KR20160112005A - 친수성 활성 화합물의 나노캡슐화 - Google Patents

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KR20160112005A
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glucan
nanoparticle
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시몬 베니타
타허 나사르
리아트 코차비-소우드라이
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이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디.
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Abstract

본 발명은 수용성 단백질, 글루칸 및 친수성 활성제를 포함하는 나노입자를 제공하며, 상기 글루칸은 메타인산염(metaphosphate)에 의해 적어도 부분적으로 가교-결합된다.

Description

친수성 활성 화합물의 나노캡슐화{NANOENCAPSULATION OF HYDROPHILIC ACTIVE COMPOUNDS}
본 발명은 친수성 활성 화합물을 포함하는 나노입자 및 이의 나노캡슐화 방법에 관한 것이다.
대부분의 펩티드 및 단백질 약물은 여전히 매일 주사로 투여된다, 따라서 환자에 대한 규정 준수 문제, 통증-관련 문제 및 주요 불편사항과 관련되어 있다. 따라서, 이러한 약물에 대한 장시간 주사가능한 전달 시스템 또는 비-침습성 전달 시스템이 요구되고 있다.
경구 경로는 높은 환자의 수용 및 순응과 함께 자가-투여의 이점을 제공한다.
펩티드 및 단백질의 경구 및 주사가능한 장시간 방출 전달은 도전 과제로 남아있고, 매일 투여를 필요로 하는 비경구 종래의 전달에 대해 가장 매력적인 대안이 되고 있다. 지난 20년 넘게 투자된 집중적인 노력에도 불구하고, 이러한 친수성 거대분자의 나쁜 장관막 투과성, 제한된 경구 생체이용률, 장(gut) 내 불안정성 및 광범위한 빠른 신진대사와 관련된 다수의 결점 및 장애물 때문에, 친수성이 강한 거대분자의 경구 전달을 위한 실행가능한 해결책이 나타나지 않았다.
현저한 생체이용률과 함께 경구 전달 시스템을 개발하기 위하여, 3가지 방법이 체택될 수 있다:
(a) 거대분자의 물리화학적 특성의 변형;
(b) 거대분자의 새로운 기능화; 또는
(c) 나노담체를 통한 개선된 화물 전달(cargo delivery)의 사용.
그럼에도 불구하고, 상기 방법과 상관없이 단백질의 초기 생물학적 활성을 유지하는 것이 중요하다. 경구 전달 시스템은 추가 임상 시험을 위해 잠재적으로 고려될 수 있는 기회를 가지도록 이러한 거대분자의 장관막 투과성을 현저히 향상시키는 것이 필요할 것이다. 다수의 나노미립자 및 미세미립자 전달 시스템을 사용하여 친수성 거대분자의 경구 흡수를 향상시켰고 유망한 결과를 나타내었으나, 여전히 장관 흡수(intestinal absorption) 및 약물 안정성 보호의 기간의 제약으로부터 고통받고 있다.
나노-크기 시스템 (예를 들어, 리포좀, 지질 및 고분자 나노입자, 미셀 등)은 종래의 단백질 전달을 위한 제형에 비해 유리한 것으로 확인되었다. 생명공학 약물은 조만간 치료제의 주요 공급원이 될 것으로 예상된다 [1]. 그럼에도 불구하고, 이러한 분자의 치료제 개발은 이의 사용의 내재적 한계; 즉 낮은 경구 생체이용률 및 생물학적 및 물리화학적 불안정성을 충분히 극복할 수 있는 적당한 제형의 개발 가능성에 의존한다. 그러나, 단백질 약물의 경구 투여는 이의 단백질 가수분해의 불안정성 및 생물학적 장벽을 통과하는 제한된 능력으로 인하여 많은 난관에 봉착하였다. 리포좀 및 미셀 기반 전달 시스템은 장 내강(gut lumen)에서 안정하지 않으며, 민감성 거대분자에 대해 적당한 보호를 도출해낼 수 없다.
따라서, 의약품 제형들 중, 나노입자가 펩티드 약물의 약물 전달을 위해 성공적으로 연구되었다 [2-4]. 나노입자, 더 상세하게는 생분해성 고분자 나노입자는 우수한 조직 생체적합성, 생분해성, 조성 유연성(composition flexibility) 및 작은 크기를 가지며, 이들을 다양한 용도에 적합하게 만들 수 있다. 또한, 이들 제형은 경구 투여 후 약물의 생체이용률을 향상시키는 것으로 나타났다 [5].
비록 생분해성 고분자와 함께 캡술화가 매우 매력적일지라도, 친수성 거대분자의 경우 제조 방법은 여전히 복잡하고 비용이 많이 든다. 이러한 시스템으로 단백질 약물의 효율적인 포착 방법의 경우, 고분자를 이용한 캡슐화는 (a) 저장 및 전달 동안 분해로부터 단백질의 보호 및 (b) 원할 때 서방출(sustained release) 프로파일을 제공할 수 있다 [6-8].
[9] WO 2012/101639
[1] Tsuji, K., Tsutani, K. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2008, 68, 496-502 [2] Joshi, M.D., Muller, R.H. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2009, 71, 161-172 [3] Kluge, J., Fusaro, F., Muhrer, G., Thakur, R., Mazzotti, M., J. Supercrit. Fluids, 2009, 48, 176-182 [4] Mehnert, W., Mader, K. Adv. Drug Deliv. Rev., 2001, 47, 165-196 [5] Gursoy RN, Benita S., Biomed Pharmacother., 2004, 58, 173-82 [6] Almeida, A.J., Souto, E. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007, 59, 478-490 [7] Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2005, 59, 375-388 [8] Mundargi, R.C., Babu, V.R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T.M. J. Control. Release, 2008, 125, 193-209
본 발명은 펩티드 약물 방출의 보호 및 제어를 위한 친수성 생체-거대분자의 나노캡술화를 제공한다. 이러한 신규한 전략은 고분자 혼합물 내에 미세캡슐화 되었을 때 점막 근처에서 또는 대안적으로 이미 설명된 나노-분무 건조 기술을 이용하여 이중 나노캡슐화 되었을 때 비경구 투여 후에 용해된 약물의 방출보다는, 나노입자 내에 로딩된 작은 펩티드 약물 종의 제어 방출을 허용한다 [9]. 이러한 캡슐화는 경구 투여의 경우 산성 환경으로부터 민감성 거대분자의 보호를 제공하고, 또한 투여 경로와는 상관없이 단백질 가수분해 효소에 의해 분해로부터 민감성 거대분자의 보호를 제공한다.
따라서, 이러한 측면들 중 하나에서, 본 발명은 수용성 단백질, 글루칸 및 친수성 활성제를 포함하는 나노입자를 제공하며, 상기 글루칸은 메타인산염 (metaphosphate)에 의해 적어도 부분적으로 가교-결합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명의 " 나노입자 "는 나노캡슐 (nanocapsule; NC) 또는 나노구(nanosphere; NS)인 미립자 물질(particulate matter)이고, 이는 생체적합적이며 화학적 및/또는 물리적 파괴에 대해 충분히 저항적이어서, 충분한 양의 나노입자는 원하는 표적 조직 (장기)에 도달할 수 있도록 충분한 시간 동안 인간 또는 동물 신체에 투여한 후 상당히 온전한 상태로 남아있다. 일반적으로, 나노입자는 최대 700nm의 평균 직경을 갖는 구 모양이다. 입자의 모양이 구가 아닌 경우, 직경은 입자의 가장 긴 치수를 나타낸다.
친수성 활성제와 관련된 다양한 매개변수 (예를 들어, 용해도, 분자량, 극성, 전하(electrical charge), 반응성, 화학적 안정성, 생물학적 활성 등)에 따라, 상기 활성제는 상기 나노입자 내에 함유 (캡슐화)될 수 있고, 및/또는 나노입자를 형성하는 매트릭스 내에 박힐(embedded) 수 있다. 따라서, 선택된 적용을 위해, 나노입자는 고분자 쉘 및 적어도 하나의 친수성 활성제를 함유하는 코어를 갖는 코어/쉘의 형태일 수 있다 (이하 나노캡슐 이라고도 함).
대안적으로, 나노입자는 뚜렷한 코어/쉘 구조를 특징으로 하지 않는 실질적으로 균일한 조성일 수 있다. 이러한 나노입자는 본 명세서에서 나노구 ( nanospheres ; NSs)라고 한다.
일 실시예에서, 나노입자는 나노구 및 나노캡슐로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 평균 직경은 약 100 및 200 nm 사이이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 200 및 300 nm 사이이다. 추가 실시예에서, 평균 직경은 약 300 및 400 nm 사이이고, 평균 직경은 400 및 500 nm 사이이다. 추가 실시예에서, 평균 직경은 약 600 및 700 nm 사이이다.
다른 일 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 700 nm 사이이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 500 nm 사이이다. 다른 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 400 nm 사이이다. 추가 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 300 nm 사이이다. 추가 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 200 nm 사이이다. 추가 실시예에서, 평균 직경은 약 50 및 100 nm 사이이다.
나노입자는 각각 실질적으로 동일한 모양 및/또는 크기일 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자는 0.01% 내지 10% 미만의 입자가 상기 언급된 평균 직경의 10% 이상 또는 이하 보다 더 큰 직경을 갖도록 직경의 분포를 가진다, 그리고 일 실시예에서, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9% 미만의 나노입자는 상기 언급된 평균 직경의 10% 이상 또는 이하 보다 더 큰 직경을 갖도록 직경의 분포를 가질 수 있다.
" 수용성 단백질 "은 수용성 단백질을 만드는 용매화 매질, 즉 물과 쌍극자-쌍극자 상호작용의 형성을 허용하는 구조를 갖는 단백질의 종류에 속하는 단백질이다. 상기 단백질은 선형, 또는 구형 구조일 수 있다 (즉, 소수성 아미노산이 구조의 내부로 향하는 반면 친수성 아미노산이 밖으로 향하는 구형의 4차(quaternary) 구조를 가짐).
일 실시예에서, 수용성 단백질은 알부민이다.
다른 실시예에서, 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, " 글루칸 "은 글리코시드 결합(glycosidic bonds)에 의해 함께 연결된 당 단량체의 다당류를 포함하는 것을 의미한다. 글루칸은 α-글루칸 또는 β-글루칸일 수 있고, 천연, 합성 또는 반-합성 기원일 수 있다.
일 실시예에서, 글루칸은 α-글루칸이다.
적어도 하나의 글루칸은 2 이상의 글루칸의 조합 (예를 들어, 혼합물)일 수 있다. 적어도 하나의 글루칸은 기술분야에서 알려진 하나 이상의 글루칸일 수 있다. 적어도 하나의 글루칸의 비-제한적인 예는 산화 셀룰로오스, 풀루란, 전분, 글리코겐, 덱스트란, 리케닌(lichenin), 만난, 갈락토만난, 아라비노자일란 (arabinoxylan), 갈락톤 및 이의 유도체이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 글루칸은 덱스트란이다.
다른 실시예에서, 글루칸은 약 5 KDa (킬로달톤) 및 2,000 KDa 사이의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 나노입자에서, 글루칸은 " 적어도 부분적으로 가교- 결합된다 "; 글루칸 분자들 중 적어도 일부는 가교-결합제를 통해 상호-연결되어 3-차원 구조를 형성한다. 글루칸은 적어도 1% 가교-결합 (즉, 글루칸의 모든 -OH 기들 중 1%가 가교-결합제에 결합됨), 적어도 2% 가교-결합, 적어도 5% 가교-결합, 적어도 10% 가교-결합, 적어도 20% 가교-결합, 또는 적어도 30% 가교-결합될 수 있다.
가교-결합은 임의의 알려진 가교-결합제에 의할 수 있다. 일 실시예에서, 가교-결합은 메타인산염의 사용에 의해 이루어진다. 일 실시예에서, 가교-결합은 가교-결합제의 조합을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 메타인산염 물질이다.
일 실시예에서, 하나 이상의 메타인산염을 가교-결합제로 사용하여 글루칸을 적어도 부분적으로 가교-결합한다. 용어 " 메타인산염 ( metaphosphate ) "은 실험식 PO3 -을 갖는 산소음이온(oxyanion)을 포함하는 것을 의미하고, PO4 구조 단위로 구성된 구조를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 일 실시예에서, 메타인산염은 STMP (sodium trimetaphosphate), STPP(sodium triphosphate pentabasic), 및 POCl3 (phosphorous oxychloride)로부터 선택된다.
일 실시예에서, 메타인산염은 하기 구조식을 갖는 STMP(sodium trimetaphosphate)이다:
Figure pct00001
이론에 얽매이지 않고, STMP는 단지 글루칸의 히드록실(-OH) 기와 반응한다. 유사한 시스템에 사용된 대표적인 가교-결합제, 예를 들어 글루타르알데히드와는 달리, STMP는 -NH2 기와 결합하지 않는다. 원하지 않는 결합으로 인한 친수성 활성제의 활동 방해를 막음으로써, 담체로서 사용된 가교-결합된 나노입자의 형성을 유지하고 및/또는 활성 화합물의 용기(vessel)를 보호한다. 따라서, 가교결합된 글루칸은 단백질 (즉, 알부민)을 운반하기 위한 미립자 구조를 형성하고; 결국, 단백질은 담체 및 친수성 활성제의 보호층으로서 작용한다.
일 실시예에서, 글루칸 (예를 들어, 덱스트란) 및 메타인산염 (예를 들어, STMP) 사이의 비는 1:10 및 3:4 (w/w) 사이이다. 다른 실시예에서, 글루칸 (예를 들어, 덱스트란) 대 메타인산염 (예를 들어, STMP)의 비는 1:1, 1:2, 1:4, 1:10, 2:1 및 3:4 (w/w) 일 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 " 친수성 활성제 "도 포함한다. 친수성 활성제는 피험자 (인간 또는 비-인간)에서 질환 또는 질병의 예방 또는 치료에 사용된 활성 친수성 약물 중에서 선택될 수 있다. 활성 약물은, 비-제한적인 방식으로, 비타민, 단백질, 항-산화제, 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 항체, 단일클론항체, 백신, 예방제, 진단제, 조영제, 핵산, 기능성 식품(nutraceutical agent), 약 1,000 Da 미만 또는 약 500 Da 미만의 분자량의 소분자, 전해질, 약물, 면역제 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 친수성 활성제는 호르몬 중에서 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 친수성 활성제는 인슐린, 엑세나타이드(exenatide), 성장 호르몬 (예를 들어, 소마토트로핀), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate), 고세렐린 아세테이트 (goserelin acetate), 코팍손(copaxone), 에타네르셉트(etanercept), 또는 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 아달리무맙(adalimumab), 베바시주맙 (bevacizumab) 등과 같은 단일클론항체로부터 선택된다.
일 실시예에서, 친수성 활성제는 -NH2 말단 부분 또는 -NH2 펜딩 부분 (pending moieties)을 가진다. STMP가 이러한 친수성 활성제의 -NH2 기와 반응하지 않기 때문에, 가교-결합 또는 STMP와 활성제 사이의 어떠한 화학 반응이 가교-결합 공정 중에 발생하지 않을 수 있다. 이것은 이의 활성 및/또는 구조를 손상시키거나 또는 악영향을 미치지 않고 나노입자 내의 활성제의 캡슐화를 야기한다.
본 발명의 나노입자는 순환계로 국소, 안구, 경구, 흡입, 경비(nasal) 또는 비경구로 다양한 친수성 활성제의 전달 비히클로 사용될 수 있다. 본 발명의 나노입자 전달 시스템은 표적 약물 전달 및 제어 방출 적용을 용이하게 하고, 제거의 감소로 인해 작용 부위에서 약물 생체이용률을 향상시키고, 투여 빈도수를 감소시키며, 부작용을 최소화한다. 본 발명의 나노입자는 건조 분말 형태로 사용될 수 있거나 (흡입성 조성물로서 투여됨), 또는 수성 매질에서 재구성되어 주사가능한 제형을 형성할 수 있다.
필요에 따라, 다른 환경에 대한 활성 화합물의 보호 및 안정화를 더 제공하기 위하여, 본 발명의 나노입자는 더 큰 입자, 즉, 비경구 투여용 나노캡슐 또는 경구 투여용 미세입자로 더 캡슐화될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 소수성 고분자 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 다수의 본 발명의 나노입자를 포함하는 담체를 제공하고, 다수의 나노입자는 (i) 소수성 고분자, 예를 들어 PLGA에 의해 캡슐화되고 (즉, 이중 나노캡슐화를 형성함); 또는 (ii) 매트릭스, 예를 들어 소수성 고분자 혼합물로 형성된 매트릭스내에 박힌다. 이러한 고분자 혼합물은 유드라짓(Eudragit):HPMC 혼합물일 수 있으며, 여기서 유드라짓은 pH-의존성 용해도를 가지고, HPMC는 pH에 상관없이 수용성이다.
이러한 추가 캡슐화는 나노입자를 포함하는 다양한 구조를 야기할 수 있다. 예를 들어, 나노입자가 나노구인 경우, 소수성 고분자는 외부 쉘의 형성에 의해, 즉 나노구를 포함하는 나노캡슐을 형성하여 나노구를 캡슐화할 수 있다 (이차 NC 내에 일차 NS). 대안적으로, 소수성 고분자는 매트릭스 형태일 수 있으며, 나노구는 박힌다 (이차 미세구 내에 일차 NS).
유사하게, 나노입자가 나노캡슐인 경우, 소수성 고분자는 나노캡슐을 캡슐화할 수 있거나 (이차 NC 내에 일차 NC), 또는 매트릭스 형태일 수 있다 (이차 미세구 내에 일차 NC).
일 실시예에서, 약물-담체는 나노캡슐, 나노구 및 이의 혼합물로부터 선택된 형태일 수 있다.
용어 "소수성 고분자"는 물을 적게 흡수하거나 또는 흡수하지 않는 고분자 물질을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 고분자는 수성 환경 내에서 친수성 활성제의 전달을 위한 보호층 또는 매트릭스로 작용한다. 또한, 소수성 고분자를 사용하여 미리 결정된 방법으로 친수성 활성제를 방출하는, 서-방출 또는 제어-방출 특징을 갖는 본 발명의 담체를 만들 수 있다.
일 실시예에서, 소수성 고분자는 폴리(락틱 글리콜릭) 산 (PLGA), 폴리메틸-메타크릴레이트 (PMMA), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(락토-코-글리코라이드) (PLG), 폴리(락타이드), 폴리글리콜릭산 (PGA) 및 폴리(히드록시부티레이트)로부터 선택된다.
일 실시예에서, 소수성 고분자는 폴리(락틱 글리콜릭)산 (PLGA), 폴리(락트산) (PLA) 및 폴리(락토-코-글리코라이드) (PLG)로부터 선택된다.
일 실시예에서, 담체는 일반적으로 약 200 내지 900 nm의 직경을 갖는 구 형태일 수 있다. 다른 실시예에서, 담체의 직경은 약 200 및 800 nm 사이, 약 200 및 700 nm 사이, 약 200 및 600 nm 사이, 또는 200 및 500 nm 사이일 수 있다. 다른 실시예에서, 담체의 직경은 약 300 및 900 nm 사이, 약 400 및 900 nm 사이, 약 500 및 900 nm 사이, 약 600 및 900 nm 사이 또는 약 700 및 900 nm 사이일 수 있다.
본 발명의 나노입자 및/또는 담체는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 발명의 나노입자 및/또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 친수성 활성제의 전달 시스템은 소수성 고분자, 및 상기 소수성 고분자 내에서 캡슐화된 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 나노입자를 포함하는 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 매트릭스를 형성하는 소수성 고분자, 및 상기 매트릭스 내에 박힌 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 나노입자를 포함하는 친수성 활성제의 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 전달 시스템은 일정 기간 동안, 예를 들어 적어도 약 12시간, 또는 일 실시예에서는, 적어도 약 24시간, 적어도 7일, 또는 적어도 2주 동안 활성제의 제어 방출을 허용하는 속도에서 활성제의 전달에 적합하다. 이와 같이, 전달 시스템은 다양한 적용, 예를 들어, 제한 없이, 약물 전달, 유전자 치료, 의학적 진단, 및 피부 병리학, 암, 병원체-매개 질환(pathogen-borne diseases), 호르몬-관련 질환, 장기 이식과 관련된 생성물에 의한 반응(reaction-by-products associated with organ transplants), 및 기타 비정상 세포 또는 조직 성장을 위한 의학적 치료제에 사용될 수 있다.
약학적 조성물에서 나노입자 및/또는 담체의 농도는, 선택된 특별한 투여 방식에 따라 피험자에게 친수성 활성제의 바람직한 유효량을 전달하기에 충분한 양으로 선택될 수 있다. 알려진 대로, 본 명세서에서 목적을 위한 "유효량"은 기술분야에서 알려진 대로 이러한 고려에 의해 결정될 수 있다. 상기 양은 특히 치료받을 질환의 유형 및 중증도 및 치료 방법에 따라, 원하는 치료 효과를 이루는데 효과적이어야 한다. 유효량은 일반적으로 적당하게 설계된 임상 시험 (용량 범위 연구)에서 결정되고, 당업자는 유효량을 결정하기 위하여 이러한 시험을 적절히 수행하는 방법을 알 것이다. 일반적으로 알려진 대로, 유효량은 다양한 요인, 그 중에서도, 신체 내 이의 분포 프로파일, 신체 내 반감기와 같은 다양한 약리학적 매개변수, 원하지 않는 부작용, 필요하다면, 나이 및 성별과 같은 요인 등에 의존한다.
약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 첨가제는 비히클, 보조제, 부형제 또는 희석제일 수 있고, 당업자에게 잘-알려져 있으며, 일반인에게 쉽게 이용가능하다. 약학적으로 허용가능한 첨가제는 활성제에 대해 화학적으로 불활성이고 사용 조건 하에서 해로운 부작용 또는 독성을 가지지 않음을 나타낸다. 또한, 조성물은 완화제, 보습제, 증점제, 유화제, 중화제, 착색제, 향수, 흡수제 또는 여과기, 보존제 및/또는 겔화제와 같은 다른 표준 첨가제를 함유할 수 있다.
일 실시예에서, 약학적 조성물은 상기 친수성 활성제의 국소, 경구, 흡입, 경비, 경피, 안구 또는 비경구 투여에 적합하다. 다른 실시예에서, 약학적 조성물은 상기 친수성 활성제의 경구 투여에 적합하다. 다른 실시예에서, 약학적 조성물은 주사제로 상기 친수성 활성제의 투여에 적합하다.
첨가제의 선택은 특정 활성제에 의해, 및 조성물 또는 전달 시스템을 투여하는데 사용된 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다.
경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 (a) 액체 용액, 예를 들어, 희석제, 예를 들어 물, 식염수, 또는 오렌지 쥬스에 용해된 유효량의 화합물; (b) 캡슐, 향낭, 정제, 로렌지(lozenges), 및 트로키(troches), 각각은 고체 또는 과립으로 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유함; 및 (c) 분말로 이루어질 수 있다; 캡슐 형태는 계면활성제, 윤활제, 및 불활성 충전제, 예를 들어 락토오스, 수크로오스, 칼슘 포스페이트, 및 옥수수 전분을 함유하는 통상의 경질-껍질 젤라틴 또는 연질-껍질 젤라틴 유형일 수 있다. 정제 형태는 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미세결정성 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 구아검, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 및 기타 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 보습제, 보존제, 향미제, 및 약리학적으로 적합한 담체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로렌지 형태는 향미의 활성 성분, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스 (tragacanth), 및 불활성 기제 내 활성 성분, 예를 들어 기술분야에서 알려진 담체와 같은 활성 성분 외의 것을 함유하는 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아, 에멀젼, 겔 등을 포함하는 향정(pastilles)을 포함할 수 있다.
본 발명의 나노입자는, 단독으로 또는 기타 적합한 성분과 조합하여, 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 에어로졸 제형은 가압된 허용가능한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 배치될 수 있다. 또한, 이들은 비-가압된 제제의 의약품, 예를 들어 연무기(nebulizer) 또는 분무기(atomizer)로 제형화될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 항-산화제, 완충제, 세균발육저지제 (bacteriostats), 및 지정된 수령인의 혈액과 함께 등장성 제형을 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함하는 수성 멸균 현탁액을 포함한다. 비경구 제형은 일반적으로 용액 내에 약 0.5 내지 약 25 중량%의 활성 성분을 함유할 것이다. 적당한 보존제 및 완충제는 이러한 제형으로 사용될 수 있다. 주사 부위에서 자극을 최소화하거나 또는 제거하기 위하여, 이러한 조성물은 약 12 내지 약 17의 HLB (hydrophile-lipophile balance)를 갖는 비이온성 계면활성제 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서 계면활성제의 양은 약 5 내지 약 15 중량% 이다. 적당한 계면활성제는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스터, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된, 에틸렌 옥사이드와 소수성 기제의 고분자량 부가물을 포함한다. 비경구 제형은 단위-용량 또는 다회-용량 밀봉된 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용하기 직전에 주사하기 위해, 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가를 필요로 하는 동결건조 (냉동건조) 상태로 저장될 수 있다.
본 발명의 조성물은 주사가능한 제형으로 제조될 수 있다. 주사가능한 조성물의 효과적인 약학적 담체의 필요조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "국소"는 적용 부위에서, 원하는 효과, 예를 들어 미용 또는 치료 효과를 이루기 위해 피험자의 피부 (인간의 피부 또는 비-인간의 피부)의 적어도 일부에 직접 본 발명에 따른 조성물의 적용을 나타낸다.
본 발명의 나노입자, 담체 및/또는 전달 시스템은 생체적합성 수용액으로 투여될 수 있다. 이 용액은 식염수, 물 또는 약학적으로 허용가능한 매질로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
전달 시스템 제형의 투여는 단회 용량 또는 특정 시간 간격 후에 한번 또는 여러 번 반복된 용량으로 수행될 수 있다. 적당한 용량은 치료받을 개개인, 투여 방식, 치료제의 고유 특성 및 이루어질 특정 치료 효과에 따라 지시된 대로 및 직접 치료적 유효량으로 이러한 매개변수에 따라 변할 수 있다. 적당한 용량은 당업자에 의해 확립될 수 있다.
일 실시예에서, 전달 시스템은 경구 투여를 위해 생분해성 캡슐 내에서 더 캡슐화될 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 생분해성 캡슐은 장용-코팅(entero-coated) 캡슐 형태이다.
일 실시예에서, 전달 시스템은 상기 친수성 활성제의 촉진 표적 치료 전달 및 제어 방출 투여에 적합하다.
본 발명의 다른 측면은 질환, 질병 또는 만성 질환 치료용 약학적 조성물의 제조를 위해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 나노입자 또는 담체의 사용을 제공한다. 만성 질환의 비-제한적인 예는 당뇨병, 비만, 호르몬 결핍증, 단백질 결핍증 등이다. 본 발명의 입자가 활성제 (예를 들어, 호르몬 또는 단백질)의 연장 방출(extended release)을 제공하기 때문에, 본 발명의 이들 나노입자의 투여는 요구되는 일상적인 치료의 수를 감소시킴으로써, 환자의 삶의 질을 향상시키고 치료에 대한 환자의 순응을 증가시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 " 치료 " 또는 이의 언어의 변형(lingual variation)은, 질환과 관련된 바람직하지 않는 증상을 개선하고, 이들이 발생하기 전에 이러한 증상들의 징후를 예방하며, 질환의 진행을 늦추고, 증상의 악화를 늦추며, 만성 질환을 안정화시키고, 경감기(remission period)의 시작을 향상시키며, 진행성 만성 단계의 질환에서 야기된 회복불가능한 손상을 늦추고, 상기 진행성 단계의 시작을 지연시키며, 질환의 중증도를 경감시키거나 또는 질환을 치료하고, 생존율을 개선시키거나 또는 더 빠른 회복을 유도하며, 또는 발생하는 질환 또는 상기의 2 이상의 조합을 예방하는데 효과적인 본 발명의 나노입자 또는 전달 시스템의 치료량의 투여를 나타낸다.
다른 측면에서, 본 발명은 수용성 단백질, 글루칸 및 친수성 활성제를 포함하는 나노입자의 제조방법을 제공하며, 상기 글루칸은 메타인산염에 의해 적어도 부분적으로 가교-결합되며, 상기 방법은
- 상기 수용성 단백질 및 상기 글루칸을 포함하는 제 1 수용액, 및 상기 친수성 활성제를 포함하는 제 2 수용액을 함유하는 혼합물에 유기 용매를 (예를 들어, 주사로) 전달하는 단계; 및
- 상기 혼합물에 상기 메타인산염을 가하여 상기 글루칸을 적어도 부분적으로 가교-결합시켜 상기 나노입자를 얻는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 방법은
- 상기 수용성 단백질 및 상기 글루칸을 포함하는 제 1 수용액, 및 상기 친수성 활성제를 포함하는 제 2 수용액의 혼합물을 얻는 단계;
- 상기 혼합물에 유기 용매를 (예를 들어, 주사로) 전달하는 단계; 및
- 상기 혼합물에 상기 메타인산염을 가하여 상기 글루칸을 적어도 부분적으로 가교-결합시켜 상기 나노입자를 얻는 단계를 포함한다.
추가 실시예에서, 상기 방법은
- 상기 수용성 단백질 및 상기 글루칸을 포함하는 제 1 수용액을, 상기 친수성 활성제를 포함하는 제 2 수용액과 혼합하여 혼합물을 얻는 단계;
- 상기 혼합물에 유기 용매를 (예를 들어, 주사로) 전달하는 단계; 및
- 상기 혼합물에 상기 메타인산염을 가하여 상기 글루칸을 적어도 부분적으로 가교-결합시켜 상기 나노입자를 얻는 단계를 포함한다.
추가 실시예에서, 유기 용매는 주사로 혼합물에 전달된다.
본 명세서에 개시된 구성을 더 잘 이해하고 실제로 수행될 수 있는 방법을 예시하기 위하여, 첨부 도면을 참조하여 단지 비-제한적인 예로서 실시예를 지금 설명할 것이다.
도 1A는 STMP에 의한 덱스트란의 가교-결합 메커니즘의 개략적인 설명이며; 도 1B는 가교-결합된 입자의 개략적인 묘사이다.
도 2는 수용액에서 알부민을 불용성으로 만드는, 알부민의 가교-결합 반응을 나타낸다.
도 3은 엑세나타이드의 다른 제형 (FI-V) 및 바이에타(Byetta)에 대한 체중 결과를 나타낸다.
도 4는 바이에타와 함께 예비 실험으로부터의 혈당 수치를 나타낸다.
도 5는 엑세나타이드의 다른 제형 (FI-V) 및 바이에타로부터의 혈당 수치를 나타낸다.
도 6은 다른 날에 다른 군의 혈장 인슐린 농도(plasma insulin levels)를 나타낸다.
도 7A는 다른 날에 다른 군의 당화 헤모글로빈 수치(glycosylate hemoglobin levels)를 나타내고; 도 7B는 10일 치료에 당화 헤모글로빈 수치의 총 평균을 나타낸다.
도 8A-8B는 (도 8A) DX-50 NPs 제형 및 (도 8B) DX-150 NP 제형의 Cryo-TEM 영상을 나타낸다.
도 9A-9C는 (도 9A) Glut-1 MPs 제형, (도 9B) DX-50 MPs 제형 및 (도 9C) DX-150 MPs 제형의 XHR-SEM 영상을 나타낸다.
도 10은 20 μg/랫트 (56 μg/kg)의 용량으로 Byetta™ 및 엑세나타이드 용액의 피하 주사 및 50 μg/랫트 (DEX50 및 DEX150에 대해 각각 165 및 65 μg/kg)의 용량으로 다양한 제형의 경구 투여 후에 랫트에서 엑세나타이드의 약동학 프로파일(pharmacokinetic profile)을 나타낸다.
도 11A-11C는 항냉동 공정(cryo-protection process) 후에 이중 캡슐화된 BSA/인슐린 NPs의 동결-파단(freeze-fractured) SEM 영상이다.
도 12는 공복 상태에서 다양한 인슐린-로딩된 나노입자 제형의 피하 투여 후의 혈당 수치를 나타낸다 (N=3).
도 13은 비-공복 상태에서 h-인슐린-로딩된 나노입자 제형의 피하 투여 후의 혈당 수치를 나타낸다 (N=3).
엑세나타이드는 글루코오스 대사의 조절자 및 인슐린 분비의 조절자인, 인간 GLP-1(glucagon-like peptide-1)과 유사한 생물학적 특성을 나타내는 미국 독도마뱀(Gila monster)의 타액에서 발견되는 호르몬인, 엑센딘-4의 합성 버전이다. GLP-1 및 GIP(glucosedependent insulinotropic peptide)인 인크레틴 호르몬은 음식의 소화 후에 장의 L 및 K 내분비 세포(endocrine cells)에 의해 생성된다. GLP-1 및 GIP는 췌장 내 랑게르한스섬의 베타 세포로부터 인슐린 분비를 자극한다. 비록 GLP-1 만이 당뇨병 상태에서 인슐린 분비를 야기할지라도, 이것은 in vivo에서 매우 짧은 반감기 (몇 분)를 가지고 있기 때문에 당뇨병에 대한 임상 치료로서는 비효과적이다.
엑세나타이드는 포도당조절 효과(glucoregulatory effects)를 갖는, 인슐린 분비촉진제(insulin secretagogue)인 39-아미노산 펩티드이다. 약제는 충전된 펜 장치를 이용하여 하루에 2번씩 피하로 주사된다. 엑세나타이드는 GLP-1과 50% 아미노산 상동성을 가지며, GLP-1과 구조적으로 유사하고, in vivo에서 긴 반감기 (2.4 h)를 가진다. 따라서, 포유동물에서 인슐린 분비를 자극하고 혈당을 낮추는 능력을 시험하였으며, 당뇨병 상태에서 효과적임을 확인하였다. 설치류에 대한 연구에서도, 췌장 내 베타 세포의 수를 증가시키는 것으로 나타났다.
엑세나타이드는 인슐린 농도를 빠르게 (투여의 약 10분 이내) 올리고, 다음 한두시간 동안 인슐린 농도를 상당히 감소시킨다. 엑세나타이드는 경구 항당뇨제로 혈당 조절을 이루는데 실패한 제 2형 당뇨병을 가진 환자의 보조 요법(adjunctive therapy)으로 승인받았다. 식사 후 복용량은 사전에 복용한 것보다 혈당에 훨씬 더 작은 영향을 미친다. 6시간 내지 8시간 후에 혈당에 대한 효과가 감소한다. 약은 2번의 용량으로 이용가능하다: 5 μg 및 10 μg. 종종 치료는 5 μg 용량으로 시작하고, 부작용이 미미하면 용량을 늘린다. 제조자에 따라, 자동주입기 (autoinjector)는 처음 사용하기 전에 2 및 8℃ 사이의 냉장고에 저장하여야 하고, 그 다음에는 2 및 25℃ 사이의 온도에서 저장하여야 한다. 따라서, 더운 날씨에는, 계속해서 냉장 보관해야 한다. 엑세나타이드 임상 적용에서 잠재적인 단점은 자주 피하 (SC) 주사가 요구된다는 점이 강조되어야 한다. SC 주사는 통증, 부작용 및 환자의 순응에 악영향을 미칠 수 있는 주사 부위에서 가능성 있는 감염을 야기할 수 있다.
엑세나타이드의 지속 방출형(long-acting release form)이 주 1회(once-weekly) 주사로 사용하기 위해 개발되었다. 이러한 서방출 제형은 제어 속도로 점진적인 약물 전달을 허용하는, 흡수성 봉합사(absorbable sutures) 및 연장 방출 의약품에서 확립된 사용과 함께 보통의 생분해성 고분자인, 엑세나타이드 및 폴리 (D,L 락틱-코-글리콜릭산)의 주사가능한 미세구로 이루어져 있다. 따라서, 엑세나타이드 연장 방출은 제 2형 당뇨병의 치료, 특히 체중 감량이 개개의 환자의 관리의 필수적인 측면인 환자에서 유용한 선택이다. 그러나, 여전히 주사를 놓고, 주 1회 주사하여야 한다.
엑세나타이드 및 인슐린은 단백질 가수분해의 불안정성 및 생물학적 막을 통과하는 제한된 능력에 기인한, 동물에서 재생된 자료로부터 추정 후에 낮은 경구 인간 생체이용률 (2% 미만으로 추정됨)을 나타내는 친수성 생체거대분자이다.
본 발명에서, 친수성 거대분자의 캡슐화는 엑세나타이드 및 인슐린으로 설명된다. 첫번째 목적은, 최종 분말화된 제형 내 약물 함량이 가능한 가장 높다는 것을 확인하기 위하여, 경구 투여용 미세입자 내에 나노입자의 로딩을 증가시키는 것을 목표로, 적당한 수준으로 나노입자의 매트릭스에서 엑세나타이드의 포착이다.
본 발명은 더 큰 나노캡슐 내에 더 박힌 일차 나노캡슐 또는 나노입자에 펩티드 약물의 혼입을 더 제공하고, 그 결과 비경구 투여 경로를 이용한 장시간 방출 (prolonged release)에 대해 외부 환경의 해로운 효과로부터 펩티드를 보호하도록 설계된 이중-코팅된 나노미립자 전달 시스템의 형태로 된다. 펩티드 로딩된 일차 나노캡슐은 더 큰 이차 나노캡슐 내에 캡슐화된다. 400 또는 600 nm의 직경을 갖는 나노캡슐에서, 부피 계산을 기준으로 각각 적어도 64 및 216의 100 nm 직경의 나노캡슐을 혼입하는 것이 이론적으로 가능하다는 것을 유의해야 한다.
이차 미세입자, 즉 본 발명의 일차 나노입자를 캡슐화하는 담체는 분무 건조 기술에 의해 얻어졌다. 분무 건조는 연속 단일 단계 공정으로 액체 또는 현탁액을 건조 분말로 변환하는 공정이다. 분무 건조는 높은 수율 (>70%)의 작은 시료 양 (몇 밀리그램 또는 밀리리터)에 대해 1000 nm 내지 20 μm의 크기 범위의 미세입자를 생성할 수 있는 부치 실험실 규모 분무 건조기를 이용하여 수행함으로써, 상대적으로 높은 수율의 미세입자를 형성하였다. 이차 미세입자는 일반적으로 1 및 30 마이크론 사이의 크기 (직경)를 가진다.
물질
BSA(Bovine serum albumin) 및 덱스트란 12KDa는 Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)로부터 구입하였다. 엑세나타이드는 Teva Pharmaceuticals (Jerusalem, Israel)로부터 얻었다. 물 내 글루타르알데히드 8%는 Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)로부터 구입하였다. 트리메타인산 나트륨 (STMP)은 Alfa Aesar (Haverther chemicals and hill, MA, USA)로부터 구입하였다. 폴리(메타크릴산, 에틸 아크릴레이트 1:1) (Eudragit® L100-55)는 Rohm (Dramstadt. GmbH, Germany)로부터 얻었다. 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (Methocel E4M Premium)는 Dow Chemical Company (Midland, MI, USA)로부터 구입하였다. 인산나트륨 일염기, 일수화물 (Sodium phosphate monobasic, monohydrate)은 Mallinckrodt chemicals (Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하였다. 모든 유기 용매는 HPLC 등급이고, J.T. Baker (Deventer, Holland)로부터 구입하였다.
일차 NPs의 제조
민감성 거대분자인 엑세나타이드에 대한 가장 중요한 보호는, 일차 BSA NPs에 펩티드를 로딩함으로써 이루어졌다. 2개의 다른 유형의 NPs는 하기와 같이 제조되었다: 글루타르알데히드 8%와 가교-결합된 BSA NPs 및 STMP와 가교-결합된 덱스트란 12KDa NPs와 결합된 BSA.
글루타르알데히드와 가교- 결합된 BSA NPs
글루타르알데히드와 가교-결합된 BSA NPs는, Weber et. al [문헌 - 단백질 나노입자의 탈용매화 공정 및 표면 특성]에 의해 이전에 기재된 바와 같은 확립된 탈용매화 방법에 의해 제조되었다. 200mg의 BSA 및 4 또는 8 mg의 엑세나타이드를 20ml의 2차 증류수 (bi-distilled water, DDW)에 용해시켰다. 0.5 시간 후, 용액의 pH를 0.1M NaOH로 8.5로 조정하였다. 그 다음, 40ml의 아세톤을 수상에 천천히 가하였다. 분산 매질에서 유백광(opalescence)의 빠른 형성에 의해 입증된 바와 같이 o/w 에멀젼이 형성되었다. 그 다음, 2시간 동안 12.5㎕의 글루타르알데히드 8% 용액을 이용하여 BSA NPs를 가교-결합하였다. 가교-결합 반응이 완료한 후, 층류 공기 흐름(laminar air flow) 하에 아세톤을 증발시켰다. 이 제형을 Glut-1로 명명하였다.
BSA/ STMP와 가교- 결합된 덱스트란 NPs
BSA/덱스트란 NPs는 필요할 때 200mg의 BSA, 50mg의 덱스트란 12KDa 및 4 또는 8 mg의 엑세나타이드를 20ml의 DDW에 용해시켜 유사하게 제조되었다. 0.5 시간 후, 용액의 pH를 0.1M NaOH로 8.5로 조정하여, 덱스트란 위의 인접한 히드록실 기가 STMP 가교-결합제와 반응하는데 이용가능한지 확인하였다. 그 다음, 20ml의 아세톤을 수상에 천천히 가하였다. BSA/덱스트란 NPs를 3시간 동안 50mg의 STMP를 이용하여 가교결합한 다음, 상기 기재된 바와 같이 아세톤을 증발시켰다. 예비 제형을 제조하고 공정 매개변수를 달리하여 평가하였다. 덱스트란 양이 다른 2개의 제형을 추가 동물 연구를 위해 선택하였다: 50 및 150 mg. 50mg의 제형을 DX-50으로 명명하였고, 150mg의 제형을 DX-150으로 명명하였다.
미세구 ( MPs ) 제조
미세구 (MPs)는 분무 건조 기술을 이용하여 엑세나타이드-함유 NPs를 미세캡슐화하여 형성되었다. 미세캡슐화를 위해, 100ml의 NaH2PO4 완충제가 제조되었다. 완충제의 pH는 1M NaOH 용액으로 6.5로 조정되었다. 750mg의 유드라짓을 pH 6.5를 유지하는 용액에 용해시켰다. 또한, 1% w/v 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC) 용액은 100ml의 예열된 (~80℃) DDW에 1000mg의 HPMC를 가하여 제조되었다. 그 다음, (용해되지 않은 유드라짓 입자를 여과하기 위해) 유드라짓 용액을 가자 밴드가 있는 깔때기를 통해 HPMC 용액에 가하였다.
일단 아세톤을 NPs 현탁액으로부터 증발시키면, 모아진 미세입자 고분자 용액을 NPs 현탁액에 가하였다. 그 다음, 현탁액을 하기의 조건 하에 부치 미니 분무-건조기 B-190 기구(Buchi mini spray-drier B-190 apparatus; Flawil, Switzerland)로 분무-건조하였다: 입구온도 160℃; 출구온도 85℃; 흡기 (aspiration) 100%; 현탁액의 공급률은 7 ml/min. 이었다; 전력은 사이클론 분리기에서 모았고, 배출 수율(outlet yield)을 계산하였다.
NPs 및 MPs의 물리화학적 특성
NPs 특성
다양한 NPs의 평균 직경 및 제타 전위는 25℃에서 Malvern's Zetasizer (Nano series, Nanos-ZS, UK) 및 희석제로서 물을 이용하여 특징지워졌다. 형태학적 평가(Morphological evaluation)는 Cryo-TEM(cryo-transmission electron microscopy)을 이용하여 수행하였다. Cryo-TEM 방법에서, 용액 한방울을 300-mesh Cu grid (Ted Pella Ltd., Redding, CA, USA)에서 지지된 탄소-코팅된 구멍 뚫린 고분자(holey polymer) 필름 위에 놓고, 표본을 -170℃로 액체 에탄에서 빠른 담금질(fast quench)에 의해 Vitrobot (FEI)를 이용하여 자동적으로 유리화하였다 (vitrified). -180℃에서 유지된 가탄 냉동-홀더(Gatan cryo-holder)와 함께 120 kV에서 FEI Tecnai 12 G2 TEM를 이용하여 시료를 연구하였고, 냉각된 전하-결합 소자 카메라(charge-coupled device camera)로 천천히 스캔하여 영상을 기록하였다.
MPs의 초고해상도 SEM (scanning electronic microscopy) 연구
분무 건조된 MPs의 형태학적 및 크기 평가는 초고해상도 주사전자현미경 (model: Magellan 400L, FEI, Germany)을 이용하여 수행하였다. 시료를 양면 접착테이프를 이용하여 SEM-stub에 고정시킨 다음, 진공 하에 금 스패터링(gold spattering; Pilaron E5100) 과정으로 표준 코팅한 후 전기전도성을 만들었다.
약물 함량
분말 내 엑세나타이드의 총량은 밤새도록 2 ml의 물에 시료를 용해시켜 분석하였다. 이후, 혼합물을 2분 동안 14000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액으로부터의 1ml를 하기의 조건 하에 HPLC에 주입하였다: Column Restek Viva C4 (5μm), 250/4.6 mm. 컬럼 온도는 45℃로 유지하였다. 이동상 A는 아세토니트릴(ACN)이었고, 이동상 B는 인산으로 pH 2.5로 조정된 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate; KH2PO4, 20 mmol/L) 이었다. KH2PO4 완충제를 사용하기 전에 0.2μm 막 여과기를 통해 여과하였다. 엑세나타이드에 대해 하기의 구배 조건을 사용하였다: 15분 내 30% 내지 45% 이동상 A, 및 3분 동안 30% 이동상 A로 되돌아가 다시-평형을 유지하였다. 흐름 속도는 1.5 mL/min 이었다. 주입 부피는 20μL 이었다. UV 신호는 215 nm에서 검출되었다. 엑세나타이드 함량은 선형상관(linear correlation) (r2=0.999)을 산출하는 0 내지 20 μg/ml 범위의 엑세나타이드 농도로부터 생성된 검정곡선(calibration curve)을 이용하여 계산하였다.
랫트에서 약동학 연구
모든 동물 연구는 예루살렘 히브리 대학교의 실험동물관리 지역 윤리위원회 (local Ethical Committee of Laboratory Animal Care at The Hebrew University of Jerusalem) (MD-13575-4)에 의해 승인받았다. 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 웅성 랫트 (300-350 g)를 본 연구에 사용하였다. 동물을 SPF 조건에서 수용하고, 금식시키고, 식수를 자유로이 이용하게 하였다. 3 랫트의 7개 군을 무작위로 나누고 시간에 대해 경구 흡수 및 엑세나타이드 혈장 농도를 평가하였다. 엑세나타이드는 65 μg/kg (20 μg/랫트)의 용량으로 Byetta®에서 제형화되거나 또는 용액으로서 피하 주사되었다. 제 3 군 및 제 4 군의 랫트는 공 제형(blank formulation)이 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 165 μg/kg (50 μg/랫트)의 용량에서 엑세나타이드로 외부적으로 강화된(spiked externally) 31 mg의 공 MPs 또는 엑세나타이드 용액을 경구 투여하였다. 마지막으로, 각각의 35, 33 및 32 mg의 Glut-1, DX-50 및 DX-150을 165 μg/kg (50 μg/랫트)의 용량으로 경구 투여하였다. 모든 경구 현탁액을 2 mL DDW에 분산시켰고, 이때 피하 주사의 부피는 200μl 이었다.
혈액 시료 (500 μl)를 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간에 랫트 꼬리로부터 채취하였다. 혈액 시료를 EDTA 및 아프로티닌을 함유하는 튜브에 모았다. 시료를 10분 동안 10,000 rpm, 4℃에서 원심분리한 후, 250 μl의 혈장 시료를 새로운 튜브로 옮기고 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 엑세나타이드 농도는 회사에 의해 제안된 프로토콜에 따라 CEK-0130-01 ELISA Kit (AB Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였다.
생체이용률 계산
약동학 매개변수는 AUC의 계산을 위해 사다리꼴 공식(trapezoid rule)을 적용하는, WinNonlin 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. AUC 값은 크기 용량 정정 (size dose corrections)에 따라 조정되었다.
피하로 주사된 표준 시판 제형(standard marketed formulation) Byetta®에 비해 다른 경구 제형의 상대적 생체이용률은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00002
엑세나타이드 제형
제형 F-1: BSA 및 가교-결합된 덱스트란과 함께 엑세나타이드 일차 나노캡술화
200 mg의 BSA (Sigma-A7906) 및 50 mg의 덱스트란 12KDa (Sigma-31418)를 10 ml DDW에 용해시켰다. 4 mg의 엑세나타이드를 별도로 10 ml DDW에 용해시켰다. 알부민/덱스트란 용액을 엑세나타이드 용액에 가하여 펩티드를 완전히 용해하였다 (용액 A). pH 6.8을 NaOH 0.1M로 조정하여 pH를 ~8.5에 이르게 하였다. 20 ml 아세톤을 강하게 교반하면서 용액-A에 주입하여, 대부분의 엑세나타이드를 포함하는 BSA-덱스트란 NPs을 형성하였다. 덱스트란 가교-결합은 5% (1 ml)의 STMP(sodium trimetaphosphate)를 가하여 얻어졌고, 상기 용액을 3시간 동안 실온에서 900 rpm으로 교반하였다. 제형 F-1의 합성의 개략적인 설명은 도 1A-1B에 나타내었다.
제형 F-2: BSA 및 가교-결합된 글루타르알데히드와 함께 엑세나타이드 일차 나노캡술화
200 mg의 BSA (Sigma-A7906)를 10 ml DDW에 용해시켰다. 4 mg의 엑세나타이드를 별도로 10 ml DDW에 용해시켰다. 알부민 용액을 엑세나타이드 용액에 가하여 펩티드를 완전히 용해하였다. pH를 NaOH 0.1M로 조정하여 pH를 8.5에 이르게 하였다. 15 ml 아세톤을 강하게 볼텍싱하면서 용액-A에 주입하여, 대부분의 엑세나타이드를 포함하는 BSA-엑세나타이드 NPs을 형성하였다. BSA 가교-결합은 25μl의 글루타르알데히드 4%를 가하여 얻어졌고, 상기 용액을 3시간 동안 실온에서 900 rpm으로 교반하였다. 제형 F-2의 가교-결합의 개략적인 설명은 도 2에 나타내었다.
제형 F-3: 나노입자 표면에 엑세나타이드의 결합
엑세나타이드 활성화는 실온에서 2시간 동안 4 mg의 엑세나타이드를 스페이서 설포-SMCC (설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트)와 반응시켜 수행되었다.
나노입자를 제조하기 위해, 150 mg PLGA (50K) (Resomer RG 504H, Boehringen Ingelheim), 150 mg PLGA-co-PEG (45K 및 5K) (Resomer RGP d 50105) 및 10 mg 올레일 시스테인아미드를 50 ml 아세톤에 용해시켰다. 100 mg Solutol HS 15 (BASF)를 교반하면서 100 ml DDW에 용해시켰다. 유기상을 교반 하 (900 rpm)에 수상에 가하고 15분 동안 혼합하였다. 제형을 감압 하에 회전 증발기를 이용하여 37℃에서 10 ml 이하로 증발시켰다. pH를 NaOH 0.1M을 이용하여 6.7-6.8로 조정하고, 부피를 10 ml로 조정하였다. 제형을 4000 rpm으로 원심분리하여 큰 입자(3-4%)를 침전시켰다. 콜로이드성 상청액 만을 최종 제형으로 사용하였다.
활성화된 엑세나타이드를 형성된 제형과 함께 즉시 배양하였다. 자석 교반기로 밤새도록 교반하면서 실온에서 배양을 수행하였다. pH=6.5-7.5에서 LC-SMCC의 말레이미드 기를 올레일 시스테인아미드의 설프히드릴 기와 반응시켜 안정한 티오에테르 결합을 형성하였다.
제형 F-4: 엑세나타이드 이중 캡슐화
100 mg BSA (Sigma-A7906)를 2 ml DDW에 용해시켰다. 5 mg의 엑세나타이드를 별도로 3 ml DDW에 용해시켰다. 알부민 용액을 엑세나타이드 용액에 가하여 펩티드를 완전히 용해하였다. pH를 NaOH 1M로 7.4-8로 조정하였다. 10 ml 아세톤을 강하게 교반하면서 용액에 주입하여, 대부분의 엑세나타이드를 포함하는 BSA 나노입자를 형성하였다.
128 mg PLGA (50K)를 93ml 아세토니트릴에 용해시켰다. 6 ml의 BSA 나노입자 제형을 교반하면서 가하여 이중 캡슐화를 형성하였다 (나노분무 조건: 온도: 50℃에서, 4μm 메시).
유드라짓 L 및 HPMC와 함께 제형 F1-F4의 미세캡슐화
500 mg의 HPMC를 100ml 예열된 DDW에 용해시키고, 500 mg의 유드라짓 (음이온성)을 100ml PBS에 용해시켰다.
나노입자 용액에, 유드라짓 용액 및 HPMC 용액을 가하였다. 모아진 용액을 실온에서 500 rpm으로 30분 동안 교반하였다; 모아진 분산액을 하기의 조건에서 분무 건조기로 증발시켰다: 입구온도 160℃; 출구온도 100℃. 약물-로딩된 나노입자를 포함하는 미세입자를 얻었다.
약물-로딩된 나노입자의 물리화학적 특성은 표 1에 나타내었다.
엑세나타이드 제형의 물리화학적 특성
제형 NPs 형성 방법 크기
(nm) 		제타 전위 PDI % 수율
(건조)
EXA-12 BSA:덱스트란
(가교-결합됨)		 173.4 -38.4 0.565 45.9
F-1* BSA:D덱스트란
(가교-결합됨)		 83 -28.3 0.51 25
359 -33.5 0.306 44
F-2 BSA (글루타르알데히드와 가교-결합됨) 132.5 -45 0.1 45
F-3 PLGA (50K NPs)에 결합된 펩티드 142.8 -45 0.026 40
F-4** 이중 캡슐화 163.1 -48.6 0.093 43
88.29 -54.4 0.048 63
* 2 배치가 통합되었다.
** 통합된 제형에 대해.
OB/OB 마우스에 대해 다양한 제형 (F1-F5)의 엑세나타이드의 글루코오스 저하 효과의 평가
글루코오스를 제공함으로써, 며칠 동안 마우스의 환경 순응을 수행하였고, 6시간 동안 혈당 수치를 관찰하였다. 이후, 모든 마우스를 20 μg/kg의 용량으로 바이에타 (시판되는 엑세나타이드 주사가능한 제형)를 주사하고, 6시간 동안 혈당 수치를 관찰하였다.
OB/OB 마우스에 대해 다양한 제형 (F1-F5)의 엑세나타이드의 글루코오스 저하 효과의 평가를 동물군 당 n=8의 군 크기(group size)에 대해 수행하였다. 각 군의 OB/OB 마우스를 하기 중 하나로 제공하였다:
i) 식염수 + 빈 비히클(empty vehicle) (F-5)
ii) 바이에타-주사
iii) 엑세나타이드 (F-1)
iv) 엑세나타이드 (F-2)
v) 엑세나타이드 (F-3)
vi) 엑세나타이드 (F-4)
1일째, 모든 동물을 실험 전에 18시간 금식시킨 다음, 금식 후 혈당을 관찰하였다. 모든 동물에게 글루코오스를 복강내(i.p.)로 주사하고 (18mm/kg); 글루코오스 주사 후 60분에 하기의 매개변수를 측정하였다: 혈당 측정, Elisa를 위해 채혈, 체중 측정. 그 다음, 제형 F1-F5를 경구 투여하였다 (바이에타는 피하로 투여하였다). 투여 후, 혈당 수치를 투여로부터 30분, 1hr, 1.5hr, 2hr, 3hr 및 6hr에 관찰하였다.
2일째 내지 9일째, 시간 0에서 체중을 측정하였고, ELISA를 위해 채혈하였다. 이것은 제형의 투여 후에 하였으며, 약물 투여 (및 ELISA를 위해 채혈)로부터 1시간 이내에 혈당 수치를 측정하였다.
10일째, 시험된 제형의 마지막 용량을 투여하기 전에, 글루코오스를 다시 제공한 다음 체중을 측정하고 ELISA를 위해 채혈하였다. 이후에, 각각의 동물에게 (이들 제형의 상승작용을 체크하기 위해) 제형을 2배 용량으로 투여한 다음, 약물 투여 1시간 후에, 혈당 수치를 측정하고 ELISA를 위해 채혈하였다.
체중 측정
체중 측정은 각 마우스에 대해 동시에 수행하였다. 엑세나타이드의 다른 제형 (F1-F5) 및 바이에타의 결과는 도 3에 나타내었다.
혈당 수치 측정
혈액 시료를 1일 내지 10일에 채취하였다. 마우스를 깨끗한 내포 물질 (nesting material) 및 이들의 오래된 케이지로부터의 소량의 때묻은 침구 및 환경 강화(environmental enrichment)된 깨끗한 케이지 기지(clean cage base)로 옮기고, 15-19 주령의 동물을 혈당 측정 과정 전에 밤새도록 (최대 16 시간) 금식시켰다. 케이지 및 침구의 변화는 마우스가 흘린 음식에 접근할 수 있는 가능성을 배제하였다. 물은 전체 금식 기간 동안 자유롭게 이용가능하였다. 음식은 최종 혈액 시료의 채취 후에 반환하였다. 칼날로 꼬리 끝을 절단하여 억제되지 않은 마우스로부터 혈액 한 방울을 얻었다. 측정은 휴대용 혈당 측정기(handheld blood glucose meter) (Accu-chek Aviva, Roche Diagnostics, UK)를 이용하여 수행하였다. 바이에타와 함께 예비 실험으로부터의 혈당 수치는 도 4에 나타내었으며, 엑세나타이드의 다른 제형 (FI-FV) 및 바이에타로부터의 혈당 수치는 도 5에 나타내었다.
혈장 인슐린 농도
인슐린 측정을 위해, 꼬리 정맥으로부터 150mL의 혈액을 채취하였다 (혈액은 10분 및 5분 동안 3000 cycles/min로 원심분리기에서 처리하였다). 혈액 매개변수 및 인슐린 측정 (각 30 mL)을 위해, 2개의 헤파린-코팅된 튜브에 혈장을 분리하였다. 마우스 인슐린 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 (Mercodia, Sylveniusgatan, Sweden)를 이용하여 혈장 인슐린 농도를 측정하였다. 다른 날에 다른 군의 혈장 인슐린 농도는 도 6에 나타내었다.
당화 헤모글로빈 수치
항응고제로 EDTA를 이용하여 혈장을 모았다. 수집 30분 이내에 1000×g으로 15분 동안 시료를 원심분리하였다. 혈장을 제거하고 즉시 분석하거나 또는 -20℃ 또는 -80℃에서 분취액 내의 시료를 저장하였다. 마우스 인슐린 ELISA 키트 (Life Science, Inc, Florida, USA)를 이용하여 당화 헤모글로빈 수치를 측정하였다. 다른 날에 다른 군의 당화 헤모글로빈 수치는 도 7에 나타내었다.
NPs 및 MPs의 물리화학적 특성
BSA(Bovine serum albumin)는 (펩티드 및 단백질 제외) 경구 약물 전달을 위한 잘 알려지고 풍부한 단백질 담체이다. 이의 주요 이점은 생분해성, 생체적합성, 안전성, 비-항원성, 우수한 내성 및 유용성이다. 또한, 대부분의 코팅 고분자가 물에 가용성이고 싱크 조건(sink conditions) 하에서 펩티드의 in-vitro 장시간 방출을 도출해내기 위해 가교-결합해야 하기 때문에, 일차 NPs 내에 펩티드 및 단백질의 혼입은 쉬운 일이 아니다. 나노담체로서 널리 받아들여진 BSA NPs의 경우, 사안이 훨씬 더 복잡하다. 글루타르알데히드와 함께 가교 결합, 열에 의한 변성 또는 유기 용매의 사용을 포함하여, 알부민의 임의의 변성 처리는 분명 본 연구에서도 관찰된 바와 같이 펩티드 또는 단백질의 화학적 무결성에 영향을 미칠 것이다.
이러한 결점을 피하기 위하여, BSA 매트릭스는 도 8에 나타난 바와 같이 이의 반응성 히드록실 기를 통해 가교-결합될 수 있는 다당류 덱스트란과 결합하였다 [** 나노치료제에 대한 빌딩 블록으로서의 다당류]. 안정한 나노미립자 시스템을 이루기 위하여, 적당한 pH 조건 하에서, 덱스트란의 반응성 히드록실 기는 TSMP를 이용하여 가교-결합되었다.
다양한 제형은 다른 매개변수, 예를 들어 pH, 가교-결합 분자의 유형, TSMP 양, 덱스트란 양을 달리하여 제조되었다. 가교제로서 글루타르알데히드와 함께 제조된 엑세나타이드를 함유하는 BSA NPs는, 좁은 크기 범위를 반영하는 0.138의 PDI (poly dispersity index) 값 및 -50.3±3.03 mV의 제타 전위 값의 3번 측정치를 기준으로 59.34 ± 0.32 nm의 평균 직경을 나타내었다. BSA:덱스트란 혼합물로 구성된 NPs 제형의 특성은 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 자료를 기준으로, 덱스트란 양 (50mg 및 150mg)이 다른 2개의 제형은 앞서 언급한 바와 같이 선택하였다. NPs의 평균 직경은, 제형과 상관없이, 관찰된 상대적으로 낮은 PDI 값에 의해 반영된 바와 같은 상대적으로 좁은 분포 범위를 갖는, 190 내지 210 nm 이다.
BSA 및 덱스트란의 혼합물로부터 제조된 다른 NPs 제형의 조성물 및 특성
덱스트란 12KDa 양 (mg) pH TSMP (mg) 평균 직경 (nm) PDI 제타 전위 (mV)
50 8.5 50 192.7±3.5 0.370 -39.5
50 10 50 91.4±1.3 0.429 -45.7
50 12 50 38.6±5.5 0.699 -44.7
50 8.5 5 NA NA NA
50 8.5 75 504.9±1.8 0.399 -38.9
50 8.5 100 NA NA NA
100 8.5 50 337±6 0.316 -41.3
150 8.5 50 355.4±6.4 0.259 -40.5
200 8.5 50 691.4±17.3 0.364 -42.65
50 8.5 50 189.9±2.4 0.335 -40.5
5 8.5 50 NA NA NA
5 8.5 50 NA NA NA
5 8.5 50 NA NA NA
5 8.5 50 NA NA NA
BSA/덱스트란 혼합물로 구성된 일차 NPs의 시각화는 Cryo TEM을 이용하여 수행하였다 (도 1A-B). 영상은 Zetasizer 측정으로 관찰된 범위 값과 유사한 직경 크기를 갖는 조성물의 차이에도 불구하고 NPs의 구 형태를 나타낸다.
다양한 NP-로딩된 MPs 특성은 주로 XHR SEM 분석에 의해 시각화되었다 (도 9A, B, C). 미세캡슐화된 NPs는, MPs의 코팅이 매끄럽고, 질적으로 1 내지 15 μm의 크기이며, MPs가 SEM 시각화에 적용된 진공의 결과로 수축된다는 것을 나타낸다.
Glut-1, DX-50 및 DX-150 내 최종 엑세나타이드 함량은 각각 0.147, 0.153 및 0.158 % w/w 이고, 제형과 상관없이 대략 40%의 캡슐화 수율 효율을 야기한다.
랫트 약동학 및 흡수 연구
각각의 치료에 대한 3 랫트로부터 엑세나타이드 혈장 농도는 도 10에 나타내었다. 8 및 24 시간에, 엑세나타이드 혈장 농도는 제형과 상관없이 키트의 검출 한계 이하이었다, 따라서 자료를 나타내지 않았다. 또한, 엑세나타이드 용액, Glut-1 제형 및 경구 투여된 유리 엑세나타이드 용액으로 강화된 공 MPs 제형 (엑세나타이드 없이 DX-50 NPs로 제조됨)이 임의의 검출가능한 엑세나타이드 혈장 농도를 도출해내지 못했다는 것을 도 10에 나타낸 결과로부터 확인할 수 있다. 또한, 실제의 엑세나타이드가 시판품 Byetta™의 프로파일과 가까운 혈장 프로파일을 도출해내는 반면, 제형 DX-50는 DX-150보다 더 높은 약동학 프로파일을 도출해낸다는 것을 관찰하였으나, 둘다 주사가능한 제제보다 훨씬 더 높은 용량으로 투여되었다 (각각 165 μg/kg 대 65 μg/kg).
실제로, 약동학 매개변수의 계산에 따라 가장 높은 AUC 값이 바이에타 (Byetta) 주사에 의해 도출되어졌고, 뒤이어 엑세나타이드 주사 용액, DX-50 및 DX-150 제형에 의해 도출해되어졌다는 것을 용량 표준화에 따라 분명하게 확인할 수 있다. 또한, 용량에 상관없이 모든 제형은 1,000ng/ml 보다 높은 Cmax 값을 도출하였고 Tmax 값에서는 차이가 없었다. 더 중요한 것은, ANOVA 분석이 바이에타 및 엑세나타이드 용액 및 DEX-50 경구 현탁액 사이에서 표준화된 AUC 값 사이에 유의한 차이가 없다는 것을 가리켰다. 단지 유의한 차이는 DEX10-50과 함께 46.5%의 상대적 경구 생체이용률을 도출하였다는 것이다.
65 μg/kg의 용량으로 바이에타 및 엑세나타이드 용액 (Exe. Sol.)의 피하 주사 또는 165 μg/kg의 용량으로 DX-50 및 DX-150의 경구 투여 후에 평균 PK 매개변수 값 (평균±표준오차(SE)), N=3
제형 T½ (h) T max (h) C max (ng/mL) CL
(mL/h/kg) 		AUC all (h*ng/mL) AUC /D F relative (%)
Byetta SC 0.76±0.09 1.33±0.33 1216.56±5.91 18.70±2.12 3101.11±369.67 0.16±0.02
Exe. Sol. SC 0.21±0.00 0.83±0.17 1057.29±146.36 23.43±4.48 2637.10±544.43 0.13±0.03 85.04±17.56
DX -50 PO 1.64±0.13 1.33±0.33 2089.53±324.45 27.25±1.72 5944.55±394.88 0.12±0.01 76.68±5.10
DX -150 PO 0.23±0.00 1.00±0.00 1800.65±222.27 48.50±6.90 3599.25±575.02 0.07±0.01 46.43±7.42
관찰
본 연구에서 동물 다루기(animal handling), 돌보기(care), 및 치료에 관련된 모든 과정은 국제실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)의 지침에 따라 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인된 지침에 따라 수행되었다.
도면 및 본문에 있는 모든 값들은 n 관찰의 평균의 평균 표준오차(mean standard error; s.e.m.)로 나타낸다. in vivo 연구의 경우, n은 연구된 동물의 수를 나타낸다. 조직학(histology)과 관련되는 실험에서, 나타낸 도면은 각 군의 모든 동물로부터 수집된 조직 부분에 대해 다른 실험 날짜에 수행된 적어도 3개의 실험 (조직학적 착색(histological coloration))을 나타낸다. 자료 세트(Data sets)는 일원 분산분석 또는 이원 분산분석에 의해 조사된 다음, 개개의 군의 평균을 Student's unpaired t test와 비교하였다. 0.05 보다 작은 p-값은 유의한 것으로 간주되었다.
토의
엑세나타이드의 다른 제형 (F1-F5)의 치료 효능 및 안전성은 OB/OB 마우스에서 평가되었다. 특히, 엑세나타이드 (F1-F5) 및 바이에타의 투여 후 체중에서 유의한 차이가 없었다 (도 3).
도 4에 나타난 바와 같이, 바이에타와 함께 예비 실험에서, 글루코오스 주사 1시간 후, 마우스는 바이에타를 투여받았다; 6시간까지 혈당 수치의 감소가 나타났다. 이러한 결과는 바이에타가 당뇨병 치료에서 목표 기준을 나타낸다는 생각을 지지한다. 또한, 엑세나타이드의 다른 제형 (F1-F4)을 바이에타 치료와 비교하였다. 엑세나타이드 제형 (F1-F4)은 경구 투여되었고, 바이에타 조성물은 주사로 투여되었음은 중요하다. 결과는 F-1 및 F-2의 매일 경구 투여가 OB/OB 마우스에서 혈당 수치의 증가를 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다 (도 5). 이를 근거로, 이들 2개의 제형이 가장 흥미로운 결과를 나타내는 것으로 추측된다.
도 6의 자료는 다른 날에 다른 군의 혈장 인슐린 농도를 나타낸다. 관찰된 바와 같이, 엑세나타이드의 다른 제형 (F1-F5)과의 치료 및 바이에타와의 치료는 인슐린 농도를 증가시킬 수 있다.
또한, 10일 치료 동안, 바이에타 주사는 OB/OB 마우스에서 당화 헤모글로빈 (HbA1c)의 수치를 감소시킨다는 것을 확인하였다 (도 7-11). 정화된 당화 헤모글로빈의 비율은, 도 5와 비교하여, 단지 엑세나타이드의 2개의 제형 F-1 및 F-2 만이 당화 헤모글로빈 수치의 감소에 효과를 나타냄을 보여준다.
이로부터, 엑세나타이드 F-1의 매일 경구 투여는 (그리고 펩티드가 글루타르알데히드에 의해 가교-결합되고 이의 활성의 일부를 손실하기 때문에, F-2의 훨씬 적은 정도의 경구 투여에 대해), 당뇨병의 대증 요법(symptomatic treatment)에 유익한 영향을 미칠 수 있다고 결론지었다.
h-인슐린의 이중 나노캡슐화
주사가능한 건조 분말을 얻고, in vivo에서 펩티드의 장시간 방출을 도출해내기 위해, h-인슐린을 포함하는 이중 나노캡슐화 시료를 제조하였다.
HSA와 함께 h-인슐린 일차 나노캡슐화:
200 mg의 HSA(human serum albumin)를 교반하면서 5 ml의 DDW에 용해시켰다. 별도로, 20 mg의 인간 인슐린 또는 소 인슐린을 5 ml의 DDW에 용해시키고 30초 동안 볼텍싱하였다. h-인슐린 용액을 HSA 용액에 가한 다음 30분 동안 교반하여 펩티드를 완전히 용해하였다. 결과 용액의 pH를 NaOH 0.1M로 7.4-8로 조정하였다. 그 다음, 20 ml의 아세톤을 격렬하게 교반하면서 (900 rpm) 빠르게 (20초 이내) 주입하여, h-인슐린과 함께 로딩된 HSA 나노캡슐의 형성을 도출하였다 (용액 A). 용액 A는 아세톤의 증발을 피하기 위해 알루미늄 호일로 덮었으며, 900 rpm에서 1시간 동안 교반하였다. 제타 전위 및 크기 측정을 위해, 1시간 교반 후에 시료 (50-100μl)를 회수하였다. 별도로, PLGA 100K (50:50) 용액을 80 ml의 아세토니트릴에 용해시키고 용액 A에 가하였다.
나노분무 건조기를 이용하여 PLGA로 HSA /h-인슐린 나노입자의 나노캡슐화 - 유기 방식
'폐쇄 루프(closed loop)' 방식으로 작동하는 NSD B-90에서 분무 건조를 통해 나노캡슐을 제조하였다. 따라서, N2 (g) 및 CO2 (g)가 공기 대신 시스템에서 흘렀다. 모든 실험에서, 가스 흐름은 약 120 l/min 이었다. 공기는 건조 및 응축을 위해 제습기 단위(Dehumidifier unit)로 옮겨진 휘발성 증기 및 습도와 함께 흡수된 다음, 원형 경로(circular path)에서 시스템으로 건조 환수되었다. 분무 건조는 메시 크기 막 4μm와 함께 낮은 온도 (Tin=30-60℃)에서 수행되었다. 다른 HSA/h-인슐린/PLGA 비율의 다양한 제형을 제조하였다. 난류(turbulent flow)에서 작동하는 종래의 분무 건조기와 달리, NSD B-90은 층류(laminar flow)에서 작동한다; 따라서 부드러운 열(gentle heating)이 달성될 수 있으므로, 열-민감성 생물의약품에 적합한 시스템을 만들 수 있다.
약물- 로딩된 일차 나노캡슐의 물리화학적 특성
일차 나노캡슐 내의 인슐린 함량
HPLC에 의한 적당한 분석 방법은 하기 조건에서 개발되었다:
h-인슐린의 분리 및 분석을 위해 c4 컬럼을 사용하였다 (RESTEK viva 4.6 mm×250 mm, i.d., 5 μm 입자, Bellefonte, PA. USA). 컬럼 온도는 45℃로 유지하였다. 이동상 A는 아세토니트릴 (ACN)이었고, 이동상 B는 인산으로 pH 2.5로 조정된 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate; KH2PO4, 20 mmol/L) 이었다. 이동상을 0.45 μm 막 여과기를 통해 여과하였고, 사용하기 전에 진공을 통해 탈기하였다.
h-인슐린에 대해 하기의 구배 조건을 사용하였다: 15분 내 30% 내지 45% 이동상 A, 및 3분 동안 30% 이동상 A로 되돌아가 다시-평형을 유지하였다. 흐름 속도는 1.5 mL/min 이었다. 주입 부피는 20μL 이었다. UV 신호는 215 nm에서 검출되었다.
다양한 제형 내 h-인슐린 함량
제형 나노입자 방법 캡슐화 효율 (%) 함량
(인슐린/mg 형성)
DEHI-002 PLGA 100K (3X), 인슐린 (3X) 나노캡슐화 69 15.01
DEHI-003 PLGA 100K (3X), 인슐린 (1X) 나노캡슐화 145 12.36
DEHI-004 PLGA 100K (1X), 인슐린 (1X) 나노캡슐화 25 13.09
다양한 제형의 일차 나노캡슐의 제타 전위 및 입자 크기
제형 나노입자 방법 크기 (nm) PDI 제타 전위 ( mV)
DEHI-002 PLGA 100K (3X), insulin (3X) double nanoencapsulation 151.1 0.17 -59.6
DEHI-003
 PLGA 100K (3X), insulin (1X) nanoencapsulation 150.1 0.17 -61.9
DEHI-004
 PLGA 100K (1X), insulin (1X) nanoencapsulation 160.9 0.10
유체 계면에서 나노캡슐의 동결-파단 SEM 영상
시료를 초순수(ultrapure water)에 현탁시키고 볼텍싱한 다음, 동결 전에, 적어도 30분 동안 흔들어주었다. 1.5 μm의 현탁액 부피를 스페이서로 사용된 200 메시 TEM 그리드와 함께 2개의 평평한 알루미늄 혈소판 사이에 끼웠다. 그 다음, 시료를 HPM010 고압동결기(high-pressure freezing machine) (Bal-Tec, Liechtenstein)에서 고압 동결시켰다. 동결된 시료를 홀더 위에 탑재하고, VCT 100 Vacuum Cryo Transfer device (Bal-Tec)를 이용하여 BAF 60 동결 파단 장치(freeze fracture device) (Bal-Tec)로 옮겼다. -120℃의 온도에서 파단 후, 시료를 5분 동안 -110℃에서 에칭하고, 이중축 회전 음영(double axis rotary shadowing)에 의해 3 nm Pt/C으로 코팅하였다. VCT 100을 이용하여 시료를 Ultra 55 SEM (Zeiss, Germany)으로 옮기고, -120℃의 온도에서 1.5 kV에서 이차 전자 인-렌즈 검출기 (secondary electrons in-lens detector)를 이용하여 관찰하였다. SEM 영상은 도 11A-11C에 나타내었다.
당뇨병 (DM)의 유도
0.05M 시트르산염 완충제 (50 mg/kg 체중)에 희석시킨 스트렙토조토신(STZ)의 정맥 주사에 의해 랫트에서 DM을 유도하였다. 2주 후에, 당뇨병으로 선택된 동물은 250 mg/dL 이상의 공복 혈당증(fasting glycemia)을 나타낸 동물이었다. 혈당증은 임상 혈당측정기(clinical glucometer) (ContourTM, BAYER)를 이용하여 글루코오스 산화효소법(glucose oxidase method) (Bergmeyer and Bernt, 1974)으로 측정되었다.
그 다음, 당뇨 랫트를 이용하여 다른 조건 (공복 및 비-공복)의 동물 당 5; 10 IU/ (175; 350 μg)에서 경구 영양 (oral feeding) 및 5 IU (175 μg)에서 피하 주사를 통해 인슐린 나노캡슐을 함유하는 다른 제형의 혈당강하 효과를 평가하였다.
도 12-13은 각각 공복 및 비-공복 상태에서 다양한 인슐린-로딩된 나노입자 제형의 피하 투여 후의 혈당 수치를 나타낸다 (N=3).
h-인슐린의 일차 HSA 나노캡슐이 PLGA의 더 큰 나노캡슐에서 나노캡슐화됨을 SEM 영상으로부터 알 수 있다. 또한, 이들 일차 나노캡슐은 인슐린 방출이 근육내 (i.m.) 주사 또는 피하 주사로 제어될 수 있음을 암시하는 고분자 PLA에 의해 내부적으로 코팅된다. 이중 나노캡슐에서 양쪽 유형의 인슐린의 주사가 공복 상태에서 24시간 동안 혈당의 현저한 장시간 감소를 도출해내는 반면, 비-공복 상태에서는 효과가 더 짧기 때문에, 이러한 가정은 (도 12-13에서 알 수 있는 바와 같이) 확인되었다. 신규한 기술은 적어도 현저하게 인슐린의 약리 활성에 악영향을 미치지 않는다고 결론지을 수 있다.

Claims (31)

  1. 수용성 단백질, 글루칸 및 친수성 활성제를 포함하는 나노입자로서,
    상기 글루칸은 메타인산염(metaphosphate)에 의해 적어도 부분적으로 가교-결합되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서, 수용성 단백질은 알부민인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 글루칸은 α-글루칸인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 α-글루칸은 덱스트란, 글리코겐, 풀루란, 전분, 리케닌(lichenin), 만난, 갈락토만난, 아라비노자일란(arabinoxylan) 및 갈락톤으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루칸은 5KDa 및 2,000KDa 사이의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 메타인산염은 STMP(sodium trimetaphosphate), STPP(sodium triphosphate pentabasic), 및 POCl3(phosphorous oxychloride)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  8. 제 7항에 있어서, 메타인산염은 STMP(sodium trimetaphosphate)인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 활성제는 -NH2 말단 부분 또는 -NH2 펜딩 부분 (pending moieties)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 활성제는 비타민, 단백질, 항-산화제, 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 호르몬, 항체, 단일클론항체, 백신, 예방제, 진단제, 조영제, 핵산, 기능성 식품(nutraceutical agent), 1,000 Da 미만 또는 500 Da 미만의 분자량의 소분자, 전해질, 약물, 면역제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 친수성 활성제는 인슐린, 엑세나타이드(exenatide), 성장 호르몬, 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 코팍손 (copaxone), 에타네르셉트(etanercept) 및 단일클론항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 친수성 활성제는 인슐린 및 엑세나타이드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자는 최대 500 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  14. 제 13항에 있어서, 나노입자는 50 nm 내지 250 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자는 나노구 또는 나노캡슐인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  16. 소수성 고분자 및 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 다수의 나노입자를 포함하는 담체로서, 다수의 나노입자는 (i) 상기 소수성 고분자에 의해 캡슐화되거나 또는 (ii) 상기 소수성 고분자로 형성된 매트릭스 내에 박힌 것을 특징으로 하는, 담체.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 소수성 고분자는 폴리(락틱 글리콜릭)산 (PLGA), 폴리메틸-메타크릴레이트 (PMMA), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(락토-코-글리코라이드) (PLG), 폴리(락타이드), 폴리글리콜릭산 (PGA) 및 폴리(히드록시부티레이트)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 담체.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 나노입자는 200 내지 900 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 담체.
  19. 제 18항에 있어서, 나노입자는 1 내지 30 마이크론의 직경을 갖는 나노캡슐에 박힌 것을 특징으로 하는, 담체.
  20. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 나노입자 및/또는 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 약학적 조성물은 상기 친수성 활성제의 국소, 경구, 흡입, 경비, 경피, 안구 또는 비경구 투여에 적합한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 약학적 조성물은 상기 친수성 활성제의 경구 투여에 적합한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 약학적 조성물은 주사제로 상기 친수성 활성제의 투여에 적합한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  24. 소수성 고분자, 및
    상기 소수성 고분자 내에서 캡슐화된 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 다수의 나노입자를 포함하는, 친수성 활성제의 전달 시스템.
  25. 매트릭스를 형성하는 소수성 고분자, 및
    상기 매트릭스 내에 박힌 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 다수의 나노입자를 포함하는, 친수성 활성제의 전달 시스템.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 생분해성 캡슐 내에서 더 캡슐화되는 것을 특징으로 하는, 전달 시스템.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 생분해성 캡슐은 장용-코팅(entero-coated) 캡슐 형태인 것을 특징으로 하는, 전달 시스템.
  28. 제 24항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 시스템은 상기 친수성 활성제의 촉진 표적 치료 전달 및 제어 방출 투여에 적합한 것을 특징으로 하는, 전달 시스템.
  29. 질환, 질병 또는 만성 질환 치료용 약학적 조성물의 제조를 위해, 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 나노입자 또는 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 담체의 사용.
  30. 제 29항에 있어서, 약학적 조성물은 피험자의 순환계로 친수성 활성제를 국소, 경구, 흡입, 경비, 경피, 안구 또는 비경구로 수송하기 위한 전달 시스템으로 적용되는 것을 특징으로 하는, 사용.
  31. 수용성 구형 단백질, 글루칸 및 친수성 활성제를 포함하는 나노입자의 제조방법으로서, 상기 글루칸은 메타인산염에 의해 적어도 부분적으로 가교-결합되며,
    상기 방법은
    - 상기 수용성 구형 단백질 및 상기 글루칸을 포함하는 제 1 수용액을, 상기 친수성 활성제를 포함하는 제 2 수용액과 혼합하여 혼합물을 얻는 단계;
    - 상기 혼합물에 유기 용매를 주입하는 단계; 및
    - 상기 혼합물에 상기 메타인산염을 가하여 상기 글루칸을 적어도 부분적으로 가교-결합시켜 상기 나노입자를 얻는 단계를 포함하는, 나노입자의 제조방법.
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