KR20160121696A - 송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는, 송엽과 토복령 복합추출물을 함유하는 본 발명 조성물의 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, TNF-a 및 IL-6 사이토카인 생성, 비만세포에서 분비되는 b-HEX 및 LTC₄ 생성을 억제하는 등의 항염증 효과를 확인하고, 본 발명 조성물을 염증질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 제공한다.

Description

송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treatment or Prevention of Inflammation and Allergic Diseases Comprising Pine Leaf and Smilax China Extracts}

본 발명은 송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

대식세포(macrophages)는 미생물 및 바이러스 감염에 대한 특이적, 비특이적 면역반응에 중요한 역할을 한다. 외부자극에 의하여 활성화된 대식세포는 NO, PGE₂, 그리고 TNF-a, IL-1과 IL-6을 포함하는 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)과 같은 다양한 염증매개물질을 생성하여 방출한다(Ritchlin CT, et al., Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest, 2003, 111:821-31).

비만세포(mast cells)는 골수세포에서 유래되어 조직에서 성숙 분화된 후 항원-항체 및 각종 사이토카인 등에 의해 활성화되어 염증, 알러지 반응에 관여한다(Puxeddu I, et al., Mast cells in allergy and beyond. Int J Biochem Cell B, 2003, 35:1601-1607). 활성화된 비만세포는 이미 만들어져 과립 내에 저장되어 있던 히스타민, 지질성 매개물질인 프로스타글란딘류(prostaglandines) 및 류코트리엔류(leukotriens)와 같은 ecosanoids를 생합성하여 알러지 반응을 증가시킨다고 알려져 있다(Prussin C, et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117:S450-S456).

염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질인 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등은 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다 (Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med , 2008, 14(10):461-469).

류코트리엔은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭사이드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염 등의 알러지 및 알러지 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy. Eur J Pharmacol , 2006, 533:40-56; Kitamura S, Leukotriene(B4, C4, D4, E4). Nippon Rinsho , 2005, Sl8:28-33).

소나무과에 속하는 상록교목의 다년생인 송엽(Pinus tabulaeformis CORR. = P. densiflora S. et Z.)은 만주곰솔·소나무 및 동속 근연식물의 잎으로서, 잎에는 α-pinene, β-pinene, camphene등의 정유와 flavonoid류, 수지를 함유하고 당류, carotene, vitamin C가 함유된 것으로 알려져 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, pp 105-106, 1998).

백합과에 속하는 덩굴성 관목의 다년생인 토복령(Smilax china L. = Coprosmanthus japonicus KUNTH)는 청미래덩굴 및 동속 근연식물의 근경으로서, 근경에는 diosgenin과 diosgenin으로 구성된 다종의 saponin이 함유하고 alkaloid, phenol류, amino 산, 유기산, 당류 등을 함유하고 종자에는 조지 11.2%가 함유되었고 지방에는 linoleic acid 39.1%, oleic acid 48.4%가 함유된 것으로 알려져 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, pp 185-186, 1998).

1. 대한민국 공개특허공보 10-2014-0040184 2. 대한민국 공개특허공보 10-2014-0040183 3. 대한민국 등록특허공보 10-1361626 4. 대한민국 공개특허공보 10-2012-0077889

본 발명은 송엽과 토복령의 복합추출물을 이용하여 효과적인 염증 및 알러지 질환 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 본 발명자들은 송엽과 토복령 복합추출물이 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, TNF-a 및 IL-6 사이토카인 생성, 비만세포에서 분비되는 b-HEX 및 LTC₄ 및 생성을 억제하는 항염증 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는,

송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물이 제공된다.

복합추출물은 물이나 C1~C4의 알코올, 다른 유기용매를 추출용매로 사용하여 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 복합추출물은 송엽과 토복령을 에탄올에 침지시킨 후 추출액을 수득하는 과정을 1~5회 반복 실시하는 방법으로 얻어질 수 있다. 이때 에탄올은 특별히 한정되는 것은 아니나 바람직하게는 50% 이상의 에탄올이 이용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70~75% 에탄올이 이용될 수 있고, 특히 바람직하게는 75% 에탄올이 이용될 수 있다.

상기 복합추출물의 추출방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 추출용매로 알코올 사용할 경우 바람직하게는 90℃ 이하의 온도로 실시한다. 더욱 바람직하게는 추출용매로 에탄올을 사용할 때 50~70℃에서 에탄올에 18~30시간 침지시킨 후 상온에서 추출액을 수득하는 과정을 반복 실시하는 방법으로 본 발명의 복합추출물을 얻을 수 있다.

송엽과 토복령 복합추출물을 함유하는 본 발명의 추출물은, 실시예를 통해 확인되는 바와 같이, LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, TNF-a 및 IL-6 사이토카인 생성, 비만세포에서 분비되는 b-HEX 및 LTC₄ 생성을 억제하는 항염증 효과를 나타내므로, 염증질환 또는 알레르기 질환의 예방과 치료를 위한 효과적인 약제로 이용될 수 있다.

도 1은 송엽과 토복령 복합추출물을 함유하는 본 발명 조성물의 Nitrite 생성 억제 실험결과이다 (IC₅₀=16.8μM).
도 2는 본 발명 조성물의 TNF-a 생성 억제 실험결과이다.
도 3은 본 발명 조성물의 IL-6 생성 억제 실험결과이다.
도 4는 본 발명 조성물의 b-HEX 생성 억제 실험결과이다 (IC₅₀=3.2μg/ml).
도 5는 본 발명 조성물의 LTC₄ 생성 억제 실험결과이다 (IC₅₀=13.1μg/ml).

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 ]

실시예 1. 복합추출물의 제조

(주)휴먼허브(http://www.humanherb.co.kr/)에서 구입한 토복령(40 g)과 송엽(60 g)을 75% 에탄올 1,500 ㎖에 60℃에서 24시간 침지시킨 후 실온에서 추출액을 수득하고, 다시 75% 에탄올 1,500 ㎖를 가하여 2회 더 추출하여 추출액을 모은 후, 상기 각 추출액을 여과한 여과물을 감압 회전농축기 (Vaccum rotary evaporator; 일본 Nihon Seiko사, VR-205c)로 용매를 증발시키는 감압 농축 및 건조과정을 통하여 복합추출물 75% 에탄올 추출물 10.8 g(수율 : 10.8%)를 수득하였다.

[ 실험예 ]

실험재료

세포 배양액인 RPMI-1640, Modifed Eagle Medium(MEM) non-essential amino acids solution, fetal bovine serum(FBS), streptomycine, penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 SCF(Stem cell factor, STEMCELL, Vancouver, Canada), LPS(Lipopolysaccharides, Sigma, St. Louis, MO, USA), IL-10(Recombinant Mouse IL-10, BD Pharmingen^TM, San Jose, CA, USA)을 구입하여 사용하였고, LTC₄ 측정 kit은 Cayman사(Ann Arbor, MI, USA), IL 측정용 kit는 R&D System사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.

세포배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% FBS, 100U/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycin을 포함한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)는 BALB/C 마우스의 대퇴골에서 골수세포를 분리하여, 10% FBS, 100U/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycine을 포함한 RPMI-1640 배지에 IL-3공급원으로 PWM-SCM(containing pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium) 을 final 20% 되도록 넣은 배양액으로 약 3주 정도 배양하여 90% 이상의 균질한 BMMC을 얻어 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였고, BMMC를 96-well plate에 일정한 수의 세포를 분주하여 실험하였다.

시료준비

실험에 사용하기 위한 시료로서 송엽과 토복령 복합추출물을 DMSO 용매에 녹여 농도 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다.

실험예 1. Nitric oxide(NO) 및 전염증성 사이토카인 생성량 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 nitric oxide (NO) 및 전염증성 사이토카인 IL-6 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Yang JH et al., Anti-inflammatory activity of ethylacetate fraction of Cliona celata. Immunopharmacol Immunotoxicol 2011, 33(2):373-379).

RAW 264.7 세포(1.5Ｘ10⁵ cells/well)를 24 well plate에 전 배양하여, DMEM 배지로 교체한 후 복합생약 추출물을 농도별로 1 시간동안 전 처리한 후에 LPS 200ng/㎖을 각 well에 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간동안 배양한 후 상층액을 수거하여 100㎕에 동량의 Griess 시약(G4410, Sigma)을 섞어 반응시킨 후 ELISA reader(Sunrise-Basic Tecan, TECAN)로 570 nm에서 흡광도를 측정하고 sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 NO의 생성량을 그래프로 나타내었다. 또한 수거한 상층액으로 TNF-a 및 IL-6 사이토카인을 ELISA kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 송엽과 토복령 복합추출물의 NO생성 저해 효과를 확인하기 위해 추출물을 전 처리한 결과, 12.5μg/㎖, 25μg/㎖, 50μg/㎖ 농도에서 nitrite의 생성량이 각각 15μM, 9μM, 2μM 의 농도로 저해효과를 나타내었으며, NO생성에 대한 IC₅₀는 16.8μM이었다.

사이토카인을 정량한 결과, 도 2와 같이, LPS를 처리한 세포상층액에서는 TNF-a의 경우 34.43 ng/㎖로 크게 증가되었으나, 송엽과 토복령 복합추출물(25μg/㎖, 50μg/㎖, 100μg/㎖)을 전 처리한 세포상층액에서 27.77 ng/㎖, 24.65 ng/㎖, 22.72 ng/㎖로 TNF-a 생성에 대하여 농도의존적인 억제활성을 나타냄을 확인하였다.

또한 도 3에 나타난 바와 같이, IL-6 사이토카인을 정량한 결과 LPS를 처리한 세포 상층액에서는 IL-6의 생성량이 3032 pg/㎖로 크게 증가되었으나, 송엽과 토복령 복합추출물(12.5μg/㎖, 25μg/㎖, 50μg/㎖)을 전 처리한 세포 상층액에서 1259 pg/㎖, 721 pg/㎖, 98 pg/㎖로 IL-6 생성에 대하여 농도의존적인 억제활성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. b- hexaminidase (b-Hex) 방출 억제 측정

상기 실시예의 얻은 BMMC의 탈과립 지표(marker)물질인 β-Hex 효소 활성 측정을 통해 탈과립의 정도를 확인하기 위하여, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다(Son JK et al, Ginkgetin, a Biflavone from Ginko biloba leaves, inhibits cyclooxygenases-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Biol Pharm Bull 2005, 28(12):2181-84).

2Ｘ10⁵ cells/well의 BMMC에 송엽과 토복령 복합추출물을 농도 별로 처리 하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분 동안 전배양한 후에 KL(100ng/㎖) (c-kit ligand, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃ 에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 β-hex 기질[100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/㎖ p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide]와 1:2(w/v)의 혼합비로 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후에 0.2M glycine(pH 10.7) (Sigma 사)으로 반응을 정지시켜 ELISA 판독기(Tecan System, San Jose, CA, USA)를 사용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 분비율(release %)로 환산하였다.

본 실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 송엽과 토복령 복합추출물은 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25 ㎍/㎖의 농도에서 각각 57%, 64%, 72% 저해를 하였으며, β-Hex에 대한 IC₅₀는 3.2 mg/㎖이었다.

류코트리엔 ( Leukotriene , LT ) 생성량 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 류코트리엔(Leukotriene, LT) 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621).

LT 생성을 확인하기 위해 1Ｘ10⁶ cells/㎖ BMMC에 송엽과 토복령 복합추출물을 농도 별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 1시간 동안 배양하고 SCF를 50ng/㎖농도로 15분간 자극하여 3000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리기(Centrifuge 5415R, Eppendorf)로 상층액을 분리하였다. 그 상층액 중 LTC₄ 함량을 LTC₄-EIA kit(Cayman)를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, SCF에 의해 자극된 세포에서는 LTC₄의 생성량이 급격히 증가 (76.74 ng/㎖)하였다. 송엽과 토복령 복합추출물의 LTC₄생성 저해 효과를 확인하기 위해 전 처리한 결과, LTC₄의 생성량은 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖ 세 농도에서 생성량이 각각 47.57 ng/㎖, 40.96 ng/㎖, 28.25 ng/㎖ 로 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였으며, LTC₄의 생성에 대한 IC₅₀는 13.1㎍/㎖이었다.

Claims (3)

1. 송엽과 토복령 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 복합추출물은 송엽과 토복령을 에탄올에 침지시킨 후 추출액을 수득하는 과정을 1~5회 반복 실시하는 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 복합추출물은 에탄올에 50~70℃에서 18~30시간 침지시킨 후 상온에서 추출액을 수득하는 과정을 반복 실시하는 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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