는 크기, 서열 및 전하와, 실제 이의 작용 메카니즘(현재 일부 펩타이드에 대해서는 알려져 있지 않으며 다른 것에 대해서도 완전히 밝혀지지는 않았음) 측면에서 매우 다양할 수 있지만, 원형질막을 통해 전위할 수 있으며 부착 또는 조합된 모이어티(이른바 "카고(cargo")를 세포질 또는 어떤 경우에는 세포의 핵으로 전달할 수 있는 공통된 능력을 공유하고 있다. CPP는 따라서 펩타이드계 전달 벡터이다.
CPP는, 초파리 호메오박스 단백질 Antennapedia(전사 인자) 등의 세포막을 통과하여 전위할 수 있는 천연 단백질, HIV-1 전사 인자 TAT 및 HSV-1 유래의 캡시드 단백질 VP22 등의 바이러스 단백질로부터 유래될 수 있으며, 및/또는 이는 예컨대 키메라 단백질 또는 폴리아르기닌 등의 합성 폴리펩타이드로부터 합성될 수 있다. 전술한 바와 같이, 전이 작용을 담당하는 단일 메카니즘은 없으며, 그래서 CPP의 설계는 여러가지 구조 및 서열을 기초로 할 수 있다. 세포 통과 펩타이드는 Jarver et al. 2006 Biochimica et Biophysica Acta 1758, pages 260-263에서 논의되었으며, 하기 표 2에는 다양한 대표적인 펩타이드가 나열되어 있다. US 6,645,501에는 사용할 수도 있는 다양한 세포 통과 펩타이드가 기술되어 있다.
CPP 서열 참고문헌
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기타 펩타이드
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antennapedia-유래 CPP (Antp 클래스)는 표 2에 나타낸 바와 같이 약 16개의 아미노산 페네트라틴 서열을 기초로 하는, 특히 관심을 끄는 클래스이며, antennapedia 단백질의 3번째 루프에 해당되며, 단백질의 전위를 담당하는 것으로 확인된 부분이다. 페네트라틴은, 특히 약학적 용도 등, 전달 비히클로서 널리 개발되었으며, 매우 다양한 페네트라틴 유도체들과 변형된 서열들이 제안되고 개시되었다. 특히, WO 91/1891, WO 00/1417, WO 00/29427, WO 2004/069279 및 US 6,080,724에 언급되어 있다. 따라서, 페네트라틴의 16개 아미노산 서열을 변형 및/또는 절단시키거나, 또는 펩타이드를 화학적으로 변형시거나, 또는 펩타이드를 화학적으로-변형시키거나, 또는 세포 통과 활성을 유지하면서, 레트로-, 인버스-레트로 또는 레트로-인버스 유사체를 제조할 수 있다.
유용하게 사용될 수 있는 세포 통과 펩타이드의 다른 그룹은, HIV-TAT 서열을 기본으로 하며, HIV-TAT와 이의 단편은 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 CPP 클래스이다. 다양한 TAT-기반의 CPP는 US 5,656,122에 개시되어 있다. 하기 실시예들에서 사용되는 예시적인 HIV-TAT 펩타이드는 RKKRRQRRR (서열번호 71)이며, 이것은 더 길거나 짧은 TAT 단편을 사용할 수 있는 것으로 쉽게 이해될 것이다.
전술한 바와 같이, 특정 구조적 특성 또는 서열 모티프는 모든 CPP에서 공통적인 것은 아니다. 그러나, 다양한 CPP 클래스는, 예컨대 양쪽 친매성의 전체가 양으로 하전된 펩타이드와 같은, 특정한 특성에 의해 동정할 수 있다. 다른 CPP 클래스는 알파-나선 함량이 높은 구조를 가질 수 있다. 다른 그룹은 염기성 아미노산의 함량이 높은 것이 특징인 펩타이드일 수 있다. 따라서, CPP는, 아르기닌과 같은 염기성 아미노산으로 구성된 올리고머, 예컨대, 5 - 20, 6 - 15 또는 6 - 12개의 R 잔기들, 예컨대, R7 (서열번호 70), R8 (서열번호 72) 또는 R11 (서열번호 73) 또는 QSR8 (서열번호 74)이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
프롤린이 풍부한 양쪽 친매성 펩타이드는 또 다른 CPP 클래스이며, 프롤린 유래의 피롤리딘 고리의 존재가 특징적인 이러한 펩타이드는 Pujals et al. 2008 Advanced Drug Delivery Reviews 60, pages 473-484에 기술되어 있다.
그외 성공적으로 개발된 CPP로는, pVEC (Elmquist et al. 2003 Biol. Chem 384, pages 387-393; Holm et al. 2005 Febs Lett. 579, pages 5217-5222) 및 칼시토닌-유래 펩타이드(Krauss et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, pages 51-54)가 있다.
상업적으로 이용가능한 CPP로는, Pep-1 펩타이드(Active Motif, France) 유래의 Chariot, 프로테그린 펩타이드 PG-1(Syntem, France)을 근간으로 한 Syn-B 벡터, 및 미국 Genospectra사의 MPG 펩타이드를 근간으로 한 Express-si Delivery가 있다.
공개적으로 이용가능하며 보고된 CPP 뿐만 아니라, 신규한 또는 유도체 CPP 펩타이드들을 설계하고, 공지의 또는 보고된 기준을 토대로 합성할 수 있다(예, 전술한 바와 같이, 공지의 CPP 서열 또는 염기성 아미노산의 함량, 알파-나선 함유 등의 특성). 추가적으로, 랜덤 설계된 또는 기타 펩타이드들을, 예컨대 리포터 분자, 예컨대 형광 검출가능한 테그와 같은 검출가능한 표지 또는 테그를 포함하는 펩타이드를 예컨대 원하는 카고(cargo)(본 발명에 따른 올리고펩타이드 화합물)에 커플링 또는 부착하고, 이 구조체가 세포 막을 통과하여 전위되는지를 테스트함으로써, 예컨대 살아있는 세포에 이들 펩타이드를 넣고 예컨대 공초점 현미경을 이용하여 세포내 유입을 검경함으로써, CPP 활성에 대해 탐색할 수 있다.
실제, CPP는 사실상 임의의 세포 타입을 통과 또는 도입하는 경우가 일반적이지만, 일부 경우에서는, 충분한 또는 효과적인 전달은 카고(예, 카고 펩타이드 서열) 및/또는 사용되는 CPP의 실제 성질에 의존하거나 또는 의존하여 바뀔 수 있는 것으로 관찰할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자의 일상적인 기술 수준내에서, 최적의 펩타이드 서열 및 조합 등을 결정하고, 카고 및/또는 CPP 서열 또는 구조 등을 테스트 및/또는 변형시킬 수 있을 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물(또는 구조체) 내에 포함시킬 수 있는 신호 서열은, 특정 세포 내부 구획, 특히 핵으로 화합물(또는 구조체)을 향하게 하는 신호 서열일 수 있다. 핵 위치화 신호(NLS)는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 문헌에 널리 기술되어 있으며, 임의의 공지된 또는 기능성 NLS가 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는, (i) 본원에서 정의된 APIM 모티프(즉, PCNA-인터칼레이팅 모티프)를 포함하는 올리고펩타이드 화합물 및 (ii) 핵 위치화 신호를 포함하는 구조체이다.
NLS는 길이 및/또는 서열이 다양할 수 있으며, 매우 다양한 특이적인 NLS 서열들이 서술되어 있다. 그러나, 일반적으로, 양으로 하전된 아미노산(특히, 라이신(K), 아르기닌(R) 및/또는 히스티딘(H))을 포함하는 펩타이드가 NLS로서 기능할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, NLS의 예는, 예컨대 4-20, 보다 구체적으로 4-15, 4-12, 4-10 또는 4-8개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 이때, 아미노산 4개(및 보다 상세하게는, NLS 펩타이드에서 아미노산 잔기들의 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 또는 90%) 이상이 양으로 하전된 아미노산, 바람직하게는 K, R 또는 H로부터 선택될 수 있다. 이러한 예시적인 NLS는 예컨대 서열 RKRH (서열번호 75)를 가지거나 포함할 수 있다.
실제 실험으로 결정하고 예측 또는 제안한 NLS 서열 둘다를 포함하는 핵 위치화 신호, 및 NLS를 동정하는 전략들은 Lange et al., J. Biol. Chem. 2007, 282(8), 5101-5105; Makkerh et al., Current Biology 1996, 6(8), 1025-1027; Leslie et al., Methods 2006, 39, 291-308; 및 Lusk et al. Nature Reviews MCB 2007, 8, 414-420에 개시되어 있다.
고전적인 NLS는 염기성 아미노산들로 구성된 1(단일) 또는 2(이중) 가닥으로 구성된다. 단일 NLS는 SV40 라지 T 항원 (126PKKKRKV132 [서열번호 76])으로 예시될 수 있으며, 이중 NLS는 뉴클레오플라스민 NLS (155 KRPAATKKAGQAKKKK170 [서열번호 77])로 예시될 수 있다. 단일 NLS 컨센서스 서열 K-[K/R]-X-[K/R] (서열번호 78)이 제안되었고, 따라서 본 발명에 따른 NLS는 일 구현예에서 그러한 컨센서스 서열(X는 임의의 아미노산임)을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 대표적인 이중 NLS는 서열 KR-[X]5-20-KKKK (서열번호 79), 예컨대, KR-X10-KKKK (서열번호 80) (X는 임의의 아미노산임)를 가질 수 있다.
다른 예시적인 이중 NLS는 형태 RKRH-[X]2-10-KK (서열번호 81), 예컨대, RKRH-X2-KK(서열번호 82), 예컨대 RKRH-II-KK (서열번호 83) 형태를 취할 수 있다.
온코단백질 c-myc NLS는, 9개의 아미노산 잔기 중 3개만 염기성(PAAKRVKLD [서열번호 84])이라는 점에서 고전적인 NLS와 다른데, 이는 NLS가 상기 표시한 컨센서스 또는 고전 서열과 반드시 일치될 필요는 없다는 것을 의미한다. Makkerh et al (상기 참조)에는, 염기성 아미노산 클로스터(예컨대, KKKK [서열번호 85])의 측면에, 예컨대, PAAKKKKLD (서열번호 86)으로, 중성 및 산성 잔기가 있는 NLS 서열이 기재되어 있다.
예로 제공할 수 있는 다른 가능한 NLS 서열은 하기 서열을 포함한다: PKKKRKVL (서열번호 87), KKKRK (서열번호 88), KKKRVK (서열번호 89), KKKRKVL (서열번호 90) 및 RKKRKVL (서열번호 91). 공지된 NLS, 예컨대 SV40, 뉴클레오플라스민, UNG2 또는 c-mys NLS의 유도체인, 임의 NLS를 사용할 수 있다.
추정의, 제안된 또는 예측된 NLS 서열은, 당해 기술 분야에 공지되고 개시된, 원칙과 분석 방법을 이용하여 NLS 활성에 대해 테스트할 수 있다. 예컨대, NSL 후보 서열을 원하는 카고(이러한 경우, 본 발명에 따른 전술한 올리고펩타이드)에 부착할 수 있으며, 구조체는 검출가능한 리포터 분자(예, 가시화할 수 있는 테그 또는 표지 물질, 예컨대, 형광 표지물)와 함께 제공하여 타겟 세포에 접촉시킬 수 있다. 그런 후, 세포내 구조체의 분포를 결정할 수 있다.
따라서, 종합하여, 당업자들은 적합한 신호 서열을 알고 있을 것이지만, 예로, 본원에서는 하기 서열을 언급한다. 세포 통과 펩타이드 서열의 예는, Antennapedia 단백질의 호메오도메인의 3번째 나선에 해당되는 16개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 Penetratin™, R이 풍부한 테그, 예컨대 R6-페네트라틴(아르기닌잔기들이 페네트라틴의 N-말단에 추가됨) 및 HIV Tat 단백질의 유도체. 예컨대 GRKKRRQRRRPPQQ (서열번호 92)를 포함한다. 핵 위치화 서열의 예는 SV40 단백질 유도체 KKKRK (서열번호 93)를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 구조체는, (i) 본원에 정의된 APIM 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물, (ii) 핵 위치화 신호, 및 (iii) 세포 통과 신호 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 구조체의 개별 인자들과 구성 성분들은, 임의의 순서, 바람직하게는, 상기 기재된 순서(예, APIM 올리고펩타이드 화합물-CPP; APIM 올리고펩타이드 화합물-NLS; APIM 올리고펩타이드 화합물-NLS-CPP)로 포함되거나 존재할 수 있다.
나아가, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물 또는 구조체는 2개 이상의 PCNA-상호작용 모티프를 포함할 수 있다. 따라서, 다른 예로, 본 발명에 따른 구조체는 PCNA-상호작용 모티프를 포함하는 2개 이상의 올리고펩타이드 화합물을 포함할 수 있다. 구조체 또는 올리고펩타이드 화합물은 예컨대 모티프를 1-10, 예컨대, 1-6, 또는 1-4 또는 1-3 또는 1 또는 2개를 포함할 수 있다. 또한, 신호 서열을 포함하는 구조체 내부에, 이러한 모티프는 선택에 따라, 이격되어 있거나 또는 위치될 수 있으며, 예컨대 이들은 집단을 이룰 수 있거나, 또는 이는 신호 서열 인자들, 예컨대, 모티프-NLS- 모티프-CPP; 또는 모티프-NLS-모티프-모티프-CPP; 또는 모티프-모티프-NLS-CPP 등에 의해 분리되어 있을 수 있다. 본 발명에 따른 구성 성분 또는 인자는, 임의의 바람직한 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 기법들에 따른 간편한 방법으로 서로 부착 또는 연결될 수 있다. 따라서, 구성 성분 또는 개별 파트들은 예컨대 공지의 화학적 커플링 기술을 이용하여 화학적으로 연결 또는 접합될 수 있으며, 또는 구조체는 유전자 조작 기법, 예컨대 융합 단백질을 형성하기 위한 기법을 이용하여 전체가 하나로 형성될 수 있거나, 또는 펩타이드 합성 기법을 이용하여 전체로서 간단하게 합성될 수 있다.
개별 파트 또는 구성 성분들은 서로 직접 연결될 수 있거나, 이들은 하나 이상의 링커(또는 스페이서) 서열을 이용하여 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 링커 서열은, 올리고펩타이드 구조체에서 구조체의 2개 이상의 개별 파트들, 또는 개별 모티프 인자들 사이를 채우거나 분리시킬 수 있다. 링커 서열의 명확한 성질은 핵심적인 것은 아니며, 가변적인 길이 및/또는 서열일 수 있으며, 예컨대 0-40, 더 상세하게는 0-20, 0-15, 0-12, 0-10, 0-8, 또는 0-6, 0-4 또는 0-3개의 잔기, 예컨대 1, 2 또는 3개 이상의 잔기를 가질 수 있다. 대표적인 예로, 링커 서열은 존재한다면 1-15, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6 또는 1-4개 등의 잔기를 가질 수 있다. 잔기의 성질은 결정적인 것은 아니며, 예컨대 임의의 아미노산, 예컨대 중성 아미노산, 또는 지방족 아미노산일 수 있으며, 또는 다른 예로, 소수성, 극성 또는 하전된, 또는 구조를 형성하는, 예컨대 프롤린일 수 있다. 짧은(예, 1-6) 중성 및/또는 지방족 아미노산 서열 등의 여러가지 다른 링커 서열이 유용한 것으로 확인되었다.
따라서, 예시적인 링커 서열은 임의의 단일 아미노산 잔기, 예컨대, A, I, L, V, G, R, Q, T, 또는 W, 또는 이들 잔기들로 구성된 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사-펩타이드를 포함한다.
대표적인 링커로서, I, II, IL, R, W, WW, WWW, RIL, RIW, GAQ, GAW, VAT, IILVI (서열번호 94), IILVIII (서열번호 95) 등을 언급할 수 있다.
여러가지 인자들 사이의 링커들은 동일하거나 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 서열 MDRWLVKRILVATK (서열번호 96) 또는 MDRWLVKRILKKKRKVATKG (서열번호 97)을 가지거나 또는 포함하는, 올리고펩타이드 화합물을 제공한다.
본 발명의 다른 예시적인 화합물(또는 보다 상세하게는 구조체)은 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 98), MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK (서열번호 99), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG (서열번호 100), MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK (서열번호 101), MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK (서열번호 102), MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK (서열번호 103), MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (서열번호 104), MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK (서열번호 105), MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 106), MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK (서열번호 107), MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK (서열번호 108), MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK (서열번호 109), MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK (서열번호 110), Ac-MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK (서열번호 111), Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (서열번호 112), Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR (서열번호 113), Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK (서열번호 114), Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR (서열번호 115), MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK (서열번호 116), KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM (서열번호 117)을 포함한다.
서열번호 98 내지 117에 기재된 서열을 가진 올리고펩타이드 화합물은 상기 실시예 6의 표 3에 기재되어 있으며, 표 3에는 구조체를 구성하는 개별 구성 성분(즉, 모티프-함유 서열, 링커, NLS, CPP 등)을 보여준다. 따라서, 서열번호 98-117은 1개 이상의 모티프-함유 서열, NLS 및 CPP를 포함하며, 일부 경우에는, 명시된 바와 같이 서열이 다양할 수 있는 링커 서열에 의해 연결된, 구조체를 나타내는 것을 알 것이다. 서열번호 117 (RI-MDR26-3)은 D-아미노산으로 구성된 레트로-인버스 펩타이드이다. SV40 또는 UNG2 NLS를 기반으로 하는 NLS 서열이 사용되며, 페네트라틴, HIV 또는 R이 풍부한 펩타이드를 기반으로 하는 CPP 서열이 사용된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 정의된 서열번호 1을 가지거나 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 이러한 핵산 분자의 상보체를 제공한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 1을 가지거나 포함하는 펩타이드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 또한 핵산 분자는 상기 명시된 신호 서열을 코딩한다.
본 발명의 핵산 분자는 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 800개 미만, 더 바람직하게는 700개 미만, 650개 미만, 600개 미만, 550개 미만, 500개 미만, 450개 미만, 400개 미만, 350개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만, 150개 미만, 100개 미만 또는 50개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 핵산 분자는 바람직하게는 분리된 분자이다.
다른 측면은, 본원에 명시된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 벡터는, 복제 오리진, 항생제 내성 등의 선별 마커 및/또는 다중 클로닝 부위 등, 벡터에서 전형적으로 발견되는 다른 인자들을 포함할 수 있다. 벡터는, 또한 발현 벡터일 수 있으며, 핵산 분자의 발현을 위해, 다른 인자, 예컨대 전사 및/또는 번역 통제 또는 조절 인자를 포함할 수 있다. 이러한 통제 인자, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합부, 인핸서, 종결자 등은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 광범위하게 기술되어 있다.
벡터는 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 일 수 있으며, 바람직하게는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노바이러스-부속 바이러스로부터 선택된다.
다른 측면은 상기 기술된 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 래트, 뮤라인 또는 인간 세포이다.
"재조합"은, 핵산 분자 및/또는 벡터가 숙주 세포에 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포는 핵산 분자의 내인성 카피를 천연적으로 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있지만, 핵산 분자 및/또는 벡터의 외인성 또는 다른 내인성 카피가 도입된 재조합일 수 있다.
다른 측면에서는, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 본원에 기술된 벡터와, 약물학적으로(또는 약학적으로) 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
부형제는 당해 기술 분야에 공지된 임의 부형제, 예컨대 임의의 담체 또는 희석제, 또는 완충제, 항산화제, 킬레이터, 결합제, 코팅제, 붕괴제, 충진제, 향료, 색소, 활택제, 윤활제, 보존제, 흡수제 및/또는 감미제 등의 임의의 다른 성분이나 제제를 포함할 수 있다.
부형제는, 예컨대 락트산, 덱스트로스, 소듐 메타바이설페이트, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 미세결정 셀룰로스, 락토스, 스타치, 키토산, 미리 젤라틴화한 스타치, 칼슘 카르보네이트,. 칼슘 설페이트, 덱스트레이트, 덱스트린, 덱스트로스, 다이베이직 칼슘 포스페이트 다이하이드레이트, 트리베이직 칼슘 포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 말토덱스트린, 만니톨, 셀룰로스 분말, 소듐 클로라이드, 소르비톨 및/또는 탈크로부터 선택할 수 있다.
약학 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 임의 형태로, 예컨대 정제, 캡슐제, 코팅 정제, 액체, 현탁제, 탭(tab), 사케트(sachet), 임플란트, 흡입제, 분말, 펠렛, 에멀젼, 동결건조제, 발포제(effervescent), 스프레이, 고약((salve), 에멀젼, 향유, 경고제 또는 이의 임의 혼합형태로 제공될 수 있다. 이는, 예컨대 위액-내성 조제물 및/또는 지속 작용 형태로서 제공할 수 있다. 이는, 경구, 비경구, 국소, 직장, 생식기, 피하, 경요도, 경피, 코내, 복막내, 근육내 및/또는 정맥내 투여용으로 및/또는 흡입에 의한 투여에 적합한 형태일 수 있다.
대표적인 구현예에서, 약학 조성물은 리포좀 투여에 적합한 형태이며, 바람직하게는 약학 조성물을 함유하는 리포좀이 제공된다. 리포좀을 사용하는 경우, 추가적인 부형제를 반드시 포함하지는 않을 수도 있으며, 그래서 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 본원에 기술된 벡터를 함유하는 리포좀이 제공된다.
데이타베이스 검색을 이용하여, 본 발명자들은, 대부분 DNA 복구, 유지 및 세포 주기 조절, 예컨대 전사, 복제, 인산화, 유비퀴틴화, 트랜스 병변 합성, 딸 염색분체 유착 및 세포 주기 조절에 참여하는, 200개 이상의 다른 단백질에 새로운 PCNA 결합 모티프가 존재하고 있다는 것을 발견하였다(표 1 및 실시예 4). 이러한 단백질들은 하기 사항을 포함한다:
- TFIIS 연장 인자에서 발견되는 보존된 N-말단 도메인을 포함하고 있는 기능 미확인 단백질로서, 전사 진행을 느리게 하는데(stalled transcription) 중요한 단백질, 그래서 본 발명자들은 이것을 TFIIS-유사 단백질라고 명하였다. 이 단백질은 7개의 N-말단 아미노산 내부에 모티프를 포함한다.
- 세포 주기 조절 및 생장에 경쟁적인, 다기능성 전사 인자 TFII-I. TFII-I를 과다 발현하는 세포는 γ-H2AX 위치 영속성이 증가되어(DNA 이중 가닥 파괴의 마커), 이는 DNA 복구에서 TFII-I에 대한 역할을 시사한다. 이 단백질은 4개의 모티프를 함유하고 있다.
- 복제 후 DNA 연결 해체(decatenation) 및 DNA 분리에서 작용하는 DNA 토포이소머라제 II 알파(Topo II 알파). 이 단백질은 모티프 1개를 포함한다.
- 나선형 꼬임을 인지하는 주요 뉴클레오티드 삭제 복구 단백질 XPA. 이 단백질은 모티프 1개를 포함한다.
- 적절한 센트로좀 기능과 염색체 분열에 중요한 것으로 확인된 상동성 재조합 단백질 RAD51B. 이 단백질은 모티프 1개를 포함한다.
- 판코니 빈혈 복합체 단백질, FANCC. FA 코어 복합체는 가교제의 DNA 복구를 조절하는 DNA 손상-활성화된 시그널링 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 모티프 1개를 포함한다.
1개 이상의 모티프를 포함하는 것으로 확인된 추가적인 단백질은 표 1에 나열되어 있다.
이론에 의해 결부되고자 하는 것은 아니며, 본 발명자들의 발견에 따르면, PCNA가 이것의 통상적인 파트너 1종 이상과 상호작용하는 것을 방지함으로써, 세포가 세포증식 억제제의 작용에 민감하게 될 수 있다. 따라서, 세포증식 억제제의 작용을 조절할 수 있다. 예컨대, 복구 단백질과 PCNA의 상호작용을 저해할 수 있으며(예, hABH2), 그로 인해 DNA 복구가 저해되며, 그 결과 DNA 손상에서의 세포증식 억제제의 효과를 증가시킬 수 있다.
따라서, 다른 측면은, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 본원에 기술된 벡터를 필요로하는 개체에게 투여하는(특히 유효량으로 투여하는) 단계를 포함하는, 질환 또는 상태, 특히 세포 생장이 저해되는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환, 또는 세포증식 억제 요법이 필요하거나 이에 반응하는 임의의 상태의 치료 방법을 제공한다.
다른 측면은, 치료법에 사용하기 위한, 특히 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법(즉, 세포증식 억제제의 사용)을 포함하는 모든 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 본원에 기술된 벡터를 제공한다. 따라서, 화합물 등은 세포증식 억제 요법이 필요하거나 또는 반응하는 모든 상태의 치료에 이용할 수 있다.
다른 측면에서, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 모든 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 본원에 기술된 벡터의 용도를 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 도달한 놀라운 사실은, PCNA-상호작용 모티프를 가진 펩타이드를 사용하여 다양한 세포증식 억제 약물의 효과를 강화 또는 높일 수 있으며, 그로 인해 아마도 광범위한 범위의 단백질들, 예컨대 DNA 복구와 복제 및 세포 주기 진행 등에 참여하는 단백질과 PCNA의 상호작용을 저해할 수 있다는 것이다. 이로써, 임의의 PCNA 상호작용 분자를, 세포증식 억제제의 효과를 강화하거나 또는 세포를 그 효과에 민감하게 되도록 하기 위해, 세포증식 억제제와 조합하여 사용할 수 있다는, 일반적인 제안을 도출한다.
따라서, 또다른 측면은, 필요한 개체에게, PCNA과 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물 또는 PCNA과 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 투여와, 세포증식 억제제의 개별, 동시 또는 연속 투여를 포함하는, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료 방법, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
다른 측면으로, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료에 세포증식 억제제와 조합하여 사용하기 위한, PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
즉, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료에, 세포증식 억제제와 조합하여 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 용도를 제공한다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 약제는 세포증식 억제제를 더 포함할 수 있다.
상기 약제는 올리고펩타이드 화합물 또는 핵산 분자와 세포증식 억제제를 포함하는, 단일 조성물 형태일 수 있거나, 또는 개별(예, 동시 또는 순차적) 투여를 위해 이들을 포함하는 키트나 제품 형태일 수 있다.
따라서, 또한, 세포의 질환, 예컨대 과증식성 질환의 치료, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료용 약제 제조에 있어서의, PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 용도를 제공하며, 상기 약제는 세포증식 억제제와 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법을 포함하는 치료에, 개별, 동시 또는 연속 사용하기 위한 조합된 조제물로서, 세포증식 억제제와 함께, PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를, 포함하는 제품을 제공한다.
PCNA와 상호작용할 수 있는 올리고펩타이드 화합물, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하거나 가지는 올리고펩타이드 화합물을 사용하여 세포증식 억제제의 효능을 조절 또는 높일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 올리고펩타이드 화합물(구조체 포함)은 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한(또는 유익할 수 있는), 모든 상태 또는 임상적인 상태에 치료학적 용도를 가진다.
용어 "저해한다"는 세포의 생장의 임의의 경감 또는 감소, 뿐만 아니라 세포 생장의 방지 또는 폐지를 포함하는 것으로 광범위하게 사용된다. 따라서, "저해"는 세포 생장의 경감 또는 방지를 포함한다. 이는, 세포 수, 크기(예, 세포가 포함된 조직의 크기), 세포 생활성 및/또는 세포 사멸 등을 당해 기술 분야에서 잘 알려진 기법들에 의해 측정할 수 있는 바와 같이, 측정 또는 평가하는 등의, 임의의 적합한 또는 편리한 수단에 의해 측정할 수 있다.
세포의 "생장"은 본원에서 넓은 의미로, 특히 세포의 증식 등의 세포 생장의 모든 측면에서 사용된다.
따라서, 올리고펩타이드 화합물은 세포 생장(특히, 세포 증식)의 감소에 반응하는, 모든 상태(광의적으로 모든 질환 또는 모든 임상적인 상태를 포함함)의 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 올리고펩타이드 화합물은, 세포 생장(또는 증식)을 타겟하는 임의의 치료법(또는 치료)에 활용성이 있다. 즉, 화합물은 세포 상태을 저해하는 것이 바람직한 또는 유익한 임의의 치료학적 적용에 이용할 수 있다.
용어 "치료"는 본원에서 광의적으로 임상 상태의 조치에 유익한 임의의 효과 또는 단계(또는 개입)를 의미하며, 따라서, 치료학적 및 치료학적 치료를 모두 포함한다. 치료는, 치료 중인 상태 또는 상태의 한가지 이상의 증상, 또는 치료 전의 증상의, 경감, 완화, 개선, 진행 서행 또는 제거, 또는 개체의 임상 상태를 개선시키는 임의의 방식을 포함한다. 치료는 치료 프로그램 또는 요법에 제공되는 또는 일부분인 임의의 임상 단계 또는 개입을 포함할 수 있다. 예방학적 치료는, 질환 또는 질환의 개시, 또는 이의 한가지 이상의 증상의, 예컨대 예방학적 치료를 수행하기 전의 상태 또는 증상에 상대적인, 지연, 제한, 경감 또는 예방을 포함할 수 있다. 따라서, 예방은 명확하게 상태 또는 이의 증상의 발생 또는 병의 절대적 예방, 및 상태 또는 증상의 개시 또는 진행의 임의 지연, 또는 상태나 증상의 진행 또는 진전의 감소 또는 제한을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는, 세포의 생장 사멸, 저해 또는 서행, 또는 세포 집단 또는 세포체(예, 조직, 종양 또는 생장)의 크기 증가, 세포 수 감소, 세포의 (예, 다른 해부적학 부위로의) 전파 예방, 세포 생장의 크기 감소 등을 포함한다. 용어 "치료"는 세포 생장, 또는 세포들의 생장의 치유 또는 완전한 무효나 제거, 또는 세포의 생장을 내포하는 것은 아니다.
본 발명의 치료적 이용 및 활용은 일반적으로 세포 증식 저해를 포함하기 때문에, 임의의 증식성 세포가 본원에 기술되고 내포된 치료법 및 이용들에서 타겟이 될 수 있다. 이러한 증식성 세포는 건강하거나 병에 걸린 세포 및 증식이 이루어지는 임의 조직의 세포를 포함할 수 있다. 예컨대, 그러한 세포는, 악성 및 비-악성 신생물 세포들과 면역계의 세포(면역 세포), 일반적으로 조혈계 세포 또는 피부 세포 등의, 특히 신생물 세포를 포함할 수 있다.
비정상적인 또는 원치않은 세포 생장을 수반하는 질환 또는 상태는 세포증식 억제제로 치료할 수 있으며, 세포증식 억제제는 세포를 사멸 또는 제거하는 것이 바람직한 상황 등의, 세포 생장 및 상태를 감소 또는 예방하는 것이 바람직한, 임의의 상황에 사용할 수 있다. 따라서, 전술한 바와 같이, 본 발명의 (구조체 포함) 올리고펩타이드 화합물은 세포증식 억제제의 사용을 수반(또는 포함)하는 임의의 치료 방법에 이용할 수 있다. 이러한 것으로는, 세포증식 억제제에 반응하는 임의 상태, 또는 세포증식 억제제의 사용으로 치료되거나 사용이 필요한 임의 상태의 치료를 포함할 수 있다.
과증식성 질환의 치료는 특히 흥미로운 측면이다. 용어 "과증식성 질환"은 광의적으로 세포의 바람직하지 않거나 원치않은 증식 증가를 수반하는 임의의 질환 또는 상태를 포함한다. 따라서, 세포의 증식이 예컨대 정상적이거나 건강한 세포, 또는 문제되는 증상이 없는 세포에 비해(예, 건강하거나 대조군 개체에 비해 또는 상대적으로, 또는 동일 개체에서 건강하거나 질병이 없는 조직으로부터 취한 세포에 비해 또는 상대적으로) 증가된, 상태, 뿐만 아니라, 세포 증식이 정상 이상으로는 증가(또는 크게 또는 현저하게 증가)되진 않지만 이루어지는 증식이 일반적으로 또는 특정 상황에서 원하지 않거나 바람직하지 않은, 상태가 포함된다. 이는, 예컨대 "정상" 반응에서 이루어질 수 있는, 예컨대 면역 반응 또는 염증성 반응 등의, (즉, 특정 (예컨대 정상) 상태에서 발생할 수 있지만 원하지 않을 수 있는 "정상" 반응), 세포의 원하지 않거나 바람직하지 않은 증식을 포함할 수 있다. 이러한 원하지 않는 증식성 반응은 예컨대 원하지 않는 염증성 반응, 또는 자가면역 반응 또는 알레르기 반응 등의 원하지 않는 면역 반응을 초래하는 세포의 증식일 수 있다.
본 발명에 따라 타겟이 될 수 있는 과증식성 질환은 따라서 명확하게 염증(보다 상세하게는, 염증성 질환 또는 상태, 또는 염증을 수반, 조합 또는 특징인 상태) 및 자가 면역 질환 또는 상태, 또는 자가면역 성분을 취하는 질환 또는 상태를 포함한다.
과증식성 질환은 자율적인 생장 능력을 가진 세포, 즉 정상적인 조절 메카니즘과 독립적으로 존재하고 생산하는 세포의 증식을 (비제한적으로) 포함할 수 있다. 과증식성 질환은 따라서 신생물 질환일 수 있으며, 전술한 바와 같이, 악성 또는 비-악성 질환일 수 있다.
과증식성 세포는 병리적(즉, 정상 세포에서의 이탈 및 질병 상태가 조합됨) 또는 비-병리적(즉, 정상 세포로부터 이탈되었지만 질병 상태와 조합되지 않음)으로 분류할 수 있다. 병리적 과증식성 세포는, 다음의 질환 상태나 질환들롸 조합되거나 이것이 특징일 수 있다: 재협착증, 당뇨병성 신장병, 갑상선 과형성, 그레이브씨 질환, 건선, 양성 전립선 비대증, Li-프라우멘티 증후군 및 암(모든 종양 또는 악성 종양 포함).
비-병리적 과증식성 세포의 예는 수유기의 유방관 상피 세포와 또한 상처 복구와 연관된 세포를 포함한다.
본 발명의 화합물은 당뇨병성 신장병 및 말초 혈관 질환 등의, 그러한 질환 및 질병 등의 치료에 유용할 수 있다.
과증식성 질환은 전술한 바와 같이 악성 또는 비-악성 신생물 질환일 수 있다. 또한, 전-악성 또는 비-악성 신생물 질환이 포함된다. 전-악성 또는 비-악성 또는 비-악성 과증식성 질환의 예는 골수 이형성 질환, 경부암-인-시츄, 가족성 장 용종(예, 가드너 증후군), 구강 백색증(oral leukoplasia), 조직구 증식증, 켈로이드증, 혈관종, 과증식성 동맥 협착증, 염증성 관절염, 각막 비후증 및 구진인설 발진(papulosquamous eruption), 예컨대 관절염을 포함한다. 또한, 사마귀 및 EBV-유도성 질환(예, 감염성 단핵구증) 등의 바이러스-유도성 과증식성 질환, 흉터 형성 등이 포함된다.
따라서, 과증식성 질환은, 암과 같은 신생물 질환, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환과 같은 위 과증식성 질환, 건선 등의 피부병, 레이터씨 증후군, 모공성 홍색 비강진 및 각화증 질환의 과증식성 변이증으로부터 선택되는, 임의의 과증식성 질환일 수 있다.
암은 특별히 관심을 두는 과증식성 질환이며, 모든 타입의 암, 예컨대 고형암과 혈액암이 포함된다. 대표적인 타입의 암은, 경부암, 자궁암, 난소암, 췌장암, 신장암, 담낭암, 간암, 두경부암, 편평 세포암, 위장암, 유방암, 전립선암, 고환암, 폐암, 비-소 세포 폐암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병(예, 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병), 뇌암(예, 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종), 신경모세포종, 육종, 결장암, 직장암, 위암, 항문암, 방광암, 췌장암, 자궁내막암, 형질구종, 림프종, 망막 아종, 윌름씨 종양, 유잉 육종, 흑색종 및 그외 피부암을 포함한다.
또한, 동 종양(sinus tumour), 요도암, 생식기-요도암, 식도암, 골수종, 내분비암, 골육종, 혈관 육종, 및 섬유 육종과, 말초 또는 중추 신경계, 악성 및 양성, 예컨대 교종 및 신경모세포종도 언급할 수 있다.
자가면역 질환 또는 질병은 특히 관심을 가지는 다른 증상으로, 예컨대 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 로푸스(SLE; 루푸스) 또는 중증 근무력증을 포함한다.
또한, 일반적으로 관심을 가지는 것은, 반드시 악성 또는 암성(예, 다양한 혈액이상(dyscrasias), 또는 이형성증, 비-악성 과형성증, 육아종 또는 MGUS(미결정 유의성 단일클론 감마병증)일 필요는 없는, 혈액 질환, 또는 혈액 질환 이나 골수 질환이다. 따라서, 혈액 또는 골수 세포, 또는 이의 전구체의 원하지 않는, 바람직하지 않는 또는 비정상적인 증식을 수반하는 임의의 상태를 본 발명에 따라 치료할 수 있다.
특히 언급할 수 있는 그외 상태로는, 신생물성 수막염 및 골증식성 질환, 예컨대 적혈구 증가증(과다 적혈구 세포가 생성될때 발생되는)을 포함한다.
또한, 다양한 상태들은 염증 또는 자가면역 질환의 결과로서 발생하거나, 또는 이와 조합될 수 있다. 또한, 이러한 상태들은 본 발명에 따라 치료할 수 있다. 특히, 경화성 점액수종, 구진성 점액증, 아밀로이드증 및 베그너의 육아종증을 언급할 수도 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물을 세포증식 억제제의 효능을 증대 또는 높일 수 있다. 즉, 이는, 세포증식 억제제가 사용될 수 있는 임의의 치료적 적용에 용도를 찾을 수 있다. 이는, 질환에 걸린 세포만을 포함하지 않을 수 있는 세포를 사멸 또는 제거하는 것이 바람직한 임의의 상황을 포함할 수 있다. 특히, 이러한 상황은, 이식하기 전에 골수를 제거하는 것이 바람직한 경우에 생긴다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 예컨대 골수 이식, 또는 더 일반적으로는 조혈 줄기 세포 이식(HSCT), (뿐만 아니라 골수로부터, 조혈 줄기 세포는 또한 혈액, 예컨대 말초 혈액으로부터 수득 또는 유래될 수 있음)일 수 있는, 골수 말소(myeloablation), 특히 이식 전의 골수 말소에 사용할 수 있다.
줄기 세포 이식은, 악성 또는 비-악성일 수 있는, 혈액 또는 골수(즉, 혈액학적 상태 또는 질환)의 질환 또는 상태, 및 그외 특정 타입의 암, 예컨대 신경모 세포종, 결합조직 형성 소형 라운드 세포 암, 유잉 육종 및 융모막 암종과 같은 고형 종양 암의 치료에 사용할 수 있다. 비-약성 혈액 질환으로는, 식세포 질환(예, 골수 이형성증), 빈혈(예, 중증 발육 부전증 또는 재생 불량성 빈혈), 및 골수증식성 질환(예, 적혈구 증가증 및 본태성 혈소판 증가증)을 포함한다. 줄기 세포 이식에 의해 치료할 수 있는 다른 후천성 상태로는, 아밀로이드증과 같은 대사성 질환 및 방사성 중독과 같은 환경-유발성 질환을 포함한다. 줄기 세포의 이식은 또한, 다양한 리소좀 저장 질환, 면역 결핍증 및 비-악성 혈관 질환, 예컨대, 빈혈, 혈구 감소증(cytopenias), 혈구탐식성 증후군, 혈색소 변증, 겸상 세포 질환 및 베타 주 지중해성 빈혈의 치료에 사용될 수 있다.
방사선치료(또한, 방사성 치료법 및 방사성 종양학이라 함)를, 전술한 과증식성 질환 등의 다양한 상태 치료에 사용할 수 있다. "방사선치료"는 DNA 체인을 구성하는 원자를 직접 또는 간접적으로 이온화함으로써 세포의 DNA를 손상시킬 수 있는 이온화 방사선의 사용을 의미한다. 간접 이온화는 물의 이온화의 결과로서 발생되어 유리 라디칼, 특히 하이드록실 라디칼이 생기며, 그런 후 DNA가 손상된다. 가장 일반적인 방사선치료 형태에서, 대부분의 방사선 효과는 유리 라디칼을 통해 이루어진다.
방사선치료는 프로그래밍된 세포 사멸의 활성화 또는 영구적인 DNA 이중가닥 파괴로부터 초래되는 세포독성 효과로 인해 병리 조직의 제거 및 암 치료에 유용하다. 이온화 방사선 조사는 종양 및 암 세포 등의 과증식성 세포가 세포자살에 의해 생체내 및 시험관내 세포 사멸을 초래한다.
공교롭게도, 방사선치료는 주변 정상 조직에 대한 허용불가한 고위험성의 손상없이 종양 세포를 사멸시키기에 충분히 높은 국소 방사선 선량을 전달하는 것은 대체로 불가능하기 때문에, 환자에게서 암 세포를 완전히 제거하는 것은 종종 성공하지 못한다. 또한, 세포가 방사선-유도성 세포 사멸에 대한 배우 다양한 감수성을 보이며, 이온화 방사선은 또한 포스파티딜이노시톨 3-키나제/Akt(PI3K/Akt) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 신호 전달 경로를 통해 프로-생존 반응 메카니즘을 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이온화 방사선의 작용에 대해 세포를 민감화함으로써 방사선치료법의 효능을 강화시킬 필요가 있다.
즉, 본 발명의 화합물을 사용하여 이러한 민감화 효과를 제공할 수 있으며, 즉 방사선치료 효과를 강화(또는 다른 예로 증가, 증대 또는 높임)시키거나, 또는 개체(또는 보다 상세하게는, 개체에 존재할 수 있는 세포)가 방사선치료 효과에 높은 감수성을 가지게 할 수 있다. 따라서, 이것은 방사선치료가 사용되는 모든 치료학적 적용에 이용성을 가질 수 있다. 이는, 오직 질병에 걸린 세포만 포함하지 않을 수 없는 세포를 사멸 또는 제거하는 것이 바람직한, 모든 상황을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 따라서 DNA를 손상시키는 이온화 방사선의 효과에 대한 세포의 민감화제로서 사용할 수 있다. "민감화제"는 세포에 대한 DNA 손상성 이온화 방사선의 효과를 강화시키기 위해 본 발명의 화합물을 사용하는 것을 의미한다. 이는, 내인성 세포 DNA 복구 메카니즘의 저해에 의해 달성할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 방사선치료와 조합 사용하기 위한, PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물(보다 구체적으로는 본원에 기술된 PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물), 또는 상기 PCNA 상호작용 모티프를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 화합물은 방사선치료와 별개로, 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 방사선치료는, 상기 화합물과 더불어, 방사선 치료에 반응하거나 이를 필요로하는 모든 상태의 치료에 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 구조체는 따라서, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 치료에, 또는 방사선치료를 수반하는 모든 치료에 사용할 수 있다.
다른 예로, 정의된, 본 발명은, PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물(보다 구체적으로는 본원에 기술된 PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물), 또는 상기 PCNA 상호작용 모티프를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를, 방사선치료의 민감화제로서 제공하며, 상기 화합물은 방사선치료와 별개로, 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
또한, 본 발명의 이러한 측면은, 개체에게 본원에 기술된 본 발명의 올리고펩타이드 화합물을, 특히 상기 개체(또는 세포 또는 조직)를 방사선치료에 민감하게 하기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체(또는 특히 상기 개체의 세포나 조직)를 방사선치료에 민감하게 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 측면은, 개체에게 방사선치료를 본원에 기술된 본 발명의 올리고펩타이드 화합물과 병용하여 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 이러한 방법은, 방사선치료에 반응하거나 이를 필요로하는 질환 또는 상태, 또는 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태의 치료 방법, 또는 방사선치료를 수반하는 치료 방법일 수 있다.
본 발명은 고식적 외부 방사선치료(Conventional external beam radiotherapy), 정위 방사선치려( Stereotactic Radiotherapy), 가상 시뮬레이션, 3차원 공초점 방사선치료, 세기-조절성 방사선치료 및 방사선 동위원소 치료(RIT) 등의 모든 타입의 방사선치료를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본원에 기재된 측면들 중 임의의 측면에 대한 바람직한 일 구현예에서, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 및/또는 벡터는 방사선치료와 함께(동시에, 별개로 또는 순차적으로) 사용된다.
본원에 기재된 측면들 중 임의의 측면에 대한 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 및/또는 벡터는 세포증식 억제제와 함께(동시에, 별개로 또는 순차적으로) 사용된다.
"세포증식 억제제"는 동물 세포의 생장 및/또는 배가(복제/증식)를 저해 또는 억제할 수 있는 제제를 의미한다.
세포증식 억제제로서, 세포독성 물질, 항-신생물제 및 종양 또는 혈액 적용이 지시될 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 따라서, 화학치료학적 치료 프로토콜("화학치료제")에 사용되는 제제가 포함된다.
세포증식 억제제는 전형적으로 작용 메카니즘에 따라 서로 다른 4개의 클래스로 그룹화되며, 이 클래스 모두 본원에 포함된다. 따라서, 세포증식 억제제는 알킬화제, 가교제, 인터칼레이팅제, 뉴클레오티드 유사체, 방추선 형성 저해제 및/또는 토포이소머라제 I 및/또는 II의 저해제를 포함할 수 있다. 다른 유형 또는 클래스의 제제는 항-대사산물, 식물성 알칼로이드 및 테르페노이드, 또는 항-종양 항생제를 포함한다. 바람직하게는, 알킬화제이다.
알킬화제는 뉴클레오시드를 알킬화하여 정확한 DNA 복제가 안되게 함으로써 DNA 변형시킨다. 뉴클레오티드 유사체는 복제 중에 DNA로 삽입되어 DNA 합성을 저해한다. 방추선 형성 저해제는 방추선 형성을 파괴시켜, 중기 동안에 세포분열을 정지시킨다. 인터칼레이팅제는 DNA 염기 사이를 인터칼레이팅하여, DNA 합성을 저해한다. 토포이소머라제 I 또는 II의 저해제는 DNA의 비틀림에 영향을 주어 DNA 복제를 방해한다.
적합한 세포증식 억제제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예로, 액티노마이신 D, BCNU (carmustine), 카보플라틴, CCNU, 캄포테신 (CPT), 칸타리딘, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 다우노루비신, 독세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에토포시드, 게피니팁, 겜시타빈, 이포스아미드, 이리노테칸, 이오노마이신, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신 C (MMC), 미토잔트론머캅토퓨린, 옥살리플라틴, 파클리탁셀 (taxol), PARP-1 저해제, 탁소테르(taxotere), 테모졸로미드(TZM), 테니포시드, 토포테칸, 트레오설판, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 5-아자시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 5-플루오로우라실이 본원에서 언급된다. 당업자는 임의의 주어진 세포증식 억제제에 대해 적합한 투여량 범위를 알 것이며, 일 구현예에서, 세포증식 억제제는 약학 조성물로 존재하거나, 또는 전형적인 투여량 범위로 개체에게 투여된다. 유익한 구현예에서, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터는 세포가 세포증식 억제제에 민감하게 하기 때문에, 낮은 용량의 세포증식 억제제를 제시/사용할 수 있으며, 그래서 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터와 조합 사용하였을 때, 저용량의 세포증식 억제제는 고용량의 세포증식 억제제 자체와 동일하거나 상응하는 치료 효과를 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터, 예컨대, 질환, 영양 불량 등으로 약화된 노인, 유아 및 어린이, 또는 사람 등의, 세포증식 억제제에 대한 낮은 허용성 또는 평균 보다 낮은 허용성을 가지는, 개체를 치료할 수 있게 한다.
과증식성 질환을 치료하기 위해 세포증식 억제제를 이용할 때 대면하는 문제는, 전형적으로 질병에 걸린 세포가 모두 사멸되진 않는다는 것이다. 세포증식 억제제 및 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터를 함께 사용하였을 때, 질병에 걸린 세포가 높은 비율으로 사멸되며, 일 구현예에서, 질병에 걸린 세포를 매우 높은 비율로, 예컨대 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 사멸, 가장 바람직하게는 질병에 걸린 세포 모두를 실질적으로 사멸시키기 위해, 전형적인 용량 보다 높은 용량의 세포증식 억제제를 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터와 함께 사용한다.
전술한 바와 같이, 본원에 기술된 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 및/또는 벡터를 세포증식 억제제와 함께 사용하였을 때, 2가지 다른 제제들은 동일한 약한 조성물에 존재할 수 있으며, 또는 이는 별개로 투여할 수 있다. 개별 투여는 실질적으로 동일한 시간에, 그러나 상이한 투여 경로를 통해 또는 상이한 위치에 투여함으로써 투여되는 것을 포함한다. 또한, 개별 투여는 상이한 시간에, 예컨대 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 12시간 각격으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
개체는 동물(즉, 임의의 인간 또는 인간을 제외한 동물), 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다.
당업자는 올리고펩타이드 화합물, 핵산 및/또는 벡터를 세포에 도입하는데 적합한 방법을 인지할 것이다. 예컨대, 몇가지 적합한 방법들이 하기에 간략하게 논의되어 있다. 상기에 상세하게 언급된 바와 같이, 펩타이드-매개의 전달 방법은, 특히 전술한 바와 같이, 짧은, 일부 경우에, 다양이온성 서열인 세포 통과 펩타이드(CPP)를 사용할 수 있으며, 이 서열은 예컨대 포유류 세포의 엔도좀으로의 흡수를 강화시킴으로써 CPP를 포함하거나 CPP에 연결된, 펩타이드, 단백질 또는 뉴클레오티드 분자의 세포내 흡수를 촉진시킬 수 있다. 마이크로캡슐화는, 생활성 물질을 보호하고 봉입된 물질이나 조절된 양상으로 그 산물의 분비하기 위한 목적으로, 반투과성의 폴리머막 내부에 생활성 물질을 봉입하는 간단하고 비용-효율적인 방식을 제공한다. 광화학 내재화(PCI)에서, 대상 분자와 감광성 화합물 둘다 세포에 의해 리소좀이나 엔도좀으로 취해진다. 그런 후, 세포는 상기 감광성 화합물을 활성화시키는 적합한 파장의 광에 노출되어, 감광성 화합물이 리소좀이나 엔도좀의 막을 파괴하게 유도함으로써 세포의 세포질로 대상 분자가 분비된다.
다른 방법들은 미세주입, 적혈구 세포 고스트-매개 융합, 리포좀 융합, 피노좀의 삼투성 용혈, 스크랩 로딩, 전기영동, 칼슘 포스페이트 및 바이러스-매개 형질감염 및 공중합체 담체의 이용을 포함한다.
키토산 및 수용성 키토산 유도체, 특히 글리콜 키토산은 이들의 생체내 생체친화성 및 생분해성으로 인해 선택 약물 담체로서 떠오른다. 바람직한 예는 5베타-콜란산으로 소수성으로 변형된 글리콜 키토산이다.
본원에서는 표준적인 1문자 아미노산 코드를 사용하며, 그래서 K는 라이신(Lys)이고, I는 이소루신(Ile) 등이다.
본 발명의 올리고펩타이드 화합물은, 본원에서 "비-코드화 아미노산"으로 칭해지는, 표준 유전자 코드에 의해 코드화되지 않는, 측쇄를 가진, 1개 이상, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산을 포함할 수 있다. 이것은 대사 과정을 통해 형성되는 아미노산, 예컨대 오르니틴 또는 타우린, 및/또는 인위적으로 변형된 아미노산, 예컨대 9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐 (Fmoc), (tert)-(부)틸 (옥)시 (카)르보닐 (Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (Pmc) 보호된 아미노산, 또는 벤질옥시-카르보닐 (Z) 기를 가진 아미노산 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 비-코드화된 아미노산이 존재하는 경우 이는 모티프 내부에 위치되지 않고, 일 구현예에서, 1개 이상의 비-코드화된 아미노산이 모티프 내부에 존재한다.
본 발명의 올리고펩타이드 화합물의 시험관내 및/또는 생체내 안정성은 당해 분야에 공지된 안정화 또는 보호 수단을 통해, 예컨대 보호기나 안정화기를 추가하거나, 아미노산 유도체나 유사체를 투입하거나, 또는 아미노산의 화학적 변형을 통해, 향상 또는 강화시킬 수 있다. 이러한 보호기 또는 안정화기는, 예컨대 N 및/또는 C-말단에 첨가할 수 있다. 이러한 기의 예는 아세틸기 및 그외 보호기이거나, 펩타이드를 안정화시키는 기는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 올리고펩타이드 화합물은 전형적으로 L-배위를 가진 아미노산만 포함할 것이지만, D 배위를 가진 하나 이상의 아미노산도 존재할 수 있다. 바람직하게는, 올리고펩타이드 화합물은 D-아미노산을 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게는 모티프에서 발견되며, 다른 구현예에서, D 아미노산은 모티프 외부에만 존재한다. 올리고펩타이드 화합물은 선형 또는 환형일 수 있다.
따라서, 특히 본 발명의 올리고펩타이드 화합물의 인버스 올리고펩타이드 화합물 또는 인버스 유사체(및 보다 구체적으로 인버스 펩타이드)가 포함된다.
또한, 잔기들(예, 아미노산 잔기)이 모 또는 기준 화합물(예, 펩타이드)과 반대 방향으로 조합된, 레트로 올리고펩타이드 화합물(또는 레트로 펩타이드)이 포함된다.
레트로-인버스 올리고펩트이드 화합물은 모 또는 기준 화합물 서열에 대해 역(반대) 방향으로 D-아미노산을 포함한다. 레트로-인버스 유사체는 따라서 역위된 말단과 예컨대 펩타이드 결합들을 역위된 순으로 포함하며, 모 서열 또는 기준 서열에서의 측쇄 기하학을 대략적으로 유지한다.
본 발명의 화합물은 일부 인버스, 레트로 또는 레트로-인버스 서열을 포함할 수 있다.
"올리고펩타이드 화합물"은 펩타이드 또는 등가의 결합으로 함께 연결된, 아미노산 또는 등가의 서브유닛으로 구성된 화합물을 의미한다. 따라서, 용어 "올리고펩타이드 화합물"은 펩타이드 및 펩타이드 모방체를 포함한다.
"등가의 서브유닛"은 아미노산과 구조적으로 기증적으로 유사한 서브유닛이다. 서브유닛의 벡본 모이어티는 표준 아미노산과 다를 수 있으며, 예컨대 하나 이상의 탄소 원자 대신 1개 이상의 질소 원자를 포함할 수 있다.
"펩타이드 모방체"는 펩타이드와 기능적으로 등가이거나 유사한 화합물로, 이의 펩타이드 카운터파트와 유사한 3차 구조를 가질 수 있지만, 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산으로만 구성되지 않는다. 펩타이드 모방체의 바람직한 클래스는 펩토이드, 즉 N-치환된 글리신이다. 펩토이드는 이의 천연 펩타이드 카운터파트와 매우 유사하지만, 그 측쇄가 아미노산에 있는 알파-탄소가 아닌 분자의 벡본 상에 있는 질소 원자에 부착되어 있다는 점에서 화학적으로 다르다.
바람직한 구현예에서, 올리고펩타이드 화합물의 적어도 일부분 이상의 모티프 파트는 펩타이드 결합만 포함하며, 바람직하게는 코드화된 아미노산으로만 구성된다. 가장 바람직하게는, 올리고펩타이드 화합물은 펩타이드이다.
올리고펩타이드 화합물은 디-아미노산 및/또는 베타-아미노산을 포함할 수 있지만, 적어도 일부분 이상의 모티프 파트는 바람직하게는 알파-아미노산으로만 구성된다. 가장 바람직하게는, 올리고펩타이드 화합물은 알파-아미노산으로 구성된다.
접두사 "올리고"는 아미노산과 같은 서브유닛의 수가 상대적으로 적은, 즉 200개 미만, 바람직하게는 100개 미만, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 60개 미만 또는 50개 미만의 서브유닛을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물은 5개 이상 200개 이하의 서브유닛을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 서브유닛을 포함한다. 다른 예로, 이것은 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 29개 이하, 28개 이하, 27개 이하, 26개 이하 또는 25개 이하의 서브유닛을 포함한다. 따라서, 대표적인 서브유닛의 범위는 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-12, 5-10 등이고, 5-20 및 5-30이 바람직하다.
올리고펩타이드 화합물이 5개 이상의 서브유닛을 포함하는 경우, 모티프 바깥의 서브유닛의 특성은 결정적이지 않으며, 그래서 모티프 바깥 서브유닛은 천연 단백질들에서 발견되는 것, 예컨대 hABH2이거나, 또는 이는 알라닌 잔기이거나 또는 임의의 다른 적합한 잔기들 일 수 있다.
펩타이드 모방체는 전형적으로 환자의 신체 내부에서 긴 반감기를 가지므로, 이는 효과가 장기적으로 지속되는 것이 바람직한 경우에 바람직하다. 이는 화합물을 재투여하여야하는 횟수를 줄이는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 생물-안정성의 이유로, 짧은 반감기가 다른 경우에는 바람직할 수 있으며, 그러한 경우에 펩타이드가 바람직하다.
본 발명의 올리고펩타이드 화합물은 보다 큰 유닛의 일부분을 형성할 수 있으며, 예컨대 이것은 폴리펩타이드에 융합되어 재조합 융합 단백질을 형성하거나, 또는 스캐폴드에 부착되어 펩타이드 앱타머를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물이 함유된 융합 단백질 및 앱타머는 본 발명의 다른 측면이 된다. 또다른 측면은, 상기 융합 단백질 또는 앱타머를 포함하는 약학 조성물과, 상기 융합 단백질 또는 앱타머의 전술한 치료 방법 또는 치료법에서의 용도를 포함한다.
이론에 결부되고자 하는 것은 아니며, 최적의 DNA 복구, 유지 및/또는 세포 주기 조절을 위해, 수종의 단백질은 PCNA와 상호작용하여야 하며, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물은 PCNA와 상호작용하기 위한 컨센서스 모티프를 가진 단백질과 경쟁할 수 있는 것으로 생각된다. 최적의 DNA 복구, 유지 및/또는 세포주기 조절을 위한 신규한 모티프를 통해 PCNA와 상호작용해야할 수 있는 단백질의 예들은 표 2에 기술되어 있으며, 그래서 단백질은 DNA 중합효소, DNA 라이가제, 토포이소머라제, DNA 복구 단백질, DNA 복구 관련/상호작용 단백질, 딸 염색분체 유착에 관여하는 단백질, 염색질 리모델링, DNA 결합, 유비퀴틴 프로세싱 또는 SUMO 프로세싱, E3 유비퀴틴 라이가제, 전사 인자, 세포 주기 조절자, 단백질 키나제, 메틸트랜스퍼라제, 아세틸-트랜스퍼라제, 암 관련 항원, 구조 단백질 또는 센트로좀 키네신일 수 있다.
본 발명의 올리고펩타이드 화합물이 충분한 수준으로 세포 내부에 존재하는 경우, 이들 단백질 한가지 이상의 활성은 경쟁적인 저해로 인해 감소되거나 심지어 없어진다.
본원에 언급된 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터는 그 자체가 효소 활성은 없으며, 세포에 무독성인 것으로 간주된다(실시예 2 참조). 따라서, PCNA-상호작용 모티프를 포함하는 본원에 언급된 본 발명의 펩타이드의 발현이, 이를 발현하는 세포의 생장에 효과가 없거나 또는 단지 약간의 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이는 발현 수준에 따라 정해질 수 있다. 그러나, 일부 경우에는, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물이 세포독성일 수 있으며, 따라서 이들은 그 자체로 세포독성(세포증식 억제)제로서 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 본원에 논의된 상태의 치료에, 그리고 항상 반드시 그런 것은 아니지만 개별 세포증식 억제제 또는 방사선치료법과 조합하여 세포독성제로서 사용될 수 있다.
실험들을 통해, 세포에 투여한 올리고펩타이드 화합물들이 세포에 대해 세포독성 효과를 가질 수 있는 것으로 확인되었다.
세포독성 효과는 화합물의 정확한 성질, 예컨대 그것의 서열과 구성에 따라 바뀔 수 있다. 특히, 세포독성 효과는 NLS 및/또는 CPP를 포함하는 구조체로 수득할 수 있으며, NLS와 CPP 모두를 포함하는 구조체에서 관찰되었다. 강력한 세포독성 증거는 핵-위치화 구조체를 이용하여 관찰되었다.
세포독성 효과를 보이는 올리고펩타이드 화합물은 인버스, 레트로 또는 레트로-인버스 등일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 PCNA 결합 모티프를 2개 이상 포함하는 화합물 또는 구조체를 이용하여 세포독성 효과의 증가를 수득할 수 있는 것으로, 추가로 관찰되었다.
다른 측면은, 하기를 포함하는 키트 또는 약학 제품을 제공한다:
(i) 본원에 언급된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 언급된 핵산 및/또는 본원에 언급된 벡터; 및
(ii) 세포증식 억제제.
다른 측면은, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식 질환의 치료에, 또는 세포증식 억제 요법을 수반하는 치료에, 동시, 순차적 또는 개별 사용하기 위한, 조합된 조제물로서, (i) 본원에 언급된 올리고펩타이드 화합물, 본원에 언급된 핵산 및/또는 본원에 언급된 벡터, 및 (ii) 세포증식 억제제를 포함하는 제품을 제공한다.
또한, 본원에 언급된 올리고펩타이드 화합물, 핵산 및/또는 벡터를 세포 또는 세포 배양물에 시험관내 투여하는 것을 고려한다. 이러한 시험관내 방법을 이용하여 DNA 복구, 유지 및/또는 세포 주기 조절을 연구할 수 있다. 바람직한 측면에서, 시험관내 방법을 이용하여 신규한 세포증식 억제제를 동정한다. 이는 세포증식 억제제의 빠른 동정, 또는 단독으로 사용하였을 때 단지 약한 세포증식 억제성을 보이지만, 본 발명의 올리고펩타이드 화합물, 핵산 분자 또는 벡터와 조합 사용하였을 때 유용한 세포증식 억제 활성을 가지는 제제를 동정할 수 있게 할 수 있다.
본원에 언급된 신규한 PCNA 상호작용 모티프는, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환의 진단 또는 모니터링에, 또는 세포증식 억제 요법 또는 방사선치료를 수반하는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 PCNA 결합 모티프를 가진 수개의 암 관련 항원들을 발견하였다(표 1 참조). 따라서, 과증식성 장애나 또는 상기에서 논의된 다른 질환들을 진단할 수 있거나, 또는 상기 모티프를 포함하는 단백질의 발현 수준 및/또는 위치를 검출함으로써 이의 진행을 모니터링할 수 있는 것으로 생각되며, 이때 단백질의 비정상적인 수준 및/또는 위치는 질환, 예컨대 과증식성 질환을 나타낸다.
"비정상적인 수준"은 단백질의 수준 증가, 예컨대 수준이 동일한 세포 타입의 건강한 세포에서의 수준과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상 또는 40% 이상 증가된 것, 또는 단백질의 수준 감소, 예컨대 동일한 세포 타입의 건강한 세포에서의 수준과 비교하여 10% 미만, 20% 미만, 30% 미만 또는 40% 미만 감소를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 상기 모티프를 포함하는 단백질의 수준 증가는 질환, 예컨대 과증식성 질환을 의미한다.
모티프-함유 단백질의 수준은, 임의의 공지된 단백질 검출 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프에 특이적인 항체를 사용한다. 항체는 진단 방법에 사용되도록 모티프에 충분히 특이적이어야 한다(소 혈청 알부민과 같은 기준 단백질과 비해).
항체는 단일클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 이는 전 항체, 예컨대, IgG, IgA, IgE, IgM, 또는 IgD, 또는 항체의 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, ds-scFv, Fd, dAb일 수 있다.
검출 분석을 생체내 또는 시험관내에서, 예컨대 조직이나 세포 또는 체액 샘플, 예컨대 세포 용혈물, 혈청 또는 혈액으로 수행할 수 있다.
검출은, 항체를 검출가능한 물질(즉, 항체 표지)과 커플링(즉, 물질의 연결)함으로써 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, NMR 콘트라스트 제제 및 방사활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린아세테라제, 글루코스 옥시다제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 등을 포함하며, 적합한 보결기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하며, 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함하며, 발광 물질의 예로는 루미놀(luminol)을 포함하며, 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 에쿠오린(aequorin)을 포함하며, 적합한 방사활성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다. 직접적인 시각적 표지의 경우, 콜로이달 금속성 또는 비금속성 입자를 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식 질환의 진행을 개체에서 진단 또는 모니터링하는 방법을 제공하며,
상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 개체(예, 포유류)로부터 취한 테스트 샘플을, 항체-항원 복합체의 포뮬레이션을 허용하는 조건 하에서 모티프에 특이적인 항체와 접촉하는 단계;
(2) 상기 테스트 샘플내 항체-항원 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 테스트 샘플내 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계.
대조군은 동일한 개체로부터 취한 건강한 세포, 예컨대 건강한 섬유모세포일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 모티프에 특이적인 항체에 관한 것이다.
본 발명은, 세포의 생장을 저해하는 것이 바람직한 질환 또는 상태, 예컨대 과증식성 질환을 진단 또는 모니터링하기 위한 키트를 더 포함하며,
상기 키트는 상기 모티프에 특이적인 항체와 질환 또는 상태를 진단하기 위한 이의 사용 설명서를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 전술한 검출가능한 물질과 커플링되거나, 또는 키트는 그러한 검출가능한 물질을 포함한다.
다른 진단 방법은, 상기 모티프를 코딩하는 핵산 분자의 비정상적인 수준의 검출을 포함한다. 이러한 방법에서, 핵산의 수준은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 적합하게 표지된 프로브를 이용한 혼성화 기법과 같은, 적절한 검출 방법을 이용하여 모니터링한다. 본 발명은 하기 비제한적인 실시예와 도면을 참조하여 더욱 설명될 것이다.
본 발명은, 치료에 사용하기 위한, PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물 또는 상기 올리고펩타이드 화합물을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
도 1은 hABH2 및 PCNA가 공동-위치되며, hABH2의 10개의 N-말단 아미노산들이 이러한 공동-위치화에 필수적이고 충분함을 나타내는, 공초점 현미경 이미지이다. EYFP로 표지된, 다양한 hABH2 구조체(1-261개의 잔기를 가진 전장 hABH2, 11-261개의 잔기를 가진 절단형 hABH2 및 1-10개의 잔기로 구성된 hABH2의 N-말단 단편)를, ECFP-표지된 PCNA와의 공동-위치화에 대해 조사하였다(실시예 1 참조). 좌측 레인은 hABH2 단독으로 형질전환한 세포이고, 나머지 레인 3개는 hABH2 구조체와 PCNA로 공동-형질전환된 세포이다.
도 2는 FRET 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. EYFP (옐로우 형광 단백질)/ ECFP (시안 형광 단백질) (레인 1, 테그의 이량화로 인한 백그라운드), EYFP-PCNA / ECFP-PCNA (레인 2, PCNA가 PCNA에 결합하기 때문에 이에 대한 양성 대조군), hAHB2-EYFP / ECFP-PCNA (레인 3) 및 1-10N hABH2-EYFP / ECFP-PCNA (레인 4)의 정상화한 FRET (NFRET) 측정값을 나타낸다.
도 3은 hABH21 -10-EYFP를 발현하는 세포, 또는 대조군으로서 EYFP를 발현하는 세포에 대한 다양한 세포증식 억제제의 효과를 나타낸 그래프이다. 처리한 세포는 좌측에, 무처리 세포는 우측에 나타낸다. 처리는 4일간 10 μM MMS, 40 μM BCNU, 1 μM MMC 또는 600 μM TMZ을 이용하여 수행하였다(도 3a-d 각각). 나타낸 데이타는 3가지 이상의 실험에서 도출한 하나의 대표값이며, 다양한 용량에서의 세포 생장은 8개의 병렬 웰에서 테스트하였다.
도 4는 호모 사피엔스(Homo sapiens)(NP 001001655.1), 보스 나우루스(Bos Taurus)(NP 001019687.1), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(XP 222273.3),　무스 무스쿨루스(Mus musculus)(NP 778181.2), 갈루스 갈루스 ( Gallus gallus)(XP 415188.2) 및 스트롱일로센트로투스 푸르푸라투스(Strongylocentrotus purpuratus)(XP 797704.1)로부터 유래된 ABH2-상동체의 10개의 N-말단 아미노산을 Clustal W를 이용하여 서열 정열한 것이다. 서열은 공공의 데이타베이스로부터 수득하였다.
도 5는 다양한 상이한 종들로부터 실시예 4에서 동정한 단백질의 서열 정렬이다.
도 6은 실시예 7(도 6a 내지 h)에 나타낸 다양한 펩타이드를 이용한 세포독성 분석의 결과를 나타낸 그래프이다. HeLa 세포를 96웰 플레이트(6000 cells/well)에 파종하여 3시간 인큐베이션하였다. 다양한 용량의 펩타이드를 배지 중에 혈청의 존재(◆) 또는 무존재(■)하에 웰에 첨가하였다. 1시간 후, 10% 또는 20% 혈청(혈청 무첨가 배지에)이 첨가된 배지를 동일 부피로 웰에 첨가하였다. 웰을 48시간 인큐베이션한 다음, MTT 분석에 의해 세포 생존을 측정하였다. 그래프는 펩타이드 농도(μM)에 대한 세포 생장을 나타낸다(OD 750 nm).
실시예들에 사용된 실험 과정들
발현 구조체
형광 물질로 테깅된 발현 구조체 ECFP-PCNA 및 hABH21 -261-EYFP의 클로닝은 종래에 언급되었다(Aas et al., 2003). 주형으로서 hABH21 -261-EYFP를 사용하고, PCR에 의해 hABH21 -10-EYFP 및 hABH211 -261-EYFP를 제작하였다. 앰플리콘들을 각각 NdeI / AgeI 및 AgeI / EcoRI를 이용하여 pEYFP-N1 (Clonetech)에 클로닝하였다. EST (Image clone 5176979 (BC035374) RZPD)의 PCR 산물을 pEYFP-C1 (HindIII / Acc651)에 클로닝하여, EYFP-TFIIS-L을 제작하였다. EYFP-XPA 구조체는, Dr. Wim Vermeulen (Department of Cell Biology and Genetics, Rotterdam)로부터 관대하게 제공받은 His9-HA-EGFP-XPA(Rademakers et al., 2003) 에서, EYFP를 EGFP (NheI / BsrGI fragment)로 스위칭함으로써, 제작하였다. TFII-I-EYFP는, Dr. Robert G. Roeder (Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, The Rockefeller University, New York)로부터 관대하게 제공받은 pI3CX-TFII-I (Roy et al., 1993)로부터 TFII-I을 PCR 증폭하고, 이를 EYFP-N1 (SacI / ApaI)에 클로닝하여 제작하였다. EYFP-Topo-II알파는, William T. Beck (Division of Molecular Pharmacology, Department of Molecular Genetics, University of Illinois, Chicago)로부터 관대하게 제공받은 EGFP-Topo-II알파 (pT104-1)(Mo and Beck, 1999)로부터 EGFP 테그 (EcoRI 블런트 / NheI)를 EYFP 테그 (XhoI 블런트 / NheI)로 스위칭하여, 제작하였다. 올리고를 XhoI / EcoRI 오버행(overhang)과 어닐링한 다음 ATG 코돈이 돌연변이된 EYFP-N1으로 클로닝하여, F4 돌연변이를 포함하는 hABH21-7-EYFP 구조체를 제작하였다. QuickChange® II 설명서 매뉴얼에 따라 부위 특이 돌연변이를 만들어, 모든 점 돌연변이를 제작하였다. 제한 효소들과 소 장 알칼리 포스파타제(CIP)는 New England Biolabs® Inc로부터 구하였고, 올리고뉴클레오티드는 MedProbe, Eurogentech (Oslo, Norway)으로부터 구하였다. 모든 구조체들은 서열분석으로 검증하였다.
공초점 이미징 및 FRET 측정
ECFP 및 EYFP 융합 구조체를 일시적으로 형질감염시킨(Fugene 6(Roche Inc.)에 의해, 제조사의 권고안에 따라) 후 16-24시간 후에 살아있는 HeLa 세포를 조사하였다. 형광 이미지를, Plan-Apochromate 63x/1.4 유침 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 510 Meta 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 입수하였다. 연속 스캔으로, 강화된 시안 형광 단백질(ECFP)을 λ= 458 nm에서 여기시키고, λ= 470-500 nm에서 검출하였고, 강화된 옐로우 형광 단백질(EYFP)은 λ= 514 nm에서 여기시키고 λ= 530-600 nm에서 검출하였다. 슬라이스 두께는 1 ㎛이다.
테그(EYFP 및 ECFP)가 100 Å (10 nm) 미만으로 떨어져 있으면, 형광 공명 에너지 전이(FRET)가 발생한다. 감응형 방사 방법을 이용하고 어셉터(EYFP) 방사를 도너(ECFP) 여기시 측정하여 FRET를 검출하였다. ECFP 형광 발색단(fluorochrome)의 여기 후 EYFP로부터 방사되는 광의 세기가, EYFP 및 ECFP 레이저 각각을 이용한 여기 후(블리드를 통해) ECFP 또는 EYFP-테깅된 단백질 단독에 의해 방사된 광 보다 강할 때, 등식: FRET= I2 - I1 (ID2/ID1) - I3 (IA2/IA3)(>0)에 의해 FRET를 구하였다. 등식: NFRET = FRET/ (I1 x I3)1/ 2을 이용하여 발현 수준에 대해 FRET를 정상화하였다. 모든 픽셀의 강도가 250 보다 낮고, 평균 강도가 도너 및 어셉터 구조체 둘다에서 100 내지 200인, 픽셀 25개 이상 포함하는 관심 영역(ROI)내 평균 강도(I)로부터 NFRET를 계산하였다. 채널 1 (ECFP) 및 3 (EYFP)의 이미지를 전술한 바와 같이 측정하고, 채널 2 (FRET)는 λ=458 nm로 여기하고 λ=530-600 nm에서 검출하였다. ECFP 및 EYFP 구조체만으로 형질전환한 세포에 대해 ID1, D2, D3 및 IA1, A2, A3를 측정하였고, 공동-형질감염한 세포와 조건을 동일하게 하고 동일한 형광 강도를 사용하였다(I1 및 I3). 양성 대조군으로서 ECFP-PCNA와 EYFP-PCNA를 포함시켰고, 공동-발현된 테그의 이량화로 인해, 빈 벡터로부터 발현되는 ECFP 및 EYFP 단백질을 모든 실험에서 음성 대조군으로 포함시켰다.
세포주의 배양 및 세포 추출물의 제조
대상 구조체를 안정적으로 발현하는 HeLa (경부 암) 및 HaCaT (자발적으로 형질전환된 각질형성세포)는, 형질전환(Fugene 6에 의해)한 후, 세포 분류 또는 희석에 의해 클로닝한 다음, 10% 소 태아 혈청(FCS), 암포테리신 (250 ㎍/ml, Sigma-Aldrich), 젠타마이신 (100 ㎍/ml, Gibco) 및 글루타민 (1 mM, BioWhittaker®)이 보충된 선택적인(젠티신 이용, G418, 400 ㎍/ml, Invitrogen) 둘베코의 변형된 이글스 배지 글루코스 고 함유 4.5 g/l (DMEM) (BioWhittaker®)에서 장기간 배양하여, 준비하였다. 세포를 5% 이산화탄소, 습윤 대기 하에 37℃에서 배양하였다. 세포 펠렛을, 1x 충전 세포 용적(PCV)로 버퍼 I(10 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 50 mM KCl)와 1x PCV로 버퍼 II(10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 20% 글리세롤, 0.5% Nonidet P-40, 10 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1x 완전한 프로테아제 저해제(Roche), 포스페이트 저해제 칵테일(PIC I 및 PIC II, Sigma)에 재현탁하여, HeLa의 분획화된 세포 추출물을 제조하였다. 세포를 30분간 4℃에서 일정하게 흔들면서 인큐베이션하였다. 상층액(가용성 분획)을 회수하였다. 펠렛(핵 함유)은 1x PCV의 버퍼 III (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 100 mM KCl) 및 1x PCV 버퍼 II에 재현탁하고, 핵들이 모두 파괴될 때까지 간단히 음파처리하였다. 핵소체-함유 분획 750 ㎍을 원심분리하고, 펠렛(염색질 결합 분획)을 버퍼 II 및 III에 재현탁하였다. 염색질 결합 분획을, DNAse / RNAse 칵테일(2 ㎕ Omnicleave® 엔도뉴클레아제(200 U/㎕, Epicentre® Biotecnologies, WI), 2 ㎕ DNAse (10 U/㎕, Roche Inc.), 2 ㎕ 벤조나제 (250 U/㎕, Novagene, Ge), 2 ㎕ 마이크로코커스의 뉴클레아제 (100-300 U/㎕, Sigma-Aldrich) 및 2 ㎕ RNAse (10 mg/ml, Sigma-Aldrich)에 실온에서 30분간, 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 가용성 분획 750 ㎍을 추가적인 2 ㎕ Omnicleave®와 함께 밤새 4℃에서 IP하는 동안 인큐베이션하였다.
공동-면역침강(co-IP) 및 웨스턴 분석(WB)
GFP 단백질에 대해 생성시키고 사내에서 친화성으로 정제하였고, 또한 EYFP 및 ECFP 단백질을 인지하는, 토끼 다클론 항체를, New England Biolabs® Inc (지금 알파-GFP 비드로 불려짐) 사의 방법에 따라 단백질-A 상자성 비드(Dynal®)에 공유 결합으로 연결시켰다. 각 분획을 알파-GFP 비드(10 ㎕)와 일정하게 흔들면서 4℃에서 밤새(IP) 인큐베이션하였다. IP한 후, 비드를 200 ㎕의, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl (pH 7.5)로 4번 헹구고, 그 사이에 얼음 위에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 후, 비드를 NuPAGE ® (Invitrogen) 로딩 버퍼 및 1 mM DTT에 재현탁하고, 열처리한 후, 10% 또는 4-12% 비스-트리스-HCl (NuPAGE®) 겔에서 분리시키고 이를 PVDF 막(Immobilon®, Millipore)으로 옮겼다. 막을 PBST(PBS + 0.1% Tween® 20) 중의 5% 저지방 건조 밀크에서 1시간 블롯킹하였다. 일차 항체, 알파-PCNA (PC10, Santa Cruz biotechnology Inc.)와 알파-GFP를 PBST 중의 1% 건조 밀크 중에 희석하고, 1시간 인큐베이션한 다음, 이차 항체, 폴리 토끼 항-마우스 IgG/HRP 및 다클론 돼지 항-토끼 IgG/HRP 각각(DakoCytomation, Denmark)과 1시간 인큐베이션하였다. 막에 화학발광 시약(SuperSignal® West Femto Maximum, PIERCE)을 처리하고, Kodak Image Station 2000R에서 단백질을 가시화하였다.
서열 분석
초기 서열 분석을 위해, Swiss-Prot 및 TrEMBL 데이타베이스를 이용하여, 대상 서열 영역과 유사한 서브-서열들을 가진 단백질들을 찾았다. 데이타베이스는 PROSITE 포맷에서 모티프를 조회하였다. Clustal W를 이용하여 대상 서열들을 정렬하였다. 부록 파일 1에 열거된 보존된 모티프들을, 유전자 오솔로스(ortholog)를 비교하여 동정하였다. Inparanoid version 5.1의 데이타 파일들을 유기체의 대표적인 서브세트에 대해 Inparanoid 웹 서버<http://inparanoid.sbc.su.se/>로부터 다운받았다. 인간 서열을 기준으로서 사용하였고, Inparanoid 처리한 fasta 파일을 로칼 툴을 이용하여 APIM 모티프에 대한 규칙적인 발현을 검색하였다. Ile, Val 및 Leu 외에도, Ala가 모티프의 3번 또는 4번 위치 중 어느 하나에서 허용되며, 양쪽 위치에 동시는 아닌, 약간 확장된 모티프 정의를 사용하였다. 총 22218개의 단백질 서열들에서, APIM 모티프에 대해 1개 이상의 히트(hit)를 가진 636개의 서열이 있었다. 이들 엔트리는 실험적으로 매치되었고, 웹 서버 <http://gpcr.biocomp.unibo.it/esldb/>로부터 다운받은 eSLDB 데이타베이스에서 세포내 위치화를 예측하였고, 핵으로 타겟팅이 지시되지 않은 349개의 엔트리는 제외하였다. 나머지 287개의 엔트리에서, 대응되는 Inparanoid 오르솔로그를 동정하였고, 대응되는 서열들을 fasts 파일에서 추출하고, 수득되는 서열 라이브러리들을 Clustal W로 정렬하였다.
Inparanoid에서 오르솔로그가 없는 24개의 엔트리들을 분석에서 제외하였다. 보존된 부위를 동정하기 위해, 2가지 다른 방법들을 병행하여 실시하였다. 제1 방법(Consensus)에서, 인간 서열에서 각 히트 위치에 대한 다중 정렬로부터 컨센서스 서열을 추정하였다. 컨센서스의 추정에 등가 심볼로서 처리된 보존적인 APIM 모티프(Ala 없음)내 컨센서스 등가 심볼을 추정할 때, 예컨대 Ile, Val 및 Leu는 단일 잔기 타입으로 처리하였다. 히트 위치가 용인되기 전에, 컨센서스에 대해 규칙적인 발현을 다시 테스트하였다. 다른 방법(Individual)에서는, 인간 서열에서 히트 위치에 대응하는 각각의 오솔로그 서브서열에 대해 규칙적인 발현을 테스트하였고, 50% 이상의 오솔로그에서 발현이 매칭된 위치들만 허용하였다. 이러한 추정에서, 갭들로만 구성된 서브서열들을 제외시켰는데, 이것은 예컨대 선택적 스플라이스(alternative splice) 변이체일 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 2가지 방법으로 거의 동일한 결과들이 도출되었고, 조합한 결과는 부록 파일 1에 나타내었다. 총 37개의 엔트리를 이러한 과정으로 제외하고, 나머지 226개의 엔트리를 열거하고 분석하였다. 결과에 사용된 단백질 내용들을 Inparanoid unprocessed human fasta file 및 Ensembl release 45로부터 취하였다. 결과 파일은 html 포맷이며, 표준 웹 브로우저로 열 수 있다.
예상된 PCNA-결합 펩타이드의 도트-블롯 분석
28 nmol 펩타이드(폰소우로 염색하여 스팟을 가시화함)의 도트를 포함하는 아미노-PEG500-UC540 시트(안정성이 개선되고 산 경화됨)를 노르웨이 오슬로 대학의 생물공학 센터의 펩타이드 합성 랩에서 준비하였다. 막을 2시간 동안 1 ㎍/ml PCNA로 탐침하고, 1차 항체(알파-PCNA, PC10)로 탐침한 다음 WB로 전술한 바와 같이 발색하였다.
세포 생존 분석
HeLa 및 HaCaT 세포를 96웰 플레이트(4000 cells/well)에 파종하여 4시간 인큐베이션하였다. 다양한 농도의, MMS (메틸 메탄설포네이트, Acros), BCNU (1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로수렘, Sigma), 테모졸로미드 (4-메틸-5-옥소- 2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로[4.3.0] 노나-2,7,9-트리엔-9-카르복스아미드, TZM, Sigma) 및 미토마이신 C (6-아미노-1,1a,2,8,8a,8b-헥사하이드로-8-(하이드록시메틸)-8a-메톡시-5-메틸-아지리노[2',3':3,4] 피롤로[1,2-a]인돌-4,7-디온 카바메이트, MMC, Sigma)를 웰에 첨가하였다. U2OS 세포를 MMS 및 TMX 단독에 노출하였다. 세포는 수확할 때까지 계속 노출시켰다. MTT 분석(Mosmann, 1983)을 이용하여 4일간 매일 세포를 회수하였다. OD를 570 nm에서 측정하였고, 6개 이상의 웰의 평균을 이용하여 세포 생존율을 계산하였다. 제시된 데이타는 하나의 대표적인 실험으로부터의 생장이고, 2번 이상 재현되었다.
실시예 1
본 실시예에 기술된 연구에서는, 복제소에서 hABH2의 위치화를 조사하고, hABH2와 PCNA 간의 직접 상호작용과 이러한 상호작용을 담당하는 hABH2의 영역을 동정한다.
살아있는 S기의 세포에서, 그린 형광 단백질이 테깅된 PCNA(EGFP)는 복제 부위를 나타내는 구분되는 개별 소를 형성하므로, 따라서 S기 마커로서 사용할 수 있다.
또한, 시안 형광 단백질(ECFP)로 테깅된 PCNA를, 옐로우 형광 단백질(EYFP)이 융합된 다양한 hABH2 결손 구조체와 공동-발현시켰다. hABH2내 1-개의 N-말단 아미노산의 삭제(hABH211 -261-EYFP)는 복제소내 PCNA과의 공동-위치화를 무효화한다는 사실을 확인하였다. 놀랍게도, 이들 10개의 아미노산을 EYFP와 융합하였을 때(hABH21-10-EYFP라는 구조체를 제공하기 위해), 이것들은 PCMA와의 공동-위치화에 충분하였다(도 2). 특히, ECFP-PCNA의 공동-발현은 전장 hABH2 (hABH21 -261-EYFP) 뿐만 아니라 hABH21 -10-EYFP의 핵 소(nuclear foci)의 위치화를, hABJ2 구조체 단독 발현하는 세포와 비교하여, 증가시켰다. 이는, hABH2의 N-말단의 10개의 아미노산에 의해 매개되는 PCNA와 hABH2 사이의 직접 상호작용을 시사한다.
hABH2와 PCNA의 근접성 정도를 조사하기 위해, 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 조사하였다. 전장 hABH2-EYFP와 hABH21 -10-EYFP는 ECFP-PCNA와 양성 FRET를 형성하였는데, 이는 형광 테크들 간의 거리가 100 Å미만임을 나타낸다. 이는, hABH2 변이체들이 ECFP-PCNA와 직접 상호작용하거나 또는 동일한 복합체를 이룸을 시사한다(도 2).
직접 상호작용을 검증하기 위해, hABH2-EYFP, hABH211 -261-EYFP, hABH21 -10-EYFP 또는 EYFP를 안정적으로 발현하는 세포의 단백질 추출물을 이용하여, 공동-면역침강 실험을 수행하였다. 각각의 융합 단백질을 면역침강시키기 위해, 항-GFP-항체를 사용하였다. 이후, 서든 웨스턴 블롯 분석을 통해, 내인성 PCNA가 hABH21 -216-EYFP 및 hABH21 -10-EYFP에 의해 아래로 끌려갔지만 hABH211 -261-EYFP 또는 EYFP에 의해서는 그렇지 않았다. 종합하면, 이들 결과들은, hABH2가 직접 PCNA와 상호작용하며, 결합 서열은 hABH2의 10개의 N-말단 아미노산내에 포함되어 있음을 의미한다.
실시예 2
hABH21-10의 hABH2 저해 능력을 테스트하였다.
hABH21 -10-EYFP 또는 EYFP 단독을 발현하는 세포주를, 알킬화제 MMS (메틸 메탄설포네이트), BCNU (카르무스틴), 테모졸로미드(TZM) 또는 미토마이신 C (MMC)에 노출시켰다. MMS는 hABH2에 의해 복구되는 3-메틸시토신(3meC) 및 1-메틸아데닌(1meA)를 유도하는 SN2 알킬화제이며, BCNU는 주로 세포간의 가교와 일부 모노-베이스 사이클릭 부가물(1,N(6)에타노아데닌)을 유도하는 O6-클로로에틸화제이다. TZM은 06G 메틸화제인 것으로 보고되어 있으며, MMC는 CpG에서 구아닌의 N-알킬화를 통한 가닥간의 가교를 야기한다.
hABH21 -10-EYFP 또는 EYFP의 과다 발현은 무처리 세포의 생장 속도를 방해하지 않았지만, hABH21 -10-EYFP의 발현은 HeLa 세포를 MMS 처리에 민감하게 하는 것으로 확인되었다. 놀랍게도, 또한, hABH21 -10-EYFP의 발현도 HeLa 세포를 테스트한 다른 세포증식 억제제 모두에 민감하게 하는 것으로 확인되었다(도 3). 이는, 증가된 민감성이, 3meC 및 1meA을 복구시키는 것으로 생각되는, hABH2의 저해에 의한 것만은 아님을 의미한다.
이전의 연구로부터, 마우스 Abh2 -/- 세포, 즉 ABH2 넉-아웃 세포가 MMS에 대해 증가된 민감성을 보이지만 BCNU에 대해선 그렇지 않다고 알려져 있다. 따라서, hABH21-10-EYFP를 발현하는 세포의 BCNU 등의 세포증식 억제제에 대한 민감성 증가는 hABH 저해만으로는 설명될 수 없다.
안정적으로 hABH21 -10-EYFP를 발현하는 HaCaT(자발적으로 형질전환된 각질형성세포) 세포 역시 MMS와 TMZ에 과민해졌다.
여러가지 알킬화제로 처리한 후 세포의 플로우 및 코메트 분석을 통해, 약물들이 세포 주기에 차별적으로 작용하며, 코메트 분석에 의해 검출되는 바와 같이 DNA 복구 중간체(어베이직 부위, SSB, DSB)를 상이한 수준 및 패턴으로 유도하는 것으로 확인되었다. MMS는 S기 정지(1일)을 유도하였고, 4시간 후에 DNA 복구 중간체의 최대 수준을 보여주었다. 그러나, MMS 처리 세포는, 2일에 정상 세포 주기 분포를 보였고, DNA 복구 중간체의 수준 증가가 없었다. MMS와 마찬가지로, TMZ 역시 4시간 후에 복구 중간체의 최고 수준을 보였지만, 세포는최대 3일까지 G2/M에서 정지되어, 여러가지 손상되 복구 패턴을 보였다. 또한, TMZ는 처리한 다른 3가지 제제 보다 가닥 파괴를 더 높은 수준으로 유도하였다. 이는, TMZ가, 임의의 베이스 제거 또는 가닥 파괴를 수반하지 않고, MGMT에 의한 직접 복구 메카니즘으로 복구되는 06메틸-G를 주로 유도하는 것으로 생각되지 때문에, 놀라운 일이었다. BCNU 처리는 1일에 일시적인 G2/M 기 정지를 유도하였으며, 복구 중간체는 매우 낮은 수준으로 확인되었는데, 이는, 가교제를 함유하는 대부분의 세포가 사멸되었음을 의미한다. 반면, MMC 처리는 1일과 2일에 S기 정지를 유도하였고, 이는 대조군 세포 보다는 hABH21 -10-EYFP 발현 세포에서 많이 나타났다. 세포는 3일에도 여전히 G2/M에서 정지되어 있었다. MMC 처리 후 코메트 분석에서 세포주들간에 유의한 차이는 관찰할 수 없었지만, 2일에 복구 중간체의 수가 가장 많았다.
일반적으로, 코메트 분석에서, EYFP와 hABH21 -10-EYFP 발현 세포들 간에 복구 중간체의 양에 있어 어떠한 유의한 차이도 검출할 수 없었다. 코메트 및 플로우 분석은, 사용한 여러가지 제제들이 상이한 세포 주기 반응들과 상이한 복구 패턴을 유도한다는 것을 보여준다. 여전히 모든 제제들이 EYFP 발현 세포 보다는 APIM 발현 세포에 대해 높은 세포독성을 보여, 복구와 세포 사멸을 조절하는데 APIM 함유 단백질 수종이 역할을 수행한다는 것을 뒷받침한다.
실시예 3
상이한 몇가지 종들로부터 유래한 ABH2의 데이타베이스 서열 정렬을 통해, 7개의 N-말단 아미노산들이 잘 보존되어 있다는 것인 확인되었다(도 4). 결합 서열을 동정하기 위해, 펩타이드-PCNA 상호작용에 있어 이들 아미노산의 중요성을 도트 블롯 분석으로 조사하였다. 특히, Arg3와 Lys7을 서로 치환할 수 있었으며, Leu5와 Val6를 서로, 또는 Ile및 Ala과 같이 PCNA에 대한 명백한 친화성에 영향을 미치지 않는 다른 지방족 아미노산을로 치환할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 완전히 보존된 방향족 아미노산 Phe4를 Tyr로 치환할 수 있었지만, 이 위치에 Ala을 두면 PCNA 결합성이 현저하게 감소되었다.
아미노산 1-2 및 8-10을 Ala으로 치환하더라도 PCNA 결합에 영향이 없었는데, 이는 펜타펩타이드 RFLVK (서열번호 2)가 핵심적인 상호작용 서열임을 시사한다.
추가 분석을 통해, 이 펜타펩타이드가 그 자체로도 PCNA 결합에 충분하지만, 측면에 있는 아미노산들이 그 상호작용을 증대시키는 것으로 나타났다.
다음으로, hABH2의 아미노산 1-7과, Phe4를 Tyr, Trp 또는 Ala으로 치환시킨, 이의 변이체들을, EYFP와의 융합된 형태로 발현시켜, PCNA와의 공동-위치화를 생체내에서 테스트하였다. 도트 블롯 분석에서 확인되는 바와 마찬가지로, 4번 위치에 방향족 아미노산을 함유하는 융합 단백질들은 ECFP-PCNA와 함께 공동-위치되었지만, 이 위치에 Ala을 가진 단백질은 그렇지 않았다.
실시예 4
Swiss-Prot 및 TrEMBL 데이타베이스를 이용하여, hABH2의 PCNA 결합을 담당하는 것으로 동정된 서열과 비슷한 서브-서열들을 가진 단백질을 탐색하였다. 쿼리로서, 컨센서스 [KR]-[FYW]-[LIVA]-[LIVA]-[KR](서열번호 30)을 이용하여, 226개의 히트를 수득하였고(표 1 참조), 이중 몇가지 인간 단백질들을 추후 분석을 위해 선택하였다..
한가지는, 7개의 N-말단 아미노산들내에서 상기 컨센서스 서열을 포함하는 hABh2와 비슷한 단백질이다. 이 단백질은, 지연된 전사(stalled transcription)를 진행시키는데 중요한 단백질인, TFIIS 연장 인자에서 발현되는 보존적인 N-말단 도메인 I도 함유하고 있다. 본 발명자들이 이 단백질을 TFIIS-유사 단백질(TFIIS-L)로 명명하였다. 이 단백질의 기능은 알려져 있지 않다.
두번째 단백질은, 4개의 컨센서스 서열을 함유하고 있는 다기능성의 전사 인자 THII-I이다. TFII_I은 세포 주기 조절과 증식에 결정적인 요소이며, TFII-I를 과다 발현하는 세포는 γ-H2AX 소의 지속성 증가(DNA 이중 가닥 파괴에 대한 마커)를 보여, DNA 복구에서의 TFII-I의 역할을 시사해준다.
하나의 컨센서스 서열을 함유하는 DNA 토포아이소머라제 II 알파 (Topo II 알파)도 조사하였다. Topo II 알파는 복제 후 DNA 해체 및 DNA 분열에서 기능한다.
또한, 나선 꼬임을 인지하는 주된 뉴클레오티드 절제 복구 단백질(NER) XPA의 내부에서 컨센서스 서열이 발견되었다.
적절한 센트로좀 기능과 염색체 분리에 중요한 것으로 확인된 상동적인 재조합 단백질인 RAD51B에서 컨센서스 서열이 발견되었다.
그외 단백질은 판코니 빈혈 코어 복합체 단백질 FANCC인데, 이것은 한개의 컨센서스 서열을 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 핀코니 빈혈(FA)은 재생불량성 빈혈, 백혈병 감수성 증가 및 가교제에 대한 과민성이 특징적인 희귀한 유전자 질환이다. FA 코어 복합체는 가교제의 DNA 복구를 조절하는 DNA 손상-활성화성 시그널링 경로에 관여하는 것으로 확인되었다.
이들 모든 단백질들에서, 상이한 종들에서 보존되어 있는 추정의 PCNA_결합 모티프가 발견되었다(도 5). 이들 5가지 단백질들 중에서, 오직 Topo II 알파와 FANCC (손상 후)만 핵의 S기 소에 BRCA1과 공동-위치화되는 것으로 보고되었고, Topo II 알파는 잠재적인 PIP-박스를 함유하는 유일한 단백질이다(QttLaFkp, aa 1277-84). 이제, 본 발명자들은 이들 단백질들의 EYFP 융합 단백질 각각 및 모두가 S기 소에 ECFP-PCNA과 공동위치함을 나타낸다.
가장 흥미로운 것으로 발견된 APIM 함유 단백질들은, DNA 복구 등의 몇가지 DNA 유지 과정에 참여하는 폴리(ADP_리보스) 패밀리(PARP-1, 2 및 4), PARP-1 파트너 및 복제 분기점(replication fork)에 의해 초래되는 기하학적 문제 해결에 관여하는 Topo II 알파 이소형 DNA 토포이소머라제 II 베타에 속한다. 더욱이, APIM은, 점 돌연변이와 큰 규모의 게놈 안정성 모두에 관여하는 트랜스병변 중합효소 ξ의 REV3L 서브유닛, DNA 복제와 복구에 모두 관여하는 DNA 라이가제 I 및 IV, 모드 세포 조기의 조절, 게놈 유지 및 완전성에 관여하는 4가지 E3 유비퀴틴-단백질 라이가제(UHRF1 및 UHRF2/NIRF, UBR1 및 2), 뿐만 아니라 드란 E3 유비퀴틴 라이가제들에서 발견된다(표 1). 흥미로운 사실은, E3 유비퀴틴 라이가제는 대체적으로 유방 종양 형성에서 유전적으로 발현적으로 변형된 것으로 확인된다. 또한, 절단형 PIP-박스를 통해 PCNA에 결합하는 효모 오솔로그 단백질이며, 적절한 딸 염색분체 유착과 인간 염색체의 구조적 유지에 관여하는 단백질인 N-아세틸트랜스퍼라제 ESCO1/EFO1과, HR을 통한 이중 가닥 파괴의 DNA 복구 및 ALT 세포에서 텔로미어의 유지에 관여하는 것으로 확인된, 인간 염색체 구조 유지 단백질 5 hSMC5에, APIM이 함유되어 있다. 마지막으로, 일반적인 전사인자 II 및 II의 몇가지 서브유닛, RNA 중합효소 II의 서브유닛, 및 세린/트레오닌 단백질 키나제에 APIM 모티프가 함유되어 있는 것으로 확인되었다(표 1).
단백질 타입/그룹 APIM을 함유하는 단백질
DNA 중합효소 Pol zeta 촉매 서브유닛 (hREV3L)1
DNA 라이가제 DNA 라이가제 I1, DNA 라이가제 IV
토포이소머라제 Topo II 알파 및 Topo II 베타2
DNA 복구 단백질 hABH2*, XPA*, PARP-13, 2 및 4, RAD51B*, FANCC*4
DNA 복구 관련/상호작용성 단백질 XPA-결합 단백질2, BRCA1/BRCA2-함유성 복합체 서브유닛 45 (prot-BRE), X-레이 조사 내성 관련 단백질 1
딸 염색분체 유착 N-아세틸트랜스퍼라제 ESCO1/EFO11, hSMC55
염색질 리모델링 및 DNA 결합 단백질 크로모도메인 헬리카제-DNA-결합 단백질 3, 4 및 5, RSF 염색질 리모델링 복합체의 p325 서브유닛, 텔로미어의 반복-결합 단백질 2 (TRF2)6
E3 유비퀴틴 라이가테 UHFR1, UHFR2, UBR1, UBR2, 링 핑거 단백질 3, 17 및 151, 가능성있는 E3 유비퀴틴-단백질 라이가제 MYCBP2
유비퀴틴 프로세싱 유비퀴틴-특이적인-프로세싱 프로테아제(FAF-X)
SUMO 프로세싱 센트린/SUMO-특이적인 프로테아제 SENP2
전사 인자 TFIIS-L*, TFII-I*, TFIIE-알파, 스테롤 조절 인자 결합성 전사 인자 2(SREBF2), TFIIIC 서브유닛 알파, TFIID 100kDa 서브유닛 (TAF5), TFIIIC 102 kDa 서브유닛 (TF3C gamma), 전사 인자-유사 단백질 MRG15 및 X (사망 인자 4-유사 단백질 1 및 2), E2F 전사 인자 7
세포 주기 조절 세포 분열 주기 관련 2, 세포 사멸의 Bcl2-상호작용성 매개체, 고환 정모세포 세포자살-관련 유전자 2 단백질
단백질 키나제 세린/트레오닌(S/T)-단백질 키나제 SRPK1 및 2, 33 및 MST4, 루신-리치 반복 S/T-단백질 키나제 1, STK23 (S/T 단백질 키나제 23), S/T 단백질 키나제 PLK3, 마이크로투불린-조합 S/T-단백질 키나제, 마이크로투불린-조합 S/T-단백질 키나제 1, P13-키나제 p110 서브유닛 감마, 인터페론-유도성 이중 가닥 RNA-의존성 단백질 키나제 활성자 A, FYVE 핑거-함유 포스포이노시티드 키나제, 포스포이노시티드 3-키나제-C2-베타, 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 5-키나제 타입 II 알파 및 베타, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 촉매 서브유닛 알파 이소형, MAPKAP 키나제 2 및 5, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 15 (MAP 15)
메틸트랜스퍼라제 H3 라이신-4 특이적인 MLL3, H3-K9 메틸트랜스퍼라제 5, 추정의 rRNA 메틸트랜스퍼라제 3
아세틸트랜스퍼라제 디아세틸글리세롤 O-아세틸 트랜스퍼라제(DGAT1)
암 관련 항원 흑색종 관련 항원 E1, MAGE E1, MAGE B18, MAGE-G1, NK-종양 인지 단백질(NK-TR), Myc-결합 단백질 관련 단백질, Myb 결합 단백질 1A, 간암-유래 성장 인자 관련 단백질 2 이소형 1, 혈청학적으로 한정된 결장암 항원 1
구조 단백질 라민-B1 및 B2, 액틴-유사 단백질 2
센트로좀, 키네신 센트로좀 단백질 110kDA (Cep110), 센트로좀 단백질 192kDa, 마이크로투불 + 말단 지시성 키네신 모터 3 (KIF3A), 키네신 중쇄 (UKHC), 카이네토코어-관련 단백질 1
굵은 체: 정상 조건이나 DNA 손상 후 복제소에 위치된 단백질. 본 연구에서* 등:
1 G. L. Moldovan, B. Pfander, and S. Jentsch, Cell 129 (4), 665 (2007).
2 Z. Lou, K. Minter-Dykhouse, and J. Chen, Nat Struct Mol Biol 12 (7), 589 (2005); A. Niimi, N. Suka, M. Harata et al., Chromosoma 110 (2), 102 (2001).
3 C. M. Simbulan-Rosenthal, D. S. Rosenthal, S. Iyer et al., Molecular and cellular biochemistry 193 (1-2), 137 (1999).
4 C. Jacquemont and T. Taniguchi, BMC biochemistry 8 Suppl 1, S10 (2007).
5 P. R. Potts, M. H. Porteus, and H. Yu, Embo J 25 (14), 3377 (2006).
6 P. L. Opresko, M. Otterlei, J. Graakjaer et al., Mol Cell 14 (6), 763 (2004).
실시예 5
실시예 4에서 연구한 단백질들에서 컨센서스 서열의 기능을 실험적으로 연구하였다. 컨센서스 서열내 방향족 아미노산 Phe를 Ala으로 치환하면 PCNA의 시험관내 상호작용과 PCNA과의 생체내 공동-위치화가 없어졌기 때문에, 대응되는 돌연변이가 전장 단백질과 유사한 효과를 가지는 지를 실험하였다. 전장 hABH2에서 Phe4를 Ala으로 돌연면이한 경우 PCNA와의 공동-위치화가 사라졌다. 4개의 모티프를 함유하고 있는 TFII-I의 경우, Phe 잔기들(F431A, F536A, F641A 및 F803A)을 각각 Ala으로, 모두 Ala으로 치환하였다. 단일 돌연변이의 경우 PCNA과의 공동-위치화가 감소되었지만, TFII-I의 컨센서스 서열 전체를 돌연변이한 경우에는 복제소에서의 PCNA과의 공동-위치화가 크게 감소되어, 동일한 단백질에 존재하는 몇가지 컨센서스 서열 모티프가 최적의 PCNA 상호작용에 기여할 수 있음을 보여준다.
참조문헌
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실시예 6
모티프(" APIM ")- 함유성 펩타이드와 신호 서열을 포함하는 구조체의 제조 및 테스트
서열번호 98-117의 펩타이드들을 표준 기법으로 합성하고, 표준 기법에 따라 형광 테그를 지시된 부분에 삽입하였다. 이 펩타이드들은 표 3에 나타내었으며, 각 펩타이드의 아미노산 서열을 나타내고, 또한 각 펩타이드(모티프("APIM")-함유성 펩타이드를 구성하는 개별 구성 성분들, NSL, CPP 및 적합한 경우, 그리고 함유된 사용 테그를 적절하게 분리하여 나타낸다. 서열번호 98 - 116의 펩타이드들은 L-아미노산으로 구성된다. 서열번호 117의 펩타이드 RI-MDR26-3는 D-아미노산으로 구성된 레트로-인버스 펩타이드이다. 표 3에 나타낸 펩타이드 모두 1개 이상의 APIM 펩타이드, NLS 및 CPP를 가진다.
다양한 실험을 착수하여, 세포에 대한 펩타이드들의 효능을 보았다. 이에, 세포를 펩타이드와 인큐베이션하여, 상기 실시예들에 기술된 기법을 기초로한 기법을 이용하여 세포에서의 펩타이드의 위치성을 결정하였다. 간략하게, 형광 테그로 표지되는 것으로 표시된 펩타이드를 세포(HeLa 세포)와 함께 배양하고, 세포의 유입을 공초점 현미경으로 검경하였다.
세포증식 억제제의 효과에 대해 세포를 민감하게 하는 펩타이드 효과를 MTT 분석과 집락형성 분석( lonogenic assay) (CFU 분석)을 이용하여 조사하였다.
펩타이드의 세포독성은 하기에 나타낸 바와 같이 MTT 분석에 의해 펩타이드 단독을 이용하여 세포증식 억제제의 부재 하에 조사하였다. 또한, 세포증식 억제제 MTT 분석에 사용된 대조군(세포증식 억제제를 첨가하지 않은 펩타이드를 이용한 대조군)으로부터 세포독성 데이타를 수득하였고, 이때 대조군 펩타이드는 더 길게 두었다(4일).
막 동성도 하기와 같이 조사하였다.
펩타이드의 안정성은, 펩타이드를 혈청이 함유된 배지에서 인큐베이션한 후 펩타이드의 MS 분석에 의해 조사하였다.
MTT 분석
HeLa 세포를 96 웰 플레이트(6000 cells/well)에 파종하여, 3시간 인큐베이션하였다. 다양한 용량의 MMS 및 시스플라틴을 웰에 첨가하였다. 24시간 후, 펩타이드를 혈청 무첨가 배지 중의 세포에 첨가하여, 1시간 인큐베이션하였다. 세포증식 억제제가 첨가된 신선한 배지를 첨가하고, 추가로 24, 48 및 72시간 둔 후 세포를 회수하였다. MTT(3-(4,50-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 세포에 첨가하여, 570 nm에서 OD를 측정하고[52]. 6개의 웰로부터 수득한 결과의 평균을 이용하여 세포 생존율을 계산하였다. 데이타는 각각의 실험으로부터 생장율로서 나타내고, 2번 이상 재현하였다.
집락형성(CFU) 분석
750개의 HeLa 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 세포증식 억제제(MMS)가 첨가된 11 ml 생장 배지 중에 접종하였다. 2일째에, 세포에 1시간 동안 혈청 무첨가 조건 하에서 펩타이드로 처리하였다. 신선한 세포증식 억제제가 포함된 신선한 배지를 10일간 다시 인큐베이션하기 위해 세포에 첨가하였다. 그런 후, 세포를 PBS 중의 6% 글루타르알데하이드로 실온에서 고정하고, PBS로 한번 헹군 다음 크리스탈 바이올렛으로 염색하여, 집락 형성 단위를 계수하였다. 50개 이상의 세포로 구성된 집락만 포함시켰다.
세포독성 분석
48시간 후의 펩타이드의 세포독성을 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. HeLa 세포를 96웰 플레이트(6000 cells/well)에 접종하여 3시간 인큐베이셔하였다. 다양한 용량의 펩타이드를 배지 중에 혈청의 존재 또는 부재 하에 웰에 첨가하였다. 1시간 후, 1X 또는 2X(무혈청 배지에)의 동일 부피의 배지를 첨가하여, 세포를 48시간 인큐베이션한 다음, MTT를 첨가하였다(상기 참조).
유세포 측정에 의한 막 독성
1시간 동안, 세포에 다양한 농도(2, 4 및 8 μM)의 펩타이드를 처리하였다. 다음으로, 프로피듐 요오드화물(PI) (PBS 중의 50 ㎍/ml)을 첨가하였는데, 세포막이 투과성이라면 이것은 DNA를 염색시킬 것이다. 분석은 FACS 칸토 유세포 측정기(BD-Life Science)에서 10분 이내에 수행하엿다.
결과는 표 4에 나타낸다. 여기서, 테그 표지된 테스트한 펩타이드들 모두, 기본적으로 CPP 및 NLS와 APIM-함유성 펩타이드로 구성된 구조체로서, 모두 핵으로 위치화되었다. 이러한 효과는 구조체의 개별 구성 요소들을 연결하는 여러가지 링커 서열들을 가진 펩타이드, 가변적인 길이의 링커를 가진 펩타이드 및 링커 서열이 없는 펩타이드에서 관찰되었다. 이러한 결과는, 링커 서열의 존재가 필수 사항은 아니며 링커 서열을 바꿀 수 있음을 의미한다.
세포증식 억제제를 이용한 MTT 및 CFU 실험의 결과에서, 세포증식 억제제의 생장 저해 효과를 증가시키는 펩타이드 효능이 확인되었다. 즉, 펩타이드는 세포가 세포증식 억제제의 효능에 민감해지게 할 수 있다. 이러한 효능은 APIM-함유성 펩타이드를 발현하는 형질전환된 세포주에서 보고된 상기 실시예 2의 결과와 유사하다.
또한, 표 4는 다수 펩타이드들의 세포독성 효과를 나타낸다. 추가적인 실험 작업(데이타 미기재)을 통해, 핵으로 위치화하는 펩타이드가 그렇지 않은 펩타이드 보다 세포독성 효과가 더 높은 것으로 나타났다. 하나의 펩타이드(MDR2; 서열번호 98)를 이용하여 수행한 막 독성 실험에서는 막 독성이 낮을 것으로 나타났는데, 이는, 펩타이드에서 관찰되는 세포독성 효과는 막 효과로 인한 것이 아님을 의미한다. 동일한 경우에서, 세포독성 효과는 펩타이드 농도가 증가된 경우(예, 1 μM에서, 펩타이드 세포독성은 확인할 수 없었으나(그러나, 세포를 세포증식 억제제에 민감하게 하는 효과는 나타남), 펩타이드 2 μM에서는 펩타이드 자체의 세포독성 효과와 민감화 효과가 나타남)에만 볼 수 잇는 것으로 관찰되었다.
또한, 표 4의 결과들은, 세포로의 도입과 핵으로의 위치화, 세포증식 억제제에 대한 세포 민감화, 및 세포독성에 있어서의, 펩타이드 효능을 여러가지 NLS 및/또는 CPP 서열들에서 수득할 수 있었지만, 이러한 효능의 크기나 정도는 다양할 수 있지만, 그 효능은 특정 NLS 및/또는 CPP 서열에 의존되는 것으로 보이지 않는 것으로 나타낸다.
표 3 및 4에 나타낸 특정 펩타이드들에 N-말단에 Ac기를 삽입하였다. 이것은 혈청 및 세포질 둘다에서 펩타이드를 안정화하기 위한 목적으로 포함시켰다. 펩타이드 MDR26-72-0 (서열번호 112)은 CFU 및 MTT 분석과 세포독성 테스트에서 우수한 안정성과 우수한 활성을 나타내었다. MDR26-72-0은 CPP로서 R-풍부 서열을 함유하고 있다. 동일하게 우수한 결과들은, CPP를 페네트라틴 또는 HIV-TAT로부터 유래 또는 이를 토대로한 CPP로 치환하고, NLS가 SV40 또는 UNG2-유래된 것인, 등가의 펩타이드들에서 수득될 수 있을 것으로 생각된다.
서열번호 펩타이드 # 전체 펩타이드 서열 APIM 서열
(서열번호)		 링커 1 NLS
(서열번호)		 링커 2
98 MDR2 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 GAQ PKKKRKVL
(123)
99 MDR27 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 GAW KKKRVK
(124)		 II
100 MDR26-0 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG MDRWLVK
(118)		 GAW KKKRK
(125)		 II
101 MDR26-1 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 GAW KKKRK
(125)		 II
102 MDR26-2 MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 RIW KKKRK
(125)		 II
103 MDR26-3 MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 WWW KKKRK
(125)		 II
104 MDR26-4 MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 WW RKRHIIKK
(126)
105 MDR26-7 MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 RIW KKKRK
(125)		 II
106 MDR26-8 MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 RIW KKKRK
(125)		 II
107 MDR26-10 MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRFLVK
(119)		 GAW RKRHIIKK
(126)
108 MDR26-72 MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK-FAM)G MDRWLVK
(118)		 W KKKRK
(125)		 I
109 MDR26-32 MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK-FAM)G MDRWLVK
(118)		 W KKKRK
(125)		 I
110 MDR26-42 MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK-FAM)G MDRWLVK
(118)		 W RKRH
(127)		 I
111 MDR24-43 MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK-FITC MDRWLVK
(118)		 GAW RKRH
(127)		 I
112 MDR26-72-0 Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR Ac-MDRWLVK
(120)		 W KKKRK
(125)		 I
113 MDR26-72-A Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR Ac-MDRALVK
(121)		 W KKKRK
(125)		 I
114 MDR26-72-011 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G Ac-MDRWLVK
(120)		 KKKRK
(125)
115 MDR26-72-01 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR Ac-MDRWLVK
(120)		 KKKRK
(125)
116 MDR34 MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G MDRWLVK
(118)		 RIW KKKRK
(125)		 II
117 RI-MDR26-3 FITC-KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM KVLWRDM
(122)		 WWW KRKKK
(128)		 II
서열
번호 		펩타이드 # 전체 펩타이드 서열 제2 APIM 링커
3 		CPP 태그
98 MDR2 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G RQIKIWFQNRRMKWK
(129)		 K-Ahx-5-FAM)G
99 MDR27 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
100 MDR26-0 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG RKKRRQRRRG
(131)		 테그 없음
101 MDR26-1 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
102 MDR26-2 MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
103 MDR26-3 MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
104 MDR26-4 MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
105 MDR26-7 MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G RRRRRRRRRRR
(132)		 K-Ahx-5-FAM)G
106 MDR26-8 MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G RQIKIWFQNRRMKWK
(129)		 K-Ahx-5-FAM)G
107 MDR26-10 MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
108 MDR26-72 MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK-FAM)G RRRRRRRRRRR
(132)		 K-FAMG
109 MDR26-32 MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-FAMG
110 MDR26-42 MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK-FAM)G RKKRRQRRR
(130)		 K-FAMG
111 MDR24-43 MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK-FITC RKKRRQRRR
(130)		 K-FITC
112 MDR26-72-0 Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRR
(132)		 테그 없음
113 MDR26-72-A Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRR
(132)		 테그 없음
114 MDR26-72-011 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G RRRRRRRRRRR
(132)		 K-Ahx-5-FAM)G
115 MDR26-72-01 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRR
(132)		 테그 없음
116 MDR34 MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G RWLVK
(134)		 WWW RKKRRQRRR
(130)		 K-Ahx-5-FAM)G
117 RI-MDR26-3 FITC-KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM RRRQRRKKR
(133)		 K-FITC
서열
번호 		펩타이드 # 전체 펩타이드 서열 위치화 CFU MTT 안정성 세포독성 막 독성
98 MDR2 MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G 핵 + +(+)
99 MDR27 MDRWLVKGAWKKKRVKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 + + 낮음
100 MDR26-0 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG 미확인 +(+)
101 MDR26-1 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 + + +
102 MDR26-2 MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 + +
103 MDR26-3 MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 ++ ++ +(+)
104 MDR26-4 MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 ++ ++ +(+) +(+)
105 MDR26-7 MDRWLVKRIWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 ++ ++ + +(+)
106 MDR26-8 MDRWLVKRIWKKKRKIIRQIKIWFQNRRMKWKK-Ahx5-FAM)G 핵 ++ ++ ++ +(+)
107 MDR26-10 MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 +(+) +
108 MDR26-72 MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK-FAM)G 핵 ++ ++ +(+)
109 MDR26-32 MDRWLVKWKKKRKIRKKRRQRRRK-FAM)G 핵 ++ ++ +(+)
110 MDR26-42 MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK-FAM)G 핵 ++ ++ +(+)
111 MDR24-43 MDRWLVKGAWRKRHIRKKRRQRRRK-FITC 핵 ++ +(+)
112 MDR26-72-0 Ac-MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR 미확인 +++ ++ ++ ++
113 MDR26-72-A Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRRRRR 미확인 - (+) ++ (+)
114 MDR26-72-011 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 - +(+) +++ (+)
115 MDR26-72-01 Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR 미확인 - (+) +++ (+)
116 MDR34 MDRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK-Ahx5-FAM)G 핵 - - ++ ++
실시예 7 세포독성 데이타
본 실시예에서는, 세포독성
추가적인 실험의 보다 상세한 데이타가 제시된다. 세포독성 분석은 상기 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는, 펩타이드 MDR26-0 (서열번호 100), MDR26-3 (서열번호 103), MDR26-4 (서열번호 104), MDR26-8 (서열번호 106), MDR26-7 (서열번호 105), MDR26-72-0 (서열번호 112), MDR26-72-01 (서열번호 115) 및 MDR34 (서열번호 116)에 대한 MTT 세포독성 분석 결과를 나타낸 도 6에 제시한다.
펩타이드의 세포독성을 관찰할 수 있으며, 혈청 무첨가시 더 큰 효과가 관찰될 것으로 보인다. APIM 모티프 1개를 가진 MDR26 변이 펩타이드들 모두에서 세포독성이 보여진다. APIM 모티프 2개를 가진 MDR34 변이체에서는 증가된 세포독성이 나타난다. 테그가 없거나(MDR34-0) MDR34의 인버스(I-MDR-34) 또는 레트로-인버스(RI-MDR-34) 등가체인, MDR34에 대응되는 펩타이드들에서, 비슷한 세포 독성 결과가 수득된다. MDR34-2는 NSL 서열이 없고, 대신 연장된 링커 서열 IILVIII (서열번호 95)를 링커 2로서 포함하는 것으로, 이것은 감소된 세포 독성을 보인다.
실시예 8
PCNA와 APIM-함유 펩타이드 상의 상호작용을 뒷받침하는, 추가적인 실험들을 수행하였다. 공동-면역침강(co-IP) 실험을 통해, EYFP-PCNA를 안정적으로 발현하는 세포내 내인성 PCNA 및 EYFP-PCNA 둘다 hABH2를 아래로 침전시킬 수 있는 것으로 확인된다. 염색질-농화된 분획내에서의 hABH2와 PCNA 간의 보다 강한 상호작용은, PCNA 또는 hABH2 상의 번역 후 수정을 의미한다. 이러한 실험들에서, EYFP-PCNA를 안정적으로 발현하는 세포 유래의 hABH2의 co-IP는 알파-EYFP에 대한 항원에 커플링된 자기 비드를 이용하여 입증하였다. 막을 알파-hABH2로 탐침하고, 알파-PCNA 항체로 재탐침하였다. 또한, 내인성 단백질만 발현하는 세포 유래의 hABH2의 co-IP를 알파-PCNA에 대한 항체가 커플링된 자기 비드를 이용하여 입증하였다.
생체내 가교를 보여주는 추가적인 실험들은 APIM과 PCNA 사이의 직접 결합을 뒷받침한다. hABH21-7-EYFP 3xFLAG 및 hABH21-7-F4A-EYFP 3xFLAG를 안정적으로 발현하는 세포 유래의 가교 및 역가교된 FLAG 융합 단백질들은 알파-FLAG 친화성 겔을 이용하여 면역침강하였다. IP 용출 분획을 알파-PCNA 또는 알파-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
SEQUENCE LISTING <110> NTNU Technology Transfer AS <120> Oligopeptidic compounds and uses thereof <130> 27.20.95626/02 <150> GB0803352.4 <151> 2008-02-22 <160> 134 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus APIM <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X may be any genetic or non-genetic basic amino acid and it may be modified <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X may be any genetic or non-genetic lipophilic amino acid and it may be modified <220> <221> VARIANT <222> (3)..(4) <223> X may be any genetic or non-genetic uncharged amino acid and it may be modified <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X may be any genetic or non-genetic basic amino acid and it may be modified <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> PCNA Binding motif (APIM) <400> 2 Arg Phe Leu Val Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 3 Lys Phe Leu Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 4 Lys Tyr Leu Leu Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 5 Lys Trp Leu Leu Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 6 Lys Tyr Ile Leu Arg 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 7 Lys Tyr Val Leu Arg 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 8 Arg Phe Leu Leu Arg 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 9 Arg Tyr Leu Leu Arg 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 10 Arg Trp Leu Leu Arg 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 11 Arg Tyr Ile Leu Arg 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM variant <400> 12 Arg Tyr Val Leu Arg 1 5 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Artificial sequence <220> <223> NLS variant <220> <221> variant <222> (5)..(5) <223> /REPLACE= any amino acid <220> <221> repeat <222> (5)..(5) <223> 2 to 10 <220> <221> repeat <222> (5)..(5) <223> X can be 2 to 10 residues <400> 81 Arg Lys Arg His Xaa Lys Lys 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS variant <220> <221> variant <222> (5)..(6) <223> /REPLACE= any amino acid <400> 82 Arg Lys Arg His Xaa Xaa Lys Lys 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS variant <400> 83 Arg Lys Arg His Ile Ile Lys Lys 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Oncoprotein c-myc NLS <400> 84 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS cluster of basic amino acids <400> 85 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS variant <400> 86 Pro Ala Ala Lys Lys Lys Leu Asp 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> 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<223> Linker <400> 95 Ile Ile Leu Val Ile Ile Ile 1 5 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APIM Oligopeptidic compound <400> 96 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Leu Val Ala Thr Lys 1 5 10 <210> 97 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM Oligopeptidic compound <400> 97 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Leu Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 10 15 Ala Thr Lys Gly 20 <210> 98 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR2 <220> <221> mod_res <222> (34)..(34) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 98 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Gly Ala Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Val Leu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp 20 25 30 Lys Lys <210> 99 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR27 <220> <221> mod_res <222> (28)..(28) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 99 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Gly Ala Trp Lys Lys Lys Arg Val Lys 1 5 10 15 Ile Ile Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 100 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-0 <400> 100 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Gly Ala Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly 20 25 <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-1 <220> <221> mod_res <222> (27)..(27) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 101 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Gly Ala Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 102 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-2 <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 102 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 103 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-3 <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 103 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Trp Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 104 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-4 <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 104 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Trp Arg Lys Arg His Ile Ile Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 105 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-7 <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 105 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 106 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-8 <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 106 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 20 25 30 Lys <210> 107 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDr26-10 <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 107 Met Asp Arg Phe Leu Val Lys Gly Ala Trp Arg Lys Arg His Ile Ile 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 108 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-72 <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Coupled to fluorescein <400> 108 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 109 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-32 <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Coupled to fluorescein <400> 109 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile Arg Lys 1 5 10 15 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 <210> 110 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-42 <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Coupled to fluorescein <400> 110 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Arg Lys Arg His Ile Arg Lys Lys 1 5 10 15 Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 <210> 111 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR24-43 <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Coupled to fluorescein-5-isothiocyanate <400> 111 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Gly Ala Trp Arg Lys Arg His Ile Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys 20 25 <210> 112 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-72-0 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 112 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 113 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-72-A <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 113 Met Asp Arg Ala Leu Val Lys Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 114 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-72-011 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 114 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys 20 <210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR26-01 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 115 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 116 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MDR34 <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> 5-Carboxyfluorescein coupled by Aminohexanoic acid <400> 116 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys Arg Ile Trp Lys Lys Lys Arg Lys Ile 1 5 10 15 Ile Arg Trp Leu Val Lys Trp Trp Trp Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 20 25 30 Arg Arg Lys 35 <210> 117 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> RI-MDR26-3 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Coupled to fluorescein-5-isothiocyanate <400> 117 Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Ile Ile Lys Arg Lys Lys 1 5 10 15 Lys Trp Trp Trp Lys Val Leu Trp Arg Asp Met 20 25 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM sequence <400> 118 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys 1 5 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM sequence <400> 119 Met Asp Arg Phe Leu Val Lys 1 5 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 120 Met Asp Arg Trp Leu Val Lys 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 121 Met Asp Arg Ala Leu Val Lys 1 5 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> APIM sequence <400> 122 Lys Val Leu Trp Arg Asp Met 1 5 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 123 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu 1 5 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS# <400> 124 Lys Lys Lys Arg Val Lys 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 125 Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 126 Arg Lys Arg His Ile Ile Lys Lys 1 5 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 127 Arg Lys Arg His 1 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NLS <400> 128 Lys Arg Lys Lys Lys 1 5 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CPP <400> 129 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CPP <400> 130 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CPP <400> 131 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly 1 5 10 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CPP <400> 132 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CPP <400> 133 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2nd APIM sequence <400> 134 Arg Trp Leu Val Lys 1 5

Claims (24)

  1. 치료에 사용하기 위한, PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물로서,
    상기 PCNA 상호작용 모티프는 서열번호 18의 서열을 가지고,
    상기 올리고펩타이드 화합물은 18 내지 50 아미노산을 가지며, 서열번호 125의 핵 위치화 신호 서열과 서열번호 129 내지 서열번호 131 중에서 선택되는 어느 하나의 세포 통과 신호 서열을 포함하고,
    상기 화합물에서 PCNA 상호작용 모티프는 신호 서열에 대해 N-말단인, 올리고펩타이드 화합물.
  2. PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물과 약학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 PCNA 상호작용 모티프는 서열번호 18의 서열을 가지고,
    상기 올리고펩타이드 화합물은 18 내지 50 아미노산을 가지며, 서열번호 125의 핵 위치화 신호 서열과 서열번호 129 내지 서열번호 131 중에서 선택되는 어느 하나의 세포 통과 신호 서열을 포함하고,
    상기 화합물에서 PCNA 상호작용 모티프는 신호 서열에 대해 N-말단인, 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 약학 조성물이 경구, 비경구, 국소, 직장, 생식기, 피하, 경요도, 경피, 코내, 복막내, 근육내 또는 정맥내 투여용으로, 혹은 흡입에 의한 투여에 적합한 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. (i) PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물로서,
    상기 PCNA 상호작용 모티프는 서열번호 18의 서열을 가지고,
    상기 올리고펩타이드 화합물은 18 내지 50 아미노산을 가지며, 서열번호 125의 핵 위치화 신호 서열과 서열번호 129 내지 서열번호 131 중에서 선택되는 어느 하나의 세포 통과 신호 서열을 포함하고,
    상기 화합물에서 PCNA 상호작용 모티프는 신호 서열에 대해 N-말단인, 올리고펩타이드 화합물 및
    (ii) 세포증식 억제제
    를 포함하는, 암 치료용 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 방사선 치료와 조합하여 사용되고, 이때 상기 화합물은 상기 방사선 치료와 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 올리고펩타이드 화합물.
  6. PCNA 상호작용 모티프를 포함하는 올리고펩타이드 화합물로서,
    상기 PCNA 상호작용 모티프는 서열번호 18의 서열을 가지고,
    상기 올리고펩타이드 화합물은 18 내지 50 아미노산을 가지며, 서열번호 125의 핵 위치화 신호 서열과 서열번호 129 내지 서열번호 131 중에서 선택되는 어느 하나의 세포 통과 신호 서열을 포함하고,
    상기 화합물에서 PCNA 상호작용 모티프는 신호 서열에 대해 N-말단인, 올리고펩타이드 화합물을 포함하는 리포좀.
  7. 서열번호 18의 서열을 가진 PCNA 상호작용 모티프를 가지거나 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자로서,
    상기 펩타이드는 18 내지 50 아미노산을 가지며, 서열번호 125의 핵 위치화 신호 서열과 서열번호 129 내지 서열번호 131 중에서 선택되는 어느 하나의 세포 통과 신호 서열을 포함하고,
    상기 펩타이드에서 PCNA 상호작용 모티프는 신호 서열에 대해 N-말단인, 핵산 분자.
  8. 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물이 서열번호 100-103, 106, 109 및 116 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는, 올리고펩타이드 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물은 세포증식 억제제와 함께(conjunction), 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용되는, 올리고펩타이드 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물은 융합 단백질 또는 앱타머(aptamer)의 일부인, 올리고펩타이드 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 D-아미노산, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 비-코드화된 아미노산, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 디(di)-아미노산, 또는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 베타-아미노산을 포함하는 올리고펩타이드 화합물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 액티노마이신 D, BCNU(카르무스틴: carmustine), 카보플라틴, CCNU, 캄포테신(CPT), 칸타리딘, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에토포시드, 게피니팁, 겜시타빈, 이포스아미드, 이리노테칸, 이오노마이신, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신 C(MMC), 메틸 메탄설포네이트(MMS), 미토잔트론머캅토퓨린, 옥살리플라틴, 파클리탁셀(taxol), PARP-1 저해제, 탁소테르(taxotere), 테모졸로미드(TZM), 테니포시드, 토포테칸, 트레오설판, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 5-아자시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 5-플루오로우라실로부터 선택되는, 올리고펩타이드 화합물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 알킬화제인 올리고펩타이드 화합물.
  15. 제2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물이 서열번호 100-103, 106, 109 및 116 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 세포증식 억제제와 함께(conjunction), 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용되는, 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 액티노마이신 D, BCNU(카르무스틴: carmustine), 카보플라틴, CCNU, 캄포테신(CPT), 칸타리딘, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에토포시드, 게피니팁, 겜시타빈, 이포스아미드, 이리노테칸, 이오노마이신, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신 C(MMC), 메틸 메탄설포네이트(MMS), 미토잔트론머캅토퓨린, 옥살리플라틴, 파클리탁셀(taxol), PARP-1 저해제, 탁소테르(taxotere), 테모졸로미드(TZM), 테니포시드, 토포테칸, 트레오설판, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 5-아자시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 5-플루오로우라실로부터 선택되는, 약학 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 알킬화제인 약학 조성물.
  19. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 치료와 조합하여 사용되고, 이때 상기 조성물은 상기 방사선 치료와 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 약학 조성물.
  20. 제2항에 있어서, 상기 암은 방광암, 전립선암 또는 혈액암인 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 혈액암은 다발성 골수종 또는 백혈병으로부터 선택되는 약학 조성물.
  22. 제4항에 있어서, 상기 올리고펩타이드 화합물이 서열번호 100-103, 106, 109 및 116 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는, 키트.
  23. 제4항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 액티노마이신 D, BCNU(카르무스틴: carmustine), 카보플라틴, CCNU, 캄포테신(CPT), 칸타리딘, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에토포시드, 게피니팁, 겜시타빈, 이포스아미드, 이리노테칸, 이오노마이신, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신 C(MMC), 메틸 메탄설포네이트(MMS), 미토잔트론머캅토퓨린, 옥살리플라틴, 파클리탁셀(taxol), PARP-1 저해제, 탁소테르(taxotere), 테모졸로미드(TZM), 테니포시드, 토포테칸, 트레오설판, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 5-아자시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 5-플루오로우라실로부터 선택되는, 키트.
  24. 제4항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 알킬화제인 키트.
KR1020177003734A 2008-02-22 2009-02-20 올리고펩타이드 화합물 및 이의 용도 KR101758671B1 (ko)

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