KR20160114082A - 안정한 글루카곤 유사체 및 저혈당증의 치료를 위한 용도 - Google Patents
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Abstract
발명은 치환 Imp1 및 His3을 포함하는 글루카곤 유사체의 유도체, 라이신의 측쇄에 공유적으로 부착되는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가지는 치환기, 뿐만 아니라 그것들의 중간체 및 조성물 및 그것들의 의학에서의 용도에 관련된다.
Description
본 발명은 글루카곤 유사체의 신규한 유도체 및 그것의, 예컨대 저혈당증의 치료와 같은 의학에서의 사용에 관한 것이다.
글루카곤은 오랫동안 인슐린 작용에 의해 유발된 저혈당증을 치료하는 데 효과적인 것으로 알려져 왔다. 글루카곤의 과혈당 효과는 간 글리코겐의 글루코오스로의 분해 (글리코겐 분해)를 자극하고 간으로부터의 증가된 글루코오스 유출을 초래하는 아미노산 전구체로부터 유도된 글루코오스 생성 (글루코오스 신생합성)을 증가시킨 결과이다.
심각한 저혈당증을 치료하기 위한 상업적으로 입수 가능한 글루카곤은 냉동 건조된 글루카곤이 들어 있는 바이알과 물이 사전충전되어 있는 일회용 주사기로 구성된 키트 (Eli Lilly and Novo Nordisk)로서 공급된다. 사용 전에, 글루카곤은 주사기로부터의 물을 글루카곤이 들어 있는 바이알에 첨가함으로써 복원 (reconstitution)되어야 한다. 그런 다음 바이알은 모든 글루카곤이 용해될 때까지 부드럽게 흔들어주고 그 결과의 용액은 주사기에 다시 넣어져서 필요한 사람에게 주사된다. 심각한 저혈당증인 경우에 환자는 의식이 없거나 반-무의식이어서 글루카곤을 투여하기 위해 도움을 주는 사람에게 의존하게 된다.
복원 단계는 당뇨병과의 관련에 의해 다소 문제가 있는 것으로 여겨지고, 그것은 심각한 저혈당 사건의 치료를 지연시키거나 심지어 방해할 수도 있다.
사용할 준비가 되어 있는 사전충전된 장치에 대한 주요 장애물은 글루카곤의 고유한 불안정성이다. 글루카곤 용액은 용해 후 수시간 내에 겔 또는 피브릴을 형성한다. 또한, 글루카곤은 3 내지 9의 pH 범위에서 고유하게 낮은 용해도를 가진다. 그것은 여러 개의 불안정한 아미노산을 함유하고, 글루카곤 조성물의 화학적 안정성은 주로 탈아미드화, 이성질체화, 산화 및 가수분해성 절단으로 인해 매우 낮다.
사용할 준비가 되어 있는 사전충전된 장치의 개발을 가능하게 하기 위하여, 새로운 비-피브릴화 글루카곤 유사체가 개발될 필요가 있다. 또한, 글루카곤의 개선된 화학적 안정성은 연장된 시간 동안 용액이 실온에서 유지되는 것을 가능하게 하기 위해 필요하다. 나아가, 그런 글루카곤 유사체는 피하 (SC) 또는 근육 내 (IM) 투여 후 빠르게 작동 (예컨대 과혈당 효과)이 개시되어야 한다.
한 구체예에서, 발명은 다음 식 I을 포함하는 글루카곤 유사체의 유도체 또는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
상기 식에서,
X2는 Ser 또는 Aib이고;
X10은 Tyr, Leu, Ile 또는 Val이며;
X12는 Lys 또는 Arg이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val 또는 Lys이고;
X20은 Gln, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Lys이고;
X24는 Gln, Ala, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X27은 Met, Leu 또는 Val이고;
X28는 Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu 또는 Lys이며;
X29는 Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu 또는 Lys이고; 및
X30은 없거나 Lys이며;
상기 유도체는 식 I의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착되어 있는 치환기를 포함하고, 이때 상기 치환기는 다음 식 II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
를 가지며, 상기 식에서
Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타내고,
Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 개별적으로 없거나 개별적으로 Ser 잔기, Ala 잔기, Gly 잔기, 다음 식 i, 식 ii, 식 iii, 식 iv 및 식 v로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내며:
이때 식 i, ii, iii 및 iv는 개별적으로 입체 화학 L 또는 D를 가지며,
단 상기 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다.
한 구체예에서 발명은 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다:
(i) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-글루카곤.
한 구체예에서 발명은 발명의 유도체 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물에 관련된다.
한 구체예에서 발명은 의학에 사용하기 위한 발명에서 정의된 것과 같은 유도체에 관련된다.
한 구체예에서 본 발명은 글루카곤 유사체의 신규한 빠른-작용 유도체, 즉 투여 후 신속한 생물학적 작용의 개시가 요구되는 예컨대 저혈당증의 치료에 사용될 수 있는 글루카곤 유사체의 유도체에 관련된다.
본 발명자들은 놀랍게도 발명의 유도체가 용액에서 개선된 화학적 및 물리적 안정성을 가지는 한편 인간 글루카곤 수용체에 대해 양호한 효능 및 빠른 과혈당 효과의 개시를 유지하는 것을 발견하였다. 따라서, 발명의 유도체는 액체 조성물이 상기 유도체를 포함하는 상기 액체 조성물의 장기간 안정성을 가지는 것을 가능하게 한다.
유도체는 위치 1에서 아미노산 치환 이미다조프로피오닐 (Imp) 및 위치 3에서 히스티딘을 포함한다. 유도체는 나아가 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가지는 치환기를 포함하며, 이때 상기 치환기는 아미노산의 측쇄, 예컨대 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착된다.
한 구체예에서 발명은 다음 식 I을 포함하는 글루카곤 유사체의 유도체 또는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
상기 식에서,
X2는 Ser 또는 Aib이고;
X10은 Tyr, Leu, Ile 또는 Val이며;
X12는 Lys 또는 Arg이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val 또는 Lys이고;
X20은 Gln, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Lys이고;
X24는 Gln, Ala, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X27은 Met, Leu 또는 Val이고;
X28는 Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu 또는 Lys이며;
X29는 Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu 또는 Lys이고; 및
X30은 없거나 Lys이며;
상기 유도체는 식 I의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착되어 있는 치환기를 포함하고, 이때 상기 치환기는 다음 식 II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
를 가지며, 상기 식에서
Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타내고,
Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 개별적으로 없거나 개별적으로 Ser 잔기, Ala 잔기, Gly 잔기, 다음 식 i, 식 ii, 식 iii, 식 iv 및 식 v로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내며:
이때 식 i, ii, iii 및 iv는 개별적으로 입체 화학 L 또는 D를 가지며,
단 상기 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다.
한 구체예에서, 기호 "*" (또는 다르게는 파선)는 본원의 화학적 구조식에서 사용될 때 유도체에서 인접한 위치에의 부착점을 나타낸다.
글루카곤 펩티드 및 유사체
본원에서 사용되는 용어 "글루카곤 펩티드"는 그것의 서열이 SEQ ID NO:1로서 서열 목록에 포함되어 있는 인간 글루카곤 또는 그것의 유사체 (예컨대 식 I의 글루카곤 유사체)를 나타낸다. SEQ ID NO:1의 서열을 가지는 펩티드는 또한 본원에서 "글루카곤"으로서도 언급될 수 있다. 한 구체예에서 본원에서 사용되는 용어 "글루카곤"은 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO:1)을 나타낸다.
발명의 유도체는 글루카곤 유사체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "글루카곤 유사체"는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 변이체인 펩티드 또는 화합물을 나타낸다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체는 다음 식 I을 포함한다:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
상기 식에서,
X2는 Ser 또는 Aib이고;
X10은 Tyr, Leu, Ile 또는 Val이며;
X12는 Lys 또는 Arg이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val 또는 Lys이고;
X20은 Gln, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Lys이고;
X24는 Gln, Ala, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X27은 Met, Leu 또는 Val이고;
X28는 Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu 또는 Lys이며;
X29는 Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu 또는 Lys이고; 및
X30은 없거나 Lys이다.
발명의 유도체의 글루카곤 유사체는 i) 변형된 아미노산 잔기에 해당하는 인간 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기의 수 (즉 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 해당 위치) 및 ii) 실제 변형을 참조로 기술될 수 있다. 다음은 적합한 유사체 명명법의 비-제한적인 실레이다.
다른 말로 하면, 글루카곤 유사체는 인간 글루카곤 (SEQ ID NO:1)에 비교할 때 변형된 아미노산 잔기의 수인 글루카곤 펩티드이다. 이들 변형은 독립적으로 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 나타낼 수 있다. 예를 들어, "[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤"은 위치 1의 아미노산이 Imp로 치환되었고, 위치 3의 아미노산이 His으로 치환되었으며, 위치 15의 아미노산이 Glu로 치환되었고, 위치 24의 아미노산이 Lys으로 치환되었으며, 위치 27의 아미노산이 Leu으로 치환되었고, 위치 28의 아미노산이 Ser으로 치환된 글루카곤 (SEQ ID NO:1)을 표시한다.
특정한 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는 SEQ ID NO:1과 비교하여 추가의 변화를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 유사체는 명시된 변화를 "가진다".
상기 실시예로부터 분명한 것과 같이, 아미노산 잔기들은 그것들의 전체 이름, 1-글자 코드 및/또는 그것들의 3-글자 코드에 의해 확인될 수 있다. 이들 3가지 방법은 완전히 동등하다. 한 구체예에서 펩티드 유사체 및 그것의 유도체는 IUPAC-IUB 명명법에 따라 표준 1-글자 또는 3-글자 코드를 사용하여 표시된다.
표현 "위치" 또는 "해당하는 위치"는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)을 참조로 하여 글루카곤 유사체 서열의 변화 부위를 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 변화의 수뿐만 아니라 위치는 예컨대 간단한 수기 및 육안 관찰에 의해 쉽게 추론될 수 있다.
예컨대 발명의 유도체의 글루카곤 유사체의 맥락에서 사용된 용어 "펩티드"는 아미드 (또는 펩티드) 결합에 의해 상호연결된 일련의 아미노산들을 포함하는 화합물을 나타낸다. 발명의 펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 구성성 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 펩티드는 i) 29 또는 ii) 30 아미노산으로 a) 이루어지거나 또는 b) 구성된다. 추가의 특정 구체예에서 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호연결된 아미노산들로 구성된다.
아미노산은 아미노기 및 카르복실산기, 및 임의로, 측쇄로도 언급되는 하나 또는 그 이상의 추가의 기를 함유하는 분자들이다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 코드된 아미노산 (그 중에서도 20개의 표준 아미노산)과, 뿐만 아니라 코드되지 않은 아미노산을 포함한다. 코드된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코드화된 것들이다 (IUPAC Table 1 section 3AA-1, http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/아미노Acid/AA1n2.html#AA1). 코드화되지 않은 아미노산은 천연 펩티드 및/또는 단백질에서 발견되지 않거나, 또는 표준 세포 기작에 의해 생성되지 않는 것들 (예컨대 그것들은 번역-후 변형이 수행될 수 있음)이다. 코드화되지 않은 아미노산의 비-제한적 실례는 Aib (알파-아미노아이소부티르산), 데스-아미노-히스티딘 (또 다른 명칭은 이미다조프로피온산, 약칭 Imp), 뿐만 아니라 코드된 아미노산들의 D-이성질체들이다. 본원에서, Imp는 그것이 아미노기를 함유하진 않지만 아미노산으로서 언급된다.
다음으로, 그것에 대한 광학 이성질체가 표시되지 않은 글루카곤 펩티드의 모든 아미노산은 (다른 표시가 없는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 인지되어야 한다.
글루카곤 펩티드는 글루카곤과 비교하여 총 15개까지의 아미노산 차이 (본원에서는 변형으로도 언급됨), 예를 들면 하나 또는 그 이상의 첨가, 하나 또는 그 이상의 결실 및/또는 하나 또는 그 이상의 치환을 가지는 글루카곤 유사체 (SEQ ID NO:1)일 수 있다.
한 구체예에서 글루카곤 유사체는 식 I로 구성된다. 한 구체예에서 X2는 Ser이다. 한 구체예에서 X10은 Tyr이다. 한 구체예에서 X12는 Lys이다. 한 구체예에서 X15는 Asp이다. 한 구체예에서 X16은 Ser이다. 한 구체예에서 X20은 Gln이다. 한 구체예에서 X21은 Asp이다. 한 구체예에서 X24는 Gln이다. 한 구체예에서 X27은 Met이다. 한 구체예에서 X28은 Asn이다. 한 구체예에서 X29는 Thr이다. 한 구체예에서 X30은 없다. 한 구체예에서 X2는 Aib이다. 한 구체예에서 X10은 Leu이다. 한 구체예에서 X15는 Glu이다. 한 구체예에서 X16은 Leu이다. 한 구체예에서 X16은 Val이다. 한 구체예에서 X20은 Lys이다. 한 구체예에서 X21은 Glu이다. 한 구체예에서 X24는 Lys이다. 한 구체예에서 X24는 Ala이다. 한 구체예에서 X27은 Leu이다. 한 구체예에서 X28은 Ser이다. 한 구체예에서 X28은 Lys이다. 한 구체예에서 X29는 Lys이다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체는 C-말단 아미드를 포함하지 않는다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체 또는 유도체는 X30의 C-말단에 첨가된 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
한 구체예에서 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에, 3 내지 15 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함한다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 3 내지 15 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함한다. 한 구체예에서 유도체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 14개까지, 예컨대 13개까지 또는 12개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함한다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 11개까지, 예컨대 10개까지 또는 9개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함한다. 한 구체예에서 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 8개까지, 예컨대 7개까지 또는 6개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함한다.
글루카곤 유도체
발명은 글루카곤 유사체의 유도체에 관련된다. 글루카곤 펩티드, 예컨대 글루카곤 유사체의 맥락에서 본원에서 사용된 용어 "유도체"는 하나 또는 그 이상의 치환이 글루카곤 펩티드에 공유적으로 부착되어 있는, 화학적으로 변형된 글루카곤 펩티드를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "치환기"는 수소 원자를 대체하는 화학적 부분 또는 기를 의미한다. 유도체는 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르 등으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있다.
한 구체예에서 글루카곤 유도체는 식 I의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착된 치환기를 포함한다. 한 구체예에서 치환기는 다음 식 II를 가진다:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
상기 식에서 Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타내고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 개별적으로 없거나 개별적으로 Ser 잔기, Ala 잔기, Gly 잔기, 다음 식 i, 식 ii, 식 iii, 식 iv 및 식 v로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내며:
이때 식 i, ii, iii 및 iv는 개별적으로 입체화학 L 또는 D를 가진다.
한 구체예에서, Y12는 유도체의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 질소 원자에 부착된다. 한 구체예에서 치환기는 라이신의 측쇄의 엡실론-질소 원자에 공유 부착된다. 한 구체예에서 치환기는 위치 X12, X16 또는 X20에서 라이신에 부착된다. 한 구체예에서 치환기는 위치 X21, X24 또는 X28에서 라이신에 부착된다. 한 구체예에서 치환기는 위치 X29 또는 X30에서 라이신에 부착된다. 한 구체예에서 치환기는 위치 X24에서 라이신에 부착된다. 치환기는 라이신의 측쇄의 엡실론-질소 원자에 Y12를 통하여 공유 부착될 수 있다. 치환기는 위치 X12, X16 또는 X20에서 라이신에 Y12를 통하여 부착될 수 있다. 치환기는 위치 X21, X24 또는 X28에서 라이신에 Y12를 통하여 부착될 수 있다. 치환기는 위치 X29 또는 X30에서 라이신에 Y12를 통하여 부착될 수 있다. 치환기는 위치 X24에서 라이신에 Y12를 통하여 부착될 수 있다.
한 구체예에서 Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "C2-6 아실기"는 다음과 같이 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 분지되거나 분지되지 않은 아실기를 나타낸다:
한 구체예에서 Y1은 아세틸기이다. 본원에서 사용된 용어 "석시노일"은 다음 부분: 
을 나타낸다. 한 구체예에서 Y1은 석시노일 부분이다. 한 구체예에서 Y1은 수소이다.
한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 및 Y12는 존재하는 경우 아미드 결합을 통해 연결된다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 없다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 Ser 잔기이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 Ala 잔기이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 Gly 잔기이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 식 i이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 식 ii이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 식 iii이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 식 iv이다. 한 구체예에서 Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 식 v이다. 한 구체예에서 치환기는 식 i의 3 내지 10, 예컨대 3 내지 5 또는 4개의 잔기를 포함한다.
한 구체예에서 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다. 한 구체예에서 치환기는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다. 한 구체예에서 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다. 한 구체예에서 치환기는 3 내지 10, 예컨대 3 내지 7 또는 3 내지 5개의 음으로 하전된 부분을 가진다. 본원에서 사용되는 용어 "음으로 하전된 부분"은 음으로 하전될 수 있는 화학적 부분을 의미하며, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 아미노산 부분 (예컨대 Glu, 감마-Glu, Asp 또는 베타-Asp, 카르복실산, 설폰산 또는 테트라졸 부분)을 의미한다. 한 구체예에서 "음으로 하전된 부분"의 수는 생리적 pH (pH 7.4)에서 측정된다. 한 구체예에서 "음으로 하전된 부분"은 카르복실산 기이다.
한 구체예에서 치환기는 다음 부분이다:
한 구체예에서 치환기는 다음 부분이다:
한 구체예에서 치환기는 다음 부분이다:
한 구체예에서 치환기는 다음 부분이다:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 1:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 2:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 3:
한 구체예에서 유도체는 Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤이다.
Chem. 4:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 5:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 6:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 7:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 8:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 9:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 10:
한 구체예에서 유도체는 Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 11:
한 구체예에서 유도체는 Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 12:
한 구체예에서 유도체는 Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 13:
한 구체예에서 유도체는 Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤이다.
Chem. 14:
한 구체예에서 유도체는 Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤이다.
Chem. 15:
한 구체예에서 유도체는 Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤일)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]Lys이다.
Chem. 16:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]아세틸]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 17:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 18:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 19:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 20:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤이다.
Chem. 21:
한 구체예에서 유도체는 Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤이다.
Chem. 22:
약학적으로 허용되는 염, 아미드, 에스테르 또는
카르복실산
발명의 유도체, 유사체 및 중간 생성물은 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 카르복식산 또는 에스테르의 형태로 존재할 수 있다. 염은 예컨대 염기와 산 사이의 화학적 반응에 의해 형성되는데, 예컨대 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4이다. 염은 염기성 염, 산성 염일 수 있고, 또는 둘 다 아닐 수도 있다 (즉 중성 염). 염기성 염은 물 중에서 하이드록사이드 이온을 생성하고 산성 염은 하이드로늄 이온을 생성한다. 한 구체예에서 유도체는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르이다.
발명의 유도체의 염은 음이온성 기 또는 양이온성 기 사이에서 각각 첨가된 양이온 또는 음이온으로 형성될 수 있다. 이들 기는 글루카곤 유사체 부분에 및/또는 발명의 유도체의 치환기에 있을 수 있다.
발명의 유도체의 음이온성 기의 비-제한적 실례는 치환기, 뿐만 아니라 존재한다면 글루카곤 유사체 부분의 유리 카르복실기를 포함한다. 글루카곤 유사체 부분은 보통 C-말단에 유리 카르복실산 기를 포함하고, 또한 Asp 및 Glu와 같은 내부 산 아미노산 잔기에서 유리 카르복실기를 포함할 수 있다.
글루카곤 유사체의 양이온 기들의 비-제한적 실례는 His, Arg 및 Lys과 같은 내부 염기성 아미노산 잔기들의 유리 아미노기를 포함한다.
발명의 유도체의 에스테르는 예컨대 유리 카르복실산 기와 알코올 또는 페놀과의 반응에 의해 형성될 수 있고, 그것은 알콕시 또는 아릴옥시기에 의한 적어도 하나의 하이드록실기의 대체를 유도한다.
에스테르 형성은 글루카곤 유사체의 C-말단에서 유리 카르복실기 및/또는 치환기에 어떠한 유리 카르복실기를 포함할 수 있다.
발명의 유도체의 아미드는 예컨대 유리 카르복실산 기와 아민 또는 치환된 아민과의 반응에 의해, 또는 유리 또는 치환된 아미노기와 카르복실산과의 반응에 의해 형성될 수 있다.
아미드 형성은 글루카곤 유사체의 C-말단에서 유리 카르복실기, 치환기의 어떠한 유리 카르복실기, 글루카곤 유사체의 N-말단에 유리 아미노기 및/또는 글루카곤 유사체 및/또는 치환기의 어떠한 유리 또는 치환된 아미노기를 포함할 수 있다. 한 구체예에서 유도체는 글루카곤 유사체의 C-말단 아미드를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 발명의 유도체는 C-말단의 카르복실산 기를 포함한다. 한 구체예에서 발명은 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 환자에게 해롭지 않은 염을 가리키는 것으로 의도된다. 한 구체예에서 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재한다. 한 구체예에서 유도체의 카르복실산은 글루카곤 유사체의 C-말단에서 아미드기를 포함하는 유도체, 즉 글루카곤 유사체이다. 다른 특정 구체예에서, 유도체는 약학적으로 허용되는 아미드, 바람직하게는 글루카곤 유사체의 C-말단에 아미드기를 가지는 형태로 존재한다. 또 다른 추가의 특정 구체예에서, 글루카곤 유사체 또는 유도체는 약학적으로 허용되는 에스테르의 형태로 존재한다.
글루카곤 펩티드의 유도체의 제조
발명의 유도체는 아래에 기술되는 방법에 의해 제조될 수 있다.
SPPS
일반적 방법
사용될 Fmoc-보호된 아미노산 유도체들은 표준 권장될 수 있다: 예컨대 Anaspec, Bachem, Iris Biotech 또는 NovabioChem으로부터 공급되는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH 및 Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Imp를 포함시키기 위해 3-(N-1-트리틸-이미다졸-4-일)-프로피온산이 사용된다.
SPPS는 Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 U.S.A.)로부터의 Prelude 고상 펩티드 합성기 상에서 Fmoc 기초 화학을 사용하여 수행될 수 있다. C-말단 카르복실산의 제조를 위해 적합한 수지는 Fmoc-Thr(tBu)-Wang 수지 (Low Load, 0.35 mmol/g)와 같은 아미노산이 사전 로딩된 Wang 수지이다. 치환기가 C-말단 라이신에 부착되어 있는 경우에, 적합한 수지는 사전 로딩된 fmoc-Lys(Mtt)-Wang이다. C-말단 펩티드 아미드의 제조에 적합한 수지는 H-링크 아미드-ChemMatrix 수지 (로딩 예컨대 0.52 nmol/g) 또는 링크 아미드 AM 폴리스티렌 수지 (Novabiochem, 로딩 예컨대 0.62 mmol/g) 등이다. Fmoc-탈보호는 NMP 중의 20% 피페리딘으로 이루어진다. 펩티드 커플링은 DIC/HOAt/콜리딘 또는 DIC/옥시마 퓨어/콜리딘 중 하나를 사용하여 사전활성화 없이 수행된다. 아미노산/HOAt 또는 아미노산/옥시마 퓨어 용액 (NMP 중에 0.3 M/0.3 M, 3 내지 10배의 몰 과량)을 수지에 첨가한 후 동일한 몰 당량의 DIC (NMP 중의 3 M)와 이어서 콜리딘 (NMP 중의 3 M)이 첨가된다. 예를 들어, 다음 양의 0.3 M 아미노산/HOAt 용액이 다음 규모의 반응에 대해 커플링당 사용될 수 있다: 규모/mL, 0.05 mmol/1.5 mL, 0.10 mmol/3.0 mL, 0.25 mmol/7.5 mL. Mtt 기는 수지를 HFIP/DCM (75:25) (2분, 2회)으로 세척하고, DCM으로 세척한 후 수지를 HFIP/DCM (75:25)(20분, 2회)에 현탁하고 계속해서 순서대로 피페리딘/NMP (20:80), DCM(1회), NMP(1회), DCM(1회), NMP(1회)로 세척함으로써 제거될 수 있다.
치환기의 부착
치환기는 상기 기술된 것과 같이 Prelude 펩티드 합성기에 의해 적합하게 보호된 빌딩 블록을 사용하여 단계식 과정으로 도입될 수 있고, 이때 아미노산 및 카르복실산 유도체, 이를테면 Fmoc-Ado-OH, Fmoc-Glu-OtBu 및 아세트산, 프로피온산, 아이소부티르산, 부티르산, 펜탄산, 헥산산 또는 4-메틸 펜탄산이 변형된다. 각각의 커플링 단계 후에, 미반응 펩티드 중간체는 과량 (>10 당량)의 아세트산 무수물 및 콜리딘을 사용하여 캡핑될 수 있다.
라이신의 엡실론-질소 상에 치환기의 도입은 Mtt (Fmoc-Lys(Mtt)-OH)로 보호된 라이신을 사용하여 이루어진다. 다르게는, 라이신의 엡실론-질소는 ivDde 기 (Fmoc-Lys(ivDde)-OH)로 보호될 수 있다. 치환기에 감마-Glu 부분의 포함은 아미노산 Fmoc-Glu-OtBu를 사용한 커플링에 의해 이루어질 수 있다.
치환기에 각 부분의 도입은 연장된 커플링 시간 (1회 6시간)과 이어서 아세트산 무수물로의 캡핑 또는 다르게는 아세트산/DIC/HOAt/콜리딘으로의 캡핑에 의해 이루어질 수 있다. 치환기 상의 말단 질소의 아세틸화는 NMP 중의 아세트산 무수물 (10 당량) 및 콜리딘 (20 당량)을 사용하여 이루어진다.
수지로부터의 절단
합성 후 수지는 DCM으로 세척되고, 펩티드는 수지로부터 TFA/TIS/물 (95/2.5/2.5)을 사용한 2 내지 3시간 동안의 처리와 이어서 다이에틸에테르로의 침전에 의해 절단된다. 침전물은 다이에틸에테르로 세척된다.
정제 및 정량
미정제 펩티드는 물과 MeCN, 예컨대 물/MeCN (4:1)의 혼합물에 용해되고, 역상 제조용 HPLC (Waters Deltaprep 4000 또는 Gilson)에 의해 C18-실리카겔을 함유하는 칼럼 상에서 정제된다. 용출은 0.1% TFA를 함유하는 물 중의 MeCN의 증가하는 구배를 사용하여 수행된다. 관련 분획은 분석 HPLC 또는 UPLC에 의해 조사된다. 순수한 표적 펩티드를 함유하는 분획들은 혼합되고 감압하에 농축된다. 그 결과의 용액은 분석되고 (HPLC, LCMS) 생성물 (즉 유도체)은 화학발광 질소 특이적 HPLC 검출기 (Antek 8060 HPLC-CLND)를 사용하여 또는 280 nm에서의 UV-흡광도를 측정함으로써 정량된다. 생성물은 유리 바이알에 분배된다. 바이알은 Millipore 유리섬유 프레필터로 캡핑된다. 그것들을 냉동-건조하면 백색 고체로서의 펩티드 트라이플루오로아세테이트가 얻어진다.
중간 생성물
한 구체예에서 발명은 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다:
(i) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-글루카곤.
한 구체예에서 발명은 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련된다:
(xvii) [Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xviii) [Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xix) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤.
한 구체예에서 발명은 중간 생성물 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련되고, 이때 글루카곤 유사체는 다음의 글루카곤 (SEQ ID NO:1) 유사체들로부터 선택된다:
(i-a) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii-a) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii-a) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix-a) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x-a) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤.
한 구체예에서 발명은 중간 생성물 또는 그것들의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관련되고, 이때 글루카곤 유사체는 다음의 글루카곤 (SEQ ID NO:1) 유사체들로부터 선택된다:
(xvii-a) [Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xviii-a) [Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xix-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤.
발명의 글루카곤 유도체는 (i) 중간 글루카곤 유사체의 제조와 이어서 (ii) 치환기의 부착을 포함하는 단계식 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 방법의 단계 (i)은 실험 단원에서 기술되는 것과 같이 보호된 아미노산을 사용하여 표준 고상 합성을 사용하여 이루어질 수 있고; 수지로부터 절단된 후에 글루카곤 유사체는 본원의 실험 단원에서 기술된 것과 같이 제조용 HPLC를 사용하여 정제되어 중간 생성물이 얻어질 수 있다. 다르게는, 이 방법의 단계 (i), 중간 생성물의 제조는 WO2009/083549에 기술된 것과 같이 반-재조합 합성법을 사용하여 수행될 수 있다. 이 방법의 단계 (ii), 즉 최종 생성물을 유도하는 중간 생성물에 대한 치환기의 부착, 뿐만 아니라 치환기 자체의 제조는 WO2009/083549에 기술된 방법들을 사용하여 이루어질 수 있다.
기능적 특성들
첫 번째 기능성 구체예에서, 발명의 유도체는 화학적으로 안정하다. 또한, 또는 다르게는, 두 번째 기능성 구체예에서, 유도체는 물리적으로 안정하다. 또한, 또는 다르게는, 세 번째 기능성 구체예에서, 유도체는 글루카곤 수용체에 대해 양호한 수용체 결합 및 효능을 가진다. 또한, 또는 다르게는, 네 번째 기능성 구체예에서, 유도체는 빠른-작용 유도체이다. 또한, 또는 다르게는, 네 번째 기능성 구체예에서, 유도체는 고도의 용해도를 가진다. 또한, 또는 다르게는, 여섯 번째 기능성 구체예에서, 유도체는 GLP-1 수용체에 대한 그것의 EC50과 글루카곤 수용체에 대한 그것의 EC50 사이에 높은 비율 (또는 인간 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 그것과 동등한 비율)을 가진다. 한 구체예에서 기능성 구체예들에서 효과는 인간 글루카곤 (SEQ ID NO:1)에 비례하여 측정된다.
화학적 안정성
본원에서 사용된 용어 펩티드 조성물의 "화학적 안정성"은 천연 펩티드 (예컨대 인간 글루카곤) 구조에 비교하여 잠재적인 더 적은 생물학적 효능 및/또는 잠재적인 증가된 면역원성 특성을 가지는 화학적 분해 산물의 형성을 유도하는 펩티드 구조의 화학적 공유 변화를 나타낸다. 다양한 화학적 분해 산물은 천연 펩티드의 유형 및 성질 및 그 펩티드가 노출되는 환경에 따라 형성될 수 있다. 화학적 분해는 대부분 완전하게 피할 수 없을 것 같고 화학적 분해 산물의 증가하는 양은 보통 연장된 저장 중에 볼 수 있다. 대부분의 펩티드는 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 유리 카르복실산이 형성되는 과정인 탈아미드화가 진행되기 쉽다. 다른 분해 경로는 공유적으로 결합된 이량체, 올리고머 및 중합체 분해 산물의 형성을 유도하는, 둘 또는 그 이상의 펩티드 분자가 서로 트랜스아미드화 및/또는 이황화 상호작용을 통해 공유적으로 결합되는 고분자량 변형 산물의 형성을 포함한다 (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). 산화 (예를 들면 메티오닌 잔기의 산화)는 화학적 분해의 다른 변형으로서 언급될 수 있다. 아스파라긴 또는 아스파르트산 함유 펩티드는 D- 및 L-이성질체가 둘 다 형성될 수 있는 해당하는 아이소-아스파르트산 이성질체를 유발하는 중간 아스파르티미드의 형성을 통해 이성질체화가 쉽게 이루어질 수 있다. 아스파르티미드 중간체는 또한 D-아스파르트산 이성질체의 형성을 유도할 수 있다. (Formulation Consideration for Proteins Susceptible to Asparagine Deamidation and Aspartate Isomerization, Wakankar and Borchardt, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, Vol. 95, no. 11, p 2321). 마지막으로, 펩티드는 또한 펩티드 단편 또는 단일한 아미노산이 펩티드 결합의 가수분해에 의해 절단되는 가수분해성 절단이 진행될 수 있다.
조성물의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출된 후 다양한 시점에서 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다 (분해 산물의 형성은 보통 예를 들면 온도 증가에 의해 가속화될 수 있다). 각각의 개별적인 분해 산물의 양은 보통 다양한 크로마토그래피 기법 (예컨대 SE-HPLC 및/또는 RP-UPLC)을 사용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라 분해 산물의 분리에 의해 측정된다.
그러므로, 상기에서 개관한 것과 같이, "안정화된 조성물"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리적 및 화학적 안정성을 가지는 조성물을 나타낸다. 일반적으로, 조성물은 유효기간이 다 될 때까지 (권장 사용 및 저장 조건과 부합하게) 사용 및 저장 중에 안정해야 한다.
유도체의 화학적 안정성은 본원에 기술된 분석 (IV)에서 화학적 분해의 측정에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서 화학적으로 안정한 유도체는 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 3% 미만 또는 2% 미만의 화학적 분해를 나타내며, 이때 상기 화학적 분해는 본원에 기술된 분석 (IV)에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서 유도체는 5% 미만, 예컨대 4% 미만, 3% 미만 또는 2% 미만의 화학적 분해를 나타내며, 이때 상기 화학적 분해는 본원에 기술된 분석 (IV)에 의해 측정될 수 있다.
물리적 안정성
펩티드는 물리적 상태의 다양한 변화가 진행될 수 있다. 펩티드는 특정 세트의 조건에서 용해도의 부족으로 인해, 예컨대 pH의 변화로 인해 아미노산 측쇄 상의 반발 전하의 중성화로 인해 침전될 수 있다. 다른 물리적 변화는 아밀로이드 피브릴의 형성인데, 그것은 베타-쉬트가 풍부한 마크로분자 섬유 구조로의 형태적 변화를 포함한다. 다른 마크로분자 구조는 응집에 의한 덜 체계적인 구조적 반복에 의해 형성될 수 있다. 후자의 두 가지 경우에서 펩티드 물질은 궁극적으로 침전물로서 관찰될 수 있다. 실제로 이들 물리적 변화는 어느 정도는 상관될 수 있는데, 예를 들면 용해도 대 pH 및 피브릴 형성은 서로 관련된다 [Schmittschmitt and Scholtz, Protein Science, 12, 10, 2374-2378, 2003]. 나아가, 이들 현상을 육안 검사만으로 구별하기는 어려우므로, 이들 변화의 결과는 보통 일반적인 용어 "침전물"에 의해 기술된다.
물리적 상태의 다른 변화들은 용액으로부터의 펩티드의 함량의 손실로서 관찰된 표면에의 흡착 및 액체 용액으로부터 겔로의 변화를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 그것의 성질이나 겔의 형성과 무관한 침전물의 관찰은 주사 가능한 약제로 그것의 저장 및 사용중일 때 문제가 된다.
글루카곤은 중성 pH에서 매우 낮은 수성 용해도를 가지며, 그것은 중성 pH에서 약학 조성물이 기능할 수 없게 만든다. 산성 pH에서 용해될 때조차도, 글루카곤은 농도 및 온도에 따라 다양한 상 (phase) 전이가 진행될 수 있어서 물리적으로 매우 불안정하다. 글루카곤 샘플을 염산에 녹인 후 샘플의 점도가 낮고 용액이 완전히 투명한 지체-상 (lag-phase)이 발생할 수 있다. 몇 시간이 지난 후 점도는 증가하기 시작하며 - 그것은 겔 형성을 나타낸다 (Beaven et al, European J. Biochem. 11 (1969) 37-42). 고원 (plateau)에 도달한 후 점도는 다시 감소하기 시작하고 동시에 피브릴이 나타날 수 있으며 용액으로부터 침전될 수 있다. 과정은 볼 수 있고, 소량의 사전-형성된 겔의 첨가는 지체-상을 감소시킨다. 겔 형성 및 피브릴화는 물리적 스트레스, 예컨대 가열 및 흔듦에 매우 의존적이며, 이것들은 둘 다 과정의 속도를 증가시킨다.
본원에 사용된 용어, 조성물의 "물리적 안정성"은 펩티드 및/또는 단백질이 펩티드 및/또는 단백질의 열-기계적 스트레스에의 노출 및/또는 탈안정화시키는 계면과 표면, 예컨대 소수성 표면과 계면 사이의 상호작용의 결과로서 펩티드 및/또는 단백질의 생물학적으로 비활성 및/또는 불용성 응집체를 형성하는 경향을 나타낸다. 수성 펩티드 및/또는 단백질 조성물의 물리적 안정성은 적합한 용기 (예컨대 카트리지 또는 바이알)에 채워진 조성물이 상이한 온도에서 다양한 시간 주기 동안 기계적/물리적 스트레스 (예컨대 교반)에 노출된 후에 육안 검사 및/또는 혼탁도 측정에 의해 평가된다. 조성물의 육안 검사는 어두운 배경을 가진 좁은 촛점의 빛 중에서 수행된다. 조성물의 혼탁도는 예를 들어 0 내지 3의 척도로 혼탁도 정도를 등급화한 육안 점수에 의해 특성화된다 (혼탁도를 나타내지 않는 조성물은 육안 점수 0에 해당하고, 주간에 가시적인 혼탁도를 나타내는 조성물은 육안 점수 3에 해당한다). 조성물은 단백질 응집과 관련하여 주간에 가시적인 혼탁도를 나타낼 때 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다. 다르게는, 조성물의 혼탁도는 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 간단한 혼탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 수성 펩티드 및/또는 단백질 조성물의 물리적 안정성은 또한 펩티드 및/또는 단백질의 형태적 상태의 분광학적 제제 또는 프로브를 사용함으로써 평가될 수 있다. 프로브는 바람직하게 우선적으로 펩티드 및/또는 단백질의 비-천연 컨포머에 결합하는 작은 분자이다. 펩티드 및/또는 단백질 구조의 작은 분자 분광학적 프로브의 한 실례는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 피브릴의 검출에 광범위하게 사용되어 온 형광 염료이다. 피브릴의 존재하에, 그리고 아마도 다른 펩티드 및/또는 단백질 형태도 마찬가지로, 티오플라빈 T는 피브릴 펩티드 및/또는 단백질 형태에 결합될 때 약 450 nm에서의 새로운 여기 최대값 및 약 482 nm에서의 증강된 발광값을 발생시킨다. 미결합 티오플라빈 T는 본질적으로 이들 파장에서 비-형광성이다.
다른 작은 분자들이 천연 상태로부터 비-천연 상태로의 펩티드 및/또는 단백질 구조의 변화에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어 "소수성 패치"는 우선적으로 펩티드 및/또는 단백질의 노출된 소수성 패치에 결합하는 것을 프로브한다. 소수성 패치는 일반적으로 펩티드 및/또는 단백질의 천연 상태의 삼차 구조 내에 묻히지만, 펩티드 및/또는 단백질이 펼쳐지거나 변성되기 시작함에 따라 노출되기 시작한다. 이들 작은 분자, 분광학적 프로브의 실례는 방향족, 소수성 염료, 예컨대 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이다.
유도체의 물리적 안정성은 본원에 기술된 분석 (III)에서 회복 및/또는 지체 시간에 의해, 즉 ThT 피브릴화 분석에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서 물리적으로 안정한 유도체는 본원에 기술된 분석 (III)에서 70%보다 큰 회복 및/또는 7시간 이상의 지체 시간을 가진다.
한 구체예에서 유도체는 ThT 피브릴화 분석, 예컨대 본원에 기술된 분석 (III)에서 70%보다 큰 회복을 가진다. 한 구체예에서 유도체는 ThT 피브릴화 분석, 예컨대 본원에 기술된 분석 (III)에서 90%보다 큰, 예컨대 95%보다 큰 또는 98%보다 큰 회복을 가진다. 한 구체예에서 유도체는 ThT 피브릴화 분석, 예컨대 본원에 기술된 분석 (III)에서 약 100%의 회복을 가진다.
한 구체예에서 유도체는 ThT 피브릴화 분석, 예컨대 본원에 기술된 분석 (III)에서 7시간 이상, 예컨대 20시간 이상 또는 45시간 이상의 지체시간을 가진다.
수용체 결합 및 효능
발명의 유도체는 글루카곤 수용체 아고니스트이다. 수용체 아고니스트는 수용체에 결합하고 천연 리간드에 전형적인 반응을 유도하는 유도체로서 정의될 수 있다. 한 구체예에서 본원에서 사용된 용어 "글루카곤 수용체"는 인간 글루카곤 수용체를 의미한다.
한 구체예에서 발명의 유도체는 글루카곤 수용체 아고니스트이거나 및/또는 글루카곤 수용체 활성을 가진다. 한 구체예에서 발명의 글루카곤 유사체는 글루카곤 수용체 아고니스트이거나 및/또는 글루카곤 수용체 활성을 가진다. 한 구체예에서 글루카곤 펩티드는 글루카곤 수용체 아고니스트이거나 및/또는 글루카곤 수용체 활성을 가진다. 용어 "글루카곤 수용체 활성"은 글루카곤 수용체에 결합하고 세포내 신호 변환 경로, 예컨대 아데닐레이트 사이클라제 및 기술분야에 공지되어 있는 것과 같이 생리적 효과를 중재하는, 증가된 수준의 세포내 cAMP를 활성화하는 능력을 말한다. 예를 들어, 발명의 유도체 또는 유사체는 본원에 기술된 분석 (I)(b) 분석 (II)(b)를 사용하여 글루카곤 수용체 활성에 대해 시험될 수 있다.
한 구체예에서 유도체는 200 pM보다 크지 않은 EC50을 가지는 글루카곤 수용체의 아고니스트이다. 한 구체예에서 유도체는 예컨대 본원에 기술된 분석 (I)(b)에 의해 측정되는 바 200 pM 아래, 예컨대 100 pM 아래 또는 20 pM 아래의 EC50을 가지는 글루카곤 수용체의 아고니트스이다. 다른 구체예에서 유도체는 예컨대 본원에 기술된 분석 (I)(b)에 의해 측정되는 바 10 pM 아래, 예컨대 5 pM 아래의 EC50을 가지는 글루카곤 수용체의 아고니트스이다.
한 구체예에서 유도체는 적어도 50, 예컨대 적어도 100, 1000 또는 5000의, GLP-1 수용체에 대한 그것의 EC50과 글루카곤 수용체에 대한 그것의 EC50 사이의 비율을 가지며, 이때 상기 효능 (즉 EC50)은 본원에 기술된 분석 (I)(a) 및 분석 (I)(b)를 사용하여 측정될 수 있다.
한 구체예에서 발명의 유도체는 본원에 기술된 분석 (II)(b)에 의해 측정되는 바 100 nM 아래, 예컨대 50 nM 아래, 10 nM 아래 또는 2 nM 아래의 IC50을 가진다.
빠른-작용 유도체
한 구체예에서 유도체는 빠른-작용 유도체이다. 한 구체예에서, 본원에 사용되는 바 "빠른-작용 유도체"는 과혈당 효과가 빠르게 개시된다. 한 구체예에서 "빠른-작용 유도체"는 피하 또는 근육 내 투여 후에 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 그것에 동등한 과혈당 효과의 작용이 개시된다.
한 구체예에서 빠른-작용 유도체는 피하 또는 근육 내 투여 후에 인간 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 개선된 생체내 활용성을 가진다.
용해도
발명의 유도체는 가용성 글루카곤 수용체 아고니스트일 수 있다. 한 구체예에서 유도체의 용해도는 적어도 0.1 mmol/l, 적어도 0.2 mmol/l 또는 적어도 0.5 mmol/l, 예컨대 적어도 2 mmol/l, 적어도 4 mmol/l 또는 적어도 8 mmol/l 또는 적어도 10 mmol/l 또는 적어도 15 mmol/l이다. 한 구체예에서 용어 "가용성", "용해도" 및 "수성 용해도"는 발명의 유도체와 관련하여 사용될 때, 유도체의 1) 물에서의 용해도 또는 2) 수성 염 또는 수성 완충제 용액, 예를 들면 10 mM 포스페이트 용액 중에서의 용해도 또는 3) 다른 화합물을 함유하는 수용액 중에서의 용해도를 나타내며, 이때 상기 용해도는 6.5 내지 8.5, 예컨대 7.0 내지 8.5 또는 7.4 내지 8.2 범위의 pH에서 측정될 수 있다.
한 구체예에서 가용성 유도체는 7.0 내지 8.5, 예컨대 7.4 내지 8.2 범위의 pH를 가지는 10 mM 포스페이트 용액에서 적어도 0.1 mmol/l의 용해도를 가진다.
한 구체예에서 유도체는 적어도 0.1 mmol/l의 용해도를 가진다. 한 구체예에서 유도체의 용해도는 7.4 내지 8.2 범위의 pH에서 10 mM 포스페이트 완충액 중에서 상기 유도체를 포함하는 조성물 중에서 측정될 수 있다.
약학 조성물
한 구체예에서 발명은 발명의 유도체 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관련된다. 한 구체예에서 조성물은 비경구 투여, 예컨대 SC, IM 또는 IV 투여에 적합하다. 용어 "약학 조성물"과 "조성물"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
발명의 유도체를 함유하는 약학 조성물은 종래 기법에 의해, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 or in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995에 기술된 대로 제조될 수 있다.
한 구체예에서 발명은 발명의 유도체를 포함하는 약학 조성물에 관련되고, 이때 상기 유도체는 약 0.01 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 예컨대 약 0.05 mg/mL 내지 약 5 mg/mL 및 약 0.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL의 농도로 존재하고, 상기 조성물은 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다. 약학 조성물은 발명의 유도체를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도체는 약 0.01 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다.
한 구체예에서 약학 조성물은 발명의 유도체의 수용액 및 완충액을 포함하고, 이때 상기 유도체는 0.01 mg/mL 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다. 다른 구체예에서 약학 조성물은 발명의 유도체의 수용액 및 완충액을 포함하고, 이때 상기 유도체는 0.01 mg/mL 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 상기 조성물은 약 6.5 내지 약 8.5의 pH를 가진다.
한 구체예에서 발명의 조성물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다. 다른 구체예에서 조성물은 약 6.5 내지 약 8.5의 pH를 가진다. 추가의 구체예에서 조성물은 약 7.0 내지 약 8.5, 예컨대 약 7.2 내지 약 8.2의 pH를 가진다.
조성물은 추가로 완충제 시스템, 보존제(들), 등장성 제제(들), 킬레이트화제(들), 안정화제 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서 약학 조성물은 수성 조성물, 즉 물을 포함하는 조성물이다. 그런 조성물은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 발명의 추가의 구체예에서 약학 조성물은 수용액이다. 용어 "수성 조성물"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 조성물이다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 용액으로서 정의된다. 한 구체예에서 조성물은 비-수성 유기 용매를 포함한다.
다른 구체예에서 약학 조성물은 사용 전에, 예컨대 의사 또는 환자에 의해 용매 및/또는 희석제가 첨가되는 냉동-건조된 조성물이다.
또 다른 구체예에서 약학 조성물은 어떠한 사전 용해 없이 사용할 준비가 되어 있는 건조된 조성물 (예컨대 냉동-건조 또는 분무-건조)이다.
한 구체예에서 발명은 발명의 유도체 및 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분, 예컨대 GLP-1, 인슐린 또는 그것들의 유사체 및/또는 유도체를 포함하는 조성물에 관련된다. 한 구체예에서 발명은 발명의 유도체 및 GLP-1 또는 그것들의 유사체 및/또는 유도체를 포함하는 조성물에 관련된다. 한 구체예에서 발명은 발명의 유도체 및 인슐린 또는 그것들의 유사체 및/또는 유도체를 포함하는 조성물에 관련된다. 발명의 유도체 및 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 포함하는 조성물은 "공동-제형"으로서 언급될 수 있다. 한 구체예에서 그런 공동-제형은 물리적으로 안정한 및/또는 화학적으로 안정한 조성물이다.
발명의 유도체가 중성 pH에서 가용성일 수 있다는 사실은 공동-제형이 인슐린을 포함하는 것을 허용하고 보다 안정한 혈당 수준 및 감소된 수의 저혈당 에피소드, 뿐만 아니라 당뇨병 관련 합병증의 감소된 위험을 허용할 수 있다.
약학적 투여
발명의 유도체는 환자에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 유도체의 투여 경로는 근육 내 (IM), 피하 (SC) 또는 정맥 내 (IV)일 수 있다. 환자에게 투여될 본 발명의 유도체를 포함하는 조성물의 단위용량은 의사에 의해 선택되도록 권장된다.
비경구 투여는 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의해 주사기, 임의로 펜-형 주사기에 의해 수행될 수 있다. 한 구체예에서 발명의 유도체를 포함하는 조성물은 글루카곤 투여를 위해 사용할 준비가 되어 있는 펜 장치로 사용될 수 있다. 다르게는, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 한 구체예에서 발명의 유도체를 포함하는 조성물은 글루카곤 투여용 펌프로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 비강 투여일 수 있다. 추가의 선택사항으로서, 발명의 유도체를 함유하는 글루카곤 제제는 또한 경피 투여에 의해, 예컨대 바늘이 없는 주사에 의해 또는 패치, 임의로 이온영동 패치로부터 또는 점막을 통해, 예컨대 볼 투여에 의해 적용될 수 있다.
발명에 따르는 방법에 사용될 때 발명의 유도체 또는 조성물의 전형적인 단위용량은 약 0.0001 내지 약 1 mg/kg 체중/1일, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 1 mg/kg 체중/1일, 보다 바람직하게는 약 0.005 내지 약 0.02 mg/kg 체중의 범위이다. 상기에서 기술된 것과 같이, 발명의 유도체는 하나 또는 그 이상의 추가의 치료적 활성 화합물 또는 물질과 함께 투여되거나 적용될 수 있고, 적합한 추가의 화합물 또는 물질은 예를 들면 항당뇨병제, 항고지혈증제, 항비만제, 항고혈압제 및 당뇨병으로부터 유발된 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료를 위한 제제들로부터 선택될 수 있다.
적합한 항당뇨병제는 인슐린, 인슐린 유도체 또는 유사체, GLP-1 (글루카곤 유사 펩티드-1) 유도체 또는 유사체 [예컨대 WO 98/08871 (Novo Nordisk A/S)에 기술된 것들, 또는 다른 GLP-1 유사체, 예컨대 엑세나티드 (Byetta, Eli Lilly/Amylin; AVE0010, Sanofi-Aventis), 타스포글루티드 (Roche), 알비글루티드 (Syncria, GlaxoSmithKline)], 아밀린, 아밀린 유사체 (예컨대 심린/프람린티드) 및 뿐만 아니라 경구적으로 활성인 저혈당 제제들을 포함한다.
약학적 표시
본 발명은 또한 의학에서 사용하기 위한 발명의 유도체에 관련된다. 한 구체예에서 유도체는 저혈당증을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용된다.
한 구체예에서 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 발명의 유도체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 저혈당증의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 관련된다.
한 구체예에서 발명의 유도체는 저혈당증, 인슐린 유도된 저혈당증, 반응성 저혈당증, 당뇨병성 저혈당증, 비-당뇨병성 저혈당증, 단식-저혈당증, 약물-유도성 저혈당증, 위 우회 유도된 저혈당증, 임신중 저혈당증, 알코올 유도성 저혈당증, 인슐린종 및/또는 폰 기에르케병의 치료 또는 예방에 사용된다.
한 구체예에서 발명의 유도체는 위장관의 운동의 억제에 사용하기 위한 것으로, x-선, CT- 및 NMR-스캐닝과 같은 기법을 사용한 위장관의 조사와 관련하여 유용하다.
한 구체예에서 유도체는 베타-차단제 중독의 치료에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 간 지방증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 인슐린 유도성 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 반응성 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 당뇨병성 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 비-당뇨병성 인슐린 유도성 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 단식 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 약물-유도된 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 위 우회 유도된 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 임신중 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 알코올-유도성 저혈당증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 인슐린종의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 한 구체예에서 유도체는 폰 기에르케병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
한 구체예에서 유도체는 상기 유도체의 치료적 유효량을 제공하는 단위용량 처방으로 투여된다. 본원에서 사용되는 용어, 발명의 유도체의 "치료적 유효량"은 주어진 질병 및/또는 그것의 합병증의 임상적 징후들을 치료, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양을 말한다. 이것을 이루기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 각각의 목적에 효과적인 양들은 질병 또는 손상의 심각성뿐만 아니라, 환자의 체중과 일반적 상태에 따라 좌우될 것이다. 적절한 단위용량의 측정은 기본적인 실험을 사용하여, 값들의 매트릭스를 구성하고 매트릭스에서 상이한 지점들을 시험함으로써 이루어질 수 있고, 그것들은 모두 훈련된 의사 또는 수의사의 통상적인 숙련도 수준 내에 있다는 것이 인지될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 및 그것들의 다른 변용 용어들은 상태, 예컨대 질환 또는 장애에 맞설 목적으로 환자 또는 환자의 관리 및 돌봄을 나타낸다. 그 용어들은 환자가 고통받는 주어진 상태에 대한 전체 치료 스펙트럼, 예컨대 증상 또는 그것의 합병증을 완화시키기 위해, 질환, 장애 또는 상태의 진전을 지연시키기 위해, 질환, 장애 또는 상태를 치료하거나 제거하기 위해 및/또는 상태를 예방하기 위해 관심의 활성 화합물(들)을 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도되며, 이때 예방은 질환, 상태 또는 장애에 맞설 목적으로 환자를 관리하고 돌보는 것으로서 인지되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위하여 관심의 활성 화합물(들)을 투여하는 것을 포함한다. 치료될 환자는 바람직하게 포유류, 특히 인간이지만, 다른 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 염소 또는 돼지의 치료도 발명의 범주 내에 있다.
발명의 유도체들의 추가의 특정 구체예들이 "특정 구체예들"이란 제목의 단원에서 기술된다.
특정
구체예들
다음은 발명의 비-제한적인 특정 구체예들이다:
1. 다음 식 I을 포함하는 글루카곤 유사체의 유도체 또는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
상기 식에서,
X2는 Ser 또는 Aib이고;
X10은 Tyr, Leu, Ile 또는 Val이며;
X12는 Lys 또는 Arg이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val 또는 Lys이고;
X20은 Gln, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Lys이고;
X24는 Gln, Ala, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X27은 Met, Leu 또는 Val이고;
X28는 Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu 또는 Lys이며;
X29는 Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu 또는 Lys이고; 및
X30은 없거나 Lys이며;
상기 유도체는 식 I의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착되어 있는 치환기를 포함하고, 이때 상기 치환기는 다음 식 II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
를 가지며, 상기 식에서
Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타내고,
Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 개별적으로 없거나 개별적으로 Ser 잔기, Ala 잔기, Gly 잔기, 다음 식 i, 식 ii, 식 iii, 식 iv 및 식 v로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내며:
이때 식 i, ii, iii 및 iv는 개별적으로 입체 화학 L 또는 D를 가지며,
단 상기 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다.
2. 상기 글루카곤 유사체가 식 I로 구성되는, 전술한 구체예에 따르는 유도체.
3. 상기 글루카곤 유사체 또는 유도체가 X30의 C-말단에 첨가된 아미노산을 포함하지 않는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
4. 상기 유도체는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
5. 상기 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 3 내지 15개의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
6. 상기 유도체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 14개까지, 예컨대 13개까지 또는 12개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
7. 상기 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 11개까지, 예컨대 10개까지 또는 9개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
8. 상기 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 8개까지, 예컨대 7개까지 또는 6개까지의 아미노산 잔기 변형, 예컨대 치환 또는 첨가를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
9. X2가 Ser인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
10. X10이 Tyr인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
11. X12가 Lys인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
12. X15가 Asp인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
13. X16이 Ser인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
14. X20이 Gln인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
15. X21이 Asp인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
16. X24가 Gln인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
17. X27이 Met인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
18. X28이 Asn인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
19. X29가 Thr인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
20. X30이 없는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
21. X2가 Aib인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
22. X10이 Leu인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
23. X15가 Glu인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
24. X16이 Leu인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
25. X16이 Val인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
26. X20이 Lys인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
27. X21이 Glu인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
28. X24가 Lys인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
29. X24가 Ala인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
30. X27이 Leu인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
31. X28이 Ser인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
32. X28이 Lys인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
33. X29가 Lys인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
34. Y12가 상기 유도체의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 상기 질소 원자에 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
35. 상기 치환기가 라이신의 측쇄의 엡실론-질소 원자에 공유적으로 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
36. 상기 치환기가 위치 X12, X16 또는 X20에서 라이신에 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
37. 상기 치환기가 위치 X21, X24 또는 X28에서 라이신에 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
38. 상기 치환기가 위치 X29 또는 X30에서 라이신에 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
39. 상기 치환기가 위치 X24에서 라이신에 부착되어 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
40. 상기 치환기가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 음으로 하전된 부분을 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
41. 상기 치환기가 식 i의 3 내지 10, 예컨대 3 내지 5 또는 4개의 잔기를 포함하는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
42. 상기 치환기의 Y1이 아세틸기인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
43. 상기 치환기가 다음 부분들로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
44. 상기 치환기가 다음 부분인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
45. 상기 유도체가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 1:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 2:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 3:
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 4:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 5:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 6:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 7:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 8:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 9:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 10:
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 11:
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 12:
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 13:
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 14:
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤
Chem. 15:
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤일)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]Lys
Chem. 16:
46. 상기 유도체가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체:
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]아세틸]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 17:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 18:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 19:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 20:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 21:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤
Chem. 22:
47. 상기 글루카곤 유사체가 C-말단 아미드를 포함하지 않는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
48. 상기 유도체는 200 pM보다 크지 않은 EC50을 가지는 글루카곤 수용체의 아고니스트인, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
49. 상기 유도체는 본원에 기술된 분석 (III)과 같은 ThT 피브릴화 분석에서 70%보다 큰 회복을 타나내는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
50. 상기 유도체는 본원에 기술된 분석 (III)과 같은 ThT 피브릴화 분석에서 7시간보다 긴 지체 시간을 타나내는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
51. 상기 유도체는 본원에 기술된 분석 (IV)에 의해 측정되는 바 5% 미만의 화학적 분해를 나타내는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
52. 상기 유도체는 적어도 0.1 mmol/l의 용해도를 가지는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
53. 상기 용해도는 7.4 내지 8.2의 범위의 pH에서 10 mM의 포스페이트 완충액 중에 상기 유도체를 포함하는 조성물에서 측정될 수 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
54. 상기 유도체는 적어도 50의, GLP-1 수용체에 대한 그것의 EC50 효능과 글루카곤 수용체에 대한 그것의 EC50 효능 사이의 비율을 가지고, 상기 효능은 본원에 기술된 분석 (I)(a) 및 분석 (I)(b)를 사용하여 측정될 수 있는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 유도체.
55. 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것들의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
(i) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-글루카곤.
56. 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것들의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
(xvii) [Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xviii) [Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xix) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤.
57. 글루카곤 유사체가 다음의 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 유사체들로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 중간 생성물 또는 그것들의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
(i-a) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii-a) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii-a) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii-a) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix-a) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x-a) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii-a) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi-a) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤.
58. 글루카곤 유사체가 다음의 글루카곤 (SEQ ID NO:1)의 유사체들로부터 선택되는, 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따르는 중간 생성물 또는 그것들의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
(xvii) [Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xviii) [Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xix) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤.
59. 전술한 구체예들 중 어느 하나에서 정의된 유도체 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
60. 의학에서 사용하기 위한, 전술한 구체예들 중 어느 하나에서 정의된 유도체.
61. 저혈당증을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 구체예 60에 따르는 유도체.
62. 치료를 필요로 하는 환자에게 전술한 구체예들 중 어느 하나에서 정의된 유도체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 저혈당증의 치료 및/또는 예방 방법.
실시예
발명은 다음의 실시예를 참조로 한층 더 예시될 것이며, 실시예들은 청구되는 것과 같은 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
약어 목록
BOC: 삼차-부틸 옥시카르보닐
DCM: 다이클로로메탄
DIC: 다이아이소프로필카르보다이이미드
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HOAt: 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량 분광학
MeCN: 아세토니트릴
Min: 분
Mtt: 4-메틸트리틸
NMP: N-메틸 피롤리돈
Oxyma Pure: 시아노-하이드록시이미노-아세트산 에틸 에스테르
RP: 역상
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RT: 실온
Rt: 보유 시간
SPPS: 고상 펩티드 합성
TFA: 트라이플루오로아세트산
TIPS: 트라이아이소프로필실란
UPLC: 초성능 액체 크로마토그래피
10EE: 10의 제곱 (예컨대 "10EE(X)"는 숫자 10의 (X)제곱을 나타내거나, 간단하게 숫자 10(X)를 나타냄, 즉 5x10EE3는 5x103임)
일반적 방법
이 단원은 수지 결합 펩티드의 합성 방법 (SPPS 방법, 아미노산의 탈보호 방법, 수지로부터 펩티드를 절단하는 방법 및 펩티드의 정제 방법을 포함함)뿐만 아니라 그 결과의 펩티드의 검출 및 특성확인 방법 (LCMS 및 UPLC 방법)에 관련된다.
SPPS
일반적 방법
이 단원은 고상 펩티드 합성 방법 (SPPS 방법, 아미노산의 탈보호 방법, 수지로부터 펩티드를 절단하는 방법 및 펩티드의 정제 방법을 포함함)뿐만 아니라 그 결과의 펩티드의 검출 및 특성확인 방법 (LCMS 및 UPLC 방법)에 관련된다. 사용된 Fmoc-보호된 아미노산 유도체는 예컨대 Anaspec, Bachem, Iris Biotech 또는 Novabiochem.으로부터 공급되는 표준 권장된 것들이었다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 또는 Fmoc-Val-OH 등. 특별히 표시되지 않는 한, 명시된 아미노산의 천연 L-형태를 사용하였다. N-말단 Imp를 3-(N-1-트라이틸-이미다졸-4-일)-프로피온산을 사용하여 포함시켰다.
이 단원 "SPPS 일반적 방법"의 아래에서 표시한 모든 조작을 100-μmol 합성 규모에서 수행하였다.
C-말단 카르복실산의 제조에 적합한 수지는 Fmoc-Thr(tBu)-Wang 수지 (Low Load, 0.35 mmol/g)와 같은 아미노산이 사전 로딩된 Wang 수지였다. 치환기가 C-말단 라이신에 부착되어 있는 경우에, 적합한 수지는 사전 로딩된 fmoc-Lys(Mtt)-Wang이었다.
SPPS를 Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 U.S.A.)로부터의 Prelude 고상 펩티드 합성기 상에서 수지 로딩, 예컨대 낮은 로딩 Fmoc-Gly-Wang (0.35 mmol/g)에 비해 6배 과잉의 Fmoc-아미노산 (300 mM HOAt 또는 Oxyma Pure®가 첨가된 NMP 중의 300 mM)을 사용하여 100-μmol 규모로 수행하였다. Fmoc-탈보호를 NMP 중의 20% 피페리딘을 사용하여 수행하였다. 커플링을 NMP 중의 3:3:3:4의 아미노산/Oxyma Pure®/DIC/콜리딘을 사용하여 수행하였다. NMP와 DCM 상부 세척 (각각 2 x 2)을 탈보호 단계와 커플링 단계 사이에 수행하였다. 커플링 시간은 일반적으로 60 또는 120분이었다. 일부 아미노산은 "이중 커플링"되었는데, 그것은 첫 번째 커플링 후에, 수지가 누출되고 더 많은 시약이 첨가되었으며 (아미노산, (HOAt 또는 Oxyma Pure®), DIC 및 콜리딘), 혼합물은 다시 반응하는 것이 허용된 것을 의미한다.
수지
결합된
보호된 펩티드 골격에의 치환기의 부착
아실화될 라이신의 엡실론 아미노기를 Mtt를 사용하여 보호하였다. Mtt-탈보호를 헥사플루오로아이소프로판올/DCM (75:25, 5 x 20 ml, 각 10분)으로 처리하고, 이어서 상기 "SPPS 일반적 방법" 단원에서 기술한 대로 세척함으로써 수행하였다.
라이신의 화학적 변형을 상기에서 기술한 것과 같이 Prelude 펩티드 합성기 상에서 Fmoc-Glu-OtBu 또는 빌딩 블록을 사용하여 하나 또는 그 이상의 자동 단계에 의해 수행하였다. 이중 커플링을 커플링당 120분 반응 시간으로 수행하였다. 아세틸화를 아세트산 무수물을 사용하여 이루었다.
수지로부터의 절단
합성 후에 수지를 DCM으로 세척하고, 펩티드를 TFA/TIS/물 (95/2.5/2.5)로의 2 내지 3시간 처리에 의해 수지로부터 절단한 후 이어서 다이에틸에테르를 사용하여 침전시켰다. 침전물을 다이에틸에테르로 세척하였다.
정제 및 정량
미정제 펩티드를 물과 MeCN의 적합한 혼합물, 예컨대 물/MeCN (9:1)에 용해시키고, 역상 제조용 HPLC (Waters Deltaprep 4000 또는 Gilson)에 의하여 C18-실리카겔 함유 칼럼 상에서 정제하였다. 용출을 0.1% TFA를 함유하는 물에서 증가하는 MeCN의 구배를 사용하여 수행하였다. 관련 분획을 분석 HPLC 또는 UPLC에 의해 조사하였다. 순수한 표적 펩티드를 함유하는 분획들을 혼합하고 감압하에 농축하였다. 그 결과의 용액을 분석하고 (HPLC, LCMS) 생성물을 화학발광 질소 특이적 HPLC 검출기 (Antek 8060 HPLC-CLND)를 사용하여 또는 280 nm에서의 UV-흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 생성물을 유리 바이알에 분배하였다. 바이알을 Millipore 유리섬유 프레필터로 캡핑하였다. 그것들을 냉동-건조하여 백색 고체로서의 펩티드 트라이플루오로아세테이트를 얻었다.
검출 및 특성확인 방법
실시예
1
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 1:
UPLC01: Rt = 10.2 min
LCMS01: Rt = 1.99 min; 계산치 m/z = 4014.3; 실측치 m/3 = 1339; 실측치 m/4 = 1004; 실측치 m/5 = 803
실시예
2
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 2:
UPLC02: Rt = 6.3 min
LCMS01: Rt = 1.75 min; 계산치 m/z = 4002.3; 실측치 m/3 = 1335; 실측치 m/4 = 1001; 실측치 m/5 = 801
실시예
3
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 3:
UPLC02: Rt = 6.7 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 실측치 m/1 = 3952.3; 실측치 m/3 = 1318; 실측치 m/4 = 989; 실측치 m/5 = 791
실시예
4
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 4:
UPLC02: Rt = 6.2 min
LCMS01: Rt = 1.7 min; 계산치 m/z = 3986.3; 실측치 m/3 = 1329; 실측치 m/4 = 997; 실측치 m/5 = 798
실시예
5
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 5:
UPLC01: Rt = 9.2 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 계산치 m/z = 4004.2; 실측치 m/3 = 1336; 실측치 m/4 = 1002; 실측치 m/5 = 801
실시예
6
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 6:
UPLC01: Rt = 9.4 min
LCMS01: Rt = 1.82 min; 계산치 m/z = 4018.3; 실측치 m/3 = 1340; 실측치 m/4 = 1005; 실측치 m/5 = 804
실시예
7
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 7:
UPLC02: Rt = 6.4 min
LCMS01: Rt = 1.7 min; 계산치 m/z = 4016.3; 실측치 m/3 = 1339; 실측치 m/4 = 1005; 실측치 m/5 = 804
실시예
8
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 8:
UPLC01: Rt = 10.8 min
LCMS01: Rt = 1.9 min; 계산치 m/z = 4030.3; 실측치 m/3 = 1344; 실측치 m/4 = 1008; 실측치 m/5 = 807
실시예
9
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 9:
UPLC01: Rt = 10.5 min
LCMS01: Rt = 1.9 min; 계산치 m/z = 4016.3; 실측치 m/3 = 1340; 실측치 m/4 = 1005; 실측치 m/5 = 804
실시예
10
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 10:
UPLC01: Rt = 10.3 min
LCMS01: Rt = 1.9 min; 계산치 m/z = 4000.3; 실측치 m/3 = 1334; 실측치 m/4 = 1001; 실측치 m/5 = 801
실시예
11
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 11:
UPLC02: Rt = 6.4 min
LCMS01: Rt = 3.1 min; 계산치 m/z = 4059.3; 실측치 m/3 = 1354; 실측치 m/4 = 1015; 실측치 m/5 = 812
실시예
12
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 12:
UPLC02: Rt = 6.4 min
LCMS01: Rt = 3.2 min; 계산치 m/z = 4018.3; 실측치 m/3 = 1340; 실측치 m/4 = 1005; 실측치 m/5 = 804
실시예
13
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 13:
UPLC01: Rt = 9.5 min
LCMS01: Rt = 3.1 min; 계산치 m/z = 4017.3; 실측치 m/3 = 1340; 실측치 m/4 = 1005; 실측치 m/5 = 804
실시예
14
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 14:
UPLC02: Rt = 6.2 min
LCMS01: Rt = 3.2 min; 계산치 m/z = 4059.3; 실측치 m/3 = 1354; 실측치 m/4 = 1015; 실측치 m/5 = 812
실시예
15
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤
Chem. 15:
UPLC01: Rt = 9.4 min
LCMS01: Rt = 4.1 min; 계산치 m/z = 4045.3; 실측치 m/3 = 1349; 실측치 m/4 = 1012; 실측치 m/5 = 810
실시예
16
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤일)-N{엡실론}[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]Lys
Chem. 16:
UPLC01: Rt = 9.2 min
LCMS01: Rt = 4.1 min; 계산치 m/z = 4146.4; 실측치 m/3 = 1383; 실측치 m/4 = 1037; 실측치 m/5 = 830
실시예
17
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]아세틸]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 17:
UPLC01: Rt = 9.6 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 계산치 m/z = 4075.3; 실측치 m/3 = 1359.7; 실측치 m/4 = 1020.0; 실측치 m/5 = 816.2
실시예
18
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 18:
UPLC01: Rt = 9.8 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 계산치 m/z = 3889.2; 실측치 m/3 = 1297.3; 실측치 m/4 = 973.2; 실측치 m/5 = 1178.8
실시예
19
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 19:
UPLC01: Rt = 9.8 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 계산치 m/z = 4147.4; 실측치 m/3 = 1383.4; 실측치 m/4 = 1037.7; 실측치 m/5 = 830.4
실시예
20
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 20:
UPLC01: Rt = 10.2 min
LCMS01: Rt = 1.9 min; 계산치 m/z = 3974.2; 실측치 m/3 = 1325.6; 실측치 m/4 = 994.5; 실측치 m/5 = 795.8
실시예
21
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 21:
UPLC01: Rt = 10.6 min
LCMS01: Rt = 2.0 min; 계산치 m/z = 3988.2; 실측치 m/3 = 1330.0; 실측치 m/4 = 998.0; 실측치 m/5 = 798.6
실시예
22
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤
Chem. 22:
UPLC01: Rt = 10.0 min
LCMS01: Rt = 1.8 min; 계산치 m/z = 4060.3; 실측치 m/3 = 1354.3; 실측치 m/4 = 1016.0; 실측치 m/5 = 813.0
분석 (I): GLP-1 및 글루카곤 수용체 효능
이 분석의 목적은 발명의 유도체의 활성 또는 효능을 시험관 내에서 시험하는 것이다. 시험관 내 효능은 전체 세포 분석에서 각각 인간 GLP-1 수용체 및/또는 글루카곤 수용체 활성화의 척도이다.
원리
시험관 내 효능을 수용체 유전자 분석으로, 각각 인간 GLP-1 또는 글루카곤 수용체의 반응을 측정함으로써 측정하였다. 분석을 인간 GLP-1 수용체 또는 인간 글루카곤 수용체 중 어느 하나를 발현하고 반딧불이 루시페라제 (CRE 루시페라제)에 대한 프로모터 및 유전자에 커플링되어 있는 cAMP 반응 요소 (CRE)에 대한 DNA를 함유한 안정하게 형질전환된 BHK 세포에서 수행하였다. 인간 GLP-1 또는 글루카곤 수용체가 각각 활성화되었을 때, cAMP의 생성이 유발되었고, 그것은 계속해서 루시페라제 단백질이 발현되는 것을 유발하였다. 분석 인큐베이션이 완료되었을 때, 루시페라제 기질 (루시페린)을 첨가하였고, 효소는 루시페린을 옥시루시페린으로 전환시켰으며 생물발광을 발생시켰다. 생물발광을 분석에 대한 판독값으로서 측정하였다.
(a) GLP-1 수용체 활성화
세포 배양 및 제조
이 분석에서 사용한 세포 (클론 FCW467-12A/KZ10-1)는 원래의 셀라인으로서 BHKTS13을 가지는 BHK 세포였다. 세포를 인간 GLP-1 수용체를 발현하고 현재의 클론을 얻기 위해 CRE 루시페라제를 사용하여 추가의 형질전환에 의해 수립된 클론 (FCW467-12A)으로부터 유도하였다.
세포를 10% FBS, 1x 글루타맥스, 1 mg/mL G418, 240 nM MTX (메토트렉세이트) 및 1% pen/strep (페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 DMEM 배지에서 5% CO2에서 배양하였다. 세포를 부분표본화하고 액체 질소 중에 저장하였다. 각각의 분석 전에 부분표본을 취하여 PBS로 3회 세척한 후 분석 완충액 중에 원하는 농도로 현탁시켰다. 96-웰 플레이트에 대해 현탁액을 5x10EE3 세포/웰의 최종 농도로 만들었다.
물질
다음의 화학물질을 분석에 사용하였다: 플루로닉 F-68 (10%) (Gibco 2404), 오브알부민 (Sigma A5503), DMEM w/o 페놀 레드 (Gibco 11880-028), 1 M Hepes (Gibco 15630), 글루타맥스 100x (Gibco 35050) 및 스테디라이트 플러스 (PerkinElmer 6016757).
분석 배지는 DMEM w/o 페놀 레드, 10mM Hepes, 1x 글루타맥스, 2% 오브알부민 및 0.2% 플루로닉 F-68로 구성하였다.
과정
세포 스톡을 37℃의 수조에서 해동시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 계수하고 분석 배지로 5x10EE3 세포/50 μl (1x10EE5 세포/mL)로 조정하였다. 세포의 50 μl 부분표본을 분석 플레이트의 각 웰에 옮겼다.
시험 화합물 및 참조 화합물의 스톡을 분석 배지로 0.2 μM의 농도로 희석하였다. 화합물들을 10-배로 희석하여 다음의 농도를 얻었다: 2x10EE-6 M, 2x10EE-7 M, 2x10EE-8 M; 2x10EE-9 M, 2x10EE-10 M, 2x10EE-11 M, 2x10EE-12 M 및 2x10EE-13 M. 각 화합물에 대해 블랭크 분석 완충액 대조표준을 또한 포함시켰다.
50 μl의 부분표본 화합물 또는 블랭크를 희석 플레이트로부터 분석 플레이트로 옮겼다. 화합물들을 다음의 최종 농도에서 시험하였다: 1x10EE-6 M, 1x10EE-7 M, 1x10EE-8 M; 1x10EE-9 M, 1x10EE-10 M, 1x10EE-11 M 및 1x10EE-12 M 및 1x10EE-13 M.
분석 플레이트를 3 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 분석 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 실온에서 15분 동안 놓아두었다. 스테디라이트 플러스 시약의 100 μl 부분표본을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (시약은 감광성이다). 각 분석 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어서 빛으로부터 보호하고 30분 동안 실온에서 흔들어주었다. 각 분석 플레이트를 Packard TopCount NXT 기기에서 판독하였다.
계산
TopCount 기기로부터의 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 옮겼다. 소포트웨어는 비-선형 회귀분석을 수행하였다 (로그(아고니스트) 대 반응-가변성 기울기 (4개의 변수)). EC50 값을 소프트웨어에 의해 계산하였고 pM로 기록하였다.
(b) 글루카곤 수용체 활성화
세포 배양 및 제조
이 분석에 사용된 세포 (클론 pLJ6'-4-25)는 CRE 루시페라제 유전자를 발현하는 원래의 셀라인으로서 BHK570을 가지는 BHK 세포였고 (클론 BHK/KZ10-20-48) 인간 글루카곤 수용체를 사용한 추가의 형질전환에 의해 수립되었다 (pHZ-1 벡터 중의 클론 pLJ6').
세포를 5% CO2에서 10% FBS, 1x 글루타맥스, 1 mg/mL G418, 240 nM MTX (메토트렉세이트) 및 1% pen/strep (페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 부분표본화하고 액체 질소 중에 저장하였다. 각각의 분석 전에 부분표본을 취하여 PBS로 3회 세척한 후 분석 완충액 중에 원하는 농도로 현탁시켰다. 96-웰 플레이트에 대해 현탁액을 5x10EE3 세포/웰의 최종 농도로 만들었다.
물질
다음의 화학물질을 분석에 사용하였다: 플루로닉 F-68 (10%) (Gibco 2404), 오브알부민 (Sigma A5503), DMEM w/o 페놀 레드 (Gibco 11880-028), 1 M Hepes (Gibco 15630), 글루타맥스 100x (Gibco 35050) 및 스테디라이트 플러스 (PerkinElmer 6016757).
분석 배지는 DMEM w/o 페놀 레드, 10mM Hepes, 1x 글루타맥스, 2% 오브알부민 및 0.2% 플루로닉 F-68로 구성하였다.
과정
세포 스톡을 37℃의 수조에서 해동시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 계수하고 분석 배지로 5x10EE3 세포/50 μl (1x10EE5 세포/mL)로 조정하였다. 세포의 50 μl 부분표본을 분석 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 시험 화합물 및 참조 화합물의 스톡을 분석 배지로 0.2 μM의 농도로 희석하였다. 화합물들을 10-배로 희석하여 다음의 농도를 얻었다: 2x10EE-6 M, 2x10EE-7 M, 2x10EE-8 M; 2x10EE-9 M, 2x10EE-10 M, 2x10EE-11 M, 2x10EE-12 M 및 2x10EE-13 M. 각 화합물에 대해 블랭크 분석 완충액 대조표준을 또한 포함시켰다.
50 μl의 부분표본 화합물 또는 블랭크를 희석 플레이트로부터 분석 플레이트로 옮겼다. 화합물들을 다음의 최종 농도에서 시험하였다: 1x10EE-6 M, 1x10EE-7 M, 1x10EE-8 M; 1x10EE-9 M, 1x10EE-10 M, 1x10EE-11 M 및 1x10EE-12 M 및 1x10EE-13 M.
분석 플레이트를 3 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 분석 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 실온에서 15분 동안 놓아두었다. 스테디라이트 플러스 시약의 100 μl 부분표본을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다 (시약은 감광성이다). 각 분석 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어서 빛으로부터 보호하고 30분 동안 실온에서 흔들어주었다. 각 분석 플레이트를 Packard TopCount NXT 기기에서 판독하였다.
계산
TopCount 기기로부터의 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 옮겼다. 소포트웨어는 비-선형 회귀분석을 수행하였다 (로그(아고니스트) 대 반응-가변성 기울기 (4개의 변수)). EC50 값을 소프트웨어에 의해 계산하였고 pM로 기록하였다.
분석 (II): GLP-1 및 글루카곤 수용체 결합
(a) GLP-1 수용체 결합
이 분석의 목적은 발명의 글루카곤 유도체의 시험관 내 수용체 결합 활성을 시험하는 것이다. 수용체 결합은 인간 GLP-1 수용체에 대한 화합물의 친화성의 척도이다.
원리
각 화합물의 인간 GLP-1 수용체에 대한 수용체 결합을 대체 결합 분석으로 측정하였다. 이 유형의 분석에서 표지된 리간드 (이 경우 125I-글루카곤)는 수용체에 결합된다. 각각의 유도체를 인간 글루카곤 수용체를 함유하는 분리된 막에 일련의 농도로 첨가하고 표지된 리간드의 대체를 모니터링한다. 수용체 결합을 표지된 리간드의 절반이 수용체로부터 대체된 농도, IC50 값으로서 기록한다.
물질
다음의 화학물질을 분석에 사용하였다: DMEM w/o 페놀 레드 (Gibco 11880-028), Pen/strep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), 1 M Hepes (Gibco 15630), EDTA (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), 우태아 혈청 (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl2 (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), SPA 입자 (맥아 아글루티닌 (WGA) SPA 비즈, Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (내부 제조), 옵티플레이트TM-96 (Packard 6005290).
완충액 1은 20 mM Na-HEPES 플러스 10 mM EDTA로 구성하였고 pH를 7.4로 조정하였다. 완충액 2는 20 mM Na-HEPES 플러스 0.1 mM EDTA로 구성하였고 pH를 7.4로 조정하였다. 분석 완충액을 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 0.005% Tween 20을 첨가한 50 mM HEPES로 구성하였고, pH를 7.4로 조정하였다.
세포 배양 및 막 제조
이 분석에 사용한 세포 (클론 FCW467-12A)는 원래의 셀라인으로서 BHKTS13을 가지는 BHK 세포였다. 세포는 인간 GLP-1 수용체를 발현한다.
세포를 DMEM, 10% 우태아 혈청, 1% Pen/Strep (페니실린/스트렙토마이신) 및 1.0 mg/mL의 선택 마커 G418 중에서 5% CO2에서 성장시켰다. 막 제조를 위해 세포를 대략 80%의 집밀도로 성장시켰다. 세포를 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하고 수확하였다. 세포를 간단한 원심분리에 의해 펠릿화하고 세포 펠릿을 얼음에 보관하였다. 세포 펠릿을 ULTRA-THURRAX 분배 기기로 20 내지 30초 동안 적당한 양 (예컨대 10 mL)의 완충액 1 중에서 균등화하였다. 균등화물을 15분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10 mL의 완충액 2에 재현탁하고 (균등화함) 원심분리하였다. 이 단계를 한 번 더 반복하였다. 그 결과의 펠릿을 완충액 2에 재현탁하고 단백질 농도를 측정하였다. 막을 부분표본화하고 -80℃에서 저장하였다.
과정
1. 수용체 결합 분석을 위해 50 μl의 분석 완충액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
2. 시험 화합물을 연속적으로 희석하여 다음의 농도를 얻었다: 8x10EE-7 M, 8x10EE-8 M, 8x10EE-9 M, 8x10EE-10 M, 8x10EE-11 M, 8x10EE-12 M 및 8x10EE-13 M. 25 μl를 분석 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다.
3. 세포막 부분표본을 해동시키고 그것들의 작동 농도로 희석하였다. 50 μl를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
4. WGA SPA 비즈를 분석 완충액에 20 mg/mL로 현탁하였다. 현탁액을 분석 완충액으로 10 mg/mL로 희석한 직후에 분석 플레이트에 첨가하였다. 50 μl를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
5. 인큐베이션을 분석 플레이트의 각 웰에 25 μl의 [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2의 480 pM 용액을 첨가함으로써 시작하였다. 총 계수/웰을 측정하기 위하여 25 μl의 부분표본을 보관하였다.
6. 분석 플레이트를 2시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다.
7. 분석 플레이트를 10분 동안 원심분리하였다.
8. 분석 플레이트를 Packard TopCount NXT 기기에서 판독하였다.
계산
TopCount 기기로부터의 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 옮겼다. 소포트웨어는 반복에 대한 값들의 평균을 구하였고 비-선형 회귀분석을 수행하였다. IC50 값을 소프트웨어에 의해 계산하였고 nM로 기록하였다.
(b) 글루카곤 수용체 결합
이 분석의 목적은 발명의 글루카곤 유도체의 시험관 내 수용체 결합 활성을 시험하는 것이었다. 수용체 결합 활성은 인간 글루카곤 수용체에 대한 유도체의 친화성의 척도이다.
원리
각 화합물의 인간 글루카곤 수용체에 대한 수용체 결합을 대체 결합 분석으로 측정하였다. 이 유형의 분석에서 표지된 리간드 (이 경우 125I-GLP-1)는 수용체에 결합된다. 각각의 유도체를 인간 GLP-1 수용체를 함유하는 분리된 막에 일련의 농도로 첨가하고 표지된 리간드의 대체를 모니터링한다. 수용체 결합을 표지된 리간드의 절반이 수용체로부터 대체된 농도, IC50 값으로서 기록한다.
물질
다음의 화학물질을 분석에 사용하였다: DMEM w 글루타맥스 (Gibco 61965-026), Pen/strep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), Versene (Gibco 15040), 1 M Hepes (Gibco 15630), PBS (Invitrogen 14190-094), 우태아 혈청 (Invitrogen 16140-071), MgCl2 (Merck 1.05832.1000), EDTA (Invitrogen 15575-038), CaCl2 (Sigma, C5080), Tween 20 (Amresco 0850C335), 오브알부민 (Sigma A5503), SPA 입자 (맥아 아글루티닌 (WGA) SPA 비즈, Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-글루카곤 (내부 제조), 옵티플레이트TM-96 (Packard 6005290).
HME 완충액을 25 mM HEPES, 2 mM MgCl2 및 1 mM EDTA로 구성하였고, pH를 7.4로 조정하였다. 결합 완충액을 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.02% Tween 20 및 0.1% 오브알부민을 첨가한 50 mM HEPES로 구성하였고, pH를 7.4로 조정하였다.
세포 배양 및 막 제조.
이 분석에 사용한 세포 (클론 BHK hGCGR A3*25)는 인간 글루카곤 수용체를 코드화하는 cDNA를 함유한 발현 플라스미드로 안정하게 형질전환된 BHK 세포였다.
세포를 DMEM, 10% 우태아 혈청, 1% Pen/Strep (페니실린/스트렙토마이신) 및 1.0 mg/mL의 선택 마커 G418 중에서 5% CO2에서 성장시켰다. 막을 제조하기 위하여 세포를 대략 80%의 집밀도로 성장시켰다. 세포를 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하고 수확하였다. 세포를 간단한 원심분리에 의해 펠릿화하고 세포 펠릿을 얼음에 보관하였다. 세포를 대략 5 mL의 HME 완충액을 첨가하고, 피펫화에 의해 혼합한 후 액체 질소 중에서 즉석 냉동시킴으로써 용해시켰다. 세포 용해물을 신속하게 해동하고 HME 완충액을 10 mL로까지 첨가하였다. 세포 펠릿을 ULTRA-THURRAX 분배 기기로 20 내지 30초 동안 균등화하였다. 균등화물을 20.000xG에서, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 1 내지 2 mL의 HME 완충액에 재현탁하였다 (균등화함). 단백질 농도를 측정하였다. 막을 부분표본화하고 액체 질소 중에서 즉석 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
과정
1. 수용체 결합 분석을 위해 50 μl의 분석 완충액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
2. 시험 화합물을 연속적으로 희석하여 다음의 농도를 얻었다: 8x10EE-7 M, 8x10EE-8 M, 8x10EE-9 M, 8x10EE-10 M, 8x10EE-11 M, 8x10EE-12 M 및 8x10EE-13 M. 25 μl를 분석 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다.
3. 세포막 부분표본을 해동시키고 그것들의 작동 농도로 희석하였다. 50 μl를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
4. WGA SPA 비즈를 분석 완충액에 20 mg/mL로 현탁하였다. 현탁액을 분석 완충액으로 10 mg/mL로 희석한 직후에 분석 플레이트에 첨가하였다. 50 μl를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
5. 인큐베이션을 분석 플레이트의 각 웰에 25 μl의 [125I]-글루카곤의 480 pM 용액을 첨가함으로써 시작하였다. 총 계수/웰을 측정하기 위하여 25 μl의 부분표본을 보관하였다.
6. 분석 플레이트를 2시간 동안 25℃에서 인큐베이션하였다.
7. 분석 플레이트를 10분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다.
8. 분석 플레이트를 Packard TopCount NXT 기기에서 판독하였다.
계산
TopCount 기기로부터의 데이터를 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 옮겼다. 소포트웨어는 반복에 대한 값들의 평균을 구하였고 비-선형 회귀분석을 수행하였다.
분석 (III): 펩티드 조성물의 물리적 안정성의 평가를 위한
ThT
피브릴화
분석
이 시험의 목적은 수용액 중에서 발명의 글루카곤 유도체의 물리적 안정성을 평가하는 것이다.
펩티드의 낮은 물리적 안정성은 샘플 중의 꽤 규칙적이고, 실같은 마크로분자 구조로서 관찰되는, 아밀로이드 피브릴 형성을 유도할 수 있고, 그것은 궁극적으로 겔 형성을 유도할 수 있다. 이것은 전통적으로 샘플의 육안 검사에 의해 측정되어 왔다. 그러나 그런 종류의 측정은 매우 성가시고 관찰자에 좌우되는 것이다. 그러므로, 작은 분자 인디케이터 프로브의 적용이 훨씬 더 유리하다. 티오플라빈 T (ThT)는 그런 프로브이고 피브릴에 결합될 때 뚜렷한 형광 신호를 나타낸다 [Naiki et al. (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
피브릴 형성에 대한 시간 과정은 다음과 같이 표시되는 S자형 곡선에 의해 기술될 수 있다 [Nielsen et al. (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
식에서, F는 시간 t에서의 ThT 형광이다. 상수 t0는 최대 형광의 50%에 도달하기 위해 필요한 시간이다. 피브릴 형성을 나타내는 2개의 중요한 변수는 t0-2τ에 의해 계산되는 지체-시간 및 외관상 속도 상수 kapp 1/τ이다.
펩티드의 부분적으로 접혀진 중간체의 형성은 피브릴화에 대한 일반적인 개시 메커니즘으로서 시사된다. 그런 중간체 중 소수는 핵화하여 추가의 중간체들이 조립하고 피브릴화가 진행될 수 있을 주형을 형성한다. 지체-시간은 핵의 임계 질량이 세워지는 간격에 해당하고 외관상 속도 상수는 피브릴 자체가 형성되는 속도이다.
샘플을 각 분석 전에 새롭게 제조하였다. 각 샘플 조성은 범례에 기술한다. 샘플의 pH를 적절한 양의 농축된 NaOH 및 HCl을 사용하여 원하는 값으로 조정하였다. 티오플라빈 T를 H2O 중의 스톡 용액으로부터 샘플에 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다.
샘플 부분표본 200 μl (10 mM HEPES 완충액, pH 7.5 중의 글루카곤 유도체/유사체 250 μM)를 96 웰 미소적정 플레이트 (Packard OptiPlateTM-96, 백색 폴리스티렌)에 놓았다. 통상적으로 각 샘플의 4 또는 8개의 복제물 (한 가지 시험 조건에 해당함)을 웰의 한 줄에 놓았다. 플레이트를 스카치 패드 (Qiagen)로 밀봉하였다.
주어진 온도에서의 인큐베이션, 흔들어줌 및 ThT 형광 방출의 측정을 Fluoroskan Ascent FL 형광 판 판독기 (Thermo Labsystems)에서 수행하였다. 플레이트를 1 mm의 진폭으로 960 rpm으로 조정한 궤도 진동을 하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 형광 측정을 444 nm 필터를 통한 여기 및 485 nm 필터를 통한 방출 측정을 사용하여 수행하였다.
각각의 이동을 플레이트를 분석 온도에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 시작하였다. 플레이트를 원하는 시간 주기 동안 20분마다 측정하였다. 각 측정 사이에, 플레이트를 기술한 대로 흔들어주었고 가열하였다.
ThT 분석을 완료한 후에 각 샘플의 4 또는 8개의 복제물을 모아서 20000 rpm에서 30분 동안 18℃에서 원심분리하였다. 상층액을 0.22 μm 필터를 통해 여과하였고 부분표본을 HPLC 바이알로 옮겼다. 초기 샘플 및 여과된 상층액 중의 펩티드의 농도를 역상 HPLC에 의하여 참조대로 적절한 표준을 사용하여 측정하였다. 백분율 분획은 초기 샘플 농도로 구성된 여과된 샘플의 농도를 회복으로서 기록하였다.
측정 지점을 추가의 프로세싱 및 곡선 제도를 위해 마이크로소프트 엑섹 포맷으로 저장하고 피팅을 GraphPad 프리즘을 사용하여 수행하였다. 피브릴이 없을 때 ThT로부터의 바탕 방출은 무시할만하였다. 데이터 지점은 전형적으로 4 또는 8개 샘플의 평균이었고 표준 편차 에러 막대를 사용하여 도시하였다. 동일한 실험 (즉 동일한 플레이트 상의 샘플)에서 얻은 데이터만을 동일한 그래프에 표시하여 실험간 피브릴화의 상대적 측정을 확실하게 하였다.
데이터 세트를 Eq.(1)에 적용할 수 있다. 그러나, 여기서 기록된 피브릴화 전의 지체 시간은 ThT 형광이 바탕값 수준 이상으로 상당히 증가한 시점을 나타내는 곡선의 육안 검사에 의해 측정하였다.
분석 (IV): 화학적 안정성 평가
이 분석의 목적은 수용액 중의 발명의 글루카곤 유도체의 화학적 안정성을 평가하는 것이다.
글루카곤 유사체의 화학적 안정성을 RP-UPLC에 의해 측정하였다. 동결건조된 샘플을 8 mM 포스페이트 완충액 pH 8.6에 녹인 후 HCl을 333 μM의 최종 농도로 사용하여 pH를 7.3으로 조정하였다. 샘플을 14일 동안 5℃ 및 37℃에서 인큐베이션한 후 RP-UPLC 분석을 하였다. 순도를 각 크로마토그램에서 모든 집적된 피크의 총 면적에 대한 주요 피크의 면적 백분율로서 정의하였다. 37℃에서 14일 후에 순도 손실 (본원에서 또한 화학적 분해로서도 언급함)로서 측정한 화학적 안정성을 5℃에서 인큐베이션한 샘플 또는 출발 샘플 (인큐베이션하지 않음)과 출발 샘플 또는 5℃에서 14일 동안 인큐베이션한 후의 순도로 나눈, 37℃에서 인큐베이션한 샘플 사이의 순도의 차이로서 측정하였다.
RP-UPLC 분석을 50℃에서 및 0.3 mL/min의 유속에서 작동한 Waters Acquity CSH 플루오로-페닐 150 x 2.1 mm, 1.7 μm 칼럼을 사용하여 A: 0.09 M 포스페이트 완충액 pH 3.6 (다이-암모늄하이드로겐포스파트), 10% MeCN (v/v %) 및 B: 60% MeCN (v/v%), 20% 아이소프로판올 (v/v%)로 구성된 이동상 시스템을 사용하여 수행하여다.
UV-검출을 215 nm에서 수행하였다. 대부분의 샘플에 대해 사용한 전형적인 구배 프로필을 아래에 나타낸다. 대부분의 유사체와 비교한 실질적으로 상이한 보유 시간에서의 유사체 용출을 위해, 샘플을 가로지르는 순도 평가 비교를 더욱 잘 할 수 있도록 구배 프로필에 대한 일부 조정을 수행하였다. 데이터는 본 발명의 글루카곤 유도체의 개선된 화학적 안정성을 확인해주었다.
고분자량 단백질 (HMWP) 함량을 크기-축출 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 측정하였다. 분석은 50℃ 및 0.5 mL/min의 유속에서 작동하는 Waters Insulin HMWP 7.8 x 300 mm 칼럼을 사용하여 500 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 5 mM H3PO4 및 50% (v/v) 2-프로판올로 구성된 해리 이동상을 사용하여 수행하였다. UV-검출을 215 nm에서 수행하였다.
RP-UPLC 분석에 대해 사용한 전형적인 구배 프로필:
실시예
23: 발명의 유도체들의 특성
발명의 유도체들을 인간 글루카곤 수용체에 대한 효능 (EC50 hGlucagonR), 인간 글루카곤 수용체에 대한 친화성 (IC50 hGlucagonR), 물리적 및 화학적 안정성에 대해 각각 본원에 기술된 분석 (I)(b), 분석 (II)(b), 분석 (III) 및 분석 (IV)를 사용하여 시험하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
| 실시예의 유도체 |
EC50 hGlucagonR (pM) |
IC50 hGlucagonR (nM) |
물리적 안정성: THT 분석 지체 시간 (시간) |
물리적 안정성: THT 분석 회복 (%) |
화학적 안정성: 37℃에서 14일에 걸친 화학적 분해 (%) |
| 실시예 1 | 1.0 | 0.2 | 45.0 | 101 | 1.9 |
| 실시예 2 | 5.0 | 1.9 | 45.0 | 104 | 3.0 |
| 실시예 3 | 10.0 | 4.9 | 45.0 | 100 | 2.5 |
| 실시예 4 | 5.0 | 1.8 | 45.0 | 100 | 3.8 |
| 실시예 5 | 12.0 | 6.2 | 45.0 | 100 | 3.1 |
| 실시예 6 | 4.7 | 1.8 | 45.0 | 101 | 0.6 |
| 실시예 7 | 2.0 | 1.0 | 36.9 | 100 | 2.1 |
| 실시예 8 | 1.0 | 0.2 | 45.0 | 103 | 1.7 |
| 실시예 9 | 3.0 | 0.5 | 45.0 | 100 | 2.1 |
| 실시예 10 | 2.0 | 0.5 | 45.0 | 100 | 2.8 |
| 실시예 11 | 105.0 | 24.4 | 1.7 | 98 | -3.3 |
| 실시예 12 | 41.0 | 7.6 | 6.7 | 88 | 2.5 |
| 실시예 13 | 17.0 | 5.2 | 0.3 | 39 | -0.3 |
| 실시예 14 | 6.0 | 2.6 | 1.7 | 98 | n.d.a |
| 실시예 15 | 4.0 | 5.1 | 2.3 | 88 | 2.8 |
| 실시예 16 | 4.0 | 2.0 | 6.0 | 61 | 5.0 |
| 실시예 17 | 9.9 | 2.5 | 4.3 | 100 | 0.9 |
| 실시예 18 | 6.0 | 1.5 | 45.0 | 100 | 1.4 |
| 실시예 19 | 6.0 | 2.7 | 45.0 | 104 | 1.4 |
| 실시예 20 | 4.0 | 0.9 | 45.0 | 105 | n.d. |
| 실시예 21 | 2.0 | 0.3 | 45.0 | 104 | 2.4 |
| 실시예 22 | 17.0 | 8.7 | 45.0 | 100 | 0.9 |
| a) "n.d."는 측정되지 않음. | |||||
결과는 발명의 유도체들이 글루카곤 수용체에 대한 양호한 효능, 글루카곤 수용체에의 양호한 친화성뿐 아니라 양호하거나 적당한 물리적 안정성 및 양호한 화학적 안정성을 가지는 것을 보여준다.
발명의 특정 특징들이 본원에서 예시되었고 기술된 한편, 많은 변형, 치환, 변화 및 동등물이 기술분야의 숙련자들에게 발생할 것이다. 그러므로 첨부된 청구범위는 그런 모든 변형 및 변화가 발명의 진정한 사상 내에 속하는 것으로 포함되도록 의도된 것임이 인지되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novo Nordisk A/S
<120> STABLE GLUCAGON ANALOGUES AND USE FOR TREATMENT OF HYPOGLYCAEMIA
<130> 130077WO01
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
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<223> Artificial protein based on human glucagon
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<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
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<223> This amino acid residue is alpha-aminoisobutyric acid (Aib)
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<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 9
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Leu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 10
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Leu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> This amino acid residue is alpha-aminoisobutyric acid (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 11
His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Val
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 12
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 13
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 13
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 14
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Lys Phe Val Gln Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 15
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 15
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Lys Thr
20 25
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 16
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Ser Lys
20 25
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 17
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Ser Thr Lys
20 25 30
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carb
oxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]ami
no]-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]-Lys
<400> 18
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxybutanoyl]a
mino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 19
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4
-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoy
l]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 20
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 21
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 22
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Lys Trp Leu Leu Ser Thr
20 25
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial protein based on human glucagon
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> This amino acid residue is modified to imidazopropionyl (Imp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> This amino acid residue is
N-epsilon-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-acetamido-4-carboxyb
utanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-
4-carboxybutanoyl]-Lys
<400> 23
His Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Glu Phe Val Lys Trp Leu Leu Glu Thr
20 25
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Artificial sequence based on human glucagon
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(1)
<223> This residue is Imp (desaminohistidine)
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> This residue is Ser or Aib
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> This residue is Tyr, Leu, Ile or Val
<220>
<221> SITE
<222> (12)..(12)
<223> This residue is Lys or Arg
<220>
<221> SITE
<222> (15)..(15)
<223> This residue is Asp or Glu
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> This residue is Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(20)
<223> This residue is Gln, Glu, Aib or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> This residue is Asp, Glu or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (24)..(24)
<223> This residue is Gln, Ala, Glu, Aib or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (27)..(27)
<223> This residue is Met, Leu or Val
<220>
<221> SITE
<222> (28)..(28)
<223> This residue is Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (29)..(29)
<223> This residue is Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu or Lys
<220>
<221> SITE
<222> (30)..(30)
<223> This residue is absent or is Lys
<400> 24
His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Xaa Xaa Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Claims (15)
- 다음 식 I을 포함하는 글루카곤 유사체의 유도체 또는 상기 유도체의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
상기 식에서,
X2는 Ser 또는 Aib이고;
X10은 Tyr, Leu, Ile 또는 Val이며;
X12는 Lys 또는 Arg이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Ser, Ala, Leu, Thr, Aib, Ile, Val 또는 Lys이고;
X20은 Gln, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X21은 Asp, Glu 또는 Lys이고;
X24는 Gln, Ala, Glu, Aib 또는 Lys이며;
X27은 Met, Leu 또는 Val이고;
X28는 Asn, Ser, Thr, Gln, Ala, Gly, Glu 또는 Lys이며;
X29는 Thr, Gly, Ser, Gln, Ala, Glu 또는 Lys이고; 및
X30은 없거나 Lys이며;
상기 유도체는 식 I의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 질소 원자에 공유 부착되어 있는 치환기를 포함하고, 이때 상기 치환기는 다음 식 II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
를 가지며, 상기 식에서
Y1은 수소이거나 C2-6 아실기 또는 석시노일 부분을 나타내고,
Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11 또는 Y12는 개별적으로 없거나 개별적으로 Ser 잔기, Ala 잔기, Gly 잔기, 다음 식 i, 식 ii, 식 iii, 식 iv 및 식 v로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내며:
,
,
,
,
,
이때 식 i, ii, iii 및 iv는 개별적으로 입체 화학 L 또는 D를 가지며,
단 상기 치환기는 3 내지 10개의 음으로 하전된 부분을 가진다. - 제 1항에 있어서, 상기 글루카곤 유사체는 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 상기 글루카곤 유사체에서 3 내지 15개의 아미노산 잔기 치환 또는 첨가와 같은 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Y12는 상기 유도체의 위치 X12, X16, X20, X21, X24, X28, X29 또는 X30에서 라이신의 측쇄의 상기 질소 원자에 부착되는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 라이신의 측쇄의 엡실론-질소 원자에 공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 위치 X24에서 라이신에 부착되는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 음으로 하전된 부분을 가지는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 식 i의 3 내지 10, 예컨대 3 내지 5 또는 4개의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기의 Y1은 아세틸기인 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는 다음의 부분들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유도체:
,
,
및
.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도체는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유도체:
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 1:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 2:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 3:
;
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 4:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 5:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 6:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 7:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 8:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 9:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 10:
;
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 11:
;
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 12:
;
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 13:
;
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤
Chem. 14:
;
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤
Chem. 15:
;
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤일)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]Lys
Chem. 16:
;
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]아세틸]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 17:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 18:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 19:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 20:
;
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤
Chem. 21:
; 및
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-아세트아미도-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]아미노]-4-카르복시부타노일]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤
Chem. 22:
.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도체는 본원에서 기술된 분석 (IV)에 의해 측정되는 바 5% 미만의 화학적 분해를 나타내는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 글루카곤 (SEQ ID NO:1)과 비교하여 다음의 변형을 포함하는 글루카곤 유사체 형태의 중간 생성물 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르:
(i) [Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iii) [Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(iv) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(v) [Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(vii) [Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(viii) [Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(ix) [Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(x) [Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xi) [Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xii) [Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiii) [Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xiv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-글루카곤;
(xv) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-글루카곤;
(xvi) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-글루카곤;
(xvii) [Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xviii) [Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-글루카곤;
(xix) [Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-글루카곤. - 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에서 정의된 유도체 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 의학에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제 14항에 있어서, 저혈당증을 치료 및/또는 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 유도체.
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