JP4982516B2 - 塩耐性l−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ及びそれを得る方法 - Google Patents
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Description
(i)ポルテレシアコアルクタタ(PINO1)の葉から前記L−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ遺伝子の全長cDNAを、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応によって単離すること、
(ii)前記単離されたL−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ遺伝子を配列決定すること、
(iii)発現プラスミド構築物を得るために適当な細菌発現ベクターにPINO1の前記単離された全長cDNAをクローニングすること
を含む方法が提供される。
形質転換による細菌宿主株E.coli BL21(DE3)への発現プラスミド構築物の導入、及びIPTGによるPINO1遺伝子産物の発現の誘導。
1.第1回目は、5’末端にT7プロモーターのプライマーを用い、3’末端にSP6プロモーターのプライマーを用いた。
2.第2回目は、RT−PCR増幅に使用されたとき遺伝子の5’末端と3’末端に設計されたプライマーを用いた。
3.第3回目の配列決定では、開始部位から約250塩基対下流と終止部位の250ヌクレオチド上流の位置に設計されたプライマーを用いた。
PINO1配列:
RINO1とPINO1のcDNAを細菌発現ベクターpET 20B(+)の適切なクローニング部位にサブクローニングした。得られたプラスミドを宿主株E.coli BL−21(DE3)に導入した。該細菌を、LB培地で0.5吸光度単位のA600まで増殖させ、30℃で6時間のあいだ0.5mM IPTGで誘導した。該細菌を、遠心分離で収集し、20mM Tris−HCl、pH7.5、各10mMのNH4ClとME、2mM PMSFを含む緩衝液中で超音波処理によって溶解した。溶解抽出物を遠心分離し、可溶性及び膜の分画の両方からの蛋白質を、Laemmli(Nature、227、680〜685頁、1970年)にしたがった10%SDS−PAGEとそれに続く免疫検出用ウエスタンブロットによって解析した。分離した蛋白質をPVDF膜上にブロットし、そのブロットを、エントアメーバの精製した組換えL−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ(Lohiaら、Mol.Biochem.Parasitol.、98、67〜79頁、1999年)又はオリザの葉由来の精製した細胞基質性L−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼに対して産生されたウサギの抗L−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ抗体(1:500)で探った。結合抗体をケミルミネッセンス(Amersham Life Sciencesからのキット)によって検出した。このような実験の結果は、RINO1とPINO1の両方が主に膜分画で発現された(図2、AとB、レーン1と3)ことを示している。
発現RINO1及びPINO1蛋白質を、室温で30分間保った可溶化緩衝液(8M尿素、0.5M NaCl、20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM ME、2mM PMSF)中において、ペレット分画から可溶化した。可溶化サンプルを15000rpmで30分間遠心分離した。上清を取り、同じ緩衝液中で尿素濃度を8Mから2Mへ段階的に希釈して連続的に透析した。可溶化サンプルをSDS−PAGEとウエスタンブロットでRINO1及びPINO1蛋白質について調べた(図3、AとB、レーン2と4)。可溶化後、SDS−PAGE解析によって、発現蛋白質が可溶化分画(図3A)にあることが明らかにされ、これを、ウエスタンブロット解析(図3B)で再度確認した。
透析されたサンプル内の蛋白質を、当研究所(RayChaudhuryら、Plant Physiol.、115、727〜736頁、1997年)から以前に記述された手順でDEAE Sephacel及びBiogel A0.5によって精製した。可溶化透析サンプルを取り、DEAE Sephacelカラム(ベッドボリューム20ml)に載せた。カラムへの蛋白質の吸収を2時間行った後、流出物を回収し、20mM Tris−HCl、pH7.5、各10mMのNH4CLとME、2mM PMSF、20%グリセロールを含む緩衝液Aで洗浄した。洗浄は、非結合蛋白質の溶出のために上記ベッドボリュームの約3倍の体積の緩衝液を使い、分画のA280が0に近づくまで行った。結合蛋白質を、緩衝液A中でNH4Cl濃度の0.01から0.25Mまでの直線的勾配液60mlで溶出させた。複数の1mlの分画を0.4ml/分の速度で回収した。イノシトールシンターゼ活性を有する分画を集め、濃縮し、緩衝液Aを2L交換して4℃で6時間透析した。透析濃縮した集められたDEAE分画をBiogel A0.5カラムに載せ、ベッドボリュームの3倍の緩衝液Aで予備平衡化した。蛋白質を緩衝液Aを用いて0.1ml/分の流速で複数の0.5mlの分画に溶出させた。イノシトールシンターゼ活性を含む分画を集め、20mM Tris−Cl(pH7.5)10mM MEの2Lの1回交換で透析した。
精製された細菌性発現RINO1及びPINO1蛋白質の生化学的特性を決定した(表1)。基質(グルコース6ホスフェート)及びコファクター(NAD)のKm及びVmax値の推定値を、Line−Weaver Burk解析法を使い、Biogel 0.5Aで精製した組み換えシンターゼを用いて得た。オリザ(RINO1)とポルテレシア(PINO1)の組換えシンターゼのグルコース6ホスフェートに対するKm値の間には違いがある。ポルテレシア(PINO1)の組換えシンターゼのグルコース6ホスフェートに対するKm値がより低いことは、オリザ組換えシンターゼ(RINO1)に比べて、基質特異性がより高いことを示している。どちらの場合も最適酵素活性は37℃のときであったが、ポルテレシア組換えシンターゼ(PINO1)の最適pHは8.0であり、オリザ組換えシンターゼ(RINO1)では7.5であった。
塩分ストレスに対するRINO1とPINO1の異なる挙動の構造的な基礎を理解するために、我々は、蛍光、円偏光二色性(CD)及びゲル濾過実験を行った。
PINO1の植物系への移入がその植物の塩存在下での生育を助けるかどうかを決定するために、アグロバクテリウム介在手順を用いてPINO1遺伝子で形質転換したタバコ草を産生した。このために、標準的手順に従って、PINO1遺伝子を植物発現ベクターpCAMBIA1301にクローニングし、アグロバクテリウム株LBA4404に動員した。再生培地で前培養したタバコ葉のディスクを、PINO1−pCAMBIA構築物を含むアグロバクテリウム培地の懸濁液に1時間漬け、セフォタキシムとハイグロマイシンを追加した再生培地に戻した。苗条及び根が成長した後、再生した小植物体を、さらなる生育のために0、100、200及び400mMのNaClを含む培養器に移した。pCAMBIAベクターのみで形質転換したコントロール小植物体も類似の方法で塩環境で生育した。増大するNaCl量の存在下で生育したこれらの植物(コントロール及びPINO1形質転換体)の比較は、コントロール植物は200mM NaClの存在下で葉緑素の損失を見せるが、PINO1形質転換植物は、表示された塩濃度ではそのような葉緑素の損失を見せず、400mM塩では、どちらのタイプの植物も生育できなかった(図7)ことを示している。このことは、PINO1形質転換植物は、形質転換されていない植物の生育に対して通常は阻害的である濃度のNaClの存在下で、光合成の仕組みを維持することができることを示唆している可能性がある。
Claims (7)
- 前記単離された塩耐性L−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼ(PINO1)は、インビトロ条件下でNaCl濃度500mMまでは塩に対して耐性である、請求項2に記載のベクター。
- 細菌発現ベクターである、請求項1から3の何れか1項に記載のベクター。
- 請求項1から4の何れか一項に記載のベクターを含む、形質転換植物。
- 200mM NaClの存在下で生育することができる、請求項5に記載の形質転換植物。
- 請求項1から4の何れか一項に記載のベクターで植物材料を形質転換することを含む、塩耐性L−ミオイノシトール−1−ホスフェートシンターゼを有する植物を製造する方法。
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