KR20120077889A

KR20120077889A - 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120077889A
Application number: KR1020100140012A
Authority: KR
Inventors: 안동현; 송유진; 이청조; 김꽃봉우리; 김태완; 신정화; 신별
Original assignee: 부경대학교 산학협력단; 신정화
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2012-07-10

Abstract

본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 송엽 또는 송절의 추출물은 대식세포의 NO (Nitric Oxide), TNF-α (tumor necrosis factor- α), IL-6 (InterLeukin-6) 및 IL-1β (Interleukin-1 β) 사이토카인 분비량을 감소시켜 염증을 억제하며, 아토피 피부염이 유발된 마우스의 부종 및 미란 등의 아토피 피부염 증상을 효과적으로 개선시키고, IL-4 (InterLeukin-4)등 사이토카인과 IgE (Immunoglobulin E) 항체의 분비량을 감소시켜 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Prevention or Treatment of atopic dermatitis Comprising an Extract of pine leaf or pine gnarl}

본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

인체의 피부는 물리적, 화학적으로 외계로부터 신체를 보호하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 영위하는 생명유지에 필수 불가결한 기관이다. 사람의 피부에 나타나는 모든 이상 소견을 피부질환, 즉 피부병이라 한다. 피부는 신체의 표면을 덮고 있으므로 외계로부터 자극이나 여러 병원체에 직접 접촉될 기회가 많고, 체내로부터의 영향을 강하게 받는다. 더욱이 피부의 근소한 변화도 눈으로 보고 손으로 만질 수 있으며, 병변부의 일부를 채취하여 병리조직학적으로 검사하거나, 미생물의 검색 등의 검사를 하기 쉽고, 개개의 질병의 진단을 명확하게 하는 것이 용이하므로, 그 종류는 다른 장기에 비해 상당한 수에 이르며, 병명도 복잡 다양하다. 비교적 흔한 피부질환으로는 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 두드러기, 무좀, 완선, 건선, 단순포진, 대상포진, 피부 건조증, 주부 습진, 여드름 등이 있다.

아토피 피부염 (atopic dematitis)은 공통적으로 원인 불명의 강한 소양감을 보이고 그 외에 피부의 건조, 피부 홍반과 염증이 복합적으로 동반되는 피부의 이상 증후군이다 (Lancet. 1998; 351:1715-1721). 아토피 피부염은 장기간 생활에 큰 불편을 끼치는 만성 질환으로, 주로 영아나 유아에게서 일어난다. 이는 전체 영아, 유아의 10 내지 15%에서 발생하는데, 아토피 환자군 내의 발생 현황을 살펴보면, 1년 이하의 영아기 때 60 %가, 5년 이하의 유아기 때 85 %가 발생한다 (Lancet. 1998; 351:1715-1721). 아토피 피부염 어린이 환자의 40 %는 성장과 함께 병세가 점점 개선되었으나 급격한 산업화로 유발된 공해, 환경오염 등으로 인해 성인의 발생율이 전체 성인의 1 내지 3 % 정도 (Immunol. Allergy. Cli. North Am. 2002; 22:1-24)로 산업화 이전에 비해 2 내지 3배로, 그 발생율이 증가하고 있다 (Lancet. 2003; 361:151-160). 이러한 이유로 많은 연구자가 아토피 피부염의 임상적인 증상을 감소시키는데 관심을 갖고 있다.

아토피성 피부염의 임상증상은 개인에 따라 차이는 보이지만, 대표적으로 나타나는 증세는 첫째로 극심한 가려움증을 호소하고, 둘째로 환자의 피부가 건조한 상태로 유지되어 불쾌감을 갖게 하며, 셋째로는 건조성 피부로 인해 피부 표면의 방어기능이 소실되어 외부로부터 자극물질의 피부침입이 쉬워지고, 이러한 침입물로 인하여 피부가 거부반응을 일으켜 염증반응이 일어나는 것이다 (Lancet. 1998; 351:1715-1721, J. Pediatr. Health Care. 2002; 16;143-145).

상기의 아토피 피부질환은 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않으나 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여하리라고 생각되고 있다. 아토피 피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피 피부염은 면역 글로불린E (IgE)와 연관된 면역기전에 의하여 발생하는데 특정 알레르겐에 대한 속발성 면역 반응보다는 T-세포 이상에 의한 원발성 면역반응이 관여한다는 보고들이 많다. 아토피 피부염 환자에게서 세포 매개성 면역기능 장애가 면역 글로불린 E의 증가와 관련이 있음이 밝혀지면서 속발성 면역 반응 외에도 원발성 면역 반응이 아토피 피부염의 병인에 관여한다고 주장하는 보고들이 증가하고 있다 (이기영, 최신알레르기 진료, 한국의학사, 서울, 2001, pp23~52).

아토피 피부염 환자에게서 세포 매개성 면역 장애는 약 80 %까지 발생하는 것으로 알려져 있으며, 바이러스 및 피부 사상균등에 의한 피부 감염증에 대하여 감수성이 증가하고 접촉 알레르겐에 대한 감수성은 감소하는 경향을 보인다. 과거에는T-세포 성숙 결핍설, CD8+ 억제 T-세포의 수적 감소 등이 보고된 바 있으나 최근엔 CD4+ T-세포의 역할이 더욱 중요한 것으로 알려지고 있다. 즉, B 세포로부터 면역글로불린 E의 생성을 유도 또는 촉진하는 인터루킨 (interleukin) 4, 5와 증폭시키는 인터루킨 6 등을 분비하는 T-세포는 CD4+ T-세포 중 Th2 세포인데 아토피 질환자들의 피부에서 Th1 세포에 비하여 Th2 세포가 높게 존재하는 것이 밝혀졌다. 이러한 사이토카인 (cytokine)들은 비만세포, 대식세포, 호염구 등의 면역세포를 자극하여 히스타민 (histamine), 루코트리엔 (leukotrien), 프로스타글란딘 (prostaglandin), 일산화질소 (NO) 등의 분비를 촉진하게 되고 이들 염증 매개 물질이 피부의 염증반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부질환에서 나타나는 또 다른 특징은 피부 세포의 세포막을 형성하는 지질 중 감마 리놀렌산 (γ-linolenic acid)의 결핍이 보고된 점이다. 감마 리놀렌산의 결핍은 필수 지방산의 생합성 경로에서 델타-6-디세추라아제 (δ-6-desaturase)의 기능 결손에 의하여 리놀레산 (linoleic acid)으로부터 감마 리놀렌산으로의 합성 장애로 인하여 일어나는 현상으로서, 이후 프로스타글란딘 등의 합성을 조절하지 못해 염증 매개 물질의 생성이 높아지게 된다. 또한, 감마 리놀렌산의 결핍으로 피부 지질막의 구조에 이상이 발생하여 과도한 수분 유출 등이 일어남으로써 피부 장벽이 허물어지는 결과를 초래하며 이때 세균 등의 2차 감염이 일어난다.

아토피 피부염의 원인과 치료에 대해서는 최근까지 많은 연구가 진행되고 있으나, 질환 자체의 복잡성과 서로 상충하는 연구 데이터들로 인해 정확한 병인과 유효한 치료법에 대해서 아직까지 명확한 이론이 확립되지 않은 상태이다. 따라서, 현재까지 개발되어 있는 아토피성 피부염 치료제는 스테로이드, 타크로리무스, 피메크롤리무스와 같은 국소 항염증 제제, 항히스타민제 및 사이클로스포린과 같은 면역 억제제 등이 이용되고 있다. 또한, 보조적인 요법으로 저자극성 보습제 사용, 자외선 A를 이용한 광화학 요법도 임상에서 시행되고 있다. 그러나 이러한 치료법 또는 치료제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 것으로서, 현재까지 아토피 피부염 환자들의 요구를 완전히 충족시켜주지 못하고 있다.

이에 따라 안전성이 입증된 천연물로부터 치료효과가 높고 부작용이 적은 치료제를 찾고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다. 현재까지 알려진 항아토피 관련 물질로는 단삼, 다래, 참소리쟁이, 삼백초, 자운고, 황련해독탕 등 육상식물 및 한약재가 주를 이루고 있다.

한편, 소나무는 항균, 항산화 등 다양한 생리 활성이 보고되고 있으며 천연의약품으로 이용되고 있다. 하지만 아직까지 송엽 또는 송절 추출물의 아토피 피부염의 예방 및 치료 효과에 대해서는 보고된바 없다.

이에 본 발명자는 치료효과가 높고 부작용이 적은 아토피 피부염의 치료제를 찾기 위한 연구를 계속하던 중, 소나무의 잎 또는 소나무 가지와 줄기 사이에 송진이 함유된 송절 부위의 추출물을 이용하여 LPS로 염증이 유도된 대식세포 배양액에 처리한 결과 NO (Nitric Oxide), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-6 (InterLeukin-6) 및 IL-1β의 분비량이 감소하여 염증을 효과적으로 억제하는 기작을 확인하였다. 또한 아토피 피부염 마우스 모델에서 송엽 또는 송절의 에탄올 추출물 도포 시 IFN-γ (Interferon-γ)의 분비가 증가하고 IL-4 및 IgE (Immunoglobulin E) 의 분비 억제 활성을 통해 부종 및 미란의 발생이 감소하여, 매우 우수한 아토피 피부염의 치료 또는 예방 효능을 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 소나무의 일부인 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 송엽 또는 송절의 에탄올 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

송엽 또는 송절을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하고 분쇄한다. 송엽 또는 송절은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 분쇄된 송엽 또는 송절에 적당한 양의 용매를 첨가하여 완전히 침지되도록 한다. 추출용매로는 물, 탄소수 1내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매가 바람직하며, 보다 바람직하게는 에탄올이다. 추출방법은 실온에서 함침하거나 가온할 수 있으며, 보다 바람직하게는 실온에서 10시간 동안 교반하여 추출한다. 다음 상기에서 얻은 송엽 또는 송절의 추출물을 원심분리 및 여과한 후 농축하여 최종 추출물을 수득한다. 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

송엽 (松葉)은 소나무 잎으로, 소나무 중에서도 향토수종인 적송이 으뜸인데, 잎은 생것 또는 그늘에서 말린 것을 사용한다.

송절 (松節)이란, 소나무 옹이 및 가지가 있는 부분을 의미하며, 소나무 가지가 성장하는 부분 및 소나무 가지가 절단된 부분을 포함하는 의미로 사용된다. 소나무 가지가 성장하는 부분은 송진이 모여 있는 곳이며, 가지가 절단된 부분은 송진이 모여 그 부분이 담황색으로 변해 있게 된다.

본 발명의 조성물은 유효성분인 송엽 또는 송절의 추출물뿐만 아니라 기존에 공지된 피부질환 예방 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

상기 조성물의 유효량은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 송엽 또는 송절의 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 1 ㎎/kg~250 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 송엽 또는 송절의 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한 상기 식품 조성물은 송엽 또는 송절의 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 송엽 또는 송절의 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 피부질환 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 외용제 또는 화장품 등으로 제형화 될 수 있다. 상기 피부 외용제는 연고제, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤 등을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 상기한 유효성분 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말 성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도 조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하는 것이 가능하다. 또한 종래의 아토피피부 치료제에 많이 사용되어온 세라마이드 (Ceramides) 등 보습제 또는 지질 (Lipids) 성분이나 하이드로코티손 (Hydrocortisone) 등의 스테로이드 (Steroids), 레티닐 팔미테이트 (Retinyl palmitate) 등의 비타민A 유도체 또는/및 토코페롤 (Tocopherol), 기타 식물추출물 등을 공지의 레시틴 (lecithin)을 이용하여 리포좀 (liposome) 형태로 만들거나 N-스테아로일-파이토스핑고신 (Nstearoyl-phytosphingosine)에 포접시켜 병용도 가능하다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으되, 종래의 화장료 제형인 피부외용연고, 에센스, 미백 크림, 로션, 에멀젼, 팩, 일반화장수, 스킨밀크, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 헤어토닉, 전신세정제, 오일젤과 같은 여러 가지 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 및 향료로 이루어지는 군으로부터 1 종 이상 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 염증이 유도된 마우스의 대식세포에서 염증 관련 인자인 NO, TNF-α, IL-6 및 IL-1β 분비량을 현저히 감소시키고, 아토피 피부염을 유발한 마우스 모델에서 상기 추출물을 도포하였을 때, 부종 및 미란 등의 증상을 완화시켰으며, IL-4 및 IgE의 분비량을 감소시켜 아토피 피부염에 현저한 억제 효과가 있다. 따라서 상기 조성물을 이용하여 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 의약품 또는 아토피 피부염의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 및 화장품에 사용할 수 있다.

도 1은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 대식세포에서 NO 분비량 감소에 따른 염증 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 대식세포에서 TNF-α의 분비량 감소에 따른 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 대식세포에서 IL-6의 분비량 감소에 따른 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다
도 5는 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 대식세포에서 IL-1β 의 분비량 감소에 따른 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다
도 6은 아토피 피부염 동물모델에서 송엽 추출물의 도포를 통한 아토피 피부염의 개선 효과를 관찰한 그림이다.
도 7은 아토피 피부염 동물모델에서 송절 추출물의 도포를 통한 아토피 피부염의 개선 효과를 관찰한 그림이다.
도 8은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 비장세포에서 IFN-γ의 분비량 증가에 따른 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다
도 9는 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 비장세포에서 IL-4의 분비량 감소에 따른 염증 억제 효과를 나타낸 그래프이다
도 10은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 비장세포에서 마우스 혈청 total IgE 함량 감소에 따른 아토피 피부염 억제 효과를 나타낸 그래프이다
도 11은 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 비장세포 증식능에 미치는 영향을 관찰한 그래프이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 송엽 또는 송절의 추출물 제조

본 실험에 사용한 송엽 또는 송절은 울진에서 자생하는 금강송으로부터 채취된 것으로 (주)솔나라에서 제공받아 사용하였다. 시료에 10 배 양의 70 % 에탄올을 가하여 실온에서 10시간 교반하여 추출하였다. 추출물은 원심분리 및 여과한 후, rotary evaporator (RE200, Yamato Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 -20 ℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실험예 1. 항염증 및 항아토피 피부염 실험을 위한 동물모델 설계

항염증 실험을 위한 마우스는 생후 6주령의 암컷, BALB/c 마우스를 사용하였으며, 오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea)로부터 구입하였다.

항아토피 실험을 위한 마우스는 생후 4주령의 수컷 BALB/c 마우스를 사용하였으며 오리엔트바이오(Orient Co., Seongnam, Korea)로부터 구입하였다.

마우스는 온도 20±2 ℃, 습도 50±10 %, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다.

실험예 2. 염증 억제 효과 확인

실험예 2-1. 대식세포의 분리 및 배양

실험예 1의 항염증 실험을 위한 BALB/c 마우스에 3 % thioglycollate를 복강주사하여 대식세포의 생성을 유도하고, 4 일 후 RPMI 1640 배지로 복강을 세척하였다. 회수한 복강 세척액은 원심분리한 후, 10 % FBS-RPMI 1640 배지를 첨가하여 5X10⁵및 5X10⁶ cell/mL 농도로 희석하였다. 이를 well plate에 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator (MCO-15 AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 4 시간 배양한 후, RPMI 배지로 3 회 세척하여 비부착 세포를 제거하고 10 % FBS-RPMI 1640 배지를 첨가하였다. 그 후, 음성대조군 (PBS만 처리), 양성대조군 (염증반응을 일으키기 위하여LPS (lipopolysaccharide) 5 μg/ml 처리)과 함께 LPS와 송엽 또는 송절 70 % 에탄올 추출물 1, 10, 50 μg/ml의 농도로 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 12 시간 및 24 시간동안 배양하였다.

실험예 2-2. 대식세포의 NO ( nitric oxide ) 분비량 측정

염증 매개인자인 NO의 분비 억제능을 확인하기 위하여 Microplate에 실험예 2-1의 24시간 배양한 대식세포 상층액을 넣고, 동량의 griess 시약(1 % sulfanilamide + 0.1 % naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10 분간 반응시킨 후, microplate reader기 (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO₂)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 1-50 μg/mL 농도의 송엽 에탄올 추출물 첨가 그룹에서 양성대조군에 비해 낮은 분비량을 보였다. 특히 송엽 50 μg/mL 농도에서 가장 낮은 NO 분비량을 보였다. 송절 에탄올 추출물의 경우에도, 양성대조군에 비해 다소 낮은 NO 분비량을 보였다. 이를 통해, 송엽, 송절 에탄올 추출물이 NO의 과다한 생성으로 인한 염증 반응 억제에 효과적임을 확인하였다.

실험예 2-3. 대식세포의 사이토카인 ( cytokine ) 분비량 측정

송엽, 송절 에탄올 추출물의 염증 억제 활성을 측정하기 위해 실험예 2-1의 대식세포에서 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비량을 측정하였다. 이를 위해 대식세포 배양액을 10,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리 (Micro 17TR, Hanil Co., Incheon, Korea)하여 상층액을 분리하였다. ELISA microplate에 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β 마우스 안티바디를 분주하여 코팅시키고, 10 % FBS 용액으로 blocking하였다. 배양액을 넣고 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 mAb와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하였다. IL-1β의 경우 biotinylated anti-mouse IL-1β를 첨가하고 1 시간 반응시킨 후, streptavidin- horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30 분동안 반응시켰다. 그 후, OPD 용액을 첨가하여 암반응 시키고 microplate reader기 (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 송엽, 송절 에탄올 추출물 첨가구의 모든 첨가 농도에서 TNF-α의 분비량이 양성대조군에 비해 현저히 감소하였다. 특히 송엽 추출물 50 μg/mL 농도에서 가장 낮은 TNF-α 분비량을 보였다. IL-6 및 IL-1β 분비량의 경우에도 송엽, 송절 에탄올 추출물 모든 첨가농도에서 양성대조군에 비해 유의적으로 낮은 값을 보였다 (도4, 도 5). 이상의 결과를 통해 송엽, 송절 에탄올 추출물이 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등의 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제시킴을 확인하였다.

실험예 3. 아토피성 피부염의 억제 효과 확인

실험예 3-1. 아토피 피부염의 유발 및 증상 관찰

송엽, 송절 에탄올 추출물의 아토피 피부염 억제 효과를 알아보기 위해 피부염을 인위적으로 일으키는 합텐 (hapten)형성 물질인 DNCB (2,4-dinitro chlorobenzene)를 BALB/c 마우스의 등 부위에 도포하여 아토피 피부염 유사 마우스 모델을 만든 후, 송엽, 송절 에탄올 추출물을 도포하여 아토피 피부염 증상에 미치는 영향을 알아보았다.

먼저 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후, 1 % DNCB 용액 (acetone : olive oil = 3 : 1)을 일주일에 3 번 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 도포하여 아토피 피부염을 유발하고, 일주일 후부터는 0.3 % DNCB 용액을 하루에 한번 동일한 부위에 고르게 도포하였다. 3 % 농도의 시료는 0.3 % DNCB 용액과 12 시간 간격으로 하루에 한번 2 주 동안 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 고르게 도포하였다.

아토피 피부염 증상은 제모 직후, 송엽, 송절 에탄올 추출물 도포 1 주일 및 2 주일 후 마우스 등 피부조직의 외형적 변화 (홍반, 가려움과 건조 피부, 부종, 짓무름 및 태선화)를 통해 관찰하였다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 제모한 직후에는 대조군과 차이를 보이지 않았으나, 송엽, 송절 에탄올 추출물을 1주일 동안 도포하였을 때 아토피 피부염의 대표적인 증상인 건조, 표피박탈 및 미란 등의 증상이 송엽 에탄올 추출물 처리구에서 발생하였다. 반면 송절 에탄올 추출물 처리구의 경우 건조한 상태를 유지하였지만 표피에 미란 등의 각질층이 줄어들었다. 송엽, 송절 에탄올 추출물을 2 주 동안 도포한 후 외형변화를 관찰한 결과, 송엽과 송절 에탄올 추출물 처리구에서 부종 및 미란 등의 증상이 양성대조군에 비해 감소함을 확인하였다. 이를 통해 송엽, 송절 에탄올 추출물이 아토피 피부염 억제에 효과를 보임을 알 수 있었다.

실험예 3-2. 비장세포의 사이토카인 분비량 측정

실험예 3-1의 아토피를 유발시킨 마우스로부터 비장을 적출하고 배양하여 비장세포 배양액의 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-4의 분비량을 측정하였다. 먼저 비장을 무균적으로 적출한 후, 조직 그라인더로 균질화하여 세포를 유리시켰다. 그 후, 10 % FBS-RPMI 1640 배지를 첨가하여 2×10⁶cell/mL 농도로 희석된 비장세포 현탁액을 well plate에 분주한 후 PBS를 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 72 시간 배양하였다.

상기 비장세포 배양액을 10,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리 (Micro 17TR, Hanil Co., Incheon, Korea)하여 상층액을 분리한 후, ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA)를 이용하여 IFN-γ 및 IL-4의 분비량을 측정하였다. 먼저, ELISA microplate에 anti-mouse IFN-γ 및 IL-4 mAb를 분주하여 coating시키고, 10 % FBS 용액으로 blocking하였다. 배양액을 넣고 biotinylated anti-mouse IFN-γ, IL-4 mAb와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하였다. OPD 용액을 첨가하여 암반응 시킨 후, microplate reader기 (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이 송엽과 송절 에탄올 추출물 처리구에서 양성대조군에 비해 IFN-γ 의 분비량이 증가하였고, 도 9에 나타낸 바와 같이 양성대조군에 비해 IL-4 의 분비량이 감소하였다. 비장세포 배양액에서 IFN-γ의 분비량이 송엽 또는 송절 에탄올 추출물 처리구에서310, 402 ng/mL로 71 ng/mL인 양성대조군에 비해 현저히 증가하였으며 IL-4의 분비량은 23, 28 ng/mL로 36 ng/mL인 양성대조구에 비해 약 20-40 %정도 감소하였다. 이를 통해 송엽, 송절 에탄올 추출물은 Th (T helper) 1 사이토카인의 분비량을 증가시키고, Th 2 사이토카인의 분비량 감소시켜 Th 1과 Th 2 조절을 통한 아토피 피부염 억제에 활성을 보이는 것을 확인하였다.

실험예 3-3. 혈청의 total IgE 함량 측정

아토피 피부염의 기전에 관여한다고 알려진 면역 글로불린 E (IgE)의 함량을 측정하여, 송엽 또는 송절 에탄올 추출물의 효과를 확인하였다. 실험 종료일에 안와 채혈한 후, 마우스의 혈청 내 total IgE의 함량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA)를 이용하여 측정하였다. 먼저, ELISA microplate에 anti-mouse IgE를 coating시키고, BSA로 blocking하였다. 일정 농도로 희석한 혈청을 넣고 반응시킨 후 biotinylated anti-mouse IgE와 strepavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하였다. OPD 용액을 첨가하여 암반응 시킨 후, microplate reader기 (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 송엽, 송절 에탄올 추출물 도포구의 IgE 분비량이 양성대조군에 비해 다소 감소하였다 (도 10). 이는 IL-4의 감소를 통해 IgE의 분비량이 억제되었을 것으로 생각되며, IgE의 감소로 인해 송엽 또는 송절 에탄올 추출물이 비만세포 및 호염구로부터 다양한 염증성 물질의 분비를 감소시켜 아토피 피부염을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3-4. 비장세포 증식능 확인

실험예 3-1의 마우스 비장세포를 분리?배양하여 MTT assay를 실시하였다.

그 결과 송엽, 송절 에탄올 추출물 처리구의 비장세포 증식능이 음성대조구에 비해 약 50 % 정도 증가함을 확인하였다 (도 11). 이를 통해 송엽, 송절 에탄올 추출물이 세포 독성을 가지지 않으며, 세포 사멸에 의해 사이토카인의 분비량이 감소한 것이 아님을 확인하였다. 또한 비장세포 증식능을 증가시켜 면역세포를 활성화 시키는 것을 확인하였다.

이하 본 발명의 상기 조성물을 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능식품, 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

송엽 또는 송절 추출물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

송엽 또는 송절 추출물 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

송엽 또는 송절 추출물 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 ; 식품의 제조

1. 건강기능식품의 제조

송엽 또는 송절 추출물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

송엽 또는 송절 추출물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 3 : 화장품의 제조

1. 유연화장수(스킨로션)의 제조

송엽 또는 송절 추출물 0.5 %

베타-1,3-글루칸 1.0 %

부틸렌글리콜 2.0 %

프로필렌글리콜 2.0 %

카르복시비닐폴리머 0.1 %

피이지-12 노닐페닐에테르 0.2 %

폴리솔베이트 80 0.4 %

에탄올 10.0 %

트리에탄올아민 0.1 %

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 to 100 %

2. 영양화장수( 밀크로션 )의 제조

송엽 또는 송절 추출물 0.5 %

베타-1,3-글루칸 1.0 %

밀납 4.0 %

폴리솔베이트 60 1.5 %

솔비탄세스퀴올레이트 1.5 %

유동파라핀 0.5 %

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 %

글리세린 3.0 %

부틸렌글리콜 3.0 %

프로필렌글리콜 3.0 %

카르복시비닐폴리머 0.1 %

트리에탄올아민 0.2 %

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 to 100 %

3. 영양크림의 제조

송엽 또는 송절 추출물 1.0 %

베타-1,3-글루칸 5.0 %

밀납 10.0 %

폴리솔베이트 60 1.5 %

피이지 60 경화피마자유 2.0 %

솔비탄세스퀴올레이트 0.5 %

유동파라핀 10.0 %

스쿠알란 5.0 %

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 %

글리세린 5.0 %

부틸렌글리콜 3.0 %

프로필렌글리콜 3.0 %

트리에탄올아민 0.2 %

방부제, 색소, 향료 적량

정제수 to 100 %

4. 국소투여용 약제(겔 연고제)

송엽 또는 송절 추출물 33.0 %

베타-1,3-글루칸 10.0 %

폴리아크릴산(Carbopol 940) 1.5 %

이소프로판올 5.0 %

헥실렌글리콜 25.0 %

트리에탄올아민 1.7 %

탈이온수 to 100 %

5. 국소 투여용 약제( 패취제 )의 제조

송엽 또는 송절 추출물1.0 %

베타-1,3-글루칸 3.0 %

헥실렌글리콜 20.0 %

디에틸아민 0.7 %

폴리아크릴산(Carbopol 934P) 1.0 %

아황산나트륨 0.1 %

폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9) 1.0 %

폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000) 1.0 %

점성의 파라핀 오일 2.5 %

카프릴산에스테르/카프르산에스테르 Cetiol LC) 2.5 %

폴리에틸렌글리콜 400 3.0 %

탈이온수 to 100 %

Claims

송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품
송엽 또는 송절의 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 완화용 화장료 조성물