KR20160093743A - 재조합에 의해 제조된 인자 ⅷ을 위한 신규한 보호 조성물 - Google Patents

재조합에 의해 제조된 인자 ⅷ을 위한 신규한 보호 조성물 Download PDF

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Abstract

고순도 인자 VIII (r-인자 VIII); 아르기닌 및/또는 수크로오스; 인자 VIII의 표면 흡착을 방지하거나 또는 적어도 억제하기 위한 계면활성제; 인자 VIII의 특이적 안정화를 위한 양의 염화 칼슘을 포함하는, 히스티딘-불포함 조성물.

Description

재조합에 의해 제조된 인자 Ⅷ을 위한 신규한 보호 조성물{New protecting compositions for recombinantly produced factor VIII}
본 발명은 고 순도의 재조합에 의해 제조된 인자 VIII(r-인자 VIII)을 보호하는 능력을 갖는 동결건조 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 동결건조 전 및 동결건조된 고체 제제의 주사용액으로의 재구성 후 r-인자 VIII의 액체 제제에 관한 것이다.
인자 VIII은 혈액 응고 과정에 관련된 필수적인 혈액 혈장 단백질이다. 이 응고 인자의 결함은 인자 VIII 대체 요법에 의해 치료되어야 하는 생명을 위협하는 질병인 A형 혈우병을 초래한다. 전통적으로, 정제된 혈장-유래 인자 VIII(p-인자 VIII)의 농축물이 대체 요법을 위해 이용되었다. 보다 최근에, 재조합에 의해 제조된 인자 VIII (r-인자 VIII)이 이용가능하게 되어, 혈장 헌혈과 독립적인 공급원을 제공하며, 바이러스-전염 질환의 위험을 감소시킨다.
인자 VIII은 복합 분자이고 시간의 경과에 따른 활성 상실과 연관된 매우 민감한 단백질이다. 혈액에서, 인간 혈장 알부민(HSA) 및 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor, vWF)와 같은 기타 혈액 단백질이 인자 VIII의 응고제 활성 보존을 보조한다. 그러나, 바이러스 전염의 위험 때문에, r-인자 VIII의 약제학적 제제에서 혈액 혈장의 정제에 의해 수득된 단백질의 존재를 피하는 것이 바람직하다. 따라서, 활성 상실을 유발하는, 물리적 및 화학적 분해와 응집으로부터 r-인자 VIII을 보호하기 위해 기타 약제학적으로 허용가능한 부형제의 조성물을 제공하는 것이 필수적이다. 장기 보관 동안 단백질 활성의 상실을 예방하기 위해 통상적으로 이용되는 기법은 동결건조(freeze-drying)에 의해 건조 고체 약제학적 제제를 제조하는 것이다. 약제학적 부형제는 또한 약제학적 공정 동안, 장기 보관 동안 및 동결건조된 제제의 투여를 위한 용액으로의 재구성 후에 인자 VIII을 보호해야 한다.
인자 VIII의 DNA 서열은 6개의 도메인; 3개의 A-도메인, 2개의 C-도메인 및 1개의 B-도메인으로 나뉘고, 인자 VIII은 다른 응고 인자들, vWF, 인지질 및 금속 이온을 위한 상호작용 부위를 포함한다. 인자 VIII 단백질의 가장 작은 활성 형태는 B 도메인이 결여되고 90 kDa의 중쇄와 결합된 80 kDa의 경쇄로 구성된다 (Wang W. et al, 2003). 전장 r-인자 VIII (Kogenate®, Bayer, Helixate®, CSL Behring, Recombinate®, Baxter and Advate®, Baxter) 및 B-도메인 결실 r-인자 VIII (ReFacto®, Wyeth and Xyntha®, Wyeth) 약물 제품이 현재 시판되고 있다. 인자 VIII의 약제학적 제제에서, 모든 성분들은 조심스럽게 선택되어야 한다. 각 부형제는 약제학적 공정, 장기 보관, 및 최종적으로 재구성 및 환자로의 투여에서 인자 VIII의 고수율을 유지하기 위해 보호 기능을 제공한다. 또한, 모든 부형제의 임상적 안정성이 고려된다.
동결건조의 목적 (Manning, M. C. et al, 1989, Tang, X. et al, 2004, Schwegman, J. J. et al, 2005)은 유해한 물리적 및 화학적 반응은 종종 수성상에서 일어나기 때문에, 제제로부터 물을 제거하는 것이다.
동해-/동결보호제(cryo-/lyoprotectant)가 단백질을 둘러싼 무정형 매트릭스를 형성하는 것에 의해, 동결건조 공정 동안 및 보관 동안 단백질을 보호하기 위해 요구된다.
벌킹제(bulking agent)는 동결건조 동안 기계적 지지를 제공하고 약물 제품의 건량을 증가시키기 위해 케이크 형성제(cake former)로서 기능하기 위해 포함된다. 벌킹제는 그에 의해 동결건조된 제품의 균일한 품질 및 외양을 제공하는데 기여한다.
완충제는 단백질 및 제품의 치료적 용도에 적합한 값으로 pH를 유지하기 위해 첨가될 수 있다.
인자 VIII의 높은 효능 때문에, 치료제 용액 중 인자 VIII의 농도는 낮다. 또한, 인자 VIII은 쉽게 표면에 흡착하여, 표면 흡착이 제조 동안 및 제품의 재구성 후 활성 상실의 주요 원인이다. 현재 시판되는 인자 VIII 제품의 경우, 통상적으로 계면활성제가 미셀 응집체(micellar aggregate)를 형성하는 용액 농도인 그의 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, cmc)보다 높은 농도로 이용되는 것으로 주장된다. 폴리옥시에틸렌-함유 비-이온성 디터전트의 cmc 값은 cmc 값이 보다 낮은 온도에서 더 높아지기 때문에 온도 의존적이다 (Alexandridis, P. et al, 1994, Nilsson, M. et al, 2007). 폴록사머(Poloxamer) 188의 cmc는 37℃에서 20-30 mg/ml 이상이고 (Kabanov, A. V. et al, 1995, Alexandridis, P. et al, 1994, Moghimi, S. M. et al, 2004) 2O℃에서 100 mg/ml까지 증가된다 (Nakashima, K. et al, 1994). 따라서, 이 보고서들에 따르면, 폴록사머 188의 cmc는 25℃에서 20 내지 100 mg/ml의 구간 내에 존재한다.
금속 이온이 인자 VIII의 경쇄와 중쇄의 결합에 관련된 것으로 확인되었고 (Wang W et al, 2003) 따라서, 칼슘 이온 (Ca2 +)이 일반적으로 80 kDa 사슬과 90 kDa 사슬의 복합체의 결합을 유지하기 위해 인자 VIII의 제제에 존재한다.
하기와 같이, 인자 VIII의 적합한 제제를 찾기 위해 상당한 노력이 이루어졌다:
Osterberg 등에 의한 발표 (1997)는 계면활성제인 염화칼슘과 조합된, 벌킹제인 염화나트륨 및, 안정화제인 수크로오스와 벌킹제인 히스티딘을 포함하는 제제를 개시한다.
US-B-7247707 (Besman et al)은 300 내지 500 mM 염화나트륨, 1 내지 4%의 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 안정화제, 1 내지 5 mM CaCl2, 및 완충제, 바람직하게는 히스티딘을 포함하는 알부민-불포함(albumin-free) 제제를 개시한다. 계면활성제도 상기 조성물에 0.1% 이하의 농도로 포함된다.
US-A-5874408 (Nayar)은 글리신, 히스티딘, 수크로오스, CaCl2 및 소량의 염화나트륨을 포함하는, 재조합 인자 VIII의 제제를 개시한다. Nayar는 현재 모든 상업적으로 이용가능한 r-인자 VIII 제제 중에 완충제로 포함되는, 히스티딘이 동결건조된 인자 VIII 제제에서 불안정화 효과를 갖는다는 것을 발견되었다. 그러나, 이 효과는 염, 글리신 및 수크로오스의 첨가에 의해 극복되었다.
US-A-4877608 (Lee et al)은 130 IU/mg 이상의 활성을 갖는 치료적 활성 인자 VIII; 0.4 내지 1.2 M 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물; 1.5 내지 40 mM 염화칼슘 및 1 내지 50 mM 히스티딘 및 선택적으로, 10% 이하의 만니톨, 수크로오스 및 말토오스로 구성된 군으로부터 선택된 당으로 필수적으로 구성된 수용액 중 고도로 정제된 인자 VIII 단백질 제제의 용도를 개시한다.
US-A-2005/0256038 (White et al)은 계면활성제, 염화칼슘, 수크로오스, 염화나트륨, 트리소디움 시트레이트, 및 아미노산 불포함 완충제를 포함하는 동결건조된 인자 VIII 조성물을 교시한다.
WO-A-99/10011 (Kanellos et al)은 고순도를 갖는 혈장 인자 VIII을 위한 열-처리 제제를 개시한다. 상기 제제는 수크로오스, 트레할로오스 및 하나 이상의 아미노산의 안정화 유효량(stabilizing effective amount)을 포함한다. 바람직한 아미노산은 라이신이나, 사용가능한 다른 아미노산은 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 히스티딘, 프롤린, 세린 및 글리신이다.
EP-A-1016673 (Osterberg et al)은 안정화제인 비-이온성 계면활성제 및 5000 IU/mg 보다 높은 비활성(specific activity)을 갖는 인자 VIII을 포함하는 제제의 이용을 교시한다. 또한, 계면활성제 농도는 0.01 mg/ml 이상의 양으로, 임계 미셀 농도보다 높아야한다는 것이 기재된다.
US-B-6887852 (Paik et al)는 안정화제로서 L-아르기닌, L-이소루이신 및 L-글루탐산의 혼합물을 포함하는 동결건조된 인자 VIII 제제를 개시한다. 기본 제제는 소량의 염화나트륨, 염화칼슘 및 히스티딘을 포함한다. 개시된 제제는 계면활성제를 포함하는 제제에 비해 더 우수한 안정성을 보이기 때문에, 계면활성제가 상기 조성물에 첨가되지 않는다.
US-A-5565427 (Freudenberg)은 디터전트 및 아미노산 또는 그의 염 중 하나를 포함하는 인자 VIII의 안정한 용액의 이용을 개시한다. 상기 단백질의 비활성은 2000 IU/mg 이상이다.
US-A-5328694 (Schwinn)는 혈장으로부터 정제된 인자 VIII 및 이당류와 하나 이상의 아미노산의 조합을 포함하는 안정한 주사 용액을 개시한다. 바람직하게는, 상기 아미노산은 라이신 또는 글리신이다.
본 발명은 고순도의 재조합에 의해 제조된 인자 VIII (r-인자 VIII)의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 히스티딘을 포함하지 않는다. 최대한의 보호 효과를 발휘하기 위해, 본 발명의 조성물은 동해/동결보호제, 벌킹제 및 계면활성제와 같은 부형제의 의도적인 선택에 기초한다. 각각의 첨가된 부형제가 모든 단계에서, 즉, 약제학적 공정, 장기 보관 동안 및 재구성과 투여 동안 그의 보호 효과를 발휘하지는 않을 수 있다.
본 발명의 동결건조된 제제는 동일한 충전 용량(filled volume) 및 재구성 용량을 갖는 것으로 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자에게, 제제화된 제품이 보다 희석된 제형으로 재구성될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
본 발명은 재조합에 의해 제조된 인자 VIII을 보호하는 능력을 갖는, 제1항에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 r-인자 VIII의 히스티딘-불포함 조성물은 일반적으로 아르기닌 또는 수크로오스, 또는 아르기닌과 수크로오스의 조합인 동해/동결보호제; 염화나트륨 또는 아르기닌인 벌킹제; 계면활성제; 및 선택적으로 pH 완충제를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "히스티딘-불포함(histidine-free)"은 미량이 이전의 제조 단계로부터 벌크 약물 물질에 동반될 수 있기 때문에, "히스티딘이 없는(deviod of)" 조성물을 의미하지 않고, 약제학적 공정 동안 히스티딘이 첨가되지 않는다는 것을 의미할 것이다. 히스티딘은 인자 VIII 조성물에서 완충제로 자주 사용되고 일부 자료는 인자 VIII에 대한 안정화 효과를 보고하며 (EP-A-1016673, Osterberg et al), 기타 자료는 인자 VIII의 제제 중 불안정화 효과를 보고한다 (US-A-5874408, Nayar). 본 발명은 적합한 경우, pH 완충제로서 소디움 시트레이트, 말레산 또는 트리스(tris(hydroxymethyl)aminomethane)를 포함한다. 완충제는 예를 들면, 6.5 내지 7.5 범위의 pH를 유지하는 양으로 존재하는 소디움 시트레이트이다. 소디움 시트레이트의 적합한 형태는 이수화물 염이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은 동결건조된 제형일 수 있으나, 또한 동결건조될 용액 및 동결건조된 조성물로부터 재구성된 용액과 같은 용액에 의해 대표된다.
본 발명의 조성물은 인자 VIII 분자의 특이적 안정화를 개선하기 위해 약 0.5 내지 10 mM의 양으로 염화칼슘을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 글루타티온 또는 메티오닌과 같은 항산화제와 같은 기타 화합물을 더 포함할 수 있다.
벌킹제는 동결건조된 케이크에 기계적 지지를 제공하고 건량을 증가시키기 위해 제제 중에 존재하는 부형제를 의미한다. 벌킹제는 염화나트륨과 같은 결정질 상태이거나, 또는 아르기닌과 같은 무정형 상태일 수 있다.
pH 완충제는 약 5 내지 9의 pH 범위에서 완충 능력을 갖는 화합물을 의미한다. 완충 능력은 상기 pH 구간 내에서 완충제의 pKa 값에 관한 것이다.
이온 강도 제공제(ionic strength provider)는 이온 강도를 증가시키기 위해 제제 중에 존재하는 이온성 화합물을 의미한다.
동해- 및 동결보호제(동해-/동결보호제)는 동결건조 공정의 동결 및 건조 단계 동안 및 동결건조된 제품의 후속 보관 동안 단백질 활성의 상실을 감소시키거나 또는 심지어 예방하기 위해 제제 중에 존재하는 화합물이다.
계면활성제는 표면 및 인터페이스에 흡착하고 그에 의해 흡착에 의한 인자 VIII의 활성 상실을 저지하기 위해 작용하는 화합물을 의미한다. 이와 같은 종류의 활성 상실은 전체 약제학적 공정 동안 및 환자로의 투여 전 및 투여 동안 재구성된 제품의 취급 동안 일어날 수 있다. 일부 계면활성제는 용액 중에서 미셀 응집체(micellar aggregate)를 형성한다. 계면활성제의 임계 미셀 농도는 그 이상에서 미셀이 형성되는 농도이다.
인자 VIII의 보호 조성물(protective composition)은 각각의 부형제가 약제학적 공정, 장기 보관, 및 최종적으로 재구성 및 환자로의 투여 동안 인자 VIII의 고수율을 유지하기 위해 보호 기능을 제공하는 것인 선택된 부형제들로 구성된 제제를 의미한다. 약제학적 가공(pharmaceutical processing)은 구체적으로, 생산으로부터의 벌크 약물 물질의 도착에서 개시되어 제제화된 약물 제품의 동결건조의 완료까지 지속되는 제조 공정의 마지막 단계들을 의미한다. 약제학적 가공의 단계들은 일반적으로 단백질 제제화 분야의 당업자에게 잘 알려져 있고 제제화, 무균 여과, 바이알로의 충전 및 동결건조의 단계들을 포함한다.
활성 인자 VIII의 상실은 표면 흡착, 응집, 단백질 구조의 물리적 및/또는 화학적 변화에 의한 상실, 또는 불만족스러운 것으로 보이는 동결건조물의 제거로부터의 상실을 포함하나, 이에 한정되지 않는 광범위한 의미를 갖는다.
r-인자 VIII은 특히, 완전히 또는 부분적으로 B-도메인이 결여되어, 그에 의해 제제화 전에 5000 IU/mg을 크게 초과할 수 있는 비활성을 제공하는, 결실 유도체이다. B-도메인이 완전히 또는 부분적으로 결여된 그와 같은 결실 유도체의 예가 EP-A-1136553 (Hauser et al) 및 EP-A-1739179 (Schroder et al)에서 개시되고 인간 세포주로부터 제조된다. 하기 섹션에서 설명되는, 본 발명의 조성물은 그와 같은 인자 VIII의 결실 유도체를 보호하기에 특히 적합하다.
본 발명에 따르면, 동해-/동결보호제는 아르기닌 또는 수크로오스, 또는 아르기닌과 수크로오스의 조합이다. 아르기닌은 통상적으로 아르기닌 염산염과 같은, 아르기닌의 염 또는 유도체일 수 있다.
본 발명에 따른 벌킹제는 또한 이온 강도 제공제인 추가적인 기능을 가져서, 적합한 임상 제품을 위해 필요한 성분들의 갯수를 최소화한다. 본 발명에 따른 벌킹제는 염화나트륨 또는 아르기닌일 수 있다. 아르기닌은 염 형태, 특히, 염산염 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 동해-/동결보호제는 아르기닌과 수크로오스의 조합이다. 벌킹제 및 이온 강도 제공제는 특히 염화나트륨이다. 염화나트륨이 벌킹제로 작용하는 경우, 본 발명의 조성물은 특히, 6 mg/ml 이상의 동해/동결보호제가 존재한다는 조건 하에, 동해/동결보호제로서 약 3 내지 15 mg/ml의 수크로오스 및 약 3 내지 15 mg/ml의 아르기닌, 및 벌킹제로서 약 10 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 염화나트륨을 포함한다. 본 발명의 조성물은 특히 약 3 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 특히, 약 4.5 mg/ml 내지 약 9 mg/ml 수크로오스, 약 3 mg/ml 내지 약 8 mg/ml, 특히, 약 4.5 mg/ml 내지 약 6.8 mg/ml 아르기닌 및 특히, 약 15 mg/ml 내지 약 23 mg/ml 염화나트륨을 포함할 수 있다. 다른 적합한 농도 범위는 특히, 약 4.5 mg/ml 내지 약 6.8 mg/ml의 수크로오스, 약 4.5 mg/ml 내지 약 6.8 mg/ml의 아르기닌 및 약 15 mg/ml 내지 약 23 mg/ml의 염화나트륨을 포함한다. 바람직하게는, 아르기닌과 수크로오스가 동일한 양으로 존재한다. 본 발명의 조성물은 약 9 mg/ml 이하의 아르기닌 및 약 9 mg/ml 이하의 수크로오스를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 계면활성제로서 염화칼슘과 선택적으로, pH 완충제로서 소디움 시트레이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약 10 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 양의 수크로오스 및 약 10 mg/ml 내지 40 mg/ml의 양의 염화나트륨을 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 대안으로서 필수적으로 염화나트륨을 포함하지 않고, 동해-/동결보호제는 수크로오스이며 벌킹제 및 이온 강도 제공제는 아르기닌이다. 특히, 본 발명의 조성물은 약 5 내지 약 25 mg/ml의 수크로오스 및 약 20 내지 약 70 mg/ml의 아르기닌을 포함한다. 또한, 이 조성물은 계면활성제로서 염화칼슘, 및 선택적으로, 완충제로서 소디움 시트레이트를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "필수적으로 염화나트륨을 포함하지 않는(essentially free of sodium chloride)"은 미량의 염화나트륨이 이전의 제조 단계로부터의 벌크 약물 물질에 동반될 수 있기 때문에, "염화나트륨이 없는(devoid of any sodium chloride)" 조성물을 의미하는 것이 아니고, 미량의 NaCl, 예를 들면, 1% 미만을 포함하나, 약제학적 가공 동안 염화나트륨이 첨가되지 않았다는 것을 의미한다.
통상적으로, 본 발명의 조성물은 동결건조된 형태로 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 동결건조될 용액의 제형으로, 또는 동결건조된 조성물과 희석제로부터 제조된 재구성된 용액의 제형으로 제공된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물 중 계면활성제는 단백질, 특히, 재조합 단백질이다. 상기 단백질은 특히, 재조합에 의해 제조된 알부민, 예를 들면, 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 양의 재조합에 의해 제조된 알부민이다. 이 양은 혈장 유래 인자 VIII의 전통적인 제제에서 통상적으로 이용되는 양보다 훨씬 더 작고 그 양과 상이하며, 상기 제제에서 알부민은 유일한 동해/동결보호제로 기능한다. 놀랍게도, 알부민, 특히 재조합 알부민이 실온에서 보관될 재조합 인자 VIII의 제제에서 계면활성제로 사용하기에 매우 적합하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 계면활성제는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체이다. 본 발명에 따르면, 계면활성제는 임계 미셀 농도 미만의 농도로 존재하고, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체의 경우, 약 5 mg/ml 미만으로 존재한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 5000 IU/mg 단백질 이상의 비활성을 갖는 r-인자 VIII을 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 조성물은 아르기닌인 동해/동결보호제 및 벌킹제를 가지며, 아르기닌은 이온 강도 제공제로도 작용한다. 특히, 아르기닌은 약 20 mg/ml 내지 약 70 mg/ml의 양으로 존재한다. 또한, 이 조성물은 계면활성제로서 염화칼슘 및 선택적으로 완충제로서 소디움 시트레이트를 포함할 수 있다.
다양하게 구현된 조성물 모두 계면활성제를 포함하고, 일 양태에서 상기 계면활성제는 비-이온성 디터전트, 특히, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체와 같은 블록 공중합체 종류의 중합체형 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴록사머 188, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 종류의 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트(Polysorbate) 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 그의 임계 미셀 농도(cmc) 미만의 농도, 바람직하게는 특히 약 5 mg/ml 미만의 농도에서 사용될 수 있는, 폴록사머 188이다. 폴록사머 188의 cmc는 25℃에서 20 내지 100 mg/ml의 범위인 것으로 보고되었다 (Kabanov, A. V. et al, 1995, Alexandridis, P. et al, 1994, Moghimi, S. M. et al, 2004, Nakashima, K. et al, 1994).
또 다른 양태에서, 계면활성제는 인자 VIII 단백질이 아닌 재조합에 의해 제조된 단백질, 특히, 재조합 인간 알부민이고, 특히, 그와 같은 조성물은 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 양으로 재조합에 의해 제조된 알부민을 포함한다.
다양한 구체예가 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명되며, 실시예는 본 발명을 예시하나, 본 발명의 범위를 제한 또는 한정하는 것으로 고려되어서는 안 된다.
본 발명에 따른 조성물은 히스티딘을 포함하지 않으면서도 고순도의 재조합에 의해 제조된 인자 VIII(r-인자 VIII)를 효과적으로 보호할 수 있다.
본 실험에서 사용된 인자 VIII은 EP 1739179 (Schroder et al)에 개시된 방법에 따라 인간 세포주 HEK293F에서 제조된, 재조합 인간 B-도메인 결실 인자 VIII 단백질이다. 정제 공정은 5개의 크로마토그래피 단계들로 구성되고 인간 글리코실화 유사 패턴을 갖는(Sandberg et al, European patent application 08 162 765.5) 매우 순수한 인자 VIII 단백질 제제를 생성했다 (Winge et al, European patent application 08 158 893.1).
단백질 활성은 발색 분석법 또는 일 단계 분석법(one stage assay)에 의해 측정하였다.
발색 분석법은 보조 인자(cofactor)인 인자 VIII의 생물학적 활성을 측정하는 2-단계 측광(photometric) 방법이다. 인자 VIII은 인자 X을 인자 Xa로 활성화시키고, 인자 Xa는 효소에 의해, 분광분석법으로 정량될 수 있는 산물로 절단된다.
일-단계 분석법은 인지질, 접촉 활성자(contact activator) 및 칼슘 이온의 존재 하에 인자 VIII 결핍 혈장의 응집 시간을 보정하는 인자 VIII 함유 시료의 능력에 근거한다. 피브린 괴(fibrin clot)의 출현 시간이 일 단계로 측정된다.
실시예 1
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 이 실험은 아르기닌과 수크로오스의 조합인 동해-/동결보호제를 갖는 제제를 동해-/동결보호제로서 수크로오스 또는 아르기닌을 갖는 제제와 비교한다. 염화나트륨은 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 기능한다.
150 IU/ml의 최초 농도에서 동결건조된 제제 중 인자 VIII 회복에 대해 제제를 조사하였다. 조사된 조성물이 하기 표 1에 표시된다.
표 1 - 조성물
Figure pat00001
용액의 1.5 ml 분량(aliquot)을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 동결건조된 시료를 시간의 경과에 따른 단백질 활성을 평가하기 위해, +5℃, +25℃ 및 +40℃에서 12개월까지 보관하였다. 시료를 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석하였다. 결과가 표 2에 요약된다.
표 2 - 결과
Figure pat00002
n.a. 분석되지 않음
실시예 1의 결과는 놀랍게도, 제제 1A가 제제 1B 및 1C에 비해 시간의 경과에 따라 보다 우수한 활성 회복을 보이므로, 수크로오스와 아르기닌 간에 부가 상승적 동해-/동결보호 효과가 있다는 것을 보여준다.
실시예 2
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 이 실험은 동해-/동결보호제로서 수크로오스 및 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 아르기닌을 갖는 제제를 조사한다. 150 IU/ml의 최초 농도에서 동결건조된 제제 중 인자 VIII 회복에 대해 제제를 조사하였다. 조사된 조성물이 하기 표 3에 표시된다.
표 3 - 조성물
Figure pat00003
용액의 1.5 ml 분량을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 동결건조된 시료를 시간의 경과에 따른 단백질 활성을 평가하기 위해, +5℃, +25℃ 및 +40℃에서 12개월까지 보관하였다. 시료를 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석하였다. 결과가 최초값 대비 비율로서 표 4에 요약된다.
표 4 - 결과
Figure pat00004
n.a. 분석되지 않음
실시예 2의 결과는 아르기닌이 동해-/동결보호제인 수크로오스와 조합되어 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 만족스럽게 기능한다는 것을 보여준다.
실시예 3
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 이 실험은 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 80을 계면활성제로 포함하는 제제와 계면활성제를 포함하지 않는 제제를 비교한다. 동해-/동결보호제는 아르기닌과 수크로오스의 조합이고, 염화나트륨이 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 사용된다. 표 5에 표시된 제제를 150 IU/ml의 초기 인자 VIII 농도에서, 동결건조 단계 동안 인자 VIII의 회복에 대해 조사하였다.
표 5 - 조성물
Figure pat00005
용액의 1.5 ml 분량을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 시료를 동결건조 전 및 동결된 후에 채취하였다. 동결건조된 시료를 분석 전에 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하였다. 인자 VIII 활성을 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석하였다. 동결-해동된 시료 중 및 동결건조 단계에 걸친 활성 회복의 결과가 하기 표 6에 표시된다.
표 6 - 결과, 동결건조 단계 동안의 활성 회복.
Figure pat00006
표 3의 결과는 계면활성제가 동결-해동 단계 및 동결건조 공정 동안 표면 흡착에 의해 유발되는 것으로 보이는 단백질 손실에 대응하기 위해 제제 내에 필요하다는 것을 보여준다. 이 실시예는 또한 임계 미셀 농도(cmc) 미만의 농도로 이용될 때, 비이온성 중합체성 계면활성제인 폴록사머 188이 동결건조 동안 효과적으로 인자 VIII을 보호한다는 것을 보여준다. 보호 효과는 그의 cmc 값보다 높은 농도로 이용될 때, 비-이온성 계면활성제 폴리소르베이트 80의 보호 효과와 동일하게 높다.
실시예 4
실시예 3은 표면 흡착에 의해 유발되는 인자 VIII 활성 손실을 피하기 위해 계면활성제가 제제에서 요구된다는 것을 보여주었고, 이 실시예는 재조합 알부민이 이 목적을 위해 이용될 수 있는지 여부를 조사한다.
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 표 7에 표시된 제제를 140 IU/ml의 인자 VIII 초기 농도에서, 용액 중 인자 VIII 활성 회복에 대해 조사하였다. 단백질 제제를 +25℃에 보관하고, 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 0일 차, 3일 차, 7일 차, 및 10일 차에 분석하였다. 결과가 초기값 대비 비율로 하기 표 8에 표시된다.
표 7 - 조성물
Figure pat00007
표 8 -결과
Figure pat00008
실시예 4의 결과는 재조합 알부민이 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 활성 손실에 대해 r-인자 VIII을 보호한다는 것을 보여준다.
실시예 5
실시예 3은 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 인자 VIII 활성 손실을 피하기 위해 계면활성제가 제제에서 요구된다는 것을 보여주었고, 실시예 4는 재조합 알부민이 용액 중 단백질 활성의 손실을 방지하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 이 실시예는 재조합 알부민이 동결건조 단계에서도 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 단백질 활성 손실을 보호하는지 여부를 조사한다.
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 제제는 비-이온성 디터전트를 포함하지 않으나, 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 활성 손실을 방지하기 위해 재조합 알부민이 첨가되었다. 동해-/동결보호제는 아르기닌과 수크로오스의 조합이고, 염화나트륨이 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 이용된다. 표 7에 표시된 제제를 150 IU/ml의 인자 VIII 초기 농도에서, 동결건조된 제제 중 인자 VIII 활성 회복 여부에 대해 조사하였다.
용액의 1.5 ml 분량을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 시간의 경과에 따른 단백질 활성을 평가하기 위해, +5℃, +25℃ 및 +40℃에서 12개월까지 보관한다. 시료를 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석한다. 결과가 하기 표 9에 표시된다.
표 9- 결과.
Figure pat00009
n.a. 분석되지 않음
실시예 5의 결과는 동결건조 단계에서 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 활성 손실을 방지하기 위해 r-인자 VIII 제제(제제 4B 내지 4D)에서 재조합 알부민이 비-이온성 디터전트를 대체할 수 있다는 것을 보여준다. 이 결과는 또한 재조합 알부민이 실온에서 보관될 재조합 인자 VIII의 제제에서 계면활성제로서 사용하기에 매우 적합하다는 것을 보여준다.
실시예 6
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 제제는 비-이온성 디터전트를 포함하지 않으나, 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 활성 손실을 방지하기 위해 재조합 알부민이 첨가되었다. 동해-/동결보호제는 수크로오스이고, 염화나트륨이 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 이용된다. 표 10에 표시된 제제를 160 IU/ml의 인자 VIII 초기 농도에서, 동결건조된 제제 중 인자 VIII 활성 회복에 대해 조사하였다.
표 10 - 조성물
Figure pat00010
용액의 1.5 ml 분량을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 시간의 경과에 따른 단백질 활성을 평가하기 위해, +5℃, +25℃ 및 +40℃에서 6개월까지 보관한다. 시료를 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석한다. 결과가 하기 표 11에 표시된다.
표 11 - 결과
Figure pat00011
n.a. 분석되지 않음
실시예 6의 결과는 동결건조 단계에서 표면 흡착에 의해 유발될 수 있는 활성 손실을 방지하기 위해 r-인자 VIII 제제에서 재조합 알부민이 비-이온성 디터전트를 대체할 수 있다는 것을 보여준다. 이 결과는 또한 재조합 알부민이 실온에서 보관될 재조합 인자 VIII의 제제에서 계면활성제로서 사용하기에 매우 적합하다는 것을 보여준다.
실시예 7
이 실시예는 pH 완충제를 포함하지 않는 용액 대비 pH 완충제로서 히스티딘을 포함하는 용액 중에서 인자 VIII 활성 회복을 조사한다.
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 표 12에 표시된 용액을 100 IU/ml의 인자 VIII 초기 농도에서, 용액 중 인자 VIII 활성 회복 여부에 대해 조사하였다.
표 12- 조성물
Figure pat00012
단백질 제제를 +25℃에서 보관하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 0일 차 및 3일 후와 7일 후에 분석하였다. 결과가 하기 표 14에 초기값 대비 비율로 요약된다.
Figure pat00013
실시예 7의 결과는 히스티딘 불포함 제제가 히스티딘 포함 제제보다 더 우수하게 인자 VIII을 보호한다는 것을 보여준다.
실시예 8
재조합 인자 VIII을 전술된 실험 섹션의 설명에 따라 제조하였다. 이 실험은 동해/동결보호제, 벌킹제 및 이온 강도 제공제로서 아르기닌을 갖는 제제를 조사하였다. 제제를 160 IU/ml의 인자 VIII 초기 농도에서, 동결건조된 제제 중 인자 VIII 회복에 대해 조사하였다. 조사된 제제의 조성은 하기 표 15에 표시된다.
표 15 - 조성
Figure pat00014
용액의 1.5 ml 분량을 실험실 규모 동결-건조기에서 동결건조시켰다. 시간의 경과에 따른 단백질 활성을 평가하기 위해, +5℃, +25℃ 및 +40℃에서 9개월까지 보관하였다. 시료를 1.5 ml 주사용수 중에 재구성하고 전술된 실험 섹션에서 설명된, 발색 분석법에 의해 분석하였다. 결과가 하기 표 16에 초기값 대비 비율로 요약된다.
표 16 - 결과
Figure pat00015
n.a. 분석되지 않음.
실시예 8의 결과는 아르기닌이 벌킹제 및 이온 강도 제공제, 및 동해/동결보호제로서 만족스럽게 기능하기 때문에 다기능성 부형제일 수 있다는 것을 보여준다.
참조문헌 목록
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Claims (19)

  1. 고순도 인자 VIII (r-인자 VIII);
    아르기닌 및/또는 수크로오스;
    인자 VIII의 표면 흡착을 방지하거나 또는 적어도 억제하기 위한 계면활성제;
    인자 VIII의 특이적 안정화를 위한 양의 염화 칼슘을 포함하는, 히스티딘-불포함 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 아르기닌 및/또는 수크로오스가 동해/동결보호제(cryo/lyoprotectant)로 작용하나, 벌킹제로 작용하지 않는 경우, 염화나트륨이 벌킹제로 존재하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 특히 아르기닌이 동해/동결보호제 및 벌킹제로 이용되는 경우, 염화나트륨이 필수적으로 존재하지 않는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 r-인자 VIII은 원형(native) 인자 VIII의 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결여된, 원형 인자 VIII의 결실 유도체인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 제형인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조될 용액의 제형이거나 또는 동결건조된 조성물과 희석액으로부터 제조된 재구성된 용액의 제형인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  7. 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 6 mg/ml 이상의 동해/동결보호제가 존재한다는 조건 하에, 동해/동결보호제로서 약 3-15 mg/ml의 수크로오스 및 약 3-15 mg/ml의 아르기닌을 포함하고, 벌킹제로서 약 10 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 염화나트륨을 포함하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 동해/동결보호제는 아르기닌과 수크로오스를, 특히 약 3 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 포함하고, 특히, 약 4.5 mg/ml 내지 약 9 mg/ml 수크로오스, 약 3 mg/ml 내지 약 8 mg/ml, 특히 약 4.5 mg/ml 내지 약 6.8 mg/ml 아르기닌 및 약 10 내지 40 mg/ml NaCl, 특히, 약 15 mg/ml 내지 약 23 mg/ml 염화나트륨을 포함하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수크로오스가 약 10 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 양으로 존재하고, 염화나트륨은 약 10 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 양으로 존재하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  10. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로오스인 동해/동결보호제 및 아르기닌인 벌킹제, 특히, 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 수크로오스 및 약 20 mg/ml 내지 약 70 mg/ml의 아르기닌을 포함하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  11. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌은 벌킹제 및 동해/동결보호제로서 기능하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아르기닌은 약 20 mg/ml 내지 약 70 mg/ml의 양으로 존재하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 단백질, 특히, 재조합 단백질인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질은 재조합에 의해 제조된 알부민, 특히, 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 양의 재조합에 의해 제조된 알부민인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 비-이온성 계면활성제인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 계면활성제는 임계 미셀 농도(critical micelle concentration) 미만의 농도로 존재하는 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체의 농도는 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 r-인자 VIII의 비활성은 5000 IU/mg 단백질 이상인 것인 히스티딘-불포함 조성물.
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