KR20170014024A - 장미의 내건성 개선 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장미의 내건성(耐乾性, drought resistance) 개선 방법에 관한 것으로, 구체적으로 장미에 대장균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2) 유전자를 도입하여 발현되도록 함으로써 장미의 내건성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 장미의 내건성을 효과적으로 개선할 수 있다. 내건성이 개선된 본 발명에 따른 장미는 원활한 수분 공급이 여의치 않은 경우에도 보다 오랫동안 생존할 수 있어, 계속되는 가뭄 또는 관수장치의 오작동으로 인한 농가의 피해를 줄이는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

장미의 내건성 개선 방법{Method for enhancing drought resistance of rose}

본 발명은 장미의 내건성(耐乾性, drought resistance) 개선 방법에 관한 것으로, 구체적으로 장미에 대장균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2) 유전자를 도입하여 발현되도록 함으로써 장미의 내건성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

장미를 포함한 주요 화훼작물들의 신품종은 주로 품종간 또는 종간 교잡 기술을 이용하여 개발되고 있다. 품종간 또는 종간교잡 등 교잡육종 기술은 신품종을 개발하는 주요 수단이지만 유전자원들이 보유하지 않은 특성을 가진 품종을 개발하는 것은 불가능하며, 설사 유전자원들이 보유하고 있는 특성이라도 유전자원들 간에 교잡화합성이 없을 경우에는 그 특성을 가진 품종을 개발하기가 불가능한 한계점이 있다. 이러한 교잡육종의 한계점을 극복할 수 있는 방법이 형질전환기술이다.

세계 3대 절화류의 하나인 장미의 경우, 형질전환체를 획득하기 위하여 선행적으로 수행되는 수많은 재분화 연구에 대한 보고가 있지만 형질전환에 관한 연구로는 미국 DNA Plant Technology사의 Firoozabady 등 (1994)에 의해 최초로 보고된 이후 최근까지 세계적으로 3 ~ 4개의 연구팀에 의해서 몇몇 연구만이 보고되었다. 그러나 2006년 말경 일본의 Suntory사에서 개발되어 2009년 말 상업화된 푸른색 장미 형질전환체를 획득하였다는 보고와 같이 최근까지 벼나 콩 등 주곡작물에서만 주요 육종기술로 이용되었던 형질전환 기술이 장미의 품종 육성을 위한 기술로서 이용될 수 있는 가능성이 제시되었지만 현재까지 장미의 형질전환체를 획득하는 것은 쉽지 않은 것으로 알려져 있다. Suntory사의 Tanaka (2009) 보고를 포함하여 위에서 제시되어 있는 장미 형질전환체 획득에 성공하였다는 국외 보고의 대다수는 절편체로 기내 잎(엽병포함) 및 줄기 단편으로부터 유도된 캘러스 또는 체세포배발생캘러스를 이용하여 아그로박테리움이나 유전자총을 매개로 하여 유전자의 도입을 시도하였으나 효율이 낮고 극히 일부 품종에 국한되어 연구되었다. 국내에서도 장미 형질전환에 관한 연구로는 한국생명공학연구원에서 1996년부터 2000년까지 4년간 장미 체세포배발생 캘러스의 유도 및 형질전환 기술을 개발하고자 시도하였고, Kim 등(2004)이 Castillon과 Kamo(2002)가 'Tineke'로부터 유도한 체세포배발생캘러스를 절편체로 이용하여 GFP유전자가 도입된 형질전환체를 획득하였다는 보고가 있으나 국내의 경우 본 연구팀을 제외하고는 장미 체세포배발생캘러스 유도 기술 조차도 개발하지 못한 실정이다.

한편 다양한 산화효소 및 과산화효소의 활성을 통해 발생되는 활성산소가 내부 발생 신호 또는 외부 환경 자극에 반응하여 장미의 세포 내 거대분자들을 손상시키고 세포를 죽일 수 있다. 이러한 환경적 스트레스에 의해서 장미가 쉽게 상할 수 있으며 이러한 요소로 인해서 장미 농가는 많은 피해를 입을 수 있다. 따라서 이러한 피해를 줄이기 위해서 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있는 장미 형질전환체를 제조하는 것은 농가에게 많은 도움을 줄 수 있으며 이에 대한 연구 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 장미의 다양한 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있는 방법에 관하여 다양한 연구를 진행하였으며, 이의 결과 대장균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2) 유전자의 도입을 통해 내건성(耐乾性, drought resistance)을 증진시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1077209호 대한민국 등록특허 제10-1239643호

따라서 본 발명의 주된 목적은 장미의 내건성을 효과적으로 개선하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 대장균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2)를 암호화하는 유전자를 세포 내에 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성(耐乾性, drought resistance)을 개선하는 방법을 제공한다.

슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2)는 iron/manganese 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 패밀리에 속하며, 항산화 방어기작 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 생물의 종류에 따른 다양한 SOD2가 알려져 있으며, 이 중에서 본 발명에서 사용되는 대장균(Escherichia coli) 유래 SOD2는 MnSOD로 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.

대장균 유래 SOD2 유전자 서열로는 서열번호 3의 서열이 알려져 있다. 여기에는 프로모터 등의 서열이 포함되어 있으며, SOD2의 아미노산을 암호화하는 부위는 141 ~ 761번째 염기 부분(서열번호 2)이다.

내건성은 작물이 건조(한발)에 견디는 성질을 의미하는 것으로, 본 발명에서 내건성이 증진 또는 개선되었다는 것은 대조군, 즉 SOD2 유전자를 도입하지 않은 장미에 비해 건조한 환경에서 더 오랫동안 생존할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에 있어서, 세포 내에 도입하여 발현시키는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다. 하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하도록 코돈을 변경한 서열도 가능할 것으로 판단된다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 유전자는 모자이크 바이러스(mosaic virus) 유래 35S 프로모터(P35S)에 의해 전사가 조절되도록 하는 것이 바람직하다. 하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 장미에서 작동할 수 있는 다른 프로모터도 적용할 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명의 방법에 있어서, 유전자를 세포 내에 도입하기 위한 방법으로 아그로박테리움 매개 형질전환(agrobacterium-mediated transformation) 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 형질전환은 상기 유전자를 함유하며 도 1로 표시되는 재조합 벡터를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 세포는 장미의 뿌리에서 유도된 체세포배 또는 배발생 캘러스인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 장미의 내건성을 효과적으로 개선할 수 있다. 내건성이 개선된 본 발명에 따른 장미는 원활한 수분 공급이 여의치 않은 경우에도 보다 오랫동안 생존할 수 있어, 계속되는 가뭄 또는 관수장치의 오작동으로 인한 농가의 피해를 줄이는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 SOD2 유전자 삽입 pPZP200-SOD2-Bar 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 2는 장미의 기내 뿌리 유래 체세포배발생캘러스가 생성된 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 SOD2 유전자 도입 후 형질전환체 획득까지의 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 SOD2 유전자의 도입여부를 확인한 PCR 분석 결과이다.
도 5는 SOD2 유전자 도입 copy 수를 확인한 서던 블롯(southern blot) 분석 결과이다.
도 6은 SOD2 유전자의 전사체 발현여부를 확인한 Real-time PCR 분석 결과이다.
도 7은 SOD2 유전자의 단백질 발현여부를 확인한 웨스턴 블롯(western blot) 분석 결과이다.
도 8은 비형질전환체(대조군)(NT)와 SOD2 유전자 도입 형질전환체 8계통의 무관수 7일 째 상대수분함량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 비형질전환체(대조군)(NT)와 SOD2 유전자 도입 형질전환체 8계통의 무관수 7일 째 상대 ion linkage(%)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 비형질전환체(대조군)와 SOD2 유전자 도입 형질전환체를 7일간 건조처리한 후 관수 재개 2일째의 생육상태를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. SOD2 유전자 삽입 재조합 벡터 제작 및 아그로박테리움 형질전환

서열번호 2의 SOD2 유전자가 P35S(35S promoter)에 의해 전사가 조절되도록 pBI121 벡터에 클로닝된 pBI-SOD 재조합 벡터를 사용하였다. HindIII 및 SacI 제한효소인식부위를 이용하여 pBI-SOD 재조합 벡터의 P35S-SOD2 부위(약 1.5kb)를 실용화 진입에 문제가 되지 않는 식물형질전환용 발현벡터 pPZP200-Bar에 도입하였고, 이의 결과로 pPZP200-SOD2-Bar 재조합 벡터(서열번호 4)를 제작하였다(도 1 참조).

이 pPZP200-SOD2-Bar 재조합 벡터로 아그로박테리움 균주 LBA4404를 형질전환한 다음, 형질전환된 균주를 glycerol과 1:1로 섞어 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 2. 체세포배발생캘러스 준비

대한민국 등록특허 제10-1077209호의 방법에 따라 장미의 체세포배발생캘러스를 준비하였다.

티네케(Tineke)와 미리내 골드(mirinae gold) 품종간 교잡하여 선발한 KR056002 계통 장미를 사용하였다. 이 장미의 기내 뿌리로부터 유도된 체세포배발생캘러스를 직경 2cm의 크기로 모아서 2,4-D 3mg·ℓ^-1, L-proline 300mg·ℓ^-1, sucrose 30g·ℓ^-1, phytagel 4g·ℓ^-1 등이 첨가된 SH 배지(Schenk & Hildebrandt 배지)에 계대배양하여 증식하였고, 이들 중 둥글고 겉이 매끄럽고 하얀빛을 띠는 체세포배(배발생 캘러스 포함)(이하 시료라 칭함)를 유전자 도입 재료로 선발하였다(도 2 참조).

실시예 3. SOD2 유전자 도입 및 재분화 식물체 획득

가. 아그로박테리움 배양

-70℃ 냉동고에 보관중인 pPZP200-SOD2-Bar 삽입 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404 균주 저장액 1㎖을 spectinomycin가 50㎍/ℓ의 농도로 첨가된 LB 액체배지에 넣고 28℃ 회전 인큐베이터에서 170 ~ 200rpm으로 O.D.₆₀₀ = 1.6 ~ 1.9 정도가 될 때까지 배양하였다.

나. 아그로박테리움 감염 및 배양을 통한 유전자 도입

아그로박테리움 배양액을 6,000rpm으로 7분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 수득한 균체를 acetosyringone이 50μM의 농도로 첨가된 체세포배발생캘러스 증식용 액체배지(균배양액의 1/2 부피)에 현탁한 다음 현탁액에 미리 준비된 KR056002 체세포배(배발생캘러스 포함) 2.5㎖을 30분간 감염시킨 후 멸균된 filter paper에 올려 시료에 묻어 있는 균액을 제거하고 acetosyringone이 50μM의 농도로 첨가되고 멸균 filter paper가 깔린 체세포배발생캘러스 증식 고체배지(pH 5.2)로 옮겨, 25±2℃의 온도조건으로 3일간 암배양하였다.

다. 선발배지에서 재분화 식물체 획득 및 증식

SOD2 유전자 삽입 LBA4404와 3일간 공동배양된 체세포배(배발생캘러스 포함)를 250mg·ℓ^-1 cefotaxim이 첨가된 체세포배발생캘러스 증식용 액체배지로 세척 후 멸균된 filter paper상에서 시료에 묻어 있는 세척액을 제거하였다. 세척액이 제거된 균감염 체세포배(배발생캘러스 포함)로부터 KR056002 유래 재분화식물체 41개체를 획득하기까지 3 ~ 6주 간격으로 생육단계에 따라 선발배지를 달리하여 계대배양하였다(표 1 및 도 3 참조).

내환경성 증진 유전자 SOD2도입 후 선발배지에서 재분화 식물체 획득

품종 (계통)	형질전환체 획득 계통 수	유전자 도입 후 형질전환체 획득까지의 계대배양 과정
KR056002	32	배성숙 선발배지(2회) → 배발아유도 선발배지(1회) → 신초유도 선발배지(8회) → 신초신장 선발배지(2회) → 신초유도 선발배지(3회) → 신초신장 선발배지(2회) → 다신초유도 선발배지(2회) → 신초신장 선발배지(1회) → 신초신장 선발배지(1회) → 다신초 유도 선발배지(6회)

실시예 4. 재분화 식물체의 유전자 도입, 전사체 및 단백질 발현 여부 확인

PCR 분석을 통해 SOD2 유전자 도입 후 선발배지에서 재분화된 식물체의 유전자의 도입여부를 확인하였으며(도 4 참조), 서던 블롯(southern blot) 분석을 통해 SOD2 유전자가 1 ~ 3 copy로 도입되었음을 확인하였다(도 5 참조).

또한 Real-time PCR 분석에 의해 도입유전자의 전사체가 정상적으로 발현하고 있음을 확인하였고(도 6 참조), 웨스턴 블롯(Western blot) 분석에 의해 도입유전자의 단백질이 정상적으로 발현하고 있음을 확인하였다(도 7 참조).

실시예 5. 내건성 검정

기내 발근 3주 및 기외 순화 44 ~ 54일 경과한 SOD2 형질전환체 8계통 58개체를 비형질전환체와 함께 충분히 관수한 다음 온도 25℃ 조절 생육상에서 7일간 무관수 처리 후 상대수분함량, 상대 ion linkage(세포막 보전 상태 지표), 재관수 후의 생육 회복 정도 등을 조사한 결과, 형질전환체가 비형질전환체 보다 처리 전후의 상대수분함량이 0.1 ~ 11% 높았고, 재관수 후에도 비형질전환체는 모든 처리 개체가 고사하였으나 형질전환체는 대다수 개체의 생육이 회복되는 것을 확인하였다. 또한 스트레스 상태 하에서의 식물체 세포막 보전 상태를 알려주는 상대 ion linkage는 형질전환체가 비형질전한체에 비해 5 ~ 74% 낮아, 일상조건이나 심한 건조 스트레스 조건에서의 견디는 능력이 탁월하게 증진되었음을 확인하였다(도 8, 9 및 10 참조).

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for enhancing drought resistance of rose <130> PA-D15103 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Tyr Thr Leu Pro Ser Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 Pro His Phe Asp Lys Gln Thr Met Glu Ile His His Thr Lys His His 20 25 30 Gln Thr Tyr Val Asn Asn Ala Asn Ala Ala Leu Glu Ser Leu Pro Glu 35 40 45 Phe Ala Asn Leu Pro Val Glu Glu Leu Ile Thr Lys Leu Asp Gln Leu 50 55 60 Pro Ala Asp Lys Lys Thr Val Leu Arg Asn Asn Ala Gly Gly His Ala 65 70 75 80 Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Gly Leu Lys Lys Gly Thr Thr Leu Gln 85 90 95 Gly Asp Leu Lys Ala Ala Ile Glu Arg Asp Phe Gly Ser Val Asp Asn 100 105 110 Phe Lys Ala Glu Phe Glu Lys Ala Ala Ala Ser Arg Phe Gly Ser Gly 115 120 125 Trp Ala Trp Leu Val Leu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Val Val Ser Thr 130 135 140 Ala Asn Gln Asp Ser Pro Leu Met Gly Glu Ala Ile Ser Gly Ala Ser 145 150 155 160 Gly Phe Pro Ile Met Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu 165 170 175 Lys Phe Gln Asn Arg Arg Pro Asp Tyr Ile Lys Glu Phe Trp Asn Val 180 185 190 Val Asn Trp Asp Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Ala Lys Lys 195 200 205 <210> 2 <211> 621 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgagctata ccctgccatc cctgccgtat gcttacgatg ccctggaacc gcacttcgat 60 aagcagacca tggaaatcca ccacaccaaa caccatcaga cctacgtaaa caacgccaac 120 gcggcgctgg aaagcctgcc agaatttgcc aacctgccgg ttgaagagct gattaccaaa 180 ctggaccagc tgccagcaga caagaaaacc gtactgcgca acaacgctgg cggtcacgct 240 aaccacagcc tgttctggaa aggtctgaaa aaaggcacca ccctgcaggg tgacctgaaa 300 gcggctatcg aacgtgactt cggctccgtt gataacttca aagcagaatt tgaaaaagcg 360 gcagcttccc gctttggttc cggctgggca tggctggtgc tgaaaggcga taaactggcg 420 gtggtttcta ctgctaacca ggattctccg ctgatgggtg aagctatttc tggcgcttcc 480 ggcttcccga ttatgggcct ggatgtgtgg gaacatgctt actacctgaa attccagaac 540 cgccgtccgg actacattaa agagttctgg aacgtggtga actgggacga agcagcggca 600 cgttttgcgg cgaaaaaata a 621 <210> 3 <211> 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Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 대장균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(Superoxide dismutase 2, SOD2)를 암호화하는 유전자를 세포 내에 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성(耐乾性, drought resistance)을 개선하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성을 개선하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 발현은 상기 유전자의 전사(transcription)가 모자이크 바이러스 유래 35S 프로모터(promoter)에 의해 조절되도록 하는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성을 개선하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 유전자를 세포 내에 도입하기 위한 방법으로 아그로박테리움 매개 형질전환(agrobacterium-mediated transformation) 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성을 개선하는 방법.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 형질전환은 상기 유전자를 함유하며 도 1로 표시되는 재조합 벡터를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 장미의 내건성을 개선하는 방법.
   
6. 제 4항에 있어서,
   상기 세포는 장미의 뿌리에서 유도된 체세포배 또는 배발생 캘러스인 것을 특징으로 하는 장미의 내건성을 개선하는 방법.

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